專利名稱：：一種結(jié)核菌hsp和腫瘤裂解物的混合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和治療腫瘤的熱休克蛋白和腫瘤細(xì)胞裂解物的混合物。
背景技術(shù)：
：1974年Tisskrs利用SDS凝膠電泳技術(shù)首次證明,熱應(yīng)激能誘導(dǎo)果蠅體內(nèi)產(chǎn)生一組蛋白質(zhì)，他把因環(huán)境溫度升高誘導(dǎo)細(xì)胞合成的這組蛋白質(zhì)，稱為熱休克蛋白(heatshockprotein,HSP)。現(xiàn)已證明,除熱應(yīng)激外，其他一些應(yīng)激如缺氧、重金屬中毒、氧化應(yīng)激、感染、饑餓、創(chuàng)傷、代謝毒物等條件下,也可激活HSP基因,合成熱休克蛋白。HSP(heatshockprotein)是廣泛存在于原核和真核生物細(xì)胞中的一類高度保守的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、基因轉(zhuǎn)錄等方面發(fā)揮重要作用。按照分子量大小，HSPs分為HSP90(83卯kD)家族、HSP70(6678kD)家族、HSP60家族及小HSP家族(sHSP)。此外還有分子量為100110kD而特性不同于上述家族的大分子HSPs,HSPs所共有的特性為:①應(yīng)激狀態(tài)下,其表達(dá)顯著增加；②在原核細(xì)胞與真核細(xì)胞中均表達(dá),具有高度保守的氨基酸序列及其編碼基因；如原核生物和真核生物的HSP70有40n/。60。/。的同源性，在不同真核生物中，其同源性為60%78%。單純的腫瘤抗原的抗原性較弱是目前腫瘤免疫治療中主要的難題之一。有人應(yīng)用重組的人HSP與全腫瘤細(xì)胞裂解物上清混合后用于抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究(FengZH,HuangB,ZhangGM，etal.Investigationontheeffectofpeptidesmixturefromtumorcellsinducinganti-tumorspecificimmuneresponse.Scinceinchina,2002(45):4，361-69.)，取得了較好的效果。結(jié)核菌HSP與人HSP同源性較高，且具有人HSP的諸多免疫佐劑特點(diǎn)，近年倍受關(guān)注。大量的研究表明結(jié)核菌熱休克蛋白(heatshockprotein,HSP)65及70除能夠具有交叉遞呈抗原功能外，還能夠與細(xì)胞表面CD40,TLR2/4及CCR5受體結(jié)合，通過多種途徑誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫及體液免疫，是比較有應(yīng)用前景的抗月中瘤免疫佐齊U(A.A.A.AseaandA.DeMaio(eds.)，HeatShockProteins:PotentMediatorsofInflammationandImmunity,159-172..2007Springer),有望替代人HSP與全腫瘤細(xì)胞裂解物組合后用于抗腫瘤方面的應(yīng)用。從人類及動(dòng)物的組織細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞膜可提取腫瘤細(xì)胞裂解物作為腫瘤疫苗。獲取方法為破碎方法，常用的有:冷熱交替法、反復(fù)凍融法、超聲破碎法、玻漓勻漿法、自溶法和酶處理法。傳純的腫瘤細(xì)胞疫苗就是通過自體或同種異體腫瘤細(xì)胞或其粗提物，經(jīng)過物理、化學(xué)或生物手段處理后保留其免疫原性，但這種疫苗的免疫原性弱，難以引起免疫應(yīng)答，在這種疫苗中加入佐劑如卡介苗(BCG),短小棒狀桿茵或弗氏住劑以增強(qiáng)其免疫原性，效果仍不理想。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何更好地增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞裂解物中腫瘤抗原的免疫活性，以達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的。采用的技術(shù)方案是用結(jié)核菌HSP來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞裂解物中腫瘤抗原的免疫活性。方案如下1、腫瘤細(xì)胞裂解物的獲得目前獲得腫瘤細(xì)胞裂解物的方法有很多，概括起來主要有反復(fù)凍融、超聲裂解、細(xì)胞裂解液裂解等制備方法。本研究采用的是反復(fù)凍融法來制備腫瘤細(xì)胞裂解物。方法大致為以-7(TC冷凍、37'C溶解為一個(gè)循環(huán)，反復(fù)進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色驗(yàn)證細(xì)胞裂解破壞情況。裂解完全的細(xì)胞裂解物可用于后續(xù)的研究。2、熱休克蛋白的獲得結(jié)核菌HSP65蛋白由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室提供。本發(fā)明中，我們應(yīng)用基因工程方法獲得結(jié)核菌HSP70蛋白。研究中所應(yīng)用的HSP65、HSP70蛋白是結(jié)核桿菌來源的。同目前普遍應(yīng)用的人熱休克蛋白比較具有更好的抗原性。它作為一種外來的抗原物質(zhì)將可以發(fā)揮更好的免疫活化作用和抗原提呈作用。3、利用腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65、HSP70蛋白抗腫瘤1)腫瘤細(xì)胞裂解物的制備將生長狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞用高壓后的Nacl制成細(xì)胞懸液，于-70。C和37'C反復(fù)凍融5次后(凍15min,融5min,其間震蕩混勻)，用臺(tái)酚藍(lán)染色以確定裂解情況。100%細(xì)胞藍(lán)染說明細(xì)胞已經(jīng)全部裂解死亡，這種包含有全部腫瘤細(xì)胞裂解物的裂解混合液將直接應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2)全腫瘤細(xì)胞裂解物和HSP65、HSP70混合物的制備將制備好的全腫瘤細(xì)胞裂解物同人工合成的HSP65或HSP70混合，混合物制備后放于4'C備用。3)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)將全腫瘤細(xì)胞裂解物和HSP65、HSP70的混合物免疫B16黑色素瘤或Lewis肺癌荷瘤小鼠，免疫的時(shí)間點(diǎn)為荷瘤后的-7、1、8、15天，免疫部位為小鼠右后肢腹股溝，并同時(shí)設(shè)全腫瘤細(xì)胞裂解物、HSP65、HSP70、Nac傳對(duì)照組。通過觀察繪制腫瘤生長曲線、觀察記錄小鼠生存期來判斷藥物的抑瘤作用。本發(fā)明取得的效果通過觀察繪制腫瘤生長曲線和觀察記錄小鼠生存期，本研究發(fā)現(xiàn):相應(yīng)的全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65或HSP70可以顯著的抑制B16黑色素瘤和Lewis肺癌細(xì)胞瘤的生長，同時(shí)顯著延長荷瘤小鼠的生存期。這些結(jié)果證明相應(yīng)的全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65、HSP70具有抗B16黑色素瘤和Lewis肺癌的作用。本發(fā)明的新穎性和創(chuàng)造性目前的很多抗腫瘤實(shí)驗(yàn)都把研究的重點(diǎn)集中在腫瘤細(xì)胞裂解物和熱休克蛋白上，但將二者結(jié)合起來的研究思路還不多見。而將包含有全部腫瘤細(xì)胞裂解物的裂解混合液同結(jié)核桿菌來源的熱休克蛋白HSP65、HSP70在體外直接混合進(jìn)行抗腫瘤研究的方法，在國內(nèi)外更是少見報(bào)道。馮作化等將提純得到的腫瘤細(xì)胞抗原肽和HSP70在體外混合后發(fā)現(xiàn)這種混合物具有明顯的抗H22肝癌的作用。MichaelW.Graner等也發(fā)現(xiàn)提純得到腫瘤細(xì)胞裂解物中的腫瘤抗原-熱休克蛋白復(fù)合物可以顯著抑制12Bl淋巴細(xì)胞瘤和B16黑色素細(xì)胞瘤的生長。上述的兩項(xiàng)研究是和本研究最為接近的已知研究手段。本研究無需進(jìn)行腫瘤抗原肽的復(fù)雜提純，通過簡易的反復(fù)凍融的方法所得到的全腫瘤細(xì)胞裂解物就可以和HSP65在體外直接混合使用。因此，相比上面的方法更為簡單易行。而且我們研究中用到的全腫瘤細(xì)胞裂解物中包含有更多的腫瘤抗原，實(shí)驗(yàn)證明它比單純的腫瘤細(xì)胞裂解上清中的抗原具有更好的活化免疫系統(tǒng)、抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。此外我們所用的HSP65、HSP70皆為結(jié)核桿菌來源。很都研究證明，同目前普遍應(yīng)用的人熱休克蛋白比較，結(jié)核桿菌來源的HSP65、HSP70具有更強(qiáng)的交叉提呈抗原的能力，可以更好的將外源性抗原引導(dǎo)入Mffl類抗原提呈途徑，進(jìn)而可以有效的活化抗腫瘤免疫細(xì)胞、發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。以上這些新穎之處和主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)，保證了本研究比起前面的幾種研究，將具有更好的抗腫瘤治療效果和臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明中的名詞術(shù)語"腫瘤"腫瘤(turaor)和癌癥(cancer)在本說明書中可以互換使用，具有相同的含義。癌癥細(xì)胞不受生長控制，可侵襲周圍的組織并形成轉(zhuǎn)移(metastasize),危及個(gè)體的生命。腫瘤包括實(shí)體瘤(solidt,rs/malignancies)、軟組織肉瘤(softtissuesarcomas)禾卩髓樣或淋巴樣系統(tǒng)(myeloidorlymphoidsystems)的腫瘤。這些腫瘤是食道癌、膽囊癌、膀胱癌(如transitional,squamouscellcarcinoma)、乳腺癌(如ductalandlobularadenocarcinoma)、結(jié)腸癌(如epithelialadenocarcinoma)、結(jié)直腸癌、腎上腺皮質(zhì)腫瘤、腎癌(如renalcellcarcinoma)、肝癌(如h印atoma，cholangiocarcinoma)、肺癌(如smallandlargecelladenocarcinomas,squamouscellcarcinoma,bronchoalveolarcarcinoma，nonsmallcelllungcancer)、卵巢癌(如epithelialadenocarcinoma,ovarianfolliclecancer,ovariangermcellcancer)、子宮頸癌、子宮癌、endometrialcancer、陰道癌、cancerofthevulva、胰腺癌(如pancreaticductaladenocarcinomas)、直腸癌、前列腺癌(如prostaticadenocarcinoma)、胃癌、皮膚癌(如malignantmelanoma,tumorprogressionofhumanskinkeratinocytes,squamouscellcarcinoma,basalcellcarcinoma,hemangiopericytoma)、腦月中瘤(如asneuroblastomas，astrocyticbraintumors,astrocytoma,gliomas,oligodendroglioma,ependymoma,neuroblastoma,medulloblastomas，metastatictumorcellinvasionofthecentralnervoussystem)、mesothelioma^Kaposi'ssarcoma、骨腫瘤(如osteomas)、肉瘤(如fibrosarcoma,osteosarcoma)、陰莖癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、睪丸癌、甲狀腺癌、trophoblasticneoplasms,rhabdomyosarcoma,teratocarcinoma,Wilms'tumor。月中瘤也J旨淋巴樣和髓樣造血系統(tǒng)腫瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。這些疾病包括急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphocyticleukemia)、急性非淋巴細(xì)胞白血病(acutenonl卿hocyticleukemia),慢性淋巴細(xì)胞白血病(chroniclymphocyticleukemia)、慢性髓樣細(xì)胞白血病(chronicmyelocyticleukemia)、T細(xì)胞白血病、毛細(xì)胞白血病、急性髓性白血病(acutemyeloidleukemia)、紅白血病、慢性粒細(xì)胞白血病(chronicgranulocyticleukemia)、包括霍杰金氏淋巴瘤、霍杰金氏病氏淋巴瘤、acutemyelogenousleukemia,acutemyelomonocyticleukemia、急性淋巴母細(xì)胞白血病、淋巴肉瘤細(xì)胞白血病、多形核細(xì)胞白血病(prolymphocyticleukemia,PLL),B細(xì)胞大細(xì)胞淋巴瘤、惡性淋巴瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(cell-acutelymphocyticleukemia,B-ALL)、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(B-cellchroniclymphocyticleukemia,B-CLL)、小淋巴細(xì)胞淋巴榴、B細(xì)胞原淋巴細(xì)胞性白血病(B-cellprolymphocyticleukemia)、蓬狀細(xì)胞淋巴瘤(Mantlecellly即homa)、濾泡狀淋巴瘤(Follicularlyraphoma)、淋巴結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(ExtranodalmarginalzoneB-celllymphomaofMALTtype),淋巴結(jié)邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(NodalmarginalzoneB-celllymphoma,脾邊緣區(qū)B淋巴瘤(Splenicmarginalzonelymphoma),槳細(xì)胞瘤/漿細(xì)胞骨髓瘤(Plasmacytoma/plasmacellmyeloma)、彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤(DiffuselargeB-cellly即homa)、Mediastinal(thymic)largeBcelllymphoma,血管內(nèi)大B細(xì)胞淋巴瘤(intravascularlargeB-celllymphoma)、原發(fā)性滲出性淋巴瘤(primaryeffusionly即homa)、伯基特淋巴瘤(Burkitt'sly卿homa)、多發(fā)性骨髓瘤、皮膚B細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性濾泡性皮膚B細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞非霍杰金氏病氏淋巴瘤、lymphoplasmacytoidlymphoma,mucosa-associatedlymphoidtissue(MALT)lymphoma、原發(fā)性甲狀腺淋巴瘤、intravascularmalignantlymphomatosis、皮細(xì)胞淋巴瘤、intragraftangiotropiclarge-celll卿homa^"腫瘤細(xì)胞"在本專利中，腫瘤細(xì)胞包括自體腫瘤細(xì)胞、同種異體腫瘤細(xì)胞、異體腫瘤細(xì)胞，這些腫瘤細(xì)胞可以是個(gè)體的原發(fā)腫瘤的腫瘤細(xì)胞、繼發(fā)腫瘤的腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)移癌的腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞。"腫瘤細(xì)胞裂解物"腫瘤細(xì)胞裂解物是指將腫瘤細(xì)胞破碎制備的裂解物。破碎腫瘤細(xì)胞的方法包括但不限于，反復(fù)凍融，超聲處理，機(jī)械破碎等。"基因修飾的腫瘤細(xì)胞"用來修飾腫瘤細(xì)胞的基因包括但不限于編碼MHC分子、細(xì)胞因子、協(xié)同刺激分子和腫瘤抗原的編碼基因，這些基因可以是全長的編碼基因，也可以是全長編碼基因的一部分。轉(zhuǎn)基因的方法包括但不限于化學(xué)、物理方法和病毒載體介導(dǎo)的方法，如磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、電轉(zhuǎn)移法(electroporation)、壓力介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(pressuremediatedtransfer)。可用于轉(zhuǎn)基因的載體病毒有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)載體(adenovirus-associatedvectors,MV)、皰疹病毒和痘病毒等。此外，編碼MHC分子、細(xì)胞因子、協(xié)同刺激分子和腫瘤抗原的的DNA和RNA也可用來轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞。和未修飾的腫瘤細(xì)胞相比，基因修飾的腫瘤細(xì)胞可能獲得更強(qiáng)免疫原性，更有效地激發(fā)抗腫瘤的免疫應(yīng)答。"MHC分子"MHC分子是主要組織相容復(fù)合體(majorhistoco即atibiltiycomplex,MHC)基因編碼的蛋白類分子。MHC分子包括MHCI類分子和MHCII類分子。將MHC分子的編碼基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞可能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性(immunogenity)。'"細(xì)胞因子"細(xì)胞因子(Cytokine)是具有免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白類分子?？捎糜谛揎椖[瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子包括但不限于IL-1,IL-2，IL-3，IL-4，IL-5,IL-6,IL-7，IL-8,IL-9,IL-IO，IL-ll，IL-12,IL-13,IL-14,IL-15,IL-16，IL-17，IL-18,IL-28，IL-29，G-CSF,GM-CSF,干擾素a，干擾素p，千擾素y，腫瘤細(xì)胞壞死因子和各種趨化因子。"協(xié)同刺激分子"協(xié)同刺激分子(co-stiraulaorymolecules)是表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞(antigenpresentingcells,APC)或腫瘤細(xì)胞表面的蛋白類分子，在免疫應(yīng)答的過程中提供激活CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的第二激活信號(hào)。將協(xié)同刺激分子的編碼基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞可能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性(i咖unogenity)?？捎糜谛揎椖[瘤細(xì)胞的協(xié)同剌激分子的包括但不限于CD1a,CDlb,CDlc，CD2,CD9,CD10,CDlla,CDUb,CDllc，CD19,CD20,CD21,CD22'CD23,CD24,CD25,CD27,CD28，CD40,CD70,CD80，CD83,CD86,CD137,LFA-1,LFA-2,LFA-3,VLA-1，VCAM-l,ICAM-2,VCAM-2和趨化因子受體等。"TOLL樣受體激動(dòng)劑"CpGODN是Toll樣受體(Tolllikerec印tors)9的激動(dòng)劑。Toll樣受體是一個(gè)識(shí)別微生物來源分子結(jié)構(gòu)(病原體相關(guān)分子模型)的受體家族。表達(dá)Toll樣受體的免疫細(xì)胞通過結(jié)合這種病原體相關(guān)分子模型而被激活。在人類，Toll樣受體家族共有l(wèi)l個(gè)成員。Toll樣受體可以識(shí)別很多病原微生物來源的物質(zhì)，這些物質(zhì)都是TOLL樣受體激動(dòng)劑。如，TLR4可以識(shí)別細(xì)菌脂多糖(LPS);TLR2和TLR6的雙體可以識(shí)別脂磷壁酸和雙酰脂肽TLR2和TLR1的雙體可以識(shí)別三酰脂肽；TLR9可以識(shí)別合成的或來源于細(xì)菌和病毒含CpG寡核苷酸(CpGODN);Imiquimod也是TLR9的激動(dòng)劑；TLR5可以識(shí)別細(xì)菌鞭毛蛋白；TLR2和TLR6的雙體還可以識(shí)別酵母多糖；TLR4可以識(shí)別呼吸道合胞病毒F蛋白；TLR3可以識(shí)別聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(polyIC),合成的或來源于病毒的雙鏈RNA;TLR7和TLR8可以識(shí)別單鏈病毒RNA;TLR4可以識(shí)別原蟲產(chǎn)物，如GPI錨定蛋白；TLR4還可以識(shí)別炎癥組織的產(chǎn)物，如HSP60和纖維原片段(FooY.Liew，etal.NegativeregulationoftolllikereceptormediatedimmuneresponsesNatureReviewsImmunology.Vol5，June2005，446-458)。已經(jīng)有研究證實(shí)，TLR9激動(dòng)劑可以激活天然免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)(ArthurM.Krieg.TherapeuticpotentialofToll-likerec印tor9activation.NatureReviewsDrugDiscovery,Vol5.June2006,471-484)。在人類的免疫系統(tǒng)中，B細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(pDCs)表達(dá)TLR9。含有CpG的寡核苷酸(CpG0DN)是TLR9的激動(dòng)劑(D.M.Klinman，ImmunotherapeuUcusesofCpGoligodeoxy加cleotides，428Nat.Rev.，Immunol.4(2004)249-258)。TLR9激動(dòng)劑可以被胞吞到細(xì)胞間隙而激活TLR9。在漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞中，TLR9激活可以啟始一個(gè)快速的天然免疫反應(yīng),其特征是分泌大量的促炎因子如IL-6,腫瘤壞死因子-a(TNFa)、1型干擾素(IFN-a/p)和干擾素誘導(dǎo)的趨化因子。通過干擾素依賴和干擾素非依賴兩條通路，此漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞可以繼發(fā)激活天然免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。通過TLR9的刺激，B細(xì)胞增強(qiáng)了對(duì)抗原刺激的敏感性，可以有效地分化成抗體分泌細(xì)胞。因此，TLR9的剌激有助于獲得性免疫應(yīng)答，特別是體液免疫應(yīng)答。通過TLR9激活的漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞可分泌IFNa,此IFNa可使?jié){細(xì)胞樣樹突細(xì)胞遷移聚集到淋巴結(jié)和其他周圍淋巴組織。在這些部位，此漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞可以激活未致敏的T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞，向CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞交叉提呈可溶性抗原交，促進(jìn)TH1型的CD4和CD8T細(xì)胞反應(yīng)。"藥物學(xué)可接受的載體"藥物學(xué)可接受的載體(phar腿ceuticallyacc印tablecarrier)是指一種或多種固體或液體的填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì)，該載體可以是有機(jī)的、無機(jī)的、天然的或合成的。該載體包括各種溶液、稀釋劑、溶劑、分散劑、脂質(zhì)體、乳化劑、抗菌劑、抗真菌劑、等滲的和延緩吸收的試劑等?？勺⑸溆玫妮d體包括水、生理鹽水、PBS緩沖液(phosphatebufferedsalinesolution),平衡鹽溶液、葡萄糖溶液、甘油和乳化劑和濕化劑等。乳化劑可包括水包油乳化劑(oil/wateremulsion)和油包水乳化劑(owater/oileraulsion)。"治療有效劑量"該治療有效劑量是指在應(yīng)用后，在個(gè)體后可刺激抗腫瘤免疫應(yīng)答，產(chǎn)生腫瘤治療效果的結(jié)核菌熱休克蛋白和腫瘤細(xì)胞裂解物的劑量。這個(gè)"劑量"的多少?zèng)Q定于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員應(yīng)知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，還要參考其他因素，包括并不限于個(gè)體的大小，健康情況和疾病的嚴(yán)重程度等。劑量范圍從lHg到100mg/針。為了達(dá)到理想的治療效果，本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員可以對(duì)此應(yīng)用劑量作調(diào)整，其劑量范圍可以是前述范圍的10倍到1000倍。結(jié)核菌熱休克蛋白和腫瘤裂解物的混合物中的腫瘤細(xì)胞裂解物的劑量是從含有自1Xl(f個(gè)腫瘤細(xì)胞到1X1(T個(gè)腫瘤細(xì)胞的范圍內(nèi)制備的腫瘤細(xì)胞裂解物。為了達(dá)到理想的治療效果，本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員可以對(duì)此腫瘤細(xì)胞裂解物的應(yīng)用劑量作調(diào)整，其劑量范圍可以是前述范圍的10倍到1000倍。"藥物組合物"藥物組合物(pharmaceuticalcomposition)指的是本發(fā)明中治療有效劑量的結(jié)核菌熱休克蛋白和腫瘤細(xì)胞裂解物的混合物與藥物學(xué)上可接受的載體組成的混合物。藥物組合物可以但不限于是水溶液、鹽溶液和粉劑。藥物組合物的應(yīng)用方式可以是經(jīng)腸外注射。本發(fā)明的注射劑藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的水溶液、非水溶液、分散劑、懸濁劑、乳劑。結(jié)核菌熱休克蛋白和腫瘤裂解物的混合物與藥物學(xué)上可接受的載體組成的混合物也可被制備成粉劑(Powder)。結(jié)核菌熱休克蛋白和腫瘤裂解物的混合物的粉劑可經(jīng)凍干或真空干燥的方法制備。在注射前，用無菌的注射用水或其它藥物學(xué)可接受的載體溶解。在一些情況下，為了延長本發(fā)明中結(jié)核菌熱休克蛋白和腫瘤裂解物的混合物的作用效果，藥物組合物可被處理于合適的持續(xù)釋放系統(tǒng)后應(yīng)用。本發(fā)明提供的結(jié)核菌熱休克蛋白和腫瘤裂解物的混合物也可和其它的抗腫瘤制劑聯(lián)合應(yīng)用，其方式是(l)結(jié)核菌熱休克蛋白和腫瘤裂解物的混合物和其它的抗腫瘤制劑在應(yīng)用前混合；(2)結(jié)核菌熱休克蛋白和腫瘤裂解物的混合物和其它的抗腫瘤制劑在不同的時(shí)間應(yīng)用；(3)結(jié)核菌熱休克蛋白和腫瘤裂解物的混合物和其它的抗腫瘤制劑在應(yīng)用前混合通過不同的給藥途徑應(yīng)用；(4)結(jié)核菌熱休克蛋白和腫瘤裂解物的混合物和其它的抗腫瘤制劑組成藥物組合物(pharmaceuticalcomposition)應(yīng)用。"抗腫瘤制劑"抗腫瘤制劑(anti-tumoragent)能治療腫瘤和/或激發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答的制劑，包括但不限于化療藥物，細(xì)胞因子，抗腫瘤抗體，表皮細(xì)胞生長因子受體(EGFR)-酪氨酸激酶(-TK)激活抑制劑，腫瘤細(xì)胞突變蛋白酪氨酸激酶抑制劑，腫瘤血管抑制劑，RNA干涉物，TLR激動(dòng)劑和非特異性免疫增強(qiáng)劑和等。"化療藥物"化療藥物是指用于腫瘤治療的化學(xué)藥物?；熕幬锇ǖ幌抻诘?、環(huán)磷酰胺、消瘤芥、鹽酸氮芥，卡氮芥、環(huán)乙亞硝脲、噻替派、馬利蘭、順鉑，亞硝脲類，5-氟脲嘧啶、阿糖胞苷、甲氨喋呤、巰基嘌呤、6-巰基嘌呤，羥基脲，阿霉素，表阿霉素，柔紅霉素，米托蒽醌，絲裂霉素，博采霉素，自力霉素,放線菌素D,長春新堿，長春花堿，長春花堿酰胺，三尖杉脂堿，喜樹堿，鬼臼乙叉甙,美登素，欖香烯乳，三苯氧胺，腎上腺皮質(zhì)激素，甲基芐肼，羥基甲基芐肼,左旋門冬酰胺酶，鉑類(順鉑，卡鉑，草酸鉑)，氮烯咪胺，六甲嘧胺，泰索帝或培美曲賽(Alimta)，諾維本，希羅達(dá)，伊立替康，拓?fù)涮婵担菟徙K，多烯紫杉醇(Docetaxel)，聯(lián)合應(yīng)用的化療藥物如泰素(紫杉醇)+順鉑，泰素+卡鉑、健擇(鹽酸吉西他濱)+順鉑，泰索帝(多西紫杉醇)+順鉑，泰素D、健擇+順鉑，順鉑(Cisplatin)+長春瑞賓(vinorelbine)，吉西他濱(gemcitabine)+卡鉬(Carboplatin)，紫杉醇(paclitaxel)+卡鉬。"抗腫瘤抗體"本發(fā)明提供的結(jié)核菌熱休克蛋白和腫瘤裂解物的混合物可和抗腫瘤抗體聯(lián)合應(yīng)用，這些抗體包括但不限于HEKCEPTIN(ClinCancerRes.2006Jul15;12(14Pt2):4436s-4440s)，Rituximab(Rituxan.RTM.)(Blood.69:584-591，1987)，抗-CTLA-4抗體，抗CD40抗體，抗EGF受體抗體和抗VEGF受體抗體等。"表皮細(xì)胞生長因子受體(EGFR)-酪氨酸激酶(-TK)激活抑制劑"腫瘤細(xì)胞如肺癌細(xì)胞表達(dá)的表皮細(xì)胞生長因子是受體酪氨酸激酶，抑制此激酶活性的制劑可以抑制包括肺癌細(xì)胞的生長。此類制劑包括但不限于吉非替尼或易瑞沙(Gefitinib，Iressa)和埃羅替尼(Erlotinib，Tarceva)(Bezjak,A.,etal.JClinOncol24:3831-38372006)。"腫瘤細(xì)胞突變蛋白酪氨酸激酶抑制劑"是指抑制腫瘤細(xì)胞突變蛋白酪氨酸激酶活性的制劑。此類制劑包括但不限于甲磺酸伊馬替尼(Gleevec或STI—571或Imatinibmesylate)。甲磺酸伊馬替尼是突變蛋白質(zhì)(Bcr—Abl)酪氨酸激酶磷酸化抑制劑(RubinBP,DuensingA.Mechanismsofresistancetosmallmoleculekinaseinhibitioninthetreatmentofsolidtumors.LabInvest.2006Aug21)。"腫瘤血管抑制劑"是指通過抑制腫瘤血管形成而發(fā)揮抗腫瘤作用的制劑。這類制劑包括但不限于阿瓦斯丁(Avastin)和恩度(ENDOSTAR)。阿瓦斯丁是結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的基因工程單克隆抗體(GridelliC,etal.Newanti卿iogeneticagentsandnon-smallcelllungcancer.CritRevOncolHematol.2006Jul12)。恩度是重組人血管內(nèi)皮抑制素。"RNA干涉物"RNA干擾(RNAinterference，簡稱RNAi)是采用單鏈RNA干擾同源RNA功能的現(xiàn)象。具有RNA干擾作用的這種單鏈RNA也被稱為RNA干涉物。各種能夠干擾維持腫瘤細(xì)胞惡性表型的RNA干涉物都會(huì)產(chǎn)生抗腫瘤的作用。"非特異性免疫增強(qiáng)劑"是指能非特異增強(qiáng)個(gè)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的制劑，這些制劑包括單但不限于卡介苗(BacillisCalmette-Gruen，BCG),短小棒狀桿菌(Corynabacteriumparv咖，金黃色葡萄球菌，CD40配體，細(xì)菌核糖體提取物(Ribosomalfractions),細(xì)菌膜提取物(membranarbacterialfractions),細(xì)菌膜proteoglycanes,polyarginine,HSP-60,HSP-70，HSP-90和CTLA-4抑制劑等。圖1全Lewis腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白抗Lewis肺癌抑瘤曲線橫座標(biāo)為注射腫瘤后的天數(shù)，縱座標(biāo)為腫瘤的體積。結(jié)果表明全Lewis腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白組能明顯抑制腫瘤生長(P<0.01)。圖2全Lewis腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白抗Lewis肺癌生存曲線橫座標(biāo)為注射腫瘤后的天數(shù)，縱座標(biāo)為荷瘤小鼠生存率(百分率)。結(jié)果表明全Lewis腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白組能明顯延長荷瘤小鼠生存期(PO.Ol)。圖3全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白抗B16黑色素瘤抑瘤曲線橫座標(biāo)為注射腫瘤后的天數(shù)，縱座標(biāo)為腫瘤的體積。結(jié)果表明全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白組能明顯抑制腫瘤生長(P<0.05)。圖4全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白抗B16黑色素瘤生存曲線橫座標(biāo)為注射腫瘤后的天數(shù)，縱座標(biāo)為荷瘤小鼠生存率。結(jié)果表明全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白組能明顯延長荷瘤小鼠生存期(P<0.05)。圖5全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白抗B16黑色素瘤的有效成分摸索抑瘤曲線橫座標(biāo)為注射腫瘤后的天數(shù)，縱座標(biāo)為腫瘤的體積。結(jié)果表明全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65k白組能明顯抑制腫瘤生長(P<0.01)，其抑瘤效果優(yōu)于B16腫瘤細(xì)胞裂解物上清聯(lián)合HSP65蛋白組(P<0.05)。其中，"苗"代表腫瘤裂解物。圖6全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白抗B16黑色素瘤的有效成分摸索生存曲線橫座標(biāo)為注射腫瘤后的天數(shù)，縱座標(biāo)為荷瘤小鼠生存率。結(jié)果表明全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白組能明顯延長荷瘤小鼠生存期〖P<0.05)，其效果優(yōu)于B16腫瘤細(xì)胞裂解物上清聯(lián)合HSP65蛋白組(P<0.05)。其中，"苗"代表腫瘤裂解物。圖7:pET28a-HSP70質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳泳道l,DNAMarkerDL15000(大連保生物)，其條帶堿基數(shù)目由多到少依次為15000bp,10000bp,7500bp,5000bp,2500bp，1000bp，250bp;泳道2，DNAMarkerDL2000(大連保生物)，其條帶堿基數(shù)目由多到少依次為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp;泳道3，pET28a—HSP70重組質(zhì)粒經(jīng)HindIII、Ncol雙酶切后，在約1880bp及5240bp大小處均出現(xiàn)清晰條帶，分別與HSP70目的片段及pET28a空載體的預(yù)期大小相符。圖8:HSP70純化后12XSDS-PAGE泳道l，為HSP70表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-Sepharose4B親合層析、SuperdexG-25凝膠過濾層析及Q-SepharoseSFF離子交換層析后所得產(chǎn)物。所得重組HSP70蛋白的純度約為96.58/。。圖9全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白對(duì)小鼠B16皮下移植瘤發(fā)生潛伏期的影響橫座標(biāo)為注射腫瘤后的天數(shù)，縱座標(biāo)為腫瘤發(fā)生潛伏期。結(jié)果表明全B16細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70可以顯著的延長腫瘤發(fā)生潛伏期(P<0.05)。圖10全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白抗小鼠B16皮下移植瘤抑瘤曲線橫座標(biāo)為注射腫瘤后的天數(shù)，縱座標(biāo)為腫瘤的體積。結(jié)果表明全B16細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白組能明顯抑制腫瘤生長(P<0.05)。圖11全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白抗小鼠B16皮下移植瘤生存曲線橫座標(biāo)為注射腫瘤后的天數(shù)，縱座標(biāo)為生存小鼠比例。結(jié)果表明全B16細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白組能明顯延長荷瘤小鼠生存期(P<0.05)。圖12全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白抗小鼠B16腹腔移植瘤生存曲線(預(yù)防性)橫座標(biāo)為注射腫瘤后的天數(shù)，縱座標(biāo)為荷瘤小鼠中生存小鼠比例。結(jié)果表明全B16細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白組能明顯延長荷瘤小鼠生存期(P<0.05)。圖13全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋A抗小鼠B16腹腔移植瘤生存曲線(治療性)橫座標(biāo)為注射腫瘤后的天數(shù)，縱座標(biāo)為荷瘤小鼠中生存小鼠比例。結(jié)果表明全B16細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白組能明顯延長荷瘤小鼠生存期(P<0.05)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1全腫痛細(xì)胞裂解物聯(lián)合結(jié)核菌HSP6S蛋白抗Lewis肺癌材料Lewis細(xì)胞、結(jié)核菌HSP65蛋白(均來源于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室)、Nacl溶液(內(nèi)蒙古天源藥業(yè)公司生產(chǎn))、lml注射器、冰盒、干棉花、IMDM培養(yǎng)液、無菌平皿、50ml離心管、膠頭滴管、濾網(wǎng)、腫瘤組織研磨器、紗布、天平、C57BL/6小鼠(購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)、鼠籠、標(biāo)簽、飼料(購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物室)、墊料(購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物室)、游標(biāo)卡尺方法1)全腫瘤細(xì)胞裂解物的獲得將2.2X10"的Lewis肺癌細(xì)胞用高壓后的Nacl制成l.lml細(xì)胞懸液，于-7(TC和37'C反復(fù)凍融5次后(凍15min,融5min，其間震蕩混勻)，用臺(tái)酚藍(lán)染色以確定裂解情況。然后將全部腫瘤細(xì)胞裂解混合液放于4'C冰箱中，17-18h后用于免疫。2)腫瘤細(xì)胞的制備將荷瘤小鼠的腫瘤組織于超凈臺(tái)中無菌取出，用天平稱量2g腫瘤組織。將取出的腫瘤組織用腫瘤組織研磨器進(jìn)行研磨，經(jīng)紗布和濾網(wǎng)過濾后，用12ml無血清IMDM懸浮制成單細(xì)胞懸液用于接種，接種的數(shù)量為0.5g/15只，接種部位為右后肢皮下。3)全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白抑制Lewis肺癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在C57BIV6小鼠右側(cè)背下部靠近尾根部約0.7cm處皮下注射0.033g/0.2mLIMDMLewis腫瘤組織，注射局部出現(xiàn)直徑6~8mm的皮丘，視為接種成功。實(shí)驗(yàn)分組將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只小鼠(l)Nad溶媒對(duì)照組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射150nLNacl溶液；(2)全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白治療組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射lxl0S全腫瘤細(xì)胞裂解物+10嗎HSP65/150HLNacl溶液；(3)全腫瘤細(xì)胞裂解物治療組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射1"06全腫瘤細(xì)胞裂解物/150pLNacl溶液；(4)HSP65蛋白治療組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射10ngHSP65/150nLNacl溶液。給藥后每隔2d測(cè)量腫瘤體積。腫瘤體積(V)按公式V-l/2ab2(a-瘤長，b-瘤寬)計(jì)算，并繪制腫瘤生長曲線，觀察小鼠生存期。-結(jié)果全Lewis腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白組腫瘤體積從12天開始與其它三組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),其它3組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；全Lewis腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白組小鼠的生存期同其它3組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PO.Ol)。提示腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65可以顯著的抑制Lewis肺癌細(xì)胞瘤的生長(圖l)，同時(shí)顯著延長荷瘤小鼠的生存期(圖2)。結(jié)論全Lewis腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65具有抗Lewis肺癌的作用。實(shí)施例2全腫癯細(xì)胞裂解物齢結(jié)核菌HSP65蛋白抗B16黑色素瘤材料B16細(xì)胞、HSP65蛋白(均來源于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室)、Nacl溶液(內(nèi)蒙古天源藥業(yè)公司生產(chǎn))、lml注射器、冰盒、干棉花、IMDM培養(yǎng)液、50ml離心管、膠頭滴管、天平、C57BL/6小鼠(購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)、鼠籠、標(biāo)簽、飼料(購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物室)、墊料(購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物室)、游標(biāo)卡尺方法1)全B16腫瘤細(xì)胞裂解物的獲得將2.2Xl(^的B16黑色素瘤細(xì)胞用高壓后的Nacl制成l.lml細(xì)胞懸液，于-7(TC和37'C反復(fù)凍融5次后(凍15min,融5min,其間震蕩混勻)，用臺(tái)酚藍(lán)染色以確定裂解情況。然后將全部腫瘤細(xì)胞裂解混合液放于4'C冰箱中，17-18h后用于免疫。2)全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白抑制B16黑色素瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在C57BL/6小鼠右側(cè)背下部靠近尾根部約0.7cm處皮下注射3xl05/0.2mLIMDMB16黑色素瘤細(xì)胞，注射局部出現(xiàn)直徑6~8mm的皮丘，視為接種成功。實(shí)驗(yàn)分組將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只小鼠(1)Nacl溶媒對(duì)照組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射150pLNacl溶液；(2)全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白治療組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射1><106全B16腫瘤細(xì)胞裂解物+10pgHSP65/150(iLNacl溶液；(3)全B16腫瘤細(xì)胞裂解物治療組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射lxl()S全B16腫瘤細(xì)胞裂解物/150pLNacl溶液；(4)HSP65蛋白治療組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射10pgHSP65/150pLNacl溶液。給藥后每隔2d測(cè)量腫瘤體積。腫瘤體積(V)按公式V^/2ab2(^瘤長，b-瘤寬)計(jì)算，并繪制腫瘤生長曲線，觀察小鼠生存期。結(jié)果全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白組腫瘤體積從11天開始與Nad溶媒對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，從15天開始與其它3組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其它3組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白組腫瘤體積組小鼠的生存期同其它3組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。提示全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65可以顯著的抑制B16黑色素瘤的生長(圖3)，同時(shí)顯著延長荷瘤小鼠的生存期(圖4)。結(jié)論全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65具有抗B16黑色素瘤的作用。實(shí)施例3全腫癍細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白抗B16黑色素瘤的有效成分摸索材料B16細(xì)胞、HSP65蛋白(均來源于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室)、Nad溶液(內(nèi)蒙古天源藥業(yè)公司生產(chǎn))、lml注射器、冰盒、干棉花、IMDM培養(yǎng)液、50ml離心管、膠頭滴管、天平、C57BL/6小鼠(購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)、鼠籠、標(biāo)簽、飼料(購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物室)、墊料(購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物室)、游標(biāo)卡尺方法1)全B16腫瘤細(xì)胞裂解物的獲得將4.4乂107的816黑色素瘤細(xì)胞用高壓后的1^(:1制成2.21111細(xì)胞懸液，于-70'C和37'C反復(fù)凍融5次后(凍15min,融5min,其間震蕩混勻)，用臺(tái)酚藍(lán)染色以確定裂解情況。然后將全部腫瘤細(xì)胞裂解混合液放于4'C冰箱中，17-18h后用于免疫。2)全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白抑制B16黑色素瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在C57BL/6小鼠右側(cè)背下部靠近尾根部約0.7cm處皮下注射3xl05/0.2mLIMDMB16黑色素瘤細(xì)胞，注射局部出現(xiàn)直徑6~8mm的皮丘，視為接種成功。實(shí)驗(yàn)分組將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只小鼠(l)Nad溶媒對(duì)照組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射150pLNacl溶液；(2)全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白治療組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射lxl()S全B16腫瘤細(xì)胞裂解物+10ngHSP65/150Nacl溶液；(3)全B16腫瘤細(xì)胞裂解物治療組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射lxl()6全B16腫瘤細(xì)胞裂解物/150^LNad溶液；(4)HSP65蛋白治療組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射1(HigHSP65/150nLNacl溶液。(5)B16腫瘤細(xì)胞裂解物上清液聯(lián)合HSP65蛋白治療組:第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射lxl0&16腫瘤細(xì)胞裂解上清+10嗎HSP65/150(iLNacl溶液；(6)B16腫瘤細(xì)胞裂解物上清液治療組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射"106腫瘤細(xì)胞裂解物上清/150Nacl溶液。給藥后每隔2d測(cè)量腫瘤體積。腫瘤體積(V)按公式V-l/2ab2(^瘤長，—瘤寬)計(jì)算，并繪制腫瘤生長曲線，觀察小鼠生存期。結(jié)果全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白組腫瘤體積從10天開始與Nacl溶媒對(duì)照組(PO.01)、全B16腫瘤細(xì)胞裂解物組(PO.Ol)、B16腫瘤細(xì)胞裂解物上清聯(lián)合HSP65蛋白組(P<0.05)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白組小鼠生存期與Nacl溶媒對(duì)照組、全B16腫瘤細(xì)胞裂解物組、B16腫瘤細(xì)胞裂解物上清聯(lián)合HSP65蛋白組、HSP65蛋白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PO.05),與B16腫瘤細(xì)胞裂解物上清組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65可以顯著的抑制B16黑色素瘤的生長(圖5)，同時(shí)顯著延長荷瘤小鼠的生存期(圖6)，而且全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65比腫瘤細(xì)胞裂解物上清液聯(lián)合HSP65具有更顯著的抑制B16黑色素瘤的生長的作用(圖5)。結(jié)論全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65具有抗B16黑色素瘤的作用；B16腫瘤細(xì)胞裂解物上清液聯(lián)合HSP65亦具有抗B16黑色素瘤效果；全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65比B16腫瘤細(xì)胞裂解物上清液聯(lián)合HSP65具有更強(qiáng)的抗B16黑色素瘤效果。實(shí)施例4獲取結(jié)核菌熱休克蛋白70(HSP70)的編碼基因1.分離HSP70編碼基因含有HSP70結(jié)構(gòu)基因的重組質(zhì)粒pET28a-HSP70-P16，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院分子生物教研室提供。采用PCR方法自pET28a-HSP70-P16擴(kuò)增HSP70編碼基因。采用的5'端引物序列為5'ATAATTACCATGGCTCGTGCGGTCGGGATCG3'，3'端引物序列為5'ATATTATAAGCTTGGCCTCCCGGCCGTC3',反應(yīng)條件940C，45";620C,l';740C，2'，28個(gè)循環(huán)周期后，720C延伸10min。PCR產(chǎn)物的5'端帶有NcoI酶切位點(diǎn)，3端帶有HindIII酶切位點(diǎn)。獲得的卡介苗(BCG)HSP70基因的序列為SEQIDNO:1。2.克隆PCR產(chǎn)物采用TA克隆方法，將步驟1的PCR產(chǎn)物克隆入TA載體，得到重組質(zhì)粒pMD-18T-HSP70。方法見TA連接試劑盒(Promega)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌JM109(購自Invitrogen公司)，取陽性克隆培養(yǎng)，按常規(guī)方法(Joseph.Sambrook,DavidW.Russell.SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，Molecularcloning:ALaboratoryManual,3rded.27—30，ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)提取質(zhì)粒，釆用雙脫氧末端終止法，對(duì)插入片段進(jìn)行序列測(cè)定(ABIPrism310TM,USA)。序列測(cè)定正確后，利用Ncol和Hindin切點(diǎn)將其亞克隆至pET28a(+)載體(Novagen),得到pET28a(+)-HSP70質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，取陽性轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用雙脫氧末端終止法，對(duì)插入片段進(jìn)行序列測(cè)定(ABIPrism310TM，USA)。實(shí)施例5重組HSP70的表達(dá)和純化將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-HSP70轉(zhuǎn)化進(jìn)入已制備好的大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布含100ng/ml卡那霉素的LB平板，然后在轉(zhuǎn)化平板上挑取單克隆，接種到3mlLB液體培養(yǎng)基中，37'C恒溫?fù)u床上200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，用堿裂解法抽提并檢測(cè)質(zhì)粒(圖7)。將確證含有表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-HSP70的單克隆在含lOOpg/ml卡那霉素的LB平板上點(diǎn)復(fù)板保存。挑選一株確證好的表達(dá)工程菌，采用10升的發(fā)酵罐，用lb培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)及用iptg誘導(dǎo)表達(dá)。采用高壓破菌方法，在500600bar壓力下，循環(huán)破菌45次，離心收上清，上清通過鎳親合層析，SuperdexG-25超濾脫鹽，最后經(jīng)過Q-SepharoseFP層析，得到重組HSP70蛋白(分子量為70KD),重組HSP70蛋白的純度約為％.5%。(圖8)實(shí)施例6全腫癍細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白抗小鼠B16皮下移植瘤材料B16細(xì)胞、HSP70蛋白、PBS溶液(本室配制)、ADP2Na(購于sigma公司)、MgC12(購于北京化工廠)、lml注射器、冰盒、干棉花、IMDM培養(yǎng)液、50ml離心管、膠頭滴管、天平、C57BL/6小鼠(18一22g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)、鼠籠、標(biāo)簽、飼料(購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物室)、墊料(購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物室)、游標(biāo)卡尺方法1)全B16細(xì)胞裂解物的獲得將2X1(^的B16黑色素瘤細(xì)胞用高壓后的PBS制成lml細(xì)胞懸液，于-70'C和37'C反復(fù)凍融5次后(凍15min,融5min,其間震蕩混勻)，用臺(tái)酚藍(lán)染色以確定裂解情況后存于—70。C。2)各組疫苗的獲得如下配方制備各組疫苗，于免疫前混合后37'C水浴lh后用于免疫。3)全B16細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白抑制B16黑色素瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組將48只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組(1)PBS溶媒對(duì)照組(PBS,16只):第1、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射100ulPBS溶媒(含有l(wèi)mMADP2Na及l(fā)mMMgC12的PBS溶液)；(2)全B16細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白組(HSP70-tumorlysate,8只):第1、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射lxl(^全B16腫瘤細(xì)胞裂解物+100pgHSP70/100)alPBS溶媒；(3)全B16細(xì)胞裂解物組(Tumorlysate，16只)第1、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射1><106全B16腫瘤細(xì)胞裂解物/100piPBS溶媒；(4)HSP70蛋白組(HSP70，8只)第1、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射100ngHSP70/100nlPBS溶媒。第18天在各組小鼠右側(cè)背下部靠近尾根部約0.7cm處皮下注射2xl0V0.2mLIMDMB16細(xì)胞，注射局部出現(xiàn)直徑6~8mm的皮丘，視為接種成功。腫瘤大小可觸及后，每隔2d測(cè)量腫瘤體積。腫瘤體積(V)按公式V-l/2ab2(a-瘤長，b-瘤寬)計(jì)算，并繪制腫瘤生長曲線，觀察小鼠生存期。結(jié)果:HSP70-tumorlysate組腫瘤發(fā)生潛伏期與PBS組及tumorlysate組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PO,05)(圖9),HSP70-tumorlysate組腫瘤大小自腫瘤接種后11天起與PBS組及tumorlysate組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其它各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖10);HSP70-tumorlysate組荷瘤小鼠生存期與PBS組及tumorlysate組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其它各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖11)。提示全B16細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70可以顯著的延長B16腫瘤發(fā)生潛伏期，顯著抑制腫瘤的生長，同時(shí)顯著延長荷瘤小鼠的生存期。結(jié)論全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70具有預(yù)防性抗小鼠B16皮下移植瘤的作用。實(shí)施例7全腫痛細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白抗小鼠B16腹腔移植瘤材料B16細(xì)胞、HSP70蛋白、PBS溶液(本室配制)、ADP2Na(購于sigma公司)、MgC12(購于北京化工廠)、lml注射器、冰盒、干棉花、IMDM培養(yǎng)液、50ml離心管、膠頭滴管、天平、C57BL/6小鼠(1817一22g,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)、鼠籠、標(biāo)簽、飼料(購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物室)、墊料(購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物室)方法1)全腫瘤細(xì)胞裂解物及各組疫苗的獲得同實(shí)施例6。2)全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白抑制B16黑色素瘤的預(yù)防性體內(nèi)實(shí)驗(yàn)-實(shí)驗(yàn)分組將32只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只(1)PBS溶媒對(duì)照組(PBS):第1、15天于小鼠左后肢皮下腹股溝處注射100ulPBS溶媒(含有l(wèi)mMADP2Na及l(fā)mMMgC12的PBS溶液)；(2)全B16細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白組(HSP70-tumorlysate):第1、15天于小鼠左后肢皮下腹股溝處注射lxl()6全B16腫瘤細(xì)胞裂解物+100pgHSP70/100plPBS溶媒；(3)全B16腫瘤細(xì)胞裂解物組(Tumorlysate):第1、15天于小鼠左后肢皮下腹股溝處注射lxl(/全B16腫瘤細(xì)胞裂解物/100nlPBS溶媒；(4)HSP70蛋白組(HSP70):第1、15天于小鼠左后肢皮下腹股溝處注射100嗎HSP70/100plPBS溶媒。第18天在各組小鼠左下腹部腹膜下注射7.5x104/0.2mlIMDMB16黑色素瘤細(xì)胞，觀察小鼠生存期。結(jié)果:HSP70-tumorlysate組腫瘤發(fā)生潛伏期與PBS組及tumorlysate組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PO.05)，HSP70組與PBS組、tumorlysate及HSP70-tumorlysate有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其它各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖12)。提示全B16腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70可以顯著的延長荷瘤小鼠的生存期。結(jié)論全B16細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70具有預(yù)防性抗小鼠B16腹腔移植瘤的作用。3)全B16細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70蛋白抑制B16黑色素瘤的治療性體內(nèi)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。組別及各組配方每組同預(yù)防性體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。(1)于第0天在各組小鼠左下腹部腹膜下注射7.5xlO"0.2mlIMDMB16細(xì)胞；(2)各組分別在第1、4、8天于小鼠左后肢皮下腹股溝處注射相應(yīng)配方試劑，觀察小鼠生存期。結(jié)果HSP70-tumorlysate組小鼠生存期與PBS組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其它各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示全B16細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70可以顯著的延長荷瘤小鼠的生存期(圖13)。結(jié)論:全B16細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP70具有治療性的抗小鼠B16腹腔移植瘤的作用。實(shí)施例8全腫癯細(xì)皿解物聯(lián)合結(jié)核菌HSP65蛋白治療G422神經(jīng)膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型小鼠材料G422鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(購于上?？蠌?qiáng)儀器有限公司)、結(jié)核菌HSP65蛋白(來源于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室)、Nacl溶液(內(nèi)蒙古天源藥業(yè)公司生產(chǎn))、lml注射器、冰盒、干棉花、IMDM培養(yǎng)液、無菌平皿、50ml離心管、膠頭滴管、濾網(wǎng)、腫瘤組織研磨器、紗布、天平、Balb/c小鼠(購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)、鼠籠、標(biāo)簽、飼料(購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物室)、墊料(購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物室)、游標(biāo)卡尺方法1)全腫瘤細(xì)胞裂解物的獲得將2.2X107的G422鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞用高壓后的Nacl制成l.lml細(xì)胞懸液，于-70'C和37"C反復(fù)凍融5次后(凍15min,融5min,其間震蕩混勻)，用臺(tái)酚藍(lán)染色以確定裂解情況。然后將全部腫瘤細(xì)胞裂解混合液放于4'C冰箱中，17-18h后用于免疫。2)腫瘤細(xì)胞的制備將荷瘤小鼠的腫瘤組織于超凈臺(tái)中無菌取出，用天平稱量2g腫瘤組織。將取出的腫瘤組織用腫瘤組織研磨器進(jìn)行研磨，經(jīng)紗布和濾網(wǎng)過濾后，用12ml無血清IMDM懸浮制成單細(xì)胞懸液用于接種，接種的數(shù)量為0.5g/15只，接種部位為右腋下皮下。3)全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白抑制G422鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在BALB/C小鼠右腋下注射0.033g/0.2mLIMDMG422鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只小鼠(l)Nacl溶媒對(duì)照組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射150pLNacl溶液；(2)全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白治療組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射lxl(^全腫瘤細(xì)胞裂解物+10ngHSP65/150pLNacl溶液；(3)全腫瘤細(xì)胞裂解物治療組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射lxl(^全腫瘤細(xì)胞裂解物/150nLNacl溶液；(4)HSP65蛋白治療組第-7、1、8、15天于小鼠右后肢皮下腹股溝處注射10pgHSP65/150pLNacl溶液。結(jié)果G422腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65蛋白組小鼠的生存期同其它3組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PO.Ol)。提示腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65可以顯著延長荷瘤小鼠的生存期(表1)。結(jié)論相應(yīng)的全腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65具有抗G422鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實(shí)施例9全腫癍細(xì)胞裂解物聯(lián)合結(jié)核菌HSP65蛋白治療淋巴瘤1、腫瘤細(xì)胞裂解物的制備EL4細(xì)胞(C57BL/6小鼠淋巴瘤細(xì)胞)，源自AmericanTypeCultureCollection(ATCC)。采用含1(m滅活FCS，20pg/ml慶大霉素，1mMHEPES的IMDM培養(yǎng)基(Gibco公司)，在37°C,5%0)2的條件下培養(yǎng)。將EL4細(xì)胞(1X107/ral)懸浮于lmlPBS(phosphate-bufferedsaline)中，做4輪凍融處理。方法是，液氮冷凍冰凍，37。C融解。將細(xì)胞裂解物經(jīng)超聲處理,進(jìn)一步裂解。320g,4°C，離心10分鐘。收上清，-70。C保存。100ulPBS中含有從1X106EL4細(xì)胞制備的腫瘤細(xì)胞裂解物。2、腫瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65的抗EL4細(xì)胞作用采用68周齡的C57BL/6雄性小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)進(jìn)行抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)。在EL4腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65組小鼠組，于第0天、第7天和第14天在右側(cè)背部皮下注射100u1EL4細(xì)胞裂解物和HSP65混合物(含10ugHSP65)。設(shè)EL4細(xì)胞裂解物對(duì)照組，HSP65蛋白對(duì)照組和PBS對(duì)照組。腫瘤細(xì)胞(EL4細(xì)胞)裂解物對(duì)照組小鼠注射100ylEL4細(xì)胞。HSP65蛋白對(duì)照組小鼠注射100y1含10ugHSP的PBS。PBS對(duì)照組小鼠注射100u1PBS。于第18天，在C57BL/6小鼠右側(cè)背部皮下注射O.1mlEL4細(xì)胞懸液。自接種腫瘤后開始觀察并記錄小鼠的生存期。表2EL4細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65的對(duì)EL4細(xì)胞成瘤率的影響組別動(dòng)物數(shù)(n)生存期(天)EL4腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65組2045.5±4.9EL4細(xì)胞裂解物對(duì)照組2028.1±4.4HSP65蛋白對(duì)照組2027.4±3.7PBS2021.2±5.5結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65組和對(duì)照組相比生存期顯著延長，P〈().05。實(shí)施例10結(jié)腸癌細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65的抗結(jié)腸痛作用1、腫瘤細(xì)胞裂解物的制備CMT93細(xì)胞是C57BL/6小鼠來源的結(jié)腸癌細(xì)胞(mouserectalcarcinomacellline)(購于ATCC)。用含10%(v/v)滅活的胎牛血清和抗生素(IOOIU青霉素/ml和100IU的鏈霉素/ml)的IMDM培養(yǎng)液，在37°C，5%〔02的條件下培養(yǎng)。將CMT93細(xì)胞(1X107/ml)懸浮于1mlPBS(phosphate-bufferedsaline)中，做4輪凍融處理。方法是，甲醇干冰冰凍，37。C融解。也可采用液氮冷凍。將生成的細(xì)胞裂解物用臺(tái)酚藍(lán)染色，在顯微鏡下檢測(cè)無完整的細(xì)胞。320g，4°C，離心10分鐘。收上清，-70。C保存。100ulPBS中含有從1X106CMT93細(xì)胞制備的腫瘤細(xì)胞裂解物。2、結(jié)腸癌細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65的抗結(jié)腸癌作用采用C57BL/6雌性小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司')進(jìn)行抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)。在腫瘤細(xì)胞CMT93細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65組小鼠，于第0天和第7天在右側(cè)背部皮下注射0.1mlCMT93細(xì)胞裂解物和HSP65混合物(含10ygHSP65蛋白)，設(shè)CMT93細(xì)胞裂解物對(duì)照組，HSP65對(duì)照組和PBS對(duì)照組。腫瘤細(xì)胞(CMT93細(xì)胞)裂解物對(duì)照組小鼠注射lOOul腫瘤細(xì)胞(CMT93細(xì)胞)裂解物。HSP65對(duì)照組小鼠注射100Ul含10ligHSP65蛋白的PBS。PBS對(duì)照組小鼠注射100u1PBS。于第14天，將2.5X106CMT93細(xì)胞接種到小鼠(68周齡，雌性)右側(cè)背部皮下。從注射腫瘤后的第10天開始用游標(biāo)卡尺(0.002cm)測(cè)量瘤塊的長徑(longdiameter)和短徑(shortdiameter)。月中瘤大小(cm2)=長徑(cm)X短徑(cm)。表3表示的是接種腫瘤后第20天的測(cè)量結(jié)果。'表3結(jié)腸癌細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>結(jié)果表明，結(jié)腸癌細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65在應(yīng)用于小鼠后，可產(chǎn)生顯著的抗結(jié)腸癌的作用。結(jié)腸癌細(xì)胞裂解物聯(lián)合HSP65和對(duì)照組相比，P<0.05。序列表<110>北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司<120>—種結(jié)核菌HSP和腫瘤裂解物的混合物<160>1〈170>PatentInversion3.1<210>1<211>1880<212>醒<213>Artificial<400>1ccatggctcgtgcggtcgggatcgacctcgggaccaccaactccgtcgtctcggttctgg60aaggtggcgacccggtcgtcgtcgccaactccgagggctccaggaccaccccgtcaattg120tcgcgttcgcccgcaacggtgaggtgctggtcggccagcccgccaagaaccaggcggtga180ccaacgtcgatcgcaccgtgcgctcggtcaagcgacacatgggcagcgactggtccatag240卿ttgacggaccgcgccggagatcagcgcccgcattctgatgaagctga300agcgcgacgccgaggcctacctcggtgaggacattaccgaCgCggtt3tCacgacgcccg360cctacttcaatgacgcccagcgtcaggccaccaaggacgccggccagatcgccggcctca420acgtgctgcggatcgtcaacgagccgaccgcggccgcgctggcctacggcctcgacaagg480gCg卿郷3gcagcgaatcctggtcttcgacttgggtggtggcactttcgacgtttccc540tgctgg卿tcggcgagggtgtggttg3ggtccgtgccacttCgggtg3Caaccacctcg600gcggcgacgactgggaccagcgggtcgtcgattggctggtggacaagttcaagggcaxca660gcggcatcgatctgaccaaggaca卿tggcgatgcagcggctgcgggaagccgccgaga7203ggc8幼gatcgagctgagttcgagtcagtccacctcgatcaacctgccctacatcaccg780tcgacgccgacaagaacccgttgttcttagacgagcagctgacccgcgcggagttccaac840ggatcactcaggacctgctggaccgcactcgcaagccgttccagtcggtgatcgctgaca■ccggcatttcggtgtcggagatcgatcacgttgtgctcgtgggtggttcgacccggatgc960ccgcggtgaccgatctggtcaaggaactcaccggcggcaaggaacccaacaagggcgtca1020accccgatgaggttgtcgcggtgggagccgctctgc鄉(xiāng)ccggcgtcctcaagggcgagg1080tgaaagacgttctgctgcttgatgttaccccgctgagcctgggtatcgagacc犯gggcg1140gggtgatgaccaggctcatcgagcgcaacaccacgatccccaccaagcggtcggagactt1200tcaccaccgccgacgacaaccaaccgtcggtgcagatccaggtctatcagggggagcgtg1260agatcgccgcgcacaac犯gttgctcgggtccttcgagctgaccggcatcccgccggcgc1320cgcgggggattccgcagatcgaggtcactttcgacatcgacgccaacggcattgtgcacg1380tcaccgccaaggacaagggcaccggcaaggagaacacgatccgaatccaggaaggctcgg1440gcctgtcc幼ggaagacattgaccgcatgatcaaggacgccgaagcgcacgccgaggagg1500atcgcaagcgtcgcgaggaggccgatgttcgtaatc幼gccgagacattggtctaccaga1560cggagaagttcgtcaaagaacagcgtgaggccgagggtggttcga鄉(xiāng)tacctgaagaca1620cgctgaacaaggttgatgccgcggtggcggaagcgaaggcggcacttggcggatcggata1680tUcggccatcaagtcggcgatggagaagctgggccaggagtcgcaggctctggggcaag1740cgatctacgaagcagctcaggctgcgtcacaggccactggcgctgcccaccccggcggcg1800agccgggcggtgcccaccccggctcggctgatgacgttgtggacgcggaggtggtcgacg1860acggccgggaggccaagctt1880權(quán)利要求1、一種用于治療腫瘤的制劑的制備方法，其特征是將結(jié)核菌熱休克蛋白與腫瘤細(xì)胞裂解物混合制成混合物，用于治療患有與腫瘤細(xì)胞裂解物在病理學(xué)上為同一類的腫瘤的個(gè)體，這里的“與腫瘤細(xì)胞裂解物在病理學(xué)上為同一類來源腫瘤”是指用于制備腫瘤細(xì)胞裂解物的腫瘤或腫瘤細(xì)胞系腫瘤和個(gè)體患有的腫瘤是在病理學(xué)分類上屬于同一類的腫瘤，這里所述的“個(gè)體”是人或脊椎動(dòng)物。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其中的"與腫瘤細(xì)胞裂解物在病理學(xué)上為同一類來源腫瘤"包括自體腫瘤、同種異體腫瘤、異種腫瘤，這些腫瘤的細(xì)胞可以是個(gè)體的原發(fā)腫瘤的腫瘤細(xì)胞、繼發(fā)腫瘤的腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)移癌的腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞。3、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的結(jié)核菌熱休克蛋白，包括但不限于結(jié)核菌熱休克蛋白HSP65或結(jié)核菌熱休克蛋白HSP70。4、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的結(jié)核菌熱休克蛋白是一種或多種混合。5、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的結(jié)核菌熱休克蛋白是結(jié)核菌熱休克蛋白的整體或部分。6、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的腫瘤是黑色素瘤。7、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的腫瘤是肺部腫瘤。8、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的腫瘤是膠質(zhì)細(xì)胞瘤。9、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞裂解物是腫瘤細(xì)胞裂解物的全部成分或經(jīng)過分離純化的有效成份，這里的有效成分是由如下成分中的一種或幾種組成蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類。10、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞裂解物來源于基因修飾的自體或同種異體腫瘤細(xì)胞，基因修飾的腫瘤細(xì)胞所用的基因包括MHC分子、細(xì)胞因子、協(xié)同刺激分子、腫瘤抗原的編碼基因。11、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的結(jié)核菌熱休克蛋白與腫瘤細(xì)胞裂解物混合制成的混合物在用于治療腫瘤的過程中是單獨(dú)應(yīng)用或和其它一種或多種抗腫瘤制劑聯(lián)合應(yīng)用發(fā)揮抗腫瘤作用。12、權(quán)利要求11中所述的抗腫瘤制劑包括但不限于化療藥物、細(xì)胞因子、抗腫瘤抗體、表皮細(xì)胞生長因子受體(EGFR)-酪氨酸激酶(-TK)激活抑制劑、腫瘤細(xì)胞突變蛋白酪氨酸激酶抑制劑、腫瘤血管抑制劑、RNA干涉物、Toll樣受體激動(dòng)劑、非特異性免疫增強(qiáng)劑。13、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的結(jié)核菌熱休克蛋白與腫瘤細(xì)胞裂解物混合制成的混合物和其它一種或多種抗腫瘤制劑聯(lián)合應(yīng)用發(fā)揮抗腫瘤作用時(shí)，還可以和下列腫瘤治療方法中的一種或幾種聯(lián)合應(yīng)用外科手術(shù)、放療、介入治療、理療。14、權(quán)利要求1所述的方法中，其中的結(jié)核菌熱休克蛋白與腫瘤細(xì)胞裂解物混合制成的混合物的應(yīng)用劑量是治療有效劑量。15、權(quán)利要求1所述的方法中，其中的結(jié)核菌熱休克蛋白與腫瘤細(xì)胞裂解物混合制成的混合物與藥物學(xué)可接受的載體承載應(yīng)用。16、權(quán)利要求1、10-15中任一所述的方法中，結(jié)核菌熱休克蛋白與腫瘤細(xì)胞裂解物混合制成的混合物在給予個(gè)體時(shí)經(jīng)腸外給藥途徑施用，這些途徑包括皮下、肌肉、腹腔、鞘內(nèi)、皮內(nèi)、瘤內(nèi)、瘤旁、淋巴結(jié)內(nèi)注射、淋巴結(jié)旁注射或經(jīng)呼吸道吸入。17、權(quán)利要求1、10-15中任一所述的方法中，結(jié)核菌熱休克蛋白與腫瘤細(xì)胞裂解物混合制成的混合物是作為在藥物組合物中的有效成份進(jìn)行應(yīng)用。18、權(quán)利要求l、10-15任一所述的方法中，結(jié)核菌熱休克蛋白與腫瘤細(xì)胞裂解物混合制成的混合物是一種或多種結(jié)核菌熱休克蛋白與一種腫瘤細(xì)胞裂解物或幾種腫瘤細(xì)胞裂解物的混合物。19、如權(quán)利要求l、10-15任一所述的方法中，其中所述的混合物再給予個(gè)體時(shí)，可以和佐劑聯(lián)合應(yīng)用。20、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的可被用于制備腫瘤細(xì)胞裂解物的腫瘤細(xì)胞包括但不限于淋巴瘤、白血病、肝癌、結(jié)直腸癌。全文摘要本發(fā)明是將結(jié)核菌熱休克蛋白與腫瘤細(xì)胞裂解物混合制成混合物，用于制備用于治療攜帶有同一種腫瘤的個(gè)體的制劑的用途。文檔編號(hào)A61K38/17GK101637608SQ20081013453公開日2010年2月3日申請(qǐng)日期2008年7月28日優(yōu)先權(quán)日2008年7月28日發(fā)明者孫陸果,賀李,華王,王麗穎,董博翰申請(qǐng)人:北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司