專利名稱：：一種從茶葉新鮮或干葉中提取純化egcg的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及從植物中分離純化功能性成分的一種方法，具體是從茶葉的新鮮或干燥葉中提取純化(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯。
背景技術：
：茶葉的基源為山茶科山茶屬植物茶[Camdliasinensis(L.)O.Ktze]的葉。茶葉含有多種化學成分，類型涉及茶多酚類、生物堿類、茶氨基酸類、脂肪類、酶類、核苷酸類、糖類、礦物質(zhì)元素、揮發(fā)性物質(zhì)(《中華本草》，1999)。茶多酚約占茶葉干重的25%,主要由兒茶素、黃酮(黃酮醇)、花色素和酚酸(縮酚酸)四大類化合物組成。其中兒茶素類是茶多酚的主體組分，約占茶多酚總量的80%左右(茶葉生物化學(第二版)，1998)。茶多酚具有較強的抗氧化作用(趙保路，2002)和廣泛的藥理功效(劉學銘，1998),特別是其中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG，結構見圖l)以其獨特的分子結構而在抗氧化、抗突變、抗腫瘤等方面占有重要的地位(陳宗懋，2003)，但由于茶葉中多酚主要由水溶性的縮合鞣質(zhì)組成，它們化學性質(zhì)不穩(wěn)定，分子結構之間差別往往僅是碳構型的差別，分離工作十分困難(史國放，2001)。目前，在分離茶多酚單體-(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的過程中,用葡聚糖凝膠柱層析，常需結合其他方法如重結晶法、逆流分配法、高壓液相制備法等才可得到單體(李秉正，1992;周宏志等，2000)。因為在回收水時需較高溫度，為使茶多酚不被氧化,通常需要采用凍干回收,所以用該法制備大量單體不經(jīng)濟,而且周期長,生產(chǎn)效率低。采用高壓液相法也常因需結合其他方法，成本高,回收困難,不適合工業(yè)化生產(chǎn)。高速逆流色譜法可很好地將兒茶素單體分開,但目前只能得到少量兒茶素單體,如果進行工業(yè)化生產(chǎn)，還要進一步改進分離技術,而且其設備投資也十分大(戴軍，1999;杜琪珍等，1997)。綜上所述，在利用植物資源分離純化(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的過程中，主要的影響因素在于分離過程中普遍存在(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的分離效率低下、回收過程漫長，使得成本升高。因此，有必要尋找一種簡便安全經(jīng)濟高效地提取純化(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的方法。本發(fā)明旨在建立一種通過多種現(xiàn)代分離純化技術相結合的方法，實現(xiàn)簡單快速、損失少的分離純化(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種以茶葉新鮮或者干燥葉為原料，通過采用索氏提取器萃取技術、重結晶技術、硅膠正相分配層析技術以及低溫重結晶技術相結合，從而大量、快速獲得高純度(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的工藝方法。本發(fā)明的目的是通過以下方案來達到的以茶葉干燥葉為原料，采用索氏提取器萃取技術、重結晶技術、硅膠正相分配層析技術以及低溫重結晶技術相結合，得到純度均達到99%以上的(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯。上述的(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯提取純化方法，其特征在于，取一定量的干燥茶葉，索氏提取器萃取去雜所用的溶劑為氯仿，體積為固體質(zhì)量的l倍，連續(xù)萃取48h。索氏提取器萃取所用的溶劑為乙酸乙酯，體積為固體質(zhì)量的l倍，連續(xù)萃取48h。濃縮索氏提取器回流萃取的乙酸乙酯到原體積的一半，加3-5倍量氯仿，有(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯粗品析出。所用硅膠為100-150目大孔硅膠，該方法中硅膠正相分配層析步驟采用上含水乙醚硅膠分配柱，保留液面，將索氏提取器回流萃取(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的粗品溶含水乙醚，上樣量硅膠質(zhì)量的1/10-1/20，以流速為每小時68BV，每份1/41/2BV。用高壓液相檢測洗脫液成分，合并相同部分餾份，HPLC法分析條件色譜柱,ODS柱(4.0x150mm,5um);檢測波長280nm;柱溫箱40°C;流動相,乙晴乙酸乙酯0.05磷酸(12:2:86);流速,lmL/min。餾份再經(jīng)少量無水硫酸鈉干燥過夜，45'C以下回收，得(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯粗品。重結晶所用的溶劑除乙醚外，還包括二氯甲垸、氯仿、石油醚，低溫析晶溫度為-10。C4。C。提取率為1.0%，純度為99.0%。實施例2稱取新鮮茶葉10kg(干重為2kg)，干燥后用1倍體積氯仿在索氏提取器中連續(xù)萃取48h，再用200mL乙酸乙酯回流48h，過濾乙酸乙酯溶液，用無水硫酸鈉干燥過夜，濃縮乙酸乙酯到原體積的一半，'加3-5倍量干燥氯仿有白色沉淀析出,用濾紙過濾，用少量千燥氯仿沖洗，干燥得EGCG粗品(約150g)。100g(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯粗品溶于2000mL含水乙醚，上2000g含水乙醚硅膠分配柱(內(nèi)徑20cm，高150cm)，流速每小時IOL，500mL—個餾份，合并前2.5L餾份。餾份經(jīng)少量無水硫酸鈉干燥過夜，45"以下回收得樣品再溶于含水乙醚，上2000g含水乙醚硅膠分配柱(內(nèi)徑20cm,高150cm)，流速每小時IOL，500mL—個餾份，合并前2.5L餾份。餾份再經(jīng)少量無水硫酸鈉干燥過夜，45'C以下回收，得若干瓶白色粉末狀物質(zhì)，共約10g。每個餾份用高壓液相檢測，合并相同部分。HPLC法分析條件取其1mg溶于1mL蒸餾水，過微孔濾膜(0.45Pm)，超聲溶解，進樣量20uL;日本島津色譜柱,ODS柱(4.0x150mm,5ym);檢測波長280nm;柱溫箱40。C;流動相,乙晴乙酸乙酯0.05磷酸(12:2:86);流速,lmL/min。白色粉末狀物質(zhì)在乙醚中在4'C結晶，獲得(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯單體析出。提取率為0.985%，純度為98.5%。本試驗中所用到的標準品購自Sigma公司。結果定量檢測分析采用下表條件<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>圖1是(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯分子式圖。權利要求1.一種從茶葉中提取純化(-)表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯(EGCG)的方法，其主要特征在于茶葉經(jīng)采用索氏提取器萃取技術、重結晶技術、硅膠正相分配層析技術以及低溫重結晶技術相結合，得(-)表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸純度大于99％的純品。2.按照權利要求1所述的茶葉，其特征在于茶葉主要來源于各品種茶葉植株的新鮮或者干燥葉。3.按照權利要求l所述的索氏提取器萃取技術，其特征在于索氏提取器萃取去雜所用的溶劑為氯仿，體積為固體質(zhì)量的l倍，連續(xù)萃取48h。采用索氏提取器氯仿回流萃取時，可以高效去除葉綠素等脂溶性雜質(zhì)，同時節(jié)省溶劑。索氏提取器萃取所用的溶劑為乙酸乙酯，體積為固體質(zhì)量的1倍，連續(xù)回流萃取48h。采用索氏提取器乙酸乙酯回流萃取時，可以高效萃取(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯等茶多酚，同時節(jié)省溶劑。4.按照權利要求l所述的重結晶技術，其特征在于濃縮索氏提取器回流萃取的乙酸乙酯到原體積的一半，加3-5倍量氯仿，有(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯粗品析出。5.按照權利要求1所述的硅膠正相分配層析技術，其特征在于所用硅膠為100-150目大孔硅膠，該方法中硅膠正相分配層析步驟采用上含水乙醚硅膠正相分配柱，保留液面，將索氏提取器回流萃取(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的粗品溶含水乙醚，上樣量為硅膠質(zhì)量的1/10-1/20，以流速為每小時68BV，每份1/41/2BV。用高壓液相檢測洗脫液成分，合并相同部分餾份，HPLC法分析條件色譜柱，ODS柱(4.0x150mm，5um);檢測波長280nm;柱溫箱40°C;流動相,乙晴乙酸乙酯0.05磷酸(12:2:86);流速,lmL/min。餾份再經(jīng)少量無水硫酸鈉干燥過夜，45。C以下回收，得(-)表沒食子兒條素-3-0-沒食子酸酯粗品。6.按照權利要求1所述的低溫析晶和重結晶技術，其特征在于重結晶所用的溶劑除乙醚外，還包括二氯甲垸、四氯甲烷、氯仿、石油醚，低溫析晶溫度為-10"C4'C。全文摘要本發(fā)明涉及一種中草藥功能性成分的提取純化方法，目的是要提供一種簡便安全經(jīng)濟高效地從茶葉中提取純化得到單體化合物(-)表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯(EGCG)的方法，所采取的技術方案是以茶葉干燥葉為原料，采用索氏提取器萃取技術、重結晶技術、硅膠正相分配層析技術以及低溫重結晶技術相結合，得到純度均達到99％以上的(-)表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯，其提取率為1％以上。本發(fā)明所用原料為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大都被廢棄的新鮮或者干燥茶葉，既不破壞植物生態(tài)平衡、不影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，又能得到高純度的茶葉功能性成分。而且該方法經(jīng)提取、初步除雜及再純化，簡單易行，目標化合物損失少。適用于工業(yè)應用，對產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。文檔編號A61K36/185GK101391990SQ20081013707公開日2009年3月25日申請日期2008年9月9日優(yōu)先權日2008年9月9日發(fā)明者付玉杰,姜守剛,宇張,張寶友,李慶勇,琢汪,祖元剛,馬瑞萍申請人:東北林業(yè)大學;祖元剛