專(zhuān)利名稱(chēng)：丹參植物提取物水溶性組分丹酚酸類(lèi)化合物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丹參(Salvia miltiorrhiza)根提取物水溶性組分丹酚酸類(lèi)化合物 的新用途，其中所述丹酚酸類(lèi)化合物選自丹參素鈉(danshensu sodium，DSS)、迷迭香酸 (rosmarinic acid, RA)和丹酚酸 B (salvianolic acid B, SAB)或其組合。所述丹酚酸類(lèi) 化合物具有作為CD36拮抗劑阻斷CD36與其相關(guān)配基結(jié)合的作用，其中所述CD36的相關(guān) 配基包括但不限于氧化低密度脂蛋白(oxLDL)、乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)、糖基化終末 產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGE)、凝血酶敏感蛋白 1 (thrombospondin-l, TSP-1)、生長(zhǎng)激素釋放肽(growth hormone releasing peptide, GHRP)、長(zhǎng)鏈脂肪酸(long chain fatty acid, LCFA)、β淀粉樣蛋白(Αβ)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白 (HDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞、凋亡中性粒細(xì)胞等。本發(fā)明還涉及所 述丹酚酸類(lèi)化合物用于制備阻斷CD36與其相關(guān)配基結(jié)合的藥物的用途。
背景技術(shù)：
⑶36屬于B族清道夫受體，是一種單鏈跨膜糖蛋白，由472個(gè)氨基酸殘基編碼而 成，由于糖基化程度不同在不同的細(xì)胞中具有不同的分子量，約從78kD到88kD[Greenwalt DE等人，Blood. 1992,80(5) :1105_1115]。氨基酸序列表明其C端和N端各有一個(gè)連續(xù)的 疏水氨基酸區(qū)，其中C端被認(rèn)為是跨膜區(qū)，而N端尚無(wú)定論，目前普遍認(rèn)為N端疏水氨基酸 區(qū)是第二個(gè)跨膜區(qū)[Febbraio M，等人，J.Clin. Invest. 2001,108 (6) :785_791]。這兩個(gè)疏 水末端固定于胞膜，使CD36長(zhǎng)鏈絕大部分延伸在胞外。另外，Greenwalt等[Blood. 1992， 80(5) 1105-1115]認(rèn)為⑶36的胞外區(qū)中部約20個(gè)氨基酸為潛在的膜連接位點(diǎn)，可能從胞 外與胞膜相連。CD 36在體內(nèi)的分布廣泛，在血小板、單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì) 胞等多種細(xì)胞表面均有表達(dá)，且在不同組織和細(xì)胞分化階段的表達(dá)水平差異較大。作 為一種清道夫受體，CD36 可與 oxLDL [Endemann G 等人，J. Biol. Chem. 1993，268 (16) 11811-11816]、acLDL (acLDL為體外合成以用于研究，體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn))、AGE [Ohgami N等 人，J. Diabetes Complications. 2002，16 (1) :56_59]及 β 淀粉樣蛋白 A β [Coraci IS 等 人，Am. J. Pathol. 2002，160(1) 101-112]、凝血酶敏感蛋白 1 (thrombospondin-1，TSP-1)、 長(zhǎng)鏈脂肪酸(long chain fatty acid, LCFA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、 極低密度脂蛋白(VLDL)、瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞、凋亡中性粒細(xì)胞等多種配基相結(jié)合，參與了 一系列的生理過(guò)程，如脂質(zhì)代謝、負(fù)電荷生物大分子粘附、炎癥反應(yīng)、噬菌、內(nèi)吞[Febbraio M 等人，J. Clin. Invest. 2001,108(6) :785_791]、能量代謝[Abumrad N 等人，Biochim. Biophys. Acta. 1999,1441(1) :4_13]、抗血管生成、腦損傷等。為了更好的研究各種復(fù)雜的 生理過(guò)程，必須尋找能夠有效抑制CD36與其相關(guān)配基結(jié)合的拮抗劑。對(duì)⑶36配基結(jié)合拮抗劑的研究已有一定的進(jìn)展，如研究發(fā)現(xiàn)⑶36在心臟中是 生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)的受體，并介導(dǎo)其心血管活性[Bodart V等人，Circ. Res. 2002, 90(8) =844-849] 0其中，GHRP家族的六肽化合物hexarelin可以與CD36競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合并 影響⑶36介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL的攝取，從而發(fā)揮了保護(hù)心血管的作用[Demers A，Rodrigue-Way A 等人，PPAR. Res. 2008，2008 364784]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[Demers A 等人， Biochem. J. 2004，382 (Pt 2) :417_424]，hexarelin 在 CD36 上的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與 oxLDL 的結(jié) 合結(jié)構(gòu)域是重疊的，這就進(jìn)一步證明了 hexarelin作為競(jìng)爭(zhēng)性配基，與oxLDL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 CD36，從而抑制泡沫細(xì)胞的形成及動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用。由GHRP家族衍生而來(lái)的 EP83017不再具備生長(zhǎng)激素釋放活性，但仍可與CD36結(jié)合，研究結(jié)果表明它在apoE缺失鼠 中具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用是通過(guò)拮抗oxLDL與CD36的結(jié)合實(shí)現(xiàn) 的，說(shuō)明CD36的拮抗劑有可能發(fā)展為一類(lèi)新型的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物。另外，Stewart等[Mol Immunol. 2006,43(3) :255_267]將 CD36 的胞外部分與人 IgGl的Fc結(jié)構(gòu)域融合，在C0S-7和CH0K1細(xì)胞中進(jìn)行了分泌表達(dá)，獲得了具有活性的重組 可溶性受體s⑶36-Ig，可以阻斷單核細(xì)胞對(duì)oxLDL的吸附，并可阻斷oxLDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞間粘附分子-1 (ICAM-I)的吸附，證明重組可溶性受體sCD36-Ig可 以有效地競(jìng)爭(zhēng)oxLDL對(duì)細(xì)胞膜上的⑶36的結(jié)合，是一個(gè)有效的⑶36拮抗劑。然而，到目前為止，尚未見(jiàn)非肽類(lèi)小分子的⑶36拮抗劑的報(bào)道。丹參(Salvia miltiorrhiza Bge)作為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用最早且最為廣泛的 藥物之一，已廣泛用于治療冠心病、心絞痛、高脂血癥及心腦血管循環(huán)功能障礙等。丹酚 酸(salvianolic acid)屬酚酸類(lèi)化合物，作為丹參的水溶性有效成分在丹參的功效作用 中占有重要地位。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，丹參主要的藥理學(xué)活性組分之一為丹酚酸類(lèi)的水溶性 組分，包括丹參素鈉，迷迭香酸，丹酚酸B等等[Zhou L等人，JClin Pharmacol. 2005,45 1345-1359]。其中丹參素化學(xué)名為3_(3，4_ 二羥基苯基)-2_羥基丙酸(參見(jiàn)式1)，是各 種丹酚酸的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。迷迭香酸是兩分子的丹參素形成的酯(參見(jiàn)式2)，其化學(xué)名為 3，4_ 二羥基-β-苯丙烯酸(R)-I-羧基-2-(3，4-二羥基苯基)乙酯。丹酚酸B為三分子 丹參素與一分子咖啡酸縮合而成(參見(jiàn)式3)，化學(xué)名為2- [ (2R，3S) -4- [ (E) -2- [ (IR) -1-羧 基-2- (3,4- 二羥基苯)乙氧基]羰基乙烯基]-2- (3,4- 二羥基苯基)-7-羥基-2，3- 二氫 苯并呋喃-3-羰基]氧-3-(3，4-二羥基苯基)丙酸，是目前研究較多的丹酚酸之一。已知 丹酚酸類(lèi)化合物在細(xì)胞多種功能中均發(fā)揮了重要的作用，如抗氧化、對(duì)心肌缺血再灌注損 傷的保護(hù)、對(duì)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)、對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治、對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)、 抗肝臟纖維化、抗衰老、抗腫瘤、抗炎作用等等[湛月娥，徐江平，丹酚酸B藥理作用的研究 進(jìn)展，華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志，2007年第21卷第2期37-54]。 式1式2式3本發(fā)明人利用自行構(gòu)建的CD36拮抗劑篩選模型，篩選得到丹參素鈉、迷迭香酸和 丹酚酸B，通過(guò)在分子水平及細(xì)胞水平上的研究，首次發(fā)現(xiàn)了上述化合物可通過(guò)與CD36結(jié) 合從而拮抗CD36與其配基(例如oxLDL)的結(jié)合作用，抑制巨噬細(xì)胞對(duì)其配基(例如oxLDL) 的攝取。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些化合物可顯著抑制oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CD36mRNA的表達(dá)上調(diào)作用，可能是通過(guò)拮抗oxLDL與⑶36的結(jié)合，進(jìn)而抑制了 oxLDL誘導(dǎo)的⑶36的正反饋 調(diào)節(jié)(參見(jiàn)圖1)。以上實(shí)驗(yàn)表明，所述化合物可拮抗CD36與其相關(guān)配基的結(jié)合，是CD36的 拮抗劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及丹參根提取物水溶性組分丹酚酸類(lèi)化合物的新用途，其 中所述丹酚酸類(lèi)化合物選自丹參素鈉、迷迭香酸和丹酚酸B或其組合。本發(fā)明所述丹酚酸類(lèi)化合物具有作為CD36拮抗劑阻斷CD36與其相關(guān)配基結(jié)合的 作用，其中所述⑶36的相關(guān)配基包括但不限于oxLDL、acLDL、AGE、TSP-l、GHRP、LCFA、β淀 粉樣蛋白A β、LDL、HDL、VLDL、瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞、凋亡中性粒細(xì)胞等。本發(fā)明的另一方面，還涉及所述丹酚酸類(lèi)化合物用于制備阻斷CD36與其相關(guān)配 基結(jié)合的藥物的用途。利用發(fā)明人自行建立的人CD36拮抗劑篩選模型對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模篩選，得 到了陽(yáng)性化合物丹參素鈉(DSS，式1)、迷迭香酸(RA，式2)和丹酚酸B(SAB，式3)，其量效 關(guān)系曲線(xiàn)如圖4A所示，IC50分別為37. 8 μ M，25. 1 μ M和23. 2 μ Μ。此結(jié)果表明這3個(gè)化合 物在該模型上均顯示出抑制oxLDL與CD36結(jié)合的拮抗活性，且作用呈劑量依賴(lài)關(guān)系，同時(shí) 其結(jié)構(gòu)與活性之間存在著一定的構(gòu)效關(guān)系。丹酚酸B影響CD36與oxLDL的結(jié)合飽和度分 析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，15 μ Μ、30 μ M丹酚酸B存在下⑶36與oxLDL結(jié)合曲線(xiàn)達(dá)到飽和時(shí)Bmax值 一致，說(shuō)明丹酚酸B是CD36的可逆的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑(參見(jiàn)圖4B)。發(fā)明人利用表面等離子共振(surface ρlasmon resonance，SPR)技術(shù)檢測(cè)了化合 物丹酚酸B(SAB)與重組人⑶36蛋白的結(jié)合，結(jié)果表明丹酚酸B可劑量依賴(lài)的與包被在CM5 芯片表面的⑶36結(jié)合，并且丹酚酸B與⑶36的結(jié)合是可逆的(圖5A，B)。另一方面，我們 檢測(cè)了已知的抗氧化劑(普羅布考[Parthasarathy S等人，J.Clin. Invest. 1986,77(2) 641-644]、維生素 C 和維生素 E [Frei B, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1999，222 (3) 196-204]) 在人CD36拮抗劑篩選模型中的作用，結(jié)果表明它們均不具有CD36的拮抗活性(圖4C)，說(shuō) 明丹酚酸B并不是作為抗氧化劑作用于oxLDL而在模型中顯示陽(yáng)性結(jié)果。以上結(jié)果進(jìn)一步 確證，丹酚酸B的抑制作用是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合⑶36，從而拮抗oxLDL與⑶36的結(jié)合。當(dāng)?shù)⑺剽c、迷迭香酸和丹酚酸B分別作用于小鼠巨噬細(xì)胞RAW264. 7后，油紅0 染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所述化合物均具有較強(qiáng)的抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的活性，而且所述化合 物都存在劑量依賴(lài)關(guān)系(圖6A，B)。更進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丹酚酸 B能夠降低RAW 264. 7細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記的acLDL(Dil-acLDL)的攝取(圖6C)。以上細(xì)胞水 平的結(jié)果表明丹參素鈉、迷迭香酸和丹酚酸B可以通過(guò)抑制oxLDL與⑶36的結(jié)合，抑制巨 噬細(xì)胞上的⑶36對(duì)其配基(oxLDL、acLDL)的攝取，從而緩解或阻止泡沫細(xì)胞的形成。另一方面，我們檢測(cè)了丹酚酸B對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞⑶36mRNA水平上調(diào)作 用的影響，發(fā)現(xiàn)丹酚酸B可顯著抑制oxLDL誘導(dǎo)的⑶36的表達(dá)上調(diào)作用(圖7)。據(jù)文獻(xiàn) 報(bào)道，oxLDL可顯著上調(diào)⑶36的表達(dá)，且被證實(shí)是通過(guò)激活核受體PPAR γ從而促進(jìn)⑶36 的表達(dá)，據(jù)此提出了動(dòng)脈粥樣硬化形成前期血管壁上oxLDL正反饋驅(qū)動(dòng)攝入oxLDL的假說(shuō) [Collot-Teixeira S，等人，Cardiovasc. Res. 2007，75 (3) :468_477]。CD36 作為膜受體，也 是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要的一步，引起下游信號(hào)的傳遞，形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(參見(jiàn)圖1)。我們的結(jié)果表明，丹酚酸B可通過(guò)拮抗oxLDL與⑶36的結(jié)合抑制oxLDL對(duì)⑶36的表 達(dá)上調(diào)作用，因此這一結(jié)果也間接證明了丹酚酸B作為⑶36拮抗劑的作用。


圖1⑶36的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)示意圖。圖2為重組人⑶36可溶性受體s⑶36的表達(dá)與活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖3為人⑶36拮抗劑高通量篩選模型原理示意圖。圖4表示丹參素鈉、迷迭香酸、丹酚酸B在人⑶36拮抗劑高通量篩選模型上的驗(yàn) 證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中A，丹參素鈉、迷迭香酸和丹酚酸B抑制CD36與oxLDL結(jié)合的量效關(guān)系 曲線(xiàn)；B，丹酚酸B影響⑶36與oxLDL的結(jié)合飽和度分析；C，普羅布考、維生素C和維生素E 等抗氧化劑作用于CD36與oxLDL結(jié)合的量效關(guān)系曲線(xiàn)。圖5為采用表面等離子共振技術(shù)檢測(cè)丹酚酸B與CD36結(jié)合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中圖 5A顯示，圖5B顯示丹酚酸B可劑量依賴(lài)的與包被在CM5芯片表面的⑶36結(jié)合，并且丹酚酸 B與CD36的結(jié)合是可逆的(圖5A，B)圖6為丹參素鈉、迷迭香酸和丹酚酸B抑制RAW 264. 7細(xì)胞攝取oxLDL和acLDL 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中A，丹參素鈉、迷迭香酸和丹酚酸B抑制RAW 264. 7細(xì)胞攝取oxLDL (采用油紅0染 色)。a，空白細(xì)胞對(duì)照組，b，oxLDL誘導(dǎo)后泡沫細(xì)胞對(duì)照組，c,重組s⑶36蛋白加樣組，d， 含載體pET-30a (+)的大腸桿菌蛋白對(duì)照組，e, 100 μ M丹參素加樣組，f，100 μ M迷迭香酸加 樣組，g，100 μ M丹酚酸B加樣組，h，100 μ M hexarelin加樣組(陽(yáng)性對(duì)照)；B,油紅0染色的定量結(jié)果，以oxLDL誘導(dǎo)后泡沫細(xì)胞對(duì)照組的讀數(shù)為1 ；C，丹酚酸 B抑制RAW 264. 7細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記的acLDL (DiI-acLDL)的攝取(采用流式細(xì)胞儀檢測(cè))。圖7為丹酚酸B抑制oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW 264. 7中⑶36的mRNA水平上調(diào) 作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域公知的操作技術(shù)和實(shí)驗(yàn)條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃 培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試 劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例實(shí)施例1人⑶36拮抗劑篩選模型的建立和應(yīng)用A)人重組⑶36蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及異源表達(dá)菌株和細(xì)胞株E. coli DH5 α (購(gòu)自全式金公司)用于質(zhì)粒DNA的遺傳操作，E. coli BL21 (DE3) (購(gòu)自全式金公司)用作異源蛋白表達(dá)宿主。人單核細(xì)胞骨髓瘤U937細(xì)胞株(購(gòu)自中國(guó)醫(yī) 學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)使用含有10% FBS的PRMI-1640培養(yǎng)基(pH7. 0)培養(yǎng)，用于提 取其總RNA，獲得⑶36基因cDNA序列構(gòu)建重組質(zhì)粒，從而表達(dá)重組⑶36蛋白。
質(zhì)粒pGEM-T(購(gòu)自Promega公司)用于PCR產(chǎn)物的克隆。大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET_30a(+) (購(gòu)自Novagen公司)用于構(gòu)建重組⑶36蛋白表達(dá)載體。人CD36cDNA基因序列的獲得⑶36在巨噬細(xì)胞膜表面表達(dá)，從人單核細(xì)胞U937中提取總RNA，使用試劑 ^ -QuickPrep Total RNA Extraction Kit (GE Healthcare)(1)消化細(xì)胞，離心收集至1. 5ml離心管中，PBS洗一次，以1000轉(zhuǎn)/分的速度離 心3分鐘，棄上清；(2)加入350 μ 1 LiCl，輕輕重懸細(xì)胞；(3)加入3μ 1 ΒΜΕ，及150μ 1提取緩沖液，充分混勻，冰浴靜置，使細(xì)胞完全裂解；(4)加入500 μ 1 CsTFA，充分混勻后，冰浴靜置10分鐘；(5)以12，000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速在4°C下離心15分鐘，RNA聚集在底部，蛋白在管子 頂部形成沉淀層，DNA在液相；(6)小心移除蛋白和含DNA的液體，保留底部RNA ；(7) RNA 中加入 75 μ 1 提取緩沖液，175 μ 1 LiCl，250 μ 1 CsTFA (可預(yù)先混合)；(8)高速震蕩5次，洗滌RNA。注意沉淀可能分散，但不會(huì)完全溶解；(9)以12，000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速在4°C下離心10分鐘；(10)棄上清，冰浴靜置，加入Iml 70%乙醇，劇烈震蕩5次；(11)以12，000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速在4°C下離心10分鐘；(12)棄乙醇，室溫?fù)]干，冰浴靜置，加入20 μ 1 DEPC處理的水；(13)高速震蕩5次后，冰浴靜置15-30分鐘，65°C加熱10分鐘，備用。通過(guò)RT-PCR 擴(kuò)增 CD36 胞外結(jié)構(gòu)域(soluble CD36, sCD36) cDNA 片 段。RT-PCR采用兩步法，首先使用逆轉(zhuǎn)錄酶，01 igo-dT2Q為引物(superscript III First-Strand (Invitrogen))逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為(1)細(xì)胞總 RNA 1μ1，50μΜ 01igo-dT20 1μ l,10mM dNTPs 混合物 1 μ 1，最后用 DEPC處理的水加至10μ 1 ；(2) 65 °C放置5分鐘，冰浴靜置至少1分鐘；(3) 10XRT buffer 2 μ l,25mM MgC12 4 μ 1,0. IM DTT 2 μ 1, RNaseOUT (40U/ μ 1)1 μ 1，superscript III RT (200U/μ 1) 1 μ 1。反應(yīng)條件如下50°C，50 分鐘；85°C，5 分 鐘；4°C放置；_20°C保存。然后使用Pfu DNA聚合酶(購(gòu)自上海生物工程公司)，sPl (5，-AA GAATTC GGA GAC CTG CTT ATC CAG AAG-3' )、sP2(5' -A GCGGCCGCTTA GTT TAT TTT TCC AGT TAC TTG AC-3’ )為引物、以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)體系為
7


反應(yīng)條件為 1 cycle 30 cycles
94°C，10 分鐘； 94°C, 30 秒， 58°C, 30 秒， 72°C，1.5 分鐘； 1 cycle 72°C，10 分鐘； 1 cycle 4°C，保存。PCR擴(kuò)增的目的片段用pGEM-T載體(Promega)克隆。依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中所述的方 法，將PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為(1) PCR產(chǎn)物片段加A (可根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度調(diào)整PCR產(chǎn)物片段用量)。
在室溫下置于水浴中，放入4°C冰箱過(guò)夜。與T載體連接后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α受體菌(購(gòu)自全式金公司)，用 藍(lán)白斑法篩選轉(zhuǎn)化子。對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行快速質(zhì)粒提取后進(jìn)行酶切鑒定，用EcoRI，NotI雙切 后含目的片段的轉(zhuǎn)化子為克隆有目的片段的重組子。對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明所獲片段與 GenBank中報(bào)道完全一致。重組質(zhì)粒pET_sCD36的構(gòu)建用EcoRI，NotI雙酶切連有目的片段的pGEM_T載體，將得到目的片段與經(jīng)過(guò)相同 雙酶切的pET-30a(+)質(zhì)粒相連，從而將人CD36基因cDNA序列定向插入pET_30a(+)，構(gòu)建 成重組質(zhì)粒pET-sCD36。B)重組蛋白的表達(dá)與純化將重組質(zhì)粒pET_sCD36及對(duì)照質(zhì)粒pET_30a (+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)卡那 霉素抗性篩選后獲得重組菌株，分別提取質(zhì)粒，確證重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)。將重 組菌株分別命名為BL21 (DE3) /pET-sCD36及對(duì)照菌BL21 (DE3) /pET_30a。進(jìn)行重組蛋白的 表達(dá)，具體操作步驟如下所述(1)將pET-sCD36/BL21 (DE3)與對(duì)照菌接種于5ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37°C 培養(yǎng)過(guò)夜；(2)按1 % (體積/體積)體積接種于200ml LB中，37°C培養(yǎng)至OD600為0. 4-0. 6， 加入IPTG至終濃度0. ImM ；(3)誘導(dǎo)4小時(shí)后，4°C離心收集菌體，PBS洗一次后，冰浴靜置；(4)加入 20ml 超聲緩沖液 TGT(50mM Tris-HCl [pH8. 0], IOOmM NaCl，20%甘油， 1 % Triton X-100)，置冰上超聲，每次10秒，間隔30秒，15-30分鐘至菌體全部破碎；(5)以12，000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，分別收集上清(可溶性形式)和沉淀 (包涵體形式)；(6)上清中加入10% (體積/體積)甘油，-20°C保存；(7)包涵體用包涵體洗滌液(50mM Tris-HCl [ρΗ 8. 0]，IOOmMNaCl, 20%甘油，1 % Triton X-100，2M尿素)洗滌3-5次(每次離心收集)，至去除大部分雜蛋白(基本變?yōu)榘?色)；(8)加入包涵體裂解液(50mM Tris-HCl [ρΗ 8. 0], IOOmM NaCl，20%甘油，8M尿素， IOOmM β-巰基乙醇)裂解包涵體，用BCA蛋白定量試劑盒定量，4°C或-20°C保存?zhèn)溆谩＝?jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白免疫印跡、配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析顯示，BL2KDE3)/ pET-s⑶36表達(dá)出目的蛋白，與s⑶36預(yù)測(cè)分子量53kD相當(dāng)，并可與配基oxLDL結(jié)合，如圖 2A所示。最后將重組蛋白進(jìn)行BCA蛋白定量，稀釋后蛋白復(fù)性，即可用于人CD36拮抗劑篩
9選模型的建立。對(duì)表達(dá)的重組s⑶36蛋白與包被在96孔板的配基oxLDL或acLDL的結(jié)合 活性的驗(yàn)證如圖2B中配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)所示。另外，我們利用油紅0染色實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平對(duì)表 達(dá)的重組s⑶36蛋白也進(jìn)行了活性驗(yàn)證，即重組s⑶36可與oxLDL結(jié)合，抑制RAW 264. 7細(xì) 胞的泡沫化，結(jié)果參見(jiàn)圖6A，B。C)以CD36為靶點(diǎn)的受體拮抗劑高通量篩選模型的反應(yīng)條件基于受體-配基競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的原理，我們構(gòu)建了⑶36拮抗劑ELISA-Iike高通量 篩選模型。構(gòu)建方法的示意圖見(jiàn)圖3 在96孔板包被oxLDL，加入s⑶36 (和待測(cè)樣品)后 用⑶36抗體或者His-tag抗體檢測(cè)。詳細(xì)操作如下(1)包被96孔板每孔加入100 μ 1 5 μ g/ml的oxLDL溶液(PBS稀釋)，4°C靜置8-12小時(shí)， 用IXPBS溶液洗板2次。(2)封閉棄包被液，1 X PBS溶液洗板2次，每孔加200 μ 1含1 % (質(zhì)量/體積)BSA的PBS 溶液進(jìn)行封閉，4°C靜置3-5小時(shí)；棄封閉液，用IXPBST溶液洗板2次。(3)結(jié)合:2mg/ml 重組蛋白 sCD36 樣品用 IXPBS 稀釋 20 倍至 100 μ g/ml，每孔 100μ 1，4°C 靜置1小時(shí)。(4)加樣化合物DMS0溶解的化合物樣品1 μ 1/孔加樣；競(jìng)爭(zhēng)性配基oxLDL或其他可與 oxLDL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體蛋白的配基；混勻后4°C繼續(xù)放置2小時(shí)，以IXPBST洗板5次，每次 5分鐘。(5) 一抗重組蛋白抗體(⑶36抗體或者His-tag抗體)按1 1250稀釋于1 XPBS溶液中， 每孔100 μ 1，室溫靜置2小時(shí)，IXPBST溶液洗板5次，每次5分鐘。(6) 二抗辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的相應(yīng)二抗按1 5000稀釋于IXPBS溶液中，每孔 100μ 1，4°C靜置2小時(shí)；IXPBST溶液洗板5次，每次5分鐘。(7)顯色每孔加TMB和H2O2顯色底物混合物100 μ 1，37°C放置45分鐘，每孔100 μ 1 IM HCl 終止反應(yīng)，立即測(cè)定光吸收值0D，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm。(8)結(jié)果分析重組受體(重組s⑶36蛋白)對(duì)照讀數(shù)/空載體對(duì)照讀數(shù)彡3，變異系數(shù)< 15% 時(shí)視為模型工作正常。根據(jù)上述模型，待測(cè)樣品OD45tl值比重組受體對(duì)照低50%以上即視為 具有明顯拮抗活性。D)待測(cè)化合物的篩選結(jié)果我們應(yīng)用此模型對(duì)國(guó)家新藥(微生物)篩選實(shí)驗(yàn)室化合物樣品庫(kù)中2640個(gè)化合 物進(jìn)行了初步篩選，以100 μ M hexarelin為陽(yáng)性化合物對(duì)照(抑制率70-80% )，樣品抑制 率>50%的即視為初篩陽(yáng)性，對(duì)具有明顯活性的樣品進(jìn)行復(fù)篩。通過(guò)復(fù)篩，最終確定了丹參 素鈉(DSS，式1)、迷迭香酸(RA，式2)和丹酚酸B(SAB，式3)為陽(yáng)性化合物。
實(shí)施例2陽(yáng)性化合物的量效關(guān)系測(cè)定丹參素是丹參主要的水溶性組分丹酚酸類(lèi)化合物的基本結(jié)構(gòu)，迷迭香酸是兩分子 的丹參素形成的酯，丹酚酸B為三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成，它們都具有兒茶 酚的結(jié)構(gòu)。丹參素鈉、迷迭香酸和丹酚酸B在本模型上表現(xiàn)出了比較明顯的抑制活性。測(cè) 定這幾個(gè)化合物的量效關(guān)系曲線(xiàn)，結(jié)果如圖4A所示。利用GraphPad Prism 4軟件計(jì)算陽(yáng)性化合物的IC50值分別為37. 8 μ M，25. 1 μ M 和23. 2 μ Μ。此結(jié)果表明這3個(gè)化合物在該模型上均顯示出對(duì)⑶36與oxLDL結(jié)合的拮抗活 性，且作用呈劑量依賴(lài)關(guān)系，同時(shí)其結(jié)構(gòu)與活性之間存在著一定的構(gòu)效關(guān)系。實(shí)施例3丹酚酸B對(duì)CD36的可逆競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑作用A)利用模型對(duì)已知抗氧化劑進(jìn)行檢測(cè)普羅布考[ParthasarathyS 等人，J. Clin. Invest. 1986，77 (2) :641_644]、維生 素 C 和維生素 E[Frei B, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1999, 222 (3) 196-204]為已知抗氧化 劑，可通過(guò)保護(hù)LDL不被氧化為oxLDL，從而抑制泡沫細(xì)胞的形成。采用本發(fā)明所建立的CD36拮抗劑篩選模型檢測(cè)，結(jié)果顯示，普羅布考、維生素C和 維生素E在0. 1-100 μ M的濃度范圍均未在模型上表現(xiàn)出抑制活性(圖4C)。文獻(xiàn)報(bào)道[黃 躍生等人，藥學(xué)學(xué)報(bào)1992，27 (2) 96-100]，丹酚酸類(lèi)化合物也具有抗氧化作用，但以上實(shí) 驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明丹酚酸B在CD36拮抗劑篩選模型上的拮抗作用并非通過(guò)其抗氧化活性予以實(shí) 現(xiàn)。B)⑶36與oxLDL的結(jié)合飽和度(Bmax)分析實(shí)驗(yàn)丹酚酸B影響⑶36與oxLDL的結(jié)合飽和度分析實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，15 μ M、30 μ M丹 酚酸B存在下⑶36與oxLDL結(jié)合曲線(xiàn)達(dá)到飽和時(shí)Bmax值均與丹酚酸B不存在時(shí)Bmax值 一致，說(shuō)明丹酚酸B是CD36的可逆的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑(圖4B)。C)采用表面等離子共振技術(shù)對(duì)丹酚酸B與CD36的結(jié)合作用進(jìn)行檢測(cè)表面等離子共振實(shí)驗(yàn)采用BIAcore T100系統(tǒng)(購(gòu)自GE公司)完成，緩沖液為 PBS (pH 7. 4)。用pH 4. 5的醋酸鈉溶液將重組人⑶36蛋白(購(gòu)自R&D公司)稀釋至50 μ g/ ml，并將其通過(guò)氨基偶聯(lián)的方式包被于CM5蛋白芯片表面，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照通道。將 0. 78 μ MU. 56μΜ、3. 12μΜ、6. 25 μ Μ、12. 5 μ Μ、25 μ Μ、50 μ M 禾口 ΙΟΟμΜ 8 個(gè)濃度的丹酚酸 B 分別連續(xù)性注射流經(jīng)芯片表面，芯片再生所需溶液為lOmMNaOH。利用BiaEvaluation軟件 對(duì)最終得到的結(jié)合解離曲線(xiàn)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5A，丹酚酸B可劑量依賴(lài)性地與包被 在CM5芯片表面的⑶36結(jié)合。GHRP家族的六肽化合物hexarelin為已知⑶36配基，且與oxLDL在⑶36上的結(jié)合 位點(diǎn)重疊[Demers A 等人，Biochem. J. 2004，382 (Pt2) :417_424]，因此我們利用 hexarelin 來(lái)檢測(cè)SAB與⑶36結(jié)合的可逆性。首先以50 μ M丹酚酸B進(jìn)樣120s，使其結(jié)合于芯片表面⑶36且結(jié)合曲線(xiàn)達(dá)平臺(tái)， 結(jié)束進(jìn)樣后，以PBS緩沖液洗滌200s使結(jié)合于CD36表面的丹酚酸B自然解離，然后以50 μ M hexarelin進(jìn)樣120s，隨后于PBS緩沖液中解離300s。結(jié)果顯示，hexarelin在丹酚酸B解 離后可結(jié)合于⑶36且解離完全，確證了丹酚酸B與⑶36的結(jié)合是可逆的。實(shí)施例4丹酚酸類(lèi)化合物丹參素鈉、迷迭香酸、丹酚酸B抑制巨噬細(xì)胞泡沫化活性 的測(cè)定
A) RAff 264. 7 細(xì)胞培養(yǎng)DMEM-EBSS培養(yǎng)基(Hyclone)(含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清<Hyclone>)用于小鼠單核 /巨噬細(xì)胞RAW 264.7(購(gòu)自華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)中心)的培養(yǎng)。將小鼠的巨噬細(xì) 胞RAW 264. 7置于37°C含0. 5% CO2培養(yǎng)箱中，倍增時(shí)間為24小時(shí)，在含10%胎牛血清的 DMEM-高糖培養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞以6X IO4個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，于37°C， 0. 5% CO2條件下過(guò)夜培養(yǎng)后，換為無(wú)血清培養(yǎng)液(100 μ 1/孔)。將細(xì)胞分為對(duì)照組、泡沫 細(xì)胞組和加樣組，同時(shí)將泡沫細(xì)胞組加入oxLDL至每孔的終濃度為80μ g/ml，加樣組同時(shí) 加入一定濃度的待測(cè)樣品。37°C，0. 5% CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行染色。B)采用油紅0染色研究丹參素鈉、迷迭香酸、丹酚酸B對(duì)細(xì)胞攝取oxLDL的影響(1)油紅0染色液的配制方法油紅0. 5g溶于IOOml異丙醇，60°C水浴30分鐘，過(guò)濾。臨用前取6ml油紅母液， 加入4ml雙蒸水中，靜置30分鐘，用前過(guò)濾。(2) RAff 264. 7細(xì)胞中性脂質(zhì)的油紅0染色法按步驟A)提到的方法，將加好樣的96孔培養(yǎng)板從二氧化碳孵箱中取出，10%甲醛 固定液固定(15μ 1/孔)，10分鐘后棄去溶液，水洗兩次，再加入60%異丙醇(150 μ 1/孔) 放置5分鐘，棄去溶液，用油紅0染色液(150 μ 1/孔)染色1小時(shí)，棄去溶液用60%異丙 醇(150 μ 1/孔)洗孔，然后用水(150 μ 1/孔)洗兩次，最后每孔加150 μ 1水，顯微鏡下觀(guān)察。C)鏡檢結(jié)果經(jīng)油紅0染色后，鏡下觀(guān)察不加oxLDL的對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯紅色油滴狀顆粒，而 泡沫細(xì)胞組的細(xì)胞可見(jiàn)到細(xì)胞漿內(nèi)有較多的紅色油滴顆粒，并且由于個(gè)別細(xì)胞吞噬的油滴 過(guò)多使得這些細(xì)胞體積增大，樣品組中若有對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化有抑制作用的樣品，其細(xì)胞 中紅色油滴顆粒明顯減少。由圖6A所示，100 μ M丹參素鈉(DSS)、迷迭香酸(RA)、丹酚酸 B(SAB)和hexarelin處理組能夠有效抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化。D)分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果用異丙醇將96孔板里的紅色油脂分別溶出，置于新的96孔板內(nèi)，進(jìn)行分光光度法 測(cè)定，在490nm處檢測(cè)OD值，結(jié)果如圖6B所示，與oxLDL誘導(dǎo)細(xì)胞泡沫化對(duì)照組相比較， 10 μ M和100 μ M的DSS、RA、SAB和hexarelin處理組能夠顯著降低脂質(zhì)的攝取，從而抑制 巨噬細(xì)胞泡沫化形成，且存在一定的量效關(guān)系。實(shí)施例5丹酚酸類(lèi)化合物丹酚酸B (SAB)抑制RAW 264. 7細(xì)胞攝取DiI_acLDL
A) RAW 264. 7 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAff 264. 7以2X IO5個(gè)接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C，5% CO2 條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，用冰預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞2次，加入含10yM(DMS0含量為0. ) SAB的無(wú)血清DMEM-EBSS培養(yǎng)基，同時(shí)對(duì)照孔加入含0. 1% DMSO的相應(yīng)培養(yǎng)基。B)采用流式細(xì)胞儀研究SAB對(duì)細(xì)胞攝取Dil-acLDL的影響將上述細(xì)胞于37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入2 μ g/ml Dil-acLDL， 37°C孵育4小時(shí)。以冷PBS漂洗細(xì)胞1次，各孔分別加入Iml含有0. 5% BSA和2mM EDTA 的PBS，于4°C放置1小時(shí)。輕輕吹打并分散細(xì)胞，細(xì)胞懸液于4°C，800 X g，離心3分鐘。收 集細(xì)胞重懸于0. 5ml PBS中，過(guò)300目尼龍網(wǎng)后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)DiI的熒光值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6C，10 μ M和100 μ M丹酚酸B(SAB)對(duì)RAW 264. 7細(xì)胞攝取 Dil-acLDL的能力具有一定的抑制作用，抑制率分別可達(dá)10. 3%和35. 7%。實(shí)施例6丹酚酸B (SAB)抑制oxLDL對(duì)巨噬細(xì)胞中⑶36轉(zhuǎn)錄水平的誘導(dǎo)A)細(xì)胞總RNA的提取小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAW 264. 7以7X IO5個(gè)接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C，5% CO2 條件下培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)含終濃度為80 μ g/ml oxLDL的無(wú)血清DMEM-EBSS培養(yǎng)基處理細(xì)胞 12小時(shí)后，加入含10、100 μ M (DMS0含量為0. 1 % )丹酚酸B的無(wú)血清DMEM-EBSS培養(yǎng)基，同 時(shí)對(duì)照板加入含0. 1% DMSO的相應(yīng)培養(yǎng)基。37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)6小時(shí)后，用Trizol 試劑(Invitrogen)進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取(具體操作步驟按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。提 取細(xì)胞總RNA后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核糖體RNA (rRNA)的完整性并測(cè)定所提取RNA的濃 度。B)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)——cDNA的合成采用ThermoScript RT-PCR System 試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行，具體操作步驟 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)所述。模板RNA各4 μ g分別與ThermoScript 和引物RT Oligo (dT)20 混合，55°C保溫60分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后于85°C加熱5分鐘以終止反應(yīng)。所得 cDNA于_20°C保存或繼續(xù)進(jìn)行以下的PCR反應(yīng)。C) Real-time PCR 檢測(cè)采用SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR(ABI)試劑盒，將獲得的 cDNA 樣品 分別配置Real-Time PCR反應(yīng)體系。體系配置如下
Volume (μ )
2><PCR Master Mix12.5reverse primer (2 μΜ)2.5forward primer (2 μΜ)2.5模板7.5
25
將PCR反應(yīng)液置于Real-time PCR
Total將溶液混合，以5000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速短暫離心c 儀上，按下列反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。1 cycle 95°C，10 分鐘；30 cycles 95°C, 15 秒，60°C，30 秒，78°C，15 秒(收集熒光)；1 cycle 55°C，1 分鐘；1 cycle 95°C，1 分鐘；81 cycle 55_95°C，1°C/5 秒(測(cè)定溶解曲線(xiàn))。檢測(cè)目的基因及管家基因GAPDH (內(nèi)參)各自的擴(kuò)增曲線(xiàn)，將模板倍比稀釋后對(duì)Ct 值進(jìn)行線(xiàn)性擬合，R2均大于0.98 ；對(duì)引物進(jìn)行Melting curve檢測(cè)，結(jié)果均出現(xiàn)了唯一的 峰，且2%瓊脂糖電泳驗(yàn)證擴(kuò)增片段大小正確，說(shuō)明無(wú)非特異擴(kuò)增，符合采用Real-time PCR 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行定量的要求。
各樣品的目的基因和GAPDH基因分別進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。各樣品的Ct (閾 值循環(huán))值由儀器軟件 iQ5 Optical System versionl. 1. 1442. 0 Software (Bio-Rad)給
出。每個(gè)樣品中目的基因的相對(duì)含量利用△ ACt法計(jì)算，計(jì)算公式為 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7，丹酚酸B(SAB)可劑量依賴(lài)性地降低oxLDL誘導(dǎo)的RAW 264. 7細(xì) 胞中⑶36基因的mRNA水平上調(diào)作用，10 μ M及100 μ M丹酚酸B (SAB)作用后，其抑制率分 別為 31. 9%和 55. 5%。
權(quán)利要求
丹參根提取物水溶性組分丹酚酸類(lèi)化合物的用途，其中所述丹酚酸類(lèi)化合物具有作為CD36拮抗劑阻斷CD36與其相關(guān)配基結(jié)合的作用。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其中所述丹酚酸類(lèi)化合物選自式1化合物丹參素鈉、式2化 合物迷迭香酸和式3化合物丹酚酸B或其組合
3.權(quán)利要求1所述的用途，其中所述CD36的相關(guān)配基包括但不限于氧化低密度脂蛋 白、乙?；兔芏戎鞍住⑻腔K末產(chǎn)物、凝血酶敏感蛋白1、生長(zhǎng)激素釋放肽、長(zhǎng)鏈脂肪 酸、β淀粉樣蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞、 凋亡中性粒細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述的用途，其中丹酚酸B是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CD36，從而拮抗oxLDL與 ⑶36的結(jié)合。
5.丹參根提取物水溶性組分丹酚酸類(lèi)化合物用于制備阻斷CD36與其相關(guān)配基結(jié)合的 藥物的用途。
6.權(quán)利要求5所述的用途，其中所述丹酚酸類(lèi)化合物選自式1化合物丹參素鈉、式2化 合物迷迭香酸和式3化合物丹酚酸B或其組合
7.權(quán)利要求5所述的用途，其中所述CD36的相關(guān)配基包括但不限于氧化低密度脂蛋 白、乙酰化低密度脂蛋白、糖基化終末產(chǎn)物、凝血酶敏感蛋白1、生長(zhǎng)激素釋放肽、長(zhǎng)鏈脂肪 酸、β淀粉樣蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞、 凋亡中性粒細(xì)胞。
8.權(quán)利要求5所述的用途，其中丹酚酸B是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CD36，從而拮抗oxLDL與 ⑶36的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及丹參(Salvia miltiorrhiza)根提取物水溶性組分丹酚酸類(lèi)化合物的新用途，其中所述丹酚酸類(lèi)化合物選自式1化合物丹參素鈉、式2化合物迷迭香酸和式3化合物丹酚酸B或其組合。所述丹酚酸類(lèi)化合物具有作為CD36拮抗劑阻斷CD36與其相關(guān)配基結(jié)合的作用，其中所述CD36的相關(guān)配基包括但不限于氧化低密度脂蛋白(oxLDL)、乙?；兔芏戎鞍?acLDL)、糖基化終末產(chǎn)物(AGE)、凝血酶敏感蛋白1(TSP-1)、生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)、長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)、β淀粉樣蛋白(Aβ)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞、凋亡中性粒細(xì)胞等。本發(fā)明還涉及所述丹酚酸類(lèi)化合物用于制備阻斷CD36與其相關(guān)配基結(jié)合的藥物的用途。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101919906SQ200910252160
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月10日
發(fā)明者司書(shū)毅, 巫曄翔, 楊媛, 洪斌, 王麗, 王麗非, 陳曉芳, 鮑羿 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所