專利名稱：：多糖硫酸酯作為制備抗流感病毒藥物的應用的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明屬于合成藥物學領域，涉及多糖硫酸酯作為制備抗流感病毒藥物的應用，尤其涉及海洋紅藻多糖硫酸酯和a-D-(l—6)-葡聚糖硫酸酯作為制備抗流感病毒藥物的應用。
背景技術(shù)：
：流感是流感病毒引起的嚴重危害人類健康的一種急性病毒性呼吸道傳染病，被稱為致死率最高的病毒性傳染病之一。歷史上流感曾有過幾次大規(guī)模流行，給人類帶來了深重災難。盡管已有多種治療藥物問世，但是流感的危害性及其造成的損失仍不容忽視。流感。我國是流感多發(fā)地，基本上每年都有局部爆發(fā)流行。為此，我國衛(wèi)生部已將流感列為"十五"期間重點監(jiān)控的疾病之一。流感病毒是由兩種表面糖蛋白-血凝素和神經(jīng)氨酸酶包圍的微粒，屬于正粘病毒家族，抗原變異是它最顯著的生物學特征，根據(jù)流感病毒核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)抗原型差異可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中A型流感病毒按血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原性差異分為若干亞型(H凡)。H凡和H美亞型和B型流感病毒是近十年引起人類流感暴發(fā)和流行的主要病原。流感疫苗接種是目前預防流感的唯一措施。常見的流感疫苗有滅活疫苗、減毒活疫苗、重組疫苗(或稱載體疫苗)、亞單位疫苗、合成寡肽疫苗和核酸疫苗?，F(xiàn)在臨床使用的流感疫苗是失去感染性的滅活疫苗。由于流感病毒抗原易變異，而且由于目前尚缺乏可靠的方法對流感發(fā)生與流行的周期性進行有效預測，因此接種流感疫苗的措施仍具有局限性。治療流感的藥物研究已取得較大進展。目前，已經(jīng)應用和正在研究的抗流感病毒藥物有金剛烷胺類藥物、神經(jīng)氨酸酶抑制劑，流感病毒受體阻斷劑等。金剛烷胺和金剛乙胺是常用臨床治療藥物，僅對A型病毒有效，對B型流感病毒無效，且易產(chǎn)生耐藥性并具有神經(jīng)毒性。1999年由美國FDA批準用于臨床的Zanamivir(GG167或Relenza)和Oseltamivir(GS4104或Tamiflu)為神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制物，主要用于早期治療，對甲、乙型流感均有效。然而，這兩種藥物對具有合并癥的流感療效較差，因此這兩種藥物尚未廣泛加以應用。鑒于流感病毒的危害性，針對預防和治療流感病毒的藥物的研究受到了特別的重視。多糖硫酸酯是指糖羥基上帶有硫酸基團的多糖，也稱為硫酸多糖或硫酸酯化多糖。近年來，多糖的抗病毒作用已引起醫(yī)藥界的高度重視，尤其是多糖^t酸酯的強抗病毒活性，顯示了廣闊的藥用前景。據(jù)有關(guān)文獻報道，具有強陰離子基團的多糖類物質(zhì)抗被膜病毒(Erwel叩edvirus)的主要機理是抑制被膜病毒向宿主細胞的吸附與侵入，即多糖硫酸酯靠靜電作用與被膜外膜蛋白結(jié)合，占據(jù)了被膜病毒與受體細胞結(jié)合的部位，從而使被膜病毒不能感染細胞。病毒吸附到細胞原生質(zhì)膜是一種與靜電作用有關(guān)的受體識別過程，需要細胞表面與病毒間的分子親和力[Fenner，1974]。多糖g^酸酯能與艾滋病病毒HIV-1外殼糖蛋白的gpl20的陽離子區(qū)域結(jié)合，占據(jù)被膜病毒與宿主細胞受體部位，從而阻止病毒與宿主細胞的結(jié)合[周靚1997]。對抑制作用模式的研究表明，病毒對宿主細胞的吸附被硫酸聚陰離子阻斷[Liebhaber1963，Schulze1964，Takemoto1964，Baba1988，Neyts1992,Mitsuya1988，Scholsl990]。當存在多聚陽離子如DEAE-葡聚糖和魚精蛋白時，抑制作用可被阻止或反轉(zhuǎn)。多糖硫酸酯還抑制病毒進入細胞或進入細胞后復制的某一步驟[周靚1997]。流感病毒與HIV等同屬于被膜病毒。葡聚糖有a-D-(1—4)、D-(1—4)、a-D-(1—3)、D-(1—3)、a-D-(1—6)等多種糖苷鍵連接類型。各種葡聚糖硫酸酯由于在分子量、分子側(cè)鏈、糖苷鍵類型、硫酸鍵類型、單糖硫酸酯個數(shù)(取代度)等方面的差異，使其具有不同的功能。如可作為抗凝血劑(US2715091，分子量為22000-200000、取代度最高為3.0);抗輪狀病毒(W096/30027);抗艾滋病病毒(US5861383和EP0德512，分子量為500000，一般為75000;EP0293826分子量為5000、8000、90000、200000;CN1206717A，P-D-(1—4)-葡聚糖硫酸酯)；抗單純皰疹病毒(W094/15624,分子量為50000-500000，糖苷鍵為a-D-(1—4)或P-D-(1—4));抗腫瘤(CN1283632A，a-D-(1—3)-葡聚糖硫酸酯)等。a-D-(1—6)-葡聚糖(Dextrin，右旋糖苷)硫酸酯及其他葡聚糖硫酸酯的抗流感病毒活性未見報道。耳突麒麟菜(f"C^M27eC"^/7i)是重要的一類紅藻，其主要成分為卡拉膠(Carr塔e朋朋，具有部分硫酸酯基團的聚D-半乳糖-3，6-內(nèi)醚-半乳糖硫酸酯)。1958年Gerber等人首次提出海藻含有天然抗病毒活性物質(zhì)。從^7i力'i^Csm7s《e/7^/z提取的未經(jīng)化學修飾的天然多糖可保護受孕卵免受流行性腮腺炎病毒和A型流感病毒的侵染。80年代末科學家研究發(fā)現(xiàn)有幾種聚陰離子物質(zhì)(天然的或半合成的紅藻多糖硫酸酯)是艾滋病病毒(HIV)復制的有效抑制劑，引起了人們對多糖硫酸酯抗病毒作用研究的興趣，從多種紅藻中也發(fā)現(xiàn)了對單純皰疹病毒HSV1和HSV2具有抑制作用的多糖。對39種加利福尼亞紅藻抗鼠白血病病毒篩選中發(fā)現(xiàn)，6b^X^朋i'a提取物具有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性，對水提取物及其級分進一步的研究發(fā)現(xiàn)，卡拉膠確實是抗病毒活性成分。另外，一些專利中提到卡拉膠或其硫酸酯抗單純皰疹病毒的作用(W094/15624)、抗HIV的作用(簡8/06396，EPA293826)、抗HIV以及其它DNA和RNA病毒(GB2262531)、抗輪狀病毒(W096/30027)等，并與纖維生長因子協(xié)同抗單純皰疹病毒、細胞巨化病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、森里基森林病毒、艾滋病病毒和莫洛尼氏肉瘤病毒等(EP0497341A2，分子量大于1000萬)。對天然耳突麒麟菜多糖硫酸酯抗B型流感病毒未見報道；對經(jīng)化學加工得到特定分子量、特定單糖硫酸根取代度的耳突麒麟菜多糖硫酸酯抗A型和B型流感病毒也未見報道。壇紫菜(尸or/7力y7^Aa"朋e/7S^)是產(chǎn)于我國南方的一種重要經(jīng)濟紅藻。紫菜多糖具有明顯的抗凝血、降血脂、抗血栓、強心作用，還具有抑制腫瘤、降低血糖、抗炎和防治潰瘍等作用，據(jù)報道紫菜多糖還具有明顯增強細胞免疫和體液免疫的功能，但有關(guān)紫菜多糖硫酸酯用于抗流感病毒的研究未見報道。在已報導的文獻及專利中，有關(guān)天然海洋紅藻多糖(包括卡拉膠和壇紫菜多糖)經(jīng)化學修飾和處理制得的平均分子量為1000到100000、單糖硫酸根取代度為1.0至3.0的紅藻多糖硫酸酯(卡拉膠多糖硫酸酯、紫菜多糖硫酸酯)和a-D-(1—6)-葡聚糖硫酸酯對流感A型及B型病毒的單獨抑制或協(xié)同抑制作用，未見報導。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于公開多糖硫酸酯在抗流感病毒中的應用，并制備a-D-(1—6)-葡聚糖硫酸酯(平均分子量范圍為IOOO—IOOOOO，單糖硫酸根取代度0.2—3.0)和海洋紅藻多糖硫酸酯如卡拉膠多糖硫酸酯(平均分子量范圍為1000—100000，單糖硫酸根取代度1.0—3.0)和紫菜多糖硫酸酯(平均分子量范圍為IOOO—IOOOOO，單糖硫酸根取代度0.5—3.0)為實用藥物劑型，確定了這些多糖硫酸酯具有單獨或協(xié)同抗A型和B型流感病毒的用途。為了實現(xiàn)上述目.的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下-(1)稱取一定量的耳突麒麟菜，粉碎后于95t:水提3h，粗提液經(jīng)離心后收集上清液，加入適量KC1，離心分離沉淀物。沉淀物用水溶解后用乙醇再次進行沉淀后過濾，過濾物于5(TC真空干燥，磨成細粉，得卡拉膠粉末。(2)稱取一定量干燥紫菜，加水浸泡過夜，搗碎后置-20'C冰凍，取出后微波解凍，如此重復3次后，于6(TC水浴中攪拌提取30min，離心，上清液經(jīng)減壓濃縮，干燥得粗多糖。粗多糖經(jīng)732陽離子交換樹脂法除蛋白，得到精制紫菜多糖。(3)稱取(1)所制備的卡拉膠或市售卡拉膠(分子量一般大于50萬，單糖硫酸根取代度為0.3-0.8)或(2)所制備的紫菜多糖，配成2-15%的溶液，在0.005%5°/^范圍的硫酸(或鹽酸)濃度、40120。C下作用10180分鐘。反應結(jié)束后，立即用NaOH溶液進行中和，然后用超濾膜截留過濾，制備特定分子量的卡拉膠多糖或紫菜多糖。(4)將(3)所得到的較小分子量的紅藻多糖或市售的葡聚糖(Zfer&s/7，ci-D-(1—6)-葡聚糖)經(jīng)常規(guī)吡啶-氯磺酸法處理，得到特定單糖硫酸根取代度的多糖硫酸酯，采用超濾手段除去小分子物質(zhì)后，以2倍量無水乙醇醇析沉淀，沉淀物經(jīng)蒸餾水溶解后再次用2倍量乙醇醇析，所得沉淀物經(jīng)6(TC真空干燥得到所需的多糖硫酸酯，該多糖硫酸酯粉末的雜質(zhì)含量低于2%，主要雜質(zhì)為NaCl和Na2S04o(5)多糖硫酸酯粉末經(jīng)干燥后在除濕環(huán)境中裝成膠囊以制備成口服劑型。也可將多糖硫酸酯粉末按照所需濃度溶于生理鹽水，經(jīng)0.22um膜過濾除菌后，即制備成等滲透壓的、可用于鼻粘膜(肺粘膜)吸收的藥物劑型。(6)采用雞胚模型和小鼠實驗模型，對(5)所制備的多糖硫酸酯試樣進行單獨抗流感病毒的試驗，并與金剛烷胺、病毒唑、金剛乙胺、Zanamivir(GG167或Relenza)和0seltamivir(GS4104或Tamiflu)等現(xiàn)有抗流感藥物組成復方后，進行協(xié)同抗流感病毒的試驗。試驗表明，所制備的多糖硫酸酯具有明顯的抗A型和B型流感病毒活性,且與金剛垸胺、病毒唑等現(xiàn)有藥物按1:0.Ol—l:100含量配比形成復方后具有協(xié)同作用，可進一步增強抗流感病毒作用，實施例中列舉了多糖硫酸酯與金剛烷胺、病毒唑按5:2的含量配比形成復方的抗流感病毒實驗效果。圖1為本發(fā)明所涉及的從耳突麒麟菜中提取得到的卡拉膠的結(jié)構(gòu)式，為聚D-半乳糖-3,6-內(nèi)醚-D-半乳糖，具有部分硫酸基團。圖2為本發(fā)明所涉及的a-D-(1—6)-葡聚糖硫酸酯的分子結(jié)構(gòu)式，其中取代基R可為H或S03H。當取代基R都為H時為a-D-(1—6)-葡聚糖。圖3為a-D-(1—6)-葡聚糖的紅外光譜圖。圖4為a-D-(1—6)-葡聚糖硫酸酯的紅外光譜圖，其中1244cnT左右吸收為SO伸縮振動、800cnT左右吸收為C—0—S的拉伸振動，說明葡聚糖已被硫酸酯化。具體實施例方式本發(fā)明參照下面的實施例進行詳細說明，但并不限于此。實施例h耳突麒麟菜多糖(卡拉膠)的制備稱取一定量干燥的耳突麒麟菜(購自廈門水產(chǎn)研究所)，剪碎洗凈，加入50倍重量的熱水，95X:攪拌加熱3小時。將多糖粗提液5000rpm離心10分鐘，收集上清液。加入KC1，使終濃度為5%，攪勻，靜置過夜，在5000rpm下離心10分鐘，分離不溶物。將不溶物用蒸餾水溶解，再以3:1(v/v)的比例加入乙醇，靜置沉淀60分鐘，6(TC真空干燥，磨成細粉，得精制卡拉膠粉末。所制得的卡拉膠分子量高于50萬，每單糖硫酸根取代度為0.45。實施例2:紫菜多糖的制備稱取一定量干燥的壇紫菜(產(chǎn)地為福建平潭)，剪碎洗凈，加入50倍的蒸餾水浸泡過夜，采用搗碎機將紫菜搗碎，置-2(TC冰凍，取出后微波解凍，如此重復3次后，于6(TC水浴中攪拌提取30min，3000rpm離心20min，上清液另置，紫菜渣加入蒸餾水后重復提取2次，合并3次上清液，5(TC減壓濃縮，凍干，得粗多糖。將紫菜粗多糖配成2%溶液，加入硫酸調(diào)節(jié)pH至2.0。多糖溶液流經(jīng)再生的732陽離子交換樹脂柱，可有效去除蛋白質(zhì)。收集過柱液，濃縮至3呢w/v后用乙醇沉降多糖。沉淀物經(jīng)真空干燥，粉碎后得到紫菜多糖粉末。實施例3:特定分子量卡拉膠多糖的制備將實施例1制備的卡拉膠(或商品卡拉膠)配制成5%的膠液，置恒溫水浴鍋中，充分混勻。加入硫酸調(diào)節(jié)pH至2.5，90。C恒溫反應120分鐘。反應結(jié)束后，立即用1N的NaOH溶液進行中和，然后采用不同截留分子量的超濾膜過濾，制備不同分子量的卡拉膠多糖。所制得的特定分子量的卡拉膠多糖經(jīng)噴霧干燥處理，用于卡拉膠多糖硫酸酯的制備。實施例4:a-D-(1—6)-葡聚糖硫酸酯的制備將配置冷凝管和攪拌裝置的三頸燒瓶置鹽水-冰浴中，加入吡啶48ml，攪拌，使之充分冷卻，用滴液漏斗加入氯磺酸13ml。迅速將三頸燒瓶移入IO(TC水浴中，加入平均分子量為20000的a-D-(1—6)-葡聚糖3.0g，IO(TC恒溫攪拌lh。將冷至室溫的反應液傾入200ml冰水中，用40y。NaOH中和至pH10.5，靜置分層，用分液漏斗分離出下層水相。水相部分加入4倍體積量的95%乙醇，葡聚糖硫酸酯析出沉淀，3000rprn離心10分鐘，收集沉淀物。將沉淀物溶于去離子水，在去離子水中透析48h。經(jīng)透析后的物料在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至5%w/v，加入無水乙醇100ml，靜置沉淀，離心分離沉淀物。用去離子水溶解、沉淀物，再加入無水乙醇離心分離沉淀物。重復醇析分離過程三次。將最終一次沉淀物真空干燥，制得a-D-(1—6)-葡聚糖硫酸酯。經(jīng)測定，平均分子量為45000，平均單糖硫酸根取代度為2.13。實施例5:小分子量紫菜多糖硫酸酯的制備按照實施例3所述的方法將實施例2中所制得的紫菜多糖進行處理后，得到平均分子量約60000、單糖硫酸根取代度為0.50的小分子量紫菜多糖ZSO。在l(TC溫度條件下，將25ml氯磺酸緩慢加入120ml無水吡啶中。迅速升高反應溫度，在充^攪拌條件下加入用吡啶分散的小分子量紫菜多糖ZSO樣品15克。在9(TC條件下反應4h。將反應液溫度降至IO'C，加入飽和NaOH冷溶液，將pH調(diào)至10.5。靜置分層IOmin后，分離上層有機相和下層水相。下層水相經(jīng)真空濃縮至5%w/v，加入異丙醇，異丙醇終濃度為60%w/v。沉淀物經(jīng)離心分離，然后用異丙醇洗滌三次。經(jīng)異丙醇洗滌的沉淀物重新溶解于去離子水中，用截留分子量為5000的超濾膜過濾，去除小分子量雜質(zhì)。經(jīng)超濾膜濃縮的物料中固形物含量達到約5%w/v時，加入2倍體積的異丙醇。經(jīng)過濾得到的沉淀物在真空條件下干燥(90°C，0.005MPa)。所制備的樣品ZSS的平均分子量約90000，平均單糖硫酸根取代度為1.57。實施例6:小分子量卡拉膠多糖硫酸酯的制備按實施例3的方法降解大分子量卡拉膠，采用超濾膜截留的方法制備平均分子量為35000的較小分子量卡拉膠多糖。在500ral三頸燒瓶中，加入吡啶200ml，在l(TC和充分攪拌條件下，緩慢加入氯磺酸20ml。加完氯磺酸后將反應液加熱至6(TC，加入卡拉膠多糖15克。然后升溫至8(TC恒溫攪拌2h。反應完畢后將反應液冷卻至l(TC，用40%NaOH冷溶液中和至pH9.0。反應液靜置分層，用分液漏斗分離出下層水相。水相料液經(jīng)真空濃縮至5y。w/v，加入無水乙醇，乙醇終濃度為75%。沉淀物經(jīng)離心分離后，溶于去離子水，裝入透析膜后，在去離子水中透析48h。經(jīng)透析處理的物料再置于真空旋轉(zhuǎn)干燥裝置中濃縮，濃縮至5%w/v濃度后，加入無水乙醇，乙醇終濃度為75%。沉淀物經(jīng)干燥，磨碎，制得卡拉膠多糖硫酸酯。經(jīng)測定，平均單糖硫酸根取代度為1.91。實施例7卡拉膠多糖硫酸酯抗流感病毒HA藥效研究a.按實施例1的方法，從耳突麒麟菜中提取卡拉膠。按實施例3的方法，制備平均分子量為35000的卡拉膠多糖，平均單糖硫酸根取代度為0.45。b.將步驟a制備的卡拉膠多糖進行硫酸酯化。制得卡拉膠多糖硫酸酯K,(平均分子量60000，平均單糖硫酸根取代度為1.91)。配制5000ug/ml的^藥物制劑，同時配制2000ug/ml金剛烷胺藥物制劑。按5倍比例稀釋，過濾除菌，制備一系列不同濃度試樣。c.取中國國家流感中心提供的H凡流感病毒毒株，感染雞胚尿囊腔，37°C恒溫孵育。3天后，取雞胚尿囊腔液，進行病毒濃度測定。配制病毒濃度為100TCID的HJV流感病毒試樣。d.取9日齡雞胚蛋，迅速將上述步驟a、b制備的藥物試樣和病毒試樣先后注入胚蛋，每胚蛋0.2ml。每種藥物濃度試驗使用5個胚蛋。同時設定病毒陽性對照組和生理鹽水陰性對照組。37。C恒溫孵育，連續(xù)3天觀察雞胚存活情況。e.按步驟d處理的胚蛋孵育3天后，置于4t:冰箱過夜。次日收取胚蛋尿囊腔液，進行血凝實驗，測定H凡病毒滴度。實驗表明(見表l、表2)，Id樣品具有明顯的抗H凡流感病毒的效果。在實驗樣品濃度達4.26ug/胚蛋時，病毒抑制率可達50%以上。Id抗H凡流感病毒的藥效優(yōu)于金剛垸胺，且毒性極低，其治療指數(shù)TIs。明顯高于金剛烷胺。表1卡拉膠多糖硫酸酯!^抗流感病毒H凡的實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2卡拉膠多糖硫酸酯K,和金剛垸胺抗病毒H凡的藥效比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>f.卡拉膠多糖硫酸酯Id與金剛垸胺的抗HM流感病毒的協(xié)同效應配制含量配比為5:2的卡拉膠多糖硫酸酯K,和金剛垸胺混合溶液，其中l(wèi)d含量為5000ng/ml，金剛垸胺含量為2000ug/ml。按步驟d實施，測定混合藥物抗H凡流感病毒的協(xié)同效應，實驗結(jié)果示于表2。表2表明，兩種藥物的混合使用，有助于提高抗HM病毒的效果，治療指數(shù)增加；兩種藥物混合時的毒性與金剛烷胺單獨使用時相當，未觀察到二種藥物毒性疊加的現(xiàn)象。實施例8卡拉膠多糖硫酸酯K2抗B型流感病毒藥效研究a.按實施例7方法制備卡拉膠多糖硫酸酯K2(平均分子量約40000，每單位單糖硫酸根取代度1.75)。配制5000"g/ml&藥物制劑，按2倍比例稀釋，制成一系列藥物試樣。b.按實施例7方法制備B流感病毒(由國家流感中心提供)試樣，病毒濃度為IOOTCID。c.按實施例7步驟d實施。d.按步驟c處理的胚度孵育，置于4。C冰箱過夜。次日收取胚蛋尿囊腔液，進行血凝實驗，測定B型病毒滴度。表3表明，K2單獨抗B型流感病毒的效果較為明顯。藥物用量為100ug/胚蛋時，病毒抑制率達90%以上；藥物用量12.5lig/胚蛋時，病毒抑制率達75%。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例9卡拉膠多糖硫酸酯K2抗H美流感病毒藥效學實驗a.按實施例8所制備的卡拉膠多糖硫酸酯K2樣品。配制5000Pg/ml的樣品，配制2000ug/ml金剛烷胺樣品。按2倍比例逐次稀釋。金剛垸胺為對照藥物。b.按實施例7方法制備HsN2流感病毒試樣，病毒濃度為IOOTCID。c.d均按實施例8實施。實驗數(shù)據(jù)示于表4。表4表明，卡拉膠多糖硫酸酯樣品K2具有較顯著的抑制H美流感病毒攻擊宿主細胞的功效。表4卡拉膠多糖硫酸酯K2抗病毒H3N2的實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例10卡拉膠多糖硫酸酯K3抗流感病毒H凡鼠肺適應株的藥效研究a.采用市售卡拉膠粉末，按實施例3的方法，制備平均分子量為4000的卡拉膠多糖，平均單糖硫酸根取代度為0.45。b.按實施例6的方法，將步驟a制備的卡拉膠多糖進行硫酸酯化，制得卡拉膠多糖硫酸酯K3(平均分子量為7000，平均單糖硫酸根取代度為2.14)。c.配制5000ug/ml的K3藥物制劑試樣。配制2000yg/ml病毒唑藥物制劑試樣。按4倍比例逐次稀釋，制成一系列試樣。病毒唑為對照藥物。d.流感病毒HM鼠肺適應株(由國家流感中心提供)經(jīng)胚蛋感染富集后，制成病毒濃度為100TCID病毒供試樣。e.取18—20克小鼠，先感染病毒，2h后采用滴鼻方式給藥。每天給藥兩次，連續(xù)給藥7天。7天后處死小鼠，稱其體重，然后解剖，取其肺，稱肺重。另設空白陰性對照組、病毒陽性對照組和病毒唑?qū)φ战M。小鼠肺變指數(shù)為小鼠肺重與體重之比，表示小鼠在感染流感病毒后肺病變增重指標。陰性對照組為0.686，陽性對照組為0.850。卡拉膠硫酸酯K3通過滴鼻方式給藥，可取得明顯抗病毒效果，其肺變指數(shù)與陰性對照組相近(見表5)。實驗表明，鼻粘膜吸收是一種良好的給藥方式。表5卡拉膠硫酸酯K3抗流感病毒鼠肺適應株的藥效比較<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例11卡拉膠多糖硫酸酯K,的雞胚毒性實驗a.配制30000ug/ml的卡拉膠多糖硫酸酯Id的藥物制劑溶液。同時配制5000ug/ml金剛垸胺藥物制劑溶液。按5倍比例逐次稀釋，過濾除菌。每胚蛋尿囊腔注入0.5ml試樣。每種試樣實驗5個胚蛋。b.將上述雞胚于37t恒溫孵育。連續(xù)觀察雞胚死亡或發(fā)育情況。接種后24小時內(nèi)死亡的雞胚量為非特異性死亡，不包括在統(tǒng)計數(shù)據(jù)內(nèi)。實驗觀察到卡拉膠多糖硫酸酯Kt的藥物用量達3000ug/胚蛋時，雞胚出現(xiàn)致死現(xiàn)象。ld半致死量La。為9706yg/胚蛋。而對照藥物金剛烷胺的半致死量L"。為1866yg/胚蛋。在給藥量小于2000"g/胚蛋時，未觀察到Id對雞胚發(fā)育有不良影響，在實驗胚蛋發(fā)育成小雞后，也未觀察到小雞生長有異?，F(xiàn)象。實驗表明，K對雞胚發(fā)育毒性極低。c.配制10000yg/mlId和5000yg/ml金剛烷胺混合試樣，按5倍比例逐級稀釋，過濾除菌。進行9日齡胚蛋藥物協(xié)同毒性實驗。發(fā)現(xiàn)雞胚致死的最低藥物濃度為Id2000ng/胚蛋和金剛烷胺1000yg/胚蛋；混合藥物的半致死濃度為LDs。為Id7386.86ug/胚蛋和金剛烷胺1866ug/胚蛋?；旌纤幬锏亩拘灾饕獊碜越饎偼榘?，未觀察到二種藥物毒性疊加現(xiàn)象。實施例12卡拉膠多糖硫酸酯K3的小鼠毒性實驗用生理鹽水配制60000ug/ml的K3溶液，過濾除菌。取18—20克小鼠采用灌胃方式給藥，考察K3對小鼠的毒性。每日分上午、下午間隔8小時灌胃，每次灌藥0.5ml。連續(xù)灌藥7天未觀察到小鼠致死，也未觀察到小鼠內(nèi)臟異?，F(xiàn)象和其他異?，F(xiàn)象。取18—20克小鼠采用滴鼻方式給藥。給藥量120ug/d'kg，分上午、下午間隔8小時給藥。連續(xù)給藥7天，未觀察到小鼠致死，也未觀察到小鼠其他異?，F(xiàn)象。實施例13a-D-(l—6)-葡聚糖硫酸酯抗流感病毒的藥效研究a.按實施例4的方法制備a-D-(1—6)-葡聚糖硫酸酯樣品L,。樣品L的平均分子量約45000，單糖硫酸根取代度2.13。配制5000"g/mlLi藥物制劑。同時配制200011g/ml的金剛烷胺(或病毒唑)藥物制劑為對照藥物。按5倍比例逐次稀釋，過濾滅菌，制成一系列不同濃度的供試樣品。b.取中國國家流感中心提供的A型流感病毒(H凡和H美)和B型流感病毒毒株，分別感染雞胚尿囊腔，37'C恒溫孵育。3天后，取雞胚尿囊腔液，進行病毒濃度測定。配制病毒濃度為均為100TCID的A型和B型流感病毒試樣。c.取9日齡雞胚蛋，迅速將上述步驟a、b制備的藥物試樣和病毒試樣先后注入胚蛋，每胚蛋0.2ml。每種藥物濃度試驗使用5個胚蛋。同時設定病毒陽性對照組和生理鹽水陰性對照組。37'C恒溫孵育，連續(xù)3天觀察雞胚存活情況。d.經(jīng)步驟c處理的胚蛋孵育3天后，置于4'C冰箱中過夜。次日收取胚蛋尿囊腔液，進行血凝實驗，測定病毒濃度。實驗結(jié)果(表6和表7)表明cc-D-(1—6)-葡聚糖硫酸酯L具有明顯的抗流感病毒活性，對H凡病毒的半數(shù)抑制病毒的濃度為15.61ug/胚蛋，對H美病毒的半數(shù)抑制病毒的濃度為12.60ng/胚蛋，對B型流感病毒的半數(shù)抑制病毒的濃度為8.75ug/胚蛋。表6a-D-(l—6)-葡聚糖硫酸酯L和金剛烷胺抗流感病毒HA血凝實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表7cct-D-(l—6)-葡聚糖硫酸酯L抗B型流感病毒的藥效病毒唑L+病毒唑ECs。Ug/胚蛋)8.7512.685.71+9.69實施例14a-D-(1—6)-葡聚糖硫酸酯L抗流感病毒H^鼠肺適應株藥效研究a.配制5000ug/ml的a-D-(1—6)-葡聚糖硫酸酯L,制劑試樣。配制2000ug/ml病毒唑藥物制劑試樣。按4倍比例逐次稀釋，制成一系列試樣。病毒唑為對照藥物。b.按實施例10步驟d實施。c.取18-20g小鼠，先感染病毒，2h后分別通過口服或滴鼻方式給藥。每天給藥兩次，給藥量為120tig/d'kg，連續(xù)給藥7天。病毒唑為對照藥物。7天后處死小鼠，測定小鼠肺變指數(shù)。a-D-(1—6)-葡聚糖硫酸酯L通過滴鼻方式給藥，其肺變指數(shù)與陰性對照組相近，說明抗病毒效果明顯，而口服方式給藥效果不太顯著(見表8)。表8a-D-(l—6)-葡聚糖硫酸酯L抗流感病毒鼠肺適應株的藥效比較空白陰性對照病毒陽性對照病毒唑滴鼻a-D-(l—6)-葡聚糖硫酸酯滴鼻□月艮給藥劑量Pg/dkg120120120肺變指數(shù)％0.6860.8500.8220.6830.797按實施例12所述方法，考察a-D-(1—6)-葡聚糖硫酸酯L對小鼠的毒性。采用灌胃方式給藥和采用滴鼻方式給藥，連續(xù)給藥7天均未觀察到小鼠致死，也未觀察到小鼠內(nèi)臟異?，F(xiàn)象和其他異常現(xiàn)象，說明a-D-(1—6)-葡聚糖硫酸酯L對小鼠的毒性極小。實施例15紫菜多糖硫酸酯的抗流感病毒的藥效研究a.將由實施例5得到的紫菜多糖硫酸酯ZSO(平均分子量為60000，單糖硫酸根取代度為0.50)和紫菜多糖硫酸酯ZSS(平均分子量為90000，單糖硫酸根取代度為1.57)配制成5000"g/ml藥物制劑試樣。配制金剛烷胺對照藥物制劑試樣，濃度為2000iig/ml。上述試樣均按2倍比例逐次稀釋，過濾除菌，制成一系列不同濃度試樣。b.按實施例13步驟b，制備A型流感病毒(H凡禾卩H3N2)與B型流感病毒試樣。進行病毒濃度測定，配制病毒濃度為IOOTCID的病毒試樣。c.按實施例13步驟c實施。d.經(jīng)步驟c處理的胚蛋孵育3天后，置于4。C冰箱過夜。次日收取胚蛋尿囊腔液，進行血凝實驗，測定病毒濃度。紫菜多糖硫酸酯ZSO具有一定抗H凡病毒活性，EG。約28.9"g/胚蛋。紫菜多糖硫酸酯ZSS具有較強的抗H凡病毒活性。經(jīng)硫酸酯化后，ZSS樣品的EC5。為13.lPg/胚蛋，表明硫酸酯化后提高單糖硫酸根取代度有助于提高抗H凡流感病毒的活性。紫菜多糖硫酸酯ZSS具有較強的抗A型流感病毒H具和B型流感病毒的藥效。在每胚蛋用藥量為62.5ug/胚蛋時，對H具和B型流感病毒的抑制率分別達到51.40%和68.75%(見表9)。表9a紫菜多糖硫酸酯ZSS抗流感病毒H,N,的血凝實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表9b紫菜多糖硫酸酯ZSS抗流感病毒H3N2的血凝實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表9c紫菜多糖硫酸酯ZSS抗B型流感病毒的血凝實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>e.按照實施例11的步驟進行ZSS的雞胚毒性試驗。ZSS對雞胚的半數(shù)致死量LD50為2122.49ng/胚蛋，表明ZSS對雞胚發(fā)育毒性極小。權(quán)利要求1.分子量范圍為1000至100000，單糖硫酸根取代度為0.5-3.0的壇紫菜多糖硫酸酯，作為制備抗流感病毒藥物的應用。2按照權(quán)利要求1所述的壇紫菜多糖硫酸酯作為制備抗流感病毒藥物的應用，其特征在于所述壇紫菜多糖硫酸酯平均分子量為60000，單糖硫酸根取代度為0.50。3按照權(quán)利要求1所述的壇紫菜多糖硫酸酯作為制備抗流感病毒藥物的應用，其特征在于所述壇紫菜多糖硫酸酯平均分子量為90000，單糖硫酸根取代度為1.57。4按照權(quán)利要求1所述的壇紫菜多糖硫酸酯作為制備抗流感病毒藥物的應用，其特征在于所述的流感病毒為A型流感病毒。5按照權(quán)利要求1所述的壇紫菜多糖硫酸酯作為制備抗流感病毒藥物的應用，其特征在于所述的流感病毒為B型流感病毒。6按照權(quán)利要求1所述的壇紫菜多糖硫酸酯作為制備抗流感病毒藥物的應用，其特征在于所述的多糖硫酸酯單獨制成藥劑。7照權(quán)利要求1所述的壇紫菜多糖硫酸酯作為制備抗流感病毒藥物的應用，其特征在于所述的壇紫菜多糖硫酸酯與抗流感藥物配伍制成藥劑。8按照權(quán)利要求7所述的壇紫菜多糖硫酸酯作為制備抗流感病毒藥物的應用，其特征在于:所述的壇紫菜多糖硫酸酯與金剛垸胺或病毒唑按重量比1:0.01一l:100形成復方。9照權(quán)利要求8所述的壇紫菜多糖硫酸酯作為制備抗流感病毒藥物的應用，其特征在于:所述的壇紫菜多糖硫酸酯與金剛垸胺或病毒唑按重量比5:2形成復方。全文摘要本發(fā)明屬于合成藥物學領域，涉及多糖硫酸酯作為制備抗流感病毒藥物的應用。本發(fā)明公開了分子量范圍為1000至100000，單糖硫酸根取代度為0.5-3.0的壇紫菜多糖硫酸酯，作為制備抗流感病毒藥物的應用，制備了平均分子量范圍為1000-100000，單糖硫酸根取代度0.5-3.0的紫菜多糖硫酸酯的實用藥物劑型，確定了這些多糖硫酸酯具有單獨或與金剛烷胺、病毒唑等現(xiàn)有抗流感藥物組成復方后協(xié)同抗A型和B型流感病毒的用途。文檔編號A61P31/16GK101385740SQ200810166420公開日2009年3月18日申請日期2003年5月26日優(yōu)先權(quán)日2003年5月26日發(fā)明者春孟,石賢愛,郭養(yǎng)浩申請人:福州大學