專利名稱：：用于大分子的增強(qiáng)的遞送的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本公開(kāi)內(nèi)容涉及促進(jìn)分子穿過(guò)生物膜的遞送，特別是結(jié)合抗原的多肽穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的遞送的組合物和方法。
背景技術(shù)：
：根據(jù)2006年世界衛(wèi)生組織的報(bào)告，世界上超過(guò)10億人患有神經(jīng)病癥，并且此類(lèi)病癥每年導(dǎo)致將近680萬(wàn)人死亡。治療性結(jié)合抗原的肽例如抗體可用于治療多種(如果不是大部分的話)此類(lèi)神經(jīng)病癥。然而，使用此類(lèi)治療性結(jié)合抗原的肽治療神經(jīng)病癥經(jīng)常受到與遞送藥物穿過(guò)血腦屏障(BBB)相關(guān)的困難的阻礙。雖然已發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)分子穿過(guò)上皮細(xì)胞層的遞送的化合物，但通常顯示其只在增強(qiáng)小分子的遞送中有效。例如，已顯示肽4-苯基偶氮芐基氧羰基-Pro-Leu-Gly-Pro增強(qiáng)小分子穿過(guò)上皮細(xì)胞層的運(yùn)輸，然而對(duì)于IOkDa或更大的大分子未顯示滲透增強(qiáng)作用(參見(jiàn)美國(guó)專利5，534，496；Yen等人1995，JControlRelease，36:25-37)。盡管進(jìn)行了大量研究，但目前還沒(méi)有將治療性結(jié)合抗原的多肽遞送至CNS內(nèi)的方便有效的方法。因此，在本領(lǐng)域內(nèi)存在對(duì)增強(qiáng)治療性結(jié)合抗原的多肽穿過(guò)上皮層特別地至CNS的特異性遞送以治療CNS病癥的組合物和方法的持續(xù)需要。發(fā)明概述本發(fā)明至少部分基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)滲透增強(qiáng)劑(例如，Pz-肽或FMOC-肽)能夠增強(qiáng)大的大分子(即，大于IOkDa)例如結(jié)合抗原的多肽(例如scFv)至CNS的特異性遞送，特別是當(dāng)給鼻粘膜施用時(shí)。因此，本發(fā)明提供了增強(qiáng)大的大分子(即，大于IOkDa)例如結(jié)合抗原的多肽(例如，scFv)穿過(guò)上皮層的遞送的組合物和方法。此類(lèi)方法和組合物是特別有利的，因?yàn)樗鼈兪沟媚軌蛲ㄟ^(guò)鼻內(nèi)施用方便、有效和選擇性地將結(jié)合抗原的多肽(例如scFv)遞送至CNS以治療神經(jīng)病癥。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種結(jié)合抗原的多肽例如免疫結(jié)合劑(例如，scFv)和一種或多種滲透增強(qiáng)劑(例如，Pz-肽或FMOC-肽)的組合物。在特定的實(shí)施方案中，將結(jié)合抗原的多肽共價(jià)連接至滲透增強(qiáng)劑。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合抗原的多肽特異性結(jié)合靶抗原特別是TNFa，所述靶抗原選自TNF-α、β淀粉樣蛋白、β淀粉樣蛋白衍生的可擴(kuò)散配體受體、單胺氧化酶-B、L-3，4-二羥苯丙氨酸脫羧酶、乙酰輔酶A羧化酶、N-甲基-D-天冬氨酸受體(也稱為GRIN1)、GRINA、GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C、GRIN2D、GRIN3A、GRIN3B、組胺Hl受體、毒蕈堿受體(也稱為CHRM1)、CHRM2、CHRM3、CHRM4、下丘泌素受體1、下丘泌素受體2、5_羥色胺(也稱為HTR1A)、多巴胺受體(也稱為DRD1)、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、腎上腺素能β1受體、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NET)和多巴胺D2受體。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合抗原的多肽是包含與本文的表5、6和7中所示的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%或99%的同一性或相似性的氨基酸序列的scFv。在其他實(shí)施方案中，滲透增強(qiáng)劑促進(jìn)結(jié)合抗原的多肽至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的選擇性鼻內(nèi)遞送。本發(fā)明的組合物特別地可用作藥物(或用于制造藥物)，所述藥物特別地用于治療、預(yù)防或延遲神經(jīng)病癥的進(jìn)展，所述神經(jīng)病癥包括但不限于偏頭痛、抑郁癥、阿爾茨海默氏病、帕金森病、精神分裂癥、癲癇、中風(fēng)、腦膜炎、肌萎縮側(cè)索硬化、失眠(insomnia)、腦膜炎、記憶缺陷(memoryimpairment)、多發(fā)性硬化、發(fā)作性睡病、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷和應(yīng)激(stress)ο在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括一種或多種結(jié)合抗原的多肽(例如scFv)、一種或多種滲透增強(qiáng)劑(例如，Pz-肽或FMOC-肽)以及使用說(shuō)明書(shū)的試劑盒。附圖概述當(dāng)結(jié)合下列附圖閱讀下列詳述時(shí)，將更好地理解本公開(kāi)內(nèi)容的特征和有利方面，其中圖1描述了時(shí)程實(shí)驗(yàn)，其跟蹤在鼻內(nèi)施用400μgscFv后㈧嗅球、⑶大腦、(C)小腦和(D)腦干中的ESBA105濃度。圖2比較在鼻內(nèi)GOOμg/mL)或靜脈內(nèi)(40μg/mL)施用ESBA105后(A)嗅球、(B)大腦、(C)小腦、(D)腦干和(E)血清中ESBA105的濃度，以及在以400μg/mL的等濃度鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)施用ESBA105后(F)血清中ESBA105的濃度。圖3顯示在使用或不使用I3Z肽的情況下鼻內(nèi)施用后，不同腦區(qū)域中ESBA105的(A)Cmax(平均值士SEM，n=4)和⑶暴露(AUC)的腦組織對(duì)血液的濃度比率。圖4描述了在鼻內(nèi)遞送后ESBA105從鼻腔至CNS的遷移途徑。施用的化合物可從鼻腔遷移入血液并且穿過(guò)血腦屏障，最后滲入腦組織(下面的途徑)。可選擇地，化合物可經(jīng)嗅神經(jīng)(N.olfactorius)軸突(即細(xì)胞內(nèi))或神經(jīng)周?chē)?即細(xì)胞外)遷移入嗅球，然后進(jìn)入大腦。化合物還可經(jīng)三叉神經(jīng)(N.trigeminus)(神經(jīng)周?chē)?，即?xì)胞外)遷移入腦干，然后進(jìn)入小腦。詳述定義本語(yǔ)"滲透增強(qiáng)劑"包括增強(qiáng)藥物穿過(guò)物理屏障例如組織屏障(例如上皮)的通過(guò)的任何組合物。適當(dāng)?shù)臐B透增強(qiáng)劑包括但不限于，N-端連接至保護(hù)基團(tuán)例如4-苯基偶氮芐基氧羰基(Pz)、N-甲基、叔丁基氧羰基(t-Boc)、芴基甲氧基羰基(FMOC)和芐氧羰基(CBZ)的肽Pro-Leu-Gly-Pro-Arg[SEQIDNO28],Pro-Leu-Gly-Pro-Lys[SEQIDNO29]、Pro-Leu-Gly-Pro-Glu[SEQIDNO30],Pro-Leu-Gly-Pro-Asp[SEQIDN0:31]、Pro-Leu-Gly-Pro[SEQIDNO:32]、Pro-Leu-Gly和Pro-Leu(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利5，534，496，其通過(guò)引用合并入本文)。術(shù)語(yǔ)〃Pz-肽〃是指N末端連接至I3Z基團(tuán)的Pro-Leu-Gly-Pro-Arg[SEQIDN0:28](參見(jiàn)例如，美國(guó)專利5，534，496，其通過(guò)引用合并入本文)。術(shù)語(yǔ)〃FMOC-肽〃是指N端連接至FMOC基團(tuán)的Pro-Leu-Gly-Pro-Arg[SEQIDNO:28](參見(jiàn)例如，美國(guó)專利5，534，496，其通過(guò)引用合并入本文)。術(shù)語(yǔ)“選擇性鼻內(nèi)遞送”是指在導(dǎo)致患者的CNS中分子的濃度比血清中的濃度高的條件下分子(例如，結(jié)合抗原的多肽)至患者的鼻內(nèi)應(yīng)用。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合抗原的多肽”是指大小為至少I(mǎi)OkDa的多肽，其包括免疫結(jié)合劑、單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、嵌合抗體、CDR移植抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體(scFv)和抗體片段以及基于本領(lǐng)域內(nèi)已知的可選擇的支架的抗原結(jié)合多肽，所述支架例如但不限于CTLA-4、淀粉酶抑肽、纖連蛋白(FN3)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、CBM4-2、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、T細(xì)胞受體、蛋白A結(jié)構(gòu)域(蛋白Z)、Im9、設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPins)、設(shè)計(jì)的IPR蛋白、鋅指、pVIII、鳥(niǎo)胰腺多肽、GCN4、Wff結(jié)構(gòu)域、Src同源結(jié)構(gòu)域3(SH3)、Src同源結(jié)構(gòu)域2(SH2)、PDZ結(jié)構(gòu)域、TEM-Iβ-內(nèi)酰胺酶、GFP、硫氧還蛋白、葡萄球菌核酸酶、PHD-指、CI-2、BPT1APPI,HPSTI,ecotin、LACI-Dl、LDTI、MTI-II、蝎毒素、昆蟲(chóng)防御素A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、細(xì)胞色素b562、Ldl受體結(jié)構(gòu)域Α、γ-晶體蛋白、泛素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)例如Binz2005，CurrOpinBiotechnol.第16卷，第459-69頁(yè))。術(shù)語(yǔ)“免疫結(jié)合劑”是指分子，所述分子包含抗體的全部或部分抗原結(jié)合位置，例如重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，這樣免疫結(jié)合劑能夠特異性識(shí)別靶抗原。免疫結(jié)合劑的非限定性實(shí)例包括全長(zhǎng)免疫球蛋白分子和scFv，以及抗體片段，包括但不限于(i)Fab片段，由\、VH、CjnCHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab')2片段，包含通過(guò)鉸鏈區(qū)上的二硫橋連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段，(iii)Fab'片段，其基本上是具有鉸鏈區(qū)的一部分的Fab(參見(jiàn)，F(xiàn)undamentalImmunology(Paul編輯，3.sup.rded.1993)；(iv)由Vh和ChI結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(ν)包含抗體的單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域的Fv片段；(vi)單結(jié)構(gòu)域抗體例如Dab片段(Ward等人，(1989)Nature341:544-546)，其由Vh或Vl結(jié)構(gòu)域組成，Camelid(參見(jiàn)Hamers-Casterman，等人，Nature363:446-448(1993)和Dumoulin等人，ProteinScience11:500-515(2002))或Shark抗體(例如，sharkIg-NARsNanobodies)；和(vii)納米抗體(Nanobody)，包含單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是免疫球蛋白的同義詞。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以是完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，例如單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)v(SkerraA.和Pluckthun，Α.(1988)Science240:1038-41)、scFv(Bird,R.Ε.等人(1988)kience242:423-26;Huston，J.S.等人(1988)Proc.Natl.Acad.ki.USA85:5879-83)，F(xiàn)ab、(Fab')2或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他片段。術(shù)語(yǔ)“單鏈抗體”或“scFv”意指包含通過(guò)接頭連接的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)和抗體輕鏈可變區(qū)的分子。此類(lèi)scFv分子可具有一般結(jié)構(gòu)=NH2-V^接頭-Vh-COOH或NH2-Vh-接頭-Vl-C00H。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“抗體構(gòu)架”是指可變結(jié)構(gòu)域VL或VH的一部分，其用作該可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合環(huán)的支架(Kabat,Ε.A.等人，(1991)Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.NIHPublication91_3242)。適當(dāng)?shù)臉?gòu)架的實(shí)例公開(kāi)于PCT/CH2009/000219和PCT/CH2009/000222(其通過(guò)引用合并入本文)。術(shù)語(yǔ)“接頭”是指連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的線性氨基酸序列?？赏ㄟ^(guò)遺傳學(xué)和/或化學(xué)方法將本發(fā)明的接頭融合至結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，接頭包含通過(guò)存在于接頭中的兩個(gè)半胱氨酸之間形成的二硫橋形成的環(huán)。這樣的接頭的一般結(jié)構(gòu)示于SEQIDNo.18和19中；SEQIDNo.16和17是所述接頭的示例性實(shí)施方案。另外的適當(dāng)?shù)默F(xiàn)有技術(shù)接頭由重復(fù)的GGGGS氨基酸序列或其變組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用(6666幻4接頭(SEQIDNo36)或其衍生物(例如，使用SEQIDNo:37)，但也可以使用1至3個(gè)重復(fù)的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)?？捎糜诒景l(fā)明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，ProteinEng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106,Hu等人(1996)，CancerRes.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人O001)，CancerImmunol.Immunother.5051-59描述。術(shù)語(yǔ)“修飾的”或“修飾”，就多肽的氨基酸序列而言，是指氨基酸至多肽序列內(nèi)的添加或多肽序列中現(xiàn)有氨基酸的置換。適合用于修飾多肽的氨基酸包括所有已知的天然氨基酸、非天然氨基酸和其功能化的衍生物(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利7，045，337和7，083，970，其以其全文通過(guò)引用合并入本文)。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)是指多肽序列的氨基酸的缺失?！鞍锌乖?是包含抗體特異性結(jié)合的抗原決定簇的分子(例如，可溶性蛋白質(zhì)或具有一個(gè)或多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的膜結(jié)合蛋白、多肽、肽或碳水化合物)。術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)病癥”包括可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(即腦和脊髓)的疾病和病癥。術(shù)語(yǔ)CNS病癥是指在CNS中表現(xiàn)的病癥。例如，其可以是腦腫瘤或神經(jīng)病癥。術(shù)語(yǔ)“有效量”定義為足以部分或完全預(yù)防或阻止患者的疾病或病癥(例如，神經(jīng)病癥)的治療劑(例如，結(jié)合抗原的多肽)的量。有效量將取決于疾病或病癥的嚴(yán)重度和許多藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括使用的本發(fā)明的特定組合物的活性、施用途徑、施用時(shí)間、使用的特定化合物的排泄速率、治療的持續(xù)時(shí)間、與使用的特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或物質(zhì)、待治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康情況和以前的醫(yī)療史等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的因素。術(shù)語(yǔ)“患者”包括接受預(yù)防性或治療性治療的人和其他哺乳動(dòng)物受試者。術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”、“選擇性結(jié)合”、“選擇性地結(jié)合”和“特異性地結(jié)合”是指抗體結(jié)合預(yù)先確定的抗原上的表位。通常，抗體以大約低于大約10_7M，例如大約低于大約10_8M、10-或ΙΟ,Μ的親和力(Kd)結(jié)合。如本文中所使用的，“同一性”是指兩個(gè)多肽、分子之間或兩個(gè)核酸之間匹配的序列。當(dāng)兩個(gè)進(jìn)行比較的序列中的位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)(例如，如果兩個(gè)DNA分子的每一個(gè)中的位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個(gè)多肽的每一個(gè)中的位置都被賴氨酸占據(jù))時(shí)，各個(gè)分子在該位置上是同一的。兩個(gè)序列之間的“百分?jǐn)?shù)同一性”是由這兩個(gè)序列共有的匹配位置的數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置的數(shù)目再乘以100的函數(shù)。例如，如果兩個(gè)序列的10個(gè)位置中有6個(gè)匹配，那么這兩個(gè)序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個(gè)位置中有3個(gè)位置匹配)。通常，在將兩個(gè)序列比對(duì)以產(chǎn)生最大同一性時(shí)進(jìn)行比較。這樣的比對(duì)可通過(guò)使用，例如，通過(guò)計(jì)算機(jī)程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地進(jìn)行的Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48443-453的方法來(lái)提供。還可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.ApplBiosci.，411-17(1988))，使用PAM120權(quán)重殘基表(weightresiduetable),12的缺口長(zhǎng)度罰分和4的缺口罰分來(lái)測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列之間的百分比同一性。此外，可使用已整合入GCG軟件包(可在mgcg.com上獲得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(JMolBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣以及16，14，12，10，8，6或4的缺口權(quán)重和1，2，3，4，5或6的長(zhǎng)度權(quán)重來(lái)測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列之間的百分比同一性?！跋嗨频摹毙蛄惺钱?dāng)比對(duì)時(shí)共有相同和相似氨基酸殘基的序列，其中相似的殘基是進(jìn)行比對(duì)的參照序列中的相應(yīng)氨基酸殘基的保守置換。在這點(diǎn)上，參照序列中的殘基的“保守置換”是用在物理或功能上與相應(yīng)的參照殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學(xué)性質(zhì)，包括形成共價(jià)鍵或氫鍵的能力等)的殘基進(jìn)行的置換。因此，“經(jīng)保守置換修飾的”序列是與參照序列或野生型序列相異在于存在一個(gè)或多個(gè)保守置換的序列。兩個(gè)序列之間的“百分?jǐn)?shù)相似性”是包含由兩個(gè)序列共有的匹配殘基或保守置換的位置的數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置的數(shù)目XlOO的函數(shù)。例如，如果兩個(gè)序列的10個(gè)位置中有6個(gè)匹配以及10個(gè)位置中有2個(gè)包含保守置換，那么這兩個(gè)序列具有80%的正相似性。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“保守的序列修飾”意指不會(huì)不利地影響或改變包含氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征的氨基酸修飾。此類(lèi)保守的序列修飾包括核苷酸和氨基酸置換、添加和缺失。例如，可通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變引入修飾。保守氨基酸置換包括其中用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換。已在本領(lǐng)域內(nèi)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，優(yōu)選用來(lái)自相同側(cè)鏈家族的另一個(gè)氨基酸殘基替代人抗VEGF抗體中的預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基。鑒定不消除抗原結(jié)合作用的核苷酸和氨基酸保守置換的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(參見(jiàn)，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.SciUSA94:412-417(1997))。除非另外指出，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的意義相同的意義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中，但下面描述了適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧稀Ｔ诿艿那闆r下，以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例只是舉例說(shuō)明性的而非限定性的。在下面的部分更詳細(xì)地描述本發(fā)明的多個(gè)方面。應(yīng)理解，可隨意組合不同實(shí)施方案。改進(jìn)的結(jié)合抗原的多肽的組合物在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)治療性多肽例如結(jié)合抗原的多肽(例如，scFv)穿過(guò)組織屏障，更具體地穿過(guò)鼻粘膜進(jìn)入CNS的遞送的組合物。此類(lèi)組合物通常包含結(jié)合抗原的多肽和滲透增強(qiáng)劑。此類(lèi)組合物是特別有利的，因?yàn)樗鼈兡軌驅(qū)⒔Y(jié)合抗原的多肽選擇性鼻內(nèi)遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。目前，通常全身性施用生物制品，因此需要更高劑量的藥物和/或使有此需要的生物體經(jīng)受所述藥物；可選擇地，可通過(guò)顱插管(cranialcannula)施用生物制品。因此，本發(fā)明顯著改善了需要結(jié)合抗原的多肽的受試者的生活質(zhì)量。任何結(jié)合抗原的多肽適合用于本發(fā)明的方法。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合抗原的多肽是免疫結(jié)合劑例如scFv。此類(lèi)scFv優(yōu)選包含高度穩(wěn)定的和可溶的構(gòu)架區(qū)例如W009/000098(其內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文)中所示的構(gòu)架區(qū)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，scFv包含與表5、6和7中所示的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列具有至少80%的相似性(例如，85%、90%、95%或99%)的氨基酸序列。最優(yōu)選，scFv包含與表5、6和7中所示的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列具有至少80%的同一性，優(yōu)選85%、90%、95%或99%的同一性的氨基酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述scFv包含與SEQIDNo:20、SEQIDNo:21、SEQIDNo22,SEQIDNo:23、SEQIDNo24,SEQIDNo25,SEQIDNo:26或SEQIDNo:27具有至少80%的相似性(例如，85%、90%、95%或99%)，更優(yōu)選至少80%的同一性，更優(yōu)選85%、90%、95%或99%的同一性的構(gòu)架序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述scFv包含VH結(jié)構(gòu)域，所述VH結(jié)構(gòu)域包含與SEQIDNo6,SEQIDNo:7、SEQIDNo:8、SEQIDNo:9、SEQIDNo:10或SEQIDNo:35具有至少80%的相似性(例如，85%、90%、95%或99%)，更優(yōu)選至少80%的同一性，更優(yōu)選85%，90%，95%或99%的同一性的氨基酸序列。另外或可選擇地，所述scFv包含VL結(jié)構(gòu)域，所述VL結(jié)構(gòu)域含有與SEQIDNo:11、SEQIDNo:12、SEQIDNo:13、SEQIDNo:14、SEQIDNo:15或SEQIDNo:34具有至少80%的相似性(例如，85%、90%、95%或99%)，更優(yōu)選至少80%的同一性，更優(yōu)選85%、90%、95%或99%的同一性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)接頭連接所述VH和/或VL以產(chǎn)生具有一般結(jié)構(gòu)NH2-VH-接頭-VL-COOH或NH2-VL-接頭-VH-COOH的分子。所述接頭分子可以例如選自SEQIDN0:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:36禾口SEQIDNO:37或可以是與上述序列至少具有80%的相似性的序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，scFv包含與SEQIDNo:1、SEQIDNo:2、SEQIDNo:3、SEQIDNo4,SEQIDNo:5或SEQIDNo:33具有至少80%的相似性(例如，85%、90%、95%或99%)，更優(yōu)選至少80%的同一性，更優(yōu)選85%、90%、95%或99%的同一性的氨基酸序列。任何滲透增強(qiáng)劑可用于本發(fā)明的組合物。在某些實(shí)施方案中，滲透增強(qiáng)劑是連接至保護(hù)基團(tuán)的肽或擬肽(P印tidomimetic)。適合用于本發(fā)明的肽可包含任何已知的氨基酸，包括天然氨基酸、非天然氨基酸、D-氨基酸和氨基酸衍生物。在特定的實(shí)施方案中，滲透增強(qiáng)劑是選自N末端連接至保護(hù)基團(tuán)例如4-苯基偶氮芐基氧羰基(Pz)、N-甲基、叔丁基氧羰基(t-Boc)、芴基甲氧基羰基(FMOC)和芐氧羰基(CBD的ftx)-Leu-Gly-Pr0-Arg[SEQIDNO28],Pro-Leu-Gly-Pro-Lys[SEQIDNO29],Pro-Leu-Gly-Pro-Glu[SEQIDN0:30]、Pro-Leu-Gly-Pro-Asp[SEQIDNO31],Pro-Leu-Gly-Pro[SEQIDNO:32]、Pro-Leu_Gly和ftO-Leu的肽(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利5，534，496，通過(guò)引用合并入本文)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，滲透增強(qiáng)劑是N末端連接至I3Z或FMOC基團(tuán)的Pro-Leu-Gly-Pro-Arg[SEQIDNO28](參見(jiàn)例如美國(guó)專利5，534，496，其通過(guò)引用合并入本文)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)預(yù)期，可將滲透增強(qiáng)劑和結(jié)合抗原的蛋白于單一藥物組合物中共遞送至靶組織，或可通過(guò)在不同的組合物中施用以在時(shí)間上分開(kāi)它們的遞送。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還預(yù)期，可將滲透增強(qiáng)劑綴合至結(jié)合抗原的蛋白。預(yù)期本領(lǐng)域已知的所有物理或化學(xué)綴合的模式。為了將化學(xué)基團(tuán)綴合至氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模擬物，可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)藥品?？删Y合至結(jié)合抗原的蛋白的任何氨基酸殘基，包括賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸殘基。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可包含適合于與上述結(jié)合抗原的蛋白共遞送的另外的化合物。此類(lèi)藥物包括但不限于小分子、益智藥、多肽和寡核苷酸。本發(fā)明的組合物可用于將結(jié)合抗原的蛋白遞送穿過(guò)任何生物膜(包括但不限于粘膜上皮(例如，鼻上皮)和角膜組織)的緊密連接。特別優(yōu)選的靶膜是鼻上皮，因?yàn)楸景l(fā)明的組合物至鼻上皮的施用導(dǎo)致抗原結(jié)合蛋白直接和特異性遞送至CNS內(nèi)，優(yōu)選無(wú)需首先進(jìn)入血流。CNS病癥的治療本發(fā)明的組合物特別適合于治療、預(yù)防和/或延遲CNS病癥的進(jìn)展，因?yàn)榇祟?lèi)組合物允許通過(guò)鼻粘膜將結(jié)合抗原的多肽直接和選擇性遞送入CNS?？墒褂帽景l(fā)明的組合物治療的適當(dāng)?shù)牟“Y包括但不限于，行為/認(rèn)知綜合征、頭痛癥(例如偏頭痛、叢集性頭痛和緊張性頭痛)、癲癇、創(chuàng)傷性腦損傷、神經(jīng)退行性疾病(例如腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、酒精中毒、亞歷山大病(Alexander'sdisease)、阿爾珀斯病(Alper‘sdisease)、阿爾茨海默氏病、肌萎縮側(cè)索硬化(也稱為葛雷克氏病(LouGehrig'sDisease))、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張、巴滕病(Battendisease)(也稱為Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、牛海綿狀腦病、卡納萬(wàn)病(Canavandisease)、腦性癱瘓、柯凱因綜合征(Cockaynesyndrome)、皮質(zhì)基底節(jié)變性、克雅病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、家族性致死性失眠癥、額顳葉變性、亨丁頓病(Huntington'sdisease)、HIV相關(guān)癡呆、肯尼迪病(Kennedy‘sdisease)、克拉伯病(Krabbe‘sdisease)、路易體癡呆、神經(jīng)疏螺旋體病、馬查多-約瑟夫病(Machado-Jos印hdisease)(脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)3型)、多系統(tǒng)萎縮、多發(fā)性硬化、發(fā)作性睡病、尼曼-匹克病(NiemannPickdisease)、帕金森病、佩-梅病(Pelizaeus-MerzbacherDisease)、皮克病(Pick'sdisease)、原發(fā)性側(cè)索硬化、朊病毒病、進(jìn)行性核上性麻痹、雷夫敘姆病(Refsum'sdisease)、桑德霍夫病(Sandhoffdisease)、希爾德病(Schilder'sdisease)、繼發(fā)于惡性貧血的脊髓亞急性聯(lián)合變性、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、脊髓性肌萎縮、Steele-Richardson-Olszewski病、脊髓癆、和中毒性腦病、腦血管病(例如短暫性缺血發(fā)作和中風(fēng))、睡眠障礙、腦性癱瘓、感染(例如腦炎、腦膜炎、和脊髓炎)、腫瘤(例如腦和脊髓腫瘤)、運(yùn)動(dòng)障礙(例如偏側(cè)投擲癥、抽動(dòng)障礙、和抽動(dòng)穢語(yǔ)綜合征(GillesdelaTourettesyndrome))、CNS的脫髓鞘疾病(例如多發(fā)性硬化格林-巴利綜合征(Guillain-BarWsyndrome)和慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病)、周?chē)窠?jīng)病癥(例如肌病和神經(jīng)肌肉連接)、精神狀態(tài)改變(例如腦病、木僵、和昏迷)、言語(yǔ)和語(yǔ)言障礙、神經(jīng)系統(tǒng)副腫瘤綜合征和具有無(wú)明確生理學(xué)病因的功能性神經(jīng)學(xué)癥狀的綜合征。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或病癥的方法，所述方法包括給需要此治療的受試者的鼻粘膜施用有效量的組合物，所述組合物包含結(jié)合抗原的多肽(例如，scFv)和滲透增強(qiáng)劑(例如，Pz-肽)，以便治療或預(yù)防所述疾病或病癥。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將結(jié)合抗原的多肽選擇性遞送至受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的方法，所述方法包括將包含結(jié)合抗原的多肽(例如，scFv)和滲透增強(qiáng)劑(例如，Pz-肽)的組合物與受試者的鼻粘膜接觸，由此將結(jié)合抗原的多肽直接和選擇性地遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。靶抗原用于本發(fā)明的方法的結(jié)合抗原的多肽可結(jié)合一個(gè)或多個(gè)特定靶抗原。適當(dāng)?shù)陌锌乖ǖ幌抻赥NF-α(例如Genbank登錄號(hào)NP_000585.2)、β淀粉樣蛋白(例如(ienbank登錄號(hào)ΝΡ_000475.1)、β淀粉樣蛋白衍生的可擴(kuò)散配體受體(參見(jiàn)例如，W0/2004/031400)、單胺氧化酶-B(例如Genbank登錄號(hào)NP_000889.3)、L_3，4_二羥苯丙氨酸脫羧酶(例如Genbank登錄號(hào):NP_000781.1)、乙酰輔酶A羧化酶(例如Genbank登錄號(hào):NP_942131.1)、N-甲基-D-天冬氨酸受體(也稱為GRIN1)(例如Genbank登錄號(hào)NP_000823.4))、GRINA(例如Genbank登錄號(hào)NP_000828.1)、GRIN2D(例如Genbank登錄號(hào)NP_000827.2)、GRIN2C(例如Genbank登錄號(hào)NP_000826.2)、GRIN3B(例如Genbank登錄號(hào)NP_619635.1)、GRIN2A(例如Genbank登錄號(hào)NP_000824.1)、GRIN2B(例如Genbank登錄號(hào):NP_000825.2)、GRIN3A(例如Genbank登錄號(hào):NP_597702.2)、組胺Hl受體(例如Genbank登錄號(hào):ΝΡ_000852·1)、毒蕈堿受體(也稱為CHRM1)(例如Genbank登錄號(hào)NP_000729.2)、CHRM2(ΝΡ_000730.1)、CHRM3(ΝΡ_000731.1)、CHRM4(ΝΡ_000732.2)、下丘泌素受體1(例如Genbank登錄號(hào):NP_001516.2)、下丘泌素受體2(例如Genbank登錄號(hào):NP_001517.2)、5-羥色胺(也稱為HTR1A)(例如Genbank登錄號(hào):NP_000515.2)、多巴胺受體(也稱為DRD1)(例如Genbank登錄號(hào):NP_000785.1)、DRD2(例如Genbank登錄號(hào)NP_000786.1)、DRD3(例如Genbank登錄號(hào)NP_000787.2)、DRD4(例如Genbank登錄號(hào):NP_000788.2)、DRD5(例如Genbank登錄號(hào):NP_000789.1)、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NET)(例如Genbank登錄號(hào):NP_001034.1)、腎上腺素能β1受體(例如Genbank登錄號(hào)ΝΡ_000675.1)和多巴胺D2受體(例如Genbank登錄號(hào)ΝΡ_000786.1)。制劑本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及本發(fā)明的結(jié)合抗原的多肽/滲透增強(qiáng)劑組合物的藥物制劑。此類(lèi)制劑通常包含一種或多種結(jié)合抗原的多肽，一種或多種滲透增強(qiáng)劑，和藥學(xué)可接受的載體。如本文中使用的，“藥學(xué)可接受的載體”包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選，載體適合于例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、局部(例如，至眼、皮膚或表皮層)、吸入、胃腸外、脊柱或表皮施用(例如，通過(guò)注射或輸注)。取決于施用的途徑，可將結(jié)合抗原的多肽/滲透增強(qiáng)劑組合物包被在材料中以保護(hù)化合物免受酸和可使化合物失活的其他天然條件的作用。本發(fā)明的藥物組合物可以包含一種或多種藥學(xué)可接受的鹽。“藥學(xué)可接受的鹽”是指保持親本化合物的期望的生物學(xué)活性并且不賦予任何不期望的毒理學(xué)效應(yīng)的鹽(參見(jiàn)例如，Berge,S.Μ.，等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1_19)。此類(lèi)鹽的實(shí)例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括從無(wú)毒性無(wú)機(jī)酸例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等，以及從無(wú)毒性有機(jī)酸例如脂肪族一和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等衍生的鹽。堿加成鹽包括從堿土金屬例如鈉、鉀、鎂、鈣等以及從無(wú)毒性有機(jī)胺例如N，N'-二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等衍生的鹽。本發(fā)明的藥物組合物還可包含藥學(xué)可接受的抗氧化劑。藥學(xué)可接受的抗氧化劑的實(shí)例包括(1)水溶性抗氧化劑例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(油溶性抗氧化劑例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒(méi)食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等?？捎糜诒景l(fā)明的藥物組合物的適當(dāng)?shù)乃院头撬暂d體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其適當(dāng)?shù)幕旌衔?、植物油例如橄欖油和可注射的有機(jī)酯例如油酸乙酯?？梢岳缤ㄟ^(guò)使用包衣材料例如卵磷脂，通過(guò)維持所需顆粒大小(在分散體的情況下)以及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。此類(lèi)組合物還可包含佐劑例如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和分散劑?？赏ㄟ^(guò)滅菌操作(同上)和通過(guò)包含各種抗菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥苯甲酸、三氯叔丁醇、酚、山梨酸等來(lái)確保防止微生物的存在。還可期望將等滲劑例如糖、氯化鈉等包含在組合物中。此外，可通過(guò)包含延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來(lái)產(chǎn)生可注射藥物形式的延長(zhǎng)的吸收。藥學(xué)可接受的載體包括無(wú)菌水溶液或分散體以及用于無(wú)菌可注射液或分散體的臨時(shí)制備的無(wú)菌粉劑。此類(lèi)介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。除非其與所述活性化合物不相容，否則預(yù)期任何常規(guī)介質(zhì)或試劑在本發(fā)明的藥物組合物中的用途。還可將補(bǔ)充的活性化合物摻入組合物中。藥物組合物在制造和貯存的條件下通常必須是無(wú)菌和穩(wěn)定的。可將組合物配制為溶液、微乳劑、脂質(zhì)體或適合于高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。載體可以是包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其適當(dāng)?shù)幕旌衔锏娜軇┗蚍稚⒔橘|(zhì)。可以例如通過(guò)使用包衣例如卵磷脂，通過(guò)維持所需顆粒大小(在分散體的情況下)以及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包含等滲劑例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化鈉?？赏ㄟ^(guò)在組合物中包含延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鹽和明膠來(lái)產(chǎn)生可注射組合物的延長(zhǎng)的吸收。通過(guò)將活性化合物以所需的量與上面列舉的成分之一或其組合一起(需要時(shí))摻入適當(dāng)?shù)娜軇┲?，然后進(jìn)行滅菌微過(guò)濾來(lái)制備無(wú)菌注射液。通常，通過(guò)將活性化合物摻入無(wú)菌媒介物(其含有基本分散介質(zhì)和所需的來(lái)自上面例舉的成分的其他成分)來(lái)制備分散體。在用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉劑的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)(所述方法從其之前的無(wú)菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)生活性成分加任何額外的期望的成分的粉劑)。可與載體材料組合以產(chǎn)生單個(gè)劑量形式的活性成分的量將視待治療的受試者和特定的施用模式而變化?？膳c載體材料組合以產(chǎn)生單個(gè)劑量形式的活性成分的量通常可以是產(chǎn)生治療效果的組合物的那個(gè)量。通常，除了百分之百外，該量的范圍是大約0.01%至大約99%的活性成分，優(yōu)選大約0.1%至大約70%，最優(yōu)選大約1%至大約30%的活性成分(與藥學(xué)可接受的載體組合)。調(diào)整給藥方案以提供最佳期望的應(yīng)答(例如，治療應(yīng)答)。例如，可施用單次推注，可在一段時(shí)間內(nèi)施用數(shù)個(gè)分開(kāi)的劑量或可根據(jù)治療情況的緊迫性所要求的，按比例減少或增加劑量。特別有利地以劑量單位形式配制胃腸外組合物以便于劑量的施用和均勻性。本文中使用的劑量單位形式是指適合作為用于待治療的受試者的單位劑量的物理上分開(kāi)的單位；每一個(gè)單位包含預(yù)先確定量的活性化合物，其經(jīng)計(jì)算與所需的藥物載體組合產(chǎn)生期望的治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格(specification)受制于和直接取決于(a)活性化合物的獨(dú)特特征和要獲得的具體治療效果，和(b)配制用于治療個(gè)體的敏感性的此類(lèi)活性化合物的領(lǐng)域中固有的限制。本發(fā)明的另一個(gè)方面是施用本發(fā)明的藥物組合物的方法。在本發(fā)明的范圍內(nèi)預(yù)期，代表性遞送方案可包括口服、胃腸外(包括皮下、肌內(nèi)和靜脈內(nèi))、直腸、口腔、舌下、經(jīng)肺、經(jīng)皮、鼻內(nèi)和口服途徑。優(yōu)選的遞送方案是經(jīng)鼻施用。為了進(jìn)行經(jīng)鼻施用，可使用固體或液體載體。固體載體包括顆粒大小在例如大約20至大約500微米范圍內(nèi)的粗粉，并且利用通過(guò)鼻道快速吸入來(lái)施用此類(lèi)制劑。在使用液體載體的情況下，可將制劑配制為鼻腔噴霧劑或滴劑，并且所述制劑可包含活性成分的油性或水性溶液。提供適合于經(jīng)鼻施用的制劑以便將包含活性化合物并且期望直徑在0.5至7微米的范圍內(nèi)的顆粒遞送入受者的支氣管樹(shù)中。作為一種可能性，此類(lèi)制劑以細(xì)碎粉劑(finelycomminutedpowder)的形式存在，所述粉劑可方便地在可刺破的膠囊(適當(dāng)?shù)赜衫缑髂z制成，用于吸入裝置)中提供，或可選擇地作為包含活性化合物、適當(dāng)?shù)囊后w或氣體噴射劑和任選地其他成分例如表面活性劑和/或固體稀釋劑的自噴射制劑提供。適當(dāng)?shù)囊后w噴射劑包括丙烷和氯氟碳類(lèi)，適當(dāng)?shù)臍怏w噴射劑包括二氧化碳。還可使用自噴射制劑，其中將活性化合物以溶液或懸浮液的微滴的形式分散。此類(lèi)自噴射制劑與本領(lǐng)域內(nèi)已知的自噴射制劑類(lèi)似并且可通過(guò)已建立的方法來(lái)制備。適當(dāng)?shù)?，在擁有手?dòng)開(kāi)啟的或自動(dòng)作用的閥門(mén)(具有期望的噴射特征)的容器中提供它們；有利地所述閥門(mén)是在其每一次操作時(shí)遞送固定體積例如25至100μ1的計(jì)量型閥門(mén)。作為另外的可能性，活性化合物可以以溶液或懸浮液的形式存在，以用于噴霧器或化霧器，由此將加速的氣流或超聲攪拌用于產(chǎn)生用于吸入的微滴噴霧。當(dāng)分散時(shí)，此類(lèi)制劑應(yīng)當(dāng)期望地具有范圍在10至200微米內(nèi)的顆粒直徑以使得能夠保留在鼻腔中；這可通過(guò)使用適當(dāng)顆粒大小的粉劑或選擇適當(dāng)?shù)拈y門(mén)(適當(dāng)時(shí))來(lái)實(shí)現(xiàn)。其他適當(dāng)?shù)闹苿┌w粒直徑在20至500微米范圍內(nèi)的粗粉(通過(guò)鼻道通過(guò)從緊挨鼻子的容器快速吸入來(lái)進(jìn)行施用)和在水性或油性溶液或懸浮液中包含0.2至5%w/ν的活性化合物的滴鼻劑。組合物的用途本發(fā)明的組合物可用作例如用于治療、預(yù)防和/或延遲神經(jīng)病癥的進(jìn)展的藥物。因此，本文中公開(kāi)的組合物可用于制造用于治療或預(yù)防神經(jīng)病癥的藥物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此類(lèi)病癥選自偏頭痛、抑郁癥、阿爾茨海默氏病、帕金森病、精神分裂癥、癲癇、中風(fēng)、腦膜炎、肌萎縮側(cè)索硬化、失眠、腦膜炎、記憶缺陷、多發(fā)性硬化、發(fā)作性睡病、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷和應(yīng)激。優(yōu)選，配制用于鼻內(nèi)遞送的組合物。實(shí)施例通過(guò)下列不應(yīng)當(dāng)解釋為進(jìn)一步限定的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步舉例說(shuō)明本公開(kāi)內(nèi)容。一般地，除非另外指出，否則本發(fā)明的實(shí)施使用化學(xué)、分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)(尤其是例如免疫球蛋白技術(shù))的常規(guī)技術(shù)。參見(jiàn)，例如，Sambrook,Fritsch禾口Maniatis,MolecularCloning:ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)；AntibodyEngineeringProtocols(MethodsinMolecularBiology),510,Paul,S.,HumanaPr(1996)；AntibodyEngineering:APracticalApproach(PracticalApproachSeries,169),McCafferty,Ed.,IrlPr(1996)；Antibodies:ALaboratoryManual,Harlow等人，C.S.H.L.Press,Pub.(1999)；CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.Ausubel等人，JohnWiley&Sons(1992)也參見(jiàn)例如，PolythericsUS6803438；EP1701741A2；EP1648518A2；W005065712A2；W005007197A2；EP1496941A1；EP1222217B1；EP1210093A4；EP1461369A2；WO03089010A1；WO03059973A2禾PEP1210093A1)；GenentechUS20070092940A1和EP1240337B1；和ESBATechU.S.S.N.60/899，907、PCT/CH2009/000225、PCT/CH2009/000222、PCT/CH2009/000222、WO06/131013禾口W003097697A2oESBA105的純化如之前所述(Furrer等人O009nnvestOpthalmolVisSci50，771-778;Ottiger等人(2009)InvestOpthalmolVisSci50，779-786)從大腸桿菌(Escherichiacoli)宿主細(xì)胞純化ESBA105(具有.3kDa的分子量的抗TNF-α單鏈抗體片段)。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)在大腸桿菌BL21(DE3)中重組表達(dá)，從包含體重折疊，然后進(jìn)行尺寸排阻層析來(lái)產(chǎn)生ESBA105。對(duì)于動(dòng)物研究，以10mg/ml(用于鼻內(nèi)施用)或0.5mg/ml(用于靜脈內(nèi)注射)于50mM磷酸鈉，150mMNaCl,pH6.5中配制ESBA105。在用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的所有制劑中，內(nèi)毒素含量低于0.1EU，如在LAL凝集測(cè)定中測(cè)量的。伊文斯藍(lán)(Evansblue)的鼻內(nèi)施用通過(guò)經(jīng)由鼻內(nèi)途徑將0.9%NaCl中的0.3%伊文斯藍(lán)施用給Balb/c小鼠來(lái)初步確定將蛋白質(zhì)靶向CNS的最佳條件。然后在預(yù)先確定的時(shí)間點(diǎn)上通過(guò)CO2吸入來(lái)處死動(dòng)物，收獲它們的肺和胃并且就伊文斯藍(lán)的存在進(jìn)行目視檢查。通過(guò)在異氟烷(Provet，Lyssach，Switzerland)麻醉下將動(dòng)物保持仰臥并且以5分鐘的間隔用2μ1伊文斯藍(lán)處理每一個(gè)鼻孔直至達(dá)到總共40μ1(45分鐘)(表1)來(lái)獲得最佳條件。然后，在所有本文描述的實(shí)施方案中，將該方案用于ESBA105的鼻內(nèi)施用。ESBA105的鼻內(nèi)和靜脈內(nèi)施用在用ESBA105鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥之前10天，收集全部動(dòng)物的預(yù)采血樣品(prebleed)。在異氟烷(Provet,Lyssach,Switzerland)麻醉下進(jìn)行ESBA105的鼻內(nèi)施用。將小鼠以仰臥位放置，利用吸量管以2μ1的微滴施用總共40μΚ400μg)ESBA105，在總共45分鐘的時(shí)間內(nèi)每5分鐘處理各個(gè)鼻孔1次。對(duì)于鼻內(nèi)Hi研究，在第一次鼻內(nèi)滴注后1、2、4、6、8、10、12和對(duì)小時(shí)處死4只動(dòng)物。在一些實(shí)驗(yàn)中，將3mMPz_肽(4-苯基偶氮芐基氧羰基-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg;Bachem，Bubendorf,Switzerland)(通過(guò)以短暫可逆的方式引發(fā)緊密連接開(kāi)放來(lái)促進(jìn)細(xì)胞旁標(biāo)志物的運(yùn)輸?shù)臐B透增強(qiáng)劑)(Yen和Lee(1994)JournalofControlledRelease28,97-109)加入至ESBA105制劑。在第一次施用后1、2和4小時(shí)處死4只動(dòng)物。對(duì)于靜脈內(nèi)注射，將小鼠置于制動(dòng)器(restrainer)中，將40μβ(80μ1)ESBA105注射入尾靜脈。根據(jù)對(duì)于400μgESBA105的鼻內(nèi)施用在4小時(shí)的時(shí)期內(nèi)觀察到的血液濃度-時(shí)間曲線下的面積(AUC)，選擇靜脈內(nèi)劑量以最接近全身性暴露。在各時(shí)間點(diǎn)(1、2和4小時(shí))處死兩只動(dòng)物。在處死時(shí)，用氯胺酮(Ketasol100，65mg/kg；Pharmacy,Schlieren,Switzerland)>賽拉嚷(Rompun,13mg/kg；Provet,Lyssach,Switzerland)禾口乙酷丙嚷(Prequi1lan,2mg/kg；Arovet,Zollikon,Switzerland)的、混合物深度麻醉小鼠。在用20mlPBS輸注小鼠之前通過(guò)心臟穿刺收集血液樣品。小心地收獲腦并且將其解剖成嗅球、大腦(包括丘腦和下丘腦)、小腦和腦干。稱取組織的重量，將其在干冰上冷凍并且于-80°C下貯存直至分析。組織的制備如下制備組織以用于分析。向15mg腦組織中加入100μ1裂解緩沖液(IOmMTris,pH7.4，0.1%SDS，具有蛋白酶抑制劑混合物(RocheDiagnostics,Rotkreuz,Switzerland))ο將組織超聲處理5秒(8個(gè)循環(huán)，100%的強(qiáng)度)(Sonoplus，Bandelin,Berlin,Germany)，離心，然后將上清液經(jīng)歷基于ELISA的ESBA105濃度測(cè)定。血清和腦組織中的ESBA105的定量通過(guò)在直接ELISA中以一式三份測(cè)量各樣品來(lái)測(cè)定ESBA105的濃度。在4°C下用0.5μg/ml的在PBS中的人TNF-α(Peprotech,London,UK)包被96孔板(NUNCMaxiSorp；Omnilab,Mettmenstetten,Switzerland)過(guò)夜。在每一個(gè)下列步驟之間，使用微量板洗滌機(jī)(ASYSAtlantis，Salzburg,Austria)，用TBS_T(0.005%Tween20；AxonLab,Baden-Dattwyl,Switzerland)洗滌板3次。通過(guò)在PBS/1%BSA/0.2%Tween20中溫育1.5小時(shí)來(lái)飽和非特異性結(jié)合位點(diǎn)。在含有10%的各自基質(zhì)的稀釋緩沖液(PBS，0.1%BSA,0.2%Tween20)中制備各樣品的預(yù)稀釋物(predilution)(嗅球、大腦、小腦、腦干或血清)。在稀釋緩沖液/10%的各自基質(zhì)中制備ESBA105的標(biāo)準(zhǔn)參照稀釋物系列(50-0.5ng/ml)。然后向孔中加入預(yù)稀釋的樣品和標(biāo)準(zhǔn)參照稀釋物，將板在室溫下溫育1.5小時(shí)。用在稀釋緩沖液中以120'000稀釋的生物素化的親和純化的多克隆兔抗ESBA105抗體(AK3A,ESBATech,Schlieren,Switzerland)檢測(cè)結(jié)合的ESBA105(1.5小時(shí)，室溫)。然后，用0.2ng/ml稀釋緩沖液的濃度的聚-辣根過(guò)氧化物酶鏈霉抗生物素蛋白(MereospecificDetectionTechnologies,Baesweiler,Germany)檢測(cè)AK3A。將POD(RocheDiagnostics,Rotkreuz,Switzerland)用作過(guò)氧化物酶底物，并且在2至20分鐘(取決于顏色強(qiáng)度)后通過(guò)加入IMHCl來(lái)終止顯色反應(yīng)。在酶標(biāo)儀(Sunrise；Tecan，Maennedorf，Switzerland)中在450nm處測(cè)量吸光度，通過(guò)多項(xiàng)式回歸從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中ESBA105的濃度(GraphPadPrism4，03；GraphPadSoftware,Inc.,SanDiego,CA)。ESBA105的最小可定量濃度(LOQ)在血清和腦組中分別為5ng/ml和33ng/ml。將產(chǎn)生的信號(hào)低于定量的下限的未稀釋的樣品設(shè)置為L(zhǎng)OQ以進(jìn)行數(shù)學(xué)評(píng)估和圖形顯示。實(shí)施例1鼻內(nèi)施用的模式本實(shí)施例證明，低體積的經(jīng)鼻施用導(dǎo)致至CNS的特異性遞送。為了進(jìn)行至CNS的有效和特異性藥物遞送，施用的物質(zhì)應(yīng)當(dāng)保持在鼻腔中；然而，幾個(gè)研究已顯示，鼻內(nèi)施用的物質(zhì)可由于呼吸和攝取而遷移至呼吸系統(tǒng)和胃腸道(Eyles等人(1999ΠηJPharm189，75-79；Klavinskis等人(1999)JImmunol162,254-262；LundhoIm等人(1999)Vaccine17,2036-2042;Trolle等人(2000)Vaccine18,2991-2998))。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，許多方面(例如麻醉、動(dòng)物位置和施用的體積和頻率)可影響施用的化合物在鼻腔中的駐留時(shí)間。通過(guò)使用上述鼻內(nèi)施用方案，將伊文斯藍(lán)用作示蹤劑以估量鼻內(nèi)應(yīng)用后染料的施用后分布。通過(guò)幾個(gè)不同的方法鼻內(nèi)施用40-50μ1伊文斯藍(lán)。首先，給保持仰臥位的麻醉或警醒小鼠提供單個(gè)劑量，這在兩種情況下都導(dǎo)致染料遷移至肺和胃。第二，給處于仰臥位的麻醉動(dòng)物提供單個(gè)劑量，進(jìn)行30至50分鐘而非僅3分鐘。第三，以2個(gè)分開(kāi)的10μ1劑量(以5分鐘的間隔施用)施用染料。這些方法中沒(méi)有一個(gè)減少伊文斯藍(lán)至肺和胃的遷移。最后，將低至2μ1的體積施用給處于仰臥位的已麻醉的動(dòng)物，這導(dǎo)致在肺中只有最低痕量的伊文斯藍(lán)并且藍(lán)色染色完全不存在于胃中(表1)。實(shí)施例2ESBA105至CNS的遞送本實(shí)施例證明，scFv的鼻內(nèi)施用導(dǎo)致scFv至CNS的遞送。ESBA105(SEQIDNO:1)是特異性結(jié)合和抑制TNFα的單鏈抗體(參見(jiàn)例如W006/131013，其通過(guò)引用合并入本文)。在通過(guò)上述方案進(jìn)行鼻內(nèi)施用后，ESBA105在分析的腦的所有區(qū)域中達(dá)到顯著的濃度，并且在一段時(shí)間內(nèi)展示雙峰分布。在第一次滴注后1小時(shí)達(dá)到小腦和腦干中的最大ESBA105濃度(Cmax)，且1小時(shí)后嗅球和大腦中的濃度達(dá)到峰值。然后ESBA105的水平在所有腦區(qū)域中下降，但在6至12小時(shí)后其再度上升，從而在嗅球、小腦和腦干中產(chǎn)生明顯的第二、較低水平的濃度峰(圖1)，這顯示可能存在兩個(gè)不同的遷移途徑。在嗅球和腦干中測(cè)量到最高濃度。在通過(guò)嗅覺(jué)系統(tǒng)(嗅神經(jīng))連接至鼻腔的嗅球中，濃度在9455ng/ml處達(dá)到極點(diǎn)。在通過(guò)周?chē)嫔窠?jīng)系統(tǒng)(三叉神經(jīng))連接至鼻道的腦干中濃度甚至更高(11067ng/ml)(表2)。大腦中的Cmax(975ng/ml)稍微延遲O小時(shí))，并且分別為小腦或嗅球中的大約1/7至1/10。這些結(jié)果證明，ESBA105首先到達(dá)嗅球和腦干并且由此分配至大腦和小腦。與腦干和小腦類(lèi)似，在第一次施用ESBA105后1小時(shí)達(dá)到血清中的Cmax并且其在5至10小時(shí)之間第二次達(dá)到峰值。有趣地，ESBA105的水平在最后12小時(shí)中幾乎保持恒定(圖1)。實(shí)施例3ESBA105至CNS的遞送是直接的本實(shí)施例證明，ESBA105的鼻內(nèi)施用導(dǎo)致至CNS的直接遞送而非通過(guò)血流遞送。為確定ESBA105是從鼻腔通過(guò)BBB直接遷移至CNS還是通過(guò)全身性吸收和隨后跨BBB遞送間接遷移至腦，如上所述將鼻內(nèi)施用與靜脈內(nèi)注射平行比較。在靜脈內(nèi)注射后，相當(dāng)高濃度的ESBA105到達(dá)所有分析的區(qū)域，除了大腦(其中濃度低于定量的下限)。然而，在鼻內(nèi)施用后在所有腦區(qū)域中測(cè)量到高得多的藥物濃度(圖幻。在鼻內(nèi)給藥后小腦和腦干中的最高ESBA105水平為靜脈內(nèi)注射之后的最高水平的大約10至18倍。此外，鼻內(nèi)施用后嗅球中的Cmax為靜脈內(nèi)施用的60倍高(表3)。令人驚訝地，雖然對(duì)于兩個(gè)途徑都將給藥設(shè)置為產(chǎn)生相似的全身性暴露，但在鼻內(nèi)施用后血清濃度顯著更低(圖幻，達(dá)到6006ng/ml，而在靜脈內(nèi)注射后Cmax為10倍高(63709ng/ml)(表；3)。在靜脈內(nèi)注射后，嗅球、小腦和腦干中的最大濃度(Cmax)和暴露(AUC)達(dá)到相似的值，對(duì)于Cmax分別為202、257和174ng/ml，對(duì)于AUC分別為448、567和416ng-h/ml。在靜脈內(nèi)注射后腦組織中的Cmax出現(xiàn)在2小時(shí)處，并且在4小時(shí)時(shí)未能檢測(cè)到ESBA105。相反地，在鼻內(nèi)施用后，在所有腦區(qū)域中都測(cè)量到明顯更高的濃度。對(duì)于嗅球獲得最高值(Cmax:12586ng/ml；AUC:23130ng-h/ml)，然后是腦干(Cmax:3169ng/ml；AUC:7942ng_h/ml)、小腦(Cmax:2819ng/ml；AUC:5908ng_h/ml)和大腦(Cmax:1831ng/ml；AUC:2951ng-h/ml)。此外，與靜脈內(nèi)注射不同，在鼻內(nèi)施用后4小時(shí)在所有腦區(qū)域中仍然存在可檢測(cè)濃度的ESBA105。這些結(jié)果證明，ESBA105能夠從血液穿過(guò)BBB進(jìn)入CNS，并且最有效的遞送途徑是經(jīng)由鼻內(nèi)施用(表3)。實(shí)施例4PZ-肽促進(jìn)ESBA105穿過(guò)BBB的遞送本實(shí)施例證明，Pz-肽顯著增強(qiáng)scFv至CNS的鼻內(nèi)遞送。特別地，通過(guò)將3mMPz-肽加入至ESBA105，然后估量至腦的運(yùn)輸來(lái)檢查Pz-肽用作運(yùn)輸藥物通過(guò)BBB的滲透增強(qiáng)劑的能力。在Pz-肽存在的情況下，嗅球、大腦和小腦中的Cmax比使用單獨(dú)的ESBA105更早出現(xiàn)(在第一次給藥后1小時(shí)而非2小時(shí))(表4)。此外，Pz-肽的添加導(dǎo)致嗅球和大腦中的Cmax增加2至3倍(分別地，7309至15786ng/ml和1133至3417ng/ml)，而腦干中的Cfflax保持未變。與單獨(dú)施用ESBA105的情況相比較，在共施用ESBA105和I^z肽的情況下，嗅球和大腦中的Cmax的組織對(duì)血液的比率顯著更高(圖3A)。然而對(duì)至小腦、腦干和血清的遞送的影響較不顯著。概括而言，Pz-肽可增強(qiáng)大分子量蛋白質(zhì)至嗅球和大腦的遞送而不增加全身性暴露(圖幻。因此，對(duì)于治療性應(yīng)用，Pz-肽可增強(qiáng)藥物遞送而不增加全身性副作用的風(fēng)險(xiǎn)(表4)。表1施用方案和在0.3%伊文斯藍(lán)染料的鼻內(nèi)遞送后染料的存在。權(quán)利要求1.包含結(jié)合抗原的多肽和滲透增強(qiáng)劑的組合物。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述滲透增強(qiáng)劑是I3Z-肽或FMOC-肽。3.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中所述結(jié)合抗原的多肽是免疫結(jié)合劑。4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述免疫結(jié)合劑是scFv。5.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的組合物，其中所述結(jié)合抗原的多肽特異性結(jié)合靶抗原特別是TNFa，所述靶抗原選自TNF-a、β淀粉樣蛋白、β淀粉樣蛋白衍生的可擴(kuò)散配體受體、單胺氧化酶-B、L-3，4-二羥苯丙氨酸脫羧酶、乙酰輔酶A羧化酶、N-甲基-D-天冬氨酸受體(也稱為GRim)、GRINA、GRIN2D、GRIN2C、GRIN;3B、GRIN2A、GRIN2B、GRIN3AJiKHl受體、毒蕈堿受體(也稱為CHRM1)、CHRM2、CHRM3、CHRM4、下丘泌素受體1、下丘泌素受體2、5-羥色胺(也稱為HTR1A)、多巴胺受體(也稱為DRD1)、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5、腎上腺素能β1受體、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NET)和多巴胺D2受體。6.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中所述scFv包含與SEQIDNo20,SEQIDNo21,SEQIDNo:22、SEQIDNo23,SEQIDNo24,SEQIDNo25,SEQIDNo26或SEQIDNo27具有至少80%的相似性的氨基酸序列。7.權(quán)利要求5的組合物，其中所述scFv包含VH結(jié)構(gòu)域，所述VH結(jié)構(gòu)域包含與SEQIDNo:6、SEQIDNo:7、SEQIDNo:8、SEQIDNo:9、SEQIDNo10或SEQIDNo35具有至少80%的相似性的氨基酸序列。8.權(quán)利要求5或7的組合物，其中所述scFv包含VL結(jié)構(gòu)域，所述VL結(jié)構(gòu)域包含與SEQIDNo:11、SEQIDNo:12、SEQIDNo:13、SEQIDNo:14、SEQIDNo15或SEQIDNo34具有至少80%的相似性的氨基酸序列。9.權(quán)利要求5、7或8的任一項(xiàng)的組合物，其中所述scFv包含與SEQIDNo:1、SEQIDNo2,SEQIDNo:3、SEQIDNo:4、SEQIDNo:5或SEQIDNo:33具有至少80%的相似性的氨基酸序列。10.權(quán)利要求5、7或8的任一項(xiàng)的組合物，其中所述scFv還包含與SEQIDNO16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:36或SEQIDNO:37具有至少80%的相似性的氨基酸序列。11.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中將所述結(jié)合抗原的多肽共價(jià)連接至所述滲透增強(qiáng)劑。12.前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其中所述滲透增強(qiáng)劑促進(jìn)結(jié)合抗原的多肽至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的選擇性鼻內(nèi)遞送。13.包括結(jié)合抗原的多肽、滲透增強(qiáng)劑和使用說(shuō)明書(shū)的試劑盒。14.權(quán)利要求1至12的任一項(xiàng)的組合物，其用作藥物。15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述藥物用于治療、預(yù)防或延遲神經(jīng)病癥的進(jìn)展。16.權(quán)利要求1至12的任一項(xiàng)的組合物用于制造藥物的用途，所述藥物用于治療、預(yù)防或延遲神經(jīng)病癥的進(jìn)展。17.權(quán)利要求15的組合物或權(quán)利要求16的用途，其中所述病癥選自偏頭痛、抑郁癥、阿爾茨海默氏病、帕金森病、精神分裂癥、癲癇、中風(fēng)、腦膜炎、肌萎縮側(cè)索硬化、失眠、腦膜炎、記憶缺陷、多發(fā)性硬化、發(fā)作性睡病、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷和應(yīng)激。全文摘要本發(fā)明提供了增強(qiáng)大的大分子(即，大于10kDa)(例如結(jié)合抗原的多肽)穿過(guò)緊密連接的遞送的組合物和方法。此類(lèi)方法和組合物對(duì)于通過(guò)鼻內(nèi)施用將治療性結(jié)合抗原的多肽遞送至CNS以治療神經(jīng)病癥特別有用。文檔編號(hào)A61K39/00GK102088958SQ200980126247公開(kāi)日2011年6月8日申請(qǐng)日期2009年7月10日優(yōu)先權(quán)日2008年7月10日發(fā)明者D·厄里什,E·弗爾,V·胡爾曼-考提爾申請(qǐng)人:艾斯巴技術(shù),愛(ài)爾康生物醫(yī)藥研究裝置有限責(zé)任公司