專利名稱：由iPS細胞制備血小板的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種由iPS細胞(誘導性多潛能干細胞)制備血小板的方法。
背景技術：
對于以白血病為代表的血液相關疾病的治療，使必要量的血細胞穩(wěn)定地擴增、供 給，對于治療是非常重要的，因此迄今為止由許多研究者嘗試了造血干細胞或造血前體細 胞的有效擴增的研究。在血細胞中，巨核細胞是血小板前體細胞(proplatelet)進而言之 是產(chǎn)生血小板的細胞，在治療上占有重要的位置。在血細胞中，血小板是血液凝固(止血)所必需的細胞，因此在白血病、骨髓移殖、 抗癌治療等中血小板的需求極高。迄今為止，一直采用由捐獻者獻血而獲取的方法來供給 血小板。然而，利用來自捐獻者的獻血而采取的方法由于長期的捐獻者不足、無法冷凍所獲 取的血小板等，而難以實現(xiàn)穩(wěn)定的血小板供給。另外，除了利用來自捐獻者的獻血而采取的 方法以外，嘗試了給予患者TP0的方法、由臍帶血或骨髓細胞分化巨核細胞的方法等，但是 給予患者TP0的方法由于在給予TP0后產(chǎn)生對TP0的抗體而使其無效，因而該方法尚未實 用化。進而，采用由臍帶血或骨髓細胞分化巨核細胞的方法也只能夠得到極少數(shù)成為巨核 細胞來源的造血干細胞，因此仍不是適于提供穩(wěn)定的血小板的方法。近年來，作為在生物體外制備血小板的方法，報告使由ES細胞誘導的造血干細胞 或造血前體細胞有效地向巨核細胞和血小板分化的方法等。Eto等人明確了通過將小鼠ES 細胞與0P9基質(zhì)細胞一起共培養(yǎng)從而分化誘導成巨核細胞(非專利文獻1)。Fujimoto等 人報道了采用與Eto等人同樣的方法確認誘導的血小板(非專利文獻2)。另外，還有由猴 子的ES細胞成功分化誘導出巨核細胞的報道(非專利文獻3)；也有由人的ES細胞成功分 化誘導出巨核細胞的報道(非專利文獻4)。但是，無論哪種方法都沒有確認血小板的釋放。 另外，即使在確立了由ES細胞取得血小板的方法是可用于臨床的程度的情況下，在通過輸 血將由ES細胞誘導的血小板用于患者時(特別是在初次輸血未發(fā)現(xiàn)問題，但同一患者多次 接受輸血的情況下)，仍然存在人白血球型抗原(HLA)適合性的問題。iPS細胞(誘導性多潛能干細胞)也稱作人工多能性干細胞或誘導多能性干細胞， 是通過向成纖維細胞等的體細胞導入多種轉(zhuǎn)錄因子基因，獲得與ES細胞相同的分化多能 性的細胞。根據(jù)Yamanaka等人，小鼠的iPS細胞以在維持分化多能性中重要的Nanog基因的 表達為指標，通過向小鼠成纖維細胞導入0ct3/4、SoX2、Klf4、c-Myc的4種基因，初次得 到確立(非專利文獻5)。之后也有報告通過同樣的方法確立小鼠iPS細胞(非專利文獻 6、非專利文獻7)。進一步，為了克服iPS細胞的癌化問題，有報告只以c-Myc基因以外的3 種基因(0ct3/4、SoX2、Klf4)就可以確立iPS細胞(非專利文獻8)。另一方面，對于人的iPS細胞，Thomson等人將0CT3/4、S0X 2、NAN0G、LIN28導入 人的成纖維細胞，確立iPS細胞(非專利文獻9)。另外，Yamanaka等人將0CT3/4、S0X2、 KLF4、c-MYC導入人的成纖維細胞，同樣地確立iPS細胞(非專利文獻10)。
非專利文獻1 :Eto 等，Proc. Acad. Sci.USA2002，99 12819-12824。非專利文獻2 :Fujimoto 等，Blood 2003，102 :4044_4051。非專利文獻3 :Hiroyama 等，Exp. Hematol. 2006，34 :760_769。非專利文獻4 :Gaur 等，J Thromb Haemost. 2005,4 :436_442。非專利文獻5 :0kita 等，Nature 2007,448:313-317。非專利文獻6 :Wernig 等，Nature 2007,448:318-324。非專利文獻7 :Maherali 等，Cell Stem Cell2007,1 :55_70。非專利文獻8 :Nakagawa 等，Nat Biotechnol2008，26 101-106。非專利文獻9 :Yu 等，Science 2007，318 1917-1920。非專利文獻10 :Takahashi 等，Cell 2007，131 :861_872。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已經(jīng)確立了由ES細胞有效地取得巨核細胞和血小板的方法，但在使用 ES細胞時，使用的ES細胞不同，巨核細胞和血小板的誘導效率也不同。如果能早期進行巨 核細胞和血小板的誘導效率優(yōu)異的ES細胞的選定，則可以實現(xiàn)巨核細胞和血小板取得效 率的穩(wěn)定化，使效率進一步提高，但現(xiàn)實情況是，難以發(fā)現(xiàn)至最終得到巨核細胞、血小板為 止優(yōu)異的ES細胞。因此，本發(fā)明人鑒于上述情況，首先，以確立由iPS細胞取得巨核細胞和血小板的 方法為課題，進而，以確立可以穩(wěn)定化巨核細胞和血小板的取得效率的方法為課題。此次，發(fā)明人為了解決上述課題，經(jīng)過深入地研究，嘗試由iPS細胞誘導巨核細胞 和血小板，確立其誘導方法。在該誘導中，在iPS細胞中，發(fā)現(xiàn)源自相同批次的細胞具有異 種特性，嘗試由該異種細胞群落選擇可以早期有效地誘導巨核細胞和血小板的細胞。結果， 發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出一定特征的細胞克隆，例如形成更多網(wǎng)狀結構的克隆的巨核細胞、血小板的誘 導效率優(yōu)異，通過選擇該細胞進行分化誘導，可以穩(wěn)定且有效地誘導巨核細胞或血小板。S卩，本發(fā)明涉及由iPS細胞制備巨核細胞和血小板的方法，具體的是，涉及以下 (1) (16)。(1)本發(fā)明的第1方式為，“一種內(nèi)含造血前體細胞的網(wǎng)狀結構物，其是將源自人 的iPS細胞播種于飼養(yǎng)層細胞(” 4 一夕'一細胞)上，在適于造血前體細胞分化誘導的條 件下培養(yǎng)而得到的”。(2)本發(fā)明的第2方式為，“上述(1)所述的網(wǎng)狀結構物，其中，所述適于造血前體 細胞分化誘導的條件是在VEGF存在下培養(yǎng)14 17天”。(3)本發(fā)明的第3方式為，“上述⑴或⑵所述的網(wǎng)狀結構物，其特征在于，所述 飼養(yǎng)層細胞是C3H10T1/2細胞或0P9細胞”。(4)本發(fā)明的第4方式為，“一種產(chǎn)生血細胞的方法，其中，選擇上述⑴ (3) 中任一項所述的網(wǎng)狀結構物的產(chǎn)生能力高的iPS細胞克隆，將形成該iPS細胞克隆產(chǎn)生的 網(wǎng)狀結構物的隔壁的細胞與造血前體細胞分離，將得到的造血前體細胞播種于飼養(yǎng)層細胞 上，在適于血細胞分化誘導的條件下培養(yǎng)，而產(chǎn)生血細胞”。(5)本發(fā)明的第5方式為，“上述(4)所述的方法，其特征在于，所述血細胞是巨核 細胞和血小板”。
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(6)本發(fā)明的第6方式為，“上述(5)所述的方法，其中，所述適于血細胞分化誘導 的條件是在TP0存在下培養(yǎng)7 9天”。(7)本發(fā)明的第7方式為，“上述(5)所述的方法，其中，所述適于血細胞分化誘導 的條件是在TPO、SCF和肝素存在下培養(yǎng)7 9天”。(8)本發(fā)明的第8方式為，“采用上述(5) (7)中任一項所述的方法產(chǎn)生的巨核 細胞和/或血小板”。(9)本發(fā)明的第9方式為，“一種血液制劑，其以采用上述(5) (7)中任一項所 述的方法產(chǎn)生的血小板為有效成分”。(10)本發(fā)明的第10方式為，“一種產(chǎn)生血細胞的方法，通過將源自小鼠的iPS細 胞進行液體培養(yǎng)，在胚狀體內(nèi)部形成造血前體細胞，進一步培養(yǎng)該胚狀體，而產(chǎn)生血細胞”。(11)本發(fā)明的第11方式為，“上述(10)所述的方法，其特征在于，所述血細胞是 巨核細胞和血小板”。(12)本發(fā)明的第12方式為，“上述(10)或(11)所述的方法，進一步培養(yǎng)所述胚 狀體的期間是5 7天”。(13)本發(fā)明的第13方式為，“上述(10) (12)中任一項所述的方法，進一步培 養(yǎng)所述胚狀體的條件是在TP0和SCF存在下培養(yǎng)3 5天”。(14)本發(fā)明的第14方式為，“采用上述(10) (13)中任一項所述的方法產(chǎn)生的 巨核細胞和/或血小板”。(15)本發(fā)明的第15方式為，“一種血液制劑，其以采用上述(10) (13)中任一 項所述的方法產(chǎn)生的血小板為有效成分”。(16)本發(fā)明的第16方式為，“一種試劑盒，用于通過上述⑷ (7)和上述(10) (13)中任一項所述的方法制備血小板”。本發(fā)明通過使用源自iPS細胞(特別是人iPS細胞)的巨核細胞和血小板的誘導 方法，與使用ES細胞時相比，可以穩(wěn)定且有效地誘導巨核細胞和血小板。根據(jù)本發(fā)明的方法，由于可以制備保持了需要輸血等的患者的基因特征的、患者 專用的血細胞，因此可以克服人白血球型抗原(HLA)的適合性問題。另外，可以避免在臨床 現(xiàn)場由有問題的自身以外的HLA型血液的混入導致的產(chǎn)生抗血小板抗體。另外，如果使用本發(fā)明的方法，則可以在生物體外有效地取得期望的血細胞。特別 是，對于人，可以比較大量且有效地進行特定個人專用的血小板的產(chǎn)生。而且，如果使用本發(fā)明的方法，則可以實現(xiàn)以血小板為有效成分的血液制劑的穩(wěn) 定的供給。


圖1是表示由小鼠iPS細胞誘導血小板的過程的示意圖。圖2表示將源自小鼠iPS細胞的作為培養(yǎng)第10天的血小板前體細胞的巨核細胞 進行細胞離心后，進行吉姆薩染色(A)和通過AleXa488-毒傘素、DAPI、抗⑶41抗體和抗 GPIba抗體進行免疫染色(利用Alexa647的雙染色法)(B)的結果。(B)的⑶41表示⑶41 陽性細胞的染色圖像，GPIba表示GPIba的陽性細胞的染色圖像。圖3表示源自小鼠iPS細胞的培養(yǎng)第14天的血小板前體的相差顯微鏡圖像(A)
5和利用Alexa647將通過Alexa488_毒傘素、抗CD41抗體和抗GPIba進行免疫染色(B) 進行雙染色的結果。(B)的⑶41/F-肌動蛋白表示利用抗⑶41抗體(Alexa647、紅)/ Alexa488 (綠)-毒傘素進行雙重染色的結果，GPIb a /F_肌動蛋白表示利用抗GPIb a抗體 (Alexa647、紅)/AleXa488 (綠)-毒傘素進行雙重染色的結果。圖4表示由小鼠iPS細胞培養(yǎng)第14天誘導的血小板的電子顯微鏡圖像。圖5表示利用流式細胞儀分析源自小鼠iPS細胞的培養(yǎng)第10天(上圖)和培養(yǎng) 第14天(下圖)的細胞的結果。圖6觀察源自小鼠iPS細胞的血小板對于凝血酶的形態(tài)變化?；厥张囵B(yǎng)第14天 的上清液，用纖維蛋白原涂布添加至培養(yǎng)皿后，加入血小板活性刺激藥(凝血酶)進行刺激 (上圖)。示出利用凝血酶將由iPS細胞制作的血小板完全伸展可以有助于穩(wěn)定血栓的形 態(tài)(下圖)。結果示出利用抗Allb抗體(利用Alexa647的2次染色)和Alexa488-毒傘 素的染色圖像(下圖)。圖7表示由人iPS細胞(201B6株)形成Sac結構物，進一步誘導巨核細胞和血小 板的過程。上圖表示培養(yǎng)過程的示意圖，下面的各照片表示在培養(yǎng)過程中誘導的iPS-Sac、 巨核細胞。下面的照片由左起分別表示培養(yǎng)第0天的未分化狀態(tài)的iPS細胞(利用相差顯 微鏡的觀察圖像)、由iPS細胞誘導的iPS-Sac (培養(yǎng)后第17天的觀察圖像)、巨核細胞(培 養(yǎng)第23 24天吉姆薩染色后的觀察圖像)。圖8表示iPS-sac的免疫染色圖像。iPS-sac與ES_sac相同，由CD31陽性、VEGF-R2 陽性的內(nèi)皮細胞構成。圖9表示比較人iPS細胞克隆之間的iPS-sac誘導效率的結果。測量含有培養(yǎng) 第15天的血細胞前體細胞的Sac的數(shù)量(圖的縱軸)。即使是源自相同批次的皮膚的人 iPS細胞株(TkDA3-l、2、4、5、9、20)也發(fā)現(xiàn)分化能力有差別。TkDA3_l、2、4、5、9、20 (在東 京大學建立)是由源自相同的皮膚細胞的4因子(0ct3/4、SoX2、Klf4、c-Myc)制成的人 iPS細胞，TkDN4-M(在東京大學建立)是由源自皮膚細胞的3因子(除c-Myc以外)制成 的人iPS細胞，201B6.201B7 (在京都大學建立)是由源自皮膚細胞的4因子制成的人iPS 細胞、253G1、253G4(在京都大學建立)是由源自皮膚細胞的3因子制成的人iPS細胞。另 外，KhES-3是作為對照使用的血細胞分化能力高的人ES細胞株。圖10表示由圖9所示的iPS細胞中使用Sac形成能力不同的克隆，分析血小板誘 導能力的結果。圖11是源自人ES細胞和人iPS細胞的造血前體細胞的表面抗原分析結果。比 較源自人ES細胞(上段)的血液前體細胞和源自分化能力高的TkDN4-M(3因子中段)、 TkDA3-4(4因子中段)的血液前體細胞。作為未分化的血液/血管內(nèi)皮的共通標記的⑶31 陽性/CD34陽性細胞的頻率和作為巨核細胞前體細胞的標記的CD34陽性/CD41a陽性細胞 與ES細胞同樣地表達。圖12是源自人iPS細胞的血細胞集落的分析。播種于甲基纖維素半固體培養(yǎng)基， 比較源自TkDN4-M(3因子)、TkDA3-4(4因子)的血液前體細胞的血細胞分化能力。左圖 是代表性的各血細胞系的吉姆薩染色圖像。右圖表示集落形成細胞的頻率(縱軸為源自 1X104血細胞前體細胞的集落數(shù))。只有TkDA3-4形成母細胞狀集落(左圖的右下圖)，但 分化為其它血細胞的能力相同。
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圖13表示用流式細胞儀分析培養(yǎng)后第17 18天的培養(yǎng)液中的浮游細胞成分的 結果。X軸為CD41a，Y軸分別為CD42b、CD42a、CD9。由左側開始表示KhES-3 (人ES細胞)、 253G4(3因子人iPS細胞)、TkDN4_M(3因子人iPS細胞)、TkDA3_4(4因子人iPS細胞)。 與源自人ES細胞的巨核細胞相同地表達作為成熟巨核細胞標記的⑶42a、⑶42b。圖14表示源自人iPS細胞的血小板的表面抗原分析結果。使用流式細胞儀分析培 養(yǎng)第24天釋放至培養(yǎng)上清液中的血小板。X軸為⑶41a，Y軸分別為⑶42b、⑶42a、⑶9。由 左側開始表示末梢血血小板、源自KhES-3 (人ES細胞)的血小板、源自253G4 (3因子人iPS 細胞)的血小板、源自TkDN4-M(3因子人iPS細胞)的血小板、源自TkDA3-4(4因子人iPS 細胞)的血小板。與源自末梢血的血小板相同地，表達作為血小板重要功能分子的⑶41a、 ⑶42a、⑶9。另一方面，對于⑶42b，源自人ES細胞和人iPS細胞的血小板一部分表達降低 (上段圖)。圖15表示源自巨核細胞的血小板釋放形態(tài)的觀察圖像。用Alexa488結合抗⑶41a 抗體將培養(yǎng)后第17 18天后的浮游細胞染色，利用熒光顯微鏡進行觀察(右圖)。左圖是 通過使用差分干涉測量法的明視野的觀察圖像。圖16表示源自人末梢血、人ES細胞和人iPS細胞的血小板和源自人iPS細胞的 巨核細胞的電子顯微鏡圖像。在源自人ES細胞和人iPS細胞的血小板中，與末梢血相同地 保持含有各種血小板的生理活化物質(zhì)的顆?；蜓“宓奈⒐芙Y構。圖17表示源自人iPS細胞的血小板的功能分析(內(nèi)向外的信號)的結果。上圖 代表性的FACS圖像。源自人iPS細胞的血小板(下段)與源自人ES細胞的血小板(上 段)相同地，通過生物體內(nèi)重要的血小板活化物質(zhì)ADP而確認整合蛋白的活化(PAC1抗體 陽性血小板增加)。下圖與源自人ES細胞的血小板(白色棒圖)相同地，源自人iPS細 胞的血小板(黑色棒圖)由低濃度的ADP(5yM)反應，反應以用量依賴性地增加。還確認 與作為其它活性物質(zhì)的凝血酶的反應。無激動劑無ADP的結果。
具體實施例方式本發(fā)明的實施方式之一為，將iPS細胞播種于飼養(yǎng)層細胞上，在適于造血系細胞 分化誘導的條件下培養(yǎng)而得到的、內(nèi)含造血前體細胞的網(wǎng)狀結構物(sac)。由于該網(wǎng)狀結 構物中造血前體細胞被濃縮而存在，因此能夠在活體外有效地分化誘導各種血細胞。此處 所謂“網(wǎng)狀結構物”，是源自ES或iPS細胞的立體的囊狀(在內(nèi)部伴有空間)結構體，以內(nèi) 皮細胞集團等方式形成，在內(nèi)部含有血液前體細胞。對于網(wǎng)狀結構物的詳細內(nèi)容，例如參照 TAKAYAMA等，BLOOD 2008，111 :5298_5306。在此所謂“iPS細胞”，也稱為人工多能性干細胞 或誘導多能性干細胞，是通過向成纖維細胞等的體細胞導入多種轉(zhuǎn)錄因子基因，獲得與ES 細胞相同的分化多能性的細胞。其中，作為獲得分化多能性所必需的轉(zhuǎn)錄因子基因，例如， 已知 Nanog、0ct3/4、SoX2、Klf4、c-Myc、Lin28 等。在這些基因中，通過以 0ct3/4、SoX2、 Klf4、c-Myc 的組合，0ct3/4、SoX2、Nanog、Lin28 的組合，0ct3/4、SoX2、Klf4 的組合將選 擇的基因?qū)氤衫w維細胞等的體細胞，可以建立iPS細胞。在本發(fā)明使用的iPS細胞不論 其建立方法，除了用上述導入基因的方法建立的細胞以外，還可以是通過導入與上述不同 的基因的建立方法、通過使用蛋白質(zhì)或低分子化合物等的建立方法得到的iPS細胞。另外，作為“飼養(yǎng)層細胞”，只要是有助于ES細胞或iPS細胞分化誘導的細胞就可
7以使用，可以使用例如小鼠胚胎成纖維細胞、優(yōu)選C3H10T1/2細胞株、0P9細胞等。使用“飼 養(yǎng)層細胞”時，例如可以照射放射線等來抑制細胞的增殖。作為iPS細胞的培養(yǎng)條件，可以選擇適合于用于制備網(wǎng)狀結構物(以下，也稱為 iPS-Sac)的條件。該培養(yǎng)條件根據(jù)使用的iPS細胞的生物種類而異。列舉一個例子，在源 自人的iPS細胞的情況中，作為培養(yǎng)基，使用添加了最終濃度為15%的FBS的IMDM，在其它 無血清情況下還可以使用添加了適當增殖因子和補充物等的培養(yǎng)基。進而，為了有效地由 源自人的iPS細胞形成網(wǎng)狀結構物，例如可以添加VEGF 0 lOOng/ml左右、更優(yōu)選20ng/ ml左右。另外，作為培養(yǎng)環(huán)境，根據(jù)使用的iPS細胞的不同而不同，但例如可以使用5% C02、 36 38°C、優(yōu)選37°C的條件。直至形成網(wǎng)狀結構物的培養(yǎng)期間根據(jù)使用的iPS細胞的不同 而不同，但例如由播種到飼養(yǎng)層細胞上開始，大約14 17天后可以確認其存在。形成的網(wǎng)狀結構物形成濾胞狀結構，由作為中胚葉細胞的標記之一的Flkl (fetal liver kinase 1)、CD31、CD34 或 UEA-I 凝集素(Ulex europaeus. agglutinin-1)陽性細胞 構成隔壁。在該網(wǎng)狀結構物的內(nèi)部，造血前體細胞以濃縮的狀態(tài)存在。將由存在于網(wǎng)狀結 構物內(nèi)部的造血前體細胞分化誘導各種血細胞時，必須從構成隔壁的細胞等分離造血前體 細胞。該分離優(yōu)選采用物理方法進行。例如，通過流通過滅菌后的篩狀器具(例如細胞濾 器等)，可以將隔壁細胞和造血前體細胞分離。本發(fā)明進一步的實施方式是，由從網(wǎng)狀結構物分離的造血前體細胞產(chǎn)生各種血細 胞的方法。將所得的造血前體細胞播種到飼養(yǎng)層細胞上，在適于所需血細胞分化誘導的條 件下進行培養(yǎng)。此處所謂“適于血細胞分化誘導的條件”，根據(jù)目標血細胞的種類，可以列舉 例如添加 TPO、IL-1 a、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、EPO、GM-CSF、SCF、G-CSF、Flt3 配體、肝素等中的任意一個或它們中的2種以上的組合的條件。在分化誘導巨核細胞和血 小板時，例如可以在TP0 (10 200ng/mL，優(yōu)選100ng/mL左右)存在下，或者在TP0 (10 200ng/mL,優(yōu)選 100ng/mL 左右)、SCF(10 200ng/mL，優(yōu)選 50ng/mL 左右)和肝素(10 100U/mL，優(yōu)選25U/mL左右)存在下，培養(yǎng)7 15天左右。作為培養(yǎng)環(huán)境，只要是適于在活 體外進行血細胞的分化誘導的環(huán)境即可，例如，在5% C02、36 38°C、優(yōu)選37°C的條件下 實施培養(yǎng)。另外，由iPS細胞特別是源自人的iPS細胞產(chǎn)生巨核細胞、血小板時，上述網(wǎng)狀結 構物的產(chǎn)生效率根據(jù)iPS細胞克隆而異，因此預先選擇網(wǎng)狀結構物產(chǎn)生效率高的iPS細胞 克隆，由該iPS細胞克隆產(chǎn)生的網(wǎng)狀結構物產(chǎn)生巨核細胞、血小板等的各種血細胞，由此可 以更有效地制備多種血細胞(參考圖9)。其中，作為網(wǎng)狀結構物產(chǎn)生效率“高”的iPS細胞 克隆，可以選擇網(wǎng)狀結構物的形成數(shù)例如為每1X105細胞10以上，優(yōu)選為15以上的克隆。本發(fā)明的其它實施方式是，由來自小鼠iPS細胞形成胚狀體(含有分化誘導的中 胚葉系未分化細胞的細胞集團)，進一步誘導巨核細胞和血小板的方法。在小鼠ES細胞情 況中，不與0P9細胞等的飼養(yǎng)層細胞進行共同培養(yǎng)也能形成胚狀體，向中胚葉系未分化細 胞分化誘導。在小鼠iPS細胞的情況中，在與小鼠ES細胞的情況相同的條件下可以誘導中 胚葉系未分化細胞。作為此時的培養(yǎng)條件，例如，作為培養(yǎng)基，根據(jù)使用的iPS細胞而異，但 可以使用添加了 FBS、人鐵傳遞蛋白等的IMDM，加入了其它適當補充物等的培養(yǎng)基。另外， 作為培養(yǎng)環(huán)境，根據(jù)使用的iPS細胞而異，但例如可以使用5% C02、36 38°C、優(yōu)選37°C的 條件。直至形成胚狀體的培養(yǎng)期間根據(jù)iPS細胞的不同而異，但例如大約6 9天后可以確認其存在。接著，在適合于胚狀體分化誘導血細胞的條件下進行培養(yǎng)，可以誘導巨核細胞和 血小板。此處所謂“適于血細胞分化誘導的條件”，可以列舉例如添加TPO、IL-Ia、IL-3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-ll、EP0、GM-CSF、SCF、G-CSF、Flt3 配體、肝素等中的任意一個或 它們中的2種以上的組合的條件。在分化誘導巨核細胞和血小板時，例如可以將ΤΡ0(10 200ng/mL)、SCF(1 200ng/mL)、IL-6 (1 100ng/mL 左右)、IL-Il (1 100ng/mL 左右) 等單獨或適當組合，在適當?shù)臅r期添加至培養(yǎng)基。由胚狀體開始培養(yǎng)后，約3 5天后誘導 巨核細胞，約7 9天后誘導血小板。作為培養(yǎng)環(huán)境，只要是適于在活體外進行血細胞的分 化誘導的環(huán)境即可，例如，在5% CO2,36 38°C、優(yōu)選37°C的條件下實施培養(yǎng)。進一步，在本發(fā)明的實施方式中，包含用于制備血小板的試劑盒。在該試劑盒 中，含有用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、血清、增殖因子等的補充物(例如，TPO、SCF、肝素、IL-6、 IL-Il等)、抗生素等。此外，還含有例如在制備源自人的血小板中，用于確認在網(wǎng)狀結構物 中存在的標記的抗體(例如，針對Flkl、⑶31、⑶34、UEA-I凝集素的抗體)等。在試劑盒 中所含的試劑、抗體等可在長期維持構成成分的有效活性、不由容器材質(zhì)導致吸附且不會 變質(zhì)這樣的任何種類的容器中供給。例如，密封的玻璃安瓿包含在氮氣這樣的中性且不反 應性氣體下包裝了的緩沖液。安瓿是由玻璃、聚碳酸酯、聚苯乙烯等的有機聚合物、陶瓷、金 屬、或者用于保持試劑的常用的其它任何種適當?shù)牟牧系葮嫵傻摹Ｑ“逵捎趯︻A防或改善白血病、骨髓移殖、抗癌劑治療時的血小板減少有效，因 此也可以將由本發(fā)明得到的血小板以制劑方式穩(wěn)定地供給。由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的血小板 通過回收由巨核細胞釋放的富含血小板的培養(yǎng)液部分(例如，在源自人的血小板情況中， iPS細胞培養(yǎng)后第22 28天左右)，使用白血球除去濾器(例如，可以由Terumo公司、旭 化成醫(yī)藥公司等購入)等進行巨核細胞、其它血細胞的去除，可以除去血小板以外的成分， 進行制備。當制備血液制劑時，考慮到血小板對保存是不穩(wěn)定的因素等，還可以含有有助于 使血小板穩(wěn)定化的其他成分。使血小板穩(wěn)定的條件可以選擇在該技術領域的專家所周知的 方法。更具體地說，所獲取的血小板(源自人ES細胞的洗凈后的血小板)例如可以采用以 下的方法進行制劑化。ACD-A溶液FFP (fresh frozen plasma ；由通過獻血得到的全血液制成，含有白蛋 白、凝固因子等血液成分以外的所有物質(zhì))以1 10的比例配制，照射15-50Gy的放射線 后在20-24°C振蕩并保存。ACD-A溶液用注射用水將檸檬酸鈉22g/檸檬酸Sg/葡萄糖22g 整體調(diào)整到1L。使用以上的方法時，作為血小板的濃度，優(yōu)選例如1 X IO9血小板/mL左右。此外，預 先 添 加 GM6001(a broad-range hydroxamic acid-based metalloprotease inhibitor) (Calbiochem公司，La Jolla,CA,USA)時，能夠預防伴隨著冷 凍保存和室溫保存中發(fā)生的血小板功能分子GPIb-V-IX、GPVI切斷的不活化。本發(fā)明人等 采用該方法確認能夠預防與小鼠ES細胞來源血小板相關的不活化。另外，作為使用人血小 板的與該血小板不活化相關的機理的參考論文，請參照Bergmeier，W et al. ,Cir Res 95: 677-683,2004 和 Gardiner, EE et al. , J Thrombosis and Haemostasis, 5 :1530_1537, 2007。此外，收納含有血小板制劑容器優(yōu)選玻璃這樣的避免活化血小板的材質(zhì)。
實施例以下給出實施例進一步詳細說明，但本發(fā)明并不受實施例的任何限定。1.源自小鼠iPS細胞的巨核細胞和血小板的誘導1-1.小鼠基質(zhì)細胞株0P9細胞的培養(yǎng)0P9細胞在添加了 15% FBS、2mM的L-谷氨酰胺、100U青霉素、0. lmg/mL鏈霉素的 α -最小必需培養(yǎng)基(α -MEM ；Invitrogen/GIBCO)中傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)基每天更換，為了使 細胞形態(tài)不發(fā)生變化，將由元代培養(yǎng)至傳代培養(yǎng)數(shù)為30次以內(nèi)的細胞用于實驗。1-2.小鼠Nanog-iPS細胞的培養(yǎng)使用添加了 15 % FBS,300 μ g/mL人鐵傳遞蛋白(Sigma)、4. 5mM單硫代甘 油(Sigma) ,50 μ g/mL 抗壞血酸(Sigma)、0· ImM 2-巰基乙醇(Invitrogen/GIBCO)、 2mM L-谷氨酰胺、IOOU 青霉素、0. lmg/mL 鏈霉素的 Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium(IMDM ；Invitrogen/GIBCO)在培養(yǎng)皿中(Sterilin 美國)培養(yǎng) Nanog-iPS 細胞 (Nature，448，313-317 (2007))(京都大學、山中伸彌博士提供)。在IOcm培養(yǎng)皿中相對于 IOmL培養(yǎng)液為2 X IO5個細胞數(shù)的條件下開始培養(yǎng)，嘗試形成胚狀體。1-3.巨核細胞、血小板的誘導將培養(yǎng)第6 7天產(chǎn)生的胚狀體用0. 25%胰蛋白酶處理后，在融合的0P9細胞上 以形成IX IO5個/孔的方式重新播種，在添加了 20ng/ml小鼠TPO (ρ印rotec)、lOng/ml SCF 的α MEM中進行培養(yǎng)(圖1)。培養(yǎng)10天后，誘導⑶41+GPIb α +成熟巨核細胞(圖2和圖5的上圖)，進一步，繼 續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)14天后，誘導⑶41+GPIb α +血小板(圖3和圖5下圖)。這樣誘導的血小板 具有與源自末梢血的血小板相同的形態(tài)特征(圖4)。在此，對得到的血小板的功能進行討論。將釋放了血小板的培養(yǎng)上清液添加至用 纖維蛋白原涂布了的培養(yǎng)皿中，用凝血酶進行刺激(圖6上圖)，血小板表現(xiàn)出特征性的細 胞伸展(圖6下圖)。由該結果可知，通過本發(fā)明的方法，可以由小鼠iPS細胞誘導具備與 生物體內(nèi)血小板相同特征的血小板。2.源自人iPS細胞的巨核細胞和血小板的誘導2-1.網(wǎng)狀結構物(iPS-Sacs)的制備在本實施例使用的細胞株201B6 (在皮膚細胞中導入0ct3/4、Klf4、So X 2和c_Myc 的細胞株，Cell, 131,861-872(2007))和 253G1 (在皮膚細胞中導入 0ct3/4、Klf4 和 SoX2 的細胞株，Nature Bioteh.，26，101-106 (2008))由京都大學山中伸彌博士提供。而且，使 用 TkDA3-l、TkDA3-2、TkDA3_4、TkDA3_5、TkDA3_9、TkDA3_20 (東京大學新建立的細胞株 (在皮膚細胞中導入0ct3/4、Klf4、SoX2和c-Myc的細胞株)和TkDM-M(在皮膚細胞中 導入0(^3/4、1(1€4和30\2的細胞株，東京大學建立)。另外，飼養(yǎng)層細胞使用由筑波理研 BioResource center提供的源自小鼠胎兒細胞、CSHIOTI/^細胞株，或者使用大阪大學醫(yī)學 部，仲野徹教授提供的0P9細胞株。在進行分化實驗前一天，在0. 明膠涂布化培養(yǎng)皿中 以形成6X 105/10cm培養(yǎng)皿的密度的方式播種C3H10T1/2細胞，，在分化實驗當天，為了終 止C3H10T1/2細胞的增殖，進行50Gy放射線照射，用作飼養(yǎng)層細胞。另外，在將0P9細胞用 作飼養(yǎng)層細胞時，在分化實驗前一天進行50Gy的放射線照射，重新播種后使用。人iPS細胞是在添加了 15% FBS(JRH BIOSCIENCES，美國)、2mM L-谷氨酰胺
10(Invitrogen)、ITS補充物(10 μ g/ml胰島素、5. 5mg/ml鐵傳遞蛋白、5ng/ml亞硒酸鈉) (Sigma)、50 μ g/mL 抗壞血酸(Sigma)、0· 45mMMTG (Sigma)、20ng/ml VEGF (R&D systems)的 IMDM(IMDM ；Invitrogen/GIBCO)中，播種于0P9細胞或CSHIOTI/^細胞上進行培養(yǎng)。培養(yǎng)后，在15 17天前后確認大量的在內(nèi)部含有血細胞狀細胞的網(wǎng)狀結構物 (圖 7，iPS-Sac)。iPS細胞克隆例如盡管使用4因子進行建立，但由于是異種(heterogeneity)的細 胞株，因此即使由相同的皮膚細胞作成，分化能力也各種各樣。因此，在人iPS細胞的情況 下，通過事先篩選(例如，選擇形成更多的網(wǎng)狀結構物的克隆等)，可以選擇適宜于分化的 克隆，可以容易地選擇更有效地分化誘導血細胞系細胞的克隆(參見圖9)。實際上，由圖 9所示的iPS細胞中選擇Sac形成能力不同的克隆，比較血小板誘導能力。具體的是，使用 IXlO5細胞的iPS細胞(TkDA3-4、TkDM-M和253G1)和ES細胞(KhES3)，測算最終得到的 血小板數(shù)量(圖10)。圖10表明，Sac形成能力高的iPS細胞(TkDA3-4、TkDN4_M)容易形 成含有大量血液前體細胞的Sac，最終的血小板數(shù)也增加。2-2.集落分析對網(wǎng)狀結構物中的造血前體細胞的細胞表面分子進行研究可知，作為未分化的血 液/血管內(nèi)皮的共通標記的⑶31陽性/⑶34陽性細胞的頻率與ES細胞相同，對于作為巨 核細胞前體細胞的標記的CD34陽性/CD41a陽性細胞，也與ES細胞的情況同樣地表達(圖 11)。另外，對于集落形成能力，與人ES細胞相同(圖12)，在由4因子產(chǎn)生的人iPS細胞株 TkDA3-4中，觀察到母細胞狀集落(blast-like，圖12)，暗示癌化(白血病化)的危險。2-3.巨核細胞/血小板的誘導接著，使用P-1000移液管，在相位差顯微鏡下挑出網(wǎng)狀結構物，使用70 μ m細胞 濾器，將血細胞和網(wǎng)狀結構物分離。重新將血細胞以2 3X IO4/孔播種到在6孔板上 準備的放射線照射后的C3H10T1/2細胞(6X105/6孔板1片)上，進一步在添加了 15% FBS (JRH BIOSCIENCES，美國)、2mML_ 谷氨酰胺(Invitrogen)、ITS 補充物(10 μ g/ml 胰 島素、5. 5mg/ml鐵傳遞蛋白、5ng/ml亞硒酸鈉)(Sigma)、50 μ g/ml抗壞血酸(Sigma)、 0. 45mMMTG(Sigma)、100ng/ml 人、50ng/ml SCF和 25U/ml 肝素的 IMDM(IMDM ； Invitrogen/GIBCO)中培養(yǎng)，誘導巨核細胞/血小板(圖7、圖8和圖15)。用流式細胞儀分析253G1 (京都大學株)、201B6 (京都大學株)、TkDA3_4 (東京大 學株)、TkDN4-M(東京大學株)細胞株培養(yǎng)后第23 24天的浮游細胞成分，研究細胞表面 抗原的特征，觀察巨核細胞、作為血小板特異性表面分子抗原的人CD41a(整合蛋白α lib) 和人CD42b (GPIba)、CD42a (GPIX)、CD9陽性細胞(圖13 巨核細胞，圖14 血小板)。另 外，還確認由巨核細胞釋放血小板時表現(xiàn)出的形態(tài)特征(圖15和圖16)。接著，對血小板活性物質(zhì)導致的整合蛋白的活化進行研究，確認源自人iPS細胞 的血小板(圖17上圖，下段)與源自人ES細胞的血小板(圖17下圖，上段)相同，由生物 體內(nèi)重要的血小板活化物質(zhì)ADP引起整合蛋白的活化(PAC1抗體陽性血小板的增加)。另 外，與源自人ES細胞的血小板(圖17下圖，白色棒圖)相同，源自人iPS細胞的血小板(圖 17下圖，黑色棒圖)由低濃度的ADP(5yM)反應，反應以用量依賴性地增加。進一步，還確 認與作為其它活性物質(zhì)的凝血酶的反應(圖17下圖，6)。由這些結果可知，由iPS細胞制 作的血小板發(fā)揮與源自人ES細胞的血小板相同的功能性。
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由以上結果可知，通過本發(fā)明的方法，可以有效地由人iPS細胞誘導巨核細胞和 血小板。產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明，可以提供能克服HLA適合性問題的血小板。因此，由于能夠供給必須 輸血的患者專用的血小板，因此還可以解決由抗血小板抗體產(chǎn)生導致的血小板破壞等的問題。
權利要求
一種內(nèi)含造血前體細胞的網(wǎng)狀結構物，其是將源自人的iPS細胞播種于飼養(yǎng)層細胞上，在適于造血前體細胞分化誘導的條件下培養(yǎng)而得到的。
2.根據(jù)權利要求1所述的網(wǎng)狀結構物，其中，所述適于造血前體細胞分化誘導的條件 是在VEGF存在下培養(yǎng)14 17天。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的網(wǎng)狀結構物，其特征在于，所述飼養(yǎng)層細胞是C3H10T1/2 細胞或0P9細胞。
4.一種產(chǎn)生血細胞的方法，其中，選擇權利要求1 3中任一項所述的網(wǎng)狀結構物的產(chǎn) 生能力高的iPS細胞克隆，將形成該iPS細胞克隆產(chǎn)生的網(wǎng)狀結構物的隔壁的細胞與造血 前體細胞分離，將得到的造血前體細胞播種于飼養(yǎng)層細胞上，在適于血細胞分化誘導的條 件下培養(yǎng)，而產(chǎn)生血細胞。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述血細胞是巨核細胞和血小板。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中，所述適于血細胞分化誘導的條件是在TP0存在下 培養(yǎng)7 9天。
7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中，所述適于血細胞分化誘導的條件是在TPO、SCF和 肝素存在下培養(yǎng)7 9天。
8.采用權利要求5 7中任一項所述的方法產(chǎn)生的巨核細胞和/或血小板。
9.一種血液制劑，其以采用權利要求5 7中任一項所述的方法產(chǎn)生的血小板為有效 成分。
10.一種產(chǎn)生血細胞的方法，其中，通過將源自小鼠的iPS細胞進行液體培養(yǎng)，在胚狀 體內(nèi)部形成造血前體細胞，進一步培養(yǎng)該胚狀體，而產(chǎn)生血細胞。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其特征在于，所述血細胞是巨核細胞和血小板。
12.根據(jù)權利要求10或11所述的方法，進一步培養(yǎng)所述胚狀體的期間是5 7天。
13.根據(jù)權利要求10 12中任一項所述的方法，進一步培養(yǎng)所述胚狀體的條件是在 TP0和SCF存在下培養(yǎng)3 5天。
14.采用權利要求10 13中任一項所述的方法產(chǎn)生的巨核細胞和/或血小板。
15.一種血液制劑，其以采用權利要求10 13中任一項所述的方法產(chǎn)生的血小板為有 效成分。
16.一種試劑盒，用于通過權利要求4 7和權利要求10 13中任一項所述的方法制 備血小板。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種通過體外培養(yǎng)體系由iPS細胞有效地制備成熟巨核細胞、血小板等血細胞的方法。本發(fā)明提供一種將iPS細胞播種于飼養(yǎng)層細胞上，在適于造血前體細胞分化誘導的條件下培養(yǎng)而得到的、內(nèi)含造血前體細胞的網(wǎng)狀結構物。另外，提供將該網(wǎng)狀結構物中內(nèi)含的造血前體細胞在適于血細胞分化誘導的條件下進一步培養(yǎng)，從而產(chǎn)生各種血細胞的方法。進一步，提供不通過網(wǎng)狀結構物而產(chǎn)生各種血細胞，特別是巨核細胞和血小板的方法。
文檔編號A61K35/14GK101981181SQ200980111520
公開日2011年2月23日 申請日期2009年4月1日 優(yōu)先權日2008年4月1日
發(fā)明者中內(nèi)啟光, 山中伸彌, 江藤浩之, 錦井秀和, 高山直也, 高橋和利 申請人:國立大學法人東京大學