專利名稱：一種含人參皂甙的油佐劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種新的疫苗佐劑及其制備方法，具體為一種含人參皂 甙的油佐劑及其制備方法，采用該佐劑制備疫苗可以大幅度提高疫苗誘導的特異性免疫反應 強度和減少注射部位的局部刺激反應。
背景技術：
,中國是世界第一養(yǎng)殖大國，畜禽數(shù)量龐大，每年出欄的生豬、肉牛、羊接近9億只(頭)。 動物疫病種類繁多，規(guī)?；B(yǎng)殖程度提高后，疫病更易傳播，因此動物疫病防治的任務十分 艱巨。使用疫苗對畜禽進行強制免疫，是疫病預防控制的重要措施之一。以偶蹄類動物(豬、 牛、羊等)口蹄疫為例，我國實施100%強制計劃免疫控制政策，每年需接種口蹄疫疫苗2 3次，年用疫苗總量為100億毫升，費用由國家和地方財政全額撥付，僅購買疫苗每年就需 支出十幾億元人民幣。
佐劑是滅活疫苗中的一種必備成分，起著增強或調節(jié)疫苗免疫反應的作用。每頭份成品 疫苗中約含佐劑l毫升，約占成品疫苗量的50%。我國目前采用的口蹄疫等滅活疫苗的佐劑 均為油佐劑，主要是國產(chǎn)礦物油和法國進口的油佐劑(簡稱206)。但是，目前一些商品油佐 劑疫苗的免疫效果不十分理想。比如謝琴[1等人的調查表明，注射了含油佐劑的口蹄疫疫苗 后僅有20.9%的仔豬產(chǎn)生了足夠強的免疫反應，其余的仔豬仍然存在感染的危險。郝大麗等 人在分析了 91份注射了含油佐劑的口蹄疫疫苗仔豬血清后發(fā)現(xiàn),僅有31.9%的血清所含的抗 體達到了保護性水平21。此外，油佐劑主要促進體液免疫反應，而對細胞免疫反應較弱。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服一些油佐劑疫苗免疫效果差和注射部位局部刺激大的缺點，為此， 本發(fā)明提供一種新的佐劑，采用該佐劑制備的疫苗可以在大幅度提高疫苗誘導的細胞和體液 免疫反應強度的同時，減少注射部位的局部刺激反應。
本發(fā)明的一種含人參皂甙的油佐劑，是一種由人參皂甙、佐劑油、硬脂酸鋁和山梨醇單 油酸酯組成的混合物，每毫升油佐劑中含人參皂式10 100 fig。
本發(fā)明人參皂甙的油佐劑的制備方法為
(1) 將制備佐劑的油加熱60 150'C，在每毫升油加入10 20毫克硬脂酸鋁，混勻
(2) 待油溫下降至50 20"后，按體積比加入5~7%去水山梨醇單油酸酯，攪拌均勻， 過濾，備用；
(3) 用二甲基亞砜或吐溫溶劑溶解人參皂甙成溶液；
(4) 在每毫升步驟2制得的備用物中加入人參皂甙溶液10 100Hg，混勻，11(TC滅菌30 分鐘，冷卻，即得。
所述制備油佐劑的佐劑油為MONTANIDE ISA 206油或國產(chǎn)10號白油。給油加熱為了使硬脂酸鋁更好溶解。
本發(fā)明的有益效果是，用含人參皂甙的油為佐劑制備而成的疫苗免疫動物可以大幅度提 高疫苗誘導的特異性細胞和體液免疫反應強度和減少注射部位的局部刺激反應。此外，將本 發(fā)明的新型油佐劑用于疫苗生產(chǎn)，無需改變現(xiàn)有生產(chǎn)工藝，方法簡便。


圖1:將70只ICR小鼠隨機分成7組，分別皮下注射0. 2ml下列實驗疫苗(1) FMDV + 生理鹽水組；(2) FMDV + IO號白油；(3) FMDV + IO號白油+ GSLS (1 Pg); (4) FMDV + 10 號白油+ GSLS (5 Pg); (5) FMDV + IO號白油+ GSLS (10 (6) FMDV + IO號白油+
GSLS (15 Pg); (7) FMDV + IO號白油+ GSLS (20 Mg)。每只小鼠注射2次，間隔3周。二 免后2周眼眶靜脈采血，檢測血清IgG水平。兩個柱狀圖上標字母不同者表示有顯著差異(P < 0.05)。
圖2:將70只ICR小鼠隨機分成7組，分別皮下注射0. 2ml下列實驗疫苗(1) FMDV + 生理鹽水組；(2) FMDV + IO號白油；(3) FMDV + IO號白油+ GSLS (2 (4) FMDV + 10 號白油+GSLS (4Pg); (5) FMDV+10號白油+ GSLS (6 Pg); (6) FMDV + 10號白油+ GSLS (8 M); (7) FMDV + IO號白油+ GSLS (10 Pg)。每只小鼠注射2次，間隔3周。二免后 2周眼眶靜脈采血，檢測血清IgG水平。兩個柱狀圖上標字母不同者表示有顯著差異(P < 0. 05)。
圖3:將40只ICR小鼠隨機分成5組，分別皮下注射0. 2ml下列實驗疫苗(1) 1劑量 FMDV抗原+生理鹽水組；(2) l劑量FMDV抗原+ 10號白油；(3) 1劑量FMDV抗原+ 10 號白油+GSLS; (4) 0.5劑量FMDV抗原+IO號白油+ GSLS; (5) 0. 25劑量FMDV抗原+10 號白油+ GSLS。每只小鼠注射2次，間隔3周。二免后2周眼眶靜脈采血，檢測血清IgG 水平。兩個柱狀圖上標字母不同者表示有顯著差異(P < 0.05)。
圖4:將40只ICR小鼠隨機分成5組，分別皮下注射0. 2ml下列實驗疫苗(1) 1劑量 FMDV抗原+生理鹽水組；(2) 1劑量FMDV抗原+206油；(3) 1劑量FMDV抗原+ 206油+ GSLS; (4) 0. 5劑量FMDV抗原+ 206油+ GSLS; (5) 0. 25劑量FMDV抗原+ 206油+ GSLS。 每只小鼠注射2次，間隔3周。二免后2周眼眶靜脈采血，檢測血清IgG水平。兩個柱狀圖 上標字母不同者表示有顯著差異(p 〈 0.05)。
圖5:將24只ICR小鼠隨機分成3組，分別皮下注射0. 2ml下列實驗疫苗(1) FMDV 抗原+ IO號白油；(2) FMDV抗原+ 206油；(3) FMDV抗原+ IO號白油+ GSLS。 每只小鼠注射2次，間隔3周。二免后2周眼眶靜脈采血，檢測血清IgG水平。兩個柱狀圖 上標字母不同者表示有顯著差異(P < 0.05)。
圖6:將48只ICR小鼠隨機分成6組，分別皮下注射0. 2ml下列實驗疫苗(1) FMDV 抗原+生理鹽水組；(2)商品FMDV疫苗；(3) FMDV抗原+10號白油；(4) FMDV抗原+10 號白油+ GSLS (4 Mg); (5) FMDV抗原+ 206油；(6) FMDV抗原+ 206油+ GSLS (4 Pg)。
4每只小鼠注射2次，間隔3周。二免后將小鼠脫臼處死后，置75%酒精中浸泡15分鐘，用眼 科剪從小鼠恥骨前緣將整個腹部皮膚剪下，浸泡在中性甲醛中固定24小時以上，使組織完 全固定。將皮膚用吸水紙吸干表面液體后，用游標卡尺測定皮膚厚度。兩個柱狀圖上標字母 不同者表示有顯著差異(P 〈 0.05)。
具體實施例方式
實施例所用主要試劑的說明
1、 硬脂酸鋁為溫州市化學用料廠產(chǎn)品，白色粉末，純度以Al20j標定，8.4 9.4%。
2、 去水山梨醇單油酸酯為溫州清明化工有限公司產(chǎn)品，其技術指標如下
脂肪酸％..................................................................................71-75
多元醇％....................................................................................29.5-3"
酸值(m沐OH/g;).......................................................................《8
皂化值(mgKOH/g) ...................................................................145-160
羥值(m沐OH/g) ......................................................................193-210
水分％........................................................................................《2.0
3、 白油為白色礦物油，杭州煉油廠產(chǎn)品。它是經(jīng)過特殊的深度精制后的礦物油。白油 無色、無味、化學惰性、光安定性能好，基本組成為飽和烴結構，芳香烴、含氮、氧、硫等 物質近似于零。由于這種超級的精制深度，在實際制造工藝中，難以對重質餾份實施，所以 白油的分子量通常都在250~450范圍之內。具有良好的氧化安定性，化學穩(wěn)定性，光安定 性，無色、無味，不腐蝕纖維紡織物。用作佐劑的為10號白油。
4、 吐溫購自溫州清明化工有限公司產(chǎn)品，規(guī)格
酸值(mgKOH/g)...............................................................《2.2
皂化值(mgKOH/g) .............................................................45-60
羥值(mgKOH/g) ...............................................................65-80
碘值(gl/100g) ................................................................18-24
PH值...............................................................................5.0-8.0
比重................................................................................1.06-1.09
粘度(mm2/S， 25'C) .........................................................350-550
...............................................................................《3.0
灼燒殘渣％........................................................................《0.2
金屬(Pb計)％..............................................................《0.001
冷凍試驗..........................................................................5±2'C/24hr
實施例1 :用國產(chǎn)10號白油制備含人參皂甙的油佐劑
1. 用量筒量取1000mll0號白油(杭州煉油廠產(chǎn)品)，置鋁鍋中。
2. 用電爐加熱白油，在白油中加入20g硬脂酸鋁，邊加，邊攪拌，使其完全溶解。3. 待白油溫度稍下降，在白油中加入60ml司班，攪拌均勻，用多層無菌醫(yī)用紗布過濾，得 清亮的油，備用。
4. 稱取4 g人參莖葉皂甙(吉林宏久藥業(yè)產(chǎn)品)，加入至IO ml二甲基亞砜(DMSO)中， 混勻，溶解，備用。
5. 取步驟4制得的人參莖葉皂甙溶液100微升加至步驟2制得的1000ml油佐劑中，充分混 勻，ll(TC, 30分鐘滅菌，冷卻，即得每毫升含人參皂甙40fig的油佐劑。
實施例2:法國MONTANIDE ISA 206油用于制備含人參皂甙的油佐劑
1. 用量筒量取1000ml MONTANIDE ISA 206佐劑(法國SEPPIC公司)，置鋁鍋中。
2. 用電爐加熱白油，在白油中加入16g硬脂酸鋁，邊加，邊攪拌，使其完全溶解。
3. 待白油溫度稍下降，在白油中加入60mlSpan-80,攪拌均勻，用多層無菌醫(yī)用紗布過濾， 得清亮的油，備用。
4. 稱取IO g人參莖葉皂甙(吉林宏久藥業(yè)產(chǎn)品)，加入至10ml二甲基亞砜(DMSO)中， 混勻，溶解，備用。
5. 取步驟4制得的人參莖葉皂甙溶液100微升加至步驟2制得的1000ml油佐劑中，充分混 勻，IIO'C， 30分鐘滅菌，冷卻，即得每毫升含人參皂甙100 jig的油佐劑。
實施例3: 油苗中人參皂甙不同含量對疫苗免疫效果的影響之一
1. 油佐劑的制備
(1) 用量筒量取1000mllO號白油(杭州煉油廠產(chǎn)品)，置鋁鍋中。
(2) 用電爐加熱白油，在白油中加入20g硬脂酸鋁，邊加，邊攪拌，使其完全溶解。
(3) 待白油溫度稍下降，在白油中加入60mlSpan-80,攪拌均勻，用多層無菌醫(yī)用紗布過 濾，得清亮的油，備用。
(4) 稱取0.5 g人參莖葉皂甙(GSLS)(吉林宏久藥業(yè)產(chǎn)品)，加入至含10 ml 二甲基亞砜 (DMSO)的試管中，混勻，溶解，備用。
(5) 取200 ml燒杯5只，在5只燒杯中分別加入步驟3制得的油100毫升，然后分別加入 步驟4制得的人參莖葉皂甙溶液25微升、125微升、250微升、375微升、500微升。充分混 勻，ll(TC， 30分鐘滅菌，冷卻，即得每毫升含人參皂甙分別為10微克、50微克、100微克、 150微克和200微克的油佐劑。
2. FMDV實驗疫苗的制備
在滅活O型口蹄疫病毒(FMDV) 10 ml中加入0.3ml吐溫-80,混勻。將1 ml FMDV抗原 加入到lml油相中，邊加入，邊攪拌，待水相全部加入后，再用高速攪拌器繼續(xù)繼續(xù)10分 鐘，即形成油包水型的油佐劑疫苗。
3. 實驗動物和分組
將70只ICR小鼠隨機分成7組，分別皮下注射0. 2ml下列實驗疫苗 (1) FMDV +生理鹽水組(2) FMDV + IO號白油
(3) FMDV + IO號白油+ GSLS (1 M )
(4) FMDV + IO號白油+ GSLS (5 Mg)
(5) FMDV + IO號白油+ GSLS (10 Pg)
(6) FMDV + IO號白油+ GSLS (15 Pg)
(7) FMDV + IO號白油+ GSLS (20 Pg) 每只小鼠注射2次，間隔3周。
4. 采樣
加強免疫后2周眼眶靜脈采血，血樣置4。C過夜，3000轉離心10分鐘，取血清置離心管中， -20。C保存，備用。
5. FMDV特異性IgG檢測
(1) 在ELISA板上每孔加入50^1經(jīng)碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋的?？筄型口蹄疫病毒抗 體(1:1000)(中國農科院蘭州獸醫(yī)研究所)，封板，4。C過夜。
(2) 用洗滌液洗滌5次，每次300fi1，拍干。每孔加入300nl磷酸鹽緩沖液(含5%脫脂奶 +0.05%吐溫-20)封閉，37。C孵育2小時。
(3) 用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次300fil，拍干。每孔加入50^1經(jīng)1:3稀釋的O型口蹄 疫病毒抗原，振蕩混勻，4°C孵育2小時。
(4) 用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次300ftl，拍干。每孔加入50jU經(jīng)磷酸鹽緩沖液(含0.05% 吐溫-20) l:50稀釋的待檢血清，37 °C孵育1小時。
(5) 用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次300ftl，拍干。每孔加入經(jīng)1: IOOO稀釋的山羊抗豚鼠 IgG(h+l)抗體(美國Betheyl Laboratory公司)。37 °C孵育1小時。
(6) 用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次300^1，拍干。每孔加入經(jīng)1:10000兔抗山羊IgG FC-HRP， 37 °C孵育1小時。用洗滌液洗滌5次，每次300jU，拍干。
(7) 每孔加入lOOjil TMB底物溶液。室溫孵育15分鐘，每孔加入50^1 2 M H2S04終止反 應，并輕輕振蕩混勻。在15分鐘內，用酶標儀測定在450nm波長的OD值。
6. 結果
含人參皂甙1至10 ^油佐劑疫苗組的FMDV特異性IgG水平高于不含人參皂甙的對照組，
其中含人參皂甙5 Pg油佐劑疫苗組IgG水平顯著高于不加人參皂甙的對照組(P < 0.05)。
實施例4:油苗中人參皂甙不同含量對疫苗免疫效果的影響之二
1.油佐劑的制備
步驟(1)至(4)同實例3。
(5)取200 ml燒杯5只，在5只燒杯中分別加入步驟3制得的油100毫升，然后分別加入 步驟4制得的人參莖葉皂甙溶液50微升、100微升、150微升、200微升、250微升。充分混 勾，IIO'C, 30分鐘滅菌，冷卻，即得每毫升含人參皂甙(GSLS)分別為20微克、40微克、
760微克、80微克和IOO微克的油佐劑。
2. FMDV實驗疫苗的制備 同實例3。
3. 實驗動物和分組
將70只ICR小鼠隨機分成7組，分別皮下注射0. 2ml下列實驗疫苗
(1) FMDV +生理鹽水組
(2) FMDV + 10號白油
(3) FMDV + IO號白油+ GSLS (2 Pg)
(4) FMDV + IO號白油+ GSLS (4 Mg)
(5) FMDV + IO號白油+ GSLS (6 Pg)
(6) FMDV + IO號白油+ GSLS (8 Pg)
(7) FMDV十IO號白油+ GSLS (10 Pg) 每只小鼠注射2次，間隔3周。
4. 采樣 同實例3。
5. FMDV特異性IgG檢測
同實例3。
6. 結果
含人參皂甙2至10 Pg油佐劑疫苗組的FMDV特異性IgG水平高于不含人參皂甙的對照組， 其中含人參皂甙5 Pg和6 Pg油佐劑疫苗組IgG水平顯著高于不加人參皂甙的對照組(P 〈
0. 05)。
實施例5:人參皂甙油佐劑(國產(chǎn)10號油)對不同抗原含量疫苗免疫效果的影響
1. 油佐劑的制備
步驟(1〉至(4)同實例3。
(5)在200 ml燒杯中加入步驟3制得的油IOO毫升，然后加入步驟4制得的人參莖葉皂甙 溶液100微升，充分混勻，IIO'C， 30分鐘滅菌，冷卻，即得每毫升含人參皂甙(GSLS) 40 微克油佐劑。
2. FMDV實驗疫苗的制備 同實例3。
3. 實驗動物和分組
將40只ICR小鼠隨機分成5組，分別皮下注射0. 2ml下列實驗疫苗-
(1) 1劑量FMDV抗原+生理鹽水組
(2) 1劑量FMDV抗原+ IO號白油
(3) 1劑量FMDV抗原+ IO號白油+ GSLS(4) 0.5劑量？鵬乂抗原+ IO號白油+ GSLS
(5) 0.25劑量FMDV抗原+ IO號白油+ GSLS 每只小鼠注射2次，間隔3周。
4. 采樣 同實例3。
5. FMDV特異性IgG檢測
(1) 在ELISA板上每孔加入50pl經(jīng)碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋的?？筄型口蹄疫病毒抗 體(1:1000)(中國農科院蘭州獸醫(yī)研究所)，封板，4。C過夜。
(2) 用洗滌液洗滌5次，每次300^11，拍干。每孔加入300W磷酸鹽緩沖液(含5%脫脂奶 +0.05%吐溫-20)封閉，37 。C孵育2小時。
(3) 用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次300W，拍干。每孔加入50^1經(jīng)1:3稀釋的O型口蹄 疫病毒抗原，振蕩混勻，4UC孵育2小時。
(4) 用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次300^1，拍干。在每排的第一孔加入經(jīng)磷酸鹽緩 沖液(含0.05%吐溫-20) l:20稀釋的待檢血清，然后作倍比稀釋。37°C孵育1小時。
(5) 用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次300jU，拍干。每孔加入經(jīng)1: 1000稀釋的山羊抗豚鼠 IgG(h+l)抗體(美國Betheyl Laboratory公司)。37 °C孵育1小時。
(6) 用磷酸鹽緩沖液洗滌5次,每次300jU,拍干。每孔加入經(jīng)1:10000兔抗山羊IgG FC-HRP， 37 °C孵育1小時。用洗滌液洗滌5次，每次300ji1，拍干。
(7) 每孔加入lOOfil TMB底物溶液。室溫孵育15分鐘，每孔加入2 M H2S04終止反 應，并輕輕振蕩混勻。在15分鐘內，用酶標儀測定在450mn波長的OD值。
(8) OD值大于cutoff值(未免疫小鼠血清經(jīng)上述方法處理所測的OD值，然后乘以2.1) 的為陽性， 一個血清一系列陽性孔中的最大稀釋倍數(shù)即為該血清的效價。
6. 結果
采用本發(fā)明方法以國產(chǎn)10號白油為原料制備含人參皂甙的新佐劑，用該佐劑配置FMDV 疫苗?？乖瓌┝肯嗟葧r，新佐劑疫苗的抗體效價(l:373)顯著髙于原佐劑疫苗的效價(1:109) (P < 0.05)。新佐劑和抗原劑量減半疫苗的抗體效價(1:202)高于原佐劑疫苗的效價(109)， 但無統(tǒng)計學差異(P > 0.05)。新佐劑和1/4抗原劑量疫苗的抗體效價(1:50)低于原佐劑疫 苗的效價(1:109)，但無統(tǒng)計學差異(P 〉 0.05)。說明采用本發(fā)明方法以國產(chǎn)10號白油為原 料制備的新佐劑可以減少抗原用量而免疫效果不變。
實施例6:人參皂甙油佐劑(ISA 206油)對不同抗原含量疫苗免疫效果的影響 1.油佐劑的制備
(1) 用量筒量取1000ml MONTANIDE ISA 206佐劑(法國SEPPIC公司)，置鋁鍋中。
(2) 用電爐加熱白油，在白油中加入20g硬脂酸鋁，邊加，邊攪拌，使其完全溶解。
(3) 待白油溫度稍下降，在白油中加入60mlSpan-80，攪拌均勾，用多層無菌醫(yī)用紗布過濾，得清亮的油，備用。
(4) 稱取0.5g人參莖葉皂甙(吉林宏久藥業(yè)產(chǎn)品)，加入至含10ml二甲基亞砜(DMSO) 的試管中，混勻，溶解，備用。
(5) 在200 ml燒杯中加入步驟3制得的油100毫升，然后加入步驟4制得的人參莖葉皂甙 溶液100微升，充分混勻，IIO'C， 30分鐘滅菌，冷卻，即得每毫升含人參皂甙40微克油佐 劑。
2. FMDV實驗疫苗的制備 同實例3。
3. 實驗動物和分組
將40只ICR小鼠隨機分成5組，分別皮下注射0. 2ml下列實驗疫苗
(1) 1劑量FMDV抗原+生理鹽水組
(2) 1劑量FMDV抗原+ 206油
(3) 1劑量FMDV抗原+ 206油+ GSLS
(4) 0. 5劑量FMDV抗原+ 206油+ GSLS
(5) 0. 25劑量FMDV抗原+ 206油+ GSLS 每只小鼠注射2次，間隔3周。
4. 采樣 同實例3。
5. FMDV特異性IgG檢測
(1) 在ELISA板上每孔加入50fU經(jīng)碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋的?？筄型口蹄疫病毒抗 體(1:1000)(中國農科院蘭州獸醫(yī)研究所)，封板，4。C過夜。
(2) 用洗滌液洗滌5次，每次300W，拍干。每孔加入300W磷酸鹽緩沖液(含5%脫脂奶 +0.05%吐溫-20)封閉，37°C孵育2小時。
(3) 用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次300jd，拍干。每孔加入50jU經(jīng)1:3稀釋的0型口蹄 疫病毒抗原，振蕩混勻，4°C孵育2小時。
(4) 用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次300jil，拍干。在每排的第一孔加入50fil經(jīng)磷酸鹽緩 沖液(含0.05%吐溫-20) l:20稀釋的待檢血清，然后作倍比稀釋。37°C孵育1小時。
(5) 用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次300ji1，拍干。每孔加入經(jīng)1: IOOO稀釋的山羊抗豚鼠 IgG(h+l)抗體(美國Betheyl Laboratory公司)。37 °C孵育1小時。
(6) 用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次300h1，拍干。每孔加入經(jīng)1:10000兔抗山羊IgG FC-HRP， 37°C孵育1小時。用洗滌液洗滌5次，每次300fd，拍干。
(7) 每孔加入100^1 TMB底物溶液。室溫孵育15分鐘，每孔加入50jtl 2 M H2S04終止反 應，并輕輕振蕩混勻。在15分鐘內，用酶標儀測定在450rnn波長的OD值。
(8) OD值大于cutoff值(未免疫小鼠血清經(jīng)上述方法處理所測的OD值，然后乘以2.1)的為陽性， 一個血清一系列陽性孔中的最大稀釋倍數(shù)即為該血清的效價。 6.結果
采用本發(fā)明方法以法國ISA 206油制備新型佐劑，用新佐劑配置的FMDV疫苗，抗原劑量相 等時，新佐劑疫苗的抗體效價(1:549)顯著高于原佐劑疫苗的效價(1:174) (P < 0.05)。新 佐劑和抗原劑量減半疫苗的抗體效價(1:254)高于原佐劑疫苗的效價(174),但無統(tǒng)計學差異 (P〉0. 05)。新佐劑和1/4抗原劑量疫苗的抗體效價(l: 160)低于原佐劑疫苗的效價(1:174)， 但無統(tǒng)計學差異(P 〉 0.05)。說明采用本發(fā)明方法以法國ISA 206油為原料制備的新佐劑可 以減少抗原用量而免疫效果不變。
實施例7:國產(chǎn)10號白油制成的新佐劑和法國ISA 206佐劑比較
1. 油佐劑的制備
10號白油的制備同實例5。法國206油的制備同實例6。
2. FMDV實驗疫苗的制備 同實例3。
3. 實驗動物和分組
將24只ICR小鼠隨機分成3組，分別皮下注射0. 2ml下列實驗疫苗
(1) FMDV抗原+ IO號白油
(2) FMDV抗原+ 206油
(3) 腦乂抗原+ IO號白油+ GSLS 每只小鼠注射2次，間隔3周。
4. 采樣 同實例3。
5. FMDV特異性IgG檢測
同實例3。
6. 結果
法國ISA 206油的價格10倍于國產(chǎn)10號白油。采用本發(fā)明的方法在國產(chǎn)10號白油中加入 人參皂甙可以大幅度改善國產(chǎn)油的佐劑性能。用該佐劑配置的疫苗免疫效果高于法國ISA 206 油配置的疫苗。
實施例8:人參莖葉皂甙對免疫注射局部的緩和剌激作用
1. 油佐劑的制備
10號白油的制備同實例5。法國206油的制備同實例6。
2. FMDV實驗疫苗的制備 同實例3。
3. 實驗動物和分組
將48只ICR小鼠隨機分成6組，分別皮下注射0. 2ml下列實驗疫苗(1) FMDV抗原+生理鹽水組(2) 商品FMDV疫苗(3) FMDV抗原+ IO號白油(4) FMDV抗原+ IO號白油+ GSLS (4 Pg)(5) FMDV抗原+ 206油(6) FMDV抗原+ 206油+ GSLS (4 Pg) 每只小鼠注射2次，間隔3周。4. 皮膚采集將小鼠脫臼處死后，標記組號，然后置75%酒精中浸泡15分鐘，用眼科剪從小鼠恥骨前緣將 整個腹部皮膚剪下，浸泡在中性甲醛中固定24小時以上，使組織完全固定。5. 皮膚厚度測量將已固定的皮膚用吸水紙吸干表面液體后，用游標卡尺測定皮膚厚度，記錄數(shù)據(jù)。6. 結果各組小鼠注射口蹄疫疫苗部位的皮膚厚度依次為商品苗組> ISA 206油苗組> IO號白油 油苗組> ISA 206油+ GSLS油苗組> IO號白油+ GSLS油苗。在ISA 206油和10號白油 中加入人參莖葉皂甙制備疫苗免疫動物，注射部位的皮膚厚度顯著減少(P < 0.05)，說明 本發(fā)明的新型佐劑可以減輕油佐劑疫苗的局部刺激性。
權利要求
1、一種含人參皂甙的油佐劑，該油佐劑應用于疫苗制備，其特征在于該油佐劑是一種由人參皂甙、佐劑油、硬脂酸鋁和山梨醇單油酸酯組成的混合物，每毫升油佐劑中含人參皂甙10～100μg。
2、 如權利要求1所述一種含人參皂甙的油佐劑的制備方法，其特征在于以下步驟(1) 將制備佐劑的油加熱60 150'C，在每毫升油加入10 20毫克硬脂酸鋁，混勻；(2) 待油溫下降至50 20'C后，按體積比加入5 7。/。去水山梨醇單油酸酯，攪拌均勻， 過濾，備用；(3) 用二甲基亞砜或吐溫溶劑溶解人參皂甙制成溶液；(4) 在每毫升步驟2制得的備用物中加入人參皂甙溶液10 100ng,混勻，110'C滅菌30 分鐘，冷卻，即得。
3、 如權利要求2所述一種含人參皂甙的油佐劑的制備方法，其特征在于所述制備油佐劑的 佐劑油為MONTANIDE ISA 206油或國產(chǎn)10號白油。
全文摘要
本發(fā)明為一種含人參皂甙的油佐劑及其制備方法，該油佐劑是一種由人參皂甙、佐劑油、硬脂酸鋁和山梨醇單油酸酯組成的混合物，每毫升油佐劑中含人參皂甙10～100μg。其制備方法為將制備佐劑的油加熱60～150℃，在每毫升油加入10～20毫克硬脂酸鋁，混勻；待油溫下降至50～20℃后，按體積比加入5～7％去水山梨醇單油酸酯，攪拌均勻，過濾，備用；用二甲基亞砜或吐溫溶劑溶解人參皂甙成溶液；在每毫升制得的備用物中加入人參皂甙溶液10～100μg，混勻，110℃滅菌30分鐘。用含人參皂甙的油為佐劑制備而成的疫苗免疫動物可以大幅度提高疫苗誘導的特異性細胞和體液免疫反應強度和減少注射部位的局部刺激反應。
文檔編號A61K39/39GK101670104SQ20091015297
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月24日 優(yōu)先權日2009年9月24日
發(fā)明者胡松華 申請人:浙江大學