專利名稱：一種胭脂樹低聚糖及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是從天然植物中提取的一種胭脂樹低聚糖及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
胭脂樹(Bixo orelIana)，亦稱紅木，為紅木科紅木屬速生小喬木，原產(chǎn)熱帶美洲 和西印度群島，主產(chǎn)于墨西哥、巴西、圭亞那和印度。從其小角錐狀種子的肉質(zhì)外種皮中提 取的黃橙色素稱為胭脂樹橙，一直是西方國家用于奶油、乳酪著色的主導(dǎo)品種。隨著糖鏈生 物學(xué)功能的揭示與認(rèn)識(shí)，糖生物學(xué)正成為一個(gè)新科學(xué)前沿，繼基因工程、蛋白質(zhì)工程之后， 糖工程已成為最引人注目的新生物技術(shù)學(xué)科，低聚糖的研究是糖工程中的主要組成部分。 功能性低聚糖作為新生理活性物質(zhì)，在疾病診斷與防治、營養(yǎng)與保鍵、植物生長及抗病、畜 牧養(yǎng)殖等方面的應(yīng)用倍受關(guān)注，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飲料、農(nóng)業(yè)各領(lǐng)域的重要產(chǎn)業(yè)。2007年1月16日，公眾營養(yǎng)改善OLIGO (低聚糖)項(xiàng)目在北京正式啟動(dòng)。這是自 2006年“推進(jìn)公眾營養(yǎng)改善行動(dòng)”被納入《國民經(jīng)濟(jì)與社會(huì)發(fā)展第十一個(gè)五年規(guī)劃綱要》后 新推出的公眾營養(yǎng)改善項(xiàng)目，是我國繼實(shí)施“食鹽加碘”、“營養(yǎng)強(qiáng)化面粉”等措施之后啟動(dòng) 的又一公眾營養(yǎng)改善項(xiàng)目。OLIGO(低聚糖)項(xiàng)目主要是針對現(xiàn)階段我國人民大量存在微 生態(tài)營養(yǎng)失衡的狀況，通過倡導(dǎo)食品企業(yè)在加工的食品中加入OLIGO益生元，激活與增殖 人體內(nèi)的益生菌群，從而達(dá)到促進(jìn)微生態(tài)平衡，改善公眾營養(yǎng)健康的目的。國外很早已將 OLIGO添加到食品中。日本厚生省批準(zhǔn)的569種特定保健食品中，其中有240種都添加了 0LIG0,占總數(shù)的42. 以上。在美國，OLIGO益生元已被FDA認(rèn)可為GRAS級的食品配料，列 為膳食纖維源而被廣泛應(yīng)用于食品中。歐盟也已經(jīng)提出了 OLIGO益生元的全歐研發(fā)計(jì)劃。胭脂樹種子除含色素外，還含有大量的低聚糖。胭脂樹低聚糖屬于新型功能性低 聚糖，國內(nèi)外未見相關(guān)研究報(bào)道。胭脂樹低聚糖的研究及應(yīng)用不僅有助于提高我國的學(xué)術(shù) 地位，并將在我國形成新的明星產(chǎn)業(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是一種胭脂樹低聚糖及其制備方法和用途。具體地，本發(fā)明涉及一種胭脂樹低聚糖，含有大于40%質(zhì)量的胭脂樹四糖，所述胭 脂樹四糖的結(jié)構(gòu)式為 α -D-Gal-(1 — 3)- α -D-Gal-(1 — 6)- α -D-Glc-(1 — 2)-β -D-Fru, 其中Gal為半乳糖，Glc為葡萄糖，F(xiàn)ru為果糖，其結(jié)構(gòu)確認(rèn)圖譜如圖1 6。其中所述的胭 脂樹低聚糖或胭脂樹四糖是從胭脂樹種子或提取色素后的胭脂樹種子中提取的。另一方面，本發(fā)明涉及上述胭脂樹低聚糖或胭脂樹四糖的制備方法，包括將胭脂 樹種子脫脂后用溶劑提取或?qū)⑻崛∩睾蟮碾僦瑯浞N子用溶劑提取，提取液濃縮得產(chǎn)品。 上述制備方法的優(yōu)選方案為將胭脂樹種子脫脂后，粉碎，再用溶劑提取或?qū)⑻崛∩睾蟮?胭脂樹種子粉碎后用溶劑提取；更優(yōu)選為提取液濃縮后，進(jìn)行層析，濃縮得產(chǎn)品；進(jìn)一步優(yōu) 選為提取液濃縮后，用水稀釋，再進(jìn)行層析，濃縮得產(chǎn)品；更進(jìn)一步優(yōu)選為用水稀釋后，過 濾，濾液經(jīng)活性炭柱、硅膠柱或凝膠柱層析，濃縮得產(chǎn)品。
其中所述的脫脂步驟中，所用溶劑為石油醚、汽油、異丙醚、正己烷、二氯甲烷、三 氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、堿水之一或其混合物，胭脂樹種子與所用溶劑的質(zhì)量體積比 (g/ml)為1 1 1 10，優(yōu)選為1 5，即IKg胭脂樹種子需要用5L的溶劑脫脂。胭脂樹 種子中含有豐富的脂類物質(zhì)，如色素、留醇等，其中大部分為色素類?，F(xiàn)有技術(shù)常常將胭脂 樹種子用于制備食用色素(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，M O) J43;河北化工，2009，32 ) 22)。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，胭脂樹種子脫色素的步驟相當(dāng)于本發(fā)明的脫脂步驟。因 此，本發(fā)明可以直接利用脫去色素后的胭脂樹種子作為原料，則上述脫脂步驟不是必須的。 如果原料是尚未脫色素的胭脂樹種子，上述脫脂步驟則是必須的。除非特別指明，本發(fā)明的 胭脂樹種子指已脫色素或尚未脫色素的胭脂樹種子。其中所述的提取步驟可以為本領(lǐng)域公知的各種提取方法，例如煎煮、超聲、滲漉或 冷浸，其中煎煮為本發(fā)明的優(yōu)選提取方式。提取所用的溶劑為水、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、 乙二醇、乙腈之一或其混合物，優(yōu)選水或乙醇，胭脂樹種子與所用溶劑的質(zhì)量體積比(g/ml) 為 1 1 1 20，優(yōu)選 1 10。其中所述的稀釋步驟中，胭脂樹種子與水的質(zhì)量體積比(g/ml)為1 0.05 1 1，優(yōu)選 1 0. 1。其中所述的活性炭柱層析步驟中，胭脂樹種子與活性碳的質(zhì)量比為1 0.5 1 20，優(yōu)選1 5，洗脫劑為乙醇或甲醇的水溶液，其濃度梯度體積比的比例變化范圍為 0 30%。再一方面，經(jīng)生物活性試驗(yàn)研究表明，本發(fā)明的胭脂樹低聚糖或胭脂樹四糖除了 具有增強(qiáng)免疫功能的作用外，還能夠增殖胃腸道中的雙歧桿菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、改善胃 腸道功能的作用，且無任何毒副作用。因此，本發(fā)明的胭脂樹低聚糖或胭脂樹四糖可用于制 備具有增強(qiáng)免疫功能的藥物或保健食品，也可用于制備調(diào)節(jié)腸道菌群、改善胃腸道功能的 藥物或保健食品，并可作為食品添加劑應(yīng)用于各類食品。本發(fā)明的胭脂樹低聚糖是首次從天然植物中提取得到。本發(fā)明的制備方法簡便， 產(chǎn)品純度高。而且，本發(fā)明的胭脂樹低聚糖或胭脂樹四糖不會(huì)使血糖升高，適合于高血糖人 群或糖尿病人使用。


圖1胭脂樹四糖的ESI-MS譜圖。
圖2胭脂樹四糖的^NMR譜圖。
圖3胭脂樹四糖的13CNMR譜圖。
圖4胭脂樹四糖的HMQC譜圖。
圖5胭脂樹四糖的HMBC譜圖。
圖6胭脂樹四糖的 1H-1H cosy 譜圖。
圖7胭脂樹低聚糖(A)的液相色譜圖(峰3為胭脂樹四糖，含量43.4% )。
圖8胭脂樹低聚糖(B)的液相色譜圖(峰2為胭脂樹四糖，含量73.6% )。
圖9胭脂樹四糖(C)的液相色譜圖(峰1為胭脂樹四糖，含量 97. 2% )。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例及實(shí)驗(yàn)例用于證實(shí)本發(fā)明，不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例中所 用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。胭脂樹種子云南省熱帶作物科學(xué)研究所活性炭上海唐新活性碳有限公司色譜純乙腈默克公司高效液相色譜儀(515泵，ALLTECH蒸發(fā)光檢測器)maters公司INVOA 500型核磁共振波譜儀Volian公司，TMS為內(nèi)標(biāo)ZMD Micromass 型質(zhì)譜儀英國 Micromass 公司實(shí)施例1胭脂樹低聚糖的制備方法一將Ikg胭脂樹種子，加入6%氫氧化鉀溶液3L，50°C攪拌2小時(shí)脫脂，脫脂后的胭 脂樹種子粉碎，然后用6L水超聲提取2小時(shí)，提取液濃縮即得胭脂樹低聚糖(A)(其中胭脂 樹四糖含量為43. 4%)(見圖7)。實(shí)施例2胭脂樹低聚糖的制備方法二將Ikg脫去色素的胭脂樹種子，粉碎后用3L水煎煮提取1小時(shí)，提取液濃縮即得 胭脂樹低聚糖(其中胭脂樹四糖含量為45. 2% )。實(shí)施例3胭脂樹低聚糖的制備方法三將Ikg胭脂樹種子，加入二氯甲烷1L，超聲2小時(shí)脫脂，脫脂后的胭脂樹種子 用水IL煎煮，煎煮3次，每次2小時(shí)，煎煮液濃縮，加入水50ml稀釋，進(jìn)行活性炭柱層析 (活性炭的用量為0. 5kg)，依次用水、8 %、10 %、15 %、18 %、25 %的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫， HPLC檢測，合并10% -18%乙醇洗脫液，濃縮得到胭脂樹低聚糖(其中胭脂樹四糖含量為 58. 4% )。實(shí)施例4胭脂樹低聚糖的制備方法四將0. Ikg胭脂樹種子，加入IL石油醚，50°C攪拌1小時(shí)脫脂，脫脂后的胭脂樹種 子用水2L煎煮，煎煮2次，每次2小時(shí)，煎煮液濃縮，加入水0. IL稀釋，進(jìn)行活性炭柱層 析(活性炭的用量為^g)，依次用水、10 %、15 %、20 %、25 %、30 %的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫， HPLC檢測，合并15% -30%乙醇洗脫液，濃縮得到胭脂樹低聚糖(B)(其中胭脂樹四糖含量 為 73.6% )(見圖 8)。實(shí)施例5胭脂樹四糖的制備方法一將0. 2kg胭脂樹種子，加入乙酸乙酯1L，50°C攪拌30分鐘脫脂，脫脂后的胭脂樹種 子用乙醇2L煎煮，煎煮2次，每次1小時(shí)，煎煮液濃縮，過濾，濾液經(jīng)活性炭柱層析(活性炭 的用量為IKg)，依次用水、6 %、12 %、15 %、20 %、30 %的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，HPLC檢測， 合并15%乙醇洗脫液，濃縮得到胭脂樹四糖(C)(含量為97.2%，見圖9)，相關(guān)圖譜如附圖
1 6ο實(shí)施例6胭脂樹四糖的制備方法二將0. Ikg脫去色素的胭脂樹種子，粉碎，用0. 5L水超聲提取1小時(shí)，提取液濃縮， 干法上樣，進(jìn)行硅膠柱層析(硅膠的用量為0.5Kg)，用乙酯丙酮氨水=1 2 1進(jìn) 行洗脫，HPLC檢測，合并胭脂樹四糖含量大于95%的洗脫液，濃縮得到胭脂樹四糖(含量為 96. 8% )。
實(shí)驗(yàn)例清潔級昆明小鼠河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心血糖儀強(qiáng)生公司紫外分光光度計(jì)安瑪西亞公司電熱恒溫水箱天津市泰斯特儀器有限公司離心機(jī)北京醫(yī)用離心機(jī)廠渦旋混合器上?？七_(dá)測試儀器廠分析天平sartorius，型號 BP_210s實(shí)驗(yàn)例1胭脂樹低聚糖、胭脂樹四糖增強(qiáng)糖尿病小鼠非特異性免疫功能按文獻(xiàn)中藥藥理與臨床，2001，17 ) :23提供的方法，將實(shí)施例1、4制備的胭脂 樹低聚糖(A)、(B)和實(shí)施例5制備的胭脂樹四糖(C)分別以0. 2g/kg的劑量給予四氧嘧啶 致糖尿病小鼠，同時(shí)設(shè)置正常對照組、糖尿病模型組和二甲雙胍陽性治療組，每組12只小 鼠，灌胃給藥沈天。與空白對照組相比，糖尿病模型組小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)顯著降低；與 糖尿病模型組相比，均顯著增加四氧嘧啶致糖尿病小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)(表1)。表1糖尿病小鼠免疫器官臟器指數(shù)(mg/10g體重)
組別胸腺指數(shù)脾指數(shù)空白對照組17.0±7.554.2±34.7糖尿病模型組6.6±4.3##28.1±8.5#二甲雙胍0.5g/kg16.0±4.9**44.7±9.9**胭脂樹低聚糖(A)10.7±5.6*36.4±6·8*胭脂樹低聚糖(B)12.8±6·2*39.8±9.9*胭脂樹四糖(C)14.9±8.4*44.8±12.6**# 與空白對照組相比P < 0. 05 ;## 與空白對照組相比P < 0. 01。* 與糖尿病模型組相比P < 0. 05 與糖尿病模型組相比P < 0. 01。實(shí)驗(yàn)例2胭脂樹低聚糖、胭脂樹四糖增強(qiáng)小鼠體液免疫功能按文獻(xiàn)中藥藥理與臨床，2001，17 ) :23提供的方法，將(A)、(B)、(C)分別以 0. 6g/kg給正常小鼠灌胃給藥9天，同時(shí)設(shè)立對照組和陽性對照組(蜂膠1. 6g/kg)，每組10 只小鼠。于給藥第2天，所有小鼠腹腔注射5%鳥紅細(xì)胞(CRBC)混懸液0. 2ml進(jìn)行免疫， 免疫7天。免疫7天后，小鼠分離血清，用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋血清Iml加入5% CRBC 0.5ml，每管加入0.5ml生理鹽水1 10稀釋過的豚鼠血清，在M6nm處測定各樣品 的吸光度(OD)值。本發(fā)明的胭脂樹低聚糖、胭脂樹四糖(0. 6g/kg)均能夠顯著增加小鼠的血清溶血 素含量，差異顯著(P < 0. 05，表2)。表2對正常小鼠血清溶血素的影響(0D值)
權(quán)利要求
1.一種胭脂樹低聚糖，含有大于40%質(zhì)量的胭脂樹四糖，所述胭脂樹四糖的結(jié)構(gòu)式為 α -D-Gal-(1 — 3) - α -D-Gal-(1 — 6) - α -D-Glc-(1 — 2) - β _D_Fru，其中 Gal 為半乳糖， Glc為葡萄糖，F(xiàn)ru為果糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胭脂樹低聚糖，所述的胭脂樹低聚糖或胭脂樹四糖是從胭脂 樹種子或提取色素后的胭脂樹種子中提取的。
3.—種權(quán)利要求1或2所述的胭脂樹低聚糖或胭脂樹四糖的制備方法，包括將胭脂樹 種子脫脂后用溶劑提取或?qū)⑻崛∩睾蟮碾僦瑯浞N子用溶劑提取，提取液濃縮得產(chǎn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中將胭脂樹種子脫脂后，粉碎，再用溶劑提取或?qū)⑻?取色素后的胭脂樹種子粉碎后用溶劑提取。
5.根據(jù)權(quán)利要求3述的方法，其中提取液濃縮后，進(jìn)行層析，濃縮得產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中提取液濃縮后，用水稀釋，再進(jìn)行層析，濃縮得產(chǎn)PΡΠ O
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中用水稀釋后，過濾，濾液經(jīng)活性炭柱、硅膠柱或凝 膠柱層析，濃縮得產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求4 7任一所述的方法，其中所述的脫脂步驟中，所用溶劑為石油醚、 汽油、異丙醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、堿水之一或其混合物，胭 脂樹種子與所用溶劑的質(zhì)量體積比(g/ml)為1 1 1 10。
9.根據(jù)權(quán)利要求4 7任一所述的方法，其中所述的提取為煎煮、超聲、滲漉或冷浸，提 取所用的溶劑為水、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、乙二醇、乙腈之一或其混合物，胭脂樹種子與所 用溶劑的質(zhì)量體積比(g/ml)為1 1 1 20。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述的稀釋步驟中，胭脂樹種子與水的質(zhì)量 體積比(g/ml)為 1 0.05 1 1。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的活性炭柱層析步驟中，胭脂樹種子與活性 碳的質(zhì)量比為1 0.5 1 20，洗脫劑為乙醇或甲醇的水溶液，其濃度梯度體積比的比例 變化范圍為0 30%。
12.權(quán)利要求1所述的胭脂樹低聚糖或胭脂樹四糖在制備免疫增強(qiáng)類、調(diào)節(jié)腸道菌群 類、改善胃腸道功能類的藥物或保健食品中的用途，或作為添加劑應(yīng)用于各類食品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胭脂樹低聚糖，含有大于40％質(zhì)量的胭脂樹四糖，所述胭脂樹四糖的結(jié)構(gòu)式為α-D-Gal-(1→3)-α-D-Gal-(1→6)-α-D-Glc-(1→2)-β-D-Fru。本發(fā)明胭脂樹低聚糖、胭脂樹四糖的制備方法工藝簡單，產(chǎn)品純度高，具有增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)腸道菌群、改善胃腸道功能的活性，且無毒副作用。
文檔編號A61P1/00GK102115482SQ20091026393
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者任風(fēng)芝, 張華 , 張雪霞, 李麗紅, 李寧, 王寧, 王秒, 白玉, 耿文飛, 郭棟, 陳書紅, 高月麒 申請人:華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司