專利名稱：：心血管組織培養(yǎng)用基材的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過播種、移植細(xì)胞，能夠以極高的效率再生血管的心血管組織培養(yǎng)用基材，以及采用該基材的移植用心血管組織的制造方法、心血管組織再生方法、移植用心血管組織。
背景技術(shù)：
：目前，臨床上作為人造血管最常使用的是Goretex等的非吸收性高分子的人造血管。這種人造血管，可以發(fā)揮極近似血管的物性，在短期的血管再建術(shù)中具有一定的成果。但是，采用非吸收性高分子的人造血管，移植后長期作為異物殘留在體內(nèi)，故存在必需連續(xù)給予抗凝固劑等的問題。另外，當(dāng)在小兒體內(nèi)使用時，必需伴隨著成長而產(chǎn)生重新進(jìn)行手術(shù)的問題。與此相對，近年來尚試了采用所謂再生醫(yī)療的組織再生方法。所謂再生醫(yī)療，意指在作為基底的細(xì)胞培養(yǎng)基材上播種構(gòu)成組織的細(xì)胞，通過將其移植，達(dá)到自身組織的再生。關(guān)于再生醫(yī)療，例如，已有以皮膚(非專利文獻(xiàn)1)及軟骨(非專利文獻(xiàn)2)為代表的各種組織進(jìn)行的各種研究例子的報告。把這種再生醫(yī)療應(yīng)用于血管再生術(shù)的本申請發(fā)明人等，在由生物體吸收性高分子構(gòu)成的發(fā)泡體中，形成引入作為芯材的生物體吸收性高分子構(gòu)成的增強(qiáng)材料的心血管組織培養(yǎng)用基材已被開發(fā)(專利文獻(xiàn)1)。在該心血管組織培養(yǎng)用基材中，形成發(fā)泡體與播種了的細(xì)胞牢固地粘接的基底，并且，在增強(qiáng)材料移植后至血管再生期間，具有耐血流、保持強(qiáng)度的作用，或起到耐縫合的增強(qiáng)材料的作用。通過發(fā)泡體與增強(qiáng)材料同時由生物體吸收性高分子構(gòu)成，血管再生后，由于材料被吸收，故不必繼續(xù)使用抗凝固劑等。另外，由于被再生的血管是自4身組織，故也可期待其成長。實際上，該心血管組織培養(yǎng)用基材，已確認(rèn)臨床上極有意義。但是，為了實際進(jìn)行臨床應(yīng)用，當(dāng)然必需更進(jìn)一步提高血管再生效率。專利文獻(xiàn)l:特開2001-78750號公報非專利文獻(xiàn)1:ML.，Cooper，L.F.Hansbrough,R.L.Spielvogelet.al,Biomaterials,12:243-248,1991非專利文獻(xiàn)2:C.A.Vacanti，R.langer，et.al，Plast.Reconstr.Surg，88:753-759，199
發(fā)明內(nèi)容移植向心血管組織培養(yǎng)用基材播種了細(xì)胞的材料時，血管是否再生，在于充分量結(jié)合播種了的細(xì)胞，和血管再生前不產(chǎn)生狹窄。通常，由于細(xì)胞以在培養(yǎng)液等中懸浮的懸浮液狀態(tài)進(jìn)行播種，故為了高效率播種，要求細(xì)胞培養(yǎng)用基材柔軟、具有高吸水性。另一方面，為了不產(chǎn)生狹窄，要求具有管狀體難以壓壞的機(jī)械強(qiáng)度，即，要求在壓縮管狀體時發(fā)揮高的壓縮彈性系數(shù)，保持口徑不變。因此，柔軟且吸水性高與壓縮彈性系數(shù)高存在相對立的關(guān)系，兩者難以兩全其美。本發(fā)明的目的是提供細(xì)胞的播種效率與難以壓壞的兩全其美，通過移植播種細(xì)胞，能夠以極高的效率再生血管的心血管組織培養(yǎng)用基材，以及采用該基材的移植用心血管組織的制造方法、心血管組織再生法、移植用心血管組織。本發(fā)明1涉及心血管組織培養(yǎng)用基材，所述基材是把包含生物體吸收性材料的發(fā)泡體，采用包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)材料加以增強(qiáng)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，上述發(fā)泡體含有丙交酯(D、L、DL體)的含量為50~54摩爾％、e-己內(nèi)酯的含量為50~46摩爾％的交內(nèi)酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物，上述增強(qiáng)材料由上述發(fā)泡體被覆。本發(fā)明2涉及心血管組織培養(yǎng)用基材，所述基材是把包含生物體吸收性材料的發(fā)泡體，采用包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)材料加以增強(qiáng)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，上述發(fā)泡體的厚度為0.2~3.Omm，上述增強(qiáng)材料位于中心或外面，內(nèi)面為上述發(fā)泡體。本發(fā)明3涉及心血管組織培養(yǎng)用基材，所述基材是把包含生物體吸收性材料的發(fā)泡體，采用包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)材料加以增強(qiáng)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，上述增強(qiáng)材料包含采用生物體吸收性材料涂布的生物體吸收性纖維，上述增強(qiáng)材料位于中心或外面，內(nèi)面為上述發(fā)泡體。本發(fā)明4涉及心血管組織培養(yǎng)用基材，所述基材是把包含生物體吸收性材料的發(fā)泡體，釆用包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)材料加以增強(qiáng)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，上述增強(qiáng)材料包含由生物體吸收性的復(fù)紗加捻而成的捻紗，上述增強(qiáng)材料位于中心或外面，內(nèi)面為上述發(fā)泡體。本發(fā)明5涉及心血管組織培養(yǎng)用基材，所述基材是把包含生物體吸收性材料的發(fā)泡體，采用包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)材料以及包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)紗加以增強(qiáng)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，上述增強(qiáng)紗以及增強(qiáng)材料位于中心或外面，內(nèi)面為上述發(fā)泡體。下面詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明人等進(jìn)行悉心研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用下列方法在把包含生物體吸收性材料的發(fā)泡體，采用包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)材料加以增強(qiáng)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材中，作為發(fā)泡體材料采用特定組成比的丙交酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物的方法(本發(fā)明1);使發(fā)泡體的厚度處于特定范圍的方法(本發(fā)明2);作為增強(qiáng)材料的材料，采用由生物體吸收性材料涂布的生物體吸收性纖維的方法(本發(fā)明3);作為增強(qiáng)材料采用由捻紗構(gòu)成的方法(本發(fā)明4);以及，由包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)紗增強(qiáng)的方法(本發(fā)明5)，可以得到細(xì)胞的播種效率與難以壓壞的兩全其美，通過細(xì)胞的播種、移植，以極高的效率再生血管的心血管組織培養(yǎng)用基材，完成本發(fā)明。還有，在本說明書中，為方便起見，用本發(fā)明1~5表示，這些既可單獨實施，也可并用。本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材是，包含生物體吸收性材料的發(fā)泡體，用包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)材料增強(qiáng)的基材。通過這種構(gòu)成，成為上述發(fā)泡體與播種的細(xì)胞牢固粘接的基底，并且，上述增強(qiáng)材料在移植后至血管再生的期間，具有耐血流而保持強(qiáng)度的作用。另外，通過發(fā)泡體與增強(qiáng)材料一起由生物體吸收性高分子構(gòu)成，由于在血管再生后材料被吸收，故不需繼續(xù)使用抗凝固劑等。另外，由于再生的血管是自身組織，故也可期待成長。還有，本說明書中所謂心血管組織，可以舉出血管、心瓣、生膜等。上述發(fā)泡體的孔徑，必需達(dá)到播種的細(xì)胞可適當(dāng)粘接、增殖，同時作為心血管組織，在移植時幾乎不泄漏血液的程度，具體的優(yōu)選的下限5ium，優(yōu)選的上限100pm。當(dāng)?shù)陀?jam時，播種的細(xì)胞不能浸入發(fā)泡體的孔內(nèi)，有時得不到充分的播種效率；當(dāng)大于100jam時，在移植時往往引起血液泄漏。更優(yōu)選的下限lOjam，更優(yōu)選的上限50jLim。還有，上述細(xì)微小孔的平均孔徑，例如，可以采用水銀壓入法及圖像解析法等現(xiàn)有公知的方法進(jìn)行測定。上述發(fā)泡體，也可實施親水化處理。通過實施親水化處理，在與細(xì)胞懸濁液接觸時，可以迅速吸收它，可以更有效地均勻地播種細(xì)胞。作為上述親水化處理，未作特別限定，例如，可以舉出等離子體處理、輝光放電處理、電暈放電處理、臭氧處理、表面接枝處理或紫外線照射處理等。其中，從人造血管用基材的外觀不發(fā)生變化、吸水率飛快提高的觀點考慮，等離子體處理是優(yōu)選的。作為上述增強(qiáng)材料，只要比上述發(fā)泡體的強(qiáng)度高的即可而未作特別限定，例如，可以舉出纖維狀體、無紡布狀體或膜狀體等。其中，由生物體吸收性材料構(gòu)成的纖維，針織成橫向針織物、縱向針織物、編織繩、針織物等纖維狀體是優(yōu)選的。在本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材中，上述發(fā)泡體與增強(qiáng)材料形成一整體是優(yōu)選的。關(guān)于上述發(fā)泡體與增強(qiáng)材料的位置關(guān)系，上述增強(qiáng)材料位于本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材的管狀體的中心或外面，并且管狀體的內(nèi)面為上述發(fā)泡體。通過這種結(jié)構(gòu)，可以充分發(fā)揮上述增強(qiáng)材料保持強(qiáng)度的作用，另外，可從血管內(nèi)側(cè)進(jìn)行再生，能夠進(jìn)行早期的血管再生。本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材的管狀體的內(nèi)徑及長度，最好選擇與目的血管相符合。本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材的厚度，優(yōu)選的下限為50|im，優(yōu)選的上限為5mm。當(dāng)?shù)陀?0jam時，有時得不到耐血流的充分強(qiáng)度，縫合困難，當(dāng)大于5mm時，吸收的所需時間明顯增大，有時成為狹窄的原因。作為構(gòu)成上述發(fā)泡體、增強(qiáng)材料及增強(qiáng)紗的生物體吸收性材料，例如，可以舉出聚乙醇酸、聚丙交酯(D、L、DL體)、聚己內(nèi)酯、乙醇酸-丙交酯(D、L、DL體)共聚物、乙醇酸-s一己內(nèi)酯共聚物、丙交酯(D、L、DL體)-e-己內(nèi)酯共聚物、聚(對-二噁酮)等。這些既可單獨使用，也可2種以上并用?？蓮倪@些當(dāng)中按各發(fā)明進(jìn)行選擇。在本發(fā)明1的心血管組織培養(yǎng)用基材中，上述發(fā)泡體包含丙交酯(D、L、DL體)含量為50~54摩爾％、s-己內(nèi)酯含量為50~46摩爾％的丙交酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物。通過采用這種組成比的丙交酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物，可以確保充分量的細(xì)胞播種數(shù)的柔軟性、吸水性，以及不產(chǎn)生狹窄的管狀體壓縮時的高壓縮彈性系數(shù)的兩完其美。當(dāng)丙交酯(D、L、DL體)的含量低于50摩爾％(s-己內(nèi)酯含量大于50摩爾％時)，管狀體壓縮時的壓縮彈性系數(shù)低，有時易引起狹窄，當(dāng)丙交酯(D、L、DL體)的含量大于54摩爾％(s-己內(nèi)酯含量小于46摩爾％)時，柔軟性欠缺，吸水率降低，不能播種充分量的細(xì)胞。還有，在本說明書中，上述丙交酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物的組成比，僅采用1種共聚物的該共聚物中的各成分組成比滿足上述范圍也可以，而組成比不同的多種共聚物并用時作為該多種共聚物全體的各成分組成比滿足上述范圍也可以。在本發(fā)明1的心血管組織培養(yǎng)用基材中，上述增強(qiáng)材料包含選自聚乙醇酸、聚丙交酯(D、L、DL體)、聚己內(nèi)酯、乙醇酸-丙交酯(D、L、DL體)共聚物、乙醇酸-e-己內(nèi)酯共聚物、丙交酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物及聚(對-二噁酮)的至少l種。在本發(fā)明2的心血管組織培養(yǎng)用基材中，上述發(fā)泡體的厚度下限為0.2mm、上限為3.Omm。通過采用這種厚度的發(fā)泡體，可以確〗呆充分量的細(xì)胞播種數(shù)的柔軟性、吸水性，以及不產(chǎn)生狹窄的管狀體壓縮時的高壓縮彈性系數(shù)的兩全其美。當(dāng)小于0.2mm時，管狀體壓縮時的壓縮彈性系數(shù)低，有時易引起狹窄，當(dāng)大于3.Omra時，柔軟性欠缺，吸水率降低，不能播種充分量的細(xì)胞。在本發(fā)明2的心血管組織培養(yǎng)用基材中，作為調(diào)整上述發(fā)泡體厚度的方法，未作特別限定，例如，可以舉出采用下述制造方法制造本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材時，調(diào)整形成上述發(fā)泡體的生物體吸收性材料溶液的濃度及量的方法等。在本發(fā)明2的心血管組織培養(yǎng)用基材中，上述發(fā)泡體及增強(qiáng)材料，包含選自聚乙醇酸、聚丙交酯(D、L、DL體)、聚己內(nèi)酯、乙醇酸-丙交酯(D、L、DL體)共聚物、乙醇酸-s-己內(nèi)酯共聚物、丙交酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物、聚(對-二噁酮)的至少l種。在本發(fā)明3的心血管組織培養(yǎng)用基材中，上述增強(qiáng)材料由生物體吸收性材料涂布的生物體吸收性纖維所構(gòu)成。通過采用由生物體吸收性材料涂布的生物體吸收性纖維，可以確保充分量的細(xì)胞播種數(shù)的柔軟性、吸水性，以及不產(chǎn)生狹窄的管狀體壓縮時的高壓縮彈性系數(shù)的兩完其美。作為由生物體吸收性材料涂布的生物體吸收性纖維，未作特別限定，例如，用丙交酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物涂布的聚乙醇酸纖維是優(yōu)選的。作為上述涂布方法，未作特別限定，例如，可以舉出把聚乙醇酸纖維浸漬在丙交酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物溶液中，上拉后干燥形成增強(qiáng)材料的方法；采用聚乙醇酸纖維形成增強(qiáng)材料后，浸漬在丙交酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物溶液中，上拉后加以干燥的方法等。在本發(fā)明3的心血管組織培養(yǎng)用基材中，上述發(fā)泡體，包含選自聚乙醇酸、聚丙交酯(D、L、DL體)、聚己內(nèi)酯、乙醇酸-丙交酯(D、L、DL體)共聚物、乙醇酸-s-己內(nèi)酯共聚物、丙交酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物、聚(對-二噁酮)的至少1種。在本發(fā)明4的心血管組織培養(yǎng)用基材中，上迷增強(qiáng)材料，由生物體吸收性材料構(gòu)成的復(fù)紗加捻而成的捻紗構(gòu)成。通過采用這種掄紗，可以確保充分量的細(xì)胞播種數(shù)的柔軟性、吸水性，以及不產(chǎn)生狹窄的管狀體壓縮時的高壓縮彈性系數(shù)達(dá)到兩完其美。作為上述掄紗的加掄，優(yōu)選S加搶350T/m以上、Z加掄220T/m以上。當(dāng)處于該范圍以外時，有時得不到充分的效果。在本發(fā)明4的心血管組織培養(yǎng)用基材中，上述發(fā)泡體及增強(qiáng)材料，包含選自聚乙醇酸、聚丙交酯(D、L、DL體)、聚己內(nèi)酯、乙醇酸-丙交酯(D、L、DL體)共聚物、乙醇酸-e-己內(nèi)酯共聚物、丙交酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物、及聚(對-二噁酮)的至少1種。在本發(fā)明5的心血管組織培養(yǎng)用基材中，由上迷發(fā)泡體及增強(qiáng)材料構(gòu)成的復(fù)合體，通過由包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)紗進(jìn)一步增強(qiáng)。通過增強(qiáng)紗的增強(qiáng)，使細(xì)胞的播種效率與難以壓壞達(dá)到兩全其美，通過播種、移植細(xì)胞，能夠以極高效率再生血管。上述增強(qiáng)紗，既可位于發(fā)泡體的中心，也可位于最外面。上述增強(qiáng)紗，以螺旋狀、環(huán)狀或X字狀巻繞在上述發(fā)泡體及增強(qiáng)材料構(gòu)成的復(fù)合體上是優(yōu)選的。通過采用這種形態(tài)配置增強(qiáng)紗，所得到的心血管組織培養(yǎng)用基材變成更加難以壓壞。在本發(fā)明5的心血管組織培養(yǎng)用基材中，上述增強(qiáng)紗，含有選自聚L-丙交酯、丙交酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物、及聚乙醇酸-s-己內(nèi)酯共聚物的至少1種是優(yōu)選的。對本發(fā)明5的心血管組織培養(yǎng)用基材中使用的增強(qiáng)紗的粗細(xì)，未作特別限定，但斷面直徑優(yōu)選的下限為0.lmm、優(yōu)選的上限為lmm。當(dāng)?shù)陀贠.lmm時，有時得不到充分的增強(qiáng)效果，在移植時，對來自周圍的壓迫，不能保持口徑，有形成狹窄閉塞之慮。當(dāng)大于lmm時，有時發(fā)生固化。關(guān)于增強(qiáng)紗的粗細(xì)，也可用l-0(斷面直徑0.4~0.5mm)、2-0(斷面直徑0.35~0.4mm)、3-0(斷面直徑0.25~0.3mm)等USP縫合紗標(biāo)準(zhǔn)加以表示。本發(fā)明5的心血管組織培養(yǎng)用基材中使用的增強(qiáng)紗，單長紗是優(yōu)選的。通過釆用單長紗，可以發(fā)揮更高的增強(qiáng)效果。作為制造本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材的方法，未作特別限定，例如，可以舉出把預(yù)先配制的上述增強(qiáng)材料設(shè)置在模型板中，向進(jìn)行冷凍干燥的方法(冷凍干燥法)；在預(yù)先配制的上述增強(qiáng)材料上使水溶性物質(zhì)與形成上述發(fā)泡體的生物體吸收性材料的混合溶液附著、千燥后，把該水溶性物質(zhì)通過水洗加以洗去的方法(洗脫法)等。在冷凍干燥法中，通過冷凍溫度及聚合物的濃度，可以制造具有各種孔徑的發(fā)泡體。在洗脫法中，通過調(diào)整水溶性物質(zhì)粒子，可以控制發(fā)泡體的孔徑。其次，對在本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材上播種細(xì)胞的方法加以說明。作為播種的細(xì)胞，采用心血管組織中大致相同的細(xì)胞種。即，內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞，通常，播種這些中的2種或3種的混合培養(yǎng)細(xì)胞或骨髓中的單核球成分，進(jìn)行組織構(gòu)筑。還有，本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材，也可不^"種細(xì)胞進(jìn)行移植。使用的細(xì)胞培養(yǎng)條件、播種方法如下所示。下述A~C示出使用混合培養(yǎng)細(xì)胞時的心瓣、心膜、血管制造時的細(xì)胞采取、培養(yǎng)、播種方法，D示出使用骨髓中的單核球成分時的方法。A.細(xì)胞分離、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞數(shù)增大把完全清潔下采取的血管組織，浸漬在細(xì)胞培養(yǎng)液中，在凈化臺內(nèi)采用磷酸化生理鹽水洗凈。然后，在陪替氏盤上采用外科手術(shù)刀，按照單純的人工培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行組織裁斷。把約l~2mm2大小的細(xì)組織片，均等地分配在碟子上，約20分鐘后，組織牢固地粘接在碟子的下面后，添加培養(yǎng)液。培養(yǎng)液，例如，在杜爾貝科改性的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中添加了10%牛胎兒血清與1%的抗生素溶液(L-谷氨酰胺29.2mg/mL、青霉素G1000u/mL、鏈霉素硫酸鹽10000jug/mL)后使用。血管壁細(xì)胞，通常5~7天后，細(xì)胞從組織開始移動至碟子上，再于1周后，混合細(xì)胞群體于組織片的周圍形成。其在2~3周后，混合細(xì)胞在碟子上形成聚集狀態(tài)。形成該狀態(tài)后馬上用0.25%胰蛋白酶回收細(xì)胞，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)，例如，在75cm2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，當(dāng)該型箱達(dá)到大致聚集時，可以得到約2百萬個細(xì)胞。在5%C02、21%02的環(huán)境下繼續(xù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)，通過繼續(xù)進(jìn)行達(dá)到10xl()e個左右的細(xì)胞數(shù)為止。培養(yǎng)液每45天更換一次，但通過預(yù)備實驗的結(jié)果表明細(xì)胞的倍化時間為約48小時。還有，過程中的細(xì)胞數(shù)計算，按照采用臺盼藍(lán)的古典的染色法來進(jìn)行。B.細(xì)胞隔離、內(nèi)皮細(xì)胞純化混合細(xì)胞達(dá)到聚集后，在可以得到某種程度的細(xì)胞數(shù)的階段，按照以下順序，采用FACS,從混合細(xì)胞選擇分離內(nèi)皮細(xì)胞。即，例如，把乂《4才爿f4力/"^夕乂口'乂-S土制造的Dil-acetylatedLDL(熒光色素標(biāo)記劑)(下面稱作Dil-Ac-LDL)，以1jjg/mL的濃度添加至混合細(xì)胞培養(yǎng)液中，進(jìn)行24小時溫育。該標(biāo)記劑，通過內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞特有的只軒弋《》、〉'弋-路線組入細(xì)胞內(nèi)。24小時后進(jìn)行鏈霉素處理，制成混合細(xì)胞懸浮液，采用七Ay-夕-(FACS儀器《夕f"》f4少》乂》社制造)進(jìn)行分類。細(xì)胞根據(jù)其大小與熒光發(fā)光，分離為Dil-Ac-LDL陽性與陰性。分離后將其分別繼續(xù)培養(yǎng)，使內(nèi)皮細(xì)胞達(dá)到2百萬個為止。C.組織構(gòu)筑構(gòu)筑組織的第1階段，在體外進(jìn)行細(xì)胞播種。具體的是在本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材上以約100萬個/cm'播種Di1-Ac-LDL陽性的結(jié)締組織細(xì)胞。結(jié)締組織細(xì)胞播種后30~60分鐘，放置在培養(yǎng)皿上的凈化臺內(nèi)，然后，添加約50mL的培養(yǎng)液。培養(yǎng)液基本上每天更換，7天后，在外科移植的1日前，再播種內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液(約2百萬個)，通過該作業(yè)謀求單一層的內(nèi)皮細(xì)胞。D.單核球的采取與播種作為單核球的采取方法，首先，在手術(shù)日當(dāng)日通過全身麻醉加以鎮(zhèn)靜.鎮(zhèn)痛后，采用與手術(shù)時的清潔區(qū)同等的清潔操作，從腸棘采用骨髓穿刺針，在放入用于抗凝固的肝素的注射器內(nèi)采取骨髓。為了從所得到的骨髓去除骨片成分、脂肪成分、凝血成分，首先把骨髓在凈化臺內(nèi)進(jìn)行過濾后，緩慢地向梯度液(例如，商品名"Ficoll":Pharmacia社制造)的上部注入，進(jìn)行離心。然后，另外在清潔環(huán)境下分離血漿成分，并分離單核球?qū)?。為了僅得到單核球?qū)拥募?xì)胞塊而再進(jìn)行離心，得到單核球的細(xì)胞塊。所得到的細(xì)胞塊，與播種的心血管組織培養(yǎng)用基材的大小相符合，采用適當(dāng)分離后的自身血清稀釋、攪拌，用手播種在心血管組織培養(yǎng)用基材上。細(xì)胞播種后的心血管組織培養(yǎng)用基材，為了溫存骨髓單核球細(xì)胞，在進(jìn)行移植前于浸漬在自身血清內(nèi)的狀態(tài)下，于37。C、5%二氧化碳、100%濕度的保溫箱內(nèi)保存。本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材上，于體外播種細(xì)胞，再于體外培養(yǎng)的基材表面用細(xì)胞被覆的移植用心血管組織的制造方法，也是本發(fā)明之一。本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材上，于體外播種細(xì)胞，再通過培養(yǎng)使心血管組織在體外再生的心血管組織再生法，也是本發(fā)明之一。本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材上，于體外播種細(xì)胞，再于體外培養(yǎng)，得到的內(nèi)皮細(xì)胞化的移植用心血管組織，也是本發(fā)明之一。本發(fā)明的移植用心血管組織，通過采用細(xì)胞的播種效率與難以壓壞的兩全其美的本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材，通過移植能以極高的效率再生血管。作為本發(fā)明的移植用心血管組織的移植方法，未作特別限定，可以采用公知的方法，通過抗血栓藥、抗凝固藥、抗血小板藥、糖質(zhì)類皮質(zhì)激素(類固醇藥)、非類固醇性抗炎癥藥(NSAID)并用，可以得到更高的效果。其中，采用糖質(zhì)類皮質(zhì)激素(類固醇藥)可得到極高的效果。作為上述抗血栓藥，未作特別限定，例如，可以舉出阿斯匹林等。作為上述抗凝固藥，未作特別限定，例如，可以舉出肝素、華發(fā)令、新抗凝、苯茚滿二酮等。作為抗血小板藥，未作特別限定，例如，可以舉出西洛他唑、阿斯匹林、噻氯匹定等。作為糖質(zhì)類皮質(zhì)激素(類固醇藥)，未作特別限定，例如，可以舉出潑尼松龍、得克薩麥當(dāng)松、皮質(zhì)醇等。作為非類固醇性抗炎癥藥(NSAID),未作特別限定，例如，可以舉出阿斯匹林、雙氯滅痛、消炎痛、異丁苯丙酸(布洛芬)、奈普生等。作為與糖質(zhì)類皮質(zhì)激素(類固醇藥)等并用的方法，未作特別限定，例如，可以采用原來公知的方法。例如，當(dāng)與糖質(zhì)類皮質(zhì)激素(類固醇藥)并用時，在本發(fā)明的移植用心血管組織移植后一定期間，可以口服糖質(zhì)類皮質(zhì)激素(類固醇藥)。發(fā)明效果按照本發(fā)明，提供通過播種、移植細(xì)胞，以極高的效率再生血管的心血管組織培養(yǎng)用基材，以及采用該基材的移植用心血管組織的制造方法、心血管組織再生法、移植用心血管組織。具體實施例方式下面列舉實施例，更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明又不受這些實施例限定。實驗例1L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比50:50)與L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比75:25)以100:0、90:10、80:20及70:30的比例進(jìn)行混合，配制L-丙交酯s-己內(nèi)酯(摩爾比)達(dá)50:50、52.5:47.5、55:45及57.5:42.5的L—丙交酯一e-己內(nèi)酯共聚物，及其4重量％的二噁垸溶液。外徑12mm的特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上，安裝了由140旦尼爾的聚乙醇酸線編成筒狀的平針織物，將其浸漬在上述L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物溶液中，于-80。C凍結(jié)后，于-40。C4(TC凍結(jié)干燥12小時。然后，邊將其反轉(zhuǎn)邊從特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上取下，再度安裝在特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上后，與上述進(jìn)行同樣的操作，得到用乙醇酸針織物增強(qiáng)的層狀結(jié)構(gòu)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材。還有，泡沫層(海綿層)的厚度，兩面計約l.3mm。對得到的心血管組織培養(yǎng)用基材用下法進(jìn)行評價。結(jié)果示于表1。(1)壓縮彈性試驗對得到的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，進(jìn)行壓縮使直徑達(dá)到1/2時求出必要的強(qiáng)度。如該值大，則意指對狹窄具有高的口徑保持力。(2)拉伸試驗對得到的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，求出外徑方向拉伸時的最大點強(qiáng)力。如該值大，意指耐拍動的強(qiáng)度大。(3)吸水試驗把得到的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材切成lcm大小，作為樣品，測其重量。把樣品于生理鹽水中浸漬后，用手指擠壓15次，擠出樣品中的氣泡。輕輕地擠出水后，測定吸水后的重量。從吸水前后的樣品重量算出吸水率。該值大者，表示細(xì)胞懸濁液的吸水量多。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實驗例2對L-丙交酯-e-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比50:50),配制2%、4%、6%、8%的4種濃度的二噁烷溶液。在外徑10mffl的特氟隆(注冊商標(biāo))制造的纟奉上，安裝了與實施例1同樣構(gòu)成的筒狀針織物，將其浸漬在上述L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物溶液中，然后，采用與實驗例1同樣的條件、操作，得到用聚乙醇酸針織物增強(qiáng)的層狀結(jié)構(gòu)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材。僅采取所得到的心血管組織培養(yǎng)用基材的發(fā)泡體一部分，測定的結(jié)果為其厚度分別為0.55mni(2°/濃度)、0.90mra(4%濃度)、1.30mm(6%濃度)、2.10mm(8%濃度)。對所得到的心血管組織培養(yǎng)用基材，采用與實驗例1同樣的方法進(jìn)行評價。結(jié)果示于表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實驗例3配制L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比50:50)的4重量%二噁烷溶液，以及L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比75:25)的4重量％二碌、烷溶液。在這些溶液中浸漬140旦尼爾的聚乙醇酸纖維，緩慢取出后進(jìn)行干燥，得到由L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物涂布的聚乙醇酸纖維。采用得到的涂布過的聚乙醇酸纖維，與實施例1同樣，編成針織組織的筒狀針織物，得到增強(qiáng)材料。將其與實驗例l同樣，安裝在特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上，然后，采用與實驗例1同樣的條件、操作，采用涂布過的聚乙醇酸針織物編成的增強(qiáng)材料，得到具有0.9mm厚泡沫層的層狀結(jié)構(gòu)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材。作為對照物，采用未涂布的聚乙醇酸纖維，制造增強(qiáng)材料，采用同樣的方法得到心血管組織培養(yǎng)用基材。對得到的心血管組織培養(yǎng)用基材，采用與實驗例1同樣的方法進(jìn)行評價。結(jié)果示于表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實驗例4由140旦尼爾聚乙醇酸構(gòu)成的復(fù)紗(35d/16長紗)，每根加S捻后，把4根絞合成合紗，再加Z捻、構(gòu)成掄紗，得到低捻(單紗的S掄120T/m，合紗的Z捻75T/m)、中捻(單紗的S捻600T/m，合紗的Z掄375T/m)、以及高掄(單紗的S掄1200T/m，合紗的Z捻750T/m)的3種掄紗。把該捻紗分別與實施例1同樣，編成針織組織的筒狀針織物，與實驗例1同樣，安裝在特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上，然后，采用與實驗例1同樣的條件、操作，浸漬在L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比50:50)的4重量％二噁烷溶液中，得到具有0.9mm厚泡沫層的層狀結(jié)構(gòu)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材。對得到心血管組織培養(yǎng)用基材，采用與實驗例1同樣的方法進(jìn)行評價。結(jié)果示于表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>配制L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比50:50)的4重量%二噍烷溶液。外徑10mm的特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上，安裝了由140旦尼爾聚乙醇酸紗編織成筒狀的平針織物，將其浸漬在上述L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物溶液中，于-80。C凍結(jié)后，于-40。C40X:凍結(jié)干燥12小時。然后，邊將其反轉(zhuǎn)邊從特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上取下，再度安裝在特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上后，其表面上，把L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物的單紗(粗細(xì)1-0及3-0兩種)以3血111及5111111的節(jié)距巻繞成螺旋狀。將其在上述1^-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比50:50)的4重量％二嚙烷溶液中浸漬30秒后，于-80。C凍結(jié)后，于-40。C4(TC凍結(jié)千燥12小時，得到具有0.9mm厚泡沫層的層狀結(jié)構(gòu)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材。作為對照物，除沒有巻繞單紗之外通過同樣的方法得到心血管組織培養(yǎng)用基材。對得到心血管組織培養(yǎng)用基材，采用與實驗例1同樣的方法進(jìn)行評價。結(jié)果示于表5。[表5]增強(qiáng)紗壓縮至1/2所必需的力(g)吸水率(%)1_0紗/3rrnn204236l-0紗/5mm1272843-0紗/3咖1123003-0紗/5mm60318無增強(qiáng)紗7353另外，對得到心血管組織培養(yǎng)用基材中的3-0紗/3mm節(jié)距的樣品，進(jìn)行犬的埋入實驗。即，犬(Beagle，體重10kg)7只，從大腿骨骨頭、腸骨骨頭，采用骨髓穿刺針，于放入了肝素的注射器中采取骨髓。為了從得到的骨髓去除骨片成分、脂肪成分、凝血成分，首先把骨髓在凈化臺內(nèi)過濾后，向梯度液(例如，商品名"Ficoll":Pharmacia社制造)的上部緩慢注入，進(jìn)行離心。然后，另外在清潔環(huán)境下分離血漿成分，并分離單核球?qū)印榱藘H得到單核球?qū)拥募?xì)胞塊而再進(jìn)行離心，得到單核球的細(xì)胞塊。所得到的細(xì)胞塊，在切成3cm長的心血管組織培養(yǎng)用基材上播種后，移植至同一犬的下部大靜脈中。移植后經(jīng)過2個月后，全部7只經(jīng)過順利良好。實驗例6把上述L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比75:25)的單紗(粗細(xì)1-0),浸漬在上述L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比50:50)的4重量％二噁烷溶液中，緩慢取出后進(jìn)行干燥，得到用L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物涂布的L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物的單紗。外徑10mm的特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上，安裝了由140旦尼爾聚乙醇酸紗編織成筒狀的平針織物，將其浸漬在上述L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物溶液中，于-8(TC凍結(jié)后，于-40。C40。C凍結(jié)干燥12小時。然后，邊將其反轉(zhuǎn)邊從特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上取下，再度安裝在特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上。然后，其表面上，用得到的L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物涂布的乙醇酸-s-己內(nèi)酯共聚物單紗，以3mm的節(jié)距巻繞成螺旋狀。將其在上述L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比50:50)的4重量％二噁烷溶液中浸漬30秒后，于-80。C凍結(jié)后，于-40°C~40。C凍結(jié)干燥12小時，得到具有0.9mm厚泡沫層的層狀結(jié)構(gòu)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材。在得到的心血管組織培養(yǎng)用基材中通過采用L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物涂布的乙醇酸-s-己內(nèi)酯共聚物單紗，泡沫層相對單紗的粘接性增高，該單紗難以從泡沫層上取下。實驗例7配制L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比50:50)的4重量%二嚙烷溶液。外徑10mm的特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上，安裝了由140旦尼爾聚乙醇酸紗編織成筒狀的平針織物，將其浸漬在上述L-丙交酯-e-己內(nèi)酯共聚物溶液中，于-80。C凍結(jié)后，于-40'C4(TC凍結(jié)干燥12小時。然后，邊將其反轉(zhuǎn)邊從特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上取下，再度安裝在特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上后，將其浸漬在上述L-丙交酯-e-己內(nèi)酯共聚物溶液中，于-80。C凍結(jié)后，于-40。C40。C凍結(jié)干燥12小時。其表面上，以3mm的節(jié)距，把得到的L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物單紗(粗細(xì)1-0)巻繞成螺旋狀。將其在上述L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比50:50)的4重量％二噁烷溶液中浸漬30秒后，于-8(TC凍結(jié)后，于-40。C~40匸凍結(jié)干燥12小時，得到具有0.9mm厚泡沫層的層狀結(jié)構(gòu)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材。所得到的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，制成3層結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)材料可更牢固地穩(wěn)定地保持。參考例由140旦尼爾聚乙醇酸構(gòu)成的復(fù)紗(35d/16長紗)，每根加S捻后，把4根絞合成合紗，再加Z捻，構(gòu)成捻紗，得到低捻(單紗的S搶120T/m，合紗的Z搶75T/m)的掄紗。把得到的低捻捻紗，與實施例l同樣，編織成針織組織的筒狀針織物，與實驗例l同樣，安裝在特氟隆(注冊商標(biāo))制造的棒上，然后，采用與實驗例1同樣的條件、操作，浸漬在L-丙交酯-s-己內(nèi)酯共聚物(摩爾比50:50)的4重量％二噁烷溶液中，得到具有0.9mm厚泡沫層的層狀結(jié)構(gòu)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材。從犬(Beagle犬，體重10kg)的大腿骨骨頭、腸骨骨頭，采用骨髓穿刺針，于放入了肝素的注射器中采取骨髓。為了從得到的骨髓去除骨片成分、脂肪成分、凝血成分，首先把骨髓在凈化臺內(nèi)過濾后，向梯度液(例如，商品名"Ficoir:Pharmacia社制造)的上部緩慢注入，進(jìn)行離心。然后，另外在清潔環(huán)境下分離血漿成分，并分離單核球?qū)?。為了僅得到單核球?qū)拥募?xì)胞塊而再進(jìn)行離心，得到單核球的細(xì)胞塊。所得到的細(xì)胞塊，在切成3cm長的心血管組織培養(yǎng)用基材上播種后，移植至同一犬的下部大靜脈中，把糖質(zhì)類皮質(zhì)激素(類固醇藥)的潑尼松龍0.5mg/kg，術(shù)后1個月混入餌料后供祠組，以及不供飼組(兩組都是分別3只)。結(jié)果表明，投給潑尼松龍組，抑制白血球上升，抑制炎癥。產(chǎn)業(yè)上的利用可能性按照本發(fā)明，提供通過播種、移植細(xì)胞，以極高的效率再生血管的心血管組織培養(yǎng)用基材，以及采用該基材的移植用心血管組織的制造方法、心血管組織再生方法、移植用心血管組織。權(quán)利要求1.心血管組織培養(yǎng)用基材，所述基材是把包含生物體吸收性材料的發(fā)泡體，采用包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)材料加以增強(qiáng)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，其特征在于，上述發(fā)泡體含有丙交酯(D、L、DL體)含量為50～54摩爾％、ε-己內(nèi)酯含量為50～46摩爾％的丙交酯(D、L、DL體)-ε-己內(nèi)酯共聚物，上述增強(qiáng)材料由上述發(fā)泡體被覆。2.心血管組織培養(yǎng)用基材，所述基材是把包含生物體吸收性材料的發(fā)泡體，采用包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)材料加以增強(qiáng)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，其特征在于，上述發(fā)泡體的厚度為0.2~3.Omm，而上述增強(qiáng)材料位于中心或外面，內(nèi)面為上述發(fā)泡體。3.心血管組織培養(yǎng)用基材，所述基材是把包含生物體吸收性材料的發(fā)泡體，采用包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)材料加以增強(qiáng)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，其特征在于，上述增強(qiáng)材料包含由生物體吸收性材料涂布的生物體吸收性纖維，上述增強(qiáng)材料位于中心或外面，內(nèi)面為上述發(fā)泡體。4.按照權(quán)利要求3所述的心血管組織培養(yǎng)用基材，其特征在于，上述增強(qiáng)材料包含丙交酯(D、L、DL體)一e-己內(nèi)酯共聚物涂布的聚乙醇酸纖維。5.心血管組織培養(yǎng)用基材，所述基材是把包含生物體吸收性材料的發(fā)泡體，釆用包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)材料加以增強(qiáng)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，其特征在于，上述增強(qiáng)材料包含由生物體吸收性復(fù)紗加捻而成的捻紗，上述增強(qiáng)材料位于中心或外面，內(nèi)面為上述發(fā)泡體。6.心血管組織培養(yǎng)用基材，所述基材是把包含生物體吸收性材料的發(fā)泡體，采用包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)材料以及包含生物體吸收性材料的增強(qiáng)紗加以增強(qiáng)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，其特征在于，上述增強(qiáng)紗以及增強(qiáng)材料位于中心或外面，內(nèi)面為上述發(fā)泡體。7.按照權(quán)利要求6中所述的心血管組織培養(yǎng)用基材，其特征在于，增強(qiáng)紗包含選自聚L-丙交酯、丙交酯(D、L、DL體)-s-己內(nèi)酯共聚物、以及乙醇酸-s-己內(nèi)酯共聚物的至少1種。8.按照權(quán)利要求6中所述的心血管組織培養(yǎng)用基材，其特征在于，上述增強(qiáng)紗以螺旋狀、環(huán)狀或X字狀巻繞。9.基材表面用細(xì)胞被覆的移植用心血管組織的制造方法，是在權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7或8中所述的心血管組織培養(yǎng)用基材上，于體外播種細(xì)胞，再于體外培養(yǎng)。10.心血管組織再生方法，其特征在于，是在權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7或8中所述的心血管組織培養(yǎng)用基材上，于體外播種細(xì)胞，再通過進(jìn)行培養(yǎng)使心血管組織于體外再生。11.移植用心血管組織，其特征在于，是在權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7或8中所述的心血管組織培養(yǎng)用基材上，于體外播種內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或結(jié)締組織細(xì)胞，再于體外進(jìn)行培養(yǎng)而得到的。全文摘要本發(fā)明的心血管組織培養(yǎng)用基材，所述基材是把生物體吸收性材料構(gòu)成的發(fā)泡體，采用生物體吸收性材料構(gòu)成的增強(qiáng)材料加以增強(qiáng)的管狀的心血管組織培養(yǎng)用基材，其中，上述發(fā)泡體含有丙交酯(D、L、DL體)含量為50～54摩爾％、ε-己內(nèi)酯含量為50～46摩爾％的丙交酯(D、L、DL體)-ε-己內(nèi)酯共聚物，上述增強(qiáng)材料由上述發(fā)泡體被覆。文檔編號A61L27/00GK101568637SQ20088000136公開日2009年10月28日申請日期2008年1月18日優(yōu)先權(quán)日2007年1月18日發(fā)明者坂元悠紀(jì),平嗣良,新岡俊治,松村剛毅,松田晶二郎,筏義人申請人:郡是株式會社