專利名稱：通過c型凝集素進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，特別是對CLEC9a分子具有親和力的分子用于引發(fā) 和抑制針對靶抗原之免疫應(yīng)答的用途。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)能夠檢測傳染原的存在，并引發(fā)針對它們的應(yīng)答，而不破壞自身組織。由 于病原體巨大的分子多樣性以及其高復(fù)制和突變速率，該現(xiàn)象并不尋常。多細(xì)胞生物在進(jìn) 化過程中已經(jīng)被激發(fā)發(fā)展出多種不同的免疫識別系統(tǒng)，即“先天”及“適應(yīng)性”免疫系統(tǒng)。進(jìn)化上很古老的先天免疫系統(tǒng)檢測感染的存在和性質(zhì)，提供宿主防御的第一道防 線，并控制適應(yīng)性免疫系統(tǒng)效應(yīng)子類型的引發(fā)和確定。樹突細(xì)胞(DC)在連接先天免疫和抗原特異性適應(yīng)性應(yīng)答上起到關(guān)鍵的作用。病 原表達(dá)的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecular pattern, PAMP)引發(fā)DC (特 別地)，從而引發(fā)免疫應(yīng)答。然后，DC協(xié)調(diào)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，后者要更為特化得多，并 由抗原特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞驅(qū)動。DC對病原的抗原識別和攝入功能由區(qū)分PAMP的模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)介導(dǎo)。這些由DC表達(dá)的PRR包括Toll樣受體(TLR)1。此外， DC表達(dá)另一類受體——C型凝集素，其中的一些可發(fā)揮PRR功能2_4，和/或介導(dǎo)細(xì)胞間通信 5_8。在C型凝集素中，有一類具有單個(gè)胞外C型凝集素結(jié)構(gòu)域(CTLD)的II型蛋白質(zhì)，其在 結(jié)構(gòu)上和進(jìn)化上密切相關(guān)，并且在NK基因復(fù)合物(NKC)中成簇。盡管這些受體缺乏鈣結(jié)合 位點(diǎn)和典型的糖識別結(jié)構(gòu)域，但是它們?nèi)钥梢阅軌蚪Y(jié)合糖，如對于Dectin-1所示9。這些受 體中的一些(⑶94/NKG2、NKG2D)與MHC-I或相關(guān)分子相互作用，并抑制或活化NK和T細(xì)胞 的細(xì)胞毒性，這是抑制和活化信號之間平衡的結(jié)果。但是，對于大多數(shù)NK凝集素受體而言， 其結(jié)合特異性以及在NK或DC功能中的相關(guān)性是未知的。因此，DC上表達(dá)的C型凝集素可 識別微生物，但是也可通過識別特異性的細(xì)胞對應(yīng)結(jié)構(gòu)(counterstructure)來調(diào)節(jié)DC與 其它細(xì)胞的通信。DC所處位置處的個(gè)體發(fā)育和/或微環(huán)境可導(dǎo)致DC表達(dá)不同的表面受體組合。例 如，僅表型標(biāo)準(zhǔn)就允許將小鼠淋巴結(jié)DC歸類為六種主要的亞群1(1。在這些亞群中，淋巴組 織中常規(guī)非漿細(xì)胞樣DC通常被進(jìn)一步分為⑶8 a _和⑶8 a +亞群。有看法稱，不同的DC亞 群可能涉及某些病原體的特異性識別和/或調(diào)節(jié)不同免疫應(yīng)答，例如Thl或Th2 (免疫性) 或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(耐受性)"。但是，DC的表型和功能性行為也受到外部活化刺激的顯著影 響，表現(xiàn)出顯著的可塑性。作為第一種認(rèn)識DC亞群之間差異的方法，分離DC亞群并評估它 們的體外特征在小鼠中，脾臟DC的⑶8 a +和⑶8 a _亞群差異在于它們體外產(chǎn)生IL-12的 能力12’13。但是，還通過模式識別確定了體外的差異性IL-12產(chǎn)生，證明了不同DC亞群的功 能靈活性14。作為第二種方法，分離DC亞群，用抗原脈沖刺激，然后在體內(nèi)重新灌注。CD8 a + 和⑶8 a _亞群在體內(nèi)差異地引發(fā)Thl和Th2應(yīng)答15’16。如果我們能確定在特定DC亞群中 選擇性表達(dá)的分子，就可進(jìn)行免疫治療。然后，可靶向這些分子以改變此亞群DC的功能

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，CLEC9a在小鼠中表達(dá)⑶8的樹突細(xì)胞亞群中偏好性表達(dá)，其因此 被稱為CD8+樹突細(xì)胞。因?yàn)槠浔徽J(rèn)為能夠加工來自細(xì)胞外部的抗原并將它們通過I類MHC 分子呈遞給T細(xì)胞，所以這是一個(gè)非常重要的細(xì)胞類型。這與通過II類MHC分子呈遞外部 來源抗原的大多數(shù)抗原遞呈細(xì)胞不同。因此，這種抗原呈遞的機(jī)制有時(shí)被稱為“交叉呈遞”。 所以，這些細(xì)胞在細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的產(chǎn)生和激活上起到重要作用，CTL應(yīng)答是針對 胞內(nèi)病原體(例如病毒)和癌癥之免疫應(yīng)答的重要組成部分。該發(fā)現(xiàn)開辟了許多應(yīng)用。例如，其使得抗原能夠特異性靶向能夠交叉呈遞的樹突 細(xì)胞。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了將抗原靶向至抗原呈遞細(xì)胞的方法，其包括使抗 原呈遞細(xì)胞與包含所述抗原的組合物相接觸，其中所述抗原與對CLEC9a有親和力的結(jié)合 劑相聯(lián)合，其中所述抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)CLEC9a。所述方法可體外或體內(nèi)應(yīng)用。所述抗原呈遞細(xì)胞通常是樹突細(xì)胞，并且優(yōu)選能夠 通過I類MHC分子交叉呈遞胞外抗原?！鞍狻敝缚乖患?xì)胞從細(xì)胞外環(huán)境攝取，通常通過 胞吞作用或吞噬作用。本發(fā)明還提供了在對象中激活針對抗原之免疫應(yīng)答的方法，其包括對所述對象施 用包含所述抗原的組合物，其中所述抗原與對CLEC9a有親和力的結(jié)合劑相聯(lián)合。所述方法可包括單次施用，或者間隔適當(dāng)時(shí)間間隔的兩次或更多次系列施用。例 如，所述方法可包括引發(fā)步驟(即首次施用)，然后是一個(gè)或多個(gè)加強(qiáng)步驟(后續(xù)施用)。例 如，首次施用和第二次施用可間隔一天或數(shù)天，一周或數(shù)周，或者一月或數(shù)月，優(yōu)選兩周至 一個(gè)月。后續(xù)施用可以在一周或數(shù)周或者一月或數(shù)月之后提供。通過CLEC9a靶向所刺激的免疫應(yīng)答包括T細(xì)胞增殖，其可以是CTL或輔助T細(xì)胞。 表達(dá)CLEC9a的抗原呈遞細(xì)胞(特別是樹突細(xì)胞)可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的增殖， 可在任何給定免疫應(yīng)答中激活兩種類型T細(xì)胞的增殖。在一定條件下，認(rèn)為它們能夠刺激調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)增殖。Treg細(xì)胞的特征是 Foxp3 (Forkhead box p3)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。大多數(shù)Treg細(xì)胞是CD4+和CD25+，可被認(rèn)為 是輔助T細(xì)胞的亞群，但一小部分可以是CD8+。因此，待用本發(fā)明方法激活的免疫應(yīng)答可包 括應(yīng)答于抗原而誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增殖。因此，該方法可包括對所述對象施用含有該抗原的組 合物，其中所述抗原與對CLEC9a有親和力的結(jié)合劑相聯(lián)合。所述抗原可以與促進(jìn)Treg細(xì) 胞增殖的佐劑一起施用。本方法包括應(yīng)答于特異性抗原而刺激Treg細(xì)胞的增殖和分化，因此可以認(rèn)為其 是一種刺激免疫應(yīng)答的方法。但是，由于Treg細(xì)胞能夠以其它方式調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)其它細(xì) 胞針對抗原的應(yīng)答，例如抑制或阻止它們的活性，因此對免疫系統(tǒng)的總體效果可以是調(diào)節(jié) (例如阻止或抑制)針對該抗原的應(yīng)答。因此，本發(fā)明該方面的方法同樣地可被認(rèn)為是調(diào)節(jié) (例如抑制或阻止)針對抗原之免疫應(yīng)答的方法。然后，在實(shí)踐中，本發(fā)明的這些方法可治療性或預(yù)防性地用于抑制或阻止針對特 定抗原的不期望的免疫應(yīng)答，甚至是在存在對該抗原的已有免疫或進(jìn)行中的免疫應(yīng)答的對 象中。這在(例如)自身免疫病的治療中是特別有用的。
在一定條件下，也有可能通過將抗原靶向至表達(dá)CLEC9a的抗原呈遞細(xì)胞而使對 象耐受特定抗原。因此，本發(fā)明還提供了在對象中誘導(dǎo)對抗原的耐受性的方法，其包括對所 述對象施用包含所述抗原的組合物，其中所述抗原與對CLEC9a有親和力的結(jié)合劑相聯(lián)合， 其中在沒有佐劑的情況下施用所述抗原。這種情況下的耐受性通常包括清除否則將能夠應(yīng)答于該抗原的免疫細(xì)胞，或者在 這些免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)對抗原之應(yīng)答性的持續(xù)降低。通常，所述對象是脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物。所述對象可以是人、其它靈長類或者 家養(yǎng)動物、實(shí)驗(yàn)動物或者家畜，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔類動物(例如兔)、貓、狗、豬、牛、 馬、綿羊或山羊。因此，本發(fā)明可提供包含抗原的組合物，其中所述抗原與對CLEC9a有親和力的結(jié) 合劑相聯(lián)合。所述組合物可以是藥物組合物，例如疫苗，其含有所述抗原以及其相聯(lián)合的結(jié) 合劑和可藥用載體。其可以制備成用于任何適當(dāng)?shù)慕o藥途徑，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、 腹膜內(nèi)、經(jīng)鼻、皮下、皮內(nèi)等等。因此，本發(fā)明可提供用于醫(yī)療方法的包含抗原的組合物，其中所述抗原與對 CLEC9a有親和力的結(jié)合劑相聯(lián)合。還提供了包含抗原的組合物，其用于刺激針對所述抗原的免疫應(yīng)答，其中所述抗 原與對CLEC9a有親和力的結(jié)合劑相聯(lián)合。還提供了包含抗原的組合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于激活抗所述抗原 的免疫應(yīng)答，其中所述抗原與對CLEC9a有親和力的結(jié)合劑相聯(lián)合。⑶8a +樹突細(xì)胞至少可參與Thl、Th2和Thl7型免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的方法 可用于刺激針對任何抗原的多種類型的免疫應(yīng)答。然而，這些細(xì)胞被認(rèn)為在CTL應(yīng)答產(chǎn)生 中特別重要，因此待刺激的免疫應(yīng)答優(yōu)選是CTL應(yīng)答。所述方法可包括確定CTL的產(chǎn)生和 /或增殖，其通常是表達(dá)CD8的T細(xì)胞，并且在I類MHC分子背景下能針對展示其相應(yīng)抗原 的細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性。盡管如此，將抗原靶向至CLEC9a+樹突細(xì)胞可導(dǎo)致輔助T細(xì)胞與CTL 一起增殖，或 代替CTL發(fā)生增殖。因此，本方法可另外地或替代地包括確定輔助T細(xì)胞的產(chǎn)生和/或增 殖。所述輔助T細(xì)胞可以是⑶4+T細(xì)胞，并且可以是Thl、Th2、Thl7或Treg類型。它們還 可包括不表達(dá)⑶4的其它類型的Treg細(xì)胞，例如⑶8+Treg細(xì)胞。所以，應(yīng)理解，如上所述的方法和組合物可用于預(yù)防和/或治療任何期望誘導(dǎo)CTL 應(yīng)答的疾病，例如癌癥，或者細(xì)胞內(nèi)寄生蟲或病原體引起的感染，例如病毒感染。另外可能期望施用免疫刺激劑，以實(shí)現(xiàn)最大的CTL刺激和增殖，和/或其它類型T 細(xì)胞的刺激和增殖。它們可包含能夠活化樹突細(xì)胞和刺激其促進(jìn)T細(xì)胞活化之能力的物 質(zhì)。這些物質(zhì)可以被稱為佐劑。所述佐劑可包括⑶40激動劑(例如可溶性⑶40配體，或 者⑶40特異性的激動性抗體)，⑶28、⑶27或0X40的激動劑(例如對這些分子之一具有特 異性的激動性抗體)，CTLA-4拮抗劑(例如CTLA-4特異性的封閉抗體)和/或Toll樣受 體(TLR)激動劑，和/或能夠誘導(dǎo)樹突細(xì)胞活化的任何其它物質(zhì)。TLR激動劑是活化Toll 樣受體的TLR激動劑。優(yōu)選地，TLR激動劑是TLR3、TLR4、TLR5、TLR7或TLR9活化劑。合 適的TLR激動劑是MPL (單磷酸脂A)，其結(jié)合TLR4。其它可以使用的TLR激動劑有LTA (脂 磷壁酸，其結(jié)合TLR2 ；聚I C (聚肌苷-聚胞苷酸)，其結(jié)合TLR3 ；鞭毛蛋白，其結(jié)合TLR5 ；咪喹莫特或polyURNA(l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并(4,5-c)喹啉_4_胺)，其結(jié)合TLR7， 以及CpG(DNA CpG基序)，其結(jié)合TLR9;或者任何其它結(jié)合并活化TLR的組分。細(xì)節(jié)參見 Reis e Sousa，Toll—like receptors and dendriticcells. Seminars in Immunology 16: 27,2004.不通過TLR起作用的佐劑包括5'三磷酸RNA，聚I: C和0 -葡聚糖，例如可得然 膠(curdlan) ( 3 -1，3-葡聚糖)。促炎性細(xì)胞因子例如TNF- a或IL-1也可用作佐劑。具有CLEC9a激動劑活性(例如能夠交聯(lián)樹突細(xì)胞表面上的CLEC9a，下文更詳細(xì)討 論)的結(jié)合劑也可以能夠活化樹突細(xì)胞。因此，這些激動性結(jié)合劑可以被認(rèn)為本身就是佐 劑。所以，當(dāng)使用這些結(jié)合劑時(shí)，施用如上文所述的那些其它佐劑可能不是必需的(盡管可 能仍然期望這樣做)。下文更詳細(xì)地討論能夠用作CLEC9a激動劑的結(jié)合劑。不受理論的限制，認(rèn)為所用佐劑的性質(zhì)可能影響所獲得應(yīng)答的類型。表達(dá)CLEC9a 的抗原呈遞細(xì)胞可刺激CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞二者，尤其是CD4+應(yīng)答的性質(zhì)可受到所用 佐劑的影響。例如，聚I:C的使用似乎有利于產(chǎn)生Thl型CD4+應(yīng)答。可得然膠似乎刺激 Thl7型⑶4+應(yīng)答。某些佐劑促進(jìn)對Treg細(xì)胞的刺激。它們包括視黃酸，特別是全反式視黃酸 (ATRA)，也稱為trenitoin。因此，當(dāng)待刺激的免疫應(yīng)答是Treg應(yīng)答時(shí)(其實(shí)際上可抑制免 疫系統(tǒng)其他組分對特定抗原的應(yīng)答)，使用Treg促進(jìn)佐劑可能是合適的。還有可能在不施 用佐劑的情況下刺激Treg細(xì)胞。 本發(fā)明的組合物可以與所述佐劑一起施用或者制備成用于與所述佐劑一起施用， 其施用是依次或同時(shí)地在同一組合物或分開的組合物中進(jìn)行。因此，本發(fā)明的組合物可以 但不必須包含佐劑。不受理論的限制，如上所述，認(rèn)為在不帶佐劑時(shí)施用所述抗原可導(dǎo)致產(chǎn)生對所述 抗原的耐受性。也就是說，所述免疫系統(tǒng)被誘導(dǎo)成不響應(yīng)于將來相同抗原的施用。這可能 (但不必須)涉及產(chǎn)生能夠主動抑制所述應(yīng)答的Treg細(xì)胞。因此，向已經(jīng)耐受抗原的對象 另外施用該抗原應(yīng)導(dǎo)致比初次接受該抗原的受體(即其免疫系統(tǒng)之前未接觸所述抗原)小 的免疫應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答的程度可通過任何合適的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估，例如炎癥表現(xiàn)、腫脹、 細(xì)胞增殖(例如Thl、Th2或Thl7CD4+T細(xì)胞，或CTL)或炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生(例如IL-1、 IL-4、IL-12、IFN- y , TNF- a )。在某些實(shí)施方案中，耐受的個(gè)體會顯示對該抗原基本上沒 有免疫應(yīng)答。在上述組合物和方法中，所述抗原在物理上與所述結(jié)合劑相關(guān)連，所述聯(lián)合可通 過共價(jià)或非共價(jià)(例如靜電或范德華力)相互作用。優(yōu)選地，所述抗原共價(jià)連接到所述結(jié) 合劑。例如，所述結(jié)合劑可通過合適的偶聯(lián)試劑與所述抗原偶聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚 可用于此類偶聯(lián)反應(yīng)的合適方法和試劑?；蛘撸隹乖徒Y(jié)合劑可以是同一肽鏈的一部分，S卩，它們可以作為融合蛋白表 達(dá)。所述融合蛋白可含有在所述抗原和所述結(jié)合劑之間的接頭。或者，所述抗原和結(jié)合劑 可以是物理上鄰近的(例如脂質(zhì)體)，而沒有化學(xué)鍵。所述結(jié)合劑可以是對CLEC9a具有充分特異性親和力的任何合適的分子。在本說 明書全篇中提及此類結(jié)合劑的任何地方，其可以是蛋白質(zhì)、核酸(例如適配體)、糖或者小 分子。它可以是CLEC9a的生理配體或者其變體或類似物。但是，抗CLEC9a的抗體和其功 能性片段是特別優(yōu)選的。因此，所述結(jié)合劑可包括CLEC9a特異性的抗體結(jié)合位點(diǎn)。所述結(jié)合劑可以是多價(jià)的，如下文更詳細(xì)所述的。所述抗原是肽抗原。術(shù)語“肽”指所述抗原的性質(zhì)，即，其由肽鍵連接的氨基酸組 成，并且不應(yīng)認(rèn)為暗示任何具體的大小或長度。通常，所述肽抗原至少長8個(gè)氨基酸，并可 以長達(dá)30個(gè)氨基酸、長達(dá)50個(gè)氨基酸、長達(dá)100個(gè)氨基酸、長達(dá)200個(gè)氨基酸或甚至更長， 并且可以具有與氨基酸偶聯(lián)的殘基，例如糖基鏈。例如，它可以為25至35個(gè)氨基酸長。不受任何具體理論的限制，所述肽抗原應(yīng)能夠結(jié)合II類MHC或I類MHC分子，或 者應(yīng)該能夠在抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞)中被加工而產(chǎn)生一種或多種能夠結(jié)合II類 MHC分子或I類MHC的肽。最近，有人提出，長約8個(gè)氨基酸的短表位肽可誘導(dǎo)比更長的肽 (約30個(gè)氨基酸長)持續(xù)更短的CTL反應(yīng)性(21)。I類MHC分子通常結(jié)合8或9個(gè)氨基酸 長的肽，而II類MHC分子可結(jié)合8個(gè)氨基酸至長達(dá)20個(gè)氨基酸、長達(dá)30個(gè)氨基酸長或者 更長的肽。所述抗原可以是任何蛋白質(zhì)或其片段，其中期望提高針對所述蛋白質(zhì)或片段的免 疫應(yīng)答，特別是CTL應(yīng)答，但還有Thl7應(yīng)答或Treg應(yīng)答。它們可包括與細(xì)胞相聯(lián)合、由細(xì)胞 表達(dá)、顯示于細(xì)胞上或者細(xì)胞所分泌的抗原，其中期望刺激針對該抗原的CTL應(yīng)答，所述細(xì) 胞包括癌細(xì)胞和含有胞內(nèi)病原體或寄生生物的細(xì)胞。例如，所述抗原可以是(或包含)來 自胞內(nèi)病原體或寄生生物所表達(dá)蛋白質(zhì)(例如病毒蛋白質(zhì))或者癌癥或腫瘤細(xì)胞所表達(dá)蛋 白質(zhì)的表位肽。因此，所述抗原可以是腫瘤特異性抗原。術(shù)語“腫瘤特異性”抗原不應(yīng)理解 為僅限于來自實(shí)體瘤的抗原，而應(yīng)涵蓋由任何癌性、轉(zhuǎn)變的或惡性細(xì)胞特異性表達(dá)的抗原?？赡芴貏e期望產(chǎn)生針對以下抗原的Treg應(yīng)答，其中所述對象針對該抗原顯示出 不期望的免疫應(yīng)答或有風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生這種免疫應(yīng)答。例如，它可以是自體抗原，在自身免疫病中 發(fā)生針對該自體抗原的免疫應(yīng)答。其中特異性抗原已被鑒定為可能具有病原意義的自身免 疫病的實(shí)例包括多發(fā)性硬化(髓磷脂堿性蛋白)、胰島素依賴性糖尿病(谷氨酸脫羧酶)、 胰島素抗藥性糖尿病(胰島素受體)、乳糜瀉(麥醇溶蛋白)、大皰性類天皰瘡(XVII型膠 原)、自身免疫性溶血性貧血(Rh蛋白)、自身免疫性血小板減少(GpIIb/lIIa)、重癥肌無力 (乙酰膽堿受體)、突眼性甲狀腺腫(刺激甲狀腺的激素受體)、腎小球腎炎，例如古德帕斯 徹氏病(Goodpasture' s disease) (a3(IV)NCl膠原)和惡性貧血(內(nèi)在因子)?；蛘?， 所述靶抗原可以是外源抗原，其刺激了也導(dǎo)致宿主組織破壞的應(yīng)答。例如，急性風(fēng)濕熱是由 對鏈球菌抗原的抗體應(yīng)答引起的，其與心肌細(xì)胞抗原交叉反應(yīng)。因此，這些抗原或其特定片 段或表位可以是用于本發(fā)明的合適抗原。已經(jīng)顯示，Treg細(xì)胞的清除或者Treg細(xì)胞功能的損傷小鼠模型中導(dǎo)致自身免疫 病。在測試動物中造成的疾病包括關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、炎性腸病、胃炎、惡性 貧血、甲狀腺炎、胰島炎、糖尿病、涎腺炎、腎上腺炎、自身免疫性睪丸炎/卵巢炎、腎小球腎 炎、慢性阻塞性肺病以及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎和多發(fā)性硬化。還已顯示，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性1型T細(xì)胞應(yīng)答還減少小鼠模型中動脈粥樣硬化的發(fā)生 (Mallat Z.et al. Circulation 108:1232-7,2003)。Treg活性也已顯示出在同種異體移植排斥速率中的重要性。Treg細(xì)胞的清除或 者功能損傷加速了排斥速率，而用富含Treg細(xì)胞的同源淋巴細(xì)胞輸注試驗(yàn)動物已顯示出 延長移植物的存活。因此，本發(fā)明的方法可用于任意這些疾病的治療中。
還可以刺激針對對象體內(nèi)所存在抗原的免疫應(yīng)答(CTL應(yīng)答或是任何其它類型T 細(xì)胞應(yīng)答，包括Treg應(yīng)答)，而不直接向所述對象施用所述抗原。這可以通過使用對所述抗原具有親和力并且對CLEC9a也具有親和力的結(jié)合劑 來實(shí)現(xiàn)，使得所述結(jié)合劑能夠與對象體內(nèi)的抗原形成復(fù)合物，并將所述抗原靶向到表達(dá) CLEC9a的抗原呈遞細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了具有對CLEC9的親和力的第一結(jié)合位點(diǎn)和對所述抗原有親和 力的第二結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合劑。這些結(jié)合劑在本說明書中稱為“雙特異性”結(jié)合劑。然而，應(yīng) 理解，所述結(jié)合劑還可具有具有其他結(jié)合親和力(例如對其它抗原的結(jié)合親和力)的結(jié)合 位點(diǎn)，術(shù)語“雙特異性”應(yīng)如此解釋。本發(fā)明還提供了如上所述的雙特異性結(jié)合劑，其用于醫(yī)療方法，例如，在刺激針對 靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答中。所述靶細(xì)胞可以是癌細(xì)胞或被寄生的細(xì)胞。本發(fā)明還提供如上所述的雙特異性結(jié)合劑在制備用于刺激針對靶細(xì)胞之免疫應(yīng) 答的藥物中的用途。所述靶細(xì)胞可以是癌細(xì)胞或被寄生的細(xì)胞。本發(fā)明還提供了刺激對象中針對靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述對象施 用雙特異性結(jié)合劑。所述對象可以(例如)患有癌癥或者細(xì)胞內(nèi)寄生感染。所述雙特異性結(jié)合劑可制備成與如本說明書其它地方所述的佐劑聯(lián)合施用，或者 可與佐劑制備在同一組合物中?？梢愿鶕?jù)需要的應(yīng)答性質(zhì)來選擇佐劑的性質(zhì)。因此，例如， ATRA可用在需要誘導(dǎo)針對所述抗原的Treg應(yīng)答的情況下，可得然膠可用在需要Thl7應(yīng)答 的情況下，任何其它的合適佐劑(例如抗CD40、聚I:C等)可用在需要更常規(guī)的CTL應(yīng)答的 地方。在不施用佐劑時(shí)，可以誘導(dǎo)對Treg細(xì)胞的刺激和/或?qū)λ隹乖哪褪苄?。本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包含與可藥用載體混合的如上所述雙特異性結(jié)合 劑。所述組合物可另外包含佐劑，或者可用于與佐劑聯(lián)合施用，如說明書其它地方所述。一些實(shí)施方式中，結(jié)合位點(diǎn)中的一個(gè)或兩個(gè)可以分別是對CLEC9a或所述抗原有 特異性的抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此，所述結(jié)合劑可以是雙特異性抗體，其至少包含CLEC9a特異 性的第一抗體結(jié)合位點(diǎn)和對所述抗原具有親和力的第二抗體結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語“雙特異性抗 體”應(yīng)解釋為涵蓋任何具有這樣兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的分子或分子復(fù)合物，例如雙特異性單鏈Fv 二聚體和“雙抗體(diabody) ” (見下文)。CLEC9a分子是特定樹突細(xì)胞亞群的標(biāo)志物，這一發(fā)現(xiàn)還使其成為下調(diào)不期望免疫 應(yīng)答的合適治療性靶標(biāo)。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供在對象中抑制免疫應(yīng)答的方法，其包括施用對 CLEC9a有親和力的結(jié)合劑。在本發(fā)明的這一方面，所述結(jié)合劑能夠在其結(jié)合的樹突細(xì)胞中直接或間接抑制樹 突細(xì)胞功能。所述結(jié)合劑可抑制CLEC9a與其對應(yīng)配體的結(jié)合，或者可抑制細(xì)胞功能的一個(gè) 方面，例如應(yīng)答于佐劑的成熟，或者抗原呈遞?；蛘?，所述結(jié)合劑可以能夠直接或間接地殺 傷所述細(xì)胞，這可被認(rèn)為是“清除”活性。通常，所述結(jié)合劑包含“效應(yīng)子”部分，其直接或 間接地負(fù)責(zé)殺傷細(xì)胞或者影響抗原呈遞。例如，所述結(jié)合劑可以能夠募集對象免疫系統(tǒng)的組分，因此刺激對細(xì)胞的免疫攻 擊。例如，抗體Fc區(qū)域可用于募集補(bǔ)體系統(tǒng)的組分，其可通過補(bǔ)體裂解途徑導(dǎo)致細(xì)胞裂解， 或調(diào)理所述細(xì)胞以及隨后的免疫系統(tǒng)吞噬細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)的吞噬。吞噬細(xì)胞也具有Fc受體，其使得它們能夠吞噬抗體所結(jié)合的細(xì)胞，因此抗體自身可標(biāo)識細(xì) 胞以用于吞噬作用，而不活化補(bǔ)體。因此，效應(yīng)子部分可包括抗體Fc區(qū)域，例如IgG或IgM。所述結(jié)合劑可包括其它類型的效應(yīng)子部分，其起到殺傷靶細(xì)胞的作用。例如，它可 包含能夠殺傷所述細(xì)胞的毒素分子。此機(jī)制可以是特別有效的，因?yàn)楸景l(fā)明人顯示，結(jié)合 CLEC9a的抗體可被樹突細(xì)胞吞噬，于是綴合的毒素分子有很大可能被該細(xì)胞攝取?；蛘?，所述效應(yīng)子部分可以是能夠活化細(xì)胞附近的前藥的酶，例如將非毒性分子 轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘苑肿?。如已?jīng)記載的，所述結(jié)合劑可包括CLEC9a特異性的抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此，可用的結(jié)合劑包括含有CLEC9a特異性抗體結(jié)合位點(diǎn)以及一個(gè)或多個(gè)抗體 Fc區(qū)域、毒素分子或者能夠活化前藥的酶的分子。所述結(jié)合劑自身可以是CLEC9a的功能性拮抗劑。因此，所述結(jié)合劑與CLEC9a的 結(jié)合可能就足以發(fā)揮其功能，這通過阻止CLEC9a結(jié)合其對應(yīng)配體或者阻止發(fā)揮其正常信 號作用(例如在樹突細(xì)胞成熟和/或抗原呈遞中)來實(shí)現(xiàn)。在這些實(shí)施方案中，可能期望 所述結(jié)合劑僅僅包含一個(gè)或兩個(gè)CLEC9a特異性結(jié)合位點(diǎn)(例如抗體結(jié)合位點(diǎn))。例如，所 述結(jié)合劑可以是(或包含)抗體或抗體片段，例如Fab或scFv片段。阻止CLEC9a與其配體結(jié)合的拮抗劑在自身免疫病的治療中可特別有用。一些自 身免疫病的特征是特別高水平的細(xì)胞死亡，認(rèn)為針對與這些細(xì)胞相關(guān)的自體抗原的免疫應(yīng) 答可能參與了這些疾病的發(fā)病。因此，CLEC9a拮抗劑可用于阻止CLEC9a結(jié)合死亡和瀕死 細(xì)胞(尤其是發(fā)生免疫性細(xì)胞死亡的那些)中暴露的配體，因此可抑制或防止刺激針對這 些抗原的免疫應(yīng)答。CLEC9a的其它功能性拮抗劑也可用于所述方法。這些拮抗劑包括能夠與編碼 CLEC9a的mRNA或DNA雜交的核酸或其類似物(例如核酶、反義RNA或DNA分子、siRNA等)， CLEC9a的小分子拮抗劑，等等。另一些CLEC9a拮抗劑是CLEC9a配體的競爭劑，其可封閉樹突細(xì)胞相關(guān)CLEC9a之 配體上的結(jié)合位點(diǎn)，因此可阻止配體被樹突細(xì)胞識別或結(jié)合。合適的競爭劑包括可溶性分 子，其包含足以結(jié)合CLEC9a配體的CLEC9a胞外結(jié)構(gòu)域或其部分。CLEC9a胞外結(jié)構(gòu)域(或其部分)可以與可調(diào)節(jié)所述拮抗劑一些特性(例如其體內(nèi) 藥代動力學(xué)特性)的異源部分相聯(lián)合。所述胞外結(jié)構(gòu)域可以共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合該異源部 分，或者表達(dá)為與異源部分的融合蛋白。例如，所述異源部分可以是抗體Fc結(jié)構(gòu)域，以提供 提高的血清半衰期并允許有效清除所述拮抗劑與CLEC9a配體的復(fù)合物。異源部分其它可能的功能包括介導(dǎo)CLEC9a胞外結(jié)構(gòu)域的寡聚化，并促進(jìn)拮抗劑 的純化或者從樣品中分離。例如，合適的拮抗劑可以是可溶性分子，其包含與親和素單體相 聯(lián)合的CLEC9a胞外結(jié)構(gòu)域(或其足以結(jié)合CLEC9a配體的片段)或由其組成。親和素單體 通常會聯(lián)合成為四聚體，提供了包含四個(gè)CLEC9a結(jié)構(gòu)域和四個(gè)親和素亞基的復(fù)合物。此結(jié) 構(gòu)可輕易地通過接觸生物素而分離，所述生物素可在例如珠的固體載體上提供。當(dāng)所述結(jié)合劑或拮抗劑是蛋白質(zhì)時(shí)，可以施用編碼所述拮抗劑的核酸(例如 DNA)。通常，所述核酸將被體內(nèi)的細(xì)胞(例如肌肉細(xì)胞)所攝取，被這些細(xì)胞表達(dá)和分泌。 此方法經(jīng)常被稱為DNA疫苗?？贵w特別適于用作結(jié)合劑和拮抗劑，并且可便利地表達(dá)為scFv形式。必要時(shí)，抗體可編碼為與抗原的融合蛋白，或者如上所述與效應(yīng)子部分的融合蛋白。DNA疫苗的實(shí)例記 載于 Nchinda 等，J. Clin. Invest. 118 (4)，1427-36，2008。所述核酸通常包含編碼所述結(jié)合劑或拮抗劑的編碼區(qū)，任選地與任何期望的融合 配偶體相連，與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列有效連接以確保攝取該核酸的細(xì)胞正確地表達(dá)和分泌 所述蛋白質(zhì)。這些序列包括(但不必限于)轉(zhuǎn)錄起始序列(例如啟動子和增強(qiáng)子)、轉(zhuǎn)錄終 止序列、合適的剪接信號、翻譯起始和終止序列以及使其分泌的信號肽。因此，本發(fā)明還提供了用于醫(yī)療方法的編碼CLEC9a拮抗劑或結(jié)合劑的核酸(例如 DNA)。本發(fā)明還提供了用于治療用途之方法的編碼CLEC9a拮抗劑或結(jié)合劑的核酸。施用所述結(jié)合劑或拮抗劑的對象可患有炎性病癥或自身免疫病，尤其是以不期望 的CTL活性為特征的疾病，和/或以高水平細(xì)胞死亡為特征的疾病。這些疾病包括-自身免疫病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及具有免疫成分的其他類型的慢性或急性關(guān) 節(jié)炎或關(guān)節(jié)病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(其已知涉及特別高水平的細(xì)胞死亡)、硬皮病、Sj6gren 綜合征、自身免疫性(尤其是I型)糖尿病、甲狀腺炎及其他器官特異性免疫疾病，包括銀 屑?。籣神經(jīng)疾病，包括多發(fā)性硬化、重癥肌無力及其他神經(jīng)免疫介導(dǎo)疾病。還包括胃腸 疾病，包括克羅恩病、結(jié)腸炎、乳糜瀉和肝炎；-心血管疾病，其目前被認(rèn)為具有顯著的免疫介導(dǎo)成分，包括動脈粥樣硬化、心肌 病、風(fēng)濕熱、心內(nèi)膜炎、血管炎及其他免疫介導(dǎo)心血管疾病；_免疫介導(dǎo)的呼吸疾病，包括肺氣腫、呼吸道感染及其他免疫介導(dǎo)呼吸疾??；-變應(yīng)性過程和超敏反應(yīng)(I、II、III和IV型)，包括哮喘、鼻炎及其他免疫介導(dǎo)的 超敏反應(yīng)；-移植或移植物排斥以及移植物抗宿主病，發(fā)生在例如器官移植、組織移植、輸血、 骨髓移植期間或之后；-對傳染原的免疫病理應(yīng)答，包括膿毒性休克綜合征；-退行性過程，例如神經(jīng)退行性過程，其涉及免疫活性細(xì)胞例如小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。因此，本發(fā)明還提供了用于醫(yī)療方法的具有CLEC9a親和力的結(jié)合劑或者CLEC9a 拮抗劑。本發(fā)明還提供了用于抑制免疫應(yīng)答的具有CLEC9a親和力的結(jié)合劑或者CLEC9a拮 抗劑。本發(fā)明還提供了具有CLEC9a親和力的結(jié)合劑或者CLEC9a拮抗劑在制備抑制免疫 應(yīng)答的藥物中的用途。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，CLEC9a激動劑能夠活化樹突細(xì)胞，因此可用于刺激免疫功能，甚 至是在不與抗原物理相連接時(shí)亦如此。因此，本發(fā)明提供在對象中刺激免疫應(yīng)答的方法，其 包括施用對CLEC9a有親和力的結(jié)合劑。所述CLEC9a激動劑可以是對CLEC9a具有親和力的結(jié)合劑，并且可包含CLEC9a特 異性的抗體結(jié)合位點(diǎn)。不受理論的限制，認(rèn)為具有多于兩個(gè)CLEC9a特異性結(jié)合位點(diǎn)(例如抗體結(jié)合位 點(diǎn))的結(jié)合劑可以是特別有效的CLEC9a活性激動劑，可能是因?yàn)樗鼈兛山宦?lián)或者造成 CLEC9a在細(xì)胞表面上結(jié)合或多聚化。如果具有兩個(gè)這樣的結(jié)合位點(diǎn)，則結(jié)合劑可被稱為“二價(jià)的”，如果它們具有多于兩個(gè)的這些結(jié)合位點(diǎn)，則被稱為“多價(jià)的”。因此，所述結(jié)合劑優(yōu)選 是多價(jià)的，可包含至少三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、十個(gè)或者甚至更多的結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)合劑可包含 固定在顆粒之中或之上的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，所述顆粒例如珠(如乳膠珠)、脂質(zhì)體或囊或者任 何其它合適的顆粒。因此，所述結(jié)合位點(diǎn)可固定于顆粒化固相之上或之中?；蛘撸鄡r(jià)結(jié)合 劑可簡單地包含多于兩個(gè)彼此共價(jià)相連或以其它方式相聯(lián)合的結(jié)合位點(diǎn)。例如，完整抗體 或其功能性片段(見下文)可作為融合蛋白相聯(lián)合和/或通過化學(xué)交聯(lián)相聯(lián)合。本領(lǐng)域技 術(shù)人員很了解制備這些多價(jià)結(jié)合劑的合適技術(shù)。當(dāng)體外實(shí)施所述方法時(shí)，固定于培養(yǎng)容器 表面上的結(jié)合劑(例如針對CLEC9a的抗體)可用作激動劑，在這種情況下，所述培養(yǎng)容器 的涂覆表面本身可被認(rèn)為是多價(jià)結(jié)合劑。所述激動劑可單獨(dú)施用，以一般性激活免疫功能，或者與期望誘導(dǎo)針對其的免疫 應(yīng)答的靶抗原聯(lián)合施用。根據(jù)需要，所述激動劑和抗原可同時(shí)地或者依次地分開施用或者 在同一組合物中施用。所述激動劑可以如上有關(guān)本發(fā)明第一方面所述在物理上與所述抗原 相聯(lián)合，或者所述兩種組分可以是物理上分離的不同實(shí)體。如已經(jīng)描述的，所述方法和組合物可特別地用于預(yù)防和/或治療任何期望誘導(dǎo) CTL應(yīng)答的疾病，例如癌癥，或者胞內(nèi)寄生生物或病原體的感染，例如病毒感染。所述方法和組合物還可用于預(yù)防和/或治療任何期望誘導(dǎo)Treg應(yīng)答的疾病，例如 涉及不期望的或不適當(dāng)?shù)尼槍μ囟l件的免疫應(yīng)答的疾病，例如自身免疫病。如上所述的另外免疫刺激劑或佐劑也可與所述激動劑以及任選地所述抗原聯(lián)合 施用。因此，所述佐劑可包括例如⑶40激動劑或TLR激動劑。可以根據(jù)所期望免疫應(yīng)答的 性質(zhì)選擇所述佐劑的性質(zhì)。因此，例如，如果期望是Thl7型CD4T細(xì)胞應(yīng)答或者Treg應(yīng)答， 則可相應(yīng)地選擇佐劑。CLEC9a被鑒定為樹突細(xì)胞亞群的標(biāo)志物，這提供了從生物樣品中鑒定和分離這些 細(xì)胞的手段。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測樣品中抗原呈遞細(xì)胞的方法，其包括使所 述樣品接觸具有CLEC9a親和力的結(jié)合劑，以及測定所述結(jié)合劑與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的結(jié)合。所述方法還提供了從樣品中分離抗原呈遞細(xì)胞的方法，其包括使所述樣品接觸具 有CLEC9a親和力的結(jié)合劑，以及分離與所述結(jié)合劑結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。所述結(jié)合劑可 固定于固體載體(例如磁珠)上，以便于分離。從上述討論可知，所述抗原呈遞細(xì)胞通常是樹突細(xì)胞，并且可以能夠通過I類MHC 分子交叉呈遞胞外抗原。為了證實(shí)被所述CLEC9a結(jié)合劑識別的細(xì)胞是樹突細(xì)胞，或者為了在所述細(xì)胞接 觸CLEC9a結(jié)合劑之前富集樣品中的樹突細(xì)胞，所述方法可包括下列步驟使所述樣品接觸 具有樹突細(xì)胞標(biāo)志物親和力的第二結(jié)合劑，以及測定所述第二結(jié)合劑與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的 結(jié)合。所述兩種結(jié)合劑可以同時(shí)或以任何次序依次與所述細(xì)胞接觸。在一些實(shí)施方案中， 僅鑒定或分離與所述第一和第二結(jié)合劑都結(jié)合的細(xì)胞。所述樹突細(xì)胞標(biāo)志物可以是泛樹突細(xì)胞標(biāo)志物，例如rail，特別是⑶1 Ic (在小鼠 中)。對于人樹突細(xì)胞樣品，所述樹突細(xì)胞標(biāo)志物可以是HLA-DR?？赡芷谕C實(shí)所述細(xì) 胞是譜系陰性的，即它們不表達(dá)⑶3、⑶14、⑶19或⑶56。
對于人細(xì)胞樣品，可能期望證實(shí)所述CLEC9a結(jié)合劑鑒定的細(xì)胞還表達(dá)BDCA-3 (也 稱為⑶141或血栓調(diào)節(jié)素(thrombomodulin))。因此，所述方法可包括以下步驟使所述樣 品與具有BDCA-3親和力的另外的結(jié)合劑接觸，以及測定所述另外的結(jié)合劑與一個(gè)或多個(gè) 細(xì)胞的結(jié)合，和/或分離與所述另外的結(jié)合劑結(jié)合的細(xì)胞。所述CLEC9a和BDCA-3的結(jié)合 劑可同時(shí)或者以任何次序依次與所述細(xì)胞接觸。在一些實(shí)施方案中，僅鑒定或分離與兩種 結(jié)合劑都結(jié)合的細(xì)胞。作為補(bǔ)充或替代，可能期望通過負(fù)選擇一種或多種不想要的細(xì)胞類型來富集樣品 中期望的細(xì)胞類型。所述不想要的細(xì)胞類型可包括樹突細(xì)胞的其它亞群，例如漿細(xì)胞樣樹 突細(xì)胞(PDC)，其可通過⑶123或Ly6C負(fù)選擇來排除。負(fù)選擇可以在選擇表達(dá)CLEC9a的細(xì) 胞之前、同時(shí)或之后進(jìn)行。可以對⑶3、⑶14、⑶19和/或⑶56進(jìn)行負(fù)選擇。還可期望測定所述細(xì)胞上CLEC9a的表達(dá)水平。這使得可以僅選擇表達(dá)所需 CLEC9a水平(例如比另一群表達(dá)可檢出水平CLEC9a的細(xì)胞更高的CLEC9a水平)的細(xì)胞。 例如，不受理論的限制，認(rèn)為表達(dá)⑶8 (或者等同于人中的該亞群)的DC亞群比pDC表達(dá)更 高水平的CLEC9a。因此，可以通過僅選擇表達(dá)高于某閾值水平CLEC9a的細(xì)胞來選擇⑶8DC 或其等同物。所述結(jié)合劑可以帶有標(biāo)記以便于檢測和/或分離所述細(xì)胞，例如帶有能夠發(fā)射可 檢測信號的標(biāo)記(例如熒光或放射性標(biāo)記)或者帶有能夠與結(jié)合配偶體特異性結(jié)合的親和 標(biāo)簽。親和標(biāo)簽和結(jié)合配偶體的實(shí)例包括表位和對應(yīng)抗原，帶正電肽(例如聚His)和金屬 (例如鎳)離子，親和素/鏈霉親和素和生物素，糖和凝集素，等。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù) 其具體要求設(shè)計(jì)出合適的系統(tǒng)。所述細(xì)胞的鑒定或分離可包括使所述樣品接觸一種或多種能夠結(jié)合所述第一和/ 或第二結(jié)合劑的檢測劑。所述檢測劑自身可以如上所述進(jìn)行標(biāo)記。為了便于分離或檢測，所述結(jié)合劑或檢測劑可以固定于固體支持物上。本發(fā)明還提供了如上所述方法分離的抗原呈遞細(xì)胞群。通過這些方法分離的細(xì)胞可用于多種目的，包括體外研究和離體治療。例如，可以 用所需抗原對分離的細(xì)胞進(jìn)行體外脈沖刺激。然后，可以將所述細(xì)胞施用給對象，以刺激針 對所述抗原的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明還提供了一種刺激針對肽抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括提供通過 如上所述方法分離的抗原呈遞細(xì)胞或其群體，以及使所述細(xì)胞或細(xì)胞群接觸所述抗原。優(yōu)選地，所述抗原呈遞細(xì)胞在I類MHC分子背景下呈遞所述抗原或其片段。根據(jù)所述接觸步驟，所述細(xì)胞或細(xì)胞群可以施用給對象。優(yōu)選地，所述細(xì)胞重新施 用給其所來源的對象。如上所述，所述細(xì)胞或細(xì)胞群還可與佐劑接觸。接觸可發(fā)生在體外，例如在或大致 在接觸所述抗原的同時(shí)，或者在施用給接受對象之時(shí)或之后。與所述佐劑的接觸可刺激所 述細(xì)胞或細(xì)胞群活化或促進(jìn)T細(xì)胞應(yīng)答于所述抗原而增殖的能力。所述佐劑可以在相同或 不同的組合物中與所述細(xì)胞同時(shí)或者依次施用。所述免疫刺激佐劑可以是例如CD40激動 劑或TLR激動劑?？梢愿鶕?jù)所期望免疫應(yīng)答的性質(zhì)選擇所述佐劑的性質(zhì)。因此，例如，如果 期望是Thl7型⑶4T細(xì)胞應(yīng)答或者Treg應(yīng)答，則可相應(yīng)地選擇佐劑。因此，本發(fā)明提供了通過如上所述方法獲得的已引發(fā)的抗原呈遞細(xì)胞或其群體。“已引發(fā)的”是指所述細(xì)胞已經(jīng)接觸抗原，在MHC分子(優(yōu)選MHC I分子)背景下呈遞該抗 原或其表位，以及能夠作為其應(yīng)答而活化或刺激T細(xì)胞增殖并分化為效應(yīng)細(xì)胞。本發(fā)明還提供了通過如上所述方法獲得的用于醫(yī)療方法的，尤其用于刺激針對靶 標(biāo)抗原之免疫應(yīng)答的引發(fā)的抗原呈遞細(xì)胞或其群體。本發(fā)明還提供了通過如上所述方法獲 得的引發(fā)的抗原呈遞細(xì)胞或其群體用于制備刺激針對靶標(biāo)抗原之免疫應(yīng)答的藥物中的用 途?；蛘?，所述引發(fā)的細(xì)胞可以與T細(xì)胞在體外接觸，以產(chǎn)生所述抗原特異性的T細(xì)胞 (特別是CTL，但也可以是⑶4+T細(xì)胞，包括Thl7和Treg細(xì)胞)。因此，按照所述接觸步驟， 所述方法可包括使所述抗原呈遞細(xì)胞接觸包含一種或多種T細(xì)胞的細(xì)胞群?？梢允沟萌后w 中的T細(xì)胞在培養(yǎng)物中擴(kuò)增，以增加群體中所述抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量或比例。然后可 將所述T細(xì)胞施用給對象。任選地，所述T細(xì)胞在施用前與群體中的其它細(xì)胞分離。還可將所述細(xì)胞群與佐劑接觸，例如在基本上與它們接觸已引發(fā)抗原呈遞細(xì)胞的 同時(shí)進(jìn)行接觸。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞是自體的，S卩，它們來源于同一對象，或者來 自遺傳上相同的對象。所述T細(xì)胞可以再施用給它們(或其祖細(xì)胞)所來源的對象。同樣，在施用給對象時(shí)，佐劑也可以與T細(xì)胞一起施用。所述佐劑可以是例如CD40 激動劑(例如CD40特異性抗體)或TLR激動劑。所述佐劑可以在相同或不同的組合物中 與所述T細(xì)胞同時(shí)或者依次施用。因此，本發(fā)明還提供了通過如上所述方法獲得的T細(xì)胞或其群體。本發(fā)明還提供 了通過上述方法獲得的用于醫(yī)療方法的，尤其用于刺激針對靶標(biāo)抗原之免疫應(yīng)答的T細(xì)胞 或其群體。本發(fā)明還提供了通過如上所述方法獲得的T細(xì)胞或其群體用于制備刺激針對靶 標(biāo)抗原之免疫應(yīng)答的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了分離的表達(dá)CLEC9a的人樹突細(xì)胞群。所述群體可含有至少5、至 少10、至少100、至少1000或者至少10000個(gè)樹突細(xì)胞。優(yōu)選地，所述群體中至少50%、至 少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或者至少95 %的樹突細(xì)胞表達(dá)CLEC9a。出于此目 的，樹突細(xì)胞被認(rèn)為是譜系陰性的HLA-DR+細(xì)胞。譜系陰性細(xì)胞不表達(dá)⑶3、⑶14、⑶19或 CD56。所分離的群體可包含在含有其它細(xì)胞類型的樣品中，只要樣品中所需比例的樹突 細(xì)胞表達(dá)CLEC9a。因此，樣品可包含淋巴細(xì)胞(例如T細(xì)胞，尤其是CTL)或者不是樹突細(xì) 胞的其它類型抗原呈遞細(xì)胞。表達(dá)CLEC9a的樹突細(xì)胞通常是BDCA-3+。它們還可以是CD123\ CD34\ CD16-和 CDllb/V。因此，本發(fā)明還提供了一種刺激針對肽抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括提供表達(dá) CLEC9a的人樹突細(xì)胞群，以及使所述細(xì)胞群體接觸所述抗原。按照所述接觸步驟，表達(dá)CLEC9a的人樹突細(xì)胞群可施用給自體對象；S卩，它們施 用給其最初所來源的對象。如上所述，所述表達(dá)CLEC9a的人樹突細(xì)胞群還可與佐劑接觸。接觸可發(fā)生在體 外，例如在或大致在接觸所述抗原的同時(shí)，在施用給接受對象之前、之時(shí)或之后。與所述佐劑的接觸可刺激所述細(xì)胞群活化或促進(jìn)T細(xì)胞應(yīng)答于所述抗原而增殖的能力。所述佐劑可 以在相同或不同的組合物中與所述細(xì)胞同時(shí)或者依次施用。所述免疫刺激佐劑可以是例如 CD40激動劑或TLR激動劑?？梢愿鶕?jù)所期望免疫應(yīng)答的性質(zhì)選擇所述佐劑的性質(zhì)。因此， 例如，如果期望是Thl7型⑶4T細(xì)胞應(yīng)答或者Treg應(yīng)答，則可相應(yīng)地選擇佐劑。因此，本發(fā)明提供了已用抗原引發(fā)的表達(dá)CLEC9a的人樹突細(xì)胞群。“引發(fā)”是指所 述細(xì)胞已經(jīng)接觸抗原，在MHC分子(優(yōu)選MHC I分子)背景下呈遞該抗原或其表位，以及能 夠作為其應(yīng)答而活化或刺激T細(xì)胞增殖并分化為效應(yīng)細(xì)胞。本發(fā)明還提供了用于醫(yī)療方法的，尤其用于激活抗靶標(biāo)抗原的免疫應(yīng)答的已引發(fā) 的表達(dá)CLEC9a的人樹突細(xì)胞群。本發(fā)明還提供了表達(dá)CLEC9a的已引發(fā)的人樹突細(xì)胞群在 制備激活抗靶標(biāo)抗原的免疫應(yīng)答的藥劑中的用途?；蛘?，所述已引發(fā)的細(xì)胞可以與T細(xì)胞在體外接觸，以產(chǎn)生對所述抗原具有特異 性的T細(xì)胞(特別是CTL，但也可以是輔助性T細(xì)胞或者Treg)。因此，按照所述接觸步驟， 所述方法可包括使所述表達(dá)CLEC9a的人樹突細(xì)胞群接觸包含一種或多種T細(xì)胞的細(xì)胞群。 可以使得群體中的T細(xì)胞在培養(yǎng)物中擴(kuò)增，以提高群體中所述抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量或 比例。然后可將所述T細(xì)胞施用給對象。任選地，所述T細(xì)胞在施用前與群體中其它細(xì) 胞分離。如本發(fā)明的其它方面之中的，還可將所述樹突細(xì)胞和T細(xì)胞與佐劑接觸?？梢愿?據(jù)所期望免疫應(yīng)答的性質(zhì)選擇所述佐劑的性質(zhì)。因此，例如，如果期望是CTL應(yīng)答、Thl7型 ⑶4T細(xì)胞應(yīng)答或者Treg應(yīng)答，則可相應(yīng)地選擇佐劑。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞和樹突細(xì)胞是自體的，即，它們來源于同一對象，或者來自遺 傳上相同的對象。所述T細(xì)胞可以再施用給它們(或其祖細(xì)胞)所來源的對象。同樣，佐劑也可與所述T細(xì)胞一起施用。所述佐劑可以是例如CD40激動劑(例如 CD40特異性抗體)或TLR激動劑。所述佐劑可以在相同或不同的組合物中與所述T細(xì)胞同 時(shí)或者依次施用。因此，本發(fā)明還提供了通過如上所述方法獲得的T細(xì)胞或其群體。本發(fā)明還提供 了通過上述方法獲得的用于醫(yī)療方法的，尤其用于刺激針對靶標(biāo)抗原之免疫應(yīng)答的T細(xì)胞 或其群體。本發(fā)明還提供了通過如上所述方法獲得的T細(xì)胞或其群體在制備用于刺激針對 靶標(biāo)抗原之免疫應(yīng)答的藥物中的用途。在所有上述方面中，所述抗原可以是任何需要激活針對其的免疫應(yīng)答(特別是 CTL應(yīng)答、Thl7型應(yīng)答或Treg應(yīng)答)的抗原。例如，所述抗原可以是胞內(nèi)病原體或寄生生 物表達(dá)的抗原，或者可以是癌細(xì)胞表達(dá)的，如說明書其它部分所述?；蛘?，它可以是這樣的 抗原發(fā)生了針對該抗原的不期望或不適當(dāng)?shù)膽?yīng)答(例如在自身免疫病中)，以及期望刺激 針對該抗原刺激Treg應(yīng)答。CLEC9a結(jié)合哺乳動物細(xì)胞之上或之中存在的配體而不是傳染原，這一出人意料的 發(fā)現(xiàn)還導(dǎo)致得到了用于鑒定所述配體的測定。因此，本發(fā)明提供了篩選CLEC9a生理配體的方法，其包括使靶物質(zhì)接觸測試物 質(zhì)，以及測定所述靶物質(zhì)與所述測試物質(zhì)的結(jié)合，其中所述靶物質(zhì)包含CLEC9a胞外結(jié)構(gòu)域 或其足以結(jié)合CLEC9a配體的部分，所述測試物質(zhì)是哺乳動物細(xì)胞的組分。
結(jié)合可指示所述測試物質(zhì)是CLEC9a的生理配體。當(dāng)結(jié)合發(fā)生時(shí)，所述方法還可包括鑒定所述測試物質(zhì)的步驟。認(rèn)為CLEC9a的配體在一些或所有健康哺乳動物細(xì)胞中組成型表達(dá)，但在細(xì)胞保 持健康時(shí)無法與CLEC9a相互作用。某些類型的細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡(尤其在具有免疫原 性時(shí)，例如原發(fā)或繼發(fā)性壞死)造成所述配體以使其變得能夠與樹突細(xì)胞上CLEC9a相互作 用的方式暴露出來。因此，所述測試物質(zhì)可以是哺乳動物細(xì)胞(例如，沒有被胞內(nèi)寄生生物或病原體 感染的健康哺乳動物細(xì)胞)的胞內(nèi)組分。它可包含蛋白質(zhì)、糖、脂類或核酸。它可包含多于 一種的這些組分，例如，它可以是包含糖和脂類組分的糖基化蛋白，包含脂類和蛋白質(zhì)(和 任選的糖)組分的脂類錨定蛋白，或者包含脂類和糖組分的糖脂。應(yīng)理解，所述測試物質(zhì)可以不包含在生理?xiàng)l件下存在于哺乳動物細(xì)胞中的完整分 子或物質(zhì)，而是可以包含其足以與CLEC9a相互作用的部分。例如，所述測試物質(zhì)可包含分 離的結(jié)構(gòu)域，或者甚至來自細(xì)胞蛋白質(zhì)的肽(例如5至10個(gè)氨基酸、多達(dá)20個(gè)氨基酸、多 達(dá)50個(gè)氨基酸，或者多達(dá)100個(gè)氨基酸)。通常，所述測試物質(zhì)與所述靶物質(zhì)中所存在的CLEC9a(或其部分)來自相同的哺 乳動物物種。所述方法可包括使所述靶物質(zhì)與包含所述測試物質(zhì)的樣品(例如液體樣品，如含 水樣品)接觸的步驟。所述靶物質(zhì)可以在溶液中提供(例如在水溶液中)或者可以固定于固體載體上。所述樣品可包含經(jīng)透化的哺乳動物細(xì)胞?！巴富敝纲|(zhì)膜對通常不能穿過質(zhì)膜之物 質(zhì)的擴(kuò)散變得通透(而不是被細(xì)胞主動攝取)。通常使用在正常條件下質(zhì)膜對其不通透的 染料例如碘化丙錠和T0-PR03測試質(zhì)膜完整性/通透性。因此，質(zhì)膜可對這些物質(zhì)通透。例 如，可以對分子量高于500Da、高于lkDa、高于10kD、高于50kDa、高于IOOkDa或者甚至更高 的物質(zhì)通透。本文中術(shù)語“透化”用于表示細(xì)胞基本上保持其細(xì)胞結(jié)構(gòu)(除了提高質(zhì)膜(和 細(xì)胞內(nèi)可能的其他膜)的通透性之外)以使各個(gè)細(xì)胞仍可區(qū)分(例如通過顯微鏡)。術(shù)語 “裂解物”、“提取物”或“勻漿”可用于下列制備物，所述制備物中細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞到個(gè)體細(xì) 胞不再可區(qū)分或者不再存在的程度。經(jīng)透化的細(xì)胞可以是壞死的。壞死可以是原發(fā)或繼發(fā)性壞死。原發(fā)性壞死可以通 過(例如)照射(例如用電離輻射，如紫外光)、血清除去、至少一次凍/融循環(huán)或者通過壞 死誘導(dǎo)化學(xué)品如蒽環(huán)類(例如多柔比星和柔紅霉素)和蒽醌類(比如米托蒽醌)的處理來 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)。當(dāng)被誘導(dǎo)進(jìn)入凋亡的細(xì)胞不被鄰近細(xì)胞吞噬時(shí)發(fā)生繼發(fā)性壞死，隨后質(zhì) 膜被破壞?；蛘?，可用破壞質(zhì)膜或者在質(zhì)膜中形成孔的物質(zhì)對健康細(xì)胞直接進(jìn)行透化。合適 的透化劑包括造孔劑例如皂苷(如β _七葉皂苷)，其沉淀膽固醇，由此將其從膜中除去而 增加其通透性，多種細(xì)菌毒素如溶細(xì)胞素(例如來自金黃色葡萄球菌的鏈溶素-ο)以及來 自金黃色葡萄球菌的α-毒素以及去污劑例如Triton X-100、Bri j_96、吐溫等等。任選地，所述細(xì)胞可在透化之前或之后被固定?？蓛?yōu)選透化之前的固定，以減少透 化后配體從細(xì)胞中喪失的可能性(例如通過擴(kuò)散)。固定可以用有機(jī)溶劑比如丙酮、甲醇、 乙醇或其混合物進(jìn)行(其通常除去脂類并使細(xì)胞脫水，同時(shí)將細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的蛋白質(zhì)沉淀)和/或用交聯(lián)劑例如甲醛(例如福爾馬林的形式)或者多聚甲醛進(jìn)行(其將細(xì)胞組分例如 蛋白質(zhì)等通過這些細(xì)胞組分上存在的游離活性基團(tuán)如氨基進(jìn)行交聯(lián))。當(dāng)所述樣品包含透化細(xì)胞時(shí)，所述方法可包括通過檢測靶物質(zhì)而確定靶物質(zhì)結(jié)合 所發(fā)生的亞細(xì)胞定位的步驟。檢測可以是直接或間接的。例如，所述靶物質(zhì)可包含標(biāo)記，所述方法可包括確定所 述標(biāo)記的亞細(xì)胞定位的步驟?；蛘?，所述方法可包括使所述靶物質(zhì)與檢測劑接觸的另外步 驟，所述檢測劑可以是能夠結(jié)合所述靶物質(zhì)的結(jié)合劑。所述檢測物質(zhì)自身可包含標(biāo)記?？?以通過任何合適技術(shù)實(shí)現(xiàn)檢測，例如顯微術(shù)，如共聚焦顯微術(shù)。例如，所述標(biāo)記可以是發(fā)熒 光的?；蛘撸鰳悠房梢允?或者可包含)哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞裂解物、提取物或亞細(xì) 胞級分。例如，它可包含全細(xì)胞裂解物，或者在完好的健康細(xì)胞中不暴露于外界環(huán)境的亞細(xì) 胞級分。例如，所述樣品可包含分離的細(xì)胞質(zhì)級分、分離的核級分、分離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)級分、分離 的高爾基體級分或者分離的線粒體級分。在此語境中“分離的”表示與完整細(xì)胞的至少一 種其它正常組分(例如質(zhì)膜)相分離。這些級分中的亞細(xì)胞器例(如核或線粒體)可以是 完好的或者破壞的。與第一樣品的陽性結(jié)合反應(yīng)之后，所述第一樣品可進(jìn)一步分級，提供缺少所述第 一樣品中所存在的一種或多種組分的第二樣品。然后重復(fù)該方法。這可有助于鑒定結(jié)合所 述靶物質(zhì)的測試物質(zhì)。此方法可使用越來越小的級分重復(fù)所需的次數(shù)。作為補(bǔ)充或替代，該方法可包括分離含有所述靶物質(zhì)和所述測試物質(zhì)的復(fù)合物的 步驟。這可以通過分離所述靶物質(zhì)所結(jié)合的固體支持物(例如珠)來實(shí)現(xiàn)?；蛘?，可以利 用能夠結(jié)合所述靶物質(zhì)的結(jié)合劑。所述結(jié)合劑可以固定于固體支持物上。所述靶物質(zhì)可以 包含特異性結(jié)合對的成員，所述結(jié)合劑可包含所述特異性結(jié)合對的另一成員。例如，所述結(jié) 合劑可以是對所述靶物質(zhì)具有特異性的抗體?；蛘?，所述結(jié)合劑和靶物質(zhì)之一可包含親和 素/鏈霉親和素部分，而另一個(gè)包含生物素部分。術(shù)語“特異性結(jié)合對”用于描述一對分子，其包括特異性結(jié)合成員(sbm)和其結(jié)合 配偶體(bp)，它們對彼此具有特殊的特異性，并且在正常條件下與其它分子相比優(yōu)先彼此 結(jié)合。特異性結(jié)合對的實(shí)例是抗體及其對應(yīng)表位/抗原，配體(例如激素等)和受體，親和 素/鏈霉親和素和生物素，凝集素和糖，以及互補(bǔ)核苷酸序列。為了便于分離，單個(gè)結(jié)合劑可以是多價(jià)的，即能夠同時(shí)結(jié)合多于一種靶物質(zhì)。如果 所述靶物質(zhì)也是多價(jià)的(即能夠同時(shí)結(jié)合多于一種的相同類型結(jié)合劑)，則可形成交聯(lián)的 復(fù)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員十分了解可使用的合適技術(shù)，例如免疫沉淀技術(shù)。例如，所述靶物質(zhì)可以是可溶性分子，其包含與親和素單體相聯(lián)合(例如與其綴 合或形成融合蛋白)的CLEC9a胞外結(jié)構(gòu)域，或由其組成。親和素單體通常會聯(lián)合成為四聚 物，提供包含四個(gè)CLEC9a結(jié)構(gòu)域和四個(gè)親和素亞基的結(jié)合劑。因此，在本文所述測定中，該 結(jié)構(gòu)可與測試物質(zhì)形成復(fù)合物，然后可通過與生物素相接觸而分離，生物素可存在于固體 支持物例如珠上?；蛘撸鰷y試物質(zhì)可以固定于固體支持物上，例如膜、微滴定板或者微陣列芯 片?？蓪⑺鲋С治锱c所述靶物質(zhì)相接觸，并確定任何已結(jié)合靶物質(zhì)的位置。
可能期望測試多種懷疑含有CLEC9a配體的樣品(如不同的細(xì)胞級分)，以觀察它 們中的任一種是否確實(shí)含有能夠結(jié)合所述靶物質(zhì)的物質(zhì)。作為補(bǔ)充或替代，可能期望測試 多種已知物質(zhì)(如蛋白質(zhì))，以觀察它們中的任一種是否能夠結(jié)合所述靶物質(zhì)。因此，單個(gè)固體支持物可僅僅包含一種樣品或測試物質(zhì)，或者可攜帶多種樣品或 測試物質(zhì)，其各自位于所述支持物上的確定位置。根據(jù)測定的形式，所述方法可包括鑒定發(fā)生陽性結(jié)合反應(yīng)的特定支持物的步驟， 或者鑒定支持物上發(fā)生陽性結(jié)合反應(yīng)的位置的步驟。因此，這可以揭示含有導(dǎo)致陽性反應(yīng) 之測試物質(zhì)的樣品的性質(zhì)，或者可直接顯示所述測試物質(zhì)的身份?；蛘?，可以從所述固體支持物上分離所述測試物質(zhì)與所述靶物質(zhì)的復(fù)合物，進(jìn)行 進(jìn)一步的分析以鑒定所述測試物質(zhì)。不論測定的形式如何，當(dāng)測試物質(zhì)是蛋白質(zhì)時(shí)，均可以使用蛋白質(zhì)組技術(shù)來鑒定 測試物質(zhì)。這通常將質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫檢索相結(jié)合?？捎靡环N或多種具有已知靶標(biāo)切割序列的 蛋白酶對測試物質(zhì)(或測試物質(zhì)與靶物質(zhì)的復(fù)合物)進(jìn)行消化，產(chǎn)生具有已知N或C端殘 基的肽(根據(jù)所用的具體蛋白酶)。然后，對所得肽進(jìn)行質(zhì)譜分析(例如MALDI-T0F)以確 定其分子量。隨后，檢索合適的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，以鑒定能夠產(chǎn)生這些肽的蛋白質(zhì)?；蛘撸蓪⑺鰷y試物質(zhì)展示于細(xì)胞或病毒的表面上。例如，可使用噬菌體展示技 術(shù)在噬菌體表面上展示測試物質(zhì)或其片段?；蛘?，可改造細(xì)胞以在其表面展示測試物質(zhì)。或 者，測試物質(zhì)與靶物質(zhì)之間的相互作用可在細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中發(fā)生，并且可誘導(dǎo)可 檢出反應(yīng)，例如報(bào)告基因的表達(dá)。這些系統(tǒng)的實(shí)例有酵母雙雜交系統(tǒng)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員 了解依賴于兩蛋白質(zhì)之間“餌_捕食者”相互作用來驅(qū)動報(bào)告基因表達(dá)的其它系統(tǒng)。當(dāng)所 述核酸編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，這些形式可用于篩選核酸分子群 (例如cDNA文庫)，以鑒定編碼可與靶物質(zhì)(如果存在的話)結(jié)合之物質(zhì)的核酸分子。在 這些形式中，所述方法可包括分離(例如克隆)導(dǎo)致陽性結(jié)果的核酸以及確定該核酸所編 碼蛋白質(zhì)之身份的步驟。當(dāng)所述測試物質(zhì)不是蛋白質(zhì)時(shí)，可使用其它分析技術(shù)。下面，通過舉例并非限制地，參考附圖和實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。


圖1顯示了人CLEC9a蛋白的cDNA和氨基酸序列。圖2顯示了小鼠CLEC9a蛋白的cDNA和氨基酸序列。圖3顯示了人Phoenix細(xì)胞中表達(dá)的小鼠CLEC9a蛋白的檢測。在還原(R)和非 還原(NR)條件下使用抗CLEC9a對來自表達(dá)CLEC9a之Phoenix細(xì)胞(FNX-C9)或親本細(xì)胞 (FNX)的全裂解物進(jìn)行Western印跡。圖4顯示在脾DC和體外培養(yǎng)的BMDC中小鼠CLEC9a轉(zhuǎn)錄本的分布。根據(jù)下文所 示方法，使用CLEC9a特異性引物(上圖)或β-肌動蛋白引物(下圖)對來自脾DC亞群 或者來自純化GMCSF或Flt3L-BMDC亞群的mRNA進(jìn)行RT-PCR。圖5顯示了在此研究中產(chǎn)生的⑶3(-NKRPl_CLEC9a嵌合體，顯示了該嵌合分子中 存在的結(jié)構(gòu)域，其具有CLEC9a的胞外結(jié)構(gòu)域、NKRPl的跨膜結(jié)構(gòu)域以及CD3 ζ的胞質(zhì)結(jié)構(gòu) 域。
圖6顯示原代細(xì)胞中的CLEC9a表達(dá)。用生物素-抗CLEC9a (粗線，10mg/ml)或者 生物素-大鼠IgGl (細(xì)線，同種型對照)對脾細(xì)胞染色，然后用鏈霉親和素-PE(1 1000) 染色，用⑶11c、⑶4、⑶8或Ly6C復(fù)染。柱狀圖顯示⑶Ilc陰性細(xì)胞和⑶Ilc陽性細(xì)胞的染 色，然后在常規(guī)DC的⑶4/⑶8亞群中或者在對應(yīng)于pDC的Ly6C+亞群中進(jìn)一步分析。圖7是顯示使用CLEC9a胞質(zhì)肽進(jìn)行的Syk阻滯(pull down)實(shí)驗(yàn)的Western印 跡圖。如方法中所示，使用對應(yīng)于CLEC9a胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的生物素化肽或Dectin-I對照來阻 滯重組Syk。圖8顯示用抗CLEC9a進(jìn)行的激酶活化。用涂板的抗體將表達(dá)CLEC9a的LK細(xì)胞 活化所示時(shí)間，然后將其裂解，使用抗P-Syk或抗P-Erk抗體進(jìn)行SDS-PAGE和WB，以檢測這 些途徑的活化。使用抗Syk或抗Erk的蛋白質(zhì)對照顯示總的激酶。圖9顯示抗CLEC9a雜交瘤誘導(dǎo)細(xì)胞因子。用所示雜交瘤培養(yǎng)表達(dá)CLEC9a的LK 細(xì)胞(IO5個(gè)細(xì)胞/孔)，然后收集上清液，檢測IL-2。圖10顯示涂板的抗CLEC9a在Syk存在下通過CLEC9a的WT尾誘導(dǎo)NFAT活 性，并且依賴于Y7的存在。表達(dá)CLEC9a-CD3 4 (σ )的Β3Ζ，或者表達(dá)CLEC9a_WT(ν)或 CLEC9a-Y7F(A)的B3Z_Syk。如下文方法中所示檢測NFAT活性。X軸顯示用于包被平板的 抗CLEC9a抗體濃度(微克/毫升)。圖11顯示固定在塑料上的抗Clec9a抗體誘導(dǎo)Flt3L BMDC中IL12_23p40蛋白的 產(chǎn)生。將Flt3L BMDC孵育在用抗CLEC9a mAb包被的平板上，分析過夜培養(yǎng)后 的上清液中 的 IL12-23p40。圖12顯示使用抗CLEC9a_Sl mAb在體內(nèi)靶向⑶lie+⑶8+。靜脈注射Sl綴合的抗 CLEC9a或同種型對照mAb (5微克)，第二天根據(jù)方法中所述對脾細(xì)胞進(jìn)行處理。A和B 將 ⑶Ilc陽性和陰性脾細(xì)胞與CFSE標(biāo)記的OT-I細(xì)胞一起培養(yǎng)4天。A 在25X IO3個(gè)被靶向 的⑶Ilc-或者⑶Ilc+脾細(xì)胞存在下OT-I細(xì)胞的CFSE譜。B 左圖每個(gè)孔中OT-I細(xì)胞的 絕對數(shù)；右圖在擴(kuò)增的OT-I細(xì)胞上清液中的IFN- γ產(chǎn)生。C和D.將Sl抗CLEC9a靶向 小鼠中的 CDllc+ 脾細(xì)胞分選為CDllc+B220-CD8+(CD8+DC)、CDllc+B220_CD4+(CD4+DC)和 CDllc+B220-CD4-CD8- (DN DC)，并與 CFSE 標(biāo)記的 OT-I 細(xì)胞一起培養(yǎng) 3 天。C 在 25 X IO3 個(gè) 被靶向的CD8+，DN, CD4+DC存在下OT-I細(xì)胞的CFSE譜；D 左圖每個(gè)孔中OT-I細(xì)胞的絕 對數(shù)；右圖在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)上清液中的IFN-Y產(chǎn)生。圖13顯示通過使用抗CLEC9a mAb進(jìn)行靶向來誘導(dǎo)CTL免疫。A 如方法中所示， 將Sl綴合的抗CLEC9a或同種型對照mAb與或不與抗CD40 —起皮下注射。五天后，靜脈注 射載有 20nM(0. 03yMCFSE)、200nM(0. 3μΜ CFSE) SIINFEKL 或者不載有肽(3 μ M CFSE)的 靶細(xì)胞(同類系CD45. 1)。結(jié)果表示為在體內(nèi)殺傷測定中高劑量肽特異性裂解的算術(shù)平均 值士SEM(相比于對照，DEC205和CLEC9a為η = 5，p < 0. 001。單因素ANOVA)。B 使用與 或不與抗CD40 —起施加的S2綴合的同種型對照或抗CLEC9a進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖14顯示抗CLEC9a+抗⑶40在治療B16黑素瘤上的治療作用。A 使用 B16-0VA-GFP黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行的腫瘤治療實(shí)驗(yàn)的時(shí)程。在第0天靜脈內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞 (2 X IO5個(gè))，在第6天進(jìn)行Ab-Sl+抗⑶40的治療，在第18天摘除肺并對腫瘤計(jì)數(shù)。B 顯 示在一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)中每個(gè)小鼠的腫瘤計(jì)數(shù)。使用抗CLEC9a或者抗DEC205加抗CD40，腫 瘤負(fù)荷的減少是顯著的(P < 0. 001，單因素AN0VA)。
圖15顯示人CLEC9a表達(dá)僅限于BDCA-3+血DC中。(A)用抗hCLEC9a (8F9)或 者同種型匹配對照抗體(小鼠IgG2a)對人PBMC染色，針對多個(gè)血淋巴細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行復(fù) 染。柱狀圖顯示對T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、譜系陰性HLA-DR-細(xì)胞和譜系陰性 HLA-DR+細(xì)胞的CLEC9a染色。數(shù)字表示在后一級分中hCLEC9a+細(xì)胞的百分比。(B)在來自 (A)的PBMC中對譜系陰性HLA-DR+細(xì)胞設(shè)置門控。點(diǎn)圖顯示用抗CLEC9a或者針對多種血 液DC亞群標(biāo)志物的同種型匹配對照mAb進(jìn)行的染色。數(shù)字代表每個(gè)象限中的細(xì)胞％。只 對于BDCA-3+DC可見特異性染色。四個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。圖16顯示通過將腫瘤抗原靶向CLEC_9a進(jìn)行的B16黑素瘤的免疫治療。如圖所 示(左上)，使用包含與抗CLEC9a或者同種型匹配對照抗體共價(jià)結(jié)合的內(nèi)源性黑素細(xì)胞分 化抗原已知表位的肽(“EndO”:gpl00、TRP-l和TRP-2)進(jìn)行腫瘤治療實(shí)驗(yàn)。Poly I:C+抗 CD40用作佐劑。左下圖顯示根據(jù)所示治療的小鼠肺的代表性圖片。右圖顯示在每個(gè)小鼠 中肺部腫瘤的數(shù)量。數(shù)據(jù)匯集自兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)(η = 9只小鼠/組)，每個(gè)點(diǎn)代表一只小 鼠。(B)將來自(A)中各個(gè)小鼠的脾細(xì)胞在體外再次被用于免疫的黑素細(xì)胞分化抗原肽刺 激(ΙΟμΜ)。顯示培養(yǎng)兩天后的IFN-Y水平。數(shù)據(jù)匯集自兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)(η = 9只小鼠 /組)。使用Marm Whitney U檢驗(yàn)計(jì)算ρ值。(C)如圖16中所示進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同在于在輸 注Β16細(xì)胞前一天給予疫苗。數(shù)據(jù)顯示每只小鼠的肺部腫瘤數(shù)。數(shù)據(jù)匯集自兩個(gè)獨(dú)立的實(shí) 驗(yàn)(η = 7只小鼠/組)，每個(gè)點(diǎn)代表一只小鼠，使用Marm Whitney U檢驗(yàn)計(jì)算ρ值。圖17顯示CLEC9A結(jié)合瀕死/死亡細(xì)胞上的配體。(A)BWZ-小鼠和人CLEC9A ζ 報(bào)告子的基礎(chǔ)激活與死T0-PR03+細(xì)胞數(shù)相關(guān)。產(chǎn)生BWZ細(xì)胞以篩選CLEC9A的天然配體， 所述細(xì)胞表達(dá)與LacZ偶聯(lián)的NFAT報(bào)告子，并且穩(wěn)定表達(dá)具有來自小鼠或人CLEC9A或?qū)φ?Dectin-I的胞外結(jié)構(gòu)域和來自CD3 ζ的胞內(nèi)尾的嵌合分子。在不同的細(xì)胞濃度下生長兩 天，顯示出不同程度的過度生長，通過TO-PRO 3染色顯示培養(yǎng)物中的死細(xì)胞增加。然后，將 相同量的活BWZ細(xì)胞鋪于新鮮培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，在顯色測定中測量BWZ細(xì)胞中的NFAT 活性，如方法中所示。(B)使經(jīng)UVC-處理的死細(xì)胞接觸CLEC9A配體。將活MEF(對照)或用UVC處 理并留置24小時(shí)以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的MEF與表達(dá)嵌合小鼠CLEC9A- ζ、人CLEC9A- ζ和 Dectin-I-ζ的BWZ NFAT報(bào)告細(xì)胞一起培養(yǎng)。在所示時(shí)間，向培養(yǎng)物中加入對照(ρ21)或 抗mCLEC9A(lF6)或抗hCLEC9A (8F9)的一價(jià)Fab片段。如(A)所述測定BWZ細(xì)胞中的NFAT 活性。(C)UV處理細(xì)胞中的劑量應(yīng)答。如方法中所示將LK細(xì)胞暴露于不同劑量的UVC， 留置24小時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，然后與表達(dá)mCLEC9A- ζ嵌合體的BWZ細(xì)胞或?qū)φ誃WZ —起培 養(yǎng)。如(A)中所述測定BWZ細(xì)胞中的NFAT活性。(D) CLEC9A的重組可溶性C型凝集素結(jié)構(gòu)域(rsCTLD)選擇性識別T0-PR03+死細(xì) 胞所暴露出的分子。將CLEC9A或Dectin-I (作為對照)的rsCTLD的PE-四聚體用于使經(jīng) UV照射的永生化MEF染色(散點(diǎn)圖)。柱狀圖顯示酵母多糖染色，Dectin-IrsCTLD為陽性。(E)不同的死亡誘導(dǎo)處理引發(fā)了 BWZ-CLEC9A(報(bào)告細(xì)胞。將BWZ-CLEC9A ζ細(xì)胞 單獨(dú)過夜培養(yǎng)(對照)或者與未處理LK細(xì)胞一起培養(yǎng)(LK)或者與用UVC處理(UV)、米托 蒽醌(Mtx)、血清除去(SD)、滲透壓脅迫(OS)或凍融(FT)處理的LK細(xì)胞一起培養(yǎng)。顯示 BffZ報(bào)告子活性(左側(cè)y軸)和開始共培養(yǎng)時(shí)LK細(xì)胞中的to-pro 3+和CLEC9A rsCTLD+頻率(右側(cè)y軸)。(F)使用CLEC9A rsCTLD的PE四聚體進(jìn)行的死亡MEF染色。用UV處理MEF并留 置24小時(shí)或者用滲透壓脅迫(OS)處理，然后染色。(A)-(F)進(jìn)行的至少三次實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。圖18顯示CLEC9A參與體外⑶8 α +DC對瀕死細(xì)胞的交叉引發(fā)。(A)、(B)CLEC9A的阻斷導(dǎo)致死細(xì)胞相關(guān)抗原對OT-I細(xì)胞的交叉引發(fā)受損。(A)在 存在或不存在抗CLEC9A Fab (1F6)或?qū)φ誇ab(p21)時(shí)，將OT-IOVA特異性T細(xì)胞與用載有 OVA的死亡bml脾細(xì)胞刺激的⑶8 α -樣Flt3L BMDC 一起培養(yǎng)。三天后，測定增殖(0Τ-Ι細(xì) 胞的絕對數(shù))、IL-2和IFNy產(chǎn)生(相對于未處理對照的％產(chǎn)生)。顯示六個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè) 代表性實(shí)驗(yàn)。(B)所進(jìn)行的六個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的平均11^-2和正^^產(chǎn)生以抗0^09々Fab (1F6) 或?qū)φ誇ab (p21)相比于未處理對照的％產(chǎn)生顯示。(C) CLEC9A+和WT⑶8 α -樣Flt3L BMDC具有相同的捕獲瀕死細(xì)胞材料的能力。 WT或CLEC9A+CD8 α -樣Flt3L BMDC與用PKH26-標(biāo)記且經(jīng)UVC處理的bml脾細(xì)胞以不同 比例一起孵育2小時(shí)。然后，通過流式細(xì)胞術(shù)對每種類型DC的結(jié)合(4°C)和結(jié)合+攝取 (370C )進(jìn)行定量。(D)在與表達(dá)OVA或載有OVA的bml死細(xì)胞刺激的CLEC9A+Flt3L BMDC 一起孵育 后，擴(kuò)增和向效應(yīng)OT-I細(xì)胞的分化受損。CLEC9A+Flt3L BMDC與經(jīng)UVC處理的載有OVA的 bml脾細(xì)胞或經(jīng)UVC處理的表達(dá)OVA的bmlMEF —起培養(yǎng)。然后，加入OVA特異性O(shè)T-I T細(xì) 胞，共培養(yǎng)3天后，測定OT-I細(xì)胞的絕對數(shù)(左圖)或IFN-Y (右圖)。結(jié)果顯示每組兩只 小鼠的平均值+SEM。顯示了所進(jìn)行的三個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。 (E)如(D)中所述與經(jīng)表達(dá)OVA的UV致死bmlMEF刺激的CLEC9A+Flt3L BMDC 一 起孵育后，OT-I細(xì)胞的分化受損。顯示了使用相同測定分析的四組中的每組一個(gè)代表性小 鼠°圖19顯示CLEC9A感知免疫原性細(xì)胞死亡，以促進(jìn)體內(nèi)交叉引發(fā)。(A)、⑶CLEC9A阻斷降低了體內(nèi)對死細(xì)胞相關(guān)抗原的交叉引發(fā)。用0. 75 X IO6個(gè)經(jīng) UV照射的表達(dá)截短OVA-GFP融合蛋白的bmlMEF，對用抗CLEC9A (1F6，400 μ g/小鼠)或同 種型對照(大鼠IgGl)處理或未處理的小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)免疫。六天后，測定H2Kb-0VA肽四 聚體陽性細(xì)胞㈧和響應(yīng)于SIINFEKL的離體IFNγ產(chǎn)生(B)，作為從內(nèi)源產(chǎn)生的誘導(dǎo)⑶8+T 細(xì)胞效應(yīng)子應(yīng)答的讀數(shù)。顯示了(三個(gè)實(shí)驗(yàn)中的)一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)的各個(gè)小鼠和平均值。(C) - (E) CLEC9A缺乏降低了體內(nèi)對死細(xì)胞相關(guān)抗原的交叉引發(fā)。將CLEC9a+小鼠 或?qū)φ胀C出生仔如(A)所述進(jìn)行免疫。如(A)所述對OVA特異性內(nèi)源CD8+T細(xì)胞的頻率 (C-D)進(jìn)行定量。(C)每個(gè)點(diǎn)表示從6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中匯集并按照方法中所示進(jìn)行歸一化的 各個(gè)小鼠。(D)顯示CLEC9a+和CLEC9a+小鼠的每窩中四聚體陽性細(xì)胞的平均值。(E)如 (B)中所述測定的應(yīng)答于SIINFEKL的離體IFNγ產(chǎn)生。顯示了(三個(gè)之中的)一個(gè)代表性 實(shí)驗(yàn)的各個(gè)小鼠和平均值。圖20顯示在固定/透化之后CLEC9a的配體被暴露出來。用2%的甲醛或者2% 多聚甲醛固定LK細(xì)胞，用或者不用吐溫(0.5%)和Tx-IOO (0.5% )進(jìn)行透化。徹底清洗 細(xì)胞，使用To-pro 3對透化的細(xì)胞進(jìn)行定量。將固定或者固定-透化的細(xì)胞與表達(dá)嵌合小 鼠CLAC9a-CD3 ζ的BWZ NFAT報(bào)告細(xì)胞或?qū)φ展才囵B(yǎng)，測定NFAT活性。
圖21顯示通過CLEC9a wt胞質(zhì)尾的死細(xì)胞信號。使LK細(xì)胞暴露于不同劑量的 UVC，如方法中所示，留置24小時(shí)，以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，然后與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CLEC9a wt或Tyr7突 變?yōu)镻he(Y7F)的CLEC9a的B3Z細(xì)胞(有或沒有共表達(dá)Syk) —起培養(yǎng)。如方法中所示，測 定B3Z細(xì)胞中的NFAT活性。圖22中，F(xiàn)ab—價(jià)和完整二價(jià)抗CLEC9a抗體均通過CLEC9a阻斷死細(xì)胞信號。 將用UVC處理并留置24小時(shí)以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的LK細(xì)胞與B3Z細(xì)胞一起培養(yǎng)，所述B3Z 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 CLEC9a wt或者Tyr7突變?yōu)镻he (Y7F)的CLEC9a，并且共表達(dá)Syk或 B3Z-DeCtin-l-4作為對照。在所示時(shí)間，向培養(yǎng)物中添加對照(p21)或抗CLEC9a(lF6) 的一價(jià)Fab片段或者完整二價(jià)抗體，包括同種型對照(大鼠IgGl，大鼠IgG2a)和抗 mCLEC9a(lF6，397，7Hll)。如方法中所示，測定B3Z細(xì)胞中的NFAT活性。圖23顯示應(yīng)答于抗CLEC9a-0VA323-339的OVA特異性0T-IICD4T細(xì)胞增殖。將 用幼稚CFSE標(biāo)記的OT-II⑶4T細(xì)胞靜脈內(nèi)轉(zhuǎn)移到C57BL/6小鼠體內(nèi)。一天后，在爪中皮 下接種與抗CLEC9a或同種型對照抗體綴合的0VA323-339。三至四天后，收集脾和排泄淋巴 結(jié)(draining lymph node)，在CFSE稀釋后追蹤OT-II細(xì)胞的體內(nèi)增殖。顯示了 OT-II的 絕對數(shù)，在樣品之間歸一化。圖24顯示在體內(nèi)靶向過程中加入佐劑誘導(dǎo)了強(qiáng)Thl應(yīng)答。在佐劑(0Τ-ΙΙ系統(tǒng)) 存在或不存在時(shí)的體內(nèi)靶向。如圖23中所示處理小鼠。上圖0VA特異性CD4T細(xì)胞的絕對 數(shù)(歸一化后)。下圖=OT-II⑶4T細(xì)胞群中的IFN-Y產(chǎn)生，表示為百分比(左)或絕對 數(shù)(右，歸一化之后)。在聚I:C存在下觀察到的對增殖和分化的影響不僅限于這種佐劑。 可得然膠具有類似作用。圖25顯示，與所述靶試劑共同注射的佐劑/免疫調(diào)節(jié)劑類型可調(diào)節(jié)CD4T細(xì)胞應(yīng) 答。存在或不存在佐劑時(shí)的體內(nèi)靶向。如圖24中所示進(jìn)行OT-II系統(tǒng)。上圖0Τ-ΙΙ⑶4Τ 細(xì)胞群中的IL-17產(chǎn)生，其表示為百分比(左)或絕對數(shù)(右，歸一化后)。在與靶標(biāo)抗原 一起施用時(shí)，可得然膠(一種Dectin-I激動劑)作為Thl7極化的強(qiáng)佐劑。圖26顯示，不存在佐劑時(shí)的靶向?qū)е驴乖禺愋阅褪?。將幼稚OVA特異性 DO. 11. 10⑶4T細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)BALB/c小鼠。一天后，在存在或不存在佐劑(聚I:C)時(shí)在爪中 皮下接種抗CLEC9a-0VA 323-339。在免疫后不同時(shí)間點(diǎn)，通過流式細(xì)胞術(shù)使用KJ. 126克隆 型抗體測定脾DO. 11. 10區(qū)的大小。結(jié)果表示為OVA特異性KJ. 126細(xì)胞的絕對數(shù)(歸一化 后)或者表示為KJ. 126+細(xì)胞在CD4T細(xì)胞區(qū)中的百分比。在第20天，用完全弗氏佐劑中 的OVA對一半小鼠進(jìn)行皮下攻擊。5天后，通過流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測DO. 11. 10應(yīng)答。在第0天 僅注射PBS的小鼠中，所剩DO. 11. 10細(xì)胞仍有應(yīng)答性，如它們在再次攻擊后的強(qiáng)增殖性應(yīng) 答所示。在之前注射抗CLEC9a+佐劑的小鼠中檢測到更強(qiáng)的應(yīng)答，表明此第一免疫可能導(dǎo) 致產(chǎn)生記憶細(xì)胞。相反，在第一次僅用抗CLEC9a免疫的小鼠中未檢測到應(yīng)答，表明剩下的 細(xì)胞耐受該抗原。發(fā)明詳述CLEC9aCLEC9a是樹突細(xì)胞上表達(dá)的C型凝集素。本說明書中所用術(shù)語“CLEC9a”旨在包 括人蛋白(如圖1中所示的核酸和蛋白質(zhì)序列)、小鼠蛋白(圖2中所示的核酸和蛋白質(zhì) 序列)、其在其它物種中的同源物(特別是直系同源物)，以及保留CLEC9a活性的其變體和衍生物。這些變體和衍生物優(yōu)選與圖1中所示的人蛋白質(zhì)序列具有至少約30%的序列同 一性，更優(yōu)選至少約 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或95%序列同一性，或者與圖1中所示人蛋白質(zhì)序列的胞外結(jié)構(gòu)域具有至少約35%的同一 性，更優(yōu)選至少約 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95%
同一性。尤其是，CLEC9a序列中的保守性替換(相比于參考序列)可以特別好地被容許， 而基本上對功能沒有影響。保守性替換被定義為氨基酸類別之內(nèi)的替換和/或在BL0SUM62矩陣中得分為正 的替換。根據(jù)一種分類法，氨基酸類別有酸性、堿性、不帶電有極性和非極性，其中酸性氨 基酸有Asp和Glu ；堿性氨基酸有Arg、Lys和His ；不帶電極性氨基酸有Asn、Gin、Ser、Thr 和 Tyr ；非極性氨基酸有 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Pro、Phe、Met、Trp 和 Cys0根據(jù)另一種分類法，氨基酸類別有親水性小氨基酸、酸/酰胺/親水性氨基酸、 堿性氨基酸、疏水性小氨基酸和芳香氨基酸，其中親水性小氨基酸有Ser、Thr, Pro、Ala和 Gly ；酸/酰胺/親水性氨基酸有Asn、Asp、Glu和Gln ；堿性氨基酸有His、Arg和Lys ；疏水 性小氨基酸有Met、lie、Leu和Val ；芳香氨基酸有Phe、Tyr和Trp。在BL0SUM62矩陣中得分為正的取代如下 相對于參考序列的氨基酸序列同一性百分比(％)定義為，在序列比對和引 入缺口(如果必要)以實(shí)現(xiàn)最大的百分比序列同一性后，候選序列中與參考序列氨基 酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，不考慮將任何保守性替換作為序列同一性的一部 分。可以通過 WU-BLAST-2 確定％同一性值(Altschul 等，Methods in Enzymology, 266 460-480 (1996))。WU-BLAST-2使用若干檢索參數(shù)，其中大部分設(shè)定為默認(rèn)值?？烧{(diào)節(jié)的參數(shù) 設(shè)定為如下值重疊跨越(overlap span) = 1，重疊分?jǐn)?shù)(overlapfraction) = 0. 125，字 閾值(word threshold)⑴=11。通過WU-BLAST-2所確定的匹配相同殘基數(shù)除以參考序 列的殘基總數(shù)(忽略WU-BLAST-2向參考序列中引入以使比對得分最大的缺口)乘以100， 來確定％氨基酸序列同一性值。CLEC9a激動劑是能夠誘導(dǎo)CLEC9a活性的試劑，這通常通過結(jié)合其胞外結(jié)構(gòu)域 (ECD)并通過胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可涉及下列一個(gè)或多個(gè)Syk 與胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合、Syk的磷酸化(由此活化)和/或Erk的磷酸化和/或NFAT活化。示例 性測定記載于實(shí)施例中，其使用轉(zhuǎn)染有Clec9a和Syk的B3Z細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解， 具有Clec9a胞外結(jié)構(gòu)域和來源于不同蛋白質(zhì)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白也可用于Clec9a激動劑活性的測定。跨膜結(jié)構(gòu)域可來自Clec9a——與胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相同的蛋白質(zhì)，或者來自另 一種蛋白質(zhì)。實(shí)例有圖5中顯示的⑶3 ζ -NKRPl-CLEC9a，在實(shí)施例中更詳細(xì)地描述。CLEC9a拮抗劑是能夠抑制或阻斷CLEC9a功能的試劑。例如，可阻止其正常表達(dá)， 阻止其結(jié)合生理CLEC9a配體的能力，阻止其內(nèi)化所結(jié)合分子(內(nèi)吞)的能力，阻止其胞內(nèi) 信號傳導(dǎo)(參見上文)的能力，或者阻止其ECD與結(jié)合配偶體(配體或受體，例如在其它 細(xì)胞上的)相互作用的能力。拮抗劑的另一種可能的作用機(jī)制可能是促進(jìn)Clec9a內(nèi)化而 不誘導(dǎo)顯著的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此減少細(xì)胞表面上可用于與天然配體或其它激動劑相互作 用的Clec9a庫。拮抗劑包括對CLEC9a有親和力的結(jié)合劑，例如缺少顯著激動劑活性的抗 Clec9a抗體。這些可被稱為“阻斷”抗體。沒有激動劑活性的一價(jià)或二價(jià)抗體可能特別適 合作為阻斷抗體。其它Clec9a拮抗劑包括能夠與編碼CLEC9a的DNA或RNA雜交的核酸分 子或其類似物。這些試劑包括核酶、RNAi、siRNA等。另一些CLEC9a拮抗劑是CLEC9a配體的競爭劑，其可封閉配體上用于樹突細(xì)胞相 關(guān)CLEC9a的結(jié)合位點(diǎn)，因此可阻止配體被樹突細(xì)胞識別或與之結(jié)合。合適的競爭劑包括 可溶性分子，其包含足以結(jié)合CLEC9a配體的CLEC9a胞外結(jié)構(gòu)域或其部分。因此，所述分 子可包含與如圖1所示人CLEC9a的胞外結(jié)構(gòu)域(CTLD)或如圖2所示小鼠CLEC9a或其具 有CLEC9a配體親和力的片段有至少70%同一性、至少75%同一性、至少80%同一性、至少 85%同一性、至少90%同一性或者至少95%同一性的氨基酸序列。所述片段可包含相應(yīng) 胞外結(jié)構(gòu)域序列或者與其具有期望水平序列同一性的序列的至少20、30、40、50、60、70、80、 90、100、110或至少120個(gè)氨基酸。CLEC9a胞外結(jié)構(gòu)域(或其部分)可以與可調(diào)節(jié)所述拮抗劑一些特性(例如其體 內(nèi)藥代動力學(xué)特性)的異源部分相聯(lián)合。所述胞外結(jié)構(gòu)域可以共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合異源部 分，或者表達(dá)為與異源部分的融合蛋白。例如，所述異源部分可以是抗體Fc結(jié)構(gòu)域，以提供 提高的血清半衰期，并允許有效清除所述拮抗劑與所述CLEC9a配體的復(fù)合物。異源部分其它可能的功能包括介導(dǎo)CLEC9a胞外結(jié)構(gòu)域的寡聚化，以及利于拮抗 劑的純化或者從樣品中分離。例如，合適的拮抗劑可以是可溶性分子，其包含與親和素單體 相聯(lián)合的CLEC9a胞外結(jié)構(gòu)域(或其足以結(jié)合CLEC9a配體的片段)，或由其組成。親和素單 體通常會聯(lián)合成為四聚體，提供包含四個(gè)CLEC9a結(jié)構(gòu)域和四個(gè)親和素亞基的復(fù)合物。此結(jié) 構(gòu)可輕易地通過接觸生物素而分離，所述生物素在例如珠的固體載體上提供。當(dāng)所述結(jié)合劑或拮抗劑是蛋白質(zhì)時(shí)，可以施用編碼所述拮抗劑的核酸(例如 DNA)。通常，所述核酸將被體內(nèi)的細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)所攝取，被這些細(xì)胞表達(dá)和分泌。此 方法經(jīng)常被稱為DNA疫苗?？贵w特別適于用作結(jié)合劑和拮抗劑，并且可便利地表達(dá)為scFv形式。必要時(shí)，抗 體可編碼為與抗原的融合蛋白，或者如上所述與效應(yīng)子部分的融合蛋白。DNA疫苗接種法的 實(shí)例記載于 Nchinda 等 J. Clin. Invest. 118 (4)，1427-36，2008。所述核酸通常包含編碼所述結(jié)合劑或拮抗劑的編碼區(qū)，其任選地與任何期望的融 合配偶體相連，與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列有效連接以確保攝取該核酸的細(xì)胞正確地表達(dá)和分 泌所述蛋白質(zhì)。這些序列包括(但不必限于)轉(zhuǎn)錄起始序列(例如啟動子和增強(qiáng)子)、轉(zhuǎn)錄 終止序列、合適的剪接信號、翻譯起始和終止序列以及使其分泌的信號肽。因此，本發(fā)明還提供了用于醫(yī)療方法的編碼CLEC9a拮抗劑或結(jié)合劑的核酸(例如DNA)。本發(fā)明還提供了用于治療用途之方法的編碼CLEC9a拮抗劑或結(jié)合劑的核酸。CLEC9a 配體本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，CLEC9a識別某些類型的死亡和瀕死哺乳動物細(xì)胞所展示的配體。 尤其是，某些類型的細(xì)胞死亡似乎觸發(fā)了所述配體的展示。這是出人意料的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)樵S多 已知的C型凝集素家族成員(包括Dectin-Ι，其是與CLEC9a最密切相關(guān)的蛋白質(zhì))是病原 體相關(guān)分子譜的受體，因此識別病原體所展示的結(jié)構(gòu)，而不是自體分子。公認(rèn)某些細(xì)胞自我死亡機(jī)制能夠引發(fā)免疫應(yīng)答。這可被認(rèn)為是免疫原性細(xì)胞死 亡。已有人提出，凋亡引起的死亡(通常不導(dǎo)致質(zhì)膜破裂和細(xì)胞內(nèi)容物釋放)是非免疫原 性的，而其它機(jī)制引起的死亡例如壞死(其包括質(zhì)膜的破裂和細(xì)胞內(nèi)容物的釋放)是免疫 原性的。但是，生理情況似乎比這更加復(fù)雜。例如，體內(nèi)的凋亡細(xì)胞通常在細(xì)胞死亡過程完 成之前就被鄰近的細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞吸收(吞噬)。但是，如果細(xì)胞不被吞噬，則可能發(fā)生 所謂的繼發(fā)性壞死，其中質(zhì)膜可破裂并且細(xì)胞內(nèi)容物被釋放。此種性質(zhì)的細(xì)胞死亡可以是 免疫原性的，盡管其至少部分屬于凋亡。免疫原性細(xì)胞死亡可能在自身免疫病的發(fā)生、發(fā)展或持續(xù)中起作用。這例如由 Vioritto等(Clin Immunol 122(2)，125-134(2007))、Tesniere等(Curr Op Immunol 21， 1-8(2008))和 Kim 等(Immunity 27，321-333 (2007))綜述。樹突細(xì)胞可在免疫原性細(xì)胞死亡所造成的任何免疫應(yīng)答誘導(dǎo)中起作用，其通過從 死亡或?yàn)l死細(xì)胞中攝取細(xì)胞碎片(或者甚至吸收整個(gè)細(xì)胞)并將加工后的片段呈遞給T細(xì) 胞來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明人目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CLEC9a能夠結(jié)合死亡或?yàn)l死細(xì)胞所展示的配體，并且 CLEC9a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可被這種相互作用所引發(fā)。還認(rèn)為，該配體不是在細(xì)胞死亡過程中從頭合成的。而是可能由一些或所有哺乳 動物細(xì)胞組成型表達(dá)，但是在細(xì)胞保持健康時(shí)無法與CLEC9a相互作用。某些類型的細(xì)胞死 亡導(dǎo)致所述配體暴露出來和/或所述配體以能與CLEC9a相互作用的形式從細(xì)胞中釋放。這 可能涉及質(zhì)膜的破壞。在實(shí)驗(yàn)上，可以通過(例如)照射(例如用電離輻射，如紫外光)、血清除去、至少 一次凍/融循環(huán)或者通過化療劑如蒽環(huán)類(例如多柔比星和柔紅霉素)和蒽醌類(比如米 托蒽醌)的處理來實(shí)驗(yàn)性地造成所述配體的暴露。但是，滲透壓休克導(dǎo)致的死亡似乎不暴 露所述配體。因此，不受任何特定理論的限制，認(rèn)為CLEC9a可能涉及免疫原性細(xì)胞死亡所致免 疫應(yīng)答的產(chǎn)生。CLEC9a與其配體之間的相互作用可以被CLEC9a拮抗劑所抑制。它們包括 能夠結(jié)合CLEC9a(胞外結(jié)構(gòu)域)的結(jié)合劑。其它實(shí)例包括所述配體上CLEC9a結(jié)合位點(diǎn)的 競爭劑，例如包含能夠結(jié)合CLEC9a配體的CLEC9a胞外結(jié)構(gòu)域或其部分的可溶性試劑(例 如，胞外結(jié)構(gòu)域的至少20個(gè)氨基酸、至少50個(gè)氨基酸、至少100個(gè)氨基酸、至少150個(gè)氨基 酸或者至少200個(gè)氨基酸)。能夠抑制CLEC9a與其配體之間結(jié)合的拮抗劑將能夠在與能誘導(dǎo)CLEC9a信號的合 適的死亡或?yàn)l死細(xì)胞(例如經(jīng)UV照射的哺乳動物細(xì)胞)或裂解物、提取物或其級分相接觸 時(shí)抑制CLEC9a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?？墒褂萌魏魏线m的測試系統(tǒng)評估此能力。例如，在表達(dá)CLEC9a的 樹突細(xì)胞中，可通過測定Syk激酶的磷酸化來評估CLEC9a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?；蛘?，可使用人工報(bào)告系統(tǒng)，其包含與報(bào)告系統(tǒng)功能性連接的CLEC9a胞外結(jié)構(gòu)域，例如實(shí)施例中描述的CD3zeta 嵌合體。結(jié)合劑任何對CLEC9a具有足夠高的親和力和特異性的合適分子均可用作結(jié)合劑。所述 分子可以是蛋白質(zhì)、核酸(例如適配體)、糖(例如寡糖或多糖)、小分子等等。特別優(yōu)選的 結(jié)合劑是CLEC9的生理配體，以及針對CLEC9a的抗體及其功能性片段。所述結(jié)合劑優(yōu)選對CLEC9a (特別是對CLEC9a ECD)具有至少ΙΟ 1、至少ΙΟ 1、至 少107M_\優(yōu)選至少108M_\更優(yōu)選至少IO9M4的結(jié)合親和力(親和常數(shù))。所述結(jié)合劑的親和力優(yōu)選為任何非CLEC9a分子(包括其它C型凝集素)的至少 2倍，優(yōu)選至少5倍，至少10倍，至少50倍或至少100倍。眾所周知，完整抗體的片段可發(fā)揮結(jié)合抗原的功能。功能性結(jié)合片段的實(shí)例有 ⑴由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段； (iii)由單個(gè)抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv) dAb片段(Ward，Ε. S.等，Nature 341,544-546(1989))，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；(ν)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab' )2片段——包 含兩個(gè)相連的Fab片段的二價(jià)片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu) 域通過使得這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相聯(lián)合而形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的肽接頭相連(Bird等，Science, 242,423-426,1988 ；Huston 等，PNAS USA，85，5879-5883，1988) ； (vii)雙特異性單鏈 Fv 二 聚體(PCT/US92/09965)和(ix) “雙抗體”——通過基因融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異性片段 (W094/13804 ；P.Holliger 等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 906444-6448，1993)。因?yàn)榭贵w可以多種方式進(jìn)行修飾，所以術(shù)語“抗體”應(yīng)視作涵蓋任何含有具有所需 特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何特異性結(jié)合物質(zhì)。因此，此術(shù)語涵蓋了如上所述的抗體片段，以 及抗體的衍生物、功能等同物和同源物，包括任何含有免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，而不 論是天然的還是合成的。因此，包含與另一多肽融合的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其等同物 的嵌合分子也包括在內(nèi)。嵌合抗體的克隆和表達(dá)描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023。應(yīng)理解，本文所述方法中使用的結(jié)合劑通常需要結(jié)合CLEC9a的胞外結(jié)構(gòu)域來發(fā) 揮所需的作用。除非上下文允許其他方式，否則能夠結(jié)合CLEC9a的結(jié)合劑應(yīng)如此解釋。在本發(fā)明的某些方面中，期望將抗原(例如蛋白質(zhì)或肽抗原)與所述結(jié)合劑交聯(lián)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員很了解適當(dāng)?shù)姆椒ê驮噭．?dāng)所述結(jié)合劑是蛋白質(zhì)時(shí)，所述抗原可通過所 述結(jié)合劑的巰基來偶聯(lián)。巰基通?？梢允怯坞x的，或者其通?？梢允嵌蜴I的一部分，在 這種情況下它可以通過選擇性還原所述結(jié)合劑來暴露。例如，可以使用還原劑美司那在絞 鏈區(qū)溫和地選擇性還原抗體。然后，使用磺基-SMCC活化該抗原，磺基-SMCC是一種異雙功 能交聯(lián)劑，其與蛋白質(zhì)的叔胺反應(yīng)，產(chǎn)生具有游離巰基的反應(yīng)基團(tuán)。然后，將所述抗體和所 述活化的抗原一起孵育，得到與一價(jià)抗體綴合的蛋白質(zhì)18?；蛘?，如果已知所述抗原的合適 免疫原性肽序列，則可合成含有具有游離巰基之半胱氨酸的此類肽，并將其與經(jīng)磺基-SMCC 活化的抗體相偶聯(lián)，所述經(jīng)磺基-SMCC活化的抗體將保持為二價(jià)，并且每個(gè)抗體分子具有 數(shù)個(gè)結(jié)合的肽。藥物組合物本文所述的多肽、抗體、肽、核酸和細(xì)胞可制備在藥物組合物中。這些組合物除了 上述物質(zhì)之一之外可包含可藥用賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的材料。這些材料應(yīng)該是無毒的且不應(yīng)干擾活性成分的效力。所述載體或其它材料的確切 特征可取決于給藥途徑，例如經(jīng)口、靜脈內(nèi)、皮膚或皮下、經(jīng)鼻、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)途徑。
經(jīng)口施用的藥物組合物可以是片劑、膠囊劑、粉劑或液體的形式。片劑可包括固體 載體，例如明膠或佐劑。液體藥物組合物通常包含液體載體比如水、石油、動物或植物油、礦 物油或合成油?？砂睇}水、葡萄糖或其它糖類溶液或醇比如乙二醇、丙二醇或聚乙二對于靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射或者患病部位處的注射而言，活性成分將為可用于 胃腸外的水溶液形式，其為無熱原的且具有適當(dāng)?shù)腜H、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員能 夠使用例如等滲載體(如氯化鈉注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液)制備適當(dāng)?shù)娜?液。根據(jù)需要，可包含防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加劑。優(yōu)選以“預(yù)防有效量”或“治療有效量”進(jìn)行施用(視情況而定，盡管預(yù)防也可被認(rèn) 為是治療)，這足以顯示出對個(gè)體的益處。施用的實(shí)際量，以及施用的速率和時(shí)程將取決于 所治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療的處方(例如對劑量等的決定)是全科醫(yī)師以及其它 醫(yī)生的職責(zé)之內(nèi)，通常考慮所治療的疾病、患者個(gè)體的情況、遞送部位、施用方法和其它執(zhí) 業(yè)醫(yī)師已知的因素。上文所述的技術(shù)和方案的實(shí)例可見于Remington' s Pharmaceutical Sciences,第二十版，2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins。根據(jù)所治療的病癥，組合物可單獨(dú)施用，或者與其它治療同時(shí)或依次聯(lián)合施用。
實(shí)施例CLEC9a的序列和結(jié)構(gòu)對NCBI基因數(shù)據(jù)庫的檢索顯示，已經(jīng)在小鼠(Mus musculus)、類人猿(Pan troglodytes)、人(Homo sapiens)禾口恒河猴(Macaca mulatta)中鑒定出 CLEC9a 序列。使 用小鼠CLEC9a蛋白序列進(jìn)行的blast檢索也顯示了大鼠(Rattus norvegicus)、狗(Canis familiar is)和牛(Bostaurus)中的預(yù)測CLEC9a蛋白。具有相關(guān)結(jié)構(gòu)域的人cDNA序列及 其代表的蛋白質(zhì)序列在圖1中詳細(xì)描述。我們從小鼠CDSa+DC中克隆的小鼠cDNA序列及 其代表的蛋白質(zhì)序列在圖2中詳述。此序列不同于已公開的cDNA序列，其含有另外的G殘 基，造成向分子末端的移碼，導(dǎo)致比圖2中所示更長的蛋白質(zhì)。我們的序列似乎是正確的， 因?yàn)樗c公開的基因組序列(NC_000072. 4GI =94471533)相匹配；如此頁中所見的，基因組 的13480位(ATTT)與我們的cDNA序列相匹配。所述序列預(yù)測出C型凝集素家族蛋白，其 具有C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLD)、莖結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有在 圖1和圖2中高亮表示的一個(gè)物種保守性酪氨酸。我們發(fā)現(xiàn)了小鼠CLEC9a轉(zhuǎn)錄本的三種同 工型，我們稱其為長同工型(外顯子1-7)、缺少外顯子4的短同工型(包含參與二聚化的推 定半胱氨酸)以及極短同工型(其將外顯子3與外顯子7相連，得到編碼跨膜蛋白的mRNA， 該蛋白如果表達(dá)，則會與CLEC9a具有相同的跨膜胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，但具有短且不同的胞外結(jié)構(gòu) 域)。我們僅有長同工型蛋白質(zhì)表達(dá)的證據(jù)。分析了小鼠CLEC9a的結(jié)構(gòu)。核心蛋白質(zhì)具有約29. 67kDa的預(yù)測分子量(Mw)。但 是，當(dāng)在HEK-293細(xì)胞系中表達(dá)時(shí)，在非還原條件下Mw約為IOOkDa,在還原條件下Mw為約 45KDa (圖3)。這些結(jié)果表明，所述分子通過莖中的半胱氨酸形成二聚體，如同該家族中的 其它凝集素一樣，并且所述單體是強(qiáng)糖基化的。
CLEC9a 表達(dá)作為小鼠脾⑶Ilc+⑶8+和⑶Ilc+⑶8-細(xì)胞樣品之間代表性差異分析的結(jié)果，首 先在我們實(shí)驗(yàn)室中檢測到CLEC9a。該結(jié)果顯示，在CDllc+CD8+轉(zhuǎn)錄本中選擇性發(fā)現(xiàn)了對應(yīng) 于EST克隆AW318446的序列，其對應(yīng)于CLEC9a。在分選的脾DC亞群中進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄本分析顯示了⑶8+亞群中CLEC9a高表達(dá)，但雙 陰性(CD4-CD8-)和B220+脾DC也顯示一些CLEC9a轉(zhuǎn)錄本(圖4)。在GMCSF衍生的BMDC 中未發(fā)現(xiàn)顯著表達(dá)(圖4)。在Flt3L(50ng/ml)存在下培養(yǎng)10天的小鼠骨髓產(chǎn)生了⑶lie+ 細(xì)胞，其為⑶1 Ib+ (功能上對應(yīng)于常規(guī)脾DC并包括⑶8樣亞群19)或者B220+ (其為漿細(xì)胞 樣DC(pDC)的功能等同物)。在分選的⑶lib+亞群中發(fā)現(xiàn)CLEC9a高表達(dá)，盡管pDC亞群顯 示所述分子的一些表達(dá)(圖4)。因?yàn)镽T-PCR是可檢測極低水平轉(zhuǎn)錄本的靈敏方法，所以其受到樣品純化質(zhì)量的 限制。為了明確測定CLEC9a表達(dá)模式，我們使用具有β-Gal報(bào)告子的B3Z細(xì)胞中表達(dá)的 ⑶3 ζ -NKRPl-CLEC9a嵌合體制備了針對小鼠CLEC9a的大鼠單克隆抗體(mAb)(圖5)，如方 法中所述。我們選擇了三種mAb，名為1F6、397和7H11。使用這些mAb，我們研究了小鼠脾 和骨髓中所述分子的表達(dá)模式。CLEC9a在⑶8 α +常規(guī)DC中高度表達(dá)(MFI 350-400)， 在pDC中顯示中度表達(dá)(MFI 65-70)(圖6)。在所研究的其它細(xì)胞類型中(包括B細(xì)胞、 T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞)中未檢測到所述分子。作為體外分析CLEC9a功能的模型，我們分析了在來自小鼠GMCSF和Flt3L的BMDC 中的表達(dá)。在來自GMCSF的BMDC中，我們沒有檢測到所述分子的表達(dá)，而CLEC9a在功能上 與CD8+脾DC同源的Flt3L BMDC的CDllb1。、CD24hi、B220-亞群中選擇性表達(dá)19，在等同于 pDC的⑶lib1。B220+亞群中也表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。CLEC9a信號通過Syk激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)并促進(jìn)DC活化。序列分析顯示了來自小鼠的 Tyr7，其在所有物種中都是保守的，具有相同的結(jié)構(gòu)EXXYXXL，其可作為推定的SH2結(jié)合結(jié) 構(gòu)域和/或基于酪氨酸的分選信號。此序列允許/介導(dǎo)小鼠Dectin-I中的Syk結(jié)合，稱為 “HemlTAM”22。但是，對于預(yù)測Syk結(jié)合而言，此推定序列是必要的但不是充分的。因此，我 們設(shè)計(jì)了生物素化肽，其具有表達(dá)磷酸化Tyr7的小鼠CLEC9a胞質(zhì)尾，或者具有未磷酸化的 Tyr7，或者甚至突變?yōu)镻he。Tyr7磷酸化肽能夠阻滯重組Syk(圖7)，其程度類似于來自作 為陽性對照的小鼠Dectin-I胞質(zhì)尾，其表達(dá)兩個(gè)磷酸化的Tyr23。為了確定CLEC9a是否真的作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，我們使用上文所述的大鼠抗小鼠 CLEC9a mAb。我們產(chǎn)生了在LK細(xì)胞中表達(dá)CLEC9a的轉(zhuǎn)染子，LK細(xì)胞是CLEC9a表達(dá)為陰 性的小鼠B細(xì)胞系，但其含有內(nèi)源水平的Syk23。用測試的所有三種涂板的抗CLEC9a抗體 引發(fā)CLEC9a，均在LK細(xì)胞中導(dǎo)致Syk和Erk的磷酸化(圖8)。為了確定Syk是否是CLEC9a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的，我們使用不表達(dá)Syk的報(bào)告T細(xì) 胞系B3Z的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。使用Tyr7突變?yōu)镻he的突變形式CLEC9a(CLEC9a Y7F)分析Tyr7 對CLEC9a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的貢獻(xiàn)。我們用CLEC9a wt或Y7F轉(zhuǎn)導(dǎo)B3Z細(xì)胞，其共轉(zhuǎn)導(dǎo)或不共轉(zhuǎn)導(dǎo) Syk激酶。涂板的抗CLEC9a mAb在B3Z_C9wt_Syk中通過C9的wt胞質(zhì)尾誘導(dǎo)NFAT活化， 但是在Syk或Y7不存在時(shí)不誘導(dǎo)(未顯示)。CLEC9a對免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子/共刺激分子 的調(diào)節(jié)。為了確定通過CLEC9a的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是否在其表達(dá)的細(xì)胞中促進(jìn)調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的產(chǎn)生或共刺激分子的表達(dá)，我們分析了 wt CLEC9或Y7F突變體的LK轉(zhuǎn)染子。表達(dá)397抗 CLEC9a并且較小程度表達(dá)7H11的雜交瘤細(xì)胞通過CLEC9a分子引發(fā)特異性IL-2產(chǎn)生，其 中CLEC9a分子在Y7F突變體中被消除(圖9)。DEC-205對照雜交瘤未引發(fā)任何應(yīng)答，1F6 抗CLEC9a引發(fā)降低的應(yīng)答，其帶來了這些抗體可差異性表現(xiàn)出細(xì)胞因子產(chǎn)生的可能性，這 對于CLEC9a靶向的前景而言非常有吸引力(激動性抗體，397，阻斷抗體，1F6)。為了確定CLEC9a WT尾的活化條件，我們分析了不表達(dá)Syk的報(bào)告T細(xì)胞系B3Z的 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。使用Tyr7突變?yōu)镻he的突變形式CLEC9a (CLEC9a Y7F)分析Tyr7對CLEC9a 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的貢獻(xiàn)。我們用CLEC9a wt或Y7F轉(zhuǎn)導(dǎo)B3Z細(xì)胞，其共轉(zhuǎn)導(dǎo)或不共轉(zhuǎn)導(dǎo)Syk激酶。 涂板的抗CLEC9a mAb在B3Z_C9wt_Syk中通過C9的wt胞質(zhì)尾誘導(dǎo)NFAT活化，但是在Syk 不存在時(shí)或者使用Y7F突變體時(shí)不誘導(dǎo)(圖10)。Flt3L BMDC應(yīng)答于涂板的抗CLEC9a mAb而產(chǎn)生IL12_23p40蛋白(圖11)。這些結(jié)果證明CLEC9a是能夠活化DC的信號分子。CLEC9a是在體內(nèi)選擇性靶向 CDllc+CD8+DC的內(nèi)吞受體。通過FACS分析抗CLEC9a mAb被Flt3L BMDC中表達(dá)的內(nèi)源CLEC9a內(nèi)化的潛力， 顯示CLEC9a是內(nèi)吞分子。共聚焦分析顯示所述抗體靶向至細(xì)胞內(nèi)的區(qū)室(數(shù)據(jù)未顯示)。 這些結(jié)果表明CLEC9a是內(nèi)吞受體，其可被與抗原(腫瘤/病毒疫苗)偶聯(lián)的抗體所靶向， 以將載荷特異性遞送到選擇性表達(dá)所述分子的細(xì)胞亞群。為了確定CLEC9amAb是否用作體 內(nèi)靶向工具，我們靜脈內(nèi)注射7HII-AleXa-488或同種型對照。16小時(shí)后，我們分析了總脾 細(xì)胞和選擇性靶向的CD8 α +DC(MFI 350-400)并且低親和力靶向PDC(MFI 65-70)的 抗體。用抗大鼠Cy5標(biāo)記脾細(xì)胞表明大多數(shù)大鼠抗小鼠CLEC9a mAb被內(nèi)吞，因?yàn)樗鼪]有與 抗大鼠二抗試劑共染色(未顯示)。為了研究在體內(nèi)通過CLEC9a靶向是否導(dǎo)致抗原被特定亞群加工和呈遞，我們將 用于對OVA蛋白質(zhì)(SIINFEKLC-biot，名為Si) CTL應(yīng)答的免疫顯性肽的生物素化衍生物與 同種型對照或抗CLEC9a mAb偶聯(lián)，如方法中所示。所述肽的生物素化使得我們能夠確定， 在所有情況下每個(gè)抗體有1-1. 2個(gè)肽。用5微克Sl偶聯(lián)的抗CLEC9a或用Sl-同種型對照 靜脈內(nèi)注射小鼠。第二天，富集脾細(xì)胞的⑶Ilc+或⑶Ilc-亞群，測試它們誘導(dǎo)OT-I T細(xì) 胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力(圖12a和b)。僅有被抗CLEC9a靶向的CDllc+細(xì)胞導(dǎo)致 OT-I細(xì)胞的增殖和IFN-Y產(chǎn)生，表明CLEC9a特異性靶向⑶llc+DC，導(dǎo)致呈遞到抗原特異 性T細(xì)胞。為了進(jìn)一步確定哪個(gè)亞群的樹突細(xì)胞被抗C9靶向，在注射了 Sl-偶聯(lián)之抗C9的 小鼠中對三個(gè)主要的常規(guī)DC亞群進(jìn)行分選，并如上用OT-I T細(xì)胞進(jìn)行測試。僅有DC的 ⑶8+亞群介導(dǎo)增殖和T細(xì)胞的IFN- γ產(chǎn)生，證實(shí)CLEC9特異性靶向⑶Ilc+⑶8+DC，導(dǎo)致抗 原特異性T細(xì)胞的引發(fā)(圖12c和d)。使用抗CLEC9a mAb加抗⑶40進(jìn)行體內(nèi)靶向?qū)е铝?CTL引發(fā)和腫瘤排斥我們研究了體內(nèi)的CLEC9a靶向是否可誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞活化。注射2微克的抗 C9-S1導(dǎo)致在與抗CD40共施用時(shí)在體內(nèi)誘導(dǎo)來自內(nèi)源庫的特異性CTL活性，但是同種型對 照不導(dǎo)致此結(jié)果(圖13)。此行為類似于之前用抗DEC205-S1所觀察到的24，如體內(nèi)殺傷測 定中所顯示(圖13A)。給予與對照mAb偶聯(lián)之Sl的小鼠不論是否共施用抗CD40都未清除靶細(xì)胞。相反，靶細(xì)胞在給予與抗CLEC9a偶聯(lián)的Sl以及抗CD40的小鼠中被完全清除。當(dāng)省略抗CD40mAb 時(shí)，未見應(yīng)答。與靶細(xì)胞清除一致，僅在接受抗CLEC9a-Sl與抗CD40的小鼠的脾和血液中 發(fā)現(xiàn)顯著數(shù)量的四聚體陽性0VA/H-2Kb特異性⑶8+T細(xì)胞。用SIINFEKL肽體外再刺激相 同的細(xì)胞導(dǎo)致繼發(fā)擴(kuò)增、IFN-Y產(chǎn)生和特異性殺傷活性。使用與含SIINFEKL表位的更長 OVA 肽綴合的抗 CLEC9a 獲得了相同的結(jié)果(“S2” ；SIINFEKLTEffTSSNVMEERC ；圖 13B)。值得注意的是，游離Sl肽不能誘導(dǎo)體內(nèi)殺傷應(yīng)答或引發(fā)顯著量的四聚體陽性細(xì) 胞，甚至在給予100倍過量于抗CLEC9a-Sl綴合物時(shí)亦如此(未顯示)。我們得出結(jié)論，外 源性抗原對CLEC9a的靶向以及合適的佐劑使得有效地交叉引發(fā)⑶8+T細(xì)胞。為了確定CTL活性的CLEC9a引發(fā)是否可導(dǎo)致腫瘤治療，我們使用B16黑素瘤肺轉(zhuǎn) 移模型。我們靜脈內(nèi)接種2X IO5個(gè)B16-0VA-GFP黑素瘤細(xì)胞，6天后，在爪中皮下注射與 S1SIINFEKL衍生物綴合的不同抗體(10微克)以及抗CD40 (25微克)(圖14)。在注射所 述腫瘤18天后，分析肺腫瘤的數(shù)目。結(jié)果顯示，抗CLEC9a加抗CD40對于腫瘤治療來說是 有效的(P < 0. 001，單因素AN0VA)(圖14)。我們繼續(xù)實(shí)驗(yàn)以確定抗CLEC9a靶向是否還可用于誘導(dǎo)針對可用作B16腫瘤相關(guān) 抗原的內(nèi)源黑素細(xì)胞分化蛋白的免疫應(yīng)答(25-27)。我們合成了包括了來自gplOO、TRP-I 和TRP-2的H-2Kb和H-2Db限制性抗原表位的生物素化肽(25-27)，將它們共價(jià)偶聯(lián)到抗 CLEC-9a，并用抗體綴合物和聚I:C以及抗CD40作為佐劑免疫小鼠。如圖16所示，在轉(zhuǎn)移 B16黑素瘤細(xì)胞3天后治療性給予的單劑疫苗誘導(dǎo)了幾乎完全的肺假轉(zhuǎn)移清除。這伴隨著 誘導(dǎo)針對所述黑色素瘤抗原的強(qiáng)IFN-Y應(yīng)答(圖16)。相反，非靶向形式的相同抗原(與 對照同種型匹配的mAb綴合)無法誘導(dǎo)保護(hù)或IFN- Y應(yīng)答(圖16A、B)。在B16攻擊之前 給予所述疫苗的預(yù)防模型中獲得了類似結(jié)果(圖16C)。我們得出結(jié)論，通過CLEC-9a靶向 引發(fā)特異性CTL可用于針對小鼠腫瘤的預(yù)防性或治療性疫苗。人Clec9a表達(dá)僅限于小的血液DC亞群為了將這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展到人，我們克隆了 hClec9a并制備了針對它的小鼠mAb (參見 材料和方法)。選擇這些mAb之一來分析人外周血單個(gè)核細(xì)胞中Clec9a的表達(dá)模式。在淋 巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和譜系陰性HLADR細(xì)胞中沒有人Clec9a表達(dá)(圖15A)。在通過 GM-CSF和IL-4中培養(yǎng)產(chǎn)生的單核細(xì)胞來源DC中也未檢測出其表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。但是， 在定義為譜系陰性HLA-DR+細(xì)胞的血液DC離散亞群中有明顯的Clec9a表達(dá)(圖15A)。
已經(jīng)報(bào)告了五個(gè)離散的血DC亞群，包括⑶123+pDC群以及推定髓細(xì)胞樣⑶123-DC 的不同亞群，它們可根據(jù)⑶16、⑶lb/c、BDCA-3和⑶34來區(qū)分(22)。DC的Clec9a+亞群是 CD123陰性的，表明人pDC不表達(dá)Clec9a，與小鼠中的pDC不同(圖15B)。Clec9a+血DC 也是CD34、CD16和CDlb/c陰性的。但是，Clec9a+DC是BDCA-3均一陽性的(圖15B)。因 此，人Clec9a選擇性地標(biāo)記不同的BDCA-3+DC群。最后，我們評估了人CLEC_9a是否與其小鼠直系同源物一樣可作為DC的內(nèi)吞受體 起作用。將BDCA-3+DC在4°C下用以Alexa 488標(biāo)記的抗CLEC_9a染色。在37°C而不是在 4°C下一個(gè)小時(shí)后，在胞內(nèi)區(qū)室中發(fā)現(xiàn)熒光(未顯示)。因此，人CLEC-9a介導(dǎo)BDCA3+DC中 結(jié)合抗體的胞吞作用，從而表明它可被用于在人體中將抗原靶向這些細(xì)胞。瀕死/死亡細(xì)胞表達(dá)CLEC9A的配體。含有CLEC9A-⑶3 ζ嵌合體的BWZ細(xì)胞具有短的傳代時(shí)間，很容易生長過度，從而在培養(yǎng)物中產(chǎn)生大比例的死細(xì)胞。我們觀察到在沒有任何另外激活的情況下表達(dá)CLEC9A 的BWZ轉(zhuǎn)染子的基礎(chǔ)活化，其與BWZ培養(yǎng)物中的死細(xì)胞數(shù)目相關(guān)(圖17a)。為了證實(shí)這些結(jié)果，我們使用在加入到BWZ-CLEC9A ζ轉(zhuǎn)染子時(shí)不誘導(dǎo)應(yīng)答的細(xì) 胞系。在暴露于報(bào)告細(xì)胞時(shí)，LK細(xì)胞不誘導(dǎo)應(yīng)答。但是，當(dāng)LK細(xì)胞接受UV照射而誘導(dǎo)細(xì) 胞死亡時(shí)，它們轉(zhuǎn)變?yōu)閳?bào)告子的強(qiáng)誘導(dǎo)物(圖17b)，表明在UV處理后發(fā)生改變的細(xì)胞表達(dá) CLEC9A的配體。因?yàn)槎r(jià)抗體引發(fā)B3Z細(xì)胞系中所表達(dá)分子的交聯(lián)和報(bào)告子的活化，所以 無法在此系統(tǒng)中測試阻斷抗體來證明這種相互作用的特異性。但是，抗CLEC9A抗體的一價(jià) Fab片段不引發(fā)報(bào)告子活性并以物種特異性方式阻斷經(jīng)UV處理細(xì)胞的誘導(dǎo)(圖17b)，證明 所述抗體特異性地阻斷CLEC9A受體以避免與配體的相互作用。此結(jié)果在其它獨(dú)立的UV照射細(xì)胞類型(小鼠3T3、LK細(xì)胞、MEF、EL-4)、大鼠RBL 細(xì)胞和人HEK-293中得到證實(shí)。當(dāng)細(xì)胞與咖啡因(其預(yù)防UV誘導(dǎo)的DNA損傷和凋亡)一 起預(yù)孵育然后暴露于UV照射時(shí)，不誘導(dǎo)配體的暴露。我們將LK細(xì)胞暴露于不同劑量的UV，我們發(fā)現(xiàn)LK細(xì)胞中配體的表達(dá)與死亡LK細(xì) 胞的數(shù)目相關(guān)(圖17c)，表明所述配體在此群體中選擇性表達(dá)。為了以獨(dú)立的方式對其進(jìn)行證實(shí)，我們制備了小鼠CLEC9A的重組可溶性胞外結(jié) 構(gòu)域(rsCTLD)以及小鼠Dectin-I作為對照，其各自與用于單生物素化的BirA序列偶聯(lián)。 使用單生物素化的rsCTLD來產(chǎn)生PE四聚體。我們對24小時(shí)前用UV處理的細(xì)胞進(jìn)行染色， 我們檢測到CLEC9A rsCTLD四聚體與TO-PRO 3陽性細(xì)胞的特異性結(jié)合(圖17d，點(diǎn)圖)。 作為對照，Dectin-IrsCTLD四聚體不結(jié)合死細(xì)胞，但是它們結(jié)合其特異性配體酵母聚糖 (zymosan)(圖 17d，柱狀圖)。因?yàn)閁V處理誘導(dǎo)DNA損傷和一系列相關(guān)的脅迫標(biāo)志物，我們測試了配體的誘導(dǎo) 是由DNA損傷引起還是主要由涉及細(xì)胞死亡的過程引起。不僅造成DNA損傷的試劑，而且 血清除去或者甚至凍融(已證明促進(jìn)導(dǎo)致免疫原性細(xì)胞死亡的原發(fā)性壞死)都會導(dǎo)致配 體的暴露(圖17e)。但是，誘導(dǎo)已證明為致耐受性作用的瞬間細(xì)胞死亡的滲透壓休克不暴 露CLEC9a配體(圖17e和f)?？傊?，在某些類型的原發(fā)性和繼發(fā)性壞死之后，細(xì)胞中暴 露CLEC9a配體。此外，我們發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞的固定(或者固定和透化)立即促進(jìn)了使細(xì)胞對 T0-PR03通透的變化，并“暴露”CLEC9A的配體(圖20)，進(jìn)一步證明配體的合成不是由于UV 損傷應(yīng)答而被誘導(dǎo)的，而是由于應(yīng)答于某些刺激的死亡過程而暴露的。CLEC9A介導(dǎo)由死亡 細(xì)胞遞送到樹突細(xì)胞的佐劑信號。UV死細(xì)胞以Syk和Y7依賴性方式通過CLEC9A的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域傳導(dǎo)信號(圖21)。 此系統(tǒng)使得我們能夠研究抗CLEC9A抗體是否可用作該相互作用的特異性阻斷試劑，我們 發(fā)現(xiàn)可溶形式的Fab和完整抗體都是強(qiáng)阻斷試劑(圖22)。為了測試樹突細(xì)胞中瀕死細(xì)胞 的作用及其在體外的效應(yīng)子功能，我們設(shè)計(jì)了交叉呈遞測定，其中使載有OVA蛋白的經(jīng)UV 處理bm-1細(xì)胞在有或沒有阻斷抗CLEC9A的情況下與Flt3LBMDC相互作用。Bm-I細(xì)胞來自 B6單倍體，但表達(dá)突變的H2Kb，其不結(jié)合OVA的免疫顯性I類肽(SIINFEKL)。作為DC的交 叉引發(fā)能力的讀數(shù)，將特異性O(shè)T-I細(xì)胞加入到該測定中。作為交叉呈遞的抗原量的讀數(shù)， OT-I細(xì)胞的增殖未受大的影響(圖18a)。但是，在使用阻斷性CLEC9A抗體時(shí)，OT-I細(xì)胞 的細(xì)胞因子產(chǎn)生(其依賴于通過佐劑作用而活化的DC的幫助)受到嚴(yán)重抑制(圖18a和 b)。
為了證實(shí)這些結(jié)果，我們制備了缺少CLEC9A的小鼠，其表達(dá)Clec9a啟動子控制下 的EGFP (Clec9aegfp/0。我們制備了缺少或不缺少CLEC9A的Flt3L BMDC,我們分析了瀕死細(xì) 胞的攝取是否受到影響。圖18c顯示CLEC9A+和CLEC9A_Flt3L BMDC之間瀕死細(xì)胞的攝取 能力沒有差異。然后，我們測定了 Flt3L BMDC中CLEC9A缺陷對交叉呈遞到OVA蛋白質(zhì)的影 響，所述OVA蛋白質(zhì)是載入經(jīng)UV處理的bm-1細(xì)胞中的，或是在經(jīng)UV處理的bm_lMEF中非 分泌OVA-GFP融合蛋白中胞內(nèi)表達(dá)的(圖18d)。OT-I增殖受到影響，表明比抗體阻斷更顯 著的對于交叉呈遞的阻斷效果。但是，在更高劑量的OVA(包括bmlMEF表達(dá)的OVA)下，增 殖未受影響，IFN γ產(chǎn)生受到嚴(yán)重抑制(圖18d和e)。這些結(jié)果表明，在DC中缺乏CLEC9A 時(shí)，體外交叉引發(fā)期間與瀕死細(xì)胞相關(guān)的佐劑作用被阻斷。CLEC9A感知免疫原性細(xì)胞死亡而促進(jìn)體內(nèi)交叉引發(fā)因?yàn)楸磉_(dá)CLEC9A的⑶8 α +DC是以促進(jìn)體內(nèi)死細(xì)胞相關(guān)抗原交叉引發(fā)為特征的主 要細(xì)胞類型，所以我們測試了 CLEC9A阻斷在此功能中的作用。接受經(jīng)UV處理的表達(dá)OVA 的bmlMEF的小鼠在六天后顯示出針對來自內(nèi)源成分的OVA的擴(kuò)增的CD8+T細(xì)胞(圖19a， 左圖)。這些⑶8+T細(xì)胞能夠應(yīng)答于SIINFEKI而產(chǎn)生IFN- γ，表明它們是效應(yīng)細(xì)胞，并且 死細(xì)胞作為與死細(xì)胞佐劑活性相關(guān)之抗原的免疫原性載體(圖19a，右圖)。用抗CLEC9A 阻斷性抗體進(jìn)行的預(yù)處理阻斷了特異性CD8應(yīng)答的產(chǎn)生和效應(yīng)子活性，而同種型對照不阻 斷(圖19a)。為了確定CLEC9A在涉及死細(xì)胞相關(guān)抗原之交叉引發(fā)的死細(xì)胞免疫原性過程中的 確切作用，我們在CLEC9aegfp/_小鼠中進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示在無CLEC9A時(shí)對體內(nèi)死細(xì)胞相 關(guān)抗原交叉引發(fā)的非常顯著的部分抑制(圖1%，左圖)。由于敲除小鼠在混合C57BL/6-129 背景中產(chǎn)生并與C57BL/6交(N3)，我們將12只雌性同窩仔分為一組，其匯集于圖19b左圖 中，我們比較了 CLEC9A+和CLEC9A-小鼠之間的平均值，顯示了 12只同窩仔中的12只表現(xiàn) 出降低，平均為30. 05%抑制(ρ < 0.0001，t檢驗(yàn))(圖19b，右圖)。如圖19b右圖所示， 不同同窩仔之間背景外顯率的差異可解釋同窩仔中交叉引發(fā)能力的顯著差異，并緩和了 CLEC9A+和CLEC9A-小鼠之間的真實(shí)差異，所述差異雖然僅是是一部分，但仍非常顯著。此 外，響應(yīng)于SIINFEKL的離體IFN- γ產(chǎn)生受到嚴(yán)重影響，表明在無CLEC9A時(shí)缺少通過死細(xì) 胞相關(guān)抗原交叉引發(fā)產(chǎn)生的效應(yīng)子應(yīng)答(圖19c)?？傊?，CLEC9A缺乏導(dǎo)致具有相關(guān)抗原的 死細(xì)胞的佐劑性降低，其導(dǎo)致對響應(yīng)于死細(xì)胞相關(guān)抗原的特異性T細(xì)胞效應(yīng)子的阻斷。方法小鼠將C57BL/6小鼠、Rag_/_C57BL/6背景下的OT-I小鼠和B6. SJL背景小鼠(同 族CD45. 1+)在特定的無病原條件下飼養(yǎng)于CancerResearch UK, Kbm.1小鼠購自Jackson laboratory (Bar Harhor, Maine ；保藏號 001060)，并與 C57BL/6 小鼠，Rag-/_C57BL/6 背景 下的OT-I小鼠、MyD88-TRIF雙敲除、Clec9a+和Clec9a+小鼠一起在特定無病原條件下 飼養(yǎng)于Cancer Research UK。骨髓嵌合體如前所述由Syk缺陷型胎肝細(xì)胞制得(Turner 等.Nature 378,298(1995))。所有動物實(shí)驗(yàn)根據(jù)國家及研究機(jī)構(gòu)的動物保護(hù)規(guī)定實(shí)施。試齊[J培養(yǎng)基是添加了谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、2_巰基乙醇(所有均來自 Invitrogen)和 10 % 熱滅活胎牛血清(Bioclear)的 RPMI 1640 (Invitrogen)。用于流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)的抗體來自BD Pharmingen，包括⑶Ilc (克隆HL3，倉鼠IgGl)、⑶24、 ⑶lib、B220、Ly6C、⑶4(RM4_5，大鼠IgG2a)、⑶8的特異性抗體。用于ELISA的抗體是捕 獲 IFN-Y (XMG1. 2，大鼠 IgGl)檢測/IL12-23 p40。純化的 2. 4G2 (抗 FcgRIII/ΙΙ，大鼠 IgG2b，用于封閉非特異性Ab結(jié)合)來自Cancer Research UK的抗體制備服務(wù)。對于流式 細(xì)胞術(shù)，在添加了 2mM EDTA、1% FCS和0.02%疊氮鈉的冰冷PBS中對細(xì)胞懸液染色。在 FACSCalibur (BDBiosciences)上獲取數(shù)據(jù)并使用 FlowJo 軟件(Treestar, San Carlos, CA) 分析。細(xì)胞使用GM-CSF產(chǎn)生小鼠骨髓來源DC(BMDC)，通過用抗⑶Ic微珠進(jìn)行磁選擇而從 大量培養(yǎng)物中純化(GM-CSF BMDC)?；蛘?，通過在lOOng/ml Flt3L(R&D)存在下培養(yǎng)骨髓 細(xì)胞10天而產(chǎn)生BMDC，此時(shí)所有活細(xì)胞是⑶Ilc陽性的(Flt3L BMDC)。通過釋放酶/ DNA酶消化來制備脾細(xì)胞，通過用抗⑶Ilc微珠的正選擇來富集DC。OT-I T細(xì)胞(來自淋 巴結(jié)和脾)通過使用生物素化抗體混合物(抗⑶11c、抗⑶lib、抗B220、抗FcyR、抗Gr-I 和抗CD4)負(fù)選擇然后用鏈霉親和素微珠進(jìn)行純化。人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)通過在 Ficoll-Hypaque (GE-Healthcare)上沉淀而從單個(gè)供體的淋巴細(xì)胞血沉棕黃層中制備。PCR/RT-PCR使用Trizol(Invitrogen)從用抗 CDllc 微珠(Miltenyi)富集了 CDllc 并在 FacsAria sort (BD)中針對⑶4和⑶8進(jìn)行分選的脾DC亞群中提取總RNA。另外，從GMCSF 和Flt3L體外衍生的BMDC分選亞群中提取RNA。通過DNA酶消化(無DNA，Ambion)制備 RNA，使用 Superscript II 逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco)、1 μ M dNTP 和 10 μ M 隨機(jī)六核苷酸(Gibco) 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用35個(gè)PCR循環(huán)擴(kuò)增cDNA，循環(huán)由30秒94°C，30秒55°C，1分鐘72°C組 成。引物序列如下mCLEC9a Fw 5‘ AGACTGCTTCACCACTCCAA ；mCLEC9a Rv 5' CTTGGCACAATGGACAAGGT ；b-肌動蛋白 Fw:5' GTTTGAGACCTTCAACACCCC,b-肌動蛋白 Rv:5' GTGGCCATCTCCTGCTCGAAGTC ；hClec9a Fw 5' CCCAAGTCTCATTTGGAGGA ；hClec9a-lRv 5' AAATCTGGACGGTGTGGAAG?？笴LEC9a mAb 的產(chǎn)生
針對小鼠Clec9a的mAb用轉(zhuǎn)染了與HA表位融合的CLEC9a的RBL-2H3細(xì)胞免疫Wistar大鼠，按照標(biāo)準(zhǔn)程 序?qū)碜猿庖叽笫蟮钠⒓?xì)胞與大鼠黑素瘤細(xì)胞系Y3進(jìn)行融合。對于陽性的檢測，我們使 用B3Z細(xì)胞系，其表達(dá)CLEC9a胞外結(jié)構(gòu)域、來自NKRPlB的跨膜區(qū)和⑶3 ζ的細(xì)胞內(nèi)尾以及 之后的IRES-GFP的嵌合體25，該策略已有描述21。mCLEC9a融合嵌合體的cDNA序列顯示于圖3中。B3Z細(xì)胞系含有與β -Gal活性 偶聯(lián)的NFAT報(bào)告子，任何嵌合分子的結(jié)合將導(dǎo)致NFAT和報(bào)告子的活化，然后所述報(bào)告子可 根據(jù)b-Gal活性的標(biāo)準(zhǔn)測定進(jìn)行分析。通過與親本細(xì)胞系相比，表達(dá)嵌合體的B3Z的功能 性活化來篩選抗體。通過與表達(dá)CLEC9a嵌合體的細(xì)胞(EGFP+)相比，親本細(xì)胞系(EGFP-) 的FACS分析來確認(rèn)被選為陽性的抗體。此方法允許選擇三種mAb，名為1F6，397和7H11，如圖4所示。然后將mAb與生物素或Alexa488綴合用于染色(Invitrogen)或者用于與Sl
肽綴合。針對人 Clec9a 的 mAb用表達(dá)與HA表位融合的人Clec9a的RBL-2H3細(xì)胞免疫BALB/c小鼠3-4次。使 用標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行脾細(xì)胞與小鼠黑素瘤細(xì)胞系SP2/0的融合。對于雜交瘤篩選，我們使用B3Z 細(xì)胞系，其表達(dá)NFAT的β -gal報(bào)告子(23)。用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)此細(xì)胞系，所述病毒編碼與 來自NKRPlB的跨膜區(qū)融合的人Clec9a胞外結(jié)構(gòu)域和⑶3 ζ的胞內(nèi)尾以及隨后的IRES序列 和GFP基因的嵌合體(24)。對雜交瘤上清液篩選其結(jié)合Clec9a嵌合體的能力，得到NFAT 報(bào)告子的活化和β -gal活性的誘導(dǎo)(24)。使用表達(dá)嵌合體Clec9a的B3Z細(xì)胞(GFP+)和 親本B3Z細(xì)胞(GFP-)的混合物，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步篩選在此測定中測試為陽性的上清 液。此方法允許選擇一種hClec9a特異性的小鼠mAb (8F9 (IgG2a))。流式細(xì)胞術(shù)對小鼠CDllc、⑶24、CDllb、B220、Ly6c、CD4和CD8 α具有特異性的以熒光染料 或生物素標(biāo)記的抗體來自BD Pharmingen0純化的2. 4G2 (抗Fc γ RIII/II)來自Cancer Research UK抗體生產(chǎn)服務(wù)。將小鼠細(xì)胞懸液與10 μ g/ml的2. 4G2mAb 一起孵育以封閉 Fcy受體，然后在添加了 2mM EDTA、1 % FCS和0. 02%疊氮化鈉的冰冷PBS中染色。對于 胞吞作用的研究，用5 μ g/ml生物素化抗Clec9a mAb在4°C下標(biāo)記經(jīng)Fc γ R封閉的細(xì)胞30 分鐘。然后，清洗細(xì)胞兩次，在4°C或37°C下孵育不同的時(shí)間，然后轉(zhuǎn)移到冰中，加入鏈霉親 和素PE。對于體內(nèi)標(biāo)記研究，以所示劑量靜脈內(nèi)注射與Alexa-488綴合的抗Clec9a或同種 型匹配對照mAb，在16小時(shí)后制備組織并分析。對人⑶3、⑶14、⑶19、⑶56、HLA-DR、⑶34、 CD123 和 CD16 具有特異性的抗體購自 BD，CDlb/c 和 BDCA-3 來自 AbCam(Cambridege，UK)。 用100 μ g/ml人IgG(Sigma-Aldrich)封閉人單核細(xì)胞并如上進(jìn)行染色。在FACSCalibur (BD Biosciences)上獲得數(shù)據(jù)，并使用 FlowJo 軟件(Treestar，San Carlos, CA)進(jìn)行分析。BM-DC培養(yǎng)和刺激如上所述26產(chǎn)生GM-CSF BM-DC,在使用前用抗⑶Ilc微珠從大批培養(yǎng)物中純化 DC(Miltenyi Biotec)。通過FACS檢查BM-DC的純度，其通常為> 98% (數(shù)據(jù)未顯示)。 Flt3L BMDC產(chǎn)生自在75ng/ml或50ng/ml的Flt3L(R&D)存在下培養(yǎng)10天的骨髓。對于 細(xì)胞因子的產(chǎn)生和表面標(biāo)志物的表達(dá)分析，將每孔5-10 X IO4個(gè)Flt3L BM-DC在96孔平 底培養(yǎng)板中200ml含F(xiàn)lt3L培養(yǎng)基中培養(yǎng)18-24小時(shí)，所述培養(yǎng)板之前用同種型對照或抗 CLEC9a mAb包被。通過夾心法ELISA，使用捕獲抗IL_12p40-p70 (C15. 6)和檢測生物素抗 IL12p40-p70(C17. 8)(兩者均來自BD)測定上清液中的細(xì)胞因子水平。對于Flt3L BMDC中 的胞吞作用，用10 μ g/ml的2. 4G2mAb封閉Fc y R，然后細(xì)胞與5 μ g/ml生物素化mAb在4°C 或37°C下一起培養(yǎng)30分鐘，清洗并在測定溫度下經(jīng)過1. 5小時(shí)或0. 5小時(shí)，然后清洗并同 時(shí)在4°C下加入第二試劑(鏈霉親和素PE)。對于共聚焦分析，將與Alexa 488綴合的mAb 以5mg/ml加入到經(jīng)Fc Y R封閉的Flt3L_BMDC中，在4°C或37°C下30分鐘，然后清洗并且在 測定溫度下再經(jīng)過1. 5小時(shí)，然后使之粘附于聚L-賴氨酸包被的蓋玻片上，在2% PFA中室 溫下固定20分鐘。用Fluoromount (Southern Biotech, Birmingham, AL)將樣品包埋在載玻 片上。用激光掃描共聚焦顯微鏡(Axioplan 2,Zeiss,Germany)和 63° -Plan-Apochromat NA 1.4油鏡同時(shí)獲得一系列共聚焦微分干涉相差圖和熒光圖。用LSM 510軟件(Zeiss，Germany)進(jìn)行圖像分析。Jj太下拉(Pull-down)和 Western 印跡對于肽下拉，將生物素綴合的肽溶于40% DMSO中，然后在裂解緩沖液中稀釋。將 在裂解緩沖液中稀釋的重組人Syk(Upstate)與所示的對應(yīng)于CLEC9a和Dectin-Ι胞內(nèi)尾 (Cancer Research UK肽合成實(shí)驗(yàn)室)和鏈霉親和素-瓊脂糖(Sigma Biosciences AB, Uppsala, Sweden)的生物素化肽一起孵育。在親和純化之后，將瓊脂糖珠在裂解緩沖液中 清洗一次，在含有10% β-巰基乙醇的SDS凝膠上樣緩沖液中煮沸。通過十二烷基硫酸 鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到Immobilon PVDF膜(Millipore Corporation,Bedford,MA)上，用兔抗Syk(針對對應(yīng)于小鼠Syk的318-330位氨基酸的合 成肽而產(chǎn)生的2131血清2°與來自Cell Signaling Technology，Inc.，目錄號2712的針對 對應(yīng)于人Syk C端的合成肽而產(chǎn)生的抗Syk抗體的組合)作為探針檢測，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā) 光檢測。在LK細(xì)胞活化測定中，在所示時(shí)間將LK細(xì)胞鋪板于用抗C9或同種型對照包被的 6孔板中。在裂解緩沖液(50mM HEPES[pH7. 4]，150mM氯化鈉，IOOmM氟化鈉，IOmM焦磷酸 鈉，ImM原釩酸鈉[pH10. 0]，ImM EDTA[pH 8. 0]，1. 5mM氯化鎂，10%甘油，1 % TritonX-100， ImM PMSF和“完全”蛋白酶抑制劑混合片劑[Roche])中制備細(xì)胞提取物；棄去不溶物質(zhì)，將 固定量的裂解物如上所述進(jìn)行SDS-PAGE。對于WB，兔抗Syk如上所述，抗P_Syk、抗Erk、抗 P-Erk 來自 Cell Signaling。B3Z和BWZ細(xì)胞中的NFAT報(bào)告子測定含有與LacZ活性偶聯(lián)的NFAT報(bào)告質(zhì)粒的B3Z細(xì)胞以前已有記載25。將CLEC9a WT或突變形式的Y7F (Stratagene)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)wt或Syk轉(zhuǎn)導(dǎo)的B3Z細(xì)胞。如所述將細(xì)胞鋪在 用同種型對照或抗CLEC9a mAb包被的96孔板中21，過夜培養(yǎng)后，在PBS中清洗，在含CPRG 緩沖液中裂解。四個(gè)小時(shí)后，測定A595，施用0D655作為參照。對于CLEC9A配體的檢測，用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)BWZ細(xì)胞系，所示病毒編碼融合了來 自NKRPlB的跨膜區(qū)的小鼠或人CLEC9A胞外結(jié)構(gòu)域和⑶3 ζ的胞內(nèi)尾以及隨后的IRES序 列和GFP基因的嵌合體(24)。與CLEC9A嵌合體結(jié)合的配體會導(dǎo)致NFAT報(bào)告子的活化和 β -gal活性的誘導(dǎo)。為了測定表達(dá)小鼠和人CLEC9A-CD3 ζ嵌合受體的BWZ細(xì)胞基礎(chǔ)活化， 將4、2、1或0. 5Χ IO6個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)在6孔板的3ml培養(yǎng)基中，使之(過度)生長兩天。 使用T0-PR03染料(Invitrogen)測定死細(xì)胞的頻率，將活細(xì)胞以2 X IO5個(gè)/孔鋪在96孔 平底板的新鮮培養(yǎng)基中。過夜培養(yǎng)后，如上所述測定LacZ活性。為了確定不同細(xì)胞類型中配體的暴露，使LK(B細(xì)胞系)、使用標(biāo)準(zhǔn)方案來源于 bm-1小鼠的SV-40永生化小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF) {Ref}、RBL大鼠白血病、3T3成纖維細(xì) 胞和HEK-293人胚腎細(xì)胞接受UV照射(240mJ/cm2)，留置24小時(shí)以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，然后以 1 1的比例添加到96孔平底板中的2 X IO5個(gè)BWZ轉(zhuǎn)染子，其中存在或不存在對照Fab或 抗小鼠 CLEC9A(1F6)和抗人 CLEC9A (8F9) Fab (Sancho 等人，J Clin Invest. 2008 ； 118 (6) 2098-110)。過夜培養(yǎng)后，如上所述測定LacZ活性。在一些測定中，將轉(zhuǎn)染有CLEC9A wt的 BffZ細(xì)胞用于確定配體是否通過胞質(zhì)尾進(jìn)行信號傳導(dǎo)，并且評價(jià)完整抗體作為封閉試劑是 否與Fab相當(dāng)。用下述UV劑量(mj/cm2)照射LK細(xì)胞進(jìn)行UV劑量應(yīng)答:0、0. 5、1. 5、5、15、50、240。24小時(shí)后，使用t0-pr03染料測定死亡細(xì)胞的頻率，在新鮮培養(yǎng)基中將所述細(xì)胞以與BWZ轉(zhuǎn) 染子以1 1的比例(2X105個(gè)細(xì)胞/孔)鋪板。過夜培養(yǎng)后，如上所述測定LacZ活性。對LK細(xì)胞和bm-1永生化MEF的不同處理評價(jià)配體暴露。將細(xì)胞與米托蒽醌 (ΙμΜ) —起培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)，或者在無血清情況下(除去血清)培養(yǎng)。如前所述進(jìn)行滲透 壓沖擊(Liu等· 2002. J. Exp. Med. 196 1091-1097)。對細(xì)胞沉淀進(jìn)行三輪凍融，在液氮中 冷凍，在37°C下解凍。在這些處理之后，使用to-pro3染料確定死細(xì)胞頻率，如下文所述對 rsCTLD染色。在新鮮培養(yǎng)基中細(xì)胞以與BWZ轉(zhuǎn)染子1 1的比例鋪板(2X IO5個(gè)細(xì)胞/ 孔)。過夜培養(yǎng)之后，如上所述測定LacZ活性。SIINFEKLC-biot(Sl)與 mAb 的偶聯(lián)為了將免疫顯性O(shè)VA肽SIINFEKL與二價(jià)抗體綴合，合成SIINFEKL肽衍生物，名為 Si，其含有添加的用于產(chǎn)生游離巰基的半胱氨酸(C)以及用于對標(biāo)記示蹤的生物素，其在 Cancer Research UK通過高效液相色譜進(jìn)行純化。在室溫下用磺基-SMCC處理mAb 30分 鐘，在叔胺中產(chǎn)生磺基反應(yīng)性基團(tuán)，然后在分子大小排阻色譜柱(Pierce)中純化活化的抗 體。然后，新鮮制備Sl肽，使之以等摩爾量與活化的抗體在37°C下反應(yīng)1小時(shí)，在色譜柱中 純化。使用Fluor印orter試劑盒(Invitrogen)及其所帶的產(chǎn)品說明，mAb生物素化的程 度使我們能夠定量，在所產(chǎn)生的所有抗體“綴合物”中每個(gè)mAb分子偶聯(lián)1-1. 2個(gè)肽。將S2肽和黑素細(xì)胞分化抗原肽與mAb偶聯(lián)在CancerResearch UK通過HPLC合成和純化S2肽(SIINFEKLTEWTSSNVMEERC-生 物素)。在室溫下用磺基-SMCC處理PBS中的mAb 30分鐘，在叔胺中產(chǎn)生磺基反應(yīng)性基 團(tuán)。通過分子大小排阻色譜(Pierce)純化活化的抗體，加入S2肽(2 1摩爾比)，使反 應(yīng)在37°C下進(jìn)行1小時(shí)。使用Immunobind s印harose柱純化綴合物。根據(jù)產(chǎn)品說明使用 Fluor印orter試劑盒(Invitrogen)評估m(xù)Ab的生物素化程度。使用相同策略合成來自黑素細(xì)胞分化抗原的肽，gplOO (EGSRNQDWL和 KVPRNQDffL ；H-2Db 限制性(25))，TRP-I (TWHRYHLL 和 TAYRYHLL ；H_2Kb 限制性(26))和 TRP-2 (SVYDFFVWL ；H_2Kb限制性(27))，每個(gè)均通過在C端添加半胱氨酸-eahx-生物素來 進(jìn)行修飾。使用抗CLEC9a mAb進(jìn)行體內(nèi)靶向。將抗CLEC9a、同種型對照或者抗DEC-205與Alexa488 (Invitrogen)偶聯(lián)或者與 Sl肽偶聯(lián)。對于使用Alexa488Ab的靶向?qū)嶒?yàn)，靜脈注射mAb_Alexa488 (20 μ g)，在16小時(shí) 后提取脾細(xì)胞并進(jìn)行分析。在體內(nèi)對特定亞群的抗原靶向?qū)嶒?yàn)中，靜脈注射Sl-Ab (5 μ g)，提取脾細(xì)胞，使用 抗CDllc微珠(Miltenyi Biotec)在⑶Ilc陽性和陰性級分中進(jìn)行純化。0Τ-Ι細(xì)胞獲得 自O(shè)T-I Rag-/-小鼠的淋巴結(jié)和脾細(xì)胞，使用生物素化抗體(抗CDllc，CDllb，B220，F(xiàn)cgR， Gr-I和⑶4)然后使用鏈霉親和素微珠(Miltenyi Biotec)通過負(fù)選擇進(jìn)行純化。如圖例 中所示的，在U形底培養(yǎng)板中將不同量的體內(nèi)靶向DC與IO5個(gè)用2 μ MCFSE (Invitrogen)標(biāo) 記的OT-I細(xì)胞一起培養(yǎng)。三天后，通過在Vβ 5. 1和⑶8陽性以及T0-PR0 3陰性的細(xì)胞中 進(jìn)行CFSE稀釋來測定增殖。使用實(shí)際計(jì)數(shù)的珠(...)獲取細(xì)胞，從而對細(xì)胞的絕對數(shù)進(jìn)行 定量。通過夾心法ELISA測定上清液中的IFN- γ。在體內(nèi)靶向以評價(jià)特異性CTL應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)中，在后爪中皮下注射mAb-Sl (2 μ g)，同時(shí)注射或不注射25μ g抗⑶40 (3/23，BDPharmingen)，五天后如所述進(jìn)行體內(nèi)殺傷測 定27。簡言之，在來自B6. SJL背景(同族⑶45. 1+)的靶脾細(xì)胞中載入20nM、200nM或0的 SIINFEKL肽，并分別用0. 03 μ Μ、0· 3μΜ或3μΜ的CFSE在37°C下標(biāo)記20分鐘。靜脈注射 經(jīng)標(biāo)記的脾細(xì)胞(IO7個(gè))。第二天，提取脾細(xì)胞，對⑶45. 1陽性群進(jìn)行CFSE分析。另外， 在存在或不存在1 μ MSIINFEKL下將5 X IO5個(gè)脾細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，通過ELISA對上清液的 IFN γ 進(jìn)行定量。還用 SIINFEKL-H2kb 四聚體(Beckman Coulter)、抗 CD8 和抗 Thy 1. 2 標(biāo) 記血細(xì)胞和脾細(xì)胞，分析⑶8+T細(xì)胞群中的四聚體+細(xì)胞％。B16黑素瘤腫瘤治療模型。用OVA-GFP融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)B16黑素瘤細(xì)胞，對GFP表達(dá)進(jìn)行分選。在同族B6小鼠 的尾中靜脈注射腫瘤細(xì)胞(2X IO5個(gè))，6天后在爪內(nèi)皮下注射由Ab-Sl+抗CD40組成的治 療性處理。在腫瘤注射后第18天，對肺腫瘤計(jì)數(shù)。以類似的方式進(jìn)行腫瘤治療實(shí)驗(yàn)，不同 的是在抗體治療之前3天小鼠接受B16-0VA。還用未轉(zhuǎn)導(dǎo)的親本B16細(xì)胞進(jìn)行腫瘤治療和預(yù)防實(shí)驗(yàn)。在用抗CLEC_9a抗體或 對照抗體免疫的3天前(治療)或1天后(預(yù)防)，它們通過靜脈內(nèi)給藥(5X105個(gè)/小 鼠)，所述抗體與來源于gplOO、TRP-I和TRP-2 (1 μ g/爪)以及抗CD40 (12. 5 μ g/爪)和 聚I:C(5yg/爪)的5個(gè)肽的混合物共價(jià)偶聯(lián)。通過肺病灶計(jì)數(shù)來評估腫瘤負(fù)荷。當(dāng)它們 多到難以計(jì)數(shù)時(shí)(> 250個(gè)/小鼠)，顯示為250。如上所述監(jiān)測CTL應(yīng)答。產(chǎn)生Clec9a+小鼠使用Red/ET 重組工程(Gene Bridges, Heidelberg, Germany)產(chǎn)生小鼠，以從 BAC克隆RP-23248-K14(C57BL/6BAC克隆，來自Invitrogen)直接獲取用于修飾的基因區(qū) 域。使用與載體配對的20個(gè)核苷酸和與待捕獲Clec9a區(qū)域配對的70個(gè)核苷酸的引物， 通過PCR擴(kuò)增常規(guī)基因靶向替換載體pFloXRI+tk，其同時(shí)使用陽性(新霉素抗性基因) 和陰性(單純皰疹病毒胸苷激酶基因)選擇以分離同源重組ES細(xì)胞克隆。所用引物是 Fw 3arm 24330p Flox 5' ATAATATCAT ATTTCTATAA TATCATTGTAATGACAAAAC CACTGAACTA GTGCCTGTAA AGGCAGGAGG GGTACCGAGCTCGMTTCTA CCG 3' ；Rv pFlox 5arm 5' TGCTATATTA CAGATTTTCAAGTGGGGTAG CCTGGAGTAA CAAGATGGCA GGGCATAATC ACTAGTGCGGCCGCCACCGC GGTGGAGCTC CAGCTTT 3'。一旦在Amp抗性載體中包含待修飾的區(qū)域，則包含法尼基化EGFP和PGK_gb2啟動 子以及其后Kan/Neo的表達(dá)盒就允許通過Kan選擇重復(fù)進(jìn)行重組工程化同源重組步驟。用 于擴(kuò)增EGFP-F Kan-Neo抗性表達(dá)盒的引物為Rv NeoKan 3arm 5' TGCTTTTGTACTTACACTTG ATGCCCAAGA AAATGGACGT TGCTAACAAG CCCATACAGACCACACCTCG AGATAACTTC GTATAATGTA T3 ‘ 和 Fw 5arm EGFP-F 5 ‘ TTTGTGCCAG GCTCCTATGT AGACTGCTTC ACCACTCCAA GCGCCTTCAGCATGCATGTC GACATGGTGA GCAAGGGCGA GGAG 3'。制備靶向載體以表達(dá)具有強(qiáng)多聚A的EGFP-F，其緊鄰CLEC9A中前兩個(gè)氨基酸 的下游，并破壞外顯子1和2，以強(qiáng)多聚A結(jié)束轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)染之前用NotI將靶向載體 線性化。通過電穿孔對S6B6雜合129S6/C57BL/6F1衍生胚胎干細(xì)胞(ES)進(jìn)行轉(zhuǎn)染， 在G418和更昔洛韋(gancyclovir)中培養(yǎng)后分離重組克隆。通過PCR對ES細(xì)胞存活 選擇進(jìn)行篩選，其中使用兩對獨(dú)立的引物，引物之一在短臂的外部。所用的引物對位 Scr Fwl5 ‘ GATCTGTGTGTTGGTTTTTG TGTGC 3 ‘ ；Scr Rvl. 5 ‘ TAGCATGGCA CTTCTCCATTACCTT3，擴(kuò)增子FwlRvl :2138bp. Scr Fw2,5' GCGAATTCGG TACCAATAAAAGAGC 3' ；Scr Rv2, 5' CAGAAGCTTC CTGGTTTTGG TTTTT 3'擴(kuò)增子 Fw2Rv2 :2352。將正確靶向的核型整倍體ES克隆顯微注射進(jìn)交配后3. 5天的C57BL/6囊 胚中，將具有毛色嵌合的所得后代與C57BL/6雌性交配以鑒定種系傳遞(germline transmission)。隨后，將種系傳遞嵌合體與C57BL/6雌性交配，以確保純C57BL/6背景中 基因靶向的等位基因。將雜合動物進(jìn)行種間雜交產(chǎn)生純合缺陷型動物和匹配的同窩對照。 敲除小鼠中與Clec9a連接之NKl. 1C57BL/6基因的表達(dá)顯示，靶向的C57BL/6BAC克隆的同 源重組在S6B6ES細(xì)胞中整合到Fl的C57BL/6拷貝中。此工作所用的CleC9a-/-小鼠是在與C57BL/6回交的第三代中混合129/ Sv X C57BL/6遺傳背景上。產(chǎn)生重組可溶性CTLD。將小鼠CLEC9A和Dectin-Ι的CTLD獨(dú)立地框內(nèi)克隆進(jìn)p3xFlag_CMV_9表達(dá)載體， 其來自Sigma，具有添加的BirA單生物素化序列。用于CTLD擴(kuò)增的引物是mCLEC9A Fw 5' GGATCCmCLEC9A Rv 5' GGATCC mDectin Fw 5' GGATCC3‘ mDectin Rv 5' GGATCC3‘。 轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并用G418(lmg/ml)進(jìn)行選擇。通過有限稀釋將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子克隆兩次，選擇將 來自Dectin-I或CLEC9A的rsCTLD分泌到上清液中的克隆，通過夾心法ELISA進(jìn)行檢測， 其中使用抗flag M2 (Sigma)進(jìn)行捕獲，并使用生物素-2A11抗Dectin-I或生物素-1F6抗 CLEC9A進(jìn)行檢測。在 CELLine 生物反應(yīng)器(IntegraBiosciences, Chur, Switzerland)中產(chǎn) 生來自CHO克隆的濃縮上清液，使用抗flag M2瓊脂糖(Sigma)進(jìn)行純化。然后，使用標(biāo)準(zhǔn) 程序進(jìn)行單生物素化{Ref}，使用PE-鏈霉親和素(Sigma)產(chǎn)生四聚體。然后，使用rsCTLD 的PE四聚體在常規(guī)FACS緩沖液中在4°C下對死細(xì)胞或酵母聚糖染色30分鐘。用to-pro3 復(fù)染樣品，通過流式細(xì)胞術(shù)獲取。體外交叉呈遞在體外交叉呈遞測定中，我們將三種類型細(xì)胞共培養(yǎng)載有OVA或表達(dá)OVA的死細(xì) 胞，在存在或不存在封閉CLEC9A的抗體下來自不同起源的Flt3L BMDC,以及讀數(shù)——OT-I OVA-特異性轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞。我們測試了來自CLEC9a+或CLEC9a+同窩仔的Flt3L BMDC。另 外，將來自C57BL/6的Flt3L BMDC在存在或不存在對照Fab或抗CLEC9A (1F6) Fab (10 μ g/ ml)以及抗CLEC9A的完整抗體或同種型對照(20 μ g/ml)的情況下培養(yǎng)。如所示，如所述 (19)分選具有⑶Ilblo和⑶24hi的⑶8 α樣Flt3L BMDC。作為用于交叉呈遞的死細(xì)胞相 關(guān)OVA抗原的來源，我們使用bm-1脾細(xì)胞，表達(dá)H2Kb分子中突變的C57BL/6同族小鼠，所述 突變防止作為H2Kb的免疫顯性I類OVA肽的SIINFEKL的結(jié)合。用這種方式，載有OVA的 細(xì)胞將不能直接呈遞OVA肽，應(yīng)被加工并交叉呈遞以產(chǎn)生應(yīng)答。為了通過吸附加載0VA，我 們將具有低水平內(nèi)毒素的所示劑量可溶性O(shè)VA(Calbi0Chem)與bm_l脾細(xì)胞在PBS中一起 孵育20分鐘，然后在PBS中清洗五次。或者，我們產(chǎn)生bm-1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，用 SV-40大T抗原使其永生化。然后，我們用截短的非分泌型OVA-GFP融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)它們，針 對OVA-GFP的均勻表達(dá)進(jìn)行分選。然后，對載有OVA的脾細(xì)胞和表達(dá)OVA的MEF都進(jìn)行UV 照射(240mJ/cm2)并在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第二天，將脾細(xì)胞與Flt3L BMDC(105個(gè)細(xì) 胞/孔，96孔U型底)以5 1的比例共培養(yǎng)，將OVA-MEF與Flt3L BMDC以1 1比例培 養(yǎng)。將使用MACS珠(Miltenyi)負(fù)選擇并用CFSE (2 μ Μ)標(biāo)記的0Τ-Ι細(xì)胞(純度> 80% ) 添加到該測定中(IO5個(gè)細(xì)胞/孔)。三天后，收獲上清液，通過夾心法ELISA檢測IL-2和IFN-γ，用PMA(lOng/ml)和伊屋諾霉素(500ng/ml)刺激細(xì)胞4小時(shí)，在培養(yǎng)的最后3小 時(shí)加入布雷菲德菌素A(10yg/ml，Sigma)。然后，通過胞內(nèi)染色對細(xì)胞進(jìn)行V β 5、⑶8和 IFN-Y染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)獲取，以確定絕對計(jì)數(shù)，用固定數(shù)目的校準(zhǔn)珠(BD)加載樣 品，通過細(xì)胞內(nèi)染色測定IFN-Y的產(chǎn)生。死細(xì)胞的攝取將訂或0^09&+^8 0樣？1131^ BMDC與不同比例的脾細(xì)胞孵育2小時(shí)，所述脾 細(xì)胞在24小時(shí)前用UVC(240mJ/cm2)處理并用PKH26 (Sigma)標(biāo)記。因?yàn)镕lt3L BMDC是對 CD24進(jìn)行標(biāo)記的，所以PKH26和CD24雙陽性可以是由于瀕死細(xì)胞的結(jié)合(4°C )或結(jié)合+ 攝取(37°C )，并且通過每個(gè)類型DC的流式細(xì)胞術(shù)對頻率進(jìn)行定量。體內(nèi)交叉呈遞對如上所述產(chǎn)生的表達(dá)OVA的永生化bm-lMEF進(jìn)行UVC處理(240mJ/cm2)，過夜 培養(yǎng)，然后進(jìn)行靜脈注射(0.75X 106個(gè)細(xì)胞/小鼠)。在靜脈注射30分鐘之前，用腹膜內(nèi) 注射PBS或者400 μ g同種型對照(AFRO-MAC 49，大鼠IgGl)或1F6抗CLEC9A預(yù)處理小 鼠(C57BL/6)?；蛘?，使用Clec9a+或者同窩仔CleC9a+。六天后，通過H2Kb_0VA肽四聚體 陽性細(xì)胞數(shù)和⑶8亞群中應(yīng)答于離體SIINFEKL的IFNy產(chǎn)生而對內(nèi)源庫所產(chǎn)生⑶8+T細(xì) 胞效應(yīng)子應(yīng)答的誘導(dǎo)進(jìn)行示蹤。在圖19c和19d中，匯集來自獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的多個(gè)同窩仔的數(shù) 據(jù)，我們在匯集之前進(jìn)行數(shù)據(jù)的歸一化。每一窩(雌性)被認(rèn)為是一個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，將每一窩 中的原始數(shù)據(jù)對該窩中ClecQa+小鼠的平均值進(jìn)行歸一化，然后乘以在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的所有 窩中全部ClecQa+小鼠群體獲得的算術(shù)平均值。對于窩中倍數(shù)改變的分析，計(jì)算每一窩中 ClecQa+小鼠或Clec9a+小鼠的算術(shù)平均值。所分析的12窩中全部顯示，與Clec9a+相比， Clecga-7-小鼠的⑶8T細(xì)胞亞群中四聚體陽性細(xì)胞百分比算術(shù)平均值的倍數(shù)降低。統(tǒng)計(jì)使用雙因素t檢驗(yàn)對組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，或者在歸一化數(shù)據(jù)無法推知時(shí)使 用U Marm-Whitney進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。ρ < 0. 05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。定量數(shù)據(jù)表示為 平均值士SEM，除非另外指明。盡管通過上述示例性實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但許多等同修飾和改變對給予本公 開內(nèi)容的本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的。因此，所述的本發(fā)明示例性實(shí)施方案被認(rèn)為是示 例性而不是限制性的?？蓪λ鰧?shí)施方案進(jìn)行多種改變而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。本 文引用的文獻(xiàn)通過引用并入本文。參考文獻(xiàn)1. 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權(quán)利要求
將肽抗原靶向至抗原呈遞細(xì)胞的方法，其包括使所述抗原呈遞細(xì)胞與包含所述抗原的組合物相接觸，其中所述抗原與對CLEC9a有親和力的結(jié)合劑相聯(lián)合，并且其中所述抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)CLEC9a。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述樹突細(xì)胞能夠通過I類MHC分子交叉呈遞胞外抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其在體外或體內(nèi)進(jìn)行。
5.在對象中刺激針對肽抗原之免疫應(yīng)答的方法，其包括對所述對象施用包含所述抗原 的組合物，其中所述抗原與對CLEC9a有親和力的結(jié)合劑相聯(lián)合。
6.根據(jù)權(quán)利要5的方法，其包括多于一次地施用所述組合物。
7.一種包含肽抗原的組合物，其中所述抗原與對CLEC9a有親和力的結(jié)合劑相聯(lián)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述組合物包含與可藥用載體相組合的所述抗原和 所述結(jié)合劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的組合物，其制備成用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)鼻、皮下或皮 內(nèi)施用。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)的組合物，其用于醫(yī)療方法中。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項(xiàng)的組合物，其用于刺激針對所述抗原的免疫應(yīng)答。
12.根據(jù)權(quán)利要求7至11中任一項(xiàng)的組合物在制備用于刺激針對所述抗原之免疫應(yīng)答 的藥物中的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法、組合物或用途，其中待刺激的免疫應(yīng)答是 CTL應(yīng)答或Treg應(yīng)答。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的方法、組合物或用途，其中所述組合物與佐劑一起 施用，或者制備成與佐劑一起施用。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法、組合物或用途，其中所述佐劑是視黃酸、CD40激動劑或 TLR激動劑，或者另一種免疫刺激劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的方法、組合物或用途，其中所述抗原與所述結(jié)合劑 共價(jià)偶聯(lián)。
17.根據(jù)權(quán)利要求17的方法、組合物或用途，其中所述抗原和結(jié)合劑是同一肽鏈的一 部分。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的方法、組合物或用途，其中所述結(jié)合劑包含對 CLEC9a具有特異性的抗體結(jié)合位點(diǎn)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法、組合物或用途，其中所述結(jié)合劑是抗體或其功能性片段。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的方法、組合物或用途，其中所述結(jié)合劑是CLEC9a 激動劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)的方法、組合物或用途，其中所述結(jié)合劑有至少兩個(gè) CLEC9a結(jié)合位點(diǎn)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的方法、組合物或用途，其中所述抗原是肽或者包含 肽，所述肽來自病原體或寄生生物所表達(dá)的蛋白質(zhì)或來自癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法、組合物或用途，其中所述抗原是病毒蛋白質(zhì)或腫瘤特異性抗原。
24.根據(jù)權(quán)利要求13的方法、組合物或用途，其中所述應(yīng)答是Treg應(yīng)答，并且其中所述 抗原是這樣的抗原期望抑制或阻止針對該抗原的不期望的免疫應(yīng)答。
25.在對象中抑制免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述對象施用CLEC9a拮抗劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述拮抗劑是對CLEC9a具有親和力的結(jié)合劑，或者 編碼對CLEC9a具有親和力之結(jié)合劑的核酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述結(jié)合劑能夠直接或間接抑制其所結(jié)合細(xì)胞的功能。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述結(jié)合劑能夠直接或間接殺傷所述細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28的方法，其中所述結(jié)合劑能夠募集該對象免疫系統(tǒng)的組分， 從而刺激對該細(xì)胞的免疫攻擊。
30.根據(jù)權(quán)利要求26至29中任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)合劑包含抗體Fc區(qū)。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述結(jié)合劑包含能夠殺傷所述細(xì)胞的毒素分子。
32.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述結(jié)合劑包括能夠活化該細(xì)胞附近之前藥的酶。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述酶將無毒分子轉(zhuǎn)化成有毒分子。
34.根據(jù)權(quán)利要求26至33中任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)合劑包含對CLEC9a具有特異 性的抗體結(jié)合位點(diǎn)。
35.根據(jù)權(quán)利要求26至34中任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)合劑具有僅一個(gè)CLEC9a特異 性結(jié)合位點(diǎn)。
36.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述CLEC9a拮抗劑能夠抑制CLEC9a與其配體的結(jié)I=I ο
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中CLEC9a拮抗劑是可溶性分子，其包含CLEC9a的胞外 結(jié)構(gòu)域或其能夠結(jié)合CLEC9a配體的片段。
38.根據(jù)權(quán)利要求25至37任一項(xiàng)的方法，其中施用所述拮抗劑的對象患有炎性病癥或 自身免疫病，尤其是以不期望的CTL活性為特征的疾病。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述疾病選自-自身免疫病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及含有免疫成分的其他類型的慢性或急性關(guān)節(jié) 炎或關(guān)節(jié)病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、SjGgren綜合征、自身免疫性(尤其是I型)糖尿 病、甲狀腺炎，及其他器官特異性免疫疾病，包括銀屑病；-神經(jīng)疾病，包括多發(fā)性硬化、重癥肌無力，及其他神經(jīng)免疫的介導(dǎo)疾??； -胃腸疾病，包括克羅恩病、結(jié)腸炎、乳糜瀉和肝炎；-心血管疾病，包括動脈粥樣硬化、心肌病、風(fēng)濕熱、心內(nèi)膜炎、血管炎，及其他免疫介導(dǎo) 的心血管疾病；-免疫介導(dǎo)的呼吸疾病，包括肺氣腫、呼吸道感染，及其他免疫介導(dǎo)的呼吸疾??； -變應(yīng)性過程和超敏反應(yīng)(I、II、III和IV型)，包括哮喘、鼻炎及其他免疫介導(dǎo)的超敏 反應(yīng)；-移植或移植物排斥以及移植物抗宿主病，發(fā)生在例如器官移植、組織移植、輸血、骨髓 移植期間或之后；-對傳染原的免疫病理應(yīng)答，包括膿毒性休克綜合征；“退行性過程，例如神經(jīng)退行性過程，其涉及免疫活性細(xì)胞例如小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
40.用于醫(yī)療方法的CLEC9a拮抗劑或者對CLEC9a具有親和力的結(jié)合劑。
41.用于抑制免疫應(yīng)答的CLEC9a拮抗劑或者對CLEC9a具有親和力的結(jié)合劑。
42.CLEC9a拮抗劑或者對CLEC9a具有親和力的結(jié)合劑在制備用于抑制免疫應(yīng)答的藥 物中的用途。
43.根據(jù)權(quán)利要求40至42中任一項(xiàng)的結(jié)合劑或用途，其包含對CLEC9a具有特異性的 抗體結(jié)合位點(diǎn)。
44.根據(jù)權(quán)利要求40至43中任一項(xiàng)的結(jié)合劑或用途，其中所述結(jié)合劑能夠直接地或間 接地抑制其所結(jié)合細(xì)胞的抗原呈遞。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的結(jié)合劑或用途，其中所述結(jié)合劑能夠直接或間接殺傷所述細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求44或45的結(jié)合劑或用途，其中所述結(jié)合劑能夠募集所述對象的免疫 系統(tǒng)的組分，從而刺激對該細(xì)胞的免疫攻擊。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的結(jié)合劑或用途，其中所述結(jié)合劑包含抗體Fc區(qū)。
48.根據(jù)權(quán)利要求45的結(jié)合劑或用途，其中所述結(jié)合劑包含能夠殺傷所述細(xì)胞的毒素 分子。
49.根據(jù)權(quán)利要求45的結(jié)合劑或用途，其中所述結(jié)合劑包括能夠活化該細(xì)胞附近之前 藥的酶。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的結(jié)合劑或用途，其中所述酶將無毒分子轉(zhuǎn)化為有毒分子。
51.根據(jù)權(quán)利要求40至42中任一項(xiàng)的CLEC9a拮抗劑或用途，其中所述CLEC9a拮抗劑 能夠抑制CLEC9a與其配體的結(jié)合。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的CLEC9a拮抗劑或用途，其中CLEC9a拮抗劑是可溶性分子，其包 含CLEC9a的胞外結(jié)構(gòu)域或其能夠結(jié)合CLEC9a配體的片段。
53.在對象中刺激免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述對象施用CLEC9a激動劑。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中所述激動劑是對CLEC9a具有親和力的結(jié)合劑。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中所述結(jié)合劑包含對CLEC9a具有特異性的抗體結(jié)合位點(diǎn)ο
56.根據(jù)權(quán)利要求54或55的方法，其中所述結(jié)合劑包含多于兩個(gè)對CLEC9a具有特異 性的結(jié)合位點(diǎn)。
57.檢測樣品中細(xì)胞的方法，其包括使所述樣品接觸對CLEC9a具有親和力的結(jié)合劑， 以及測定所述結(jié)合劑與一種或多種細(xì)胞的結(jié)合。
58.從樣品中分離細(xì)胞的方法，其包括使所述樣品接觸對CLEC9a具有親和力的結(jié)合 劑，以及分離與所述結(jié)合劑結(jié)合的一種或多種細(xì)胞。
59.根據(jù)權(quán)利要求57或58的方法，其中所述結(jié)合劑固定在固體支持物上。
60.根據(jù)權(quán)利要求57至59中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì)胞。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所述樹突細(xì)胞能夠通過I類MHC分子交叉呈遞胞外 抗原。
62. 根據(jù)權(quán)利要求57至61中任一項(xiàng)的方法，其包括將所述樣品與對樹突細(xì)胞標(biāo)志物具 有親和力的第二結(jié)合劑相接觸。4
63.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中所述樹突細(xì)胞標(biāo)志物是CD11，優(yōu)選CDllc，或 HLA-DR，或 BDCA-3。
64.根據(jù)權(quán)利要求62或63的方法，其中僅有與所述第一和第二結(jié)合劑均結(jié)合的細(xì)胞被 鑒定或分離。
65.根據(jù)權(quán)利要求57至64中任一項(xiàng)的方法，其包括對一種或多種不想要的細(xì)胞類型進(jìn) 行負(fù)選擇。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中所述不想要的細(xì)胞類型是樹突細(xì)胞的亞群。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中所述不想要的細(xì)胞類型是漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(pDC)。
68.根據(jù)權(quán)利要求57至67中任一項(xiàng)的方法，其包括測定細(xì)胞上CLEC9a的表達(dá)水平。
69.根據(jù)權(quán)利要求58至68中任一項(xiàng)所述方法分離的抗原呈遞細(xì)胞或其群體。
70.—種刺激針對肽抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括提供根據(jù)權(quán)利要求69的抗原呈遞 細(xì)胞或其群體，以及使所述細(xì)胞或細(xì)胞群接觸所述抗原。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其包括向所述對象施用所述細(xì)胞或細(xì)胞群體。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的方法，其中所述細(xì)胞被重新施用給其所來源的對象。
73.根據(jù)權(quán)利要求71或72的方法，其還包括將所述細(xì)胞或細(xì)胞群與佐劑相接觸。
74.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述細(xì)胞或細(xì)胞群與所述佐劑和抗原基本上同時(shí)接觸。
75.根據(jù)權(quán)利要求73或74的方法，其中所述佐劑是視黃酸、CD40激動劑或TLR激動 劑，或者另一種免疫刺激劑。
76.根據(jù)權(quán)利要求69的抗原呈遞細(xì)胞或其群體，其用于醫(yī)療方法。
77.根據(jù)權(quán)利要求69的抗原呈遞細(xì)胞或其群體，用于刺激針對靶標(biāo)抗原之免疫應(yīng)答的方法。
78.通過權(quán)利要求70所述方法獲得的已引發(fā)的抗原呈遞細(xì)胞或其群體在制備用于刺 激針對靶標(biāo)抗原之免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
79.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其還包括在所述接觸步驟之后使所述抗原呈遞細(xì)胞接觸 包含一種或多種T細(xì)胞的細(xì)胞群體。
80.根據(jù)權(quán)利要求79的方法，其包括擴(kuò)增該群體中的T細(xì)胞。
81.根據(jù)權(quán)利要求79或80的方法，其包括將所述T細(xì)胞施用給對象。
82.根據(jù)權(quán)利要求79至81中任一項(xiàng)的方法，其中所述T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞是自體的。
83.根據(jù)權(quán)利要求82的方法，其中所述T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞來源于同一對象。
84.根據(jù)權(quán)利要求83的方法，其中所述T細(xì)胞被重新施用給其所來源的對象。
85.根據(jù)權(quán)利要求81至84中任一項(xiàng)的方法，其包括施用佐劑。
86.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述佐劑是視黃酸、CD40激動劑或TLR激動劑。
87.根據(jù)權(quán)利要求79至86中任一項(xiàng)的方法，其中所述T細(xì)胞包括CTLL或輔助T細(xì)胞， 包括Treg細(xì)胞或Thl7細(xì)胞。
88.通過權(quán)利要求79或80所述方法獲得的T細(xì)胞或其群體。
89.根據(jù)權(quán)利要求88的T細(xì)胞或其群體，其用于醫(yī)療方法。
90.根據(jù)權(quán)利要求88的T細(xì)胞或其群體，其用于刺激針對靶標(biāo)抗原之免疫應(yīng)答的方法。
91.根據(jù)權(quán)利要求88的T細(xì)胞或其群體在制備用于刺激針對靶標(biāo)抗原之免疫應(yīng)答的藥 物中的用途。
92.在對象中誘導(dǎo)針對抗原之耐受的方法，其包括對所述對象施用包含所述抗原的組 合物，其中所述抗原與對CLEC9a有親和力的結(jié)合劑相聯(lián)合，并且其中在沒有佐劑的情況下 施用所述抗原。
93.根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)的組合物，其用于在對象中誘導(dǎo)針對所述抗原的耐受。
94.根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)的組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于在對象 中誘導(dǎo)針對所述抗原之耐受的方法中。
95.篩選CLEC9a的生理配體的方法，其包括使靶物質(zhì)接觸測試物質(zhì)，并測定所述靶物 質(zhì)與所述測試物質(zhì)的結(jié)合，所述靶物質(zhì)包含CLEC9a的胞外結(jié)構(gòu)域或其足以結(jié)合CLEC9a配 體的部分，所述測試物質(zhì)是哺乳動物細(xì)胞的組分。
96.根據(jù)權(quán)利要求95的方法，其還包括鑒定所述測試物質(zhì)的步驟。
97.根據(jù)權(quán)利要求95或96的方法，其中所述測試物質(zhì)是哺乳動物細(xì)胞的胞內(nèi)組分。
98.根據(jù)權(quán)利要求95至97中任一項(xiàng)的方法，其中所述測試物質(zhì)和靶物質(zhì)中所存在的 CLEC9a或其部分來源于同一物種。
99.根據(jù)權(quán)利要求95至98中任一項(xiàng)的方法，其包括使所述靶物質(zhì)與包含所述測試物質(zhì) 的樣品相接觸的步驟。
100.根據(jù)權(quán)利要求99的方法，其中所述樣品包含經(jīng)透化的哺乳動物細(xì)胞。
101.根據(jù)權(quán)利要求100的方法，其中所述細(xì)胞是已固定的。
102.根據(jù)權(quán)利要求100或101的方法，其包括通過檢測靶物質(zhì)來確定發(fā)生靶物質(zhì)結(jié)合 的亞細(xì)胞定位。
103.根據(jù)權(quán)利要求99的方法，其中所述樣品包含哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞裂解物、提取物 或亞細(xì)胞級分。
104.根據(jù)權(quán)利要求95至103中任一項(xiàng)的方法，其包括分離含有所述靶物質(zhì)及所述測試 物質(zhì)的復(fù)合物的步驟。
105.根據(jù)權(quán)利要求95至103中任一項(xiàng)的方法，其中所述測試物質(zhì)固定于固體支持物上。
106.根據(jù)權(quán)利要求95至105中任一項(xiàng)的方法，其包括通過蛋白質(zhì)組技術(shù)鑒定所述測試 物質(zhì)。
107.根據(jù)權(quán)利要求95的方法，其中測試物質(zhì)和靶物質(zhì)之間的相互作用發(fā)生在細(xì)胞或 者無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，并且誘導(dǎo)可檢測的反應(yīng)，例如報(bào)告基因的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，特別是以下發(fā)現(xiàn)CLEC9a分子是能夠經(jīng)I類MHC途徑交叉呈遞細(xì)胞外抗原的樹突細(xì)胞的標(biāo)志物。這使得它們特別適于產(chǎn)生細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明提供了誘導(dǎo)針對靶抗原之免疫應(yīng)答的材料和方法，以及抑制或阻止涉及這些細(xì)胞的不希望的免疫應(yīng)答的材料和方法。
文檔編號A61K47/00GK101896500SQ200880107621
公開日2010年11月24日 申請日期2008年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日
發(fā)明者丹尼爾·彭寧頓, 卡埃塔諾·雷斯埃索薩, 大衛(wèi)·桑喬-馬德里德, 奧利弗·舒爾茨, 奧利維耶·皮埃爾·若弗里, 尼爾·查爾斯·羅杰斯 申請人:癌癥研究技術(shù)有限公司