專利名稱：基于納米氧化石墨烯的載藥體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納米靶向藥物載體，尤其涉及一種基于納米氧化石墨烯的 靶向載藥體系。
背景技術(shù)：
納米靶向藥物載體是靶向治療的一種載體形式，粒徑在數(shù)納米至數(shù)百納米 之間，它以物理(磁場)或生物(配體受體識別、抗體抗原作用等)的方式使 藥物載體聚集在靶部位并平穩(wěn)釋放，提高耙部位的藥物濃度，增強(qiáng)治療效果； 同時(shí)減少其它部位的藥物分布，降低藥物的毒副作用。基于納米材料的耙向載 藥體系， 一般必須通過下面的步驟實(shí)現(xiàn)的首先，需要對其進(jìn)行表面修飾，以 避免納米材料發(fā)生團(tuán)聚。現(xiàn)在采用較多的是對納米材料進(jìn)行聚乙二醇(PEG) 修飾。聚乙二醇大分子的水溶性和空間位阻效應(yīng)使納米材料在生理環(huán)境中保持 穩(wěn)定。其次，在納米材料表面連接上靶向基團(tuán)，如多肽、抗體、小分子等，這 些靶向分子可以通過交聯(lián)劑鏈接到末端改性的聚乙二醇分子上。最后，通過化 學(xué)鍵合或包覆的方式將藥物裝載到納米材料上。目前，許多納米材料載藥體系 是核/殼結(jié)構(gòu)或多層結(jié)構(gòu)，即外面一層起到穩(wěn)定和靶向功能的作用，中間一層以 共價(jià)或疏水作用包裹藥物。這種多功能的納米材料，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，合成起來成本 較高，難度較大，不適宜于大量制備。
近年來的研究表明，碳納米材料，如單壁碳納米管和石墨烯有望作為一種 新型藥物載體，見文獻(xiàn)(Liu Z, Winters M， Holodniy M, and Dai H. Angew. Chem.Int. Ed. 2007, 46: 2023 -2027; Liu Z, Sun X, Nakayama-Ratchford N, and Dai H. ACSnano, 2007， 1: 50-56)的報(bào)道和美國專利(U.S. Pat. 20090087493)。但是，
一些因素限制了單壁碳納米管的應(yīng)用首先，與石墨烯相比，目前高純度的單 壁碳納米管還難以實(shí)現(xiàn)低成本規(guī)模制備；其次，單壁碳納米管之間的疏水作用
力很強(qiáng)，常以聚集的狀態(tài)存在，難以將其單根分散在水溶液屮，此外，以單壁 碳納米管作為藥物載體還涉及到一些復(fù)雜的化學(xué)修飾和純化過程。
水溶性納米氧化石墨烯是一種表面帶有含氧基團(tuán)的二維碳納米材料，可以 在氧化和超聲的條件下，利用塊體石墨制備，成本低廉。經(jīng)過進(jìn)一步化學(xué)修飾 后，可以在生理?xiàng)l件下保持良好的穩(wěn)定性而不發(fā)生團(tuán)聚。其表面的碳原子層可
以通過7Wt堆積或疏水作用吸附水溶性或不溶性的藥物分子，也可以將一些耙 向分子如葉酸、多肽、抗體等偶聯(lián)到碳原子層表面，形成具有靶向性能的藥物 載體。石墨烯衍生物本身生物毒性低，因此，納米氧化石墨烯可能是一種較為 理想的靶向藥物載體。

發(fā)明內(nèi)容
為提高納米材料作為藥物載體的靶向性，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)并提供一 種基于納米氧化石墨烯的載藥體系，以獲得針對不同病癥點(diǎn)，具有較強(qiáng)靶向性 的納米藥物載體，增強(qiáng)藥物分子針對不同病征點(diǎn)的治療效果，降低藥物對非病 征點(diǎn)的毒副作用。
本發(fā)明的目的，將通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)
一種基于納米氧化石墨烯的載藥體系，其特征在于該納米氧化石墨烯表 面含有羧基和磺酸基兩種親水性官能基團(tuán)，在化學(xué)交聯(lián)劑的配合下，納米氧化石墨烯的羧基與靶向分子偶聯(lián)，且納米氧化石墨烯的碳原子吸附并負(fù)載藥物分 子，形成靶向性的載藥體系。
進(jìn)一步地，前述基于納米氧化石墨烯的載藥體系，其中，靶向分子為葉
酸、多肽或抗體；而藥物分子為含有芳香環(huán)的藥物分子，如阿霉素、紫杉醇或
喜樹堿等。
更進(jìn)一步地，前述基于納米氧化石墨烯的載藥體系，其中，納米氧化石墨 烯負(fù)載的藥物分子可以是一種，也可以同時(shí)負(fù)載多種藥物分子。
本發(fā)明一種基于納米氧化石墨烯的載藥體系，其有益效果經(jīng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用證
明能夠切實(shí)提高藥物作用于各病癥點(diǎn)的靶向施藥及靶向細(xì)胞毒性，為腫瘤、 癌癥等病原的靶向治療提供了新的思路。


圖1是本發(fā)明納米氧化石墨烯偶聯(lián)葉酸的紅外光譜圖； 圖2a和圖2b是圖1所示載藥體系進(jìn)行細(xì)胞靶向?qū)嶒?yàn)的對比照片。其中， 圖2a為人肺癌細(xì)胞A549，圖2b為人乳腺癌細(xì)胞MCF-7;
圖3a和圖3b是圖1所示載藥體系進(jìn)行細(xì)胞耙向毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果柱狀圖。 其中，圖3a為載有阿霉素的上述靶向載藥體系對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的毒 性，圖3b為載有阿霉素的上述靶向載藥體系對人肺癌細(xì)胞A549的毒性。
具體實(shí)施例方式
為提高納米材料作為藥物載體的靶向性，本發(fā)明提供了一種基于納米氧化 石墨烯的載藥體系，特別地，該納米氧化石墨烯表面含有羧基和磺酸基兩種親 水性官能基團(tuán)，本身具有在含鹽溶液或細(xì)胞培養(yǎng)基中較強(qiáng)的穩(wěn)定性。在化學(xué)交聯(lián)劑的配合下，納米氧化石墨烯的羧基與靶向分子偶聯(lián)，且納米氧化石墨烯的 碳原子吸附并負(fù)載藥物分子，形成靶向性的載藥體系。
以下以葉酸作為靶向分子、阿霉素作為藥物分子的實(shí)驗(yàn)，對本發(fā)明藥物載 體的制備、功能發(fā)揮及效果作全面而詳細(xì)的介紹
首先從葉酸修飾納米氧化石墨烯來看，其實(shí)驗(yàn)方法為取納米氧化石墨烯
溶液(約40mg)，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 75mg，攪拌溶解，并超聲 5min，然后用D-hanks緩沖液調(diào)節(jié)溶液的pH至5。加入N3-[(3-二甲氨基)丙 基]-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 50mg至上述溶液中，超聲30min，再加入 巰基乙醇175(il，超聲5min。連接葉酸時(shí)，先用約10ml D-hanks溶液溶解 50mg葉酸，再將其加入上述納米氧化石墨烯溶液，超聲0.5h，再攪拌過夜。 將溶液10000rpm離心10min，取上清液透析24 48h。取透析后的溶液，冷凍 干燥后進(jìn)行紅外檢測，檢測結(jié)果顯示，葉酸成功連接到納米氧化石墨烯表面 (如圖1紅外光譜圖所示)。
接著從藥物或熒光染料與納米氧化石墨烯的吸附來看，其實(shí)驗(yàn)過程為取 上述葉酸修飾的納米氧化石墨烯5ml (約400pg/ml)，加入的藥物或熒光染料 200呢，室溫，攪拌過夜。對熒光染料DiI以及藥物阿霉素、喜樹堿等，在上述 反應(yīng)體系中，二甲亞砜的含量占20 — 80%，以避免染料和藥物分子沉淀。對羅 丹明b和異硫氰酸熒光素等水溶性的熒光染料，反應(yīng)體系中可不用二甲亞砜。 待吸附作用結(jié)束后，用截留分子量100000的超濾管離心除去游離的染料和藥 物分子，即得到負(fù)載有熒光染料和藥物的納米氧化石墨烯。
以下通過該生成的載藥體系的兩個(gè)靶向性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說明其實(shí)際的工作 情況及所能取得的效果。實(shí)施例一細(xì)胞耙向?qū)嶒?yàn)
本實(shí)例中，以吸附有羅丹明B的納米氧化石墨烯進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)。人肺癌細(xì) 胞(A549)不表達(dá)葉酸受體，人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)高表達(dá)葉酸受體，兩種 細(xì)胞均用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。試驗(yàn)的過程中，先將 A549細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞接種在六孔板中，培養(yǎng)24h，然后向每孔中加入5-10嗎/ml的吸附有熒光染料的納米氧化石墨烯，37。C哺育0.5-3h。哺育結(jié)束 后，用磷酸緩沖液清洗細(xì)胞，洗去未與細(xì)胞作用的氧化石墨烯。最后，用熒光 顯微鏡觀察羅丹明B的熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞的熒光信號要顯著強(qiáng) 于A549細(xì)胞的熒光信號，說明連接有葉酸的納米氧化石墨烯具有特定靶向功 能(如圖3a和圖3b所示)。
實(shí)施例二細(xì)胞靶向毒性實(shí)驗(yàn) 本實(shí)例以載阿霉素的納米氧化石墨烯的靶向細(xì)胞毒性為例。人肺癌細(xì)胞 A549和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7以5000-10000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，培養(yǎng) 24h后，加入不同濃度的載有阿霉素的納米氧化石墨烯，37'C哺育3h，然后撤 除納米氧化石墨烯，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)哺育24-48h。哺育結(jié)束后用WST-1 法檢測細(xì)胞的活性。結(jié)果顯示，連接有葉酸的納米氧化石墨烯具有明顯的靶向 細(xì)胞毒性(如圖4a和圖4b所示)。
權(quán)利要求
1.基于納米氧化石墨烯的載藥體系，其特征在于所述納米氧化石墨烯表面含有羧基和磺酸基兩種親水性官能基團(tuán)，在化學(xué)交聯(lián)劑的配合下，納米氧化石墨烯的羧基與靶向分子偶聯(lián)，且納米氧化石墨烯的碳原子吸附并負(fù)載藥物分子，形成靶向性的載藥體系。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米氧化石墨烯的載藥體系，其特征在 于所述靶向分子為葉酸、多肽或抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米氧化石墨烯的載藥體系，其特征在 于所述藥物分子為含有芳香環(huán)的藥物分子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于納米氧化石墨烯的載藥體系，其特征在 于所述納米氧化石墨烯負(fù)載的藥物分子為一種，或同時(shí)負(fù)載一種以上的藥物分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于納米氧化石墨烯的載藥體系，其特征在于該納米氧化石墨烯表面含有羧基和磺酸基兩種親水性官能基團(tuán)，在化學(xué)交聯(lián)劑的配合下，納米氧化石墨烯的羧基與葉酸、多肽或抗體等靶向分子偶聯(lián)，且納米氧化石墨烯的碳原子吸附并負(fù)載一種或多種含有芳香環(huán)的藥物分子，形成靶向性的載藥體系。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用證明，該載藥體系能夠切實(shí)提高藥物作用于各病癥點(diǎn)的靶向施藥及靶向細(xì)胞毒性，為腫瘤、癌癥等病原的靶向治療提供了新的思路。
文檔編號A61K47/04GK101670108SQ20091018392
公開日2010年3月17日 申請日期2009年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月13日
發(fā)明者夏景光, 張智軍, 張立明 申請人:蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所