專利名稱：蛋白質(zhì)的聚電解質(zhì)沉淀和純化的制作方法
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發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及純化蛋白質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：
大規(guī)模的、經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)純化日益成為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要問題。一般而言，通過細(xì)胞培養(yǎng)來生產(chǎn)蛋白質(zhì)，使用通過插入含有感興趣蛋白質(zhì)的基因的重組質(zhì)粒而改造成生成該蛋白質(zhì)的哺乳動物或細(xì)菌細(xì)胞系。由于所使用的細(xì)胞系是活的有機(jī)體，因此必須給它們進(jìn)料含有糖、氨基酸、和生長因子(通常自動物血清的制備物來供應(yīng))的復(fù)合生長培養(yǎng)基。將期望的蛋白質(zhì)與進(jìn)料給細(xì)胞的化合物混合物及與細(xì)胞自身的副產(chǎn)物分開至足以用作人治療劑的純度提出了艱難的挑戰(zhàn)。
重組治療用蛋白質(zhì)常常在數(shù)種哺乳動物宿主細(xì)胞系中生產(chǎn)，包括鼠骨髓瘤NS0和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(Anderson，D.C和Krummen，L.(2002)Curr.Opin.Biotech.13117-123；Chu，L.和Robinson，D.K.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12180-187)。每一種細(xì)胞系在細(xì)胞所生成的蛋白質(zhì)的特征和生產(chǎn)力方面具有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。商業(yè)性生產(chǎn)細(xì)胞系的選擇常常平衡對高生產(chǎn)力的需要與提供給定產(chǎn)品所要求的產(chǎn)品質(zhì)量屬性的能力。常常要求高滴度方法的一類重要的治療用重組蛋白是單克隆抗體。有些單克隆抗體需要經(jīng)由Fc區(qū)介導(dǎo)的效應(yīng)器功能來引發(fā)它們的生物學(xué)功能。一個例子是利妥昔單抗(rituximab，

Genentech，Inc.和Biogen-Idec)，一種嵌合的單克隆抗體，其結(jié)合細(xì)胞表面CD-20并導(dǎo)致B細(xì)胞消減(Cartron等(2002)Blood 99754-758；Idusogie等(2000)J.Immunol.1644178-4184)。其它抗體，諸如貝伐單抗(bevacizumab，AVASTINTM，Genentech，Inc.)，一種人源化的抗VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)抗體，不要求Fc效應(yīng)器功能來實(shí)現(xiàn)它們的活性。
發(fā)酵和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步大大提高了培養(yǎng)液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的滴度。上游效率的這種升高導(dǎo)致下游加工中細(xì)胞收獲階段的瓶頸。細(xì)胞收獲，或已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液的澄清，是幾乎所有的基于生物技術(shù)的產(chǎn)物的下游純化中的重要過程。當(dāng)產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)部的時候，使用細(xì)胞收獲來降低產(chǎn)物提取步驟中待加工的細(xì)胞的液體體積。當(dāng)產(chǎn)物存在于胞外的時候，使用細(xì)胞收獲來將產(chǎn)物與細(xì)胞和細(xì)胞碎屑分開，例如自哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物分離胞外抗體(Anthony S.Lubiniecki，編(1990)Large-Scale Mammalian Cell CultureTechnology，Marcel Dekker；Hansjoerg Hauser，Roland Wagner，編(1997)Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production，Walter GruyterPublishing)。
用于自細(xì)胞碎屑純化蛋白質(zhì)的規(guī)程最初取決于蛋白質(zhì)的表達(dá)部位。有些蛋白質(zhì)能被細(xì)胞直接分泌入周圍的生長培養(yǎng)基中；其它蛋白質(zhì)制備成胞內(nèi)的。對于后一類蛋白質(zhì)，純化過程的第一步牽涉細(xì)胞的溶解，其可通過多種方法來進(jìn)行，包括機(jī)械剪切、滲壓休克、或酶促處理。此類破碎釋放全部細(xì)胞內(nèi)容物入勻漿中，而且另外生成亞細(xì)胞碎片，其因它們的小尺寸而難以除去。這些通常通過差速離心或通過過濾來除去。由于蛋白質(zhì)生產(chǎn)運(yùn)行過程中的細(xì)胞天然死亡和胞內(nèi)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的釋放，直接分泌的蛋白質(zhì)發(fā)生同樣的問題，盡管規(guī)模較小。
在治療用抗體的純化期間，必須除去雜質(zhì)，包括宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、產(chǎn)物變體、宿主細(xì)胞DNA、小分子、方法相關(guān)污染物、內(nèi)毒素和病毒顆粒(Fahrner，R.L.等(2001)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.18301-327)。所使用的純化技術(shù)必須是可縮放規(guī)模的(scaleable)、高效的、經(jīng)濟(jì)的、可靠的，且達(dá)到終產(chǎn)物的嚴(yán)格純度要求。當(dāng)前的純化技術(shù)典型地牽涉多個采用正交分離模式的層析分離。一種典型的過程可包括如下步驟中的一些沉淀(US 7169908)、透析、電泳、超濾、親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析和/或疏水相互作用層析。常規(guī)的柱層析步驟是高效且可靠的，但是通常具有低產(chǎn)物通過量(加工kg/h)。因?yàn)閱慰寺】贵w變得越來越廣泛地使用，所以更加高效的生產(chǎn)規(guī)模生產(chǎn)是必需的。
層析技術(shù)利用蛋白質(zhì)的化學(xué)和物理特性來實(shí)現(xiàn)高程度的純化。這些化學(xué)和物理特性典型地包括尺寸、等電點(diǎn)、電荷分布、疏水性位點(diǎn)和對配體的親和力(Janson，J.C.和L.Ryden(編)(1989)Protein PurificationPrinciples，HighResolution Methods and Applications.VCH Publishers，Inc.，New York)。層析的各種分離模式包括離子交換、層析聚焦、凝膠過濾(大小排阻)、疏水相互作用、反相、和親和層析。離子交換層析(IEX)(包括陰離子交換和陽離子交換層析)通過各分析物(例如蛋白質(zhì))的凈表面電荷的差異將它們分開。IEX是用于將所表達(dá)的蛋白質(zhì)與細(xì)胞碎屑和其它雜質(zhì)分開的主要工具。今天，IEX是蛋白質(zhì)、肽、核酸和其它帶電荷生物分子的純化最頻繁使用的技術(shù)之一，以高負(fù)載容量提供高分離度和組分離。該技術(shù)能夠?qū)⒅挥兴鼈兊碾姾商匦杂形⑿〔町惖姆肿臃N類分開，例如差異為一個帶電荷的氨基酸的兩種蛋白質(zhì)。這些特性使得IEX非常適于純化方案中的捕獲、中間體純化或精制(polishing)步驟，而且該技術(shù)用于微量規(guī)模純化和分析至千克產(chǎn)物的純化。
層析技術(shù)是可靠的，但是容量和通過量對于大規(guī)模應(yīng)用可能有問題。常規(guī)的柱層析步驟是高效的且可靠的，但是通常具有低產(chǎn)物通過量(加工kg/h)。因?yàn)橹亟M蛋白變得越來越廣泛地使用，所以更加高效的生產(chǎn)規(guī)模生產(chǎn)是必需的。層析步驟的通過量典型地受限于層析樹脂對感興趣蛋白質(zhì)的容量。隨著加載至柱上的蛋白質(zhì)增加，感興趣蛋白質(zhì)自雜質(zhì)的分離度常常降低。
已知聚電解質(zhì)(polyelectrolyte)與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，其采取可溶性復(fù)合物(Dellacherie，E.(1991)Am.Chem.Soc.，Div.Polym.Chem.Prepr.32(1)602)、無定形沉淀(Mattiasson等(1998)Polym.Plast.Technol.Eng.37(3)303-308；Clark等(1987)Biotech.Progress 3(4)241；Fisher等(1988)Biotechnol.Bioeng.32777；Shieh等(1991)Am.Chem.Soc.，Div.Polym.Chem.Prepr.32(1)606；Sternberg等(1974)Biochimica et Biophysica Acta 342195-206；WO 2004/014942)、或團(tuán)聚層(coacervate)(Wang等(1996)Biotechnol.Prog.12356-362；Veis，A.(1991)Am.Chem.Soc.Div.Polym.Chem.Prepr.32(1)596)的形式。單克隆抗體在存在抗原-聚陽離子(聚甲基丙烯酸)的情況中的木瓜蛋白酶蛋白水解產(chǎn)生Fab片段(Dainiak等(2000)AnalyticalBiochem.27758-66)。
蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)復(fù)合物凝聚，即分離成兩個不同的液相，其中團(tuán)聚層相含有大部分復(fù)合物，而另一相是平衡相(Burgess，D.J.“ComplexCoacervationMicrocapsule Formation”于Macromolecular Complexes inChemistry and Biology，Dubin，P.L.等編(1994)Springer-Verlag，Berlin；Dubin等(1994)Sep.Purif.Methods 231-16)。蛋白質(zhì)的聚電解質(zhì)凝聚是一種復(fù)雜的過程，而且對于廣泛的蛋白質(zhì)是沒有用的。蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)復(fù)合物中的分子間結(jié)合是由于靜電相互作用、氫鍵和疏水力(Cooper等(2005)CurrentOpinion in Colloid & Interface Science 1052-78；Mattison等(1999)Macromol.Symp.14053-76)。雖然已知添加聚電解質(zhì)至蛋白質(zhì)溶液可導(dǎo)致蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)復(fù)合物和更大簇的形成，并最終導(dǎo)致團(tuán)聚體和/或沉淀，但是在進(jìn)一步添加聚電解質(zhì)時可出現(xiàn)逆過程，由此發(fā)生蛋白質(zhì)重溶解，使蛋白質(zhì)分離或純化的嘗試失敗(Carlsson等(2003)J.Am.Chem.Soc.1253140-3149).使用聚電解質(zhì)的蛋白質(zhì)沉淀可為層析分離提供劃算的備選方案。使用這種技術(shù)，有可能利用層析技術(shù)的官能化學(xué)來實(shí)現(xiàn)溶液中相似水平的蛋白質(zhì)純化。具體而言，沉淀步驟的通過量(throughout)會不再受限于特定層析樹脂的容量(capacity)。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了涉及衍生自細(xì)胞培養(yǎng)液的蛋白質(zhì)的分離和純化的方法。
本發(fā)明的一個方面是蛋白質(zhì)純化方法，其通過用聚電解質(zhì)，諸如聚陰離子聚電解質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了蛋白質(zhì)純化方法，其通過用聚陽離子聚電解質(zhì)沉淀細(xì)胞培養(yǎng)液雜質(zhì)。沉淀步驟可以后續(xù)陽離子交換層析、陰離子交換層析、和其它沉淀步驟。
本發(fā)明的方法包括用于抗體純化的非親和方法。
本發(fā)明的一個方面是純化抗體的方法，包括 (a)調(diào)節(jié)含有抗體的混合物的酸度或鹽濃度，其中該抗體衍生自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液； (b)添加帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)，由此形成蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀； (c)將蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀與選自下組的雜質(zhì)分開蛋白質(zhì)聚集體、蛋白質(zhì)片段、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、胰島素、慶大霉素、DNA、和浸出的(leached)蛋白A； (d)分離蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀；并 (e)在水溶液中重懸浮蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀。
本發(fā)明的另一個方面是純化抗體的方法，包括 (a)調(diào)節(jié)含有抗體的混合物的酸度或鹽濃度，其中該抗體衍生自細(xì)胞培養(yǎng)液； (b)添加帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)至混合物，由此形成包含帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)和選自下組的雜質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)聚集體、蛋白質(zhì)片段、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、胰島素、慶大霉素和DNA；并 (c)將沉淀與包含所述抗體的混合物分開。
附圖簡述

圖1顯示了用于純化自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)純化的蛋白A池的工藝步驟，后續(xù)左欄-陽離子交換層析(SepharoseTM fast flow，SPSFF)，然后是陰離子交換層析(QSFF)；中欄-QSFF；或右欄-pH 7的聚乙烯基磺酸(PVS)沉淀，然后是QSFF。
圖2顯示了純化自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)純化的SPSFF池的工藝步驟，后續(xù)左欄-QSFF；或右欄-pH 7的PVS沉淀，然后是QSFF。
圖3顯示了自HCCF直接捕獲和純化抗體的工藝步驟左欄-pH 5的PVS沉淀，接著是QSFF，然后是SPSFF；或pH 7的PVS沉淀，接著是QSFF，然后是SPSFF。
圖4顯示了在pH 5、在3.0和5.6mS/cm的PVS(1800Da)中的rhuMab 2H7溶解度曲線(蛋白A池)。mS＝毫西門子，電導(dǎo)率的單位。
圖5顯示了在pH 7、在0.7、1.5、3.0和4.7mS/cm的PVS(1800Da)中的rhuMab 2H7溶解度曲線(蛋白A池)。
圖6顯示了在pH 7、在0.8和1.5mS/cm的PVS(1800Da)中的rhuMab 2H7溶解度曲線(SPSFF捕獲池)。
圖7顯示了在pH 5和3.0mS/cm；及在pH 7和0.7mS/cm的PVS(1800Da)中的rhuMab 2H7溶解度曲線(HCCF)。
圖8顯示了比較抗CD20抗體2H7在pH 5和5mS/cm的PVS(1800Da)沉淀與PAA(1200和8000Da)沉淀的溶解度曲線。
圖9顯示了比較抗CD20抗體2H7在pH 7和1.5mS/cm的PVS(1800Da)沉淀與PAA(1200和8000Da)沉淀的溶解度曲線。
圖10顯示了抗CD20抗體(利妥昔單抗)在pH 7和1.5mS/cm的溶解度曲線，與分子量范圍為1200-1,100,000Da的PAA相比較。
圖11顯示了抗CD20抗體rhuMab 2H7的下游加工結(jié)果匯總表(a)經(jīng)過蛋白A加工的HCCF；(b)經(jīng)過SPSFF加工的HCCF；(c)HCCF的PVS沉淀。
圖12顯示了在pH 5.5和5.1mS/cm；pH 6.0和3.0mS/cm；pH 6.0和5.5mS/cm在PVS(1800Da)中的Apomab溶解度曲線。
圖13顯示了在pH 6.5和1.5mS/cm；pH 6.5和3.2mS/cm；及pH 7.0和0.7mS/cm在PVS(1800Da)中的Apomab溶解度曲線。
圖14顯示了裝有Apomab的蛋白A池的燒瓶的照片，其含有(左)無PVS(0％)，(中)0.1％PVS(w/v)，和(右)1％PVS(w/v)，在pH 5.5。
圖15顯示了在pH 4和2mS/cm；pH 5和1mS/cm；pH 5和2.4mS/cm；pH 6和0.5mS/cm；pH 7和0.5mS/cm在PVS(1800Da)中的抗cMet溶解度曲線。
圖16顯示了用于自CCF直接捕獲和純化rhuMab 2H7抗體的工藝步驟左欄-離心得到HCCF，接著是使用PVS的抗體沉淀，然后是QSFF；右欄-聚精氨酸絮凝/雜質(zhì)沉淀，離心得到HCCF，使用PVS的抗體沉淀，然后是QSFF。
圖17顯示了用于自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)純化rhuMab 2H7抗體的工藝步驟左欄-Prosep vA，陽離子交換層析(SEPHAROSETM fast flow，SPSFF)，然后是陰離子交換層析(QSFF)；右欄-聚精氨酸沉淀，Prosep vA，SPSFF，然后是QSFF。
圖18顯示了與圖17相同的用于自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)純化rhuMab 2H7抗體的工藝，只是消除了Prosep vA步驟左欄-SPSFF，然后是QSFF；右欄-聚精氨酸沉淀，SPSFF，然后是QSFF。
圖19顯示了用于自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)純化rhuMab 2H7抗體的工藝步驟，后續(xù)左欄-使用PVS的抗體沉淀，然后是QSFF；右欄-聚精氨酸沉淀，使用PVS的抗體沉淀，然后是QSFF。
圖20顯示了rhuMab 2H7CCF溶解度曲線-使用110kDa聚精氨酸。
圖21顯示了rhuMab 2H7HCCF溶解度曲線-42kDa聚精氨酸。
圖22顯示了rhuMab 2H7HCCF溶解度曲線-110kDa聚精氨酸。
圖23顯示了rhuMab 2H7、抗CD22、rhuMab C2B8HCCF溶解度曲線-42kDa聚精氨酸。
圖24顯示了rhuMab 2H7、抗CD22、rhuMab C2B8HCCF溶解度曲線-110kDa聚精氨酸。
圖25顯示了用0.075％w/v 110kDa聚精氨酸絮凝的rhuMab 2H7 CCF的PVS沉淀的溶解度曲線。
圖26顯示了SPSFF的穿透曲線，以自聚精氨酸沉淀的HCCF生成的蛋白A池作為加載。
圖27顯示了SPSFF的穿透曲線，以自聚精氨酸沉淀的生成的HCCF作為加載。
圖28顯示了2H7MAb中對抗體還原的抑制作用的凝膠電泳。HCCF4-12％BT，MOPS緩沖液，Sypro Ruby染料，2μg HCCF加載，5分鐘，70℃，9秒曝光，2F/T運(yùn)行7，RT溫育，在SS迷你罐中，500μl(微升)樣品立即冷凍于-70℃。
圖29顯示了rhuMab C2B8蛋白A池溶解度曲線-2.5kDa聚賴氨酸。
圖30顯示了rhuMab C2B8蛋白A池溶解度曲線-50kDa聚賴氨酸。
圖31顯示了rhuMab C2B8HCCF溶解度曲線-50kDa聚賴氨酸。
圖32顯示了rhuMab C2B8HCCF溶解度曲線-225kDa聚賴氨酸。
圖33顯示了人源化抗CD20溶解度曲線，1800Da至1132kDa樣品，0.00％至0.20％聚苯乙烯磺酸鹽(PSS)，pH 7和電導(dǎo)率為12mS/cm。
圖34顯示了每種過濾介質(zhì)(A1HC、B1HC、C0HC、45CE、20CE、30CE)的容量(以克抗體每過濾面積測量)對壓力下降的Vmax圖。
圖35顯示了不同流通流速對產(chǎn)率的影響，就達(dá)到2H7-PVS蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀自C0HC

過濾介質(zhì)完全重溶解所必需的緩沖液體積而言。LMH＝升每平方米每小時，流速的度量單位。
圖36顯示了兩個流量范圍(重溶解緩沖液流，以LMH計(jì))對蛋白質(zhì)自C0HC

濾器(2H7-PVS蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀)重溶解的影響。
圖37顯示了管線內(nèi)HCCF條件化/PVS沉淀設(shè)置的工藝示意圖。
圖38顯示了抗體回收產(chǎn)率，連續(xù)給料條件化/沉淀。
發(fā)明詳述 現(xiàn)在將會詳細(xì)地述及本發(fā)明的某些實(shí)施方案，所附結(jié)構(gòu)和公式中例示了它們的例子。雖然將會連同所列舉的實(shí)施方案來描述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解它們并非意圖將本發(fā)明限于那些實(shí)施方案。相反，本發(fā)明旨在涵蓋所有備選方案、修改、和等同方案，其可以包括在權(quán)利要求所限定的本發(fā)明范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會與本文中所描述的方法和材料相似的或等同的許多方法和材料可用于實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明絕非限于所描述的方法和材料。倘若所收入的文獻(xiàn)、專利、和相似的材料與本申請不同或矛盾，包括但不限于所定義的術(shù)語、術(shù)語的用法、所描述的技術(shù)、諸如此類，以本申請為準(zhǔn)。
定義 除非另有說明，以下術(shù)語和短語在用于本文時意圖具有如下含義 術(shù)語“已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液”，也稱作HCCF，意指通過包括離心或過濾在內(nèi)的手段已經(jīng)從中除去了細(xì)胞的原核或真核細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)指在受控條件下使原核或真核細(xì)胞生長的過程。術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)”指培養(yǎng)衍生自多細(xì)胞真核生物(包括動物細(xì)胞)或單細(xì)胞原核生物(包括細(xì)菌和酵母)的細(xì)胞。真核細(xì)胞培養(yǎng)包括哺乳動物細(xì)胞(諸如中國倉鼠卵巢細(xì)胞)、雜交瘤、和昆蟲細(xì)胞。憑借適宜的細(xì)胞培養(yǎng)容器，能從貼壁依賴性細(xì)胞或懸浮細(xì)胞系獲得分泌型蛋白質(zhì)。哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
術(shù)語“微生物發(fā)酵”意指經(jīng)過遺傳工程改造而生成化學(xué)品(諸如蛋白質(zhì))的細(xì)菌或酵母的細(xì)胞培養(yǎng)。使用發(fā)酵來繁殖所克隆的細(xì)菌和酵母以及其它微生物并生成有價值的蛋白質(zhì)。通過供應(yīng)特定的生長培養(yǎng)基和控制各種環(huán)境因素(諸如pH、溫度、和通氣)，這些有機(jī)體的細(xì)胞生產(chǎn)力和生長得到最大化。細(xì)菌發(fā)酵液可衍生自大腸桿菌。
術(shù)語“抗體”在本文中以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性?？贵w可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的、或衍生自其它物種的。
抗體是由免疫系統(tǒng)生成的蛋白質(zhì)，其能夠識別和結(jié)合特定的抗原(Janeway等(2001)“Immunobiology”，第5版，Garland Publishing，New York)。靶抗原一般具有眾多由多種抗體上的CDR識別的結(jié)合位點(diǎn)，也稱作表位。每一種特異性結(jié)合不同表位的抗體具有不同的結(jié)構(gòu)。如此，一種抗原可具有超過一種的相應(yīng)抗體。
術(shù)語“抗體”在用于本文時也稱作全長免疫球蛋白分子或全長免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分，即含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)免疫特異性結(jié)合感興趣靶物的抗原或其部分，所述靶物包括但不限于癌細(xì)胞或生成與自身免疫病有關(guān)的自身免疫性抗體的細(xì)胞。本文中所公開的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、和IgA)、類(例如IgG1、IgG2、IgG3、gG4、IgA1和IgA2)或亞類的。免疫球蛋白可衍生自任何物種。然而，在一個方面，免疫球蛋白是人、鼠、或兔起源的。
“抗體片段”包含全長抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段；雙抗體；線性抗體；由Fab表達(dá)庫生成的片段；抗獨(dú)特型(抗Id)抗體；任何上述的免疫特異性結(jié)合癌細(xì)胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的CDR(互補(bǔ)決定區(qū))、ECD(胞外結(jié)構(gòu)域)、和表位結(jié)合片段；單鏈抗體分子；和自抗體片段形成的多特異性抗體。
術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指自基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原性位點(diǎn)。此外，與包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性外，單克隆抗體制備物的優(yōu)點(diǎn)在于它們可以在不受其它抗體污染的情況中合成。修飾語“單克隆”指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，要依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過首次由Kohler等(1975)Nature 256495記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法來制備(US 4816567)?！皢慰寺】贵w”也可以使用例如Clackson等(1991)Nature，352624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222581-597中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫分離。
有用的單克隆抗體是針對特定抗原性決定簇(例如癌細(xì)胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、化學(xué)品、核酸、或其片段)的同質(zhì)抗體群。針對感興趣抗原的單克隆抗體(單抗)可通過使用本領(lǐng)域已知的、通過培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系提供抗體分子生成的任何技術(shù)來制備。這些包括但不限于最初由

和Milstein(1975)Nature 256495-497)記載的雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等(1983)Immunology Today 472)、和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等(1985)于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，頁77-96)。此類抗體可以是任何免疫球蛋白類的，包括IgG、IgM、IgE、IgA、和IgD及其任何亞類。生成本發(fā)明中所使用的單抗的雜交瘤可以在體外或在體內(nèi)培養(yǎng)。
對于本發(fā)明的方法有用的治療用單克隆抗體包括曲妥單抗(trastuzumab，

Genentech，Inc.，Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285-4289；US 5,725,856)；抗CD20抗體，諸如嵌合抗CD20“C2B8”(US 5736137)、利妥昔單抗(rituximab，

)、ocrelizumab即2H7抗體的一種嵌合的或人源化的變體(US 5721108；WO04/056312)或托西莫單抗(tositumomab，

)；抗IL-8(St John等(1993)Chest，103932；及WO 95/23865)；抗VEGF抗體，包括人源化的和/或親和力成熟的抗VEGF抗體，諸如人源化抗VEGF抗體huA4.6.1，貝伐單抗(bevacizumab，

Genentech，Inc.，Kim等(1992)Growth Factors753-64；WO 96/30046；WO 98/45331)；抗PSCA抗體(WO 01/40309)；抗CD40抗體，包括S2C6及其人源化變體(WO 00/75348)；抗CD11a(US 5622700；WO 98/23761；Steppe等(1991)Transplant Intl.43-7；Hourmant等(1994)Transplantation 58377-380)；抗IgE(Presta等(1993)J.Immunol.1512623-2632；WO 95/19181)；抗CD18(US 5622700；WO 97/26912)；抗IgE，包括E25、E26和E27(US 5714338；US 5091313；WO 93/04173；US 5714,338)；抗Apo-2受體抗體(WO 98/51793)；抗TNF-α抗體，包括cA2(

)、CDP571和MAK-195(US 5672347；Lorenz等(1996)J.Immunol.156(4)1646-1653；Dhainaut等(1995)Crit.Care Med.23(9)1461-1469)；抗組織因子(TF)(EP 0 420 937 B1)；抗人α4β7整聯(lián)蛋白(WO 98/06248)；抗EGFR，嵌合的或人源化的225抗體(WO 96/40210)；抗CD3抗體，諸如OKT3(US4515893)；抗CD25或抗tac抗體，諸如CHI-621

和

(US 5693762)；抗CD4抗體，諸如cM-7412抗體(Choy等(1996)Arthritis Rheum39(1)52-56)；抗CD52抗體，諸如CAMPATH-1H(Riechmann等(1988)Nature332323-337)；抗Fc受體抗體，諸如針對FcγRI的M22抗體，像Graziano等(1995)J.Immunol.155(10)4996-5002中的；抗癌胚抗原(CEA)抗體，諸如hMN-14(Sharkey等(1995)Cancer Res.55(23Suppl)5935s-5945s；針對乳房上皮細(xì)胞的抗體，包括huBrE-3、hu-Mc 3和CHL6(Ceriani等(1995)Cancer Res.55(23)5852s-5856s；及Richman等(1995)Cancer Res.55(23Supp)5916s-5920s)；結(jié)合結(jié)腸癌細(xì)胞的抗體，諸如C242(Litton等(1996)Eur J.Immunol.26(1)1-9)；抗CD38抗體，例如AT 13/5(Ellis等(1995)J.Immunol.155(2)925-937)；抗CD33抗體，諸如Hu M195(Jurcic等(1995)Cancer Res55(23Suppl)5908s-5910s)和CMA-676或CDP771；抗CD22抗體，諸如LL2或LymphoCide(Juweid等(1995)Cancer Res 55(23Suppl)5899s-5907s)；抗EpCAM抗體，諸如17-1A(

)；抗GpIIb/IIIa抗體，諸如阿昔單抗(abciximab)或c7E3 Fab(

)；抗RSV抗體，諸如MEDI-493(

)；抗CMV抗體，諸如

抗HIV抗體，諸如PRO542；抗肝炎抗體，諸如抗Hep B抗體

抗CA 125抗體OvaRex；抗獨(dú)特型GD3表位抗體BEC2；抗αvβ3抗體

抗人腎細(xì)胞癌瘤抗體，諸如ch-G250；ING-1；抗人17-1A抗體(3622W94)；抗人結(jié)直腸腫瘤抗體(A33)；抗人黑素瘤抗體R24，其針對GD3神經(jīng)節(jié)苷脂；抗人鱗狀細(xì)胞癌瘤(SF-25)；和抗人白細(xì)胞抗原(HLA)抗體，諸如Smart ID10和抗HLA DR抗體Oncolym(Lym-1)。
有用的單克隆抗體包括但不限于人單克隆抗體、人源化單克隆抗體、抗體片段、或嵌合人-小鼠(或其它物種)單克隆抗體。人單克隆抗體可通過本領(lǐng)域已知的眾多技術(shù)來制備(Teng等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA807308-7312；Kozbor等(1983)Immunology Today 472-79；及Olsson等(1982)Methods in Enzymology 923-16)。
抗體也可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體可具有一條臂中具有第一結(jié)合特異性的雜合的免疫球蛋白重鏈和另一條臂中提供第二結(jié)合特異性的雜合的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對。由于免疫球蛋白輕鏈只在雙特異性分子的一半中的存在提供了便利的分離方式，這種不對稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性化合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開(WO 94/04690；Suresh等(1986)Methods in Enzymology，121210；Rodrigues等(1993)J.of Immunology1516954-6961；Carter等(1992)Bio/Technology 10163-167；Carter等(1995)J.of Hematotherapy 4463-470；Merchant等(1998)Nature Biotechnology16677-681)。用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的(Milstein等(1983)Nature 305537-539；WO 93/08829；Traunecker等(1991)EMBO J.103655-3659)。使用此類技術(shù)，可制備雙特異性抗體，綴合成ADC，用于疾病的治療或預(yù)防，如本文中所定義的。
依照一種不同的方法，將具有期望的結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域融合至免疫球蛋白恒定域序列。融合蛋白可具有免疫球蛋白重鏈恒定域，其至少包含部分的鉸鏈、CH2、和CH3區(qū)。第一重鏈恒定區(qū)(CH1)可含有輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)，其存在于至少一種融合蛋白中。將具有編碼免疫球蛋白重鏈融合物和(如果想要的話)免疫球蛋白輕鏈的序列的核酸插入分開的表達(dá)載體中，并共轉(zhuǎn)染入合適的宿主有機(jī)體。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時或在該比例沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達(dá)載體。
雜合的或雙功能的抗體可通過生物學(xué)方法衍生，即通過細(xì)胞融合技術(shù)，或通過化學(xué)方法衍生，尤其是用交聯(lián)劑或二硫橋形成試劑，而且可包含完整抗體或其片段(EP 105360；WO 83/03679；EP 217577)。
抗體可以是免疫特異性結(jié)合癌細(xì)胞抗原、病毒抗原、或微生物抗原的抗體或結(jié)合腫瘤細(xì)胞或基質(zhì)的抗體的功能活性片段、衍生物或類似物。在這點(diǎn)上，“功能活性”意指該片段、衍生物或類似物能夠引發(fā)與衍生該片段、衍生物或類似物的抗體識別相同抗原的抗抗獨(dú)特型抗體。具體而言，在一個例示性的實(shí)施方案中，免疫球蛋白分子的獨(dú)特型的抗原性可通過刪除位于特異性識別抗原的CDR序列的C端的框架和CDR序列而得到增強(qiáng)。為了確定哪些CDR序列結(jié)合抗原，可以在使用抗原的結(jié)合測定法(本領(lǐng)域已知的任何結(jié)合測定法，例如BIAcore測定法)中使用含有CDR序列的合成肽(Kabat等，(1991)于Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institute ofHealth，Bethesda，Md；Kabat等(1980)J.of Immunology 125(3)961-969)。
其它有用的抗體包括抗體片段，諸如但不限于F(ab’)2片段(其含有可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈CH1結(jié)構(gòu)域，可通過抗體分子的胃蛋白酶消化來生成)；和Fab片段，其可通過還原F(ab’)2片段的二硫橋來生成。其它有用的抗體是抗體的重鏈和輕鏈二聚體，或其任何最小限度片段，諸如Fv或單鏈抗體(SCA)(例如如US 4946778；Bird(1988)Science 242423-42；Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；及Ward等(1989)Nature 334544-54中所記載的)，或與抗體具有相同特異性的任何其它分子。
單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合“抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，及其此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性(US 4816567；及Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855)。嵌合抗體是其中不同部分衍生自不同動物物種的分子，諸如那些具有衍生自鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體(US4816567；US 4816397)。嵌合抗體包括“靈長類化”抗體，其包含衍生自非人靈長類(例如舊大陸猴(Old World Monkey)、猿等)的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。
嵌合的和人源化的單克隆抗體(包含人的和非人的兩部分)可使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)來制備(WO 87/02671；EP 184,187；EP 171496；EP 173494；WO 86/01533；US 4816567；EP 12023；Berter等(1988)Science2401041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84214-218；Nishimura等(1987)Cancer.Res.47999-1005；Wood等(1985)Nature 314446-449；及Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.801553-1559；Morrison(1985)Science 2291202-1207；Oi等(1986)BioTechniques 4214；US 5225539；Jones等(1986)Nature 321552-525；Verhoeyan等(1988)Science2391534；及Beidler等(1988)J.Immunol.1414053-4060；通過述及將每一篇完整收入本文)。
完全人的抗體可使用不能表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因但能表達(dá)人重鏈和輕鏈基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來生成。以正常方式用選定的抗原(例如整個的或部分的本發(fā)明多肽)免疫轉(zhuǎn)基因小鼠?？墒褂贸Ｒ?guī)雜交瘤技術(shù)來獲得針對抗原的單克隆抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠所包含的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化期間重排，而且隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。如此，使用這樣的技術(shù)，有可能生成治療上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。關(guān)于用于生成人抗體的這種技術(shù)的綜述參見Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.1365-93；美國專利No.5625126；5633425；5569825；5661016；5545806?？梢宰陨虡I(yè)來源獲得其它人抗體，例如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)和Genpharm(San Jose，CA)。
識別選定表位的完全人的抗體可使用稱作“引導(dǎo)選擇”的技術(shù)來生成。在這種方法中，使用選定的非人單克隆抗體(例如小鼠抗體)來引導(dǎo)識別相同表位的完全人的抗體的選擇(Jespers等(1994)Biotechnology 12899-903)。也可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)來生成人抗體，包括噬菌體展示庫(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227381(1991)；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222581)。
抗體可以是抗體的或其功能活性片段的融合蛋白，例如其中抗體經(jīng)共價鍵(例如肽鍵)在N-末端或C-末端融合至不是抗體的另一蛋白質(zhì)(或其部分，諸如蛋白質(zhì)的至少10個、20個或50個氨基酸的部分)的氨基酸序列?？贵w或其片段可以在恒定域的N-末端共價連接至另一蛋白質(zhì)。
抗體包括經(jīng)過修飾的類似物和衍生物，即通過任何類型分子的共價附著，只要此類共價附著容許該抗體保留其抗原結(jié)合免疫特異性。例如，但非限制，抗體的衍生物和類似物包括那些經(jīng)過進(jìn)一步修飾的抗體，例如通過糖基化、乙?；?、PEG化、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護(hù)/阻斷基團(tuán)進(jìn)行的衍生化、蛋白水解切割、對細(xì)胞抗體單元或其它蛋白質(zhì)的連接、等?？赏ㄟ^已知技術(shù)來實(shí)施眾多化學(xué)修飾之任一，包括但不限于特異性化學(xué)切割、乙酰化、甲酰化、在存在衣霉素(tunicamycin)的情況中的代謝合成、等。另外，類似物或衍生物可含有一種或多種非天然氨基酸。
CD20抗體的例子包括“C2B8”，現(xiàn)在的利妥昔單抗(rituximab，

)(US 5736137)；釔-[90]標(biāo)記的2B8鼠抗體Y2B8或ibritumomab tiuxetan(

Biogen Idec，Inc.US 5736137)；2B8(于1993年6月22日以編號HB11388保藏于ATCC)；鼠IgG2a“B1”，也稱作托西莫單抗，任選用131I標(biāo)記以生成“131I-B1”或“碘I131托西莫單抗”抗體(

)，可購自Corixa(US 5595721)；鼠單克隆抗體“1F5”(例如Press等(1987)Blood 69(2)584-591)及其變體，包括“框架貼片的”(frameworkpatched)或人源化的1F5(WO 2003/002607，Leung，S.；ATCC保藏物HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗體(US 5677180)；ocrelizumab(2H7的一種人源化變體)和其它2H7變體(WO 2004/056312；US 5721108)；HUMAX-CD20TM，其是靶向B細(xì)胞的細(xì)胞膜中的CD20分子的完全人的、高親和力的抗體(Genmab，Denmark)。參見例如Glennie和van de Winkel，(2003)Drug Discovery Today 8503-510及Cragg等(2003)Blood 1011045-1052)；WO 2004/035607和WO 2005/103081(Teeling等，GenMab/Medarex)中列出的人單克隆抗體；有復(fù)雜的N-糖苷連接的糖鏈結(jié)合至Fc區(qū)的抗體(US2004/0093621，Shitara等)；結(jié)合CD20的單克隆抗體和抗原結(jié)合片段(WO2005/000901，Tedder等)諸如HB20-3、HB20-4、HB20-25、和MB20-11；結(jié)合CD20的單鏈蛋白(US 2005/0186216；US 2005/0202534；US 2005/0202028；US 2005/0202023)；CD20結(jié)合分子，諸如AME系列抗體，例如AME-133TM抗體(WO 2004/103404；US 2005/0025764)；及具有Fc突變的CD20抗體(WO2005/070963)；CD20結(jié)合分子(WO 2005/016969；US 2005/0069545)；雙特異性抗體(WO 2005/014618)；人源化LL2單克隆抗體(US 2005/0106108)；針對CD20的嵌合或人源化B-Ly1抗體(WO2005/044859；US 2005/0123546)；＝A20抗體或其變體諸如嵌合或人源化A20抗體(分別為cA20、hA20)和IMMUN-106(US 2003/0219433)；及單克隆抗體L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2，其可得自國際白細(xì)胞分型工作組(International Leukocyte TypingWorkshop)(Valentine等(1987)于Leukocyte Typing III，McMichael，編，頁440，Oxford University Press)。例示性CD20抗體包括嵌合的、人源化的、或人的CD20抗體，諸如利妥昔單抗、人源化2H7、嵌合或人源化A20抗體諸如HUMAX-CD20TM、人CD20抗體(Genmab)、和結(jié)合CD20的免疫球蛋白/蛋白質(zhì)(Trubion Pharm Inc.)。
“完整”抗體指包含抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定域(CL)和重鏈恒定域(CH1、CH2和CH3)的抗體。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列變體。
完整抗體可具有一項(xiàng)或多項(xiàng)“效應(yīng)器功能”，其指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))的生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)器功能的例子包括C1q結(jié)合；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體(BCR))的下調(diào)；等。
根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，完整抗體可分入不同的“類”。完整抗體分五大類IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，而且這些中的數(shù)類可進(jìn)一步分成“亞類”(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。與抗體的不同類對應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α、δ、ε、γ、和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是公知的。
術(shù)語“氨基酸序列變體”指具有在一定程度上與天然序列多肽不同的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列變體會擁有與至少一種天然抗體的受體結(jié)合域或與至少一種天然受體的配體結(jié)合域的至少約70％序列同一性，而且優(yōu)選的是，它們會是至少約80％，更優(yōu)選的是，序列與此類受體或配體結(jié)合域至少約90％同源。氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列內(nèi)的某些位置處擁有替代、刪除、和/或插入。氨基酸以常規(guī)名稱，即單字母和三字母代碼來表示。
“序列同一性”定義為在比對序列和在必要時引入缺口以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性后，氨基酸序列變體中同樣的殘基的百分比。用于比對的方法和計(jì)算機(jī)程序是本領(lǐng)域公知的。一種此類計(jì)算機(jī)程序是Genentech公司創(chuàng)作的“Align 2”，其于1991年12月10日與用戶文檔一起提交給美國版權(quán)局(UnitedStates Copyright Office，Washington，DC 20559)。
蛋白質(zhì)表達(dá)和生產(chǎn) 重組蛋白是通過自載體克隆DNA和本領(lǐng)域已知方法來表達(dá)的。用于本發(fā)明的聚電解質(zhì)純化方法的蛋白質(zhì)可以自合適的宿主細(xì)胞生成，諸如原核生物、酵母、和高等真核生物細(xì)胞。適合于此目的的原核生物包括真細(xì)菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏菌屬(Escherichis)例如大腸埃希氏菌或大腸桿菌(E.coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志賀氏菌屬(Shigella)、以及芽孢桿菌屬(Bacilli)諸如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD266,710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(Pseudomonas)諸如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、和鏈霉菌屬(Streptomyces)。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC 31,446)，盡管其它菌株諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的。
在原核生物以外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)也是編碼CD20抗體的載體的合適克隆或表達(dá)宿主。釀酒糖酵母或釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通?？色@得許多其它屬、種和菌株且可用于本發(fā)明，諸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，諸如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克思克魯維酵母(K.marxianus)；亞羅酵母屬(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070)；假絲酵母屬(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，諸如Schwanniomyces occidentalis；和絲狀真菌，諸如例如脈孢菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、和曲霉屬(Aspergillus)宿主諸如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
適合于表達(dá)糖基化抗體的宿主細(xì)胞衍生自多細(xì)胞真核生物體。無脊椎動物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲細(xì)胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒株和變體及相應(yīng)的允許昆蟲宿主細(xì)胞，它們來自諸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)等宿主。公眾可獲得多種病毒株用于轉(zhuǎn)染，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1變體和家蠶(Bombyx mori)NPV的Bm-5株，而且此類病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。
培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊椎動物細(xì)胞的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)流程。有用哺乳動物宿主細(xì)胞系的例子是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(293或?yàn)榱嗽趹腋∨囵B(yǎng)中生長而亞克隆的293細(xì)胞，Graham等(1977)J.Gen Virol.3659)；幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)；中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(Urlaub等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216)Mather(1980)Biol.Reprod.23243-251)；猴腎細(xì)胞(CV1)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76)；人宮頸癌瘤細(xì)胞(HELA)；犬腎細(xì)胞(MDCK)；牛鼠(buffalo rat)肝細(xì)胞(BRL 3A)；人肺細(xì)胞(W138)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562)；TRI細(xì)胞(Mather等(1982)Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68)；MRC5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；和人肝瘤系(HepG2)。
用上文所述用于抗體生產(chǎn)的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)修改的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于為本發(fā)明的方法生產(chǎn)抗體的宿主細(xì)胞。商品化培養(yǎng)基諸如Ham氏F10(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適合于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，可以使用下列文獻(xiàn)中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基Ham等(1979)Meth.Enz.5844；Barnes等(1980)Anal.Biochem.102255；US 4767704；US 4657866；US 4927762；US 4560655；US 5122469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利Re.30,985。任何這些培養(yǎng)基可以在必要時補(bǔ)充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運(yùn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如MES和HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機(jī)化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何其它必需補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件(諸如溫度、pH等)就是先前為表達(dá)而選擇用于宿主細(xì)胞的，這對于普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。
一旦獲得了含有感興趣蛋白質(zhì)的已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液，通常使用不同層析技術(shù)的組合來試圖將感興趣蛋白質(zhì)與細(xì)胞所生成的其它蛋白質(zhì)分開。這些技術(shù)基于蛋白質(zhì)的電荷、疏水性程度、或大小將蛋白質(zhì)的混合物分開。這些技術(shù)每一種有數(shù)種不同層析樹脂，容許適應(yīng)所牽涉的具體蛋白質(zhì)來精確剪裁純化方案。這些分離方法每一種的本質(zhì)在于能使得蛋白質(zhì)或是以不同速率沿長柱向下移動，從而實(shí)現(xiàn)隨著它們進(jìn)一步向下通過柱子時進(jìn)一步增大的物理分離，或是選擇性粘附至分離介質(zhì)，然后通過不同溶劑來差異洗脫。在有些情況中，在雜質(zhì)特異性粘附至柱子，而感興趣蛋白質(zhì)不粘附時將期望的蛋白質(zhì)與雜質(zhì)分開，即，感興趣蛋白質(zhì)存在于“流出液”中。
在使用重組技術(shù)時，可以在細(xì)胞內(nèi)、在周質(zhì)空間中生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，那么作為第一步，通過例如離心或超濾清除宿主細(xì)胞或裂解片段的微粒碎片，諸如對于分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間的抗體(Carter等(1992)Bio/Technology 10163-167)。在存在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)時使細(xì)胞糊在約30分鐘里融化?？梢酝ㄟ^離心除去細(xì)胞碎片。如果將抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么通常首先使用商品化蛋白質(zhì)濃縮濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元濃縮來自此類表達(dá)系統(tǒng)的上清液。在任何上述步驟中，可以包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF來抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素來防止外來污染物的生長。
傳統(tǒng)的純化自細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)的方法包括羥磷灰石層析、離子交換層析、親和層析、疏水相互作用層析、凝膠電泳、透析、及其組合(Fahrner，R.L.等(2001)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.18301-327)。蛋白質(zhì)常常用作親和配體，可以將它固定化在多種支持物上，并容許含有所表達(dá)蛋白質(zhì)的已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)的初始階段富集。蛋白A是對于蛋白質(zhì)(諸如包含F(xiàn)c區(qū)的抗體)的親和層析有用的吸附劑。蛋白A是來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，它以高親和力(約10-8M)結(jié)合抗體Fc區(qū)(Sulkowski，E.(1987)Protein PurificationMicro to Macro，頁177-195；Chadha等(1981)Preparative Biochemistry 11(4)467-482；Reifsnyder等(1996)J.Chromatography 75373-80；US 6127526；6333398)。可以將蛋白A固定化在固相上，諸如玻璃、硅土、瓊脂糖或聚苯乙烯。固相可以是純化柱或離散顆粒的不連續(xù)相，諸如可控孔徑玻璃柱或硅酸柱，或包被有旨在防止污染物粘附至固相的試劑(諸如甘油)(US 6870034)。PROSEPATM柱(可購自Bioprocessing Limited)是經(jīng)甘油包被的蛋白A可控孔徑玻璃柱的一個例子。本發(fā)明所涵蓋的柱子的其它例子包括POROS 50ATM(聚苯乙烯)柱或重組蛋白A SEPHAROSE FAST FLOWTM(瓊脂糖)柱。用于蛋白A層析的固相可以用合適緩沖液平衡。例如，平衡緩沖液可以是25mM Tris，25mM NaCl，5mM EDTA，pH 7.1。
在固定化到層析介質(zhì)上時，蛋白A提供了用于純化重組抗體的技術(shù)，因?yàn)樗苓x擇性結(jié)合復(fù)雜溶液中的抗體，容許雜質(zhì)(諸如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和小分子)流出。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.621-13)。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人γ3(Guss等(1986)EMBO J.515671575)。親和配體所附著的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能夠獲得比瓊脂糖所能實(shí)現(xiàn)的更快的流速和更短的加工時間。對于包含CH3結(jié)構(gòu)域的抗體而言，可使用Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)進(jìn)行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)諸如離子交換柱上的分級、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素SEPHAROSETM上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸銨沉淀。
聚電解質(zhì) 聚電解質(zhì)是由帶電荷的單體單元構(gòu)成的水溶性聚合物。本發(fā)明的聚電解質(zhì)的單體單元攜帶電解質(zhì)(帶電荷的官能度)基團(tuán)，其根據(jù)酸度(pH)在水溶液中發(fā)生質(zhì)子解離(離子化)。例示性的聚電解質(zhì)的帶電荷官能度包括但不限于磺酸、膦酸、羧酸、和胺，及其各自的離子磺酸鹽、膦酸鹽、羧酸鹽、和銨。所述解離影響溶液的離子強(qiáng)度和電導(dǎo)率。
對于本發(fā)明的方法有用的聚電解質(zhì)可具有范圍為約一千(1000)道爾頓(Da)至約一百萬(1,000,000)道爾頓的分子量。本發(fā)明的聚電解質(zhì)可以以某些類型的重復(fù)單體單元的混合物形式使用，但其具有寬范圍的鏈長度，即分子量范圍為約1200道爾頓(Da)至約一百萬(1,000,000)道爾頓?；旌衔锟梢允钦姆秶缂s1200Da至約2400Da、或約4000Da至約8000Da?？梢栽趩误w單元的某些聚合條件下控制平均分子量和分子量分布譜，所述條件諸如濃度、聚合引發(fā)劑或催化劑、溫度、或時間。也可以在某些制備性純化方法下選擇聚電解質(zhì)的平均分子量和分子量分布譜。
可以在沉淀反應(yīng)中使用帶負(fù)電荷的陰離子聚電解質(zhì)和帶正電荷的陽離子聚電解質(zhì)。在溶液pH低于具體抗體的pI時，抗體是帶正電荷的。在這些條件下，陽離子聚電解質(zhì)可沉淀雜質(zhì)并將感興趣抗體留在溶液中。相反，陰離子聚電解質(zhì)可沉淀抗體，形成蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀，將雜質(zhì)留在溶液中。為本發(fā)明的方法選擇聚電解質(zhì)時要考慮的其它因素包括官能團(tuán)穩(wěn)定性和反應(yīng)性、分子量、電荷密度和鏈剛度(chain stiffness)。
本發(fā)明的聚電解質(zhì)包括攜帶陽離子和陰離子兩種帶電荷官能度的聚兩性電解質(zhì)(polyampholyte)。
例示性的本發(fā)明聚陰離子聚電解質(zhì)包括聚丙烯酸(PAA)、聚乙烯基磺酸(PVS)、聚苯乙烯磺酸(PSS，聚(4-乙烯基苯磺酸金屬鹽))、聚甲基丙烯酸(PMA)、聚丙烯酰胺甲基丙磺酸(PAMPS)、羧甲基纖維素(CMC)、馬來酸酐-苯乙烯共聚物(MAS)、馬來酸酐-乙烯基甲基醚共聚物(MAVE)、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、硫酸右旋糖苷、果膠、藻酸、和糖胺聚糖(諸如硫酸軟骨素、肝素/硫酸類肝素、和透明質(zhì)酸)；及其所有的鹽和共聚物。
聚丙烯酸(PAA)和聚乙烯基磺酸(PVS)，及其陰離子(分別是聚丙烯酸酯和聚乙烯基磺酸酯)是對于本發(fā)明的方法有用的聚電解質(zhì)。PAA具有與PVS類似的結(jié)構(gòu)特性。二者都是聚合物且具有線性碳主鏈。這兩種聚電解質(zhì)的區(qū)別在于它們的官能團(tuán)。PVS具有一磺酸官能團(tuán)，該磺酸官能團(tuán)給予PVS大約為1的pKa。比較而言，PAA具有一羧酸官能團(tuán)和大約為5的pKa?？色@得一種分子量的PVS，其通過大小排阻測定為平均1800Da，其中動態(tài)光散射檢測測定n為約10-20。可購得多種分子量的PAA，包括1200和8000，其中平均n分別約為15-20和約100-120。PAA和PVS購自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO)、Polysciences Inc.(Warrington，PA)、和Carbomer Inc.(San Diego，CA)。


聚乙烯基磺酸(PVS)

聚丙烯酸(PAA，聚丙烯酸酯)

聚苯乙烯磺酸鹽((polystyrene sulfonate)PSS) 例示性的本發(fā)明帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)包括聚精氨酸(PLA，包括聚-L-精氨酸鹽酸鹽Sigma-Aldrich P-4463，MW 5-15kDa，P-7762MW15-70kDa，P-3892，MW＞70kDa，CAS No.26982-20-7，和聚-L-精氨酸硫酸鹽，Sigma-Aldrich P-7637MW 15-50kDa，CAS No.26700-68-5)；聚賴氨酸(例如poly-L-賴氨酸鹽酸鹽CAS Number26124-78-7，Sigma-AldrichP-2658MW 15-30kDa，CAS No.26124-78-7，PLL，Jacobson，B.S.和Branton，D.(1977)Science 195，302)；聚鳥氨酸(例如聚-L-鳥氨酸，Sigma-AldrichP-2533MW 15-30kDa，CAS No.26982-21-8)；聚乙烯基胍(聚(乙烯基胍)，US 6087448)；聚二烯丙基二甲基銨氯化物；聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶溴化物)；聚甲基丙烯酰胺丙基三甲基銨氯化物；聚乙烯基芐基三甲基銨氯化物；和聚組氨酸。


聚精氨酸(聚-L-精氨酸鹽酸鹽)

聚賴氨酸(聚-L-賴氨酸鹽酸鹽) 單克隆抗體純化中的聚電解質(zhì)沉淀 聚電解質(zhì)沉淀可用于在純化期間將抗體與雜質(zhì)分開。這些雜質(zhì)包括宿主細(xì)胞雜質(zhì)，諸如CHO蛋白質(zhì)(CHOP)和大腸桿菌蛋白質(zhì)(ECP)；細(xì)胞培養(yǎng)物成分，諸如胰島素、慶大霉素、和DNA；過程中的雜質(zhì)，諸如浸出的蛋白A；和產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)，諸如抗體聚集體和片段。沉淀步驟可充當(dāng)現(xiàn)有層析分離的替代?；蛘?，蛋白質(zhì)的聚電解質(zhì)沉淀可用作來自真核或原核培養(yǎng)物的已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)的直接捕獲步驟，或用作中間純化步驟。還有，聚電解質(zhì)沉淀可用作蛋白質(zhì)純化中澄清步驟，澄清細(xì)胞培養(yǎng)液，包括HCCF。聚電解質(zhì)可以在細(xì)胞培養(yǎng)液中形成絮狀物，其沉降并容許含有蛋白質(zhì)(諸如在原核或真核細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)的抗體)的混合物的快速和有效的澄清、富集、沉淀、或純化。本發(fā)明的聚電解質(zhì)純化方法可代替收獲操作，諸如離心、過濾、和層析操作。本發(fā)明的聚電解質(zhì)純化方法在純化蛋白質(zhì)(諸如抗體)方面提供了令人驚訝的和出乎意料的好處。
要為聚電解質(zhì)沉淀優(yōu)化的條件包括溶液pH、電導(dǎo)率、緩沖液、蛋白質(zhì)濃度、聚電解質(zhì)濃度、攪動的速率和類型、及添加聚電解質(zhì)的速率。
可以在帶攪動的反應(yīng)器中實(shí)施沉淀?？梢愿鶕?jù)自溶解度曲線鑒定的最佳條件將抗體池的pH和電導(dǎo)率調(diào)節(jié)至目標(biāo)條件。添加并混合聚電解質(zhì)。攪動的速率和類型可影響沉淀效率和沉淀時間。沉淀在添加聚電解質(zhì)后發(fā)生。使用過濾或離心將沉淀物與上清液分開。對于使用過濾的陰離子聚電解質(zhì)沉淀，用清洗緩沖液徹底清洗沉淀物。隨后將包含抗體的沉淀物重懸浮和下游加工。還有可能實(shí)施聯(lián)機(jī)(in-line)沉淀，即沒有混合容器，其中將抗體池調(diào)節(jié)至目標(biāo)pH，然后添加聚電解質(zhì)。直到稀釋所述池時才會發(fā)生完全沉淀，稀釋可以與過濾裝置或離心機(jī)聯(lián)機(jī)實(shí)施?；蛘撸趯⒖贵w池調(diào)節(jié)至目標(biāo)pH后，聯(lián)機(jī)實(shí)施稀釋，后續(xù)聯(lián)機(jī)添加聚電解質(zhì)，之后是過濾裝置或離心機(jī)。
在一個例示中，人生長激素(pI 5.2)在pH 7的緩沖液中結(jié)晶或沉淀時是帶負(fù)電荷的，因此會與陽離子聚電解質(zhì)相互作用或復(fù)合。類似地，具有大于9的pI的單克隆抗體(諸如利妥昔單抗(rituximab)和曲妥單抗(trastuzumab))能夠在中性緩沖液中與陰離子聚電解質(zhì)復(fù)合。一旦通過公眾可得的程序確定氨基酸序列，就能計(jì)算蛋白質(zhì)凈電荷的估值。酸性蛋白質(zhì)(那些具有較高的天冬氨酸(pKa 4.5)和谷氨酸(pKa 4.5)含量的蛋白質(zhì))通常具有小于6至6.4的pI。另一方面，堿性蛋白質(zhì)(那些具有較高的組氨酸(pKa 6.2)、賴氨酸(pKa 10.4)和精氨酸(pKa 12)含量的蛋白質(zhì))通常具有大于約7.5至8的pI。與二者相反，中性蛋白質(zhì)(那些通常具有類似量的酸性和堿性氨基酸殘基的蛋白質(zhì))具有中性(pI通常為約6.5至7.5)的pI。
盡管不是綜合列表，各種治療性蛋白質(zhì)的pI的一些例子如下重組人紅細(xì)胞生成素(pI 4)；鏈球菌DNA酶α、rhDNA酶(

)(pI 5)；依那西普(etanercept，ENBRELTM)(pI 5.1)；胰島素(pI 5.4)；粒細(xì)胞集落刺激因子(pI5.5-5.9)；TNFα(pI 5.6)；Fibrolase(pI 6.7)；IL-1β(pI 6.9)；重組組織型纖溶酶原激活劑(pI 6.5-8.5)；Orthoclone OKT3(pI 6.7-7.2)；因子VIII(pI 7-7.6)；牛生長素(pI 7.4)；白介素2(pI 7.44)；胰島素樣生長因子-1(pI 8.4)；和抑肽酶(pI 10.5)。
對陰離子聚電解質(zhì)沉淀方法作為數(shù)種例示性抗體(抗CD20rhuMab 2H7，rhuMab DR5Apomab，和抗cMet)的陽離子交換(SPSFF)步驟的替代及作為rhuMab 2H7(ocrelizumab)的蛋白A(Prosep vA)步驟的替代進(jìn)行評估?？赏ㄟ^本文所述聚電解質(zhì)沉淀方法純化其它抗體和其它蛋白質(zhì)。使用溶解度曲線來為三種抗體鑒定高效的或最佳的沉淀?xiàng)l件(pH、電導(dǎo)率和聚合物濃度)。聚電解質(zhì)沉淀步驟展示了減少宿主蛋白質(zhì)諸如中國倉鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)和大腸桿菌蛋白質(zhì)(ECP)，浸出的蛋白A，小分子諸如胰島素和慶大霉素以及抗體片段和聚集體的能力。根據(jù)CDC活性的測量，聚電解質(zhì)沉淀步驟對2H7的生物學(xué)活性沒有負(fù)面影響。使用陰離子交換(QSFF)層析自所沉淀的蛋白質(zhì)中除去聚電解質(zhì)PVS至低于1μg/mL的水平。
圖1-3的流程圖中例示了多種加工步驟系列。組合和省略各步驟以判斷它們對蛋白質(zhì)純化和加工效率的結(jié)果。一種本領(lǐng)域當(dāng)前實(shí)踐的用于自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)純化所表達(dá)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)過程使用三個層析步驟(1)蛋白A捕獲(Prosep vA)，(2)陽離子交換(SPSFF)，和(3)陰離子交換(QSFF)，如圖1左欄所示。嘗試了通過蛋白A捕獲及緊跟著的陰離子交換進(jìn)行的純化(圖1中欄)?？梢杂胮H 7的PVS沉淀步驟代替陽離子交換步驟(圖1右欄)?？梢栽跊]有蛋白A捕獲的情況中加工已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液，即初始陽離子交換，緊接著是陰離子交換(圖2左欄)，或者pH 7的PVS沉淀，跟著是陰離子交換(圖2右欄)?？梢匀缦逻M(jìn)行聚電解質(zhì)沉淀，即作為自HCCF的直接捕獲，接著是陰離子交換，然后是陽離子交換層析(圖3)。在pH 5(圖3左欄)和pH 7(圖3右欄)進(jìn)行聚電解質(zhì)沉淀。
為抗CD20抗體rhuMab 2H7選擇沉淀?xiàng)l件 在一定范圍的離子強(qiáng)度里為重組人源化抗CD20單克隆抗體rhuMab 2H7生成溶解度曲線。溶解度曲線是沉淀后上清液中留下的殘余蛋白質(zhì)(以百分比表述)對PVS濃度(以PVS摩爾數(shù)/抗體摩爾數(shù)表述)的曲線。pH 5和pH 7(圖4和圖5)的蛋白A池、用作pH 7的直接捕獲步驟的SPSFF池(圖6)、及pH 5和pH 7的HCCF(圖7)生成溶解度曲線。使用這些曲線來選擇實(shí)施制備規(guī)模沉淀的pH、離子強(qiáng)度和PVS濃度。
蛋白A池的沉淀(圖4和圖5) 隨著PVS濃度的升高，在pH5處立即沉淀，如溶液中剩余的抗體百分比(C/Co，即溶液中的抗體的濃度除以總抗體)的降低所表明的(圖4)。C/Co(％)是未沉淀的蛋白質(zhì)除以初始蛋白質(zhì)的百分比(％)。當(dāng)C/Co(％)為0％時，沉淀完全。
隨著離子強(qiáng)度降低，有可能實(shí)現(xiàn)更高水平的沉淀(4.7mS/cm比3.0mS/cm，其中mS為毫西門子，電導(dǎo)率的單位)。在pH 7，實(shí)現(xiàn)顯著沉淀需要稀釋(圖5)。隨著電導(dǎo)率降低，沉淀增加。在0.7mS/cm的電導(dǎo)率觀察到完全的沉淀。在特定的電導(dǎo)率，一旦觀察到最大水平的沉淀，添加額外的PVS引起沉淀物重溶解。
SPSFF池(圖6)和HCCF(圖7)的沉淀對SPSFF池和HCCF觀察到類似的趨勢。隨著電導(dǎo)率降低，沉淀增加。在特定的電導(dǎo)率，一旦觀察到最大水平的沉淀，添加額外的PVS引起沉淀物重溶解。
評估聚電解質(zhì)分子量的影響 還生成了溶解度曲線來比較PVS與PAA。溶解度曲線是沉淀后上清液中留下的殘余蛋白質(zhì)(以百分比表述)對聚電解質(zhì)濃度(以聚電解質(zhì)摩爾數(shù)/抗體摩爾數(shù)表述)的曲線。在pH 5(圖8)和pH 7(圖9)為PAA(1200和8000Da)和PVS(1800Da)測量了一定范圍的聚電解質(zhì)當(dāng)量每抗CD20抗體(rhuMab-2H7，pI 9.0，150kDa)里的溶解度曲線。與較低分子量形式(1200Da)的PAA和(1800Da)PVS聚電解質(zhì)(圖8)相比，較高分子量形式(8000Da)的PAA在pH 5和電導(dǎo)率值5mS/cm導(dǎo)致更多的沉淀(圖8)。在pH 7，1.5mS/cm觀察到類似的趨勢(圖9)。與較低分子量1200Da PAA和1800Da PVS聚電解質(zhì)相比，較高分子量8000Da PAA在pH 7和電導(dǎo)率值1.5mS/cm導(dǎo)致更多沉淀。電導(dǎo)率的基礎(chǔ)單位是西門子(S)，以前稱作姆歐。電導(dǎo)率測量是溫度依賴性的。電導(dǎo)率值表述為mS/cm。在兩種情況中，較大的PAA聚電解質(zhì)在進(jìn)一步添加聚電解質(zhì)引起沉淀物重溶解之前實(shí)現(xiàn)最大沉淀所需要的聚電解質(zhì)濃度方面都具有較窄的操作范圍。提高聚電解質(zhì)分子量可容許在較高電導(dǎo)率實(shí)施沉淀。
用分子量范圍1200Da至1,100,000Da內(nèi)的PAA調(diào)查了聚電解質(zhì)分子量對抗CD20抗體(利妥昔單抗)在pH 7和1.5mS/cm沉淀的影響(圖10)。提高分子量導(dǎo)致這些條件下的沉淀增加。在pH 7和1.5mS/cm，直到使用分子量大于35,000Da(35kDa)的PAA才實(shí)現(xiàn)了完全沉淀。
還用分子量范圍1800Da至1,132,000Da內(nèi)的聚苯乙烯磺酸鹽(PSS)調(diào)查了聚電解質(zhì)分子量對人源化抗CD20抗體在pH 7和12mS/cm沉淀的影響(圖33)。在此分子量范圍里為人源化抗CD20抗體的PSS沉淀生成了溶解度曲線。提高分子量導(dǎo)致這些條件下的沉淀增加。在pH 7和12mS/cm，知道使用分子量大于220,000Da(220kDa)的PSS才實(shí)現(xiàn)了完全沉淀。使用PSS容許在較高電導(dǎo)率實(shí)施沉淀和將實(shí)現(xiàn)完全沉淀對降低池的電導(dǎo)率/離子強(qiáng)度的需要降至最低。
在表1的條件下測量了聚電解質(zhì)分子量對雜質(zhì)清除的影響，而且表2顯示了下游加工結(jié)果。在沉淀步驟后，PAA 8000Da具有比PAA 1200Da或PVS高的中國倉鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)水平(表2)。對于QSFF池，對所有池觀察到類似的CHOP水平，與純化中所使用的聚電解質(zhì)的分子量無關(guān)。兩種分子量的PAA都減少浸出的蛋白A和抗體片段至類似的水平，而且對聚集體水平?jīng)]有負(fù)面影響。
表1PAA沉淀?xiàng)l件 表2下游加工結(jié)果匯總

抗CD20抗體純化 最初對聚電解質(zhì)沉淀作為陽離子交換層析步驟的替代進(jìn)行評估。陽離子交換步驟的主要功能是減少宿主細(xì)胞雜質(zhì)，除去浸出的蛋白質(zhì)、慶大霉素、DNA，和減少抗體聚集體，如果存在的話(圖11)。胰島素是通過先前的蛋白A步驟除去的。PVS沉淀步驟減少CHOP至與SPSFF步驟類似的水平。它還減少浸出的蛋白A和抗體片段。慶大霉素在沉淀步驟間有減少，只是程度與SPSFF步驟不同。DNA測定法在存在PVS的情況中不運(yùn)行，因此不能在沉淀步驟間評估PVS清除。根據(jù)CDC活性的測量，添加沉淀步驟不增加抗體聚集體或影響生物學(xué)活性(圖11和表3)。
為了提供更富挑戰(zhàn)性的給料，直接在SPSFF柱間加工HCCF。在用作初始捕獲步驟時，SPSFF池具有比蛋白A池高4倍的CHOP(圖11)。％片段也比蛋白A捕獲工藝高(9.24％比0.24％)。可能是在陽離子交換步驟間與抗體共純化的蛋白酶導(dǎo)致抗體的剪裁。PVS沉淀步驟將片段減少5.63％。CHOP通過該工藝減少至4.1ng/mg，比較而言，沒有沉淀步驟的情況中是71ng/mg。慶大霉素也被沉淀步驟顯著減少(從146變成8ng/mg)。胰島素和DNA被初始SPSFF捕獲步驟減少至低水平，因而不能評估它們的清除。對照運(yùn)行(SPSFF-QSFF)中的高片段水平導(dǎo)致降低的CDC活性，即87％(表3)。比較而言，PVS沉淀運(yùn)行具有100％CDC活性。
還對PVS步驟作為自HCCF的直接捕獲步驟進(jìn)行評估。pH 7的PVS沉淀步驟除去胰島素(圖11)。比較而言，pH 5的PVS沉淀步驟僅僅部分降低胰島素水平。pH 7的PVS沉淀清除比pH 5的沉淀多3倍的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。用正交層析方法(諸如疏水相互作用步驟)代替最終SPSFF步驟可進(jìn)一步降低宿主細(xì)胞雜質(zhì)。憑借pH 5捕獲，在陽離子交換步驟間抗體片段有4.66％的增加。這在pH 7捕獲步驟中沒有發(fā)生。這提示在pH 5(與有SPSFF捕獲步驟的情況非常相像)，酸性蛋白酶共純化，引起抗體片段增加。根據(jù)CDC活性的測量，添加沉淀步驟不影響生物學(xué)活性(表3)。使用補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)測定法對Q池分析生物學(xué)活性/效力。此測定法基于在存在人補(bǔ)體的情況中rhuMAb 2H7溶解WIL2-S細(xì)胞的能力的測量。
表3PVS沉淀對CDC活性的影響 使用基于RNA酶A抑制作用的FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)測定法測定聚電解質(zhì)清除(自重懸浮的抗體中除去聚電解質(zhì))。PVS是RNA酶A的有力抑制劑。該測定法使用在一端具有熒光標(biāo)記物而在另一端具有淬滅物的RNA類似物。一旦RNA類似物受到RNA酶A的切割，熒光標(biāo)記物自淬滅劑釋放，產(chǎn)生發(fā)射。PVS的存在會抑制RNA酶A活性，限制熒光發(fā)射。然后可通過比較自測試樣品觀察到的熒光與標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定PVS的量。在所有情況中，在QSFF層析上，PVS被清除到1μg/μl以下(表4)。
表4定量抗CD20抗體(2H7)沉淀后的PVS清除 rhuMab DR5Apomab純化 開發(fā)和應(yīng)用聚電解質(zhì)沉淀工藝來純化抗體rhuMab DR5Apomab(pI 8.0，150kDa)。含死亡結(jié)構(gòu)域的受體-5(DR5)蛋白是腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的成員(US 6872568；US 6743625)。標(biāo)準(zhǔn)層析工藝使用Prosep vA、SPSFF和QSFF樹脂。修改聚電解質(zhì)沉淀工藝來除去成問題的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)雜質(zhì)，谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(GST)。Prosep vA步驟具有0.5M TMAC清洗，pH 5，而不是0.4M磷酸鉀pH 7清洗。SPSFF步驟以淺梯度洗脫，產(chǎn)生大約12個柱體積的池體積。對PVS沉淀作為SPSFF步驟的替代進(jìn)行評估。在pH范圍5.5至7.0內(nèi)生成溶解度曲線。隨著pH升高，實(shí)現(xiàn)完全沉淀需要稀釋來降低離子強(qiáng)度(圖12和圖13)。在圖12中，實(shí)現(xiàn)完全沉淀需要隨著pH升高而稀釋來降低離子強(qiáng)度。在pH 5.5和電導(dǎo)率5.1mS/cm觀察到完全沉淀。然而，在pH 6，必須將池稀釋至3mS/cm來實(shí)現(xiàn)完全沉淀。在圖13中，實(shí)現(xiàn)完全沉淀需要隨著pH升高而稀釋以降低離子強(qiáng)度。在pH 6.5，在1.5mS/cm觀察到完全沉淀。在pH 7，必須將池稀釋至0.7mS/cm來實(shí)現(xiàn)完全沉淀。
一旦實(shí)現(xiàn)了完全沉淀，添加額外的PVS引起沉淀物重溶解。圖14中的照片圖示了這種效應(yīng)。圖14圖示了0.1％PVS(w/v)Apomab溶液燒瓶中的沉淀效應(yīng)，及在1％PVS(w/v)時的重溶解。使用溶解度曲線來選擇沉淀?xiàng)l件，如表5中所概述的。在介于pH 5.5和pH 7.0之間實(shí)施PVS沉淀。隨著pH升高，產(chǎn)率略有降低，但是CHOP和浸出的蛋白A清除有所改善(表6)。隨后在QSFF柱間加工這些池，并與對照運(yùn)行進(jìn)行比較(表6)。將CHOP清除至＜0.79ng/mg及將浸出的蛋白A清除至＜2ng/mg需要SPSFF步驟或PVS沉淀步驟，比較而言沒有SPSFF或沉淀步驟的對照運(yùn)行中有17ng/mg CHOP和4ng/mg浸出的蛋白A。PVS沉淀還展示了減少GST的能力，但是沒有到與SPSFF步驟相同的水平。
表5Apomab沉淀?xiàng)l件 表6ApoMab純化-Apomab中間池(a)和QSFF池(b)的下游加工結(jié)果

抗cMet純化 由于有限的材料可得性，在一定范圍的pH和選定的離子強(qiáng)度里為抗cMet生成溶解度曲線。溶解度曲線是自調(diào)節(jié)至pH 4-pH 7的蛋白A池生成的(圖15)。使用這些曲線來選擇實(shí)施制備規(guī)模沉淀的pH、離子強(qiáng)度和PVS濃度。在pH 4和電導(dǎo)率2mS/cm，抗cMet在大于40的PVS∶Ab摩爾比自溶液完全沉淀(圖15)。在pH 5，在電導(dǎo)率1mS/cm和2.4mS/cm得到了溶解度曲線。在更高的電導(dǎo)率，抗cMet沒有自溶液完全沉淀。通過將溶液電導(dǎo)率降低至1mS/cm，抗cMet更易于自溶液沉淀。在此電導(dǎo)率，在100的PVS∶Ab摩爾比發(fā)生了最大沉淀。在大于100的摩爾比，聚電解質(zhì)復(fù)合物具有升高的溶解度，有可能是由于聚電解質(zhì)電荷-電荷排斥效應(yīng)。pH 4與pH 5(電導(dǎo)率約2mS/cm)的溶解度曲線的比較提示，溶液抗衡離子的靜電屏蔽效應(yīng)影響發(fā)生體相(bulkphase separation)分離的pH，而且溶液離子強(qiáng)度的降低對于升高的pH是必須的。在pH 6和pH 7及溶液電導(dǎo)率0.5mS/cm時，抗cMet在所測試的PVS濃度條件下沒有自溶液完全沉淀。在pH 6和pH 7分別發(fā)生21％(C/Co＝.79)和12％(C/Co＝.88)的最大沉淀?？筩Met在pH 6和pH 7的溶解度曲線與具有類似蛋白質(zhì)pI(8.3)的全長人源化抗體相比顯著不同。例如，使用類似的條件，即pH7.0和電導(dǎo)率0.7mS/cm的溶液，Apomab完全沉淀(C/Co＝0)，在這些實(shí)驗(yàn)中使用了相同的R值。
將包括PVS沉淀的用于抗cMet(pI 8.3，100kDa)的純化方法與使用四個層析步驟的標(biāo)準(zhǔn)方法(即先是蛋白A捕獲，接著是兩個以結(jié)合和洗脫模式運(yùn)行的陽離子交換步驟，最后是以流經(jīng)模式操作的疏水相互作用層析步驟)進(jìn)行比較(表7)。陽離子交換步驟和疏水相互作用步驟都用PVS沉淀替代，接著是以流經(jīng)模式運(yùn)行的陰離子交換層析。在pH 4，可以在較高的離子強(qiáng)度實(shí)施沉淀反應(yīng)。然而，pH 5的沉淀可給出更大程度地雜質(zhì)清除，因?yàn)楦嗟乃拗骷?xì)胞雜質(zhì)在此pH應(yīng)當(dāng)是帶負(fù)電荷的，因此留在溶液中。根據(jù)溶解度曲線的測定，選擇pH 5.0、電導(dǎo)率0.6mS/cm和PVS摩爾比100(0.1％w/v)的條件來使抗體沉淀最大化?？筩Met的PVS沉淀的回收率受到PVS抗體團(tuán)粒溶解的影響。PVS抗體團(tuán)粒是凝膠樣的而且難以溶解。在團(tuán)粒在QSFF平衡緩沖液中溶解后，溶液因微粒而混濁。容易地使用0.4μM真空濾器過濾溶液，得到清澈溶液，用于在Q-Sepharose陰離子交換層析上加工。
在pH 5、0.5mS/cm、和0.1％PVS(w/v)進(jìn)行的PVS沉淀步驟將ECP降低至與CM-Sepharose步驟類似的水平(表7)。通過沉淀步驟，沒有觀察到浸出的蛋白A的顯著降低或單體百分比的增加。
表7抗CMet下游加工結(jié)果匯總
用于沉淀物捕獲的過濾條件的選擇 在本發(fā)明的方法中可以使用具有特別適合于清除細(xì)胞培養(yǎng)液中生物學(xué)污染物的吸附過濾介質(zhì)的深部濾器(Depth filter)。深部濾器典型地用于生物藥物的生產(chǎn)，像衍生自哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物的，用于澄清各種粗制品液。纖維素深部濾器，諸如可購自Millipore Corporation的

濾器，具有用吸附材料(諸如粒狀吸附劑)制成的多孔固定床，裝在不溶于水的熱塑性容器(binder)中。所得復(fù)合濾器容許比常規(guī)深部濾器更高量的吸附劑及更小的吸附劑微粒。這些復(fù)合濾器包括一層緊密結(jié)構(gòu)的纖維素深部介質(zhì)，而且可根據(jù)特定應(yīng)用來優(yōu)化，諸如保留膠狀微粒和細(xì)胞碎屑或保留全細(xì)胞和更大的碎屑。它們在單一濾筒中組合連續(xù)級別的介質(zhì)，例如通過堆疊多張膜。此類深部濾器可用于精制或二次澄清過程，用以自含水產(chǎn)物(蛋白質(zhì))流除去小量的懸浮物。通過清除膠狀污染物和其它細(xì)胞碎屑，該濾器還可以保護(hù)或延長更昂貴的下游分離過程(諸如無菌過濾和親和層析)的使用壽命。另外，通過清除痕量的聚集的蛋白質(zhì)，此類深部濾器對于病毒清除濾器的保護(hù)也是有用的。
某些深部濾器還能不同程度地保留一些在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中常見地可溶性污染物，諸如核酸、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、表面活性劑、等。這種對某些可溶性污染物的保留能力基于深部過濾介質(zhì)的吸附特性。深部濾器中通常采用的過濾介質(zhì)包括精制的纖維素纖維(木漿和/或棉衍生的)、硅藻土、或水溶性熱固性樹脂粘合劑(US 2007/0193938)。這些復(fù)合物中的硅藻土(天然形式的含痕量的各種硅酸鹽的硅土)通常為40-60％(以重量計(jì))，吸附膠狀大小生物學(xué)物質(zhì)，諸如細(xì)胞碎片、細(xì)胞器和聚集的蛋白質(zhì)，以及各種可溶性生物化學(xué)物質(zhì)，諸如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸(DNA和RNA)。
對深部過濾作為PVS抗體沉淀的捕獲步驟進(jìn)行了評估。沉淀物的大小分布寬對使用過濾來捕獲沉淀物呈現(xiàn)了挑戰(zhàn)。在正常流過濾條件下用沉淀的抗體測試了每一種過濾介質(zhì)。對不同孔徑大小的深部過濾介質(zhì)篩選它們完全捕獲沉淀物的能力。根據(jù)其完全捕獲沉淀物及其加載高容量的能力來選擇最佳的過濾介質(zhì)。使用Vmax來評估穿過濾器的壓力下降以及測定最大容量。表8顯示了所評估的過濾介質(zhì)。所評估的

CE(只有纖維素)系列介質(zhì)包括20CE、35CE和45CE。所評估的

HC(纖維素和無機(jī)助濾劑)系列介質(zhì)包括C0HC、B1HC和A1HC(Rathore等，2004年8月1日，BioPharm Intl.；US 2007/0193938)。

濾筒和濾片可得自MilliporeCorp.(Bedford，MA)。
如表8中所示，20CE介質(zhì)與35CE和45CE相比更暢通(open)。20CE具有5-10微米的標(biāo)定的孔徑大小范圍，而35CE和45CE分別具有2-4微米和0.8-2微米的標(biāo)定的孔徑大小。選擇這些系列的過濾介質(zhì)來縮小孔徑大小范圍，使其能夠完全捕獲抗體(人源化2H7變體)-PVS沉淀物。20CE介質(zhì)導(dǎo)致沉淀物的45％捕獲，而35CE導(dǎo)致沉淀物的48％被捕獲。比較而言，45CE導(dǎo)致沉淀物的97％捕獲。Millistak+HC系列介質(zhì)比Millistak+CE系列更緊密。C0HC介質(zhì)具有0.2-2微米的標(biāo)定的孔徑大小范圍，而B1HC和A1HC分別具有范圍為0.05-0.7微米和0.05-0.4微米的更緊密的孔徑大小。所有三種都導(dǎo)致沉淀物的99％捕獲。
表8 圖34顯示了每種過濾介質(zhì)的容量(以每過濾面積的抗體(2H7)克數(shù)測量)對壓力下降的Vmax圖(表8)。設(shè)定17psi的壓力極限來指明實(shí)驗(yàn)由于濾器污垢的結(jié)束。設(shè)定125g/m2的目標(biāo)容量來指明實(shí)驗(yàn)在沒有濾器污垢的情況中的結(jié)束。A1HC和B1HC過濾介質(zhì)都達(dá)到了17psi，并且如此提供了最低容量。使用A1HC介質(zhì)在過濾結(jié)束時的容量為40g/m2，而使用B1HC介質(zhì)在過濾結(jié)束時的容量為68g/m2。C0HC以3.5psi的最大壓力達(dá)到了125g/m2的極限容量。如上所述，20CE和30CE保留少于50％的沉淀物，因此沒有測量目標(biāo)容量。45CE以7psi的最大壓力達(dá)到了目標(biāo)容量。
為深部濾器內(nèi)沉淀物的重溶解選擇重溶解條件 評估了許多重溶解方法，用以自深部濾器回收所捕獲的抗體。此步驟的目的是開發(fā)具有高抗體回收率的有力方法。所評估的第一種方法是使用高pH的高電導(dǎo)率緩沖液自沉淀物重溶解抗體。在高pH和電導(dǎo)率條件下，抗體所帶正電荷較少且溶液中更多的離子屏蔽PVS和抗體，由此阻止沉淀。使用pH范圍為8-8.5且電導(dǎo)率為約6mS/cm的50mM Tris堿/50mM乙酸鈉緩沖液來重溶解抗體。用該緩沖液沖洗流過深部濾器，所得池含有抗體和PVS。評估完全重溶解抗體所需要的變量，諸如緩沖液的流速和體積。還對緩沖液流過深部濾器重循環(huán)作為生成更濃縮的池的方法進(jìn)行了評估。
根據(jù)來自C0HC

過濾介質(zhì)的2H7-PVS蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀物實(shí)現(xiàn)完全重溶解所必需的緩沖液體積，圖35顯示了不同流速對對產(chǎn)率的影響。使用600ml緩沖液，52-130LMH(升每平方米每小時，流速度量單位)和130-261LMH范圍內(nèi)的流量顯示了類似的趨勢，兩條曲線導(dǎo)致類似的最終產(chǎn)率。使用600ml緩沖液，流量為130LMH時的曲線涵蓋相同的趨勢，而且也導(dǎo)致類似的產(chǎn)率。改變流速不會改善產(chǎn)率對緩沖液體積的比值。使用這種方法獲得的最高抗體濃度是1g/L。
對緩沖液流過深部濾器重循環(huán)作為能潛在導(dǎo)致更濃縮的池的方法進(jìn)行了評估。以裝有緩沖液的水箱(reservoir)充當(dāng)輸入緩沖液和輸出池二者的容器。如圖36中所示，測試了兩個流量范圍(重溶解緩沖液流，以LMH為單位)來測定作為2H7-PVS蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀物自濾器回收大部分蛋白質(zhì)的最佳加工時間。60分鐘后，范圍為130-261LMH的流量達(dá)到了與范圍為261-522LMH的流量相同的產(chǎn)率(84％)。就池濃度而言，與緩沖液單次流過深部濾器相比，重循環(huán)方法導(dǎo)致更濃縮的池。使用重循環(huán)方法得到的最高抗體濃度是2g/L。
以連續(xù)模式操作沉淀反應(yīng)和深部過濾捕獲 PVS沉淀依賴于溶液中強(qiáng)陰離子PVS分子與僅略微陽離子抗體分子之間的離子相互作用。稀釋蛋白質(zhì)給料以將溶液的電導(dǎo)率降低至PVS沉淀可接受的范圍會引起給料體積的大大增加。為了避免在制造規(guī)?？赡艿捏w積限制，有必要開發(fā)管線內(nèi)(inline)調(diào)節(jié)給料條件的策劃。管線內(nèi)稀釋可用于降低給料流的電導(dǎo)率且不需要混合罐。通過將PVS流與條件化給料流混合，PVS-抗體沉淀能在管線內(nèi)發(fā)生且消除了規(guī)?；瘯r對大沉淀罐的需要。圖37描繪了以如下目標(biāo)設(shè)定的管線內(nèi)HCCF條件化/PVS沉淀的概況(i)長滯留時間和低流速以促進(jìn)PVS-MAb微粒聚集；(ii)管線內(nèi)反應(yīng)器的橫截面面積大以維持高加工通量；和(iii)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的執(zhí)行。
雖然PVS和條件化給料流的管線內(nèi)混合后可容易地發(fā)生PVS-抗體沉淀，但是PVS-抗體沉淀物微粒聚集過程對水流湍流、停留時間、和平均線性流速非常敏感。形成大得足以被過濾介質(zhì)捕獲的沉淀物微粒所需要的樣品微粒聚集需要一段低攪動停留時間。高流速可阻止PVS-Ab沉淀物形成大聚集體，產(chǎn)生過濾介質(zhì)可能難以捕獲的很小沉淀物微粒流。
以實(shí)驗(yàn)室規(guī)模提供管線內(nèi)連續(xù)式給料條件化/PVS沉淀管道連同深部過濾捕獲方法，用以加工連續(xù)沉淀的給料流。對圖37所示加工示意圖觀察到范圍為71％-60％的抗體回收率(圖38顯示了抗體產(chǎn)率圖)，有超過管線內(nèi)PVS沉淀步驟9倍的CHOP清除。
陽離子聚電解質(zhì)沉淀?xiàng)l件的選擇 使用兩種分子量的聚精氨酸(聚L-精氨酸)在CCF和HCCF中生成溶解度曲線。溶解度曲線是沉淀后上清液中留下的殘余蛋白質(zhì)(以百分比表述)對聚電解質(zhì)濃度(以聚電解質(zhì)(g)/溶液體積(mL)表述)的曲線。
在一定范圍的離子強(qiáng)度里為rhuMab 2H7CCF(圖20)和HCCF(通常在pH 7)生成溶解度曲線(圖21和圖22)。使用這些曲線來選擇實(shí)施制備規(guī)模沉淀的最佳CHOP沉淀?xiàng)l件，即離子強(qiáng)度、聚精氨酸濃度和分子量。還用抗CD22和rhuMab C2B8HCCF生成溶解度曲線(圖23和圖24)以確保沉淀技術(shù)的穩(wěn)健性(robustness)和一致性(consistency)。為了評估通過兩個沉淀步驟、陽離子聚電解質(zhì)沉淀、接著是陰離子聚電解質(zhì)沉淀純化抗體的可行性，為自CCF用0.075％w/v 110kDa聚精氨酸絮凝產(chǎn)生的rhuMab HCCF的PVS沉淀生成了溶解度曲線(圖25)。隨著聚精氨酸濃度的升高，有CHOP沉淀，正如上清液中殘余CHOP(ng/mg)的減少所指明的。在0.2％w/v濃度的聚精氨酸發(fā)生最佳CHOP沉淀，CHOP減少22倍，產(chǎn)率95％。聚精氨酸濃度的進(jìn)一步升高不會導(dǎo)致顯著的CHOP減少，但是產(chǎn)率有降低。
CHOP沉淀表現(xiàn)為聚電解質(zhì)的離子強(qiáng)度和分子量的函數(shù)，正如在rhuMab2H7HCCF溶解度曲線中所看到的(圖21和圖22)。隨著電導(dǎo)率降低，沉淀有增加。一般而言，提高聚電解質(zhì)的分子量表現(xiàn)出對CHOP沉淀有影響。在類似的聚精氨酸濃度，較高分子量的聚電解質(zhì)(110kDa)比較低分子量的聚電解質(zhì)(42kDa)沉淀的CHOP多。在特定的電導(dǎo)率(除了3mS/cm以外)，添加多于0.1％w/v的聚精氨酸不會導(dǎo)致進(jìn)一步的顯著的CHOP減少。在0.1％w/v的聚精氨酸濃度，用42kDa和110kDa分子量分別獲得10倍和13倍的CHOP減少，而且兩種分子量的產(chǎn)率都大于95％。
用抗CD22和rhuMab C2B8HCCF觀察到類似的趨勢，正如在rhuMab2H7、抗CD22、rhuMab C2B8HCCF溶解度曲線中所看到的(圖23和圖24)。用0.1％w/v 110kDa聚精氨酸沉淀抗CD22HCCF導(dǎo)致25倍的CHOP減少和95％的產(chǎn)率。用于rhuMab C2B8的最佳CHOP沉淀發(fā)生于0.15％w/v濃度的110kDa聚精氨酸，其導(dǎo)致20倍的CHOP減少和95％的產(chǎn)率。
隨著PVS濃度升高，在所測試的pH和電導(dǎo)率，用聚精氨酸絮凝的給料中的抗體完全沉淀，以產(chǎn)率(％)的降低指示(圖25)。這指明了聚精氨酸的存在對所測試的條件下抗體的PVS沉淀的最低限度干擾。在pH 7和1.5mS/cm電導(dǎo)率，一旦觀察到最大水平的沉淀，添加額外的PVS就引起沉淀物重溶解。
rhuMab 2H7的下游加工 標(biāo)準(zhǔn)方法當(dāng)前使用三個層析步驟，即蛋白A捕獲步驟，后續(xù)陽離子和陰離子交換步驟。表9作為工藝流程a)顯示了用0.075％w/v 110kDa聚精氨酸絮凝CCF及用PVS加工帶抗體沉淀的HCCF，后續(xù)QSFF步驟。這個絮凝步驟的主要功能是通過除去固體(細(xì)胞碎屑)來澄清CCF，由此降低濁度和沉淀宿主細(xì)胞雜質(zhì)(諸如CHOP和DNA)。聚精氨酸能夠絮凝固體和細(xì)胞培養(yǎng)基成分，而且將CHOP減少至23480ng/mg(減少4倍)和完全除去DNA。如果將110kDa聚精氨酸的濃度提高至0.2％w/v，那么得到多達(dá)22倍的CHOP降低，正如溶解度曲線所指明的(圖20)。所絮凝的HCCF的PVS沉淀進(jìn)一步將CHOP減少至212ng/mg，這顯著少于對照HCCF-PVS池中的CHOP。對照HCCF-PVS-Q池具有Poly(Arg)HCCF-PVS-Q池幾乎兩倍量的CHOP。DNA測定法在PVS存在的情況中不起作用，因此無法評估沉淀步驟間的PVS清除。除了PVS沉淀步驟之外的所有步驟間的產(chǎn)率都大于95％(表9)。PVS步驟的這些低產(chǎn)率可歸于制備規(guī)模的沉淀規(guī)程和操作，而非沉淀的機(jī)制和條件(圖25)。對這些池，沒有評估百分比單體(通過SEC)、胰島素和慶大霉素。
為了研究對下游加工的影響，用0.1％w/v 110kDa聚精氨酸沉淀HCCF并施行各種純化方案。通過聚精氨酸沉淀，CHOP減少了18倍，DNA被完全消除，而且抗體的產(chǎn)率為97％。通過這種沉淀步驟沒有清除胰島素和慶大霉素。在下游加工所沉淀的HCCF之前，生成穿透曲線(breakthrough curve)以評估聚精氨酸對SPSFF樹脂加載容量的影響。對于聚精氨酸沉淀的HCCF和沉淀后蛋白A池這兩種加載，與對照(沒有聚精氨酸沉淀)類似，在60mg抗體每ml樹脂，SPSFF發(fā)生5％穿透。這指明了聚精氨酸對SPSFF的結(jié)合容量沒有負(fù)面影響(圖26和圖27)。
標(biāo)準(zhǔn)抗體工藝(表9工藝流程b)穿過蛋白A加工聚精氨酸沉淀的HCCF，接著是離子交換層析。聚精氨酸-蛋白A池具有與對照蛋白A類似的CHOP水平，盡管加載給料中的CHOP水平差異很大。蛋白A步驟將慶大霉素和胰島素降低至低水平。與沒有沉淀步驟的情況中的307ng/mg相比，SPSFF將CHOP降低490倍至3ng/mg。與對照工藝(蛋白A-SPSFF-QSFF)相比，聚精氨酸-蛋白A-SP工藝還將DNA、浸出的蛋白A、胰島素和慶大霉素降低至可接受的水平(表9)。由于聚精氨酸沉淀后的SPSFF池中的雜質(zhì)水平是可接受的，因此沒有必要在QSFF上加工它們。
非親和抗體純化工藝(表9工藝流程c)穿過SPSFF加工聚精氨酸沉淀的HCCF，接著是QSFF。與沒有沉淀的情況中的6731ng/mg相比，沉淀后的SPSFF池具有63ng/mg CHOP(減少76倍)。SPSFF完全清除胰島素并部分減少慶大霉素。聚精氨酸-SP工藝中的CHOP清除較好，而DNA、胰島素和慶大霉素清除與對照工藝(SPSFF-QSFF)相當(dāng)(圖28)。在聚精氨酸沉淀后，SPSFF池中的CHOP水平與QSFF池類似，提示QSFF步驟在此工藝中是多余的。
兩步沉淀/層析純化工藝 聚精氨酸沉淀HCCF之后是PVS沉淀抗體，然后在QSFF上加工(表9工藝流程d)。與沒有聚精氨酸沉淀的情況中的1517ng/mg相比，PVS池具有49ng/mg CHOP(減少99倍)。PVS沉淀步驟完全清除胰島素并部分減少慶大霉素。聚精氨酸-PVS工藝中的CHOP清除較好，而DNA和胰島素清除與對照工藝(SPSFF-QSFF)相當(dāng)。在沒有QSFF步驟的情況中，對照工藝中的慶大霉素清除少2倍。在聚精氨酸沉淀后，SPSFF池中的CHOP水平與QSFF池類似，提示QSFF步驟在此工藝中是多余的。
表9rhuMab 2H7下游加工結(jié)果匯總



*Q加載至30g/L；ND-未測定；NA-不適用 對抗體還原的抑制 將含有rhuMAb 2H7的HCCF用聚精氨酸處理并在不銹鋼迷你罐中放置48小時，而且以規(guī)則的時間點(diǎn)采集樣品并分析。在聚精氨酸沉淀HCCF的整個時間段里，抗體是完整的且沒有還原(reduced)，相反，對照中的抗體在10小時時開始還原(圖28)。通過使抗體還原劑與其它帶負(fù)電荷的雜質(zhì)一起沉淀，聚精氨酸抑制抗體還原劑。
對其它陽離子聚電解質(zhì)的評估 為了進(jìn)一步增強(qiáng)雜質(zhì)消除的沉淀?xiàng)l件優(yōu)化可包括使用其它聚電解質(zhì)以及其它條件的優(yōu)化，諸如攪動的速率和類型、及添加聚電解質(zhì)的速率。選擇另一種堿性聚氨基酸，即聚賴氨酸，來與聚精氨酸進(jìn)行初步比較。聚精氨酸具有胍陽離子官能團(tuán)，賦予其大約12.5的pKa。聚賴氨酸具有胺陽離子作為官能團(tuán)，賦予其大約10.5的pKa?？梢再彽枚喾N分子量形式的聚精氨酸和聚賴氨酸。
rhuMab C2B8蛋白A池溶解度曲線 帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)引起的CHOP沉淀與聚電解質(zhì)的分子量和離子強(qiáng)度有關(guān)(圖29和圖30)。較低分子量的聚賴氨酸(2.5kDa)在電導(dǎo)率范圍3-12mS/cm中不沉淀CHOP。然而，50kDa聚賴氨酸在3mS/cm和6mS/cm分別導(dǎo)致4倍和2倍的CHOP減少。在12mS/cm沒有觀察到顯著的CHOP沉淀。一般而言，隨著電導(dǎo)率降低，CHOP沉淀增加，而且提高聚電解質(zhì)的分子量表現(xiàn)出對CHOP沉淀有影響。在較低的電導(dǎo)率，一旦獲得最大CHOP沉淀，進(jìn)一步添加聚賴氨酸導(dǎo)致沉淀物重溶解。對于所測試的所有條件，產(chǎn)率都大于95％。
rhuMab C2B8HCCF池溶解度曲線 對rhuMab C2B8HCCF觀察到類似的趨勢(圖31和圖32)。在3mS/cm和6mS/cm的電導(dǎo)率，50kDa和225kDa二者聚賴氨酸都導(dǎo)致9倍的CHOP減少。然而，在12mS/cm沒有觀察到顯著的CHOP減少，甚至在225kDa聚賴氨酸的情況下都沒有觀察到顯著的CHOP減少。這指明了在高電導(dǎo)率的CHOP沉淀需要高度帶電荷的聚電解質(zhì)(像聚精氨酸)來克服離子干擾。對于所有測試的條件，產(chǎn)率都大于90％。
使用聚精氨酸為三種抗體(rhuMab 2H7、抗CD22和rhuMab C2B8)生成溶解度曲線(圖20-25和29-32)。CHOP沉淀是聚電解質(zhì)的pKa、分子量和濃度以及溶液的離子強(qiáng)度的函數(shù)。抗體特性(諸如電荷密度和等電點(diǎn))在雜質(zhì)與抗體的分離中也可發(fā)揮作用。通過操作聚電解質(zhì)濃度和離子強(qiáng)度來消除雜質(zhì)(諸如CHOP和DNA)。聚電解質(zhì)特性(諸如官能團(tuán)、分子量、電荷密度和疏水性)可變化。聚精氨酸可用作CCF中的絮凝劑或HCCF中的雜質(zhì)沉淀劑。沉淀是電導(dǎo)率依賴性的。獲得了10-25倍的CHOP消除，而且檢測不到DNA(表9)。聚精氨酸對SPSFF的結(jié)合容量沒有負(fù)面影響，而且與使用陰離子聚電解質(zhì)和陽離子交換樹脂的抗體沉淀相容。對HCCF添加聚精氨酸也具有令人驚訝的和出乎意料的額外好處，包括抑制抗體還原，可能是通過使還原劑與其它雜質(zhì)一起沉淀而實(shí)現(xiàn)的。
實(shí)施例 為了舉例說明本發(fā)明，提供以下實(shí)施例。然而，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例不限制本發(fā)明，而且僅僅旨在提示實(shí)施本發(fā)明的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，所描述的例示性的方法、方案、工藝、試劑、和裝置可容易地在適應(yīng)性改動后實(shí)施本發(fā)明的備選方法，認(rèn)為它們也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1蛋白A層析 蛋白A柱使用Prosep vA樹脂，而且用于純化HCCF中存在的rhuMab 2H7。柱直徑為2.5cm，而且床高度為14cm。以40CV/h(柱體積每小時)的流速操作柱。以多循環(huán)(2個循環(huán))運(yùn)行Prosep vA柱。平衡后，將HCCF應(yīng)用于柱，而且rhuMab 2H7被保留在柱上。然后用平衡緩沖液清洗柱，接著用清洗緩沖液，再然后再次用平衡緩沖液清洗柱。完成這些清洗后，將洗脫緩沖液應(yīng)用于柱。根據(jù)280nm處的吸光度(0.5OD)起始合并，并且在2個柱體積后終止。隨后將再生緩沖液應(yīng)用于柱。緩沖液組成和階段持續(xù)時間示于表10。
表10Prosep vA緩沖液組成和階段持續(xù)時間 可以使用可以與平衡緩沖液相同的加載緩沖液將衍生自重組宿主細(xì)胞的已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)加載到經(jīng)過平衡的固相上。隨著含污染物的制備物流過固相，蛋白質(zhì)被吸附至固定化的蛋白A，而其它污染物(諸如中國倉鼠卵巢蛋白質(zhì)(CHOP)，在CHO細(xì)胞中生成的蛋白質(zhì))可非特異性地結(jié)合至固相。通過在中間清洗步驟(intermediate wash step)中清洗固相，下一個相繼實(shí)施的步驟需要除去結(jié)合至固相、抗體和/或蛋白A的污染物。加載后，可以用平衡緩沖液平衡固相，之后開始中間清洗步驟。中間清洗緩沖液可包含鹽和其它化合物，所述其它化合物為(a)去污劑，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；(b)溶劑，例如己二醇；和(c)聚合物，例如PEG。所采用的鹽可以根據(jù)感興趣蛋白質(zhì)來選擇，但是優(yōu)選是乙酸鹽(例如乙酸鈉)。組合物中鹽和其它化合物的量就是組合后洗脫污染物但基本上不消除感興趣蛋白質(zhì)的量。此類清洗緩沖液中的鹽濃度的范圍可以是約0.1M至約2M，或者約0.2M至約0.6M。有用的去污劑濃度為約0.01％至約5％，或者約0.1％至1％，或者約0.5％，例如其中去污劑是聚山梨醇酯。例示性的溶劑濃度為約1％至40％，或者約5至約25％。若其它化合物是聚合物(例如PEG 400或PEG 8000)，則它們的濃度可以是例如約1％至約20％，優(yōu)選約5％至約15％。
在另一個實(shí)施方案中，中間清洗步驟涉及使用高度濃縮的緩沖溶液，例如濃度大于約0.8M的，例如高至約2M的，和優(yōu)選在約0.8M至約1.5M范圍內(nèi)的，最優(yōu)選約1M的緩沖液。在此實(shí)施方案中，緩沖液優(yōu)選是Tris緩沖液，諸如Tris乙酸鹽。中間清洗緩沖液的pH可以是約4至約8，或者約4.5至約5.5，或者約5.0。在另一個實(shí)施方案中，pH為約7.0。前一段的中間清洗步驟后，自柱回收感興趣蛋白質(zhì)。這通常使用合適的洗脫緩沖液來實(shí)現(xiàn)。例如可以使用具有低pH(例如在約2至約5的范圍內(nèi)的，而且優(yōu)選在約2.5至約3.5的范圍內(nèi)的)的洗脫緩沖液自柱洗脫蛋白質(zhì)。用于此目的的洗脫緩沖液的例子包括檸檬酸鹽或乙酸鹽緩沖液。在蛋白A操作的洗脫階段期間，任何非特異性結(jié)合的CHOP可以與感興趣蛋白質(zhì)共洗脫，損害產(chǎn)物池的純度。為了在洗脫階段之前除去CHOP，例如，可以使用氯化四甲銨(TMAC)進(jìn)行中間清洗步驟以除去CHOP(US 6870034；US 6127526；US 6333398)。
實(shí)施例2SPSFF層析 陽離子交換柱使用SPSFF(SP Sepharose Fast Flow)樹脂，而且以結(jié)合和洗脫模式及梯度洗脫操作。以150cm/h的流速操作SPSFF柱。在所有情況中，柱高度為30cm。在加工中間層析池(Prosep vA和QSFF池)時，使用0.66cm i.d.柱，而且加載柱至40g/L。在加工HCCF時，使用0.6-2.2cm直徑柱，而且加載柱至10-40g/L。在所有情況中，將加載條件化至pH 5.0和約5.5mS/cm的電導(dǎo)率。加載后，用平衡緩沖液清洗柱，接著用清洗緩沖液，然后再次用平衡緩沖液。完成這些清洗步驟后，在15個柱體積里在50mM乙酸鹽至350mM乙酸鹽的梯度中洗脫rhuMab 2H7。根據(jù)280nm處的吸光度(0.5OD)起始和終止合并。用0.5N氫氧化鈉再生和清潔柱，并在0.1N氫氧化鈉中保存。緩沖液組成和階段持續(xù)時間示于表11。
表11SPSFF緩沖液組成和階段持續(xù)時間 實(shí)施例3陰離子交換層析 陰離子交換柱使用QSFF(Q Sepharose Fast Flow)樹脂，而且以流通(flowthrough)模式操作。以150cm/h的流速操作QSFF柱。柱直徑為0.66cm，而且床高度為20cm。在pH 8.0平衡和加載柱。rhuMab 2H7抗體流過柱，然后用平衡緩沖液清洗柱。根據(jù)280nm處的吸光度(0.5OD)起始和終止合并。用0.5N氫氧化鈉再生和清潔柱，并在0.1N氫氧化鈉中保存。緩沖液組成和階段持續(xù)時間示于表12。
表12QSFF緩沖液組成和階段持續(xù)時間 實(shí)施例4a陰離子聚電解質(zhì)純化 將抗體池調(diào)節(jié)至表13中概述的pH和電導(dǎo)率。將HCCF用1M乙酸調(diào)節(jié)至pH 6，并用WFI(沖洗用水)調(diào)節(jié)至電導(dǎo)率2.0mS/cm。在20分鐘時間段里將PVS管線內(nèi)添加至條件化HCCF以達(dá)到終濃度0.05％w/v。混合時，將PVS添加至條件化池至表13中概述的終濃度。使用Sorval R3-CB離心機(jī)將PVS沉淀池以4000rpm(4657g)在10℃離心30分鐘。除去上清液，并用25mM MOPS，pH 7.1清洗團(tuán)粒。將團(tuán)粒重懸于50mM Tris，50mM乙酸鹽，pH 8.0(約6.5mS/cm)隨后經(jīng)過QSFF層析加工重懸浮的團(tuán)粒。
實(shí)施例4b陽離子聚電解質(zhì)純化 細(xì)胞培養(yǎng)液(CCF)沉淀用分子量110kDa的聚精氨酸實(shí)施雜質(zhì)沉淀。在以100rpm混合的同時，在5分鐘時間段里在生物反應(yīng)器中將聚精氨酸添加至CCF以達(dá)到終濃度0.075％w/v。然后將絮凝的CCF以10000g離心，并通過0.2μm濾器無菌過濾。
已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)沉淀在以100rpm混合的同時，在5分鐘時間段里在生物反應(yīng)物中將聚精氨酸(聚-L-精氨酸)添加至HCCF以達(dá)到終濃度0.1％w/v。然后將沉淀的HCCF以5000g離心，并通過0.2μm濾器無菌過濾。通過不同純化工藝加工過濾后的給料(feed stock)。
表132H7的PVS沉淀?xiàng)l件 實(shí)施例5蛋白質(zhì)濃度測定 使用具有10mm路徑長度的流動室的8453分光光度計(jì)(Agilent)通過280nm處的吸光度(減去320nm處的吸光度來校正光散射)來測定池中的抗體濃度。采用1.75ml/(mg cm)的消光系數(shù)。使用如下方程計(jì)算抗體濃度
實(shí)施例6大小排阻層析 使用大小排阻層析來監(jiān)測天然條件下rhuMAb 2H7的大小異質(zhì)性。該測定法采用TSK-GEL G3000SWXL柱(7.8mm×300mm，Tosohaas)來分離聚集體、單體、和片段。使用0.20M磷酸鉀，0.25M氯化鉀pH 6.2運(yùn)行緩沖液以0.3mL/min的流速操作柱。于環(huán)境溫度操作柱。在運(yùn)行緩沖液中稀釋樣品，并且每種樣品注射20μg。使用280nm處的吸光度來監(jiān)測聚集體、單體和片段的水平。
實(shí)施例7CHOP ELISA-Y42 通過使用山羊抗CHOP抗體的酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)來測定所有池中的CHOP濃度。為了ELISA，將親和純化的山羊抗CHOP抗體固定化在微量滴定板的孔上。在所述孔中溫育池樣品的稀釋液，接著與偶聯(lián)有過氧化物酶的山羊抗CHOP抗體一起溫育。用產(chǎn)生比色信號的鄰苯二胺定量辣根過氧化物酶的酶活性。將樣品在測定稀釋劑中系列稀釋，使得吸光度讀數(shù)落在測定法的范圍內(nèi)(5-320ng/ml)。
實(shí)施例8蛋白A ELISA-Y80 通過夾心式蛋白A ELISA測定蛋白A水平。將雞抗葡萄球菌蛋白A抗體固定化在微量滴定板的孔上。將樣品稀釋至0.2mg/ml抗體并應(yīng)用至孔。如果存在于樣品中的話，蛋白A結(jié)合包被抗體。用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗蛋白A抗體檢測所結(jié)合的蛋白A。用產(chǎn)生比色信號的鄰苯二胺定量辣根過氧化物酶的酶活性。
實(shí)施例9胰島素ELISA-Y64 通過使用豚鼠抗胰島素多克隆抗體的ELISA來測定所有池中的胰島素濃度。為了ELISA，將親和純化的抗胰島素抗體固定化在微量滴定板的孔上。在孔中溫育池樣品的稀釋液，接著與偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的豚鼠抗胰島素抗體一起溫育。用四甲基聯(lián)苯胺定量辣根過氧化物酶的酶活性。將樣品在測定稀釋劑中系列稀釋，使得吸光度讀數(shù)落在測定法的范圍內(nèi)(0.094-3.000ng/mL)。
實(shí)施例10慶大霉素ELISA-Y81 使用競爭性ELISA來測定所有池中的慶大霉素濃度。將針對慶大霉素-BSA的山羊多克隆抗體固定化在微量滴定板的孔上。慶大霉素與生物素化慶大霉素競爭對抗體的結(jié)合。添加辣根過氧化物酶-鏈霉素和鄰苯二胺底物來檢測所結(jié)合的生物素標(biāo)記的慶大霉素的量。將樣品在測定稀釋劑中系列稀釋，使得吸光度讀數(shù)落在測定法的范圍內(nèi)(0.37-90ng/ml)。
實(shí)施例11CHO DNA PCR測定法-Y77 通過CHO DNA的PCR擴(kuò)增來定量DNA。首先使用Qiagen的病毒RNA迷你試劑盒(Qiagen’s Viral RNA Mini kit)自樣品和對照提取DNA。然后將提取物和標(biāo)準(zhǔn)曲線與含有引物和探針的PCR Master混合物一起以96孔板格式加載到商業(yè)性序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)上，在那里通過實(shí)時PCR定量CHO DNA。

PCR采用設(shè)計(jì)成對靶CHO DNA序列特異性的引物和探針。使用5’端標(biāo)記有報(bào)道染料但受到3’端的淬滅染料遏制的熒光探針測量產(chǎn)物擴(kuò)增。Taq聚合酶開始靶DNA的擴(kuò)增，并且在達(dá)到探針時，它的5’核酸酶活性置換探針，釋放報(bào)道染料。隨著報(bào)道染料不再接近淬滅染料，報(bào)道物發(fā)熒光，并且測量發(fā)射強(qiáng)度的增加。為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算越過閾值(Ct)擴(kuò)增DNA的循環(huán)數(shù)，針對該標(biāo)準(zhǔn)曲線定量未知樣品濃度。
實(shí)施例12rhuMAb 2H7效力 使用補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)測定法測定rhuMAb 2H7效力。此測定法基于測量rhuMAb 2H7在存在人補(bǔ)體的情況中溶解WIL2-S細(xì)胞的能力。
實(shí)施例13PVS的RNA酶A抑制測定法 PVS是RNA酶的強(qiáng)效抑制劑。該測定法使用一端有熒光標(biāo)記物、另一端淬滅劑的RNA類似物。一旦RNA類似物受到RNA酶A的切割，熒光標(biāo)記物自淬滅劑釋放，產(chǎn)生發(fā)射。PVS的存在會抑制RNA酶A活性，限制熒光發(fā)射。然后能通過比較對測試樣品觀察到的熒光與標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定PVS的量。
認(rèn)為上述描述僅僅是本發(fā)明原理的例示。此外，由于眾多修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，因此不希望將本發(fā)明限制于如上文所描述的所述精確構(gòu)建和工藝。因而，可認(rèn)為所有合適的修改和等同情況落在所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明范圍內(nèi)。
詞語“包含”、“含有”、“包括”和“具有”在用于本說明書和所附權(quán)利要求書時旨在說明所述特征、整數(shù)、成分、或步驟的存在，但是它們不排除一種或多種其它特征、整數(shù)、成分、步驟、或其組合的存在或增加。
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)
1.一種純化抗體的方法，包括
(a)調(diào)節(jié)含有抗體的混合物的酸度或鹽濃度，其中該抗體來自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液且該已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液來自哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物；
(b)添加帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)，由此形成蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀，其中所述帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)選自聚乙烯基磺酸、聚乙烯基磺酸鹽、聚苯乙烯磺酸、和聚丙烯酸且其中所述帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)具有1.2到1,100kDa的分子量；
(c)將蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀與選自下組的雜質(zhì)分開蛋白質(zhì)聚集體、蛋白質(zhì)片段、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、胰島素、慶大霉素、DNA、和浸出的蛋白A；
(d)分離蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀；并
(e)在水溶液中重懸浮蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體選自單克隆抗體、抗體片段、和融合蛋白。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體選自抗CD20抗體、抗DR5抗體、和抗CMET抗體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗CD20抗體是2H7。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物是中國倉鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)通過該蛋白質(zhì)在蛋白A吸附劑上的固定化而來自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)通過陽離子交換層析而來自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)是自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液直接捕獲的。
9.權(quán)利要求1的方法，其中添加超過一種的帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)至混合物。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)在含有蛋白質(zhì)的混合物中的濃度介于0.01％到1.0％重量/體積之間。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀是以分批模式或連續(xù)模式形成的。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀是通過離心而分離的。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀是通過過濾而分離的。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀是通過深部過濾而分離的。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)是通過使重溶解緩沖液流過濾器一次而重溶解的。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)是通過使重溶解緩沖液經(jīng)過濾器重循環(huán)而重懸浮的。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚電解質(zhì)是通過陰離子交換純化而與重懸浮的蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀分開的。
18.一種純化抗體的方法，包括
(a)調(diào)節(jié)含有抗體的混合物的酸度或鹽濃度，其中該抗體來自細(xì)胞培養(yǎng)液且該細(xì)胞培養(yǎng)液來自哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物；
(b)添加選自具有42到110kDa的分子量的聚精氨酸和具有2.5到225kDa的分子量的聚賴氨酸的帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)至混合物，由此形成包含帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)和選自下組的雜質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)聚集體、蛋白質(zhì)片段、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、胰島素、慶大霉素和DNA；并
(c)將沉淀與包含抗體的混合物分開。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物是中國倉鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)物。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗體選自單克隆抗體、抗體片段、和融合蛋白。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述抗體是抗CD20抗體或抗CD22抗體。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述抗CD20抗體是2H7。
23.權(quán)利要求18的方法，其中添加超過一種的帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)至混合物。
24.權(quán)利要求18的方法，其中所述帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)在含有蛋白質(zhì)的混合物中的濃度介于0.01％到1％重量/體積之間。
25.權(quán)利要求18的方法，其中所述沉淀是以分批模式或連續(xù)模式形成的。
26.權(quán)利要求18的方法，其中所述沉淀是通過離心而與混合物分開的。
27.權(quán)利要求18的方法，其中所述沉淀是通過過濾而與混合物分開的。
權(quán)利要求
1.一種純化抗體的方法，包括
(a)調(diào)節(jié)含有抗體的混合物的酸度或鹽濃度，其中該抗體來自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液；
(b)添加帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)，由此形成蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀；
(c)將蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀與選自下組的雜質(zhì)分開蛋白質(zhì)聚集體、蛋白質(zhì)片段、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、胰島素、慶大霉素、DNA、和浸出的蛋白A；
(d)分離蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀；并
(e)在水溶液中重懸浮蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體選自單克隆抗體、抗體片段、和融合蛋白。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體選自抗CD20抗體、抗DR5抗體、和抗CMET抗體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗CD20抗體是2H7。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液來自哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物是中國倉鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)物。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液來自微生物發(fā)酵。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述微生物發(fā)酵是大腸桿菌發(fā)酵。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)通過該蛋白質(zhì)在蛋白A吸附劑上的固定化而來自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)通過陽離子交換層析而來自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)是自已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液直接捕獲的。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)具有磺酸或羧酸官能度。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)選自聚乙烯基磺酸、聚乙烯基磺酸鹽、聚苯乙烯磺酸、和聚丙烯酸。
14.權(quán)利要求1的方法，其中添加超過一種的帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)至混合物。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)具有1200到1,100,000Da的分子量。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)在含有蛋白質(zhì)的混合物中的濃度介于0.01％到1.0％重量/體積之間。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀是以分批模式或連續(xù)模式形成的。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀是通過離心而分離的。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀是通過過濾而分離的。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀是通過深部過濾而分離的。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)是通過使重溶解緩沖液流過濾器一次而重溶解的。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)是通過使重溶解緩沖液經(jīng)過濾器重循環(huán)而重懸浮的。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚電解質(zhì)是通過陰離子交換層析而與重懸浮的蛋白質(zhì)-聚電解質(zhì)沉淀分開的。
24.一種純化抗體的方法，包括
(a)調(diào)節(jié)含有抗體的混合物的酸度或鹽濃度，其中該抗體來自細(xì)胞培養(yǎng)液；
(b)添加帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)至混合物，由此形成包含帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)和選自下組的雜質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)聚集體、蛋白質(zhì)片段、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、胰島素、慶大霉素和DNA；并
(c)將沉淀與包含抗體的混合物分開。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)液來自哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物是中國倉鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)物。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)液來自微生物發(fā)酵。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述抗體選自單克隆抗體、抗體片段、和融合蛋白。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗體是抗CD20抗體或抗CD22抗體。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述抗CD20抗體是2H7。
31.權(quán)利要求24的方法，其中所述帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)具有氨基或胍基官能度。
32.權(quán)利要求24的方法，其中所述帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)選自聚精氨酸和聚賴氨酸。
33.權(quán)利要求24的方法，其中添加超過一種的帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)至混合物。
34.權(quán)利要求24的方法，其中所述帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)具有2500到225000Da的分子量。
35.權(quán)利要求24的方法，其中所述帶正電荷的聚陽離子聚電解質(zhì)在含有蛋白質(zhì)的混合物中的濃度介于0.01％到1％重量/體積之間。
36.權(quán)利要求24的方法，其中所述沉淀是以分批模式或連續(xù)模式形成的。
37.權(quán)利要求26的方法，其中所述沉淀是通過離心而與混合物分開的。
38.權(quán)利要求26的方法，其中所述沉淀是通過過濾而與混合物分開的。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于分離和純化抗體的方法，其通過添加聚電解質(zhì)至細(xì)胞培養(yǎng)液，諸如已收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液，并沉淀抗體-聚電解質(zhì)復(fù)合物或雜質(zhì)與聚電解質(zhì)的復(fù)合物。
文檔編號A61K31/198GK101646431SQ200880009317
公開日2010年2月10日 申請日期2008年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月22日
發(fā)明者羅伯特·L·法爾納, 杰米·富蘭克林, 保羅·J·麥克唐納, 坦馬亞·佩拉姆, 維克拉姆·西索迪亞, 科拉宗·維克塔 申請人:健泰科生物技術(shù)公司