專利名稱：Gas57突變型抗原和gas57抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計(jì)免疫學(xué)和疫苗學(xué)領(lǐng)域。具體說，本發(fā)明涉及衍生自釀膿鏈球菌 (Streptococcus pyogenes)的抗原及它們在免疫接種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大腸桿菌表達(dá)和從其提純的釀膿鏈球菌(A群鏈球菌；GAS)抗原GAS57重組蛋白 在小鼠中誘導(dǎo)了抗釀膿鏈球菌致死性攻擊的保護(hù)活性。然而，GAS57是一種蛋白酶，能切割 和滅活人趨化因子如白介素-8 (IL-8) (Edwards 等.，J infectious Diseases. 192,783-90, 2005 ；hidalgo-Grass 等·，EMBO J. 25，4628-37，2006)。GAS57 的這種性能由于可能產(chǎn)生副 作用而妨礙了其在疫苗組合物中的應(yīng)用。因此，本領(lǐng)域需要不能切割人趨化因子但仍保留 了誘導(dǎo)抵御釀膿鏈球菌保護(hù)能力的GAS57抗原。本領(lǐng)域也需要能特異性結(jié)合GAS57抗原從 而削弱GAS57切割I(lǐng)L-8和其它物質(zhì)能力的抗體。附圖簡述

圖1. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯微照片，顯示了野生型GAS57可切割I(lǐng)L_8。圖2.野生型GAS57 (查詢序列SEQ ID NO :1)與C5a肽酶絲氨酸蛋白酶(對象序 列SEQ ID NO 9)的BLAST算法比對。圖3. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯微照片，顯示GAS57點(diǎn)突變體D151A喪失了切割 IL-8的能力。圖4.此圖所示的ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明GAS57點(diǎn)突變體D151A喪失了切割I(lǐng)L-8的 能力。圖5A-B SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯微照片，顯示GAS57單突變體D151A和S617A 及雙突變體D151A+S617A喪失了 GAS57的蛋白酶水解活性。圖6.此圖所示的ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明單突變體D151A和S617A及GAS57雙突變 體D151A+S617A喪失了 GAS57的蛋白酶水解活性。圖7. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯微照片，顯示野生型GAS57翻譯后被修飾成 150. 5kDa和23. 4kDa的兩個(gè)多肽片段。圖8. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯微照片，顯示與野生型(黑色箭頭)相比，GAS57 突變體D151A、S617A及D151A+S617A翻譯后未被修飾成為150. 5kDa和23. 4kDa的兩個(gè)多 肽片段。對應(yīng)于未經(jīng)加工蛋白的一個(gè)主要174kDa條帶存在于對應(yīng)于滅活突變株蛋白(灰 色箭頭)的泳道中。圖9A-B.ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明，在二種不同實(shí)驗(yàn)條件下，抗GAS57多克隆抗血清以 劑量依賴方式抑制GAS57介導(dǎo)的IL-8切割。圖9A，培育8小時(shí)，0. 1 μ g/ml GAS57。圖9B， 培育 24 小時(shí)，0. 05μ g/ml GAS57。圖10A-GG.不同菌株/M型的GAS57抗原比對。粗黑體字為催化三聯(lián)體(D、H和 S)。圖10A，各圖上部為氨基酸1-50 (氨基酸編號，10A-GG為GAS57M1_SF370的氨基酸序列， SEQ ID NO :1)；圖 10B，氨基酸 51-100 ；圖 10C，氨基酸 101-150 ；圖 10D，氨基酸 151-200 ； 圖10E，氨基酸201-250 ；圖10F，氨基酸251-300 ；圖10G，氨基酸301-350 ；圖10H，氨基酸351-400 ；圖 101，氨基酸 401-450 ；圖 10J，氨基酸 451-500 ；圖 10K，氨基酸 501-550 ；圖 10L, 氨基酸551-600 ；圖10M，氨基酸601-650 ；圖10N，氨基酸651-700 ；圖100，氨基酸701-750 ； 圖10P，氨基酸751-800 ；圖10Q，氨基酸801-850 ；圖10R，氨基酸851-900 ；圖10S，氨基酸 901-950 ；圖 10T,氨基酸 951-1000 ；圖 10U,氨基酸 1001-1050 ；圖 10V,氨基酸 1051-1100 ； 圖 10W，氨基酸 1101-1150 ；圖 10X，氨基酸 1151-1200 ；圖 10Y，氨基酸 1201-1250 ；圖 10Z, 氨基酸 1251-1300 ；圖 10AA，氨基酸 1301-1350 ；圖 10BB，氨基酸 1351-1400 ；圖 10CC，氨 基酸 1401-1450 ；圖 10DD，氨基酸 1451-1500 ；圖 10EE，氨基酸 1501-1550 ；圖 IOFF 氨基酸 ~ 1551-1600 ；圖 10GG，氨基酸 1601-1650。Gas57Ml_SF370, SEQ ID NO 1 ；gas57Ml_31075, SEQ ID NO 10 ；gas57Ml_31237, SEQ ID NO 11 ；gas57Ml_3348, SEQ ID NO 12 ； gas57M2_34585, SEQ ID NO 13 ;gas57M3，1_21398，SEQ ID NO :14 ;gas57M44_61_20839， SEQ ID NO :15 ;gas57M6，31_20022，SEQ ID NO 16 ;gas57Ml 1_20648，SEQ ID NO 17 ； gas57M23_2071, SEQ ID NO 18 ;gas57M18，3_40128，SEQ ID NO 19 ；gas47M4_10092, SEQ ID NO 20 ；gas57M4_30968, SEQ ID NO 21 ；gas57M6，31_22692，SEQ ID NO 22 ；gas57M68, 5_22814，SEQ ID NO 23 ；gas57M68_23623, SEQ ID NO 24 ；gas57M2_10064, SEQ ID NO 25 ；gas57M2_10065, SEQ ID NO 26 ；gas57M77_10251, SEQ ID NO 27 ；gas57M77_10527, SEQ ID NO 28 ；gas57M77_20696, SEQ ID NO 29 ；gas57M89_21915, SEQ ID NO 30 ； gas57M89_23717, SEQ ID NO 31 ；gas57M94_10134, SEQ ID NO 32 ；gas57M28_10164, SEQ ID NO 33 ；gas57M28_10218, SEQ ID NO 34 ；gas57M29_10266, SEQ ID NO 35 ； gas57M28_10299, SEQ ID NO 36 ；gas57M28_30176, SEQ ID NO 37 ；gas57M28_30574, SEQ ID NO :38 ;gas57M6，9_21802，SEQ ID NO 39 ；gas57M75_20671, SEQ ID NO 40 ； gas57M75_30603, SEQ ID NO 41 ；gas57M75_30207, SEQ ID NO 42 ；gas57M22_20641, SEQ ID NO 43 ；gas57M22_23465, SEQ ID NO :44 ;gas57M3，1_30610，SEQ ID NO 45 ；gas57M3, 1_40603，SEQ ID NO :46 ;gas57M3，28_24214，SEQ ID NO :47 ;gas57M3，34_10307，SEQ ID NO 48 ；gas57M4_40427, SEQ ID NO 49 ；gas57M3_2721, SEQ ID NO 50 ；gas57M12_10296, SEQ ID NO 51 ；gas57M12_10035, SEQ ID NO 52 ；gas57M12_20069, SEQ ID NO 53 ； gas57M12_22432，SEQ ID NO 54 ；gas57M4_40499,SEQ ID NO 55 ；和 gas57M6，1_21259，SEQ ID NO 56 ；gas57M75_20671, SEQ ID NO :80。圖11.人趨化因子的比對。GAS57在二個(gè)粗體顯示氨基酸與下劃線顯示氨基酸之 間切斷 CXCL8(IL-8) (SEQ ID NO :81)。CXCL4，SEQ ID NO 57 ；CXCL7/NAP-2，SEQ ID NO 58 ； CXCLl/GRO α，SEQ ID NO 59 ；CXCL2/GR0 3，SEQ ID NO 60 ；CXCL3/GR0y , SEQ ID NO 61 ； CXCL6/GCP-2 γ，SEQ ID NO 62 ；CXCL12/SDF-1 α，SEQ ID NO 63 ；CXCL12/SDF-1 γ，SEQ ID NO 64 ；CXCL12/SDFl-3，SEQ ID NO 65 ；CXCL9/MIG, SEQ ID NO 66 ；CXCL10/IP10, SEQ ID NO 67 和 CXCLl 1，SEQID NO :68。圖12. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯微照片，顯示GAS57切割CXC趨化因子。發(fā)明詳述本發(fā)明提供不能切割人趨化因子如IL-8但仍保留了誘導(dǎo)抵御釀膿鏈球菌保護(hù)能 力的Spy0416或GAS57突變體(本文稱為“GAS57突變抗原”、“GAS57突變體”、“突變型GAS57 抗原”)。本發(fā)明的GAS57突變體可用于疫苗組合物以誘導(dǎo)抵御釀膿鏈球菌的保護(hù)力。本 發(fā)明也提供特異性結(jié)合野生型GAS57蛋白從而能抑制GAS57切割I(lǐng)L-8和類似物質(zhì)的抗體。設(shè)想該抗體可用作預(yù)防和/或治療釀膿鏈球菌感染的治療藥物。突變型GAS57抗原“GAS57” 也稱為 “Spy0416”(Ml)、“SpyM3_0298”(M3)、“SpyM18_0464”(M18) 和“prtS”。GAS57的鑒定也曾推測為是一種細(xì)胞外膜蛋白酶。參見WO 02/34771和UA 2006/0258849。根據(jù)疾病控制中心現(xiàn)知有17種不同M類型(1、2、3、4、6、11、12、18、22、23、 28、44/61、68、76、77、89、94)的49種GAS57序列，在美國這17種不同M類型占咽炎病例的 95%以上和侵入性GAS分離物的約68%。野生型GAS57抗原的序列見SEQ ID NO 1,10-56 和80。野生型GAS57包含二條非共價(jià)結(jié)合的肽(參見實(shí)施例5和圖7)。本發(fā)明的突變型GAS57抗原對白介素8(IL_8)有蛋白水解活性，經(jīng)SDS-PAGE或 ELISA 檢測此活性比野生型 GAS57 至少低 50% (如低 50、60、65、70、75、80、85、90、95、96、 96、98、99或100% )，參見實(shí)施例2和3 ；但有免疫原性，例如能賦予小鼠模型抵御GAS致 死性攻擊的保護(hù)力(實(shí)施例4)。優(yōu)選的本發(fā)明突變型GAS57也不切割人的其它細(xì)胞因子， 如 CXCLl/GRO α (如 SEQ ID NO 59)、CXCL2/GR0 β (如 SEQ ID NO 60)、CXCL3/GR0 γ (如 SEQ ID NO 61)、CXCL4(如 SEQ ID NO 57)、CXCL12/SDF-1 α (如 SEQ ID NO 63)、CXCL12/ SDF-I β (如 SEQ ID NO 65) ,CXCL12/SDF-1 γ (如 SEQ ID NO :64)、CXCL5/ENA78 (如 SEQ ID NO :82)、CXCL6/GCP-2(如 SEQ ID NO :62)、CXCL7/NAP_2 (如 SEQ ID NO :58)、CXCL9/MIG (如 SEQ ID NO :66)、CXCL10/IP10 (如 SEQ ID NO :67)、CXCL11 (如 SEQ ID NO :68)、CXCL13 (如 SEQ ID NO 83)、CXCL14(如 SEQID NO 84)和 CXCL16(如 SEQ ID NO 85)。出乎意料的是 本發(fā)明的GAS57突變體是單一多肽，而野生型GAS57則相反經(jīng)翻譯后加工(成熟)形成二 條非共價(jià)結(jié)合的肽(實(shí)施例5和6)。能夠獲得這種單一肽形式的抗原有利于疫苗重組蛋白 的生產(chǎn)。本發(fā)明的GAS57突變體包括在SEQ ID NO :1所示野生型GAS57序列編號的D151、 H279或S617氨基酸中一個(gè)或多個(gè)處具有氨基酸改變(即取代、缺失或插入)的那些，參見 圖10。本發(fā)明的GAS57突變體包括在D151、H279和/或S617位置的一個(gè)、二個(gè)或三個(gè)氨 基酸改變(“單突變體”、“雙突變體”、“三突變體”)。因此，GAS57突變蛋白可包括以下i.D151A(SEQ ID NO :2)、D151R、D151N、D151C、D151Q、D151E、D151G、D151H、D151I、 015比、01511(、0151]\1、015明、0151卩、01515、01511\01511、0151￥或0151￥ ；ii. H279A、H279R、H279N、H279D、H279C、H279Q、H279E、H279G、H279I、H279L、H279K、 H279M、H279F、H279P、H279S、H279T、H279W、H279Y 或 H279V ；iii. S617A(SEQ ID NO 3)、S617R、S617N、S617D、S617C、S617Q、S617E、S617G、 S617H、S617I、S617L、S617K、S617M、S617F、S617P、S617T、S617W、S617Y 或 S617V ；iv. AD151 ；或 ΔΗ279 ；或 AS617 ；和它們的組合，如D151A+S617A(SEQ ID NO :4)。本發(fā)明的GAS57突變抗原也包括含上述GAS57突變抗原和另一種GAS57抗 原的融合多肽。例如WO 02/34771公開的GAS57抗原包括但不限于GAS25 (SpyO 167 ； gi13621460)、 GAS39 (Spy0266 ； gi13621542)、 GAS40 (Spy0269 ； gi13621545)、 GAS42 (Spy0287 ；gi 13621559)、GAS45 (M5005_Spy0249 ；gi71910063)、GAS58 (Spy0430 ； gil3621663)、GAS84 (Spyl274 ；13622398)、GAS95 (Spyl733 ；13622787)、GAS117 (Spy0488 ；gi13621679)、 GAS130(Spy0591 ；gi13621794)、 GAS137 (Spy0652 ；gi13621842)、 GAS159(Spyl105 ；gi13622244) 、 GAS193(Spy2025 ；gi3623029)、 GAS202 (Spy 1309 ； gi13622431) 、 GAS217(Spy0925 ；gi1362208)、 GAS236 (Spyl126 ；gi13622264)、 GAS253 (Spyl524 ；gil3622611) 、 GAS277 (Spyl939 ；gil3622962) 、 GAS294 (Spy 1173 ； gi 13622306)、 GAS309 (Spy0124 ；gi13621426)、 GAS366 (Spy 1525 ；gi13622612)、 GAS372 (Spyl625 ；gil3622698) 、 GAS384 (Spy 1874 ；gil3622908) 、 GAS389 (Spy 1981 ； gi 13622996)、 GAS504 (Spy 1751 ；gi13622806)、 GAS509 (Spy 1618 ；gi 13622692)、 GAS290(Spyl959 ；gil3622978)、 GAS511(Spy 1743 ；gil3622798)、 GAS527 (Spyl204 ； gi3622332)、GAS529(Spyl280 ;gi3622403)和 GAS533 (Spyl877 ;gil3622912)。GAS 抗原 還包括:GAS68(Spy0163 ；gi 13621456)、GAS84 (Spyl274 ；gi 13622398)、GAS88 (Spy 1361 ； gi13622470)、 GAS89(Spy 1390 ；gi13622493)、 GAS98(Spy 1882 ；gil3622916), GAS99(Spy 1979 ；gi13622993)、 GAS102(Spy2016 ；gi13623025)、 GAS146(Spy0763 ； gi13621942)、 GAS 195(Spy2043 ；gi13623043)、 GAS561(Spy 1134 ；gi13622269)、 GAS179(Spyl718 ；gil3622773)和 GAS681(Spyll52 ；gil362228)。本發(fā)明還包括經(jīng)SDS-PAGE或ELISA測定不能切割I(lǐng)L_8，但具有免疫原性能賦予 小鼠模型抵御GAS致死性攻擊保護(hù)力的GAS57突變體單一多肽的等同物。這種等同物包括 在D151、H279或S617以外的位置含有氨基酸缺失、插入和/或取代的突變型GAS57抗原， 包括N或C末端缺失最多約40個(gè)氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 個(gè)氨 基酸)。因此，這種等同物包括除了在上述氨基酸D151、H279或S617和S617中一個(gè)或多 個(gè)處具有氨基酸改變外，在D151、H279或S617位以外的一些位置含有缺失、插入和/或取 代的GAS57突變體。核酸分子本發(fā)明包括編碼突變型GAS57抗原的核酸分子。本發(fā)明也包括所含核苷酸序列 與這種分子至少有50%序列相同性的核酸分子。取決于具體的序列，所述序列相同性程度 優(yōu)選大于 50% (如 60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或更高)。核苷酸序列之間的相同性優(yōu)選用Smith-Waterman同源性檢索算 法測定，以MPSRCH程序(牛津分子公司(Oxford Molecular))進(jìn)行，所用仿射空位檢索的 參數(shù)是空位開放罰分=12，空位延伸罰分=1。本發(fā)明也提供能與上述這些分子雜交的核酸分子。可在不同“嚴(yán)謹(jǐn)性”條件下 進(jìn)行雜交反應(yīng)。提高雜交反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性的條件是本領(lǐng)域廣為所知和已發(fā)表的。參見例如 Sambrook 等“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(Molecular Cloning :A Laboratory Manual) ” 1989， 第7. 52頁。有關(guān)條件的例子包括(為提高嚴(yán)謹(jǐn)性)251、371、501、551和681的培育 溫度；10X SSC、6X SSCUX SSC 禾口 0. IX SSC(SSC 是 0. 15M NaCI 禾口 15mM 檸檬酸緩沖液)的 緩沖液濃度和與其等同的采用其它緩沖液的系統(tǒng)；0%、25%、50%和75%的甲酰胺濃度； 5分鐘至24小時(shí)的培育時(shí)間；1、2或更多次的洗滌步驟；1、2或15分鐘的洗滌培育時(shí)間； 6X SSCUX SSC、0. IX SSC或去離子水的洗滌液。雜交技術(shù)及其優(yōu)化是本領(lǐng)域熟知的，可參 見例如，Sambrook，1989 ;Ausubel等編著的“分子生物學(xué)簡短方案(Short Protocols in MolecularBiology)，，第4版，1999 ；美國專利5，707，829 ；Ausubel等編著“分子生物學(xué)當(dāng)前方案(Current Protocols in Molecular Biology) ”，增刊 30，1987。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子能在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與靶分子雜交；在其它 實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸分子能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交；在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的 核酸分子能在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件的一個(gè)例子是50°C和IOX SSC0中 等嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件的一個(gè)例子是55°C和IX SSC0高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件的一個(gè)例子是68°C和 0.IX SSCo制備突變型GAS57抗原重組制備基因密碼子的冗余度是眾所周知的。因此，可利用編碼野生型GAS57蛋白或編 碼本發(fā)明GAS57突變蛋白的任何核酸分子(多核苷酸)來產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。編碼野生型 GAS57、GAS57突變體D151A、GAS57突變體S617A和GAS突變體D151A+S617A的核苷酸序列 分別見SEQ ID N0:5、6、7和8。也可采用標(biāo)準(zhǔn)的核酸純化技術(shù)從合適的釀膿鏈球菌分離編 碼野生型GAS57的核酸分子，或采用擴(kuò)增技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或用自動(dòng)化合成 儀合成該核酸分子。參見 Caruthers 等.，Nucl Acids Res SympSer. 215, 223,1980 ；Horn 等.，Nucl Acids Res Symp Ser. 225，232，1980 ;Hunkapiller 等·，Nature 310,105-11, 1984 ；Grantham 等，Nucl Acids Res. 9，r43_r74，1981?？捎脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，以mRNA為模板制備cDNA分子。然后可用本領(lǐng)域熟知的 分子生物學(xué)技術(shù)復(fù)制該cDNA分子?？衫没蚪MDNA或cDNA作模板，以擴(kuò)增技術(shù)，如PCR 獲得更多拷貝的本發(fā)明多核苷酸。如果需要，可用本領(lǐng)域眾所周知的方法工程改造多核苷酸以改變抗原編碼序列， 包括但不限于導(dǎo)致克隆、加工和/或多肽或mRNA產(chǎn)物表達(dá)的修飾等的改變?？刹捎没蚱?段和合成寡核苷酸的隨機(jī)片段化PCR重裝配改組DNA，從而工程改造核苷酸序列。例如，可 利用定點(diǎn)誘變插入新的限制性酶位點(diǎn)，改變糖基化模式，改變密碼子偏愛，產(chǎn)生剪接變體， 引入突變等等?？衫眯蛄行揎?，例如加入純化標(biāo)簽序列或優(yōu)化密碼子來促進(jìn)表達(dá)。例如，用編碼 標(biāo)簽蛋白如聚組氨酸(“HIS”)或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(“GST”)的序列替代N-末端前導(dǎo) 序列?？衫眠@種標(biāo)簽蛋白促進(jìn)表達(dá)蛋白的純化、檢測和穩(wěn)定性?？蛇x擇具體的原核或真 核宿主偏愛的密碼子來提高蛋白表達(dá)率，或制備具有所需性能，如半壽期比天然序列產(chǎn)生 的轉(zhuǎn)錄物更長的RNA轉(zhuǎn)錄物。這些方法是本領(lǐng)域熟知的，在WO 05/032582中也有描述。表達(dá)載體可將編碼突變型GAS57抗原的核酸分子插入表達(dá)載體中，該表達(dá)載體含有轉(zhuǎn)錄和 翻譯插入的編碼序列所需的元件?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建包含編碼序列和 合適轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)和體內(nèi) 基因重組技術(shù)。宿主細(xì)胞能產(chǎn)生突變型GAS57抗原的宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì) 胞是大腸桿菌，其它合適的宿主包括乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酸乳球菌乳 脂亞種(lactococus cremoris)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、傷寒沙門菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)、乳酉先胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、分枝桿菌 (Mycobacteria)(如結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis))、酵母菌、桿狀病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞寸寸。

可選擇能以所需方式調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或加工所表達(dá)多肽的宿主細(xì)胞株。多 肽的這種修飾包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和?；?。也可利用切 害IJ “前蛋白”形式多肽的翻譯后加工來幫助正確插入、折疊和/或行施功能。可從美國模 式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC ;10801，大學(xué)大道，瑪娜絲，弗吉尼亞州(University Boulevard, Manassas, VA) 20110-2209)獲得具有翻譯后活化特異性細(xì)胞機(jī)制和特征機(jī)理的不同宿主細(xì) 胞，并作選擇以確保外源蛋白的正確修飾和加工。參見WO 01/98340?？刹捎靡蚜己媒⒌募夹g(shù)將表達(dá)構(gòu)建物引入宿主細(xì)胞，包括但不限于轉(zhuǎn)鐵蛋 白-聚陽離子介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移，用裸核酸或包裹的核酸轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞融合，包裹 DNA的膠乳珠的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，病毒感染，電穿孔，“基因槍”方法，和DEAE-或磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)
^fe ο將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞培養(yǎng)在適合從細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)蛋白和回收的條件下。轉(zhuǎn) 化細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白可能分泌出來或包含在細(xì)胞內(nèi)，這取決于核苷酸的序列和/或所用的表 達(dá)載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可以設(shè)計(jì)含有信號序列的表達(dá)載體，其能引導(dǎo)可溶性抗原穿 過原核或真核細(xì)胞膜而分泌。純化可在重組產(chǎn)生的突變型GAS57抗原中包含信號輸出序列，以便用已知方法純化細(xì) 胞培養(yǎng)液中的抗原。或者，可用本領(lǐng)域熟知的方法，從工程改造的宿主細(xì)胞中分離本發(fā)明重 組產(chǎn)生的突變型GAS57抗原，使其與宿主細(xì)胞的其它組分，如蛋白質(zhì)、糖或脂質(zhì)分開。這類 方法包括但不限于分子大小排阻層析、硫酸銨分級、離子交換層析、親和層析和制備型凝 膠電泳。純化的突變型GAS57抗原制品至少80 %純，優(yōu)選該制品為90 %、95 %或99 %純。 可用本領(lǐng)域已知的任何方法，例如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來評估制品的純度?？捎眠m當(dāng) 的試劑，如脲素來促進(jìn)突變型GAS57抗原的溶解?；瘜W(xué)合成突變型GAS57抗原的合成，例如可采用固相技術(shù)。參見，如Merrif ield，J Am Chem Soc. 85,2149-54，1963 ;Roberge 等·，Science 269，202-04，1995?？刹捎檬止ぜ夹g(shù)或自 動(dòng)化技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。實(shí)施自動(dòng)化合成，例如可采用泊金艾爾默公司的應(yīng)用生物系統(tǒng) 431A肽合成儀(Applied Biosystems431A Peptide Synthesizer,Perkin Elmer)?？扇芜x 分別合成突變型GAS57抗原的各片段，再用化學(xué)方法組合產(chǎn)生全長分子。GAS57 抗體本發(fā)明也提供能特異性結(jié)合野生型GAS57從而實(shí)質(zhì)性減弱或消除GAS57切割I(lǐng)L_8 能力的抗體。本發(fā)明的某些抗體也能特異性結(jié)合上述突變型GAS57。優(yōu)選的抗體還能減弱 或消除 GAS57 切割其它物質(zhì)，如 IL-8 同類物(如 CXCL1/GR0 α、CXCL2/GR0 β、CXCL3/GR0 γ、 CXCL4、CXCL12/SDF-1 α、CXCL12/SDF-1 β、CXCL12/SDF-1 γ、CXCL5/ENA78、CXCL6/GCP-2、 CXCL7/NAP-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP10、CXCL11、CXCL13、CXCL14 和 CXCL16)的能力。任何 用于免疫化學(xué)試驗(yàn)的抗體提供的檢測信號比用非-GAS57蛋白提供的檢測信號至少高5_、 10"或20-倍，即為能“特異性結(jié)合”野生型或突變型GAS57的抗體。能特異性結(jié)合野生型或突變型GAS57的抗體優(yōu)選在免疫 化學(xué)試驗(yàn)中不能檢測非GAS57蛋白，可用其免疫沉淀溶 液中的野生型GAS57。用SDS-PAGE或ELISA檢測，本發(fā)明的抗體可減弱GAS57對白介素 8(IL-8)的蛋白水解活性，與野生型相比至少減弱50% (如50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95、96、97、98、99 或 100% )。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體能阻斷免疫接種野生型或突變型GAS57重組 抗原并受GAS攻擊的動(dòng)物壞死病灶的發(fā)展。本文所用的“抗體”包括完整的免疫球蛋白分子，以及其能特異性結(jié)合野生型 GAS57的，某些情況下能特異性結(jié)合突變型GAS57抗原的片段。這些抗體片段包括雜交 (嵌合)抗體分子(如 Winter 等，Nature349，293-99，1991 ；美國專利 4，816，567) ；F(ab，)2 和F(ab)片段及Fv分子；非共價(jià)連接的異質(zhì)二聚體(如Inbar等，Proc Natl AcadSci. USA. 69,2659-62,1972 ；Ehrlich 等.，Biochem. 19，4091-96，1980)；單鏈 Fv 分子(sFv)(如 Huston 等.，Proc Natl Acad Sci. USA. 85，5897-83，1988) ；二聚或三聚抗體片段構(gòu)建物； 微小抗體(如 Pack 等·，Biochem. 31，1579-84，1992 ；Cumber 等·，J Immunology. 149B, 120-26,1992)；人源化抗體分子(如 Riechmann 等·，Nature. 332，323-27，1988 ；Verhoeyan 等·，Scence. 239，1534-36，1988 和公開的英國專利號 GB2, 276，169，1994/9/21 公開)；獲 自這些分子的任何功能性片段及通過非常規(guī)方法，如噬菌體展示技術(shù)獲得的抗體。制備GAS57抗體可利用突變型或野生型GAS57抗原免疫哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、猴 子或人來產(chǎn)生多克隆抗體。如果需要，可將GAS57抗原偶聯(lián)于載體蛋白，如牛血清白蛋白、 甲狀腺球蛋白或匙孔賊血蘭蛋白。根據(jù)宿主種類，可采用不同的佐劑來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。這 類佐劑包括但不限于弗氏佐劑、無機(jī)膠體(如氫氧化鋁)和表面活性劑(如溶血卵磷脂、 普朗尼克多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔賊血蘭蛋白和二硝基苯酚)。人用佐劑中，特 別采用BCG(卡介苗)和短棒桿菌?？刹捎猛ㄟ^連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)來制備能特異性結(jié)合野生 型或突變型GAS57抗原的單克隆抗體。這些技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交 瘤技術(shù)和 EBV 雜交瘤技術(shù)(Kohler 等.，Nature. 256，495-97，1985 ；Kozbor 等.，J Immunol Methods. 81，31-42，1985 ;Cote 等·，Proc Natl Acad Sci.USA.80,2026-30,1983 ；Cole 等·，Mol CellBiol. 62，109-20，1984)。此外，可采用為產(chǎn)生“嵌合抗體”而開發(fā)的技術(shù)，該技術(shù)將小鼠抗體基因剪接于 人抗體基因獲得具有合適抗原特異性和生物學(xué)活性的分子(Morrison等.，Proc Natl Acad Sci. USA. 81，6851-55，1984 ；Neuberger 等.，Nature. 312，604-08，1984 ；Takeda 等.， Nature. 314,452-54,1985)。也可“人源化”單克隆抗體和其它抗體以防止病人對所用治療 抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這類抗體的序列與直接用于治療的人抗體應(yīng)充分相似或可能需要改變 幾個(gè)關(guān)鍵殘基?？赏ㄟ^定點(diǎn)誘變單個(gè)殘基或移植整個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)，用人抗體序列取代與鼠 抗體序列中不同的殘基以最大程度減少嚙齒類抗體與人序列之間的序列差異?；蛘?，可用以下所述重組方法產(chǎn)生人源化抗體。如美國專利5，565，332所述，特異 性結(jié)合特定抗原的抗體可包含部分或完全人源化的抗原結(jié)合位點(diǎn)。可如Simmons等.，PLoS Medicine 4 (5)，928-36，2007所述體外制備人單克隆抗體?；蛘?，可采取所述的產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)，用本領(lǐng)域已知方法來產(chǎn)生特異性結(jié)合特定抗原的單鏈抗體?？蓮拿庖咔虻鞍纂S機(jī)組合庫的鏈改組來產(chǎn)生具有相關(guān)特異性但獨(dú)特 性組成不同的抗體(Burton 等·，Proc Natl AcadSci. USA. 88，11120-23，1991)。也可用DNA擴(kuò)增方法，如PCR，用雜交瘤cDNA作模板構(gòu)建單鏈抗體(Thirion 等.，Eur J Cancer Prev. 5，507-11，1996)。單鏈抗體可以是單-或雙-特異性，可以是 二價(jià)或四價(jià)抗體。構(gòu)建四價(jià)雙特異性單鏈抗體可參見，例如Coloma and Morrison. , Nat Biotechnol. 15，159-63，1997中所述。構(gòu)建二價(jià)雙特異性單鏈抗體可參見Mallender和 Voss.，J Biol Chem. 269，199-206，1994 中所述?？捎檬止せ蜃詣?dòng)化核苷酸合成構(gòu)建編碼單鏈抗體的核苷酸序列，如下所述，用標(biāo) 準(zhǔn)重組DNA方法將其克隆入表達(dá)構(gòu)建物中，再引入細(xì)胞而表達(dá)該編碼序列?；蛘?，可采 用絲狀噬菌體技術(shù)直接產(chǎn)生單鏈抗體(Verhaar等.，Int J Cancer. 61，497-501，1995 ； Nicholls 等·，J ImmunolMeth. 165，81-91，1993)。也可通過體內(nèi)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞群產(chǎn)生，或通過篩選文獻(xiàn)所述的免疫球蛋白庫或一些 高特異性結(jié)合物質(zhì)(Orlandi 等.，Proc Natl AcadSci. USA. 86，3833-37，1989 ；Winter 等.， Nature 349，293-99，1991)來制備能特異性結(jié)合GAS57抗原的抗體?？砂碬O 93/03151所述構(gòu)建嵌合抗體。也可制備免疫球蛋白衍生的多價(jià)多特異性 結(jié)合蛋白，如WO 94/13804所述的“二抗體”?？捎帽绢I(lǐng)域熟知方法純化抗體。例如，可通過結(jié)合有相關(guān)抗原的層析柱來親和純 化抗體。然后可用高鹽濃度緩沖液洗脫結(jié)合的抗體。藥物組合物本發(fā)明也提供用作藥物的組合物(如免疫原性組合物或疫苗)?？捎帽景l(fā)明的組 合物預(yù)防和/或治療釀膿鏈球菌感染所引起的疾病，該組合物包含至少一種活性成分，可 以是多肽、核酸分子或抗體。所述疾病，例如可以是菌血癥、腦膜炎、產(chǎn)褥期猩紅熱、猩紅熱、 丹毒、咽炎、膿皰病、壞死性筋膜炎、肌炎或中毒性休克綜合征。本發(fā)明的藥物組合物可用于預(yù)防或治療，但通常用于預(yù)防。因此，本發(fā)明包括治療 或預(yù)防性治療釀膿鏈球菌感染的方法。動(dòng)物優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人。該方法包括給予動(dòng) 物治療或預(yù)防量的本發(fā)明免疫原性組合物。本發(fā)明也提供本發(fā)明的免疫原性組合物以供治 療或預(yù)防性治療動(dòng)物的釀膿鏈球菌感染。包含突變型GAS57抗原或編碼突變型GAS57抗原核酸分子的組合物優(yōu)選為免疫原 性組合物，更優(yōu)選為疫苗組合物。這種組合物的PH宜在6-8之間，優(yōu)選約7。可用緩沖劑維 持此PH。該組合物可以無菌和/或無熱原。該組合物可與人體組織(如血液)等滲。本發(fā)明的某些組合物包含本文所述的一種或多種突變型GAS57抗原。本發(fā)明的其 它組合物包含編碼突變型GAS57抗原的一種或多種核酸分子及任選的可包含在此組合物 中的其它抗原(見下文)。參見例如 Robinson 禾口 Torres (1997) Seminars in Immunology 9 271-283 ；Donnelly φ . , (1997) AnnRev Immunol 15 617-648 ；Scott-Taylor & Dalgleish(2000)Expert OpinInvestig Drugs 9 471~80 ；Apostolopoulos & plebanski(2000)Curr Opin MolTher 2 ；441-47 ；Ilan(1999)Curr Opin Mol Ther 1 116-20 ；Dubensky φ . ， (2000)Mol Med 6 723-32 ；Robinson & Pertmer(2000)Adv Virus Res 55 :1-74 ;Donnelly 等·，(2000)Am J Respir Crit Care Med 162(4Pt2) :S190_193 ； Davis (1999)Mt Sinai J Med 66:84-90。所述核酸分子通常是DNA分子，如質(zhì)粒形式。
本發(fā)明的其它組合物包含至少一種特異性結(jié)合上述野生型GAS57抗原的抗體，或 編碼這種抗體的核酸分子。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物可包含一種類型以上的活性劑(如多肽抗原 和核酸分子；多肽抗原和抗體；核酸分子和抗體；多肽抗原、核酸分子和抗體)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物可包含一種或多種其它活性劑。這種活性劑 包括但不限于(a)本發(fā)明的另一種突變型GAS57抗原，(b)用于兒童疫苗的多肽抗原，(c) 用于老年人或免疫力低下個(gè)體的疫苗的多肽抗原，(d)編碼(a)-(c)的核酸分子和特異性 結(jié)合(a)-(c)的抗體。其它抗原本發(fā)明的組合物可與用于本發(fā)明治療或預(yù)防方法的一種或多種抗原一起給予。優(yōu) 選的抗原包括以下所列的那些。此外，可用本發(fā)明的組合物治療或預(yù)防以下所列任何一種 病原體引起的感染。除與以下所述抗原聯(lián)用外，本發(fā)明組合物也可與本文所述佐劑聯(lián)用。可與本發(fā)明聯(lián)用的抗原包括但不限于一種或多種以下抗原，或衍生自一種或多種 以下病原體的抗原A.細(xì)菌抗原適合用于本發(fā)明的細(xì)菌抗原包括可從細(xì)菌分離、純化或衍生的蛋白質(zhì)、多糖、脂多 糖及外膜囊泡。此外，細(xì)菌抗原可包括細(xì)菌裂解液和滅活的細(xì)菌制劑。可重組表達(dá)產(chǎn)生細(xì) 菌抗原。細(xì)菌抗原優(yōu)選包含在細(xì)菌生命周期至少某階段暴露在細(xì)菌表面的表位。細(xì)菌抗原 優(yōu)選多種血清型之間的保守性抗原。細(xì)菌抗原包括衍生自以下的一種或多種細(xì)菌及以下鑒 定的特異性示范抗原中的抗原。奈瑟腦膜炎球菌(N.meningitides)腦膜炎球菌抗原可包括自奈瑟氏腦膜炎球 菌血清群如A、C、W135、Y和/或B純化的或衍生的蛋白質(zhì)(如參考文獻(xiàn)1-7所鑒定的那 些)、糖(包括多糖、寡糖或脂多糖)或外膜囊泡(參考文獻(xiàn)8、9、10、11)?？蓮恼掣降鞍?、 自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(autotransporter)、毒素、Fe獲取蛋白和膜締合蛋白(優(yōu)選外膜整合蛋白) 中選擇腦膜炎球菌的蛋白抗原。肺炎鏈球菌(Str印tococcus pneumoniae)肺炎鏈球菌抗原可包括肺炎鏈球菌 的糖(包括多糖或寡糖)和/或蛋白質(zhì)?？蛇x用血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的糖抗原?？蛇x用 WO 98/18931、WO 98/18930、美國專利號6，800，744,WO 97/43303和WO 97/37026所鑒定蛋白質(zhì)的蛋白抗原。 可從聚組氨酸Triad家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX 截短物、CbpX-LytX截短嵌合蛋白、肺炎球菌溶酶(Ply)、PspA, PsaA, Spl28、SplOl、Spl30、 Spl25或Spl33蛋白選擇肺炎鏈球菌蛋白。釀膿鏈球菌(A群鏈球菌)A群鏈球菌抗原可包括WO 02/34771或W02005/032582 鑒定的蛋白質(zhì)(包括GAS40)、融合的GAS M蛋白片段(包括TO 02/094851和Dale， Vaccine (1999) 17 ； 193-2000 及 Dale Vaccinel4(10) :944_948 中描述的那些)、纖連蛋白 結(jié)合蛋白(Sfbl)、鏈球菌亞鐵血紅素締合蛋白(Shp)和鏈球菌溶血素S(SagA)。其它的A 群鏈球菌抗原包括但不限于:GAS25(Spy0167 ；gi 13621460) GAS39 (Spy0266 ；gi 13621542)， GAS40(Spy0269 ；gi13621545)，GAS42(Spy0287 ；gil3621559)，GAS45(M5005_Spy0249 ； gi71910063), GAS58 (Spy0430 ；gi 13621663)，GAS84 (SPyl274 ； 13622398)，GAS95 (SPyl733 ；13622787) , GAS117(Spy0448 ；gil3621679) , GAS130 (Spy0591 ； gi13621794)， GAS137(Spy0652 ；gil3621842)， GAS159 (Spyll05 ；gil3622244)， GAS193 (Spy2025 ； gi3623029)， GAS202 (Spy 1309 ；gi13622431)， GAS217 (Spy0925, gi1362208)， GAS236 (Spyll26 ；gil3622264)， GAS253 (Spyl524 ；gil3622611)， GAS277 (Spyl939 ； gi13622962)， GAS294 (Spyl 173 ；gi13622306)， GAS309 (SpyO 124 ；gi13621426)， GAS366(Spyl525 ；gil3622612) ， GAS372 (Spyl625 ；gil3622698)， GAS384(Spy 1874 ； gil3622908) , GAS389 (Spyl981 ；gi13622996)， GAS504 (Spyl751 ；gi13622806)， GAS509(Spyl618 ；gil3622692) ， GAS290(SPy1959 ；gil3622978) ， GAS511(Spyl743 ； gi 13622798)， GAS527 (Spy 1204 ；gi3622332)， GAS529 (Spy 1280 ；gi3622403)， and GAS533 (Spyl877 ；gil3622912) ， GAS68 (Spy0163 ；gil3621456)， GAS84 (Spy 1274 ； gil3622398), GAS88 (Spyl361 ； gi13622470)， GAS89 (Spyl390 ；gi13622493)， GAS98 (Spy 1882 ；gi13622916) ， GAS99(Spy 1979 ；gi13622993) ， GAS102(Spy2016, gi13623025)， GAS146(Spy0763 ；gi13621942)， GAS195 (Spy2043 ；gi13623043)， GAS561(Spyll34 ；gil3622269), GAS179 (Spyl718, gil3622773)和 GAS681(spyl152 ； gil362228)。粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhal is)粘膜炎莫拉菌抗原包括W002/18595和 WO 99/58562鑒定的抗原、外膜蛋白抗原(HMW-OMP)、C-抗原和/或LPS。百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)百日咳菌抗原包括百日咳全毒素 (PT)和絲狀血凝素(FHA)，任選也與百日咳桿菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3 聯(lián)用。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)金黃色葡萄球菌抗原包括任選與無 毒重組銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A偶聯(lián)的5型和8型金黃色葡萄 球菌莢膜多糖，例如StaphVAX ，或衍生自表面蛋白質(zhì)的抗原，侵染素(殺白細(xì)胞素、激酶、 透明質(zhì)酸酶)，抑制吞噬細(xì)胞吞噬作用的表面因子(莢膜，A蛋白)，類胡蘿卜素，過氧化氫 酶產(chǎn)物，A蛋白，凝固酶，凝血因子，和/或裂解真核細(xì)胞膜的膜破壞性毒素(任選脫毒的) (溶血素、白細(xì)胞毒素、殺白細(xì)胞素)。表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)表皮葡萄球菌抗原包括粘質(zhì)結(jié)合抗 原(SAA)。破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)(破傷風(fēng))破傷風(fēng)菌抗原包括破傷風(fēng)類毒素 (TT)，優(yōu)選用作與本發(fā)明組合物結(jié)合/偶聯(lián)的載體蛋白質(zhì)。白喉棒狀桿菌(Cornynebacterium diphtheriae)(白喉)白喉抗原包括白喉毒 素，優(yōu)選脫毒的，如CRM197。此外考慮將能調(diào)節(jié)、抑制ADP核糖基化或與之結(jié)合的抗原與本 發(fā)明組合物聯(lián)用/共同給藥/偶聯(lián)，所述白喉類毒素可用作運(yùn)載體蛋白。流感嗜血桿菌B (Haemophilus influenzaeB) (Hib) =Hib 抗原包括 Hib 糖抗原。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)銅綠假單胞菌抗原包括內(nèi)毒素A、Wzz 蛋白、銅綠假單胞菌LPS，更具體說是分離自PAOl (05血清型)的LPS和/或外膜蛋白，包括 外膜蛋白 F (OprF) (Infect Immun. 2001，May ；69 (5) :3510_15)。嗜肺軍團(tuán)病桿菌( pneumophila)可以是衍生自嗜肺軍團(tuán)桿菌病桿菌 的細(xì)菌抗原。
無乳鏈球菌(Sti^ptococcus agalactiae) (B群鏈球菌)B群鏈球菌抗原包括WO 02/3477UW0 03/093306,WO 04/041157 或 WO 2005/002619 鑒定的蛋白或糖抗原(包括蛋 白 GBS80、GBS104、GBS276 和 GBS322 以及包括血清型 la、lb、Ia/c、II、III、IV、V、VI、VII 和VIII產(chǎn)生的糖抗原)。淋病奈瑟菌(Neiserria gonorrhoeae)淋病奈瑟菌抗原包括Por (或膜通道蛋 白)蛋白，如PorB(參見Zhu等.，Vaccine (2004) 22 :660_69)、轉(zhuǎn)移結(jié)合蛋白如TbpA和 TbpB (參見 Price 等·，Infection and immunity (2004) 71 (1) :277_283)、混濁蛋白(如 Opa)、還原可修飾蛋白(Rmp)和外膜囊泡(OMV)制品(參見Plante等.，J Infectious Disease (2000) 182 :848-55)，也參見例如 WO 99/24578、WO 99/36544、WO 99/57280、WO 02/0792430。砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)砂眼衣原體抗原包括血清型A、B、Ba和 C產(chǎn)生的抗原(砂眼致病因子，導(dǎo)致失明)、血清型Li、L2和L3產(chǎn)生的抗原(與性病性淋 巴肉芽腫(Lymphogranuloma venereum)有關(guān))和血清型D-K產(chǎn)生的抗原。砂眼衣原體 抗原還可包括 WO 00/37494、WO 03/049762、WO 03/068811 或 WO 05/002619 鑒定的抗原， 包括 P印A(CT045)、LcrE (CT089)、ArtJ(CT381)、DnaK (CT396)、CT398、OmpH-樣(CT242)、 L7/L 12(CT316)、0mcA(CT444)、AtosA (CT467)、CT547、Eno (CT587)、HrtA(CT823)禾口 MurG (CT761)。蒼白密螺旋體(Tr印onema pallidum)(梅毒)蒼白密螺旋體抗原包括TmpA抗原。杜克雷嗜血桿菌(Haemophilus ducreyi)(導(dǎo)致軟性下疳)軟性下疳抗原包括外 膜蛋白(DsrA)。獎(jiǎng)腸球菌(Enterococcus faecalis)或屎腸球菌(Enterococcus faecium)抗原 包括三糖重復(fù)序列或美國專利號6，756，361提供的其它腸球菌衍生抗原。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)幽門螺桿菌抗原包括 Cag、Vac、Nap、HopX, HopY和/或脲酶抗原。腐生性葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)抗原包括160kDa腐生葡萄 球菌血凝素。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)抗原包括 LPS (InfectImmun. 2002，Augst ；70 (8) 4414)。大腸桿菌(E. coli)大腸桿菌抗原可以是腸毒素性大腸桿菌(ETEC)、腸聚集性大 腸桿菌(EAggEC)、彌散性附性大腸桿菌(DAEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)和/或腸溶血性 大腸桿菌(EHEC)產(chǎn)生的抗原。炭疽桿菌(Bacillus anthracis)(炭疽)炭疽桿菌抗原任選是脫毒的，可選自 A-組分(致死因子(LF)和水腫因子(EF) )，二者具有稱為保護(hù)性抗原(PA)的共同B-組分。鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)鼠疫抗原包括Fl莢膜抗原(Infect Immun.，2003 年 1 月；71(1) :374_383)，LPS (Infect Immun. 1999 年 10 月；67(10) 5395)， 鼠疫耶爾森菌 V 抗原(Infect Immun. 1997 年 11 月；65(11) =4476-4482) 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)結(jié)核菌抗原包括脂蛋白、LPS、BCG 抗原、抗原85B(Ag85B)和/或ESAT-6的融合蛋白，任選配制在陽離子脂質(zhì)載體中(Infect Immun. 2004年10月；72 (10) :6148)，結(jié)核分枝桿菌(Mtb)異檸檬酸脫氫酶相關(guān)抗原(ProcNatl Acad Sci USA. 2004 年 8 月 24 日；101 (34) 12652)，禾口 / 或 MPT51 抗原(Infect Immun. 2004 年 7 月；72 (7) 3829)。立克次體(Rickettsia)抗原包括外膜蛋白A 和 / 或 B (OmpB) (BiochimBiophys Acta. 2004 年 11 月 1 日；1702 (2) 145)，LPS 和表面蛋白抗原(SPA) (J Autoimmun. 1989 年 6月；2增刊81)。單核細(xì)胞增多癥李斯特菌(Listeria monocytogenes)細(xì)菌抗原可衍生自單核細(xì) 胞增多性利斯特菌。肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)抗原包括WO 02/02606鑒定的那些抗原?；魜y弧菌(Vibrio cholerae)抗原包括蛋白酶抗原、LPS、特別是霍亂弧菌II的 脂多糖、01 Inaba 0_特異性多糖、霍亂弧菌0139、IEM108疫苗的抗原(Infect Immun. 2003 年10月；71 (10) =5498-504)和/或緊密連接毒素(Zot)。傷寒沙門菌(Salmonella typhi)(傷寒熱)抗原包括莢膜多糖，優(yōu)選偶聯(lián)物(Vi， 即 vax-TyVi)。博氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)(萊姆病)(萊姆病)抗原包括脂蛋 白(如OspA、OspB、OspC和OspD)，其它表面蛋白如OspE-相關(guān)蛋白(Erps)、核心蛋白多 糖結(jié)合蛋白(如DbpA)和抗原性可變的VI蛋白，如與P39和P13結(jié)合的蛋白(一種膜 內(nèi)在蛋白，Infect Immun. 2001 年 5 月；69 (5) :3323_34)、VLsE 抗原可變異蛋白(J Clin Microbiol. 1999 年 12 月；37 (12) 3997)。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原包括其牙齦卟啉單孢菌外膜 蛋白(OMP)?？死撞?Klebsiella)抗原包括0ΜΡ，包括0ΜΡΑ，或任選與破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)的多糖。本發(fā)明的其它細(xì)菌抗原可以是任何上述的莢膜抗原、多糖抗原或蛋白抗原。其它 細(xì)菌抗原也可包括外膜囊泡(OMV)制品。此外，抗原包括活的、減毒的和/或純化的任何上 述細(xì)菌。本發(fā)明的抗原可以衍生自革蘭-陰性菌或革蘭-陽性菌。本發(fā)明的抗原可以衍生 自需氧菌或厭氧菌。此外，可將上述細(xì)菌產(chǎn)生的任何一種糖(多糖、LPS、LOS或寡糖)與其它物質(zhì) 或抗原，如運(yùn)載體蛋白(如CRM197)偶聯(lián)。這種偶聯(lián)可以是通過還原胺化糖上的羰基部 分而實(shí)現(xiàn)與蛋白質(zhì)上的氨基直接偶聯(lián)，參見美國專利號5，360，897和Can.，J Biochem Cell Biol. 1984May ；62 (5) :270_5?；蛘?，糖可以經(jīng)接頭，例如琥珀酰胺或Bioconjugate Techniques (生物偶聯(lián)技術(shù))，1996 和 CRC, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking(蛋白質(zhì)偶聯(lián)和交聯(lián)化學(xué))，1993中提供的其它連接鍵偶聯(lián)。。B.病毒抗原適合本發(fā)明用的病毒抗原包括滅活(或殺傷)病毒、減毒病毒、裂解病毒制劑、純 化亞單位制劑、從病毒和病毒樣顆粒(VLP)分離、純化或衍生的病毒蛋白質(zhì)。病毒抗原可以 是在培養(yǎng)細(xì)胞或其它基質(zhì)上增殖病毒產(chǎn)生的抗原?；蛘撸芍亟M表達(dá)病毒抗原。病毒抗原 優(yōu)選包含在其生命周期至少某階段暴露在病毒表面的表位。病毒抗原優(yōu)選在多種血清型或 分離物中為保守的抗原。病毒抗原包括衍生自以下一種或多種病毒及以下鑒定的特異性抗 原例子的抗原。
正粘病毒(Orthomyxovirus)病毒抗原可衍生自正粘病毒，例如甲型、乙型和丙 型流感(病毒)。正粘病毒抗原可選自一種或多種病毒蛋白質(zhì)，包括血凝素(HA)、神經(jīng)氨 酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質(zhì)蛋白(Ml)、膜蛋白(M2)；一種或多種轉(zhuǎn)錄酶組分(PB1、PB2和 PA)。優(yōu)選的抗原包括HA和NA。流感病毒抗原可以可衍生自流行病爆發(fā)間的(年度)流感毒株?；蛘?，流感病毒 抗原可以衍生自可能導(dǎo)致流行病爆發(fā)的毒株(即，與目前的流行毒株相比，具有新血凝素 的流感毒株，或者在禽類對象中致病并可能平行轉(zhuǎn)移至人群的流感毒株，或?qū)θ酥虏〉牧?感毒株)。副粘病毒科病毒病毒抗原可以衍生自副粘病毒科病毒，如肺病毒屬(RSV)、副粘 病毒屬(PIV)和麻疹病毒屬(麻疹)。肺病毒屬病毒抗原可以衍生自肺病毒屬，如呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合 胞病毒、小鼠肺炎病毒和火雞鼻氣管炎病毒產(chǎn)生的病毒抗原。優(yōu)選的肺病毒是RSV。肺病毒 抗原可選自以下一種或多種蛋白，包括表面融合蛋白(F)、糖蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)、 基質(zhì)蛋白Ml和M2、核衣殼蛋白N、P和L及非結(jié)構(gòu)蛋白NSl和NS2。優(yōu)選的肺病毒抗原包括 F、G*M。參見J Gen Virol. 2004年11月；85 (部分11) :3229。肺病毒屬抗原還可配制 成或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒可同時(shí)包含RSV和PIV的組分。副粘病毒屬病毒抗原可衍生自副粘病毒屬，如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎 病毒、仙臺病毒、猿猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副粘病毒優(yōu)選PIV或腮腺炎病 毒。副粘病毒抗原可以選自以下一種或多種蛋白血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)、融合蛋白Fl 和F2、核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)和基質(zhì)蛋白(M)。優(yōu)選的副粘病毒屬蛋白包括 HN、F1和F2。副粘病毒屬抗原還可配制成或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒 可同時(shí)包含RSV和PIV的組分?？缮唐坊彽玫娜傺撞《疽呙绨▎蝺r(jià)形式或與麻疹和 風(fēng)疹疫苗聯(lián)用(MMR)的減毒活腮腺炎病毒。麻疹病毒屬病毒抗原可以衍生自麻疹病毒屬如麻疹病毒。麻疹病毒屬抗原可選 自以下一種或多種蛋白血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、 聚合酶磷蛋白(P)和基質(zhì)(M)。可商品化購得的麻疹病毒疫苗包括通常與腮腺炎和風(fēng)疹病 毒組成聯(lián)合減毒活疫苗(MMR)。微小RNA病毒病毒抗原可衍生自微小RNA病毒，如腸病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒 (Heparnavirus)、心病毒和口蹄疫病毒。優(yōu)選衍生自腸病毒，如脊髓灰質(zhì)炎病毒的抗原。腸道病毒病毒抗原衍生自腸病毒，如1、2或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒、1-22型和24型 柯薩奇A病毒、B1-6型柯薩奇病毒、1-9型、11-27型和29-34型艾柯病毒(ECHO)，及68-71 型腸病毒。優(yōu)選的腸病毒是脊髓灰質(zhì)炎病毒。腸病毒抗原宜選自以下VPl、VP2、VP3和VP4衣 殼蛋白的一種或多種。可商品化購得的脊髓灰質(zhì)炎疫苗包括滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗(IPV) 和口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(OPV)。嗜肝RNA病毒病毒抗原可衍生自可以是嗜肝RNA病毒，如甲肝病毒(HAV)?？缮?品化購得的HAV疫苗包括滅活的HAV疫苗。披膜病毒病毒抗原可衍生自披膜病毒，如風(fēng)疹病毒、α病毒或動(dòng)脈炎病毒。優(yōu)選 衍生自風(fēng)疹病毒屬，如風(fēng)疹病毒的抗原。披膜病毒抗原可選自El、E2、E3、C、NSP-l、NAP0-2、 NSP-3或NSP-4。優(yōu)選的披膜病毒抗原是E1、E2或E3。可商品化購得的風(fēng)疹病毒疫苗包括通常與腮腺炎和麻疹疫苗聯(lián)用的冷適應(yīng)的活病毒(MMR)。黃病毒屬病毒抗原可衍生自黃病毒屬，如蜱傳腦炎(病毒)(TBE)、登革熱(病 毒)(1、2、3或4型)、黃熱病(病毒)、日本腦炎(病毒)、西尼洛河腦炎(病毒)、圣露易斯 腦炎(病毒)、俄羅斯春夏型腦炎(病毒)、波瓦桑腦炎病毒。黃病毒屬抗原可選自PrM、M、 C、E、NS-l、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 和 NS5。優(yōu)選的黃病毒屬抗原是 PrM、M 和 E。可商 品化購得的TBE疫苗包括病毒滅活疫苗。鼠疫病毒病毒抗原可衍生自鼠疫病毒，如牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、經(jīng)典豬瘟 病毒(CSFV)或邊界病病毒(BDV)。嗜肝DNA病毒病毒抗原可衍生自嗜肝DNA病毒，如乙肝病毒。嗜肝DNA病毒抗原 選自表面抗原(L、M和S)、核心抗原(HBc、HBe)。可商品化購得的HBV疫苗包括含表面抗 原S蛋白的亞單位疫苗。丙型肝炎病毒病毒抗原可衍生自丙肝病毒(HCV)。HCV抗原可選自El、E2、El/ E2、NS345糖蛋白、NS345-核心多蛋白和/或非結(jié)構(gòu)區(qū)肽中的一種或多種(Houghton等.， Hepatology(1991)14 381)。桿狀病毒病毒抗原可衍生自桿狀病毒，如如萊薩病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒 (VSV)。桿狀病毒抗原可選自糖蛋白(G)、核蛋白(NP)、大蛋白(L)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)?？?商品化購得的狂犬病毒疫苗包含在人二倍體細(xì)胞或恒河猴胎肺細(xì)胞上培養(yǎng)的殺傷病毒。杯狀病毒科病毒抗原可衍生自杯狀病毒科，如諾瓦克病毒，和諾瓦克樣病毒如夏 威夷病毒和雪山病毒。冠狀病毒病毒抗原可衍生自冠狀病毒，SARS、人呼吸道冠狀病毒、禽傳染性支氣 管炎病毒(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)。冠狀病毒抗原可選 自突刺(S)、包膜(E)、基質(zhì)(M)、核衣殼(N)和血凝素-脂酶糖蛋白(HE)。冠狀病毒抗原 優(yōu)選衍生自SARS病毒。SARS病毒抗原參見WO 04/92360中的描述。逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒抗原可衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒，如腫瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。腫 瘤病毒抗原可衍生自HTLV-I、HTLV-2和HTLV-5。慢病毒抗原可衍生自HIV-I或HIV-2。逆 轉(zhuǎn)錄病毒抗原選自gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef > vif > vpu 禾口 vpr。HIV 抗原選 自:gag(p24gag 禾口 p55gag)、env (gpl60 禾口 gp41)、pol、tat、nef、rev、vpu、微小蛋白(優(yōu)選 p55gag 和 gpl40v 缺失)。HIV 抗原可衍生自以下病毒株HIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、HIVLAI、 HIVMN、HIV-1CM235、HIV-1U54。呼腸孤病毒病毒抗原可衍生自呼腸孤病毒，如正呼腸孤病毒、輪狀病毒、環(huán)狀病 毒或科羅拉多蜱傳熱病毒(Coltivirus)。呼腸孤病毒抗原可選自結(jié)構(gòu)蛋白λ 1、λ 2、λ 3、 μ 1、μ 2、σ 1、ο 2或σ 3或非結(jié)構(gòu)蛋白σ NS、μ NS或σ Is。優(yōu)選的呼腸孤病毒抗原可衍生 自輪狀病毒。輪狀病毒抗原選自^卩1、￥ 2、￥ 3、￥ 4(或切割產(chǎn)物￥ 5和￥ 8)、賂？1、￥卩6、 NSP3、NSP2、VP7、NSP4或NSP5。優(yōu)選的輪狀病毒抗原包括VP4(或切割產(chǎn)物VP5和VP8)及 VP7。細(xì)小病毒病毒抗原可衍生自細(xì)小病毒，如細(xì)小病毒B19。細(xì)小病毒抗原選自 VP-1、VP-2、NS-1和NS-2。優(yōu)選的細(xì)小病毒抗原是衣殼蛋白VP-2。δ-肝炎病毒(HDV)病毒抗原可以是衍生的HDV，特別是HDV的δ -抗原(參見 例如美國專利號5，378,814)。
戊肝病毒(HEV)病毒抗原可衍生自HEV。庚肝病毒(HGV)病毒抗原可衍生自HGV。人皰疹病毒病毒抗原可衍生自人皰疹病毒，如單純皰疹病毒(HSV)、水痘-帶 狀皰疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、人皰疹病毒6 (HHV6)、人皰疹病毒 7(HHV7)和人皰疹病毒8(HHV8)。人皰疹病毒抗原可選自立即早期蛋白(α)、早期蛋白 (β )和晚期蛋白(Y )。HSV抗原可衍生自HSV-I或HSV-2毒株。HSV抗原選自糖蛋白gb、 gC、gD和gH、融合蛋白(gB)或免疫逃避蛋白(gC、gE或gl)。VZV抗原可選自核心、核衣殼、 外被膜或包膜蛋白?？缮唐坊彽肰ZV減毒活疫苗。EBV抗原可選自早期抗原(EA)蛋白、 病毒衣殼抗原(VCA)和膜抗原(MA)的糖蛋白。CMA抗原可選自衣殼蛋白、包膜糖蛋白(如 gB和gH)和外被膜蛋白。乳多空病毒抗原可衍生自乳多空病毒，如乳頭瘤病毒和多瘤病毒。乳頭瘤病毒包 括 HPV 血清型 1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63 和 65。HPV 抗原優(yōu)選衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原選自衣殼蛋白(Li)和(L2)或E1-E7或 其融合蛋白。優(yōu)選將HPV抗原配制成病毒樣顆粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。 多瘤病毒抗原選自VP1、VP2或VP3?！兑呙纭?Vaccines)，第四版，(Plotkin和Orenstein編，2004)；《醫(yī)學(xué)微生物》 (Medical Microbiology)，第四版，(Murray 等編，2002)；《病毒學(xué)》(Virology)，第三版， (W. K. Joklik 編，1988)；《基礎(chǔ)病毒學(xué)》(FundamentalVirology)，第二版，(B. N. Fields 和 D. M. Knipe編，1991)也描述其它抗原、組合物、方法和微生物，本發(fā)明的組合物涵蓋了這些 抗原。C.真菌抗原可用于本發(fā)明的真菌抗原是以下一種或多種真菌產(chǎn)生的抗原。真菌抗原可衍生自皮膚真菌，包括絮狀表皮癬菌(Epidermophytonf loccusum)、 頭癬小孢子菌(Microsporum audouini)、犬小孢子菌、扭曲小孢子菌(Microsporum distortum)、馬小孢子菌(Microsporum equinum)、石膏樣小孢子菌、矮小孢子菌 (Microsporum nanum)、同心發(fā)癬菌(Trichophytonconcentricum)、馬發(fā)癬菌、雞發(fā)癬 lif (Trichophyton gal 1 inae)、石膏樣發(fā);Jlf 菌(Trichophyton gypseum)、麥格發(fā);Jlf 菌 (Trichophyton megnini)、須發(fā)癬菌、昆克努發(fā)癬菌(Trichophyton quinckeanum)、紅色 "R'MM (Trichophyton rubrum)(Trichophyton schoenleini) > Ht^^S' (Trichophyton tonsurans)、撫狀發(fā)癬菌(Trichophyton verrucosum)、撫狀發(fā)癬菌 album $禾中(var. album)、discoides$禾中(var. discoides)、ochraceum$禾中(var. ochraceum)、jj 色發(fā)癬菌(Trichophyton violaceum)禾口 / 或蜜塊狀發(fā)癬菌(Trichophyton faviforme)。。真菌病原體可衍生自煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)> 黑曲霉(Aspergillus niger)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、 土 曲 霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi) > 黃麥i 菌(Aspergillus flavatus)(Aspergillus glaucus) >(Blastoschizomyces capitatus)、白色念珠菌(Candida albicans)、烯醇酶假絲酵母(Candida enolase)、熱帶 念珠菌(Candida tropicalis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克魯斯念珠菌(Candida krusei)(Candidaparapsilosis) ^MJ^^-^fM (Candida stellatoidea)、克魯斯念珠菌、(Cmdidaparakwsei)、葡萄牙念珠菌(Candida lusiteniae)、假熱帶念 (Candidapseudotropicalis)、^ M M^M M (Candida guilliermondi)、^■里· 分支抱子菌(Cladosporium carrionii)、粗球抱子菌(Coccidioides immitis)、皮炎 芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉 (Geotrichum clavatum)、夾膜組織胞楽菌(Histoplasma capsulatum)、月市炎克雷伯桿 菌(Klebsiella pneumoniae)、巴西芽生菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、卡氏月市囊 蟲(Pneumocystis carinii)、腐霉菌(Pythiumninsidiosum)、瓶形酵母(Pityrosporum ovale)、酉良酒酵母(Sacharomycescerevisae)、布拉第酵母菌(Saccharomyces boulardii)、 粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、尖端賽多孢子菌(Scedosporium apiosperum)、申 克(氏)孢子絲菌(Sporothrix schenckii)、白色毛孢子菌(Trichosporon beigelii)、 鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、馬尼弗(氏)青霉菌(Penicillium marneffei)、鱗斑霉 屬(Malassezia spp·)、產(chǎn)色芽生菌屬(Fonsecaea spp·)、萬吉拉菌屬(Wangiella spp.)、 抱子絲菌屬(Sporothrix spp·)、擔(dān)子菌團(tuán)屬(Basidiobolusspp·)、耳霉屬(Conidiobolus spp·)、根霉菌屬(Rhizopus spp)、毛霉屬(Mucorspp)、犁頭霉屬(Absidia spp)、被孢霉屬 (Mortierella spp)、小克銀漢霉屬(Cunninghamella spp)、瓶霉屬(Saksenaea spp)、鏈格 抱屬(Alternaria spp)、彎抱霉屬(Curvularia spp)、長螺抱屬(Helminthosporium spp)、 德抱菌屬(Fusarium spp)、曲霉菌屬(Aspergillus spp)、青霉菌屬(Penicillium spp)、褐 腐病菌屬(Monolinia spp)、絲核菌屬(Rhizoctonia spp)、擬青霉屬(Paecilomyces spp)、 皮司霉屬(Pithomyces spp)禾口分支抱子菌屬(Cladosporium spp)。制備真菌抗原的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見美國專利號6，333，164)。在一優(yōu)選 方法中，提取溶解組分，將其與真菌細(xì)胞的不可溶組分分開，其中基本上除去或至少部分除 去了細(xì)胞壁，該方法的特征在于包括獲得活的真菌細(xì)胞；獲得基本上除去或至少部分除去 細(xì)胞壁的真菌細(xì)胞；使基本上除去或至少部分除去細(xì)胞壁的真菌細(xì)胞破裂；獲得不可溶組 分；和提取溶解的組分并將其與不可溶組分分開。D. STD 抗原本發(fā)明的組合物可包含衍生自性傳播疾病(STD)的一種或多種抗原。這種抗原可 供預(yù)防或治療STD，如衣原體、生殖器皰疹、肝炎(如丙肝)、生殖器疣、淋病、梅毒和/或軟 下疳(參見WO 00/152550)?？乖梢匝苌砸环N或多種病毒或細(xì)菌STD。用于于本發(fā)明 的病毒STD抗原可衍生自，例如，HIV、單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)、人乳頭瘤病毒(HPV) 和肝炎(HCV)病毒。用于于本發(fā)明的細(xì)菌STD抗原可衍生自，例如，淋病奈瑟球菌、肺炎衣 原體(Chlamydia pneumoniae)、砂沙眼衣原體、蒼白密螺旋體、杜克雷嗜血桿菌、大腸桿菌 和無乳鏈球菌。上文描述了這些病原體產(chǎn)生的特定抗原的例子。E.呼吸道抗原本發(fā)明的組合物可包含一種或多種衍生自引起呼吸道疾病的病原體的抗原。例 如，呼吸道抗原可衍生自呼吸道病毒，如正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)、 麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(風(fēng)疹)、VZV和冠狀病毒(SARS)。呼吸道抗原可衍生自引起 呼吸道疾病的細(xì)菌，如肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌、百日咳博德特菌、結(jié)核分支桿菌、肺炎支 原體、肺炎衣原體、炭疽桿菌和粘膜炎莫拉菌。上文描述了這些病原體產(chǎn)生的特定抗原的例 子。
F.兒科疫苗抗原本發(fā)明的組合物可包含適合用于兒科對象的一種或多種抗原。兒科對象一般年齡 小于約3歲，或小于約2歲，或小于約1歲。兒科抗原可在6個(gè)月、1年、2年或3年的時(shí)間 中多次給予。兒科抗原可衍生自靶向兒科群體的病毒和/或兒科群體易受感染的病毒。兒 科病毒抗原包括衍生自以下一種或多種病毒的抗原正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘 病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(風(fēng)疹)、腸病毒(脊髓灰質(zhì)炎)、HBV、 冠狀病毒(SARS)和水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)。兒科細(xì)菌抗原衍生自以下 一種或多種細(xì)菌的抗原肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟球菌、釀膿鏈球菌(A群鏈球菌)、粘膜炎 莫拉菌、百日咳博德特菌、金黃色葡萄球菌、破傷風(fēng)梭菌(破傷風(fēng))、白喉棒狀桿菌(白喉)、 流感嗜血桿菌B (Hib)、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌(B群鏈球菌)和大腸桿菌。上文描述了 這些病原體產(chǎn)生的特定抗原的例子。G.適合用于老年人和免疫力低下個(gè)體的抗原本發(fā)明的組合物可包含適合用于老年人和免疫力低下個(gè)體的一種或多種抗原。所 述個(gè)體可能需要更經(jīng)常接種疫苗，用較高劑量或含佐劑的制劑以增強(qiáng)對靶抗原的免疫反 應(yīng)。用于老年人和免疫力低下個(gè)體的抗原包括衍生自以下一種或多種病原體的抗原腦膜 炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌(A群鏈球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黃 色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、破傷風(fēng)梭菌(破傷風(fēng))、白喉棒狀桿菌(白喉)、流感嗜血桿菌 B(Hib)、銅綠假單胞菌、嗜肺軍團(tuán)病桿菌、無乳鏈球菌(B群鏈球菌)、糞腸球菌、幽門螺桿 菌、肺炎衣原體、正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻 疹)、披膜病毒(風(fēng)疹)、腸病毒(脊髓灰質(zhì)炎)、HBV、冠狀病毒(SARS)、水痘-帶狀皰疹病 毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)。上文描述了這些病原體產(chǎn)生的特定抗原的例 子。H.適合用于青少年疫苗的抗原本發(fā)明的組合物可包含合用于青少年對象的一種或多種抗原。青少年可能需要以 前給予的兒科抗原的加強(qiáng)免疫。上文描述了適合用于青少年的兒科抗原。此外，青少年可 能需要接受衍生自STD病原體的抗原以在開始性活動(dòng)前確保具有保護(hù)性或治療性免疫力。 上文描述了適合用于青少年的STD抗原。I.抗原制劑本發(fā)明的其它方面，提供了吸附抗原微粒的生產(chǎn)方法。該方法包括(a)將含有 以下成分的混合物分散來提供乳液(i)水，(ii)洗滌劑，(iii)有機(jī)溶劑和(iv)生物可 降解的聚合物，所述聚合物選自聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚己酸內(nèi)酯、聚原酸酯、聚 酐和聚氰基丙烯酸酯。與有機(jī)溶劑相比，混合物中存在的所述聚合物濃度通常約-約 30%，而根據(jù)洗滌劑-聚合物的重量比，混合物中存在的洗滌劑通常約為0.00001 1-約 0.1 1(更常見是約 0. 0001 1-約 0. 1 1，約 0.001 1-約 0. 1 1，或約 0.005 1-約 0. 1 1) ； (b)除去乳液中的有機(jī)溶劑；和(C)將抗原吸附到微粒表面。在一些實(shí)施方式中， 與有機(jī)溶劑相比，所述生物可降解聚合物的存在濃度是約3% -約10%。可以用可滅菌、無毒和生物可降解的材料制備本文所用的微粒。這些材料包括但 不限于聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚己酸內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐、PACA和聚氰基丙烯酸酯。 本發(fā)明所用的微粒優(yōu)選源自聚(α-羥酸)，特別是聚(丙交酯)(“PLA”)或D，L丙交酯和乙交酯或乙醇酸的共聚物，例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”或“PLGA”)或D， L-丙交酯和己內(nèi)酯的共聚物。微?？稍醋苑肿恿坎煌娜魏尉酆掀鹗疾牧?，以共聚物，例 如PLG為例，各種丙交酯乙交酯的比例(其選擇在很大程度上是個(gè)選擇問題)部分取決 于共同給予的大分子。下文將更詳細(xì)地討論這些參數(shù)。其它抗原還包括外膜囊泡(OMV)制品。其它配制方法和抗原(特別是腫瘤抗原)參見美國專利序列號09/581，772。J.抗原參考文獻(xiàn)以下參考文獻(xiàn)包含可與本發(fā)明組合物聯(lián)合使用的抗原1國際專利申請W099/245782國際專利申請W099/36544.3國際專利申請W099/57280.4國際專利申請W000/22430.5Tettelin 等(2000) Science 287:1809-1815.6國際專利申請W096/29412.7Pizza 等(2000) Science 287:1816-1820.8PCT WO 01/52885.9Bjune 等(1991) Lancet 338(8775).IOFuskasawa 等(1999) Vaccine 17:2951-2958.IlRosenqist 等(1998)Dev. Biol. Strand 92 :323_333·12Constantino 等(1992) Vaccine 10:691-698.13Constantino 等(1999) Vaccine 17:1251-1263.14ffatson(2000)Pediatr Infect Dis J 19:331-332.15Rubin(20000)Pediatr Clin North Am 47 :269_285，v.16Jedrzejas(2001)Microbiol Mol Biol Rev 65:187—207.172001年7月3日遞交的國際專利申請，要求GB-0016363. 4 ；W002/02606 ； PCTIB/01/00166 的優(yōu)先權(quán)18Kalman 等(1999)Nature Genetics 21 :385_389·19Read 等(2000)Nucleic Acids Res 28 :1397-406.20Shirai 等(2000) J. Infect. Dis 181(增刊 3) :S524_S527.21 國際專利申請 W099/27105.22 國際專利申請 W000/27994.23 國際專利申請 W000/37494.24 國際專利申請 W099/28475.25Bell (2000)Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.26Iwarson (1995) APMIS 103:321-326.27Gerlich 等(1990) Vaccine 8 增刊:S63_68&79-80.28Hsu 等(1999)Clin Liver Dis 3:901-915.29Gastofsson 等(1996) N. Engl. J. Med. 334- :349_355.30Rappuoli 等(1991)TIBTECH 9 :232_238.
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Microbiol. 47 :663_567.52 歐洲專利 0477508.53 美國專利號 5，306，492.54 國際專利申請 W098/42721.55Con jugate Vaccines (偶聯(lián)物疫苗)(Cruse 等編)ISBN 3805549326，特卷 10 48-114.56Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques (生物偶聯(lián)技術(shù))ISBN 012323368 和 012342335X.57歐洲專利申請0372501.58歐洲專利申請0378881.59歐洲專利申請0427347.60 國際專利申請 W093/17712.61 國際專利申請 W098/58668.62歐洲專利申請0471177.63 國際專利申請 W000/56360.64 國際專利申請 W000/67161.以上引用的所有專利、專利申請和雜志論文的內(nèi)容通過引用全文納入本文。當(dāng)采用糖或碳水化合物抗原時(shí)，優(yōu)選將其與載體蛋白偶聯(lián)以增強(qiáng)免疫原性。 參見Ramsay 等(2001)Lancet 357(9251) 195-196 ；Lindberg(1999)Vaccine 17 增干Ij 2 :S28-36 ；Buttery 禾口 Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond34 163-168 ；Ahmad 和 Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Aml3 113-133, vii ；Goldblatt(1998) J. Med. Microbiol. 47 :563_567 ；歐洲專利 0477508 ；美國專利 5，306，492 ；W098/42721 ； Conjugate Vaccines (偶聯(lián)物疫苗)(Cruse 等編)ISBN 3805549326，具體是 10 :48_114 ； Hermanson(1996)Bioconjugate Techniques(生物偶聯(lián)技術(shù))ISBN 0123423368 或 012342335X。優(yōu)選的載體蛋白是細(xì)菌毒素或類毒素，如白喉或破傷風(fēng)類毒素。特別優(yōu)選 CRM197白喉類毒素。其它載體多肽包括腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白(EP-A-0372501)、合成肽 (EP-A-0378881 和 EP-A 0427347)、熱激蛋白(W0 93/17712 和 W094/03208)、百日咳蛋 白(W0 98/58668和EP A 0471177)、流感嗜血桿菌蛋白D(W0 00/56360)、細(xì)胞因子(W0 91/01146)、淋巴因子、激素、生長因子、艱難梭菌毒素A或B(W0 00/61761)、鐵攝取蛋白(W0 01/72337)等等。當(dāng)混合物包含血清群A和C的莢膜糖時(shí)，優(yōu)選MenA糖MenC糖的比例 (w/w)大于1(如2 1、3 1、4 1、5 UlO 1或更高)。可將不同糖與相同或不同 類型的載體蛋白偶聯(lián)。需要時(shí)可采用任何適合的偶聯(lián)反應(yīng)，和任何適合的接頭。如需要可脫毒有毒性的蛋白抗原，如用化學(xué)和/或遺傳方法脫毒百日咳毒素。藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體本發(fā)明的組合物除了上述組分外，通常包含一種或多種“藥學(xué)上可接受的運(yùn)載 體”。包含的這些運(yùn)載體本身不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受此組合物個(gè)體有害的抗體，合適的運(yùn)載體 通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共 聚物和脂質(zhì)聚集物(如油滴或脂質(zhì)體)。這類運(yùn)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。所述組合 物也可包含稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。此外，可存在輔助劑，如濕潤或乳化劑、PH緩沖劑 等?？蓮?Gennaro (2000) “Remington :The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓 藥物科學(xué)與實(shí)踐)”第20版ISBN =0683306472 一書中獲得關(guān)于藥學(xué)上可接受組分的全面論 述。免疫調(diào)節(jié)劑佐劑本發(fā)明的疫苗可與其它免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合給予。具體說，該組合物通常包含佐劑。本 發(fā)明可用的佐劑包括但不限于以下的一種或多種A.含礦物質(zhì)的組分適合用作本發(fā)明佐劑的含礦物質(zhì)組分包括礦物鹽，如鋁鹽和鈣鹽。本發(fā)明包括礦 物鹽，如氫氧化物(如羥基氧化物)、磷酸鹽(如羥基磷酸鹽，正磷酸鹽)、硫酸鹽等(例 如參見Powell和Newman主編的“疫苗設(shè)計(jì)(VaccineDesign. ·.) ”，第8禾口 9章，ISBN 030644867X普萊納姆出版社(Plenum.))或不同礦物質(zhì)化合物的混合物(如磷酸鹽與氫 氧化物佐劑的混合物，任選磷酸鹽過量)，這些化合物可采取任何合適的形式(如凝膠、晶 體、無定形等)，這些鹽優(yōu)選(具有)吸附性。也可將含礦物質(zhì)的組合物配制成金屬鹽顆粒 (W000/23105)。本發(fā)明疫苗中可包含鋁鹽，Al3+的劑量在0. 2-1. Omg/劑之間。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明所用的鋁鹽佐劑是明礬(硫酸鉀鋁AlK(SO4)2),或者，例 如通過在磷酸緩沖液中混合抗原與鋁鹽，再用堿如氫氧化銨或氫氧化鈉滴定和沉淀原位形成的明礬衍生物本發(fā)明疫苗制劑可用的另一種鋁佐劑是氫氧化鋁(Al (OH)3)或結(jié)晶堿式氫氧化鋁 (A100H)，這是一種極佳吸附劑，表面積約500m2/g?；蛘?，可用含有磷酸基團(tuán)替代了氫氧化 鋁佐劑中的一些或全部羥基的磷酸鋁佐劑(AlPO4)或羥基磷酸鋁。本文提供的優(yōu)選磷酸鋁 佐劑是無定形的并可溶于酸性、堿性和中性介質(zhì)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的佐劑包含磷酸鋁和氫氧化鋁。在一更具體的實(shí)施方 式中，此佐劑的磷酸鋁含量高于氫氧化鋁，例如以重量計(jì)，磷酸鋁與氫氧化鋁之比為2 1、 3 ；1,4 1,5 ；1,6 1、7 1、8 1、9 1或高于9 1。更具體說，該疫苗所含的鋁鹽 為每疫苗劑量0. 4-1. Omg、或每疫苗劑量0. 4-0. 8mg、或每疫苗劑量0. 5-0. 7mg或每疫苗劑 量約0. 6mg?！阃ㄟ^優(yōu)化分子間的靜電吸引使抗原在所需pH時(shí)攜帶與佐劑相反的電荷，從 而能選擇優(yōu)選的鋁佐劑或多種鋁佐劑，例如磷酸鋁與氫氧化鋁之比。例如，PH 7. 4時(shí)磷酸 鋁佐劑(iep = 4)吸附溶菌酶，但不吸附白蛋白。如果白蛋白是靶標(biāo)，則應(yīng)選擇氫氧化鋁佐 劑(iep 11. 4)?；蛘?，用磷酸預(yù)處理氫氧化鋁可降低其等電點(diǎn)，使其成為堿性更高的抗原的 優(yōu)選佐劑。B.油-乳劑適合用作本發(fā)明佐劑的油-乳劑包括角鯊烯-水乳劑，如MF59 (5%角鯊烯、0. 5% 吐溫 80和0. 5%司盤85，用微流化器制成亞微米顆粒)。參見W090/14837。也參見Podda， Vaccine (2001) 19 2673-2680 ；Frey 等，Vaccine (2003) 21 :4234_4237。MF59 已用作 FLUAD 流感病毒三價(jià)亞單位疫苗中的佐劑。本發(fā)明組合物中所用的特別優(yōu)選佐劑是亞微米水包油乳劑。本文所用的優(yōu)選亞 微米水包油乳劑是任選含有不同含量的MTP-PE的角鯊烯/水乳劑，例如含4-5% w/v角 鯊烯、0. 25-1. 0 % w/v吐溫80 (聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)和/或0. 25-1. 0%司 盤85 (失水山梨醇三油酸酯)和任選的N-乙?；邗?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺 基-L-丙氨酸-2-(1 ‘ -2' - 二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE) 的亞微米水包油乳劑，例如稱為“MF59”的亞微米水包油乳劑(國際公布號W090/14837 ；美 國專利號6，299，884和6，451，325 ；和Ott等，"MF59-人用疫苗的一種安全而強(qiáng)效佐劑的 ^CTf^Wiii"(MF59__Design and Evaluation of a Safe and PotentAdjuvant for Human Vaccines)()，刊于《疫苗設(shè)計(jì)亞單位和佐劑方法》(Vaccine Design =The Subunit and Adjuvant Approach) (Powell, Μ. F.禾口 Newman，Μ· J.編)，普萊納姆出版社(Plenum Press), 紐約，1995，第 277-296 頁)。MF59 含有 4-5% w/v 角鯊烯(如 4. 3% )、0· 25-0. 5% w/v 吐 溫80 和0. 5%司盤85 ，并任選含有各種含量的MTP-PE，用微流化儀，例如110Y型微流化 儀(微射流公司(Microfluidics)，牛頓市，馬薩諸塞州)配制成亞微米顆粒。例如，MTP-PE 的含量可以是約0-500 μ g/劑，更優(yōu)選0-250 μ g/劑，最優(yōu)選0-100 μ g/劑。本文所用的術(shù) 語“MF59-0”指不含MTP-PE的以上亞微米水包油乳劑，而術(shù)語“MF59-MTP”表示含有MTP-PE 的制劑。例如，“MF59-100”含有IOOyg MTP-PE/劑，等等。MF69是本文所用的另一種亞微 米水包油乳劑，其含有4. 3% w/v角鯊烯、0. 25% w/v吐溫80 和0. 75% w/v司盤85 和任 選的MTP-PE。還有另一種亞微米水包油乳劑是MF75，也稱為SAF，其含有10%角鯊烯、0. 4% 吐溫80 、5%普朗尼克-嵌段聚合物L(fēng)121和thr-MDP，也微流化成亞微米乳劑。MF75-MTP表示含有MTP的MF75制劑，例如100-400 μ g MTP-PE/劑國際公布號W090/14837 ；美國專利號6，299，884和美國專利6，451，325詳細(xì)描述 了用于組合物中的亞微米水包油乳劑、其制備方法和免疫刺激劑，例如胞壁酰肽。弗氏完全(CFA)和不完全佐劑(IFA)也可用作本發(fā)明的佐劑。C.皂苷制劑皂苷制劑也適用作本發(fā)明佐劑。皂苷是在許多植物種類的樹皮、葉、莖、根、甚至 花中發(fā)現(xiàn)的固醇糖苷和三萜系糖苷的異質(zhì)混合物(heterologousgroup)。皂樹(Quillaia saponaria Molina)樹皮中分離的皂苷是廣泛研究的佐劑。皂苷也可商品化購自麗花菝葜 (Smilax ornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、錐花絲石竹(Gypsophilla paniculata) (婚紗花(brides veil))禾口月巴阜草(Saponariaofficianalis)(阜根(soap root))。阜昔 佐劑制劑包括純化的制劑，例如QS21，以及脂質(zhì)制劑，例如ISC0M。已利用高效薄層色譜(HP-LC)和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化皂苷組合物。 已經(jīng)鑒定了用這些技術(shù)專門純化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A, QH-B和QH-C。 皂苷優(yōu)選QS21。美國專利號5，057，540披露了 QS21的制備方法。皂苷制劑也可含有固醇， 例如膽固醇(參見W096/33739)?？陕?lián)用皂苷和膽固醇來形成稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的獨(dú)特顆粒。ISCOM — 般還含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM 優(yōu)選含有 QuilA、QHA 和 QHC 中的一種或多種。EP0109942、W096/11711 和 W096/33739 進(jìn)一 步描述了 ISC0M。ISCOM任選不含其它洗滌劑。參見W000/07621。開發(fā)皂苷佐劑的綜述可參見Barr等，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32 :247-271。 也可參見 Sjolander 等，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32 :321_338。D.病毒體和病毒樣顆粒(VLP)病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也適用作本發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常含有一種或 多種任選與磷脂混合或用磷脂配制的病毒蛋白質(zhì)。它們通常無致病性、不能復(fù)制，通常不 含有任何天然病毒基因組?？芍亟M產(chǎn)生或從完整病毒分離病毒蛋白。適用于病毒體或VLP 中的這些病毒蛋白包括源自以下的蛋白質(zhì)流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如 核心或衣殼蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德畢斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病 毒、諾瓦克病毒、人乳頭瘤病毒、HIV, RNA-噬菌體、Q^-噬菌體(例如外殼蛋白)、GA-噬 菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty (例如逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pi)。W003/024480、 W003/024481 ；Niikura 等，(2002)，ViroloRy293 273~280 ；Lenz 等，(2001)，J. Immunol 166 (9) 5246-5355 ；Pinto 等，(2003)，J. Infect. Dis.迴:327_338 ；和 Gerber 等，(2001)， J.Virol. 75(10) :4752_4760 進(jìn)一步討論了 VLP。例如，Gluck 等，(2002)，Vaccine 20 B10-B16 進(jìn)一步討論了病毒體。鼻內(nèi)三價(jià) INFLEXAL 產(chǎn)品(Mischler 和 Metcalfe，(2002) Vaccine 20，增刊5 :B17_B23)和INFLUVAC PLUS 產(chǎn)品中使用免疫增強(qiáng)型重建流感病毒體 (IRIV)作為亞單位抗原遞送系統(tǒng)。E.細(xì)菌和微生物衍生物適合用于本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌和微生物衍生物，如(1)腸細(xì)菌脂多糖(LPS)的無毒衍生物
這種衍生物包括單磷酰基脂質(zhì)A (MPL)和3-0-脫酰基MPL (3dMPL)。3dMPL是含有 4、5或6條?；湹?脫-0-?；瘑瘟柞；|(zhì)A的混合物。EP 0689454公開了 3脫-0-酰 化單磷酰基脂質(zhì)A的優(yōu)選“小顆?！毙问?。3dMPL的這種“小顆?！弊銐蛐亩山?jīng)0. 22 μ m 膜無菌過濾(參見EP 0 689454)。其它無毒的LPS衍生物包括單磷?；|(zhì)A模擬物，例 如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529。參見Johnson等，(1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9 :2273_2278。(2)脂質(zhì)A衍生物 脂質(zhì)A衍生物包括大腸桿菌(Escherichia coli)的脂質(zhì)A衍生物，例如0M-174。 0M-174 描述于，例如Meraldi 等(2003) Vaccine 21 :2485_2491 ；和 Pajak等(2003) Vaccine 21 :836-842。(3)免疫刺激寡核苷酸適合用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通過磷酸鍵 與隨后的鳥苷相連的未甲基化胞嘧啶的序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的 細(xì)菌雙鏈RNA或寡核苷酸也顯示具有免疫刺激性。CpG可含有核苷酸修飾/類似物，例如硫代磷酸酯修飾并且可以是雙鏈或單 鏈?？扇芜x用類似物，例如2'-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷?？赡艿念愃莆锶〈蓞?見 Kandimalla 等，(2003)，Nucleic Acids Research. 31(9) 2393-2400 ；W002/26757 禾口 W099/62923。 Krieg， (2003) , Nat. Med. 9 (7) 831-835 ；McCluskie 等，(2002)， FEMS Immunology and Medical Microbiology. 32 179-185 ；W098/40100 ；美國專利號 6，207，646 ；美國專利號6，239，116和美國專利號6，429，199進(jìn)一步討論了 CpG寡核苷酸作 為佐劑的作用。CpG 序列可涉及 TLR9，例如基序 GTCGTT 或 TTCGTT。參見 Kandimalla 等(2003) Biochemical Society Transactions. 31 (部分 3) :654_658。CpG 序列，例如 CpG-A ODN 可 特異性誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，或者，例如CpG-BODN可更特異地誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答。Blackwell等 (2003)J. Immunol. 170(8) :4061_4068 ；Krieg (2002)TRENDS in Immunol. 23(2) :64_65 ；禾口 WO 01/95935 討論了 CpG-A 和 CpG-B 0DN。CpG 優(yōu)選 CpG-A 0DN。優(yōu)選將CpG寡核苷酸構(gòu)建為5’端易于為受體識別。任選將兩條CpG寡核苷酸序 列在它們的3’端相連以形成“免疫聚體”(immunomer)。參見，例如Kandimalla等(2003) BBRC 306 948-953 ；Kandimalla ^ (2003)Biochemical Society Transactions. 31
3) 664-658 ；Bhagat 等(2003) BBRC 300 :853_861 ；和 W003/035836。(4) ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物細(xì)菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可用作本發(fā)明的佐劑。蛋白質(zhì)優(yōu)選源自 大腸桿菌(即，大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素“LT”)、霍亂(弧菌)(“CT”)或百日咳(桿菌) (“PT”)。W095/17211描述了脫毒ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑的應(yīng)用，W098/42375 描述了其作為胃腸外佐劑的應(yīng)用。佐劑優(yōu)選脫毒的LT突變體，例如LT-K63、LT-R72和 LTR192G。ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，特別是LT-K63和LT-R72作為佐劑的應(yīng)用 見以下參考文獻(xiàn)Beignon 等，Infection and Immunity (2002) 70 (6) 3012-3019 ；Pizza 等，Vaccine (2001) 19 :2534-2541 ;Pizza 等，Int. J. Med. Microbiol (2000) 290 (4-5) 455-461 ；Scharton-Kersten φ, Infection and Immunity(2000)68(9) 5306-5313 ；Ryan等，Infection and Immunity (1999) 67 (12) 6270-6280 ；Partidos 等，Immunol. Lett. (1999)67(3) 209-216 ；Peppoloni 等，Vaccines (2003) 2 (2) :285_293 和 Pine 等，(2002) J. Control Release (2002) 85 (1-3) :263_270。氨基酸取代的數(shù)字基準(zhǔn)優(yōu)選以 Domenighini 等，Mol. Microbiol (1995)15(6) :1165_1167所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亞基排列 對比為基礎(chǔ)。F.生物粘附劑和 粘膜粘附劑。生物粘合劑(bioadhesive)和粘膜粘合劑(mucoadhesive)也可用作本發(fā)明的 佐劑。合適的生物粘合劑包括酯化的透明質(zhì)酸微球(Singh等，(2001) J. Cont. Release. 70 267-276)，或者粘膜粘合劑，例如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維 素的交聯(lián)衍生物。殼多糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑。參見W099/27960。G.微粒微粒也可用作本發(fā)明的佐劑?？蓮纳锟山到夂蜔o毒的材料(例如，聚(α-羥 酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等)，優(yōu)選用聚(丙交酯-共-乙交酯)形成 微粒(即，直徑約IOOnm到150 μ m,優(yōu)選約200nm到約30 μ m,最優(yōu)選約500nm到約10 μ m 的顆粒)，任選將這些微粒處理成帶負(fù)電的表面(例如，用SDS)或帶正電的表面(例如，用 陽離子洗滌劑，如CTAB)。H.脂質(zhì)體適合用作本發(fā)明佐劑的脂質(zhì)體制劑例子描述于美國專利6，090，406;美國專利 5，916，588 和 EP O 626 169。I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑適用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯(參見，例如W099/52549)。 這種制劑還包括聯(lián)用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性劑(W001/21207)以及聯(lián) 用至少一種其它非離子表面活性劑，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑 (W001/21152)。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯_9_硬脂 ?；?steoryl)醚、聚氧乙烯_8_硬脂?；选⒕垩跻蚁4_月桂基醚、聚氧乙烯_35_月桂 基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。J.聚磷腈(PCPP)PCPP 制劑描述于，例如 Andrianov 等，"Preparation of hydrogelmicrospheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions ( ffl過 疑聚聚M月青水備 水凝膠微球)”，Biomaterials (1998) 19(1-3) :109_115 和 Payne 等，‘‘Protein Release from Polyphosphazene Matrices (胃 M 月青■ M 的胃白 M # 方文)”，Adv. Drug. Delivery Review (1998)31(3) :185_196。K.胞壁酰肽適合用作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙?；鵢胞壁酰-L-蘇氨酰 基-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰(normuramyl) -L-丙氨酰基-D-異 谷氨酰胺(去甲-MDP)和N-乙?；邗?L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺-L-丙氨 酸-2- (1 ’ -2' - 二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。L.咪唑并喹啉化合物
適合用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹啉化合物的例子包括咪喹莫特(Imiquimod)及 其類似物，其描述參見 Stanley，Clin Exp Dermatol (2002) 27 (7) 571-577 Jones, Curr Opin Investig Drugs (2003) 4 (2) :214_218和美國專利 4，689，338、5，389，640、5，268，376、 4，929，624,5，266，575,5，352，784,5，494，916,5，482，936,5，346，905,5，395，937, 5，238，944 和 5，525，612。M.縮氨基硫脲化合物 所有適合用作本發(fā)明佐劑的縮氨基硫脲化合物的例子以及配制、制備和篩選這種 化合物的方法包括WO 04/60308所述的。縮氨基硫脲在刺激人外周血單核的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞 因子，例如TNF-中特別有效。N.色胺酮化合物所有適合用作本發(fā)明佐劑的色胺酮化合物的例子以及配制、制備和篩選這種化合 物的方法包括WO 04/64759所述的。色胺酮化合物在刺激人外周血單核的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因 子，例如TNF-α中特別有效。本發(fā)明還包括以上鑒定和一種或多種佐劑的組合。例如，以下佐劑組合物可用于 本發(fā)明(1)皂苷和水包油乳劑(W0"/ll241)；(2)皂苷(例如QS21) +無毒的LPS衍生物(例如3dMPL)(參見W094/00153)；(3)皂苷(例如QS21) +無毒的LPS衍生物(例如3dMPL) +膽固醇；(4)皂苷(例如 QS21) +3dMPL+IL_12 (任選 + 固醇)(W098/57659)；(5)聯(lián)用3dMPL與例如QS21和/或水包油乳劑混合物(參見歐洲專利申請0 835 318 ；0 735 898 和 0 761 231)；(6)含有10%角鯊烯、0. 4%吐溫80、5%普朗尼克嵌段聚合物L(fēng)121和thr_MDP的 SAF，微流化成亞微米乳劑或旋振(vortex)產(chǎn)生粒度較大的乳劑；(7) RIBI 佐劑系統(tǒng)(RAS)，(Ribi 免疫化學(xué)公司(Ribi Immunochem))，其含有 2 % 角鯊烯、0. 2%吐溫80和一種或多種由單磷酸酰脂質(zhì)A(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和 細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS (Detox )組成的細(xì)菌細(xì)胞壁組分；和(8) 一種或多種礦物鹽(例如鋁鹽)+LPS的無毒衍生物(例如3dMPL)；(9) 一種或多種礦物鹽(例如鋁鹽)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的 寡核苷酸序列)。0.人免疫調(diào)節(jié)劑適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(如干擾素-Y )、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤 壞死因子。 可注射的流感疫苗采用的優(yōu)選佐劑是鋁鹽和MF59。粘膜遞送疫苗采用的優(yōu)選佐劑 是細(xì)菌毒素和生物粘附劑。以上引用的所有專利、專利申請和雜志論文的內(nèi)容通過引用全文納入本文。治療方法本發(fā)明提供的上述組合物可用于治療。本發(fā)明提供的上述組合物可誘導(dǎo)或增強(qiáng)對 釀膿鏈球菌的免疫反應(yīng)。本發(fā)明提供用上述組合物誘導(dǎo)或增強(qiáng)對釀膿鏈球菌的免疫反應(yīng)的方法。免疫反應(yīng)優(yōu)選為保護(hù)性，包括抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)免疫力(包括全身和粘膜免疫 力)。免疫反應(yīng)包括增強(qiáng)反應(yīng)。青少年和兒童，包括學(xué)步兒童和嬰兒可接受預(yù)防用疫苗，而治療疫苗通常給予青 少年和成人。兒童疫苗也可給予成人，例如評估其安全性、劑量、免疫原性等?？砂凑毡景l(fā)明預(yù)防或治療釀膿 鏈球菌引起的疾病，包括但不限于咽炎(如鏈球 菌扁桃體炎)、猩紅熱、小膿皰疹、丹毒、蜂窩組織炎、敗血癥、中毒性休克綜合征、壞死性筋 膜炎和后遺癥，如風(fēng)濕熱和急性腎小球腎炎。該組合物對其它鏈球菌，如GBS也有效。檢測免疫反應(yīng)效果的試驗(yàn)一種評估治療性治療效果的方法涉及給予本發(fā)明組合物后監(jiān)測GSA感染。一種評 估預(yù)防性治療效果的方法涉及在給予本發(fā)明組合物后監(jiān)測對該組合物中突變型GAS57抗 原的免疫反應(yīng)。另一種評估本發(fā)明免疫原性組合物中組分蛋白的免疫原性的方法是用重組的突 變型GAS57抗原作免疫印染篩檢病人血清或粘膜分泌物。該蛋白與患者血清之間發(fā)生陽性 反應(yīng)表明該患者已對所述蛋白產(chǎn)生了免疫反應(yīng)，即所述蛋白為免疫原。也可用此法鑒定免 疫優(yōu)勢蛋白和/或抗原表位。另一種核查治療性治療效果的方法涉及給予本發(fā)明組合物后監(jiān)測GSA感染。一種 核查預(yù)防性治療效果的方法涉及給予本發(fā)明組合物后全身性(如監(jiān)測IgGl和IgG2a的產(chǎn) 生水平)和粘膜性(如監(jiān)測IgA的產(chǎn)生水平)監(jiān)測抗GAS57的免疫反應(yīng)。通常檢測免疫后 但攻擊前的血清特異性抗體反應(yīng)，而粘膜特異性抗體反應(yīng)在免疫后和攻擊后檢測?？稍诮o予宿主，如人前用體外和體內(nèi)動(dòng)物模型評價(jià)本發(fā)明疫苗組合物。特別有用 的小鼠模型包括先腹膜內(nèi)免疫小鼠，然后腹膜內(nèi)攻擊或經(jīng)鼻攻擊的那些。本發(fā)明免疫原性組合物的效力也可用GAS體內(nèi)攻擊經(jīng)該免疫原性組合物免疫的 模型動(dòng)物，如豚鼠或小鼠來測定。免疫原性組合物可以衍生自或不衍生自與攻擊血清型相 同的血清型。體內(nèi)效力模型包括但不限于(i)采用人GAS血清型的小鼠感染模型；(ii)采用 粘膜適應(yīng)GAS菌株，如在小鼠中特別有毒性的M23菌株的小鼠患病模型；(iii)采用人GAS 分離株的靈長動(dòng)物模型。免疫應(yīng)答可以是Thl免疫反應(yīng)和Th2應(yīng)答之一或二者。免疫反應(yīng)可能是改善的或 增強(qiáng)的或改變的免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)可以是全身和粘膜免疫反應(yīng)之一或二者。優(yōu)選的免疫 反應(yīng)是增強(qiáng)的全身和/或粘膜反應(yīng)。增強(qiáng)的全身和/或粘膜反應(yīng)為增強(qiáng)的Thl和/或Th2免疫反應(yīng)。增強(qiáng)的反應(yīng)優(yōu)選 包括IgGl和/或IgG2a和/或IgA產(chǎn)生增多。粘膜免疫反應(yīng)優(yōu)選Th2免疫反應(yīng)，粘膜免疫反應(yīng)優(yōu)選包括IgA產(chǎn)生增多?；罨腡h2細(xì)胞增強(qiáng)抗體產(chǎn)生，因此有利于對胞外感染的反應(yīng)?；罨腡h2細(xì)胞 能分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一種或多種。Th2免疫反應(yīng)可導(dǎo)致產(chǎn)生IgGl、IgE, IgA和記憶B細(xì)胞以提供進(jìn)一步保護(hù)力。Th2免疫反應(yīng)包括與Th2免疫反應(yīng)相關(guān)的一種或多種細(xì)胞因子(如IL-4、IL_5、 IL-6和IL-10)的升高，或IgGl、IgE、IgA和記憶B細(xì)胞產(chǎn)生的增多。增強(qiáng)的Th2免疫反應(yīng) 優(yōu)選包括IgGl產(chǎn)生增加。
Thl免疫反應(yīng)包括CTL的增加，與Thl免疫反應(yīng)相關(guān)的一種或多種細(xì)胞因子(如 IL-2.IFNY和TNFi3)的升高、活化巨噬細(xì)胞增多、NK細(xì)胞活性增強(qiáng)，或IgG2a產(chǎn)生增加中 的一種或多種。增強(qiáng)的Thl免疫反應(yīng)優(yōu)選包括IgG2a產(chǎn)生增加。本發(fā)明的免疫原性組合物，具體說，含本發(fā)明一種或多種突變型GAS57抗原的免 疫原性組合物可單獨(dú)使用或與其它GAS抗原聯(lián)用，任選與能引發(fā)Thl和/或Th2反應(yīng)的免 疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)用。本發(fā)明還包括含有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑，如礦物鹽(如鋁鹽)和含CpG基序的 寡核苷酸的免疫原性組合物。最優(yōu)選，該免疫原性組合物同時(shí)包含鋁鹽和含CpG基序的寡 核苷酸?；蛘?，該免疫原性組合物包含ADP核糖基化毒素(如脫毒的ADP核糖基化毒素) 和含CpG基序的寡核苷酸。優(yōu)選的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑包括佐劑。佐劑可選用Thl佐劑 和Th2佐劑中的一種或多種。本發(fā)明的組合物優(yōu)選能引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)和體液免 疫反應(yīng)二者，以有效應(yīng)對 GAS感染。這種免疫應(yīng)答宜誘導(dǎo)產(chǎn)生長效(如中和性)抗體和在接觸一種或多種GAS抗原 后能快速應(yīng)答的細(xì)胞介導(dǎo)免疫力。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，該免疫原性組合物包含能引發(fā)中和抗體反應(yīng)的一種 或多種突變型GAS57抗原，和能引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的一種或多種突變型GAS57抗原。以 此方法，中和抗體能防止或抑制最初的GAS感染，而細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)能引發(fā)增強(qiáng)的Thl細(xì) 胞反應(yīng)以防止GAS感染進(jìn)一步擴(kuò)散。通常將本發(fā)明的組合物直接給予患者?？赏ㄟ^各種不同途徑單獨(dú)或作為組合物的 一部分給予本發(fā)明組合物。某些途徑對某些組合物可能更有利益，因?yàn)榭僧a(chǎn)生更有效的免 疫反應(yīng)，優(yōu)選CMI反應(yīng)，或較少可能誘導(dǎo)副作用，或較容易給藥。遞送方法包括胃腸外注射(如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或組織間隙注射)和 經(jīng)直腸、口服(如藥片、噴霧)、經(jīng)陰道、局部、經(jīng)皮(如參見WO 99/27961)、透皮(如參見 W002/074244和W002/064162)、鼻內(nèi)(如參見WO 03/028760)、眼部、耳部和肺部或其它粘膜
途徑給予。例如，本發(fā)明的組合物可通過全身途徑或粘膜途徑或經(jīng)皮途徑給予，或可直接給 予特定組織。本文所用的術(shù)語“全身給予”包括但不限于任何胃腸外途徑給藥。具體說，胃 腸道外給藥包括但不限于皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或胸骨內(nèi)注射，靜脈內(nèi)、動(dòng) 脈內(nèi)或腎透析灌注技術(shù)。優(yōu)選的全身性、胃腸外給藥是肌肉內(nèi)注射。本文所用的術(shù)語“粘膜 給予”包括但不限于口服、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、氣管內(nèi)、腸和眼部給藥。治療劑量可以是單劑量方案或多劑量方案。初次免疫方案和/或加強(qiáng)免疫方案可 采用多劑量。在多劑量方案中，通過相同或不同途徑給予不同劑量，例如胃腸外初免和粘膜 加強(qiáng)，粘膜初免和胃腸外加強(qiáng)，等等。可將本發(fā)明組合物制成各種劑型。例如，可將組合物制成可注射的液體溶液或懸 浮液。還可以制備適合在注射前用液體運(yùn)載體配制成溶液或懸浮液的固體劑型(如凍干的 組合物)?？芍苽淇诜o藥的組合物，如片劑或膠囊、噴霧劑，或糖漿(任選加入調(diào)味劑)。 可制備肺部給藥的組合物，如吸入劑，采用細(xì)粉或噴霧劑?？蓪⒔M合物制備成栓劑或陰道 栓?？芍苽浔遣俊⒍炕蜓鄄拷o藥的組合物，例如滴劑。組合物可以是試劑試劑盒形式，如 此設(shè)計(jì)使得在給予患者之前可重建成合并的組合物。這種試劑試劑盒裝有液體形式的一種或多種突變型GAS57和其它抗原及一種或多種凍干抗原。用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫有效量的突變型GAS57或其它抗原(或編碼 該抗原的核酸分子)，以及需要的其它組分，如抗生素?！懊庖哂行Я俊笔且詥蝿┝炕蛞幌盗?劑量的一部分給予個(gè)體時(shí)能增強(qiáng)可測定的免疫反應(yīng)或防止或減少臨床癥狀的用量。本發(fā)明的免疫原性組合物可與抗生素治療方案組合給予。在一實(shí)施方式中，給予 抗生素然后給予本發(fā)明的抗原，或包含本發(fā)明的一種或多種突變型GAS57抗原的組合物。在另一實(shí)施方式中，先給予本發(fā)明的突變型GAS57抗原然后給予抗生素。適合用 于治療GAS感染的抗生素包括但不限于青霉素或其衍生物，或克林霉素、先鋒霉素、糖肽 類(如萬古霉素)和環(huán)絲氨酸。然而，該組合物中活性藥物的含量可以不同，取決于所治療個(gè)體的健康和生理狀 況、年齡、所治療個(gè)體的物種分類(如非人靈長動(dòng)物，靈長動(dòng)物等)、個(gè)體的免疫系統(tǒng)合成抗 體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗制劑、治療醫(yī)師對醫(yī)學(xué)狀況的評估和其它相關(guān)的因素。此 用量落在可通過常規(guī)試驗(yàn)確定的較廣泛范圍內(nèi)。試齊[J本發(fā)明還提供裝有本發(fā)明組合物的一個(gè)或多個(gè)容器的試劑盒。組合物可以是液體 形式或凍干形式，可以是各個(gè)抗原。組合物的合適容器包括，例如瓶子，小藥瓶，針筒和試 管。可用各種材料，包括玻璃或塑料制備容器。容器可配備無菌的入口(例如，容器可以是 裝有皮下注射針頭可刺破塞子的靜脈內(nèi)輸液袋或小藥瓶)。該試劑盒也可裝有包含藥學(xué)上可接受的緩沖液，如磷酸緩沖鹽水、林格液或葡萄 糖液的第二容器。也可裝有終末用戶所用的其它物質(zhì)，包括其它緩沖液、稀釋液、過濾器、針 頭和針筒。該試劑盒還可裝有含另一活性藥物，如抗生素的第二或第三容器。該試劑盒也可裝有書面的包裝插頁，說明誘導(dǎo)抗釀膿鏈球菌免疫力或治療釀膿鏈 球菌感染的方法。該包裝說明書可以是未經(jīng)批準(zhǔn)的草稿插頁或可以是經(jīng)食品藥物管理局 (FDA)或其它管理當(dāng)局批準(zhǔn)的包裝插頁。本文引用的所有專利、專利申請和參考文獻(xiàn)專門通過引用納入本文。以上公開內(nèi) 容已總體上描述了本發(fā)明。參考以下具體實(shí)施例可獲得更全面的理解，提供實(shí)施例的目的 只是說明而非限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1.純化的野生型GAS57能切割I(lǐng)L_8和其它CXC細(xì)胞因子大腸桿菌表達(dá)并純化的野生型GAS57為有His-尾或無His-尾的蛋白質(zhì)。表達(dá)的 所有變體蛋白沒有N-末端前導(dǎo)序列，沒有C-末端跨膜區(qū)(參見SEQ ID N0:78和79)。詳 細(xì)說，用以下引物擴(kuò)增M1_SF370基因組中的gag57基因57F, GTGCGTCATATGGCAGATGAGCTAAGCA(SEQ ID NO 69)57R, GCGTCTCGAGGGCTTTTGCTGTTGCTGAGGT(SEQ ID NO 70)57 終止 R，GCGTCTCGAGTTAGGCTTTTGCTGTTGCTGAGGT (SEQID NO 71)采用引物57F和57R獲得了含His尾的形式，而用引物57F和57終止F獲得了無 尾的形式。用NdeI-XhoI消化PCR產(chǎn)物，再分別與用相同酶切斷的pET21b+和pet24b+連 接。用連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)電感受態(tài)細(xì)胞。用集落PCR鑒定攜帶正確插
32入物(pET21_57his和pET24_57)質(zhì)粒的卡那霉素抗性菌落，測定一個(gè)陽性克隆的GAS57基 因序列。25°C攪拌下用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)GAS57的陽性克隆菌，在培養(yǎng)物中加入ImM IPTG獲得重組蛋白的表達(dá)。用金屬離子親和層析(IMAC)純化含His尾GAS57蛋白。用三 步層析離子交換層析(Q瓊脂糖HP)、羥基磷灰石層析和凝膠過濾層析純化無尾GAS57蛋 白。圖7和8顯示純化的野生型蛋白的SDS-PAGE分析。為了檢測GAS57的蛋白酶水解活性，將IL-8與二種不同濃度的純化GAS57長時(shí)間 溫育后在SDS-聚丙烯凝膠上進(jìn)行電泳，顯示原先SkDa的IL-8蛋白轉(zhuǎn)變成被切斷的無活性 6kDa蛋白。結(jié)果見圖1。圖12顯示類似實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)中，37°C將各種趨化因子(10 μ g/ml)與或不與 GAS57(1 μ g/ml) 一起溫育24小時(shí)。樣品在18% SDS-聚丙烯酰胺上進(jìn)行電泳。實(shí)施例2.制備GAS57突變體 通過與C5a蛋白酶的比較(圖2)，在GAS57中鑒定有3個(gè)氨基酸可能構(gòu)成了該蛋白 酶的催化位點(diǎn)D151、H279和S617。為了獲得滅活形式的酶，用重疊延伸PCR法(SOE-PCR) 剪接在GAS57編碼序列中引入核苷酸取代導(dǎo)致D151A和/或S617A的氨基酸改變。D151A 取代進(jìn)行了三次PCR反應(yīng)
權(quán)利要求
一種純化的突變型GAS57抗原，其在選自氨基酸D151、H279或S617的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置包含氨基酸改變，其中所述氨基酸的位置按SEQ IDNO1編號，通過SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳或ELISA試驗(yàn)檢測，該純化的突變型GAS57抗原對白介素8(IL 8)的蛋白酶水解活性比野生型GAS57降低至少50％。
2.如權(quán)利要求1所述的純化的突變型GAS57抗原，其特征在于，該抗原包含選自D151A 或S617A的至少一個(gè)氨基酸取代。
3.如權(quán)利要求2所述的純化的突變型GAS57抗原，其特征在于，該抗原包含SEQID NO 2[D151A]、SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4。
4.如權(quán)利要求1所述的純化的突變型GAS57抗原，其特征在于，該抗原是含有第二種 GAS抗原的融合蛋白。
5.如權(quán)利要求1所述的純化的突變型GAS57抗原，其特征在于，該抗原偶聯(lián)于載體蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的純化的突變型GAS57抗原，其特征在于，所述載體蛋白選自細(xì) 菌毒素、細(xì)菌類毒素、腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白、熱激蛋白、百日咳蛋白、流感嗜血桿菌蛋白 D、細(xì)胞因子、淋巴因子、激素、生長因子、艱難梭菌毒素A、艱難梭菌毒素B和鐵攝取蛋白。
7.編碼權(quán)利要求1所述的純化的突變型GAS57抗原的核酸分子。
8.如權(quán)利要求7所述的核酸分子，其特征在于，該分子編碼選自SEQIDNO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的氨基酸序列。
9.如權(quán)利要求6所述的核酸分子，其特征在于，該分子包含選自SEQIDNO :6、SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8所示編碼序列的核苷酸序列。
10.一種特異性結(jié)合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割I(lǐng)L-8的能力的抗體制劑。
11.如權(quán)利要求10所述的抗體制劑，其特征在于，該抗體還抑制野生型GAS57切割人 趨化因子的能力，所述人趨化因子選自CXCLl/GR0a、CXCL2/GR0 β、CXCL3/GR0 γ , CXCL4、 CXCL12/SDF-1a、CXCL12/SDF-1β、CXCL12/SDF-1γ、CXCL5/ENA 78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/ ΝΑΡ-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP10、CXCLl 1、CXCL13、CXCL14 和 CXCL16。
12.如權(quán)利要求10所述的抗體制劑，其特征在于，該抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、 人源化抗體、嵌合型抗體、F(ab' )2片段、F(ab)自體、Fv分子、非共價(jià)異質(zhì)二聚體、單鏈Fv 分子(sFv)、二聚抗體片段構(gòu)建物、三聚抗體片段構(gòu)建物、微小抗體或它們的混合物。
13.—種組合物，其特征在于，該組合物包含(a)選自以下的活性藥劑(i)純化的突變型GAS57抗原，該抗原在選自氨基酸D151、H279或S617的一個(gè)或多個(gè) 氨基酸位置包含氨基酸突變，所述氨基酸的位置按SEQ ID NO :1編號，通過SDS-聚丙烯酰 胺凝膠電泳或ELISA試驗(yàn)檢測，該純化的突變型GAS57抗原對白介素8 (IL-8)的蛋白酶水 解活性比野生型GAS57降低了至少50% ；( )編碼所述純化的突變型GAS57抗原的核酸分子，和(iii)特異性結(jié)合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割I(lǐng)L-8能力的抗體制劑；和(b)藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，該組合物還包含兒童疫苗所用的活性 藥劑。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述活性藥劑選自(a)選自以下的多肽抗原腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、百日咳博德特菌、粘膜炎莫 拉菌、破傷風(fēng)梭菌、白喉棒狀桿菌、呼吸道合胞病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病 毒、風(fēng)疹病毒和輪狀病毒多肽抗原；和(b)編碼所述多肽抗原的核酸分子。
16.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，該組合物還包含用于老年人或免疫力 低下個(gè)體疫苗的第二種活性藥劑。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述第二種活性藥劑選自(a)選自以下的多肽抗原糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、 嗜肺軍團(tuán)病桿菌、單核細(xì)胞增多癥李斯特菌、流感病毒和副流感病毒多肽抗原；和(b)編碼所述多肽抗原的核酸分子。
18.一種抑制野生型GAS57蛋白酶水解活性的方法，包括使野生型GAS57與權(quán)利要求 10所述的抗體制劑接觸。
19.一種治療或預(yù)防釀膿鏈球菌感染的方法，包括給予有此需要的個(gè)體有效量的組合 物，該組合物包含(a)選自以下的活性藥劑(i)純化的突變型GAS57抗原，該抗原在選自氨基酸D151、H279或S617的一個(gè)或多個(gè) 氨基酸位置包含氨基酸突變，所述氨基酸的位置按SEQ ID NO :1編號，通過SDS-聚丙烯酰 胺凝膠電泳或ELISA試驗(yàn)檢測，該純化的突變型GAS57抗原對白介素8 (IL-8)的蛋白酶水 解活性比野生型GAS57降低至少50% ；( )編碼所述純化的突變型GAS57抗原的核酸分子，和(iii)特異性結(jié)合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割I(lǐng)L-8能力的抗體制劑；和(b)藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。
20.—種試劑盒，其包括(a)裝有選自以下活性藥物的容器(i)純化的突變型GAS57抗原，該抗原在選自氨基酸D151、H279或S617的一個(gè)或多個(gè) 氨基酸位置包含氨基酸突變，所述氨基酸的位置按SEQ ID NO :1編號，通過SDS-聚丙烯酰 胺凝膠電泳或ELISA試驗(yàn)檢測，該純化的突變型GAS57抗原對白介素8 (IL-8)的蛋白酶水 解活性比野生型GAS57降低至少50% ；( )編碼所述純化的突變型GAS57抗原的核酸分子，和(iii)特異性結(jié)合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割I(lǐng)L-8能力的抗體制劑；和(b)用所述組合物治療或預(yù)防釀膿鏈球菌感染的說明書。
21.一種制備預(yù)防或治療釀膿鏈球菌感染的組合物的方法，，包括混合 (a)選自以下的活性藥劑(i)純化的突變型GAS57抗原，該抗原在選自氨基酸D151、H279或S617的一個(gè)或多個(gè) 氨基酸位置包含氨基酸突變，所述氨基酸的位置按SEQ ID NO :1編號，通過SDS-聚丙烯酰 胺凝膠電泳或ELISA試驗(yàn)檢測，該純化的突變型GAS57抗原對白介素8 (IL-8)的蛋白酶水 解活性比野生型GAS57降低至少50% ；( )編碼所述純化的突變型GAS57抗原的核酸分子，和(iii)特異性結(jié)合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割I(lǐng)L-8能力的抗體制劑；和 (b)藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述活性藥劑是突變型GAS57抗原或抗 體，所述突變型GAS57抗原或抗體通過以下方法制備，該方法包括(a)培養(yǎng)含編碼所述突變型GAS57抗原或抗體的表達(dá)構(gòu)建物的宿主細(xì)胞；和(b)回收所述突變型GAS57抗原或抗體。
23.活性藥劑在制造治療或預(yù)防釀膿鏈球菌感染的藥物中的應(yīng)用，所述活性藥劑選自(a)純化的突變型GAS57抗原，該抗原在選自氨基酸D151、H279或S617的一個(gè)或多個(gè) 氨基酸位置包含氨基酸突變，所述氨基酸的位置按SEQ ID NO :1編號，通過SDS-聚丙烯酰 胺凝膠電泳或ELISA試驗(yàn)檢測，該純化的突變型GAS57抗原對白介素8 (IL-8)的蛋白酶水 解活性比野生型GAS57降低至少50% ；(b)編碼所述純化的突變型GAS57抗原的核酸分子，和(c)特異性結(jié)合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割I(lǐng)L-8能力的抗體制劑。
24.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的純化的突變型GAS57抗原，權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng) 所述的核酸分子，權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，或權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)所 述的組合物在治療中的應(yīng)用。如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的純化的突變型GAS57抗原，權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所 述的核酸分子，權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，或權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)所述 的組合物用于治療或預(yù)防釀膿鏈球菌感染。
全文摘要
本發(fā)明提供不能切割I(lǐng)L-8和類似物質(zhì)但仍保留了誘導(dǎo)抵御釀膿鏈球菌保護(hù)能力的GAS57的突變體。本發(fā)明也提供特異性結(jié)合GAS57從而抑制其切割I(lǐng)L-8和類似物質(zhì)的抗體。所述突變體等可用于疫苗組合物中誘導(dǎo)抗釀膿鏈球菌的保護(hù)力。所述抗體可用于，例如用作藥物治療釀膿鏈球菌感染。
文檔編號A61K39/09GK101969992SQ200880115439
公開日2011年2月9日 申請日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月12日
發(fā)明者C·津加瑞蒂, G·格蘭迪, I·馬格里蒂若斯 申請人:諾華有限公司