專利名稱：施用偶合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及施用用于治療由致病細胞(pathogenic cells)所致的疾病狀態(tài)的配 體偶合物(conjugate)的方法。更特別地，將定向的配體-免疫原偶合物施用于患病宿主 以治療疾病例如癌癥、炎癥以及由活化的免疫細胞所致的其他疾病。發(fā)明背景和簡述哺乳動物免疫系統(tǒng)提供識別和消除腫瘤細胞和其他致病細胞的手段。雖然免疫系 統(tǒng)通常提供堅強的防線，但是仍有許多情況下癌細胞和其他致病細胞避開了宿主免疫應答 并保持了并發(fā)的宿主病原性。已經(jīng)開發(fā)了化療劑和放射療法以消除復制的癌細胞。然而， 大多數(shù)(如果不是所有的話)當前可得的化療劑和放射療法方案具有不利的副作用，因為 它們不僅破壞癌細胞，而且它們還影響正常宿主細胞例如造血系統(tǒng)的細胞。此外，可發(fā)生對 化療劑的抵抗。癌細胞產(chǎn)生對化療劑的抵抗的能力以及當前可得的抗癌藥物的不利副作用 強調(diào)了對于開發(fā)具有特異性和減少的宿主毒性的新的定向療法的需要。本文所述的方法涉及通過增加宿主免疫系統(tǒng)對致病細胞群體的識別和應答來消 除宿主中的此類細胞群體。實際上，增加了致病細胞的抗原性以增強內(nèi)源性免疫應答介 導的致病細胞消除。該方法包括施用配體-免疫原偶合物，其中所述配體能夠在體內(nèi)特 異性結(jié)合至獨一無二地表達、優(yōu)先表達或過量表達配體結(jié)合部分的致病細胞群體，而且 配體偶合的免疫原能夠引發(fā)抗體產(chǎn)生或者能夠被宿主動物中內(nèi)源性或共同施用的外源 性抗體所識別。免疫系統(tǒng)介導的致病細胞消除是由免疫原偶合的配體與受體、轉(zhuǎn)運蛋白 (transporter)或由致病細胞所獨一無二地表達、過量表達或優(yōu)先表達的其他表面呈遞蛋 白的結(jié)合指導的。由致病細胞所獨一無二地表達、過量表達或優(yōu)先表達的表面呈遞蛋白是 不存在或少量存在于非致病細胞上的受體，其提供選擇性消除致病細胞的手段。至少一種 另外的治療因子例如免疫系統(tǒng)刺激劑、細胞殺傷劑、腫瘤穿透增強劑、化療劑或細胞毒性免 疫細胞可被共同施用于宿主細胞以增強治療效力。在一個實施方案中，提供了治療宿主動物以消除致病細胞的方法。所述方法包 括如下步驟向宿主動物施用半抗原-載體偶合物；向宿主動物施用Th-I偏向佐劑(Th-I biasing adjuvant)，其中半抗原-載體偶合物與Th-I偏向佐劑的重量比是從約1 10 至約1 1 ；并且向宿主動物施用偶合至半抗原的配體，其中配體-半抗原偶合物在施用 半抗原-載體偶合物的第一周或者稍晚時間被施用，其中所述稍晚時間是在完成使用半抗 原-載體偶合物的第一治療周期之前。在另外的實施方案中，致病細胞是癌細胞，致病細胞 是活化的免疫細胞，或者所述活化的免疫細胞是巨噬細胞或單核細胞。在另一個實施方案中，配體-半抗原偶合物是在施用半抗原-載體偶合物的第一、第二、第三或第四周被施用 的。在又其他的實施方案中，配體是結(jié)合維生素受體的配體，所述配體選自由葉酸和 其他結(jié)合葉酸(folate)受體的配體所組成的組，所述配體是具有只通過配體的谷氨酰 基Y “羧基部分與所述半抗原共價連接的谷氨酰基部分的葉酸類似物，所述配體是具有 只通過配體的谷氨?；?羧基部分與所述半抗原共價連接的谷氨?；糠值娜~酸類似 物，或者所述配體是能夠結(jié)合至受體的小有機分子，并且其中所述受體在所述致病細胞群 體的表面上被優(yōu)先表達、獨一無二地表達或過量表達。在其他方面，半抗原是具有少于 20，000道爾頓的分子量的有機分子，并且/或者所述有機分子選自由熒光素、硝基苯基 (nitrophenyl)和多硝基苯基(polynitrophenyl)所組成的組。在其他說明性的方面，該方法還包括向宿主動物施用免疫刺激劑的步驟，所述 免疫刺激劑是細胞因子，所述細胞因子包括IL-2、IL-12、IL-15或其組合，或者所述細胞 因子包括與IFN-Y或IFN-α聯(lián)合的IL_2、IL-12、IL-15或其組合。在其他實施方案 中，以多次注射施用配體_半抗原偶合物的組合物，半抗原_載體偶合物的施用包括接種 (vaccination)，并且/或者半抗原-載體偶合物與Th-I偏向佐劑的重量比是從約1 8至
約1 1、約1 6至約1 1、約1 4至約------1 1、約1 3至約1 1，或者是約
1 3 或約 1 2. 5。在另一個說明性的實施方案中，佐劑是皂樹皂甙，佐劑是修飾的皂甙佐劑，載體是 鑰孔蜮形血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)，或者半抗原-載體偶合物具有下式 其中KLH是鑰孔蜮形血藍蛋白，而且配體-半抗原偶合物具有下式 或其藥學上可接受的鹽。在上述任一個實施方案中，提供了治療宿主動物以消除致病細胞的方法，其中所 述方法包括如下步驟向宿主動物施用半抗原-載體偶合物，向宿主動物施用Th-I偏向佐 劑，并且向宿主動物施用偶合至半抗原的配體，其中配體-半抗原偶合物在用半抗原-載體偶合物的第一治療周期中被施用。附圖簡述

圖1顯示測定結(jié)果，其中測量了使用葉酸-FITC的早期或晚期給藥時注射了 Bis-EDA-FITC和葉酸-FITC的小鼠的直腸溫度。使用1 μ g劑量的KLH-FITC對小鼠預先免疫。圖2顯示使用葉酸-FITC的早期或晚期時給藥注射了 Bis-EDA-FITC和葉酸-FITC 的小鼠的直腸溫度。使用35 μ g劑量的KLH-FITC對小鼠預先免疫。圖3顯示使用葉酸-FITC的早期或晚期給藥時的葉酸定向的免疫療法對于具有乳 腺腫瘤植入物的小鼠的存活的作用。使用35μ g劑量的KLH-FITC對小鼠預先免疫。圖4顯示葉酸-FITC的示例性結(jié)構(gòu)。
圖5顯示KLH-FITC的示例性結(jié)構(gòu)。圖6顯示KLH-FITC與葉酸-FITC相對比的給藥方案。圖7顯示示例性的給藥簡圖。圖A 在第23天靜脈內(nèi)施用單劑的EC17。圖B 在第8-12、15-19和22天用EC17的多次皮下給藥對小鼠脫敏。圖8顯示被免疫的小鼠中抗FITC IgE抗體的產(chǎn)生。圖9顯示被免疫的豚鼠中的過敏反應測定。發(fā)明詳述提供了對患有癌癥或由活化的免疫細胞如巨噬細胞或單核細胞所致的疾病狀態(tài) 的宿主的治療性治療方法。該方法通過標記抗原性的致病細胞以導致宿主免疫系統(tǒng)對它們 的識別和消除從而導致免疫應答介導的致病細胞消除的增強。該方法利用能夠高親結(jié)合至 癌細胞或其他致病細胞例如活化的免疫細胞的配體_免疫原偶合物。所述配體_免疫原偶 合物裝飾致病細胞以使它們顯示抗原性，并被宿主自身的免疫系統(tǒng)或被例如共同施用的抗 體消除。該方法還可利用組合療法，其通過使用配體_免疫原偶合物和能夠刺激內(nèi)源性免 疫應答的另外的治療因子(例如，免疫刺激劑，如細胞因子)而實現(xiàn)。本文所述方法被用來在含有致病細胞群體的宿主動物中增強內(nèi)源性免疫應答介 導的致病細胞群體消除。本發(fā)明適用于導致各種病狀例如癌癥和炎癥的致病細胞群體。在 各方面，致病細胞群體可以是致瘤性的癌細胞群體，包括良性腫瘤和惡性腫瘤，或者它可以 是非致瘤性的。在其他實施方案中，癌細胞群體可自發(fā)地或通過例如存在于宿主動物種系 中的突變或體細胞突變等過程產(chǎn)生，或者它可被化學、病毒或放射誘導。在其他說明性的實 施方案中，該方法可被用來治療癌癥例如癌、肉瘤、淋巴瘤、Hodgekin氏疾病、黑素瘤、間皮 瘤、Burkitt氏淋巴瘤、鼻咽癌、白血病和骨髓瘤。在各種其他實施方案中，癌細胞群體可包 括但不限于口腔癌、甲狀腺癌、內(nèi)分泌癌、皮膚癌、胃癌、食管癌、喉癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、膀胱 癌、骨癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、乳腺癌、睪丸癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、肝癌和肺癌。本文所述方法可被用于人類臨床醫(yī)學和獸醫(yī)應用。在各種說明性的方面，含有致 病細胞群體并用配體-免疫原偶合物治療的宿主動物可以是人(例如人類患者)，或者在獸 醫(yī)應用的情況下可以是實驗室的、農(nóng)用的、家養(yǎng)的或野生的動物。在各種說明性的實施方案中，可通過腸胃外例如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈 內(nèi)將配體-免疫原偶合物施用于宿主動物。在其他實施方案中，可通過其他醫(yī)學上有用的 過程將偶合物施用于宿主動物，并且可使用任何有效的劑量和適合的治療劑型，包括延長釋放劑型。說明性地，本文所述方法可與腫瘤的手術(shù)移除、放射療法、化療或生物療法例如 其他免疫療法聯(lián)合使用，所述其他免疫療法包括但不限于單克隆抗體療法，使用免疫調(diào)節(jié) 劑的治療，免疫效應細胞的過繼性轉(zhuǎn)移，使用造血生長因子、細胞因子和接種的治療。根據(jù)本文所述的方法，可從多種多樣的配體和免疫原中選擇配體-免疫原偶合 物。所述配體可由于致病細胞上可用于配體結(jié)合的所述配體的受體的優(yōu)先表達而能夠特 異性結(jié)合宿主動物中的致病細胞。在各種示例性的實施方案中，可接受的配體包括葉酸、 葉酸類似物和其他結(jié)合葉酸受體的分子，其他維生素，由文庫篩選鑒定的肽配體，腫瘤特 異性肽，腫瘤特異性適體，腫瘤特異性糖類，腫瘤特異性單克隆或多克隆抗體，抗體Fab或 scFv(即單鏈可變區(qū))片段或轉(zhuǎn)移癌細胞上特別表達的或可獨特地接近的其他蛋白，衍生 自組合文庫的小有機分子，生長因子例如EGF、FGF、胰島素和胰島素樣生長因子、以及同源 多肽、生長抑素及其類似物，轉(zhuǎn)鐵蛋白，脂蛋白復合物，膽汁鹽，選擇蛋白，類固醇激素，含 Arg-Gly-Asp的肽，類視黃醇，各種半乳凝素，Y _阿片樣受體配體，縮膽囊素A受體配體，血 管緊張素ATl或AT2受體的特異性配體，過氧化物酶體增殖物激活的受體γ配體以及特異 性結(jié)合優(yōu)先表達在腫瘤細胞或活化的免疫細胞表面的受體的其他分子，或者任何這些分子 的片段。如本文所用，“結(jié)合葉酸受體的配體”包括能夠高親結(jié)合葉酸受體的任何配體，其包 括結(jié)合葉酸受體的類似物和衍生物。在各種實施方案中，結(jié)合葉酸受體的配體可以是葉酸、葉酸類似物或另外的結(jié)合 葉酸受體的分子?？杀皇褂玫娜~酸類似物包括亞葉酸、蝶酰多谷氨酸(pteropolyglutamic acid)和結(jié)合葉酸受體的蝶啶例如四氫蝶啶、二氫葉酸、四氫葉酸和它們的脫氮和雙脫氮類 似物。術(shù)語“脫氮”和“雙脫氮”類似物是指用一個碳原子取代天然存在的葉酸結(jié)構(gòu)中一個或 兩個氮原子的本領(lǐng)域公認的類似物。例如，脫氮類似物包括1-脫氮、3-脫氮、5-脫氮、8-脫 氮和10-脫氮類似物。雙脫氮類似物包括例如1，5-雙脫氮、5，10-雙脫氮、8，10-雙脫氮 和5，8_雙脫氮類似物。前述葉酸類似物通常被稱作“葉酸類物質(zhì)(folates)”，這反映了它 們結(jié)合葉酸受體的能力。其他結(jié)合葉酸受體的類似物包括氨蝶呤、氨甲蝶呤(甲氨蝶呤)、 N10-甲基葉酸、2-脫氨基-羥基葉酸、脫氮類似物例如1-脫氮甲蝶呤或3-脫氮甲蝶呤和 3'，5' -二氯-4-氨基-4-脫氧-Nltl-甲基蝶酰谷氨酸(二氯甲氨蝶呤)。還可使用任何 其他結(jié)合葉酸受體的類似物或衍生物例如在美國專利第2，816，110,5, 140，104,5, 552，545 或6，335，434號中所述的那些，其通過引用并入本文?？梢允褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的任何葉 酸類似物或衍生物例如在Westerhof等人，Mol. Pharm. 48 :459_471 (1995)中所述的那些， 其通過引用并入本文。結(jié)合至葉酸受體的另外的說明性葉酸類似物(即結(jié)合葉酸受體的配體)被描述在 美國專利申請公布第2005/0227985和2004/0242582號中，其公開通過引用并入本文。說
明性地，這種葉酸類似物具有通用式，其中(*)表示另外的二價連接基團的連接點 其中X和Y各自獨立地選自由鹵素、R2、OR2、SR3和NR4R5所組成的組；
U、V 和 W 表示各自獨立地選自由-(R6a) C =、N =、- (R6a) C (R7a)-和-N (R4a)-所組 成的組的二價部分；Q選自由C和CH所組成的組；T選自由S、0、N和-C = C-所組成的組；A1 和 A2 各自獨立地選自由氧、硫、-C(Z)-, -C(Z)O-, _0C(Z)-、-N(R4b)-, -C(Z) N (R4b) -、-N (R4b) C(Z)-, -OC (Z) N (R4b)、-N (R4b) C (Z) 0-、-N (R4b) C (Z) N(R5b) -、-S (0) -、-S (0) 2_、-N(R4a) S (0) 2-、_C (R6b) (R7b)-,-N(C = CH) -,-N(CH2C = CH) _、C1-C12 烯基和C1-C12烯氧基(alkyeneoxy)所組成的組，其中Z是氧或硫；R1選自由氫、鹵素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基所組成的組；R2、R3、R4、R4a> R4\ R5、 R5b、R6b和R7b各自獨立地選自由氫、鹵素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12烷?；?、C1-C12烯 基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基和(C1-C12烷氨基)羰基所組成的組；R6和R7各自獨立地選自由氫、鹵素、C「C12烷基和C「C12烷氧基所組成的組；或者， R6和R7合起來形成羰基；R6a和R7a各自獨立地選自由氫、鹵素、C1-C12烷基和C1-C12烷氧基 所組成的組；或者R6a和R7a合起來形成羰基；L是本文所述的二價連接體；而且11、？、1~、8和1各自獨立地是0或1。在葉酸的這種結(jié)合葉酸受體的類似物的一個方面，當s是1時，t是0，而且當s是 0時，t是1。在這種葉酸類似物的另一個方面，η和r都是1，而且連接體La是通過酰胺鍵 在其α-氨基處共價連接于A2的天然存在的氨基酸。說明性氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸 以及類似氨基酸。前述葉酸類似物和/或衍生物通常被稱作“葉酸類物質(zhì)”，這反映了它們結(jié)合葉 酸受體的能力，而且當與外源性分子偶合時這種配體對于增強例如通過本文所述的葉酸介 導的胞吞作用的跨膜轉(zhuǎn)運是有效的。因此，如本文所用，將理解的是，術(shù)語“葉酸類物質(zhì)” 既具體地指用于形成偶合物的葉酸，或者可選地指能夠結(jié)合葉酸(folate)或葉酸(folic acid)受體的葉酸類似物或其衍生物(即結(jié)合葉酸受體的配體)。在另一個實施方案中，其他維生素可被用作配體。例如，可根據(jù)本文所述方法使用 的維生素包括煙酸、泛酸、葉酸、核黃素、硫胺、生物素、維生素B12、維生素A、D、E和K、其他相 關(guān)的維生素分子、其類似物和衍生物，以及其組合(參見美國專利第5，108，921,5, 416，016 和5，635，382號，其通過引用被并入本文)。在一個說明性的方面，配體的結(jié)合位點可包括能夠特異性結(jié)合受體的任何分子的 受體，其中所述受體或其他蛋白被優(yōu)先表達在致病細胞包括例如癌細胞或活化的免疫細胞 的群體上。在各種實施方案中，結(jié)合位點可以是生長因子、維生素、肽包括阿片樣肽、激素、 抗體、糖類或小有機分子的受體，或者結(jié)合位點可以是腫瘤特異性抗原。在一個實施方案 中，配體-免疫原偶合物的組合可被用來使使致病細胞的靶向最大化以通過宿主的免疫應 答或通過共同施用的抗體進行消除。在本文所述方法的各種實施方案中，可使用預先存在的免疫或構(gòu)成先天免疫系統(tǒng) 的部分的免疫。在另一個實施方案中，針對免疫原的抗體可被施用于宿主動物以建立被動 免疫。在說明性的方面，用于本發(fā)明的適合的免疫原包括已針對其發(fā)展預先存在的免疫的 抗原或抗原性肽，其中所述預先存在的免疫是通過正常安排的接種或之前對媒介物的天然 接觸發(fā)展而來的，所述媒介物例如脊髓灰質(zhì)炎病毒、破傷風、斑疹傷寒、風疹、麻疹、腮腺炎、 百日咳、肺結(jié)核和流感抗原以及α-半乳糖基。在這種情況下，配體-免疫原偶合物將被用來重新指導對宿主動物中致病細胞的之前獲得的體液或細胞免疫以消除外來細胞或致 病生物體。在其他實施方案中，免疫原可以是宿主動物已經(jīng)通過針對非天然抗原或半抗原 (例如異硫氰酸熒光素、二硝基苯基或三硝基苯基)的免疫對其發(fā)展了全新的免疫的抗原 或抗原性肽，以及存在針對其的先天免疫的抗原(例如超抗原和胞壁酰二肽)或者例如具 有少于20，000道爾頓的分子量的小有機分子。如本文所用，“免疫原”是一種不是抗體的化 合物，而且免疫原是醫(yī)生在治療方法中為了引發(fā)IgG或IgM抗體應答以導致治療性應答而 施用的化合物。在各種說明性的方面，可利用本領(lǐng)域公認的形成偶合物的任何方法來將本發(fā)明 的配體和免疫原偶合，所述方法包括將配體直接地或通過連接基團例如二價連接體間接 地與免疫原形成共價鍵、離子鍵或氫鍵連接。例如，通常通過在配體與免疫原之間形成共 價鍵來形成偶合物，所述共價鍵是通過在復合物相應成分上的酸、醛、羥基、氨基或胼撐之 間形成酰胺、酯或亞氨基鍵而形成的。將配體連接至免疫原的方法被描述在PCT公布第 W02006/012527號中，其通過引用被并入本文。另外，在各種實施方案中，進行了偶合物連接體部分的結(jié)構(gòu)修飾。例如，可對偶合 物連接體部分進行若干氨基酸取代，其包括但不限于天然存在的氨基酸以及從傳統(tǒng)合成方 法可得的那些。在一個方面，β、Y和較長鏈氨基酸可被用來替代一個或多個α氨基酸。 在另一方面，可選擇在這種分子中發(fā)現(xiàn)的手性中心的立體化學以形成完整分子的光學純度 的各種混合，或者僅僅是存在的手性中心的子集。在另一方面，包含在連接體內(nèi)的肽鏈的長 度可被縮短或加長，這是通過改變其中所包含的氨基酸數(shù)量或通過包括更多或更少的β、 Y或較長鏈氨基酸。在另一方面，可以進行肽部分中氨基酸側(cè)鏈的選擇以增加或減少連接 體部分特別的或者整個分子總體的相對親水性。相似地，本文所述連接體的其他化學片段的長度和形狀可被修飾。在一個方面，連 接體包括亞烴基鏈(alkylene chain)。所述亞烴基鏈長度可不同，或者可包括支鏈基團，或 者可包括環(huán)狀部分，其所述環(huán)狀部分相對于亞烴基鏈可以是處于線性位置(in line)或螺 方 位置(in spiro)。在一個實施方案中，所述配體是葉酸、葉酸類似物或任何其他結(jié)合葉酸受體的分 子，而且通過一種步驟將葉酸配體偶合至免疫原，所述步驟利用三氟乙酸酐通過蝶酰疊氮 化物中間產(chǎn)物制備葉酸的Y-酯而導致葉酸配體的合成，所述葉酸配體只通過葉酸的谷氨 酸基團的Y-羧基偶合至免疫原，其中Y-偶合物以高度親和力結(jié)合葉酸受體，避免Y-偶 合物和α-偶合物的混合物的形成。在另一個實施方案中，可從其中Y-羧基被選擇性地阻斷的中間產(chǎn)物制備α-偶 合物，α-偶合物形成而Y-羧基隨后用本領(lǐng)域公認的有機合成方案和步驟解除阻斷。在本文所述的方法中，配體-免疫原偶合物增強內(nèi)源性免疫應答介導的致病細胞 消除。例如，內(nèi)源性免疫應答可包括體液應答；細胞介導的免疫應答；以及對宿主動物是 內(nèi)源性的任何其他免疫應答，包括補體介導的細胞溶解，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)，導致吞噬作用的抗體調(diào)理作用，導致凋亡、抗增殖或分化的信號轉(zhuǎn)導的抗體結(jié)合之 后的受體聚集以及遞送的抗原/半抗原的直接免疫細胞識別。在各種方面，內(nèi)源性免疫應 答可包括例如B細胞、T細胞包括輔助T細胞和細胞毒性T細胞、巨噬細胞、天然殺傷細胞、 中性粒細胞、LAK細胞以及類似細胞的免疫細胞類型的參與。
在一個實施方案中，體液應答可以是由如下步驟所誘發(fā)的應答正常安排的接種， 或者使用天然抗原或非天然抗原或半抗原(例如異硫氰酸熒光素、硝基苯基或多硝基苯基 (例如二硝基苯基或三硝基苯基))的主動免疫，所述非天然抗原或半抗原誘發(fā)全新免疫。 例如，主動免疫可包括在正常接種方案之外安排的誘發(fā)全新免疫的天然抗原、非天然抗原 或半抗原的多次注射。根據(jù)本文所述的方法，所述天然抗原、非天然抗原或半抗原可與佐劑 (在相同或不同溶液中)例如皂樹皂甙佐劑(例如GPI-0100)或任何其他Th-I偏向佐劑聯(lián) 合施用。在一個實施方案中，用半抗原-載體(例如KLH或BSA)偶合物和TH_1偏向佐劑對 宿主預先免疫以引發(fā)對半抗原的預先存在的免疫。配體-半抗原偶合物然后被施用于宿主 導致體液或細胞介導的免疫應答或二者，所述免疫應答針對結(jié)合至靶致病細胞的配體_半 抗原偶合物。在一方面，用相同或不同溶液中的半抗原_載體偶合物和Th-I偏向佐劑聯(lián)合 將宿主預先免疫。在該實施方案中，Th-I偏向佐劑在隨后施用配體-半抗原偶合物之后增 強對半抗原的免疫應答?？杀皇褂玫氖纠缘妮d體包括鑰孔域形血藍蛋白(KLH)、疣鮑(Haliotis tuberculata)血藍蛋白(HtH)、滅活的白喉毒素、滅活的破傷風類毒素、結(jié)核分支桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)的純化的蛋白衍生物(PPD)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋 白(OVA)、g-球蛋白、甲狀腺球蛋白、肽抗原和合成載體例如多聚-L-賴氨酸、樹枝狀聚合物 和脂質(zhì)體。在使用半抗原的實施方案中，半抗原通常被偶合至載體以形成半抗原-載體偶合 物。可使用上述任何方法偶合半抗原和載體。例如，可使用本領(lǐng)域公認的形成復合物的方 法來將載體(例如KLH或BSA)偶合至半抗原，所述方法包括將載體直接地或通過連接基團 例如二價連接體間接地與半抗原形成共價鍵、離子鍵或氫鍵連接。通常通過形成共價鍵來 形成半抗原-載體偶合物，所述共價鍵通過在偶合物相應成分上的酸、醛、羥基、氨基或胼 撐之間形成酰胺、酯或亞氨基鍵而形成。在使用連接體的實施方案中，連接體通常包含約1 至約30個碳原子，更通常地約2至約20個碳原子。通常使用較低分子量的連接體(即具 有約20至約500近似分子量的那些)。在另一個實施方案中，連接體可包括將載體與半抗 原締合的間接手段(means)，例如通過中間連接體、間隔臂或橋分子的連接。在使用半抗原-載體偶合物(參見例如圖5)的實施方案中，半抗原-載體偶合物 與Th-I偏向佐劑的重量比可以是從約1 10至約1 1、約1 8至約1 1、約1 6 至約1 1、約1 4至約1 1、約1 3至約1 1，或者可以是約1 3或約1 2.5。 在使用半抗原_載體偶合物的其他說明性的方面，半抗原_載體偶合物與Th-I偏向佐劑的 摩爾比可以是從1.0X 10_3至約6X 10_5。在一個實施方案中，可以使用將免疫應答偏向于ThI應答的佐劑?？赏ㄟ^免疫球 蛋白同種型分布分析在小鼠中測量佐劑誘導的ThI偏向免疫。將免疫應答偏向于ThI應答 的佐劑是相對于IgGl抗體水平優(yōu)先增加小鼠中IgG2a抗體水平的佐劑?！?的抗原特異 性IgG2a/IgGl比可表示ThI樣抗體亞類模式。然而，根據(jù)本發(fā)明，增加抗原特異性抗體產(chǎn) 生并且同時將小鼠中相對的IgG2a/IgGl比增加至約> 0. 3的任何佐劑將免疫應答驅(qū)使向 ThI偏向的免疫應答。在各種方面，這種佐劑可包括皂甙佐劑(例如皂樹皂甙，包括脂修飾 的皂樹皂甙佐劑)、CpG、3-脫酰單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、卡介苗(BCG)、雙莖-環(huán)免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核糖核苷酸(d-SLIM)、熱滅活的流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus) (HKBA)、熱滅活的 母牛分枝桿菌(Mycobacterium vaccae) (SRL172)、滅活的牛痘病毒、環(huán)磷酰胺、促乳素、沙 利度胺(thalidomide)、actimid、revimid以及類似佐劑。皂甙佐劑以及它們制備和使用 的方法詳細描述在美國專利第 5，057，540,5, 273，965,5, 443，829,5, 508，310,5, 583，112、 5，650，398,5, 977，081,6, 080，725,6, 231，859 和 6，262，029 號中，其通過引用被并入本文。在另一個實施方案中，體液應答可由先天免疫產(chǎn)生，在先天免疫中宿主動物具有 天然預先存在的免疫例如對α-半乳糖基的免疫。在另一個說明性的方面，可通過向宿主 動物施用抗體來建立被動免疫，所述抗體例如從血清收集的天然抗體，或所述抗體可能是 或可能不是遺傳工程改造的抗體的單克隆抗體，包括人源化抗體。發(fā)展被動免疫的特定量 的抗體試劑的利用和其中被動施用的抗體針對免疫原的配體-免疫原偶合物的使用將提 供被用于患者預先存在的對其他潛在抗原的抗體效價在治療上是無用的情況中的標準試 劑組的優(yōu)勢。在一個實施方案中，被動施用的抗體可以與配體-免疫原偶合物“共同施用”， 而且共同施用被定義為在施用配體-免疫原偶合物之前、同時或之后的抗體施用。通過將配體_免疫原偶合物優(yōu)先結(jié)合至腫瘤細胞或其他致病細胞而將預先存在 的抗體、誘導的抗體或被動施用的抗體重新定向于這些入侵細胞。說明性地，可通過補體介 導的溶解、ADCC、抗體依賴性吞噬作用或受體的抗體聚集來消除致病細胞。細胞毒性步驟還 可包括其它類型的免疫應答例如細胞介導的免疫，以及當被吸引的抗原呈遞細胞吞噬不想 要的細胞和將天然腫瘤抗原呈遞至免疫系統(tǒng)以消除帶有抗原的細胞或生物體時產(chǎn)生的第 二應答。如本文所用，術(shù)語“消除的(eliminated)”和“消除(eliminating) ”在提及疾病 狀態(tài)時是指減少或消除疾病狀態(tài)的癥狀或者防止疾病進展或復發(fā)。如本文所用，術(shù)語表達 配體受體的免疫細胞群體的“消除(elimination) ”和“滅活(deactivation) ”是指該細胞 群體被殺死或者完全地或部分地滅活，其減少被治療疾病狀態(tài)特征性的免疫細胞介導的發(fā) 病。在一個說明性的方面，含有治療因子的至少一種另外的組合物可與上面詳述的方 法學一起被施用于宿主以增強內(nèi)源性免疫應答介導的致病細胞消除，或者可施用多于一種 另外的治療因子。所述治療因子可選自能夠刺激內(nèi)源性免疫應答的化合物、化療劑或能夠 補足施用的配體-免疫原復合物的效力的其他治療因子。在該實施方案中，另外的治療因 子能夠刺激內(nèi)源性免疫應答例如細胞因子或免疫細胞生長因子例如白細胞介素1-18、干細 胞因子、堿性 FGF、EGF、G-CSF、GM-CSF、FLK-2 配體、HILDA、MIP_1 α ,TGF-β ,TGF-α、M_CSF、 IFN- γ、IFN- α、IFN- β、可溶性 CD23、LIF 及其組合。在一個實施方案中，例如，治療有效量的IL-2，例如每日多劑方案(multiple dose daily regimen)中從約5000IU/劑/日至約500，OOOIU/劑/日的量，和IFN-α，例如每日 多劑方案中從約7500IU/劑/日至約150，OOOIU/劑/日的量，與葉酸-FITC(參見圖4) 一 起使用以消除含有致病細胞的群體的宿主動物中的這種細胞。在另一方面，可以使用治療 有效量的IL-2，例如每日多劑方案中從約0. lMIU/m2/劑/日至約60MIU/m2/劑/日的量的 IL-2，并且可以使用IFN-α，例如每日多劑方案中從約0. lMIU/m2/劑/日至約10MIU/m2/ 劑/日的量的IFN-α (MIU=百萬國際單位；m2=普通人大概的體表面積)。在另一個實施 方案中，以治療有效量(例如分別地7MIU和3MIU)使用IL-2和IFN-α，并且在另一個實 施方案中，以治療有效量使用IL-15和IFN-γ。在一個可選的實施方案中，聯(lián)合使用IL-2、IFN-Y或IFN-α和GM-CSF。在其他實施方案中，可以使用任何其他有效的細胞因子組合， 包括其他自細胞介素和干擾素以及集落刺激因子的組合。在其他說明性的實施方案中，適合用于本文所述方法的化療劑，其本身是細胞毒 性的并且可起作用以增強腫瘤滲透性或減少變應原性，包括腎上腺類皮質(zhì)激素、烷化劑、抗 雄激素劑、抗雌激素劑、皮質(zhì)類固醇、苯海拉明、雄激素、雌激素、抗代謝劑例如阿糖胞苷、嘌 呤類似物、嘧啶類似物和氨甲蝶呤、白消安、碳鉬、氯恩巴錫(chlorambucil)、順鉬和其他鉬 化合物、他莫昔芬、紅豆杉醇、環(huán)磷酰胺、植物堿、潑尼松、羥基脲、替尼泊甙、抗生素例如絲 裂霉素C和博萊霉素、氮芥、亞硝基脲(nitrosurea)、長春新堿、長春花堿、炎癥和促炎癥 劑、抗組胺劑以及本領(lǐng)域公認的任何其他化療劑或減少變應原性的劑。說明性地，致病細胞的消除可包括導致治療應答的腫瘤團塊或致病性免疫細胞的 減少或消除。在腫瘤的情況下，所述消除可能是原發(fā)性腫瘤細胞或者已轉(zhuǎn)移或在從原發(fā)性 腫瘤解離的過程中的細胞的消除。在一個實施方案中，還提供通過任何治療方法來防止腫 瘤在被除去之后復發(fā)的預防性治療，所述治療方法包括腫瘤的手術(shù)去除、放射療法、化療或 生物療法。所述預防性治療可以是使用配體-免疫原偶合物的初步治療，例如以每日多劑 方案的治療，并且/或者可以是初步治療之后幾天或幾月間隔后的另外一次治療或一系列 治療。在各種實施方案中，取決于宿主狀況、受治療的疾病狀態(tài)、偶合物的分子量、施用 途徑和組織分布以及與其他治療性治療例如放射療法共同使用的可能性，配體-免疫原偶 合物的單一日劑量(unitary daily dosage)可顯著不同。待施用于患者的有效量是基于 體表面積、患者體重和醫(yī)生評估的患者狀況。在各種示例性的實施方案中，有效劑量可從約 lng/kg 至約 lmg/kg，從約 1 μ g/kg 至約 500 μ g/kg,或從約 100 μ g/kg 至約 400 μ g/kg (例 如約300 μ g/kg)變動。說明性地，取決于宿主狀況、受治療的疾病狀態(tài)、偶合物的分子量、施用途徑和組 織分布以及與其他治療性治療例如放射療法共同使用的可能性，佐劑和半抗原-載體偶合 物的劑量可不同。待施用于患者的有效量是基于體表面積、患者體重和醫(yī)生評估的患者狀 況。在一個說明性的方面，佐劑的有效劑量可從每劑約0.01 μ g至約lOOmg，或從每劑約 100 μ g至約50mg，或從每劑約500 μ g至約IOmg或從每劑約Img至IOmg變動。在一個實施 方案中，半抗原-載體偶合物的有效劑量可從每劑約1 μ g至約lOOmg，或從每劑約10μ g至 約50mg，或從每劑約50 μ g至約IOmg或從每劑約0. 5mg至約5mg變動(例如每劑約3mg)?？墒褂檬┯肨hI偏向佐劑和半抗原-載體偶合物的任何有效方案。例如，可以以 單劑施用ThI偏向佐劑和半抗原-載體偶合物，或者可將它們分開(即分成幾次)并作為 每日多劑方案來施用。此外，交錯的方案例如每周一至五天可被用作每日治療的替代。在示例性的實施方案中，可以以單劑施用配體-免疫原偶合物和治療因子，或者 可將它們分開并作為每日多劑方案來施用。此外，交錯的方案例如每周一至六天可被用作 每日治療的替代。在本發(fā)明一個實施方案中，用配體_免疫原偶合物和治療因子的多重注 射來治療宿主以消除致病細胞群體。在一個實施方案中，用配體-免疫原偶合物對宿主注 射多次(例如約2至多達約50次)，例如以12-72小時間隔或48-72小時間隔?？稍诔跏?注射之后以幾天或幾月的間隔將配體_免疫原偶合物的另外注射施用于患者，而且所述另 外注射防止疾病的復發(fā)?？蛇x地，配體-免疫原偶合物的初始注射可防止疾病復發(fā)。
在一個實施方案中，提供了治療宿主動物以消除致病細胞的方法。所述方法包括 如下步驟向宿主動物施用半抗原-載體偶合物；向宿主動物施用Th-I偏向佐劑，其中半抗 原-載體偶合物與Th-I偏向佐劑的重量比是從約1 10至約1 1;并且向宿主動物施 用偶合至半抗原的配體，其中配體_半抗原偶合物的施用在使用半抗原_載體偶合物的第 一治療周期中被啟動。說明性地，該方法可被用來減少可表明過敏性應答的不利反應(例 如疹、癢、臉紅)的發(fā)生概率。如本文所用，“第一治療周期”是指半抗原-載體偶合物的第 一、第二、第三或第四周施用，不論半抗原-載體偶合物的施用在第一治療周期中是否是連 續(xù)的。說明性地，在該實施方案中，致病細胞可以是癌細胞或活化的免疫細胞，例如巨噬 細胞或單核細胞。在一個實施方案中，配體-半抗原偶合物的施用是在使用半抗原-載體偶 合物的第一周治療中被啟動的。在另一個實施方案中，配體_半抗原偶合物的施用是在使 用半抗原-載體偶合物的第二周治療中被啟動的。在其他實施方案中，配體_半抗原偶合物 可在施用半抗原_載體偶合物的任何一周的開始被施用，只要配體_半抗原偶合物的施用 在使用半抗原-載體偶合物的第一治療周期完成之前被啟動。在各種實施方案中，其他治 療因子例如細胞因子可與配體_半抗原偶合物一起施用。在另一個實施方案中，配體_半 抗原偶合物給藥(例如0. 3mg/kg(qdX5))可被分成幾次，而且配體-半抗原偶合物可被作 為每日劑量的分次劑量(例如0. 3mg/kg劑量的60%、30%和10% )施用。在各種說明性的實施方案中，半抗原-載體偶合物與Th-I偏向佐劑的重量比是從 約1 8至約1 1、約1 6至約1 1、約1 4至約1 1、約1 3至約1 1，或者 是約1 3或約1 ？^丨例如每天^！^至〗!!^)。在一個實施方案中，半抗原-載體偶 合物和佐劑可以在施用于患者約5分鐘至約1小時內(nèi)以重量比約1 3或約1 2. 5或約 12混合以避免膠束形成。在一個實施方案中，半抗載體偶合物具有式 或其藥學上可接受的鹽。在另一個實施方案中，提供了治療宿主動物以消除致病細胞的方法。所述方法包 括如下步驟向宿主動物施用半抗原-載體偶合物向宿主動物施用Th-I偏向佐劑，并且向 宿主動物施用偶合至半抗原的配體，其中所述配體-半抗原偶合物在使用半抗原-載體偶 合物的第一治療周期中被施用。在配體是葉酸或者葉酸類似物或衍生物的一個實施方案 中，用99mTe放射標記的葉酸定向的螯合劑可被用來確定患者是否具有葉酸受體陽性腫瘤 (參見美國專利申請公布第20040033195號，其通過引用被并入本文)。說明性地，該方法可被用來減少可表明過敏性應答的不利反應(例如疹、癢、臉 紅)的發(fā)生概率。在各種方面，致病細胞可以是癌細胞或活化的免疫細胞，例如巨噬細胞或 單核細胞。在一個實施方案中，配體_半抗原偶合物的施用是在使用半抗原_載體偶合物的 第一周治療中被啟動的。在另一個實施方案中，配體_半抗原偶合物的施用是在使用半抗 原_載體偶合物的第二周治療中被啟動的。在其他實施方案中，配體_半抗原偶合物可在 施用半抗原_載體偶合物的任何一周的開始被施用，只要配體_半抗原偶合物的施用在使 用半抗原-載體偶合物的第一治療周期完成之前被啟動。在各種實施方案中，其他治療因 子例如細胞因子可與配體_半抗原偶合物一起施用。在另一個實施方案中，配體_半抗原 偶合物給藥(例如0. 3mg/kg(qdX5))可被分成幾次，而且配體-半抗原偶合物可被作為每 日劑量的分次劑量(例如0. 3mg/kg劑量的60%、30%和10%)施用。在說明性的方面，可 每周一次、TIW(每周三次)、每天一次或使用任何其他有用的給藥時間表來施用半抗原-載 體偶合物(在一個方面與佐劑例如GPI-0100聯(lián)合)、配體-半抗原偶合物和治療因子。在該方法的一個實施方案中，半抗原-載體偶合物和佐劑可以在施用于患者約5 分鐘至約1小時內(nèi)混合以避免膠束形成。在一個實施方案中，半抗原-載體偶合物具有式 其中KLH是鑰孔域形血藍蛋白(偶合物被稱作KLH-FITC)，而且配體-半抗原偶
合物具有式 (偶合物被稱作葉酸-FITC)或其藥學上可接受的鹽。在各種實施方案中，可在配體-免疫原偶合物之前、之后或同時將治療因子施用 于宿主動物，并且治療因子可作為含有所述偶合物的相同組合物的一部分或者作為不同于 配體-免疫原偶合物的組合物的一部分來施用?？稍诒景l(fā)明中使用含有治療有效劑量的治 療因子的任何這種治療組合物。在一個實施方案中，可以使用多于一種類型的配體-免疫 原偶合物。例如，可以使用異硫氰酸熒光素和二硝基苯基二者對宿主動物進行預先免疫，并 且隨后以共同給藥方案用連接至相同或不同配體的異硫氰酸熒光素和二硝基苯基處理宿 主動物。說明性地，配體-免疫原(例如半抗原)偶合物、治療因子、佐劑和半抗原-載體偶 合物可被腸胃外注射，而且這種注射可以是腹膜內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射 或鞘內(nèi)注射。在另一個實施方案中，可使用低速泵遞送配體-免疫原(例如半抗原)偶合 物、治療因子、佐劑和半抗原-載體偶合物。腸胃外劑型的實例包括眾所周知的藥學上可接 受的液態(tài)載體中活性劑的含水溶液，所述液態(tài)載體例如液態(tài)醇、二醇類(例如聚乙二醇)、 葡萄糖溶液(例如5% )、酯、酰胺、無菌水、緩沖鹽水(包括緩沖液如磷酸鹽或醋酸鹽；例如 等滲鹽水)。另外的示例性成分包括植物油、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、石 蠟以及類似成分。在另一方面，腸胃外劑型可以是可重構(gòu)的凍干產(chǎn)物形式，其包括配體-免 疫原(例如半抗原)偶合物、治療因子、佐劑或半抗原-載體偶合物的劑量。在各種方面， 可使用增溶劑、局部麻醉劑(例如利多卡因)、賦形劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、鹽 和潤滑劑。在一個方面，可施用本領(lǐng)域已知的若干延長釋放劑型中的任何劑型，例如在美國 專利第4，713，249,5, 266，333和5，417，982號中描述的可生物降解的糖基質(zhì)，其公開通過 引用被并入本文。實施例1BALB/C小鼠中的溫度分析以1周的間隔將雌性Balb/c小鼠針對與100 μ g的GPI-0100—起配制的1 μ g (圖 1)或35yg(圖2)的EC90(KLH-FITC;參見圖5)免疫3次。雙熒光素被加入EC17 (葉 酸-FITC ；參見圖4)組合物(1500nmol/kg的EC17加上350nmol/kg的雙熒光素)。加入 雙熒光素以增強組合物的變應原性。用1500nmol/kg的EC17加上350nmol/kg的雙熒光素 經(jīng)靜脈內(nèi)攻擊小鼠。然后通過直腸探針監(jiān)測小鼠體溫的任何改變以檢測任何明顯的變應原 性。注射物的制備在每次接種前新鮮制備EC90 (KLH-FITC)/GPI-0100溶液以避免在 儲存中形成膠束。通過在PBS(pH 7. 4)中將0. 01mg/ml的EC90和lmg/ml的GPI-OlOO混 合來制備IygW EC90/GPI-0100注射物(圖1)(每劑0. Iml提供了 IygW KLH-FITC和 100 μ g 的 GPI-0100)。通過在 PBS (pH 7. 4)中將 0. 35mg/ml 的 EC90 和 lmg/ml 的 GPI-OlOO 混合來制備35 μ g的EC90/GPI-0100注射物(圖2)(每劑0. Iml提供了 35 μ g的KLH-FITC 和100 μ g的GPI-0100)。對于每5ml體積，通過混合0. 244ml的EC17儲備溶液和2. 331ml 的雙熒光素儲備溶液以及2. 425ml的PBS(pH7. 4)來制備摻雜了雙熒光素的EC17注射物。 對于IV或SC施用，每只 20g小鼠的0. Iml提供了 1500nmol/kg的EC17加上350nmol/kg 的雙熒光素。接赴使用100 μ 1的1 μ g或35 μ g的EC90/GPI-0100注射物在尾根部鄰近位點(50 μ 1/位點)經(jīng)皮下對小鼠免疫。7和14天后，在小鼠背部或頸背部注射兩次加強劑量。摻雜了雙熒光素的EC17灃射物的早期給藥用1500nmol/kg的EC17加上 350nmol/kg的雙熒光素在第7至11天、第14至18天和第21天處理小鼠。摻雜了雙熒光素的EC17灃射物的晚期給藥:在約第22天，用PBS或1500nmol/kg 的EC17加上350nmol/kg的雙熒光素經(jīng)靜脈內(nèi)攻擊小鼠。使用專門為小鼠設(shè)計的直腸探 針(RET-3，熱電偶溫度計)測量每只小鼠的體溫。在為了 IV注射而將每只動物預熱(warm up)之前、臨注射之前和攻擊之后大約30分鐘取得基線溫度(根據(jù)需要的頻率)。摻雜了雙熒光素(350nmol/kg)的 EC17 (1500nmOl/kg)導致了針對兩種 EC90給藥而被免疫的小鼠溫度的降低，但其中進行了用EC17+雙熒光素的早期給藥的除 外。通過用受到雙熒光素污染的EC17對小鼠早期給藥，預防了指示對摻入的雙熒光素的明 顯過敏性反應的應答。而且，當以Iyg(導致EC90與GPI-0100的重量比為約1 100)而 非35yg(EC90與GPI-0100的重量比為約1 2. 5)施用時，EC90獨自(不存在用EC17+雙 熒光素的攻擊；即只加入了 EC17并且在晚期給藥方案中加入了 EC17)導致小鼠溫度降低。實施例2配體偶合物對于具有乳腺腫瘤棺入物的小鼠的腫瘤體積的作用測試了兩種方案。在第一個方案中，在第1、15和29天以使用皂甙佐劑(例如 GPI-0100 ；IOOyg/劑)的35 μ g/劑的異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鑰孔蜮形血藍蛋白 (KLH ；參見圖5)對六至八周大( 20-22克)的雌性Balb/c小鼠進行免疫。在第23天， 用2.5X105個4Tlc2細胞(乳腺腫瘤細胞系)對每個動物進行注射。然后允許癌癥位點 (locus)生長。在第42-60天，每天((qdX5)3 ;第42-46、49-53和56-60天)用磷酸鹽緩沖 鹽水(PBS)或500nmol/kg的通過、羧基連接的乙二胺橋(參見圖4)偶合至葉酸的FITC 對所有動物進行注射。在同一天用20，000U/劑的重組人IL-2對動物進行注射。在與用葉 酸-FITC注射動物的相同周用IL-2以(TIW)3對動物進行注射。在第二個方案中，在第1、和29天以使用皂甙佐劑(例如GPI-0100 JOOyg/齊IJ) 的35 μ g/劑的異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鑰孔蜮形血藍蛋白(KLH)對六至八周大( 20-22克)的雌性Balb/c小鼠進行免疫。在第5天，用2. 5 X IO5個4Tlc2細胞對每個動 物進行注射。然后允許癌癥位點生長。在第8-50天，每天((qdX5)6)用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)或500nmol/kg的通過、羧基連接的乙二胺橋偶合至葉酸的FITC對所有動物進行 注射。在第32-50天中的每天用20，000U/劑的重組人IL-2對動物進行注射。在與用葉 酸-FITC注射動物的相同周用IL-2以(TIW)3對動物進行注射。然后通過監(jiān)測葉酸-FITC處理的小鼠與對照動物相比的作為時間的函數(shù)的腫瘤 體積而評估該免疫療法的效力。如圖3中所示，用免疫療法減小了小鼠的腫瘤體積，而且不 論用來施用葉酸-FITC的給藥方案(早期或晚期)如何，腫瘤體積是相似的。因此，使用葉 酸-FITC的“早期給藥方案”在減少腫瘤體積方面是有效的。實施例3KLH-FITC 和葉酸-FITC 的合成如在Kennedy 等人，Pharmaceutical Research，卷 20 (5)，2003 和 W02006/101845 中所述合成并純化葉酸-FITC，每個參考文獻通過引用被并入本文。EC17作為PBS(pH 7. 4) 中5. 5mg/ml的冰凍溶液儲存。EC90 (KLH-FITC)固體(83%蛋白含量)具有 129ymolFITC/克KLH的標記比。在PBS(pH 7.4)中制備2. 5mg/ml的儲備溶液并用0. 22 μ m的注射 器式濾器過濾滅菌。使用與用于葉酸-FITC的方法相似的方法合成了 KLH-FITC。實施例4給藥方案圖6顯示為了本文所述方法用于人以減少指示過敏反應的不利反應(例如疹、臉 紅、癢)的概率的示例性“早期給藥方案”。Vl至VlO表明用EC90 (KLH-FITC)的注射。顯 示了治療周期中的各周，而且所述周期中的周的天被顯示為D1、D8、D15等。周期被顯示為 C1、C2、C3等。顯示了施用EC90(V1、V2等)、EC17(葉酸-FITC)和EC17+細胞因子的周、周 期和天。圖6中還包括了顯示藥物劑量和給藥頻率的表格。分別以1. 2mg、3mg、0. 3mg/kg、 7MIU 和 3MIU 施用 了 EC90、GPI-0100、EC17、IL-2 和 IFN- α。實施例5給藥方案另一個示例性的“早期給藥方案”包括下述步驟。用99mTe放射標記的葉酸定向的 螯合劑(iv(靜脈內(nèi))施用0. Img)被用來確定患者是否具有葉酸受體陽性腫瘤(參見美國 專利申請公布第20040033195號，其通過引用被并入本文)。在第一治療周期中4個連續(xù) 周的每周(即每周一次)、在第二周期中2個連續(xù)周的每周并且每個另外周期一次地經(jīng)皮 下施用KLH-FITC (1. 2mg,與佐劑GPI-0100聯(lián)合)。在第一治療周期中4個連續(xù)周的每周、 在第二周期中2個連續(xù)周的每周并且每個另外周期一次地經(jīng)皮下與KLH-FITC(GPI-0100是 3. Omg) 一起施用GPI-0100佐劑。在前兩個治療周期中4個連續(xù)周的每周5天(周一至 周五)然后在每個另外周期中3個連續(xù)周的每周3天(周一、周三和周五)經(jīng)皮下施用葉 酸-FITC(0. 3mg/kg)。在前2個治療周期的4個連續(xù)周每周3次(周一、周三和周五)經(jīng)皮 下施用IL-2 (7. 0MIU)，然后在每個另外周期的3個連續(xù)周每周3次(周一、周三和周五)經(jīng) 皮下施用2. 5MIU的IL-2。在前2個治療周期的4個連續(xù)周每周3次(周一、周三和周五) 經(jīng)皮下施用IFN- α (3. 0MIU)，然后在每個另外周期的3個連續(xù)周每周3次(周一、周三和周 五)經(jīng)皮下施用3. OMIU的IFN- α。實施例6針對與GPI-0100 —起配制的EC90進行免疫的小鼠中的自動全身性過敏反應測定在第1、8和15天對雌性Balb/c小鼠免疫三次。在第23天將單劑的ECl7經(jīng)靜脈內(nèi) 施用(圖7，圖a)。在第8-12、15-19和22天用EC17的多次皮下給藥使小鼠脫敏(圖7，圖 b)。在第23天，使用EC17照常經(jīng)靜脈內(nèi)攻擊小鼠。EC17攻擊之后，使用直腸探針(RET-3， 熱電偶溫度計)測量體溫。在為了靜脈內(nèi)注射而將每只動物預熱之前、緊挨著注射之前和 攻擊之后 30分鐘取得基線溫度(根據(jù)需要的頻率)。當動物顯示刺激后沒有活動的休克 征兆時(通常它們的體溫降低_3°C或更低)，用CO2將它們安樂死。實施例7FITC免疫的小鼠中抗FITC的I戒抗體的產(chǎn)生在第1、8和15天對雌性Balb/c小鼠(η = 3)進行針對各種劑量的EC90加上 IOOyg的GPI-0100的免疫。在第29天，匯集來自每組的單個動物的等體積的血清。使用 ELISA捕捉測定(capture ELISAassay)比較了抗FITC IgE抗體的相對水平(圖8)。簡言之，用大鼠抗小鼠IgE的捕捉性mAb涂布96孔板。在阻斷非特異性結(jié)合之后，用FITC-抗 血清接著是生物素酰化的BSA-FITC和鏈霉抗生素蛋白_辣根過氧化物酶與板孵化。實施例8針對EC90加h GPI-0100佐劑講行免,瘡的豚鼠中的自動全身件過敏反應測定在第1、8和15天用各種劑量的EC90加上0. 5mg的GPI-0100對雄性和雌 性豚鼠(每組每性別1只)免疫三次。在第22天施用(經(jīng)皮下)單劑的測試品 (EC17+/-Bis-FITC-eda)。在第 8-12 和 15-19 天用摻入了 10% (摩爾)Bis-FITC-eda 的 EC17的多次給藥使豚鼠脫敏。在第22天，使用相同的EC17/BiS-FITC-eda配方經(jīng)皮下攻擊 這些小鼠。攻擊之后，通常進行1.5-2小時的臨床觀察。當動物顯示過敏性休克征兆時，將 它們安樂死。在所有動物上進行完整的宏觀的死后檢查(圖9)。結(jié)果顯示，EC17的早期給 藥和KLH-FITC的劑量增加減少動物中的變應原性。
權(quán)利要求
一種治療宿主動物以消除致病細胞的方法，所述方法包括如下步驟向所述宿主動物施用半抗原 載體偶合物；向所述宿主動物施用TH 1偏向佐劑，其中半抗原 載體偶合物與TH 1偏向佐劑的重量比是從約1∶10至約1∶1；并且向所述宿主動物施用偶合至半抗原的配體，其中配體 半抗原偶合物的施用在使用半抗原 載體偶合物的第一治療周期中被啟動。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述致病細胞是癌細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述致病細胞是活化的免疫細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述活化的免疫細胞是巨噬細胞或單核細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述配體-半抗原偶合物的施用在使用半抗 原-載體偶合物的治療的第一或第二周或者在稍晚時間被啟動，其中所述稍晚時間是在完 成使用半抗原_載體偶合物的第一治療周期之前。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述配體是結(jié)合維生素受體的配體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述配體選自由葉酸和其他結(jié)合葉酸受體的配體 所組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述配體是具有只通過配體的谷氨?；?羧基 部分與所述半抗原共價連接的谷氨酰基部分的葉酸類似物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述配體是具有只通過配體的谷氨?；?羧基 部分與所述半抗原共價連接的谷氨酰基部分的葉酸類似物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述配體是能夠結(jié)合至受體的小有機分子，并且 其中所述受體在所述致病細胞群體的表面上被優(yōu)先表達、獨一無二地表達或過量表達。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述半抗原是具有少于20，000道爾頓的分子量 的有機分子。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述有機分子選自由熒光素、硝基苯基和多硝 基苯基所組成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述聚硝基苯基是二硝基苯基或三硝基苯基。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括向所述宿主動物施用免疫刺激劑的步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述免疫刺激劑是細胞因子。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細胞因子包括IL-2、IL-12、IL-15或其組合 O
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細胞因子包括與IFN-Y或IFN-α聯(lián)合的 IL-2、IL-12、IL-15 或其組合。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述配體-半抗原偶合物的組合物以多次注射施用。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述半抗原_載體偶合物的施用包括接種。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中半抗原_載體偶合物與Th-I偏向佐劑的重量比 是從約1 8至約1 1。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中半抗原-載體偶合物與Th-I偏向佐劑的重量比 是從約1 6至約1 1。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中半抗原-載體偶合物與Th-I偏向佐劑的重量比 是從約1 4至約1 1。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中半抗原-載體偶合物與Th-I偏向佐劑的重量比 是從約1 3至約1 1。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中半抗原-載體偶合物與Th-I偏向佐劑的重量比 是約1 3或約1 2. 5。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述佐劑是皂樹皂甙佐劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述佐劑是修飾的皂甙佐劑
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述載體是鑰孔蜮形血藍蛋白。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述半抗原_載體偶合物有下 式或其藥學上可接受的鹽。
29.一種治療宿主動物以消除致病細胞的方法，所述方法包括如下步驟 向所述宿主動物施用半抗原-載體偶合物；向所述宿主動物施用Th-I偏向佐劑；并且向所述宿主動物施用偶合至半抗原的配體，其中配體-半抗原偶合物的施用在使用半 抗原-載體偶合物的第一治療周期中被啟動。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述致病細胞是癌細胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述致病細胞是活化的免疫細胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述活化的免疫細胞是巨噬細胞或單核細胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述配體_半抗原偶合物的施用在使用半抗 原-載體偶合物的治療的第一周或者在稍晚時間被啟動，其中所述稍晚時間是在完成使用 半抗原_載體偶合物的第一治療周期之前。
34.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述配體是結(jié)合維生素受體的配體。其中KLH是鑰孔蜮形血藍蛋白，而且所述配體_半抗原偶合物具有下式
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述配體選自由葉酸和其他結(jié)合葉酸受體的配 體所組成的組。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述配體是具有只通過配體的谷氨?；?羧 基部分與所述半抗原共價連接的谷氨酰基部分的葉酸類似物。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述配體是具有只通過配體的谷氨?；?羧 基部分與所述半抗原共價連接的谷氨?；糠值娜~酸類似物。
38.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述配體是能夠結(jié)合至受體的小有機分子，并 且其中所述受體在所述致病細胞群體的表面上被優(yōu)先表達、獨一無二地表達或過量表達。
39.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述半抗原是具有少于20，000道爾頓的分子量 的有機分子。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述有機分子是熒光素、硝基苯基或多硝基苯基。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述多硝基苯基是二硝基苯基或三硝基苯基。
42.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，還包括向宿主動物施用免疫刺激劑的步驟。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述免疫刺激劑是細胞因子。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述細胞因子包括IL-2、IL-12、IL-15或其組
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述細胞因子包括與IFN-Y或IFN-α聯(lián)合的 IL-2、IL-12、IL-15 或其組合。
46.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述配體_半抗原偶合物的組合物以多次注射 施用。
47.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述半抗原_載體偶合物的施用包括接種。
48.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述佐劑是皂樹皂甙佐劑。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述佐劑是的皂甙佐劑。
50.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述載體是鑰孔蜮形血藍蛋白。
51.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述半抗原_載體偶合物具有下式其中KLH是鑰孔蜮形血藍蛋白，而且所述配體_半抗原偶合物具有下式 或其藥學上可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療宿主動物以消除致病細胞的方法。所述方法包括如下步驟向所述宿主動物施用半抗原-載體偶合物；向所述宿主動物施用TH-1偏向佐劑；并且向所述宿主動物施用偶合至半抗原的配體，其中配體-半抗原偶合物在使用半抗原-載體偶合物的第一治療周期中被施用。本發(fā)明還涉及相同的方法，其中半抗原-載體偶合物與TH-1偏向佐劑的重量比是從約1∶10至約1∶1。
文檔編號A61K38/21GK101903037SQ200880121393
公開日2010年12月1日 申請日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日
發(fā)明者C·P·利蒙, P·羅納德·埃利斯 申請人:恩多塞特公司