專利名稱：黑乳海參中新的抗腫瘤化合物黑乳海參皂苷乙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種從海洋動物黑乳海參中分離到的新的抗腫瘤 化合物黑乳海參皂苷乙。 背聚技術(shù)
黑乳海參(ifo/o決"n'a"oWfcS.)，又名"鳳梨參"，屬海洋棘皮動物門海參綱 刺參科。其體形很大，長一般為700mm，寬約100mm，高約80mm，廣泛分布于 我國西沙群島和臺灣南端。其體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素、皂苷類物 質(zhì)，具有補肝腎，益精，養(yǎng)血的功效。有關(guān)其所含的皂苷類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗 腫瘤活性迄今尚未見有過報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是從生長于中國福建海域的黑乳海參中提取分離一種新的皂苷類化合
物，命名為黑乳海參皂苷乙，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下
黑乳海參皂苷乙為無色結(jié)晶性粉末，熔點192-196°C (MeOH-H20)， [a]t^-13.8°(c=0.5,MeOH)， Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molisch反應(yīng)均呈陽性。電噴霧
質(zhì)譜信號m/z 905[M+Na]+和附/z 859[M-Na『。紅外光譜max-3421，強寬峰(羥
基)，1763 (羰基)，1649 (雙鍵)，1228，1069 (us，磺酸基)。'H-和13C核磁共
振數(shù)據(jù)見表l。
表1 NobilisideB的的'H和。C核磁共振數(shù)據(jù)
position 8H(J)8H(J)
11.39(1H,m,a),36,4Xyl
1.81(1H,m，y9)
21,89(1H,m,a),27.014.72(1H，d,7.2)105,3
2.07(1 H,m,y5)
33.15(1H,dd,4.2,12.0，a)88.72楊(lH,m)83.3
440.134.31(1H，m)75.6
51,00(1H,d，11.4,a)52.845.11(1H，m)76.1
61.74(1H,m，oc),28,153.72(1H，m,a)，64.3
1,46(1H,m,灼4.78(1 H，m，灼
了1.50(1H,m,ot)，20.8Qui
1.70(1H,m,yg)
8335(1H,m,;5)40.915.13(1H,d,7.2)105.9
9153.92標(biāo)(lH，m)77.0
1039.734.13(1H，m)77.7
115.73(1H,d,4頭115.644.10(1H,m)73.5
122.03(2H，m)28,654.00(1H,m)76,7
1358,864.37(1H,m),61.8
4.28(1H,m)
1445,9
151.82(1H,m，a),36.8
1,34(1H,m,y9)
162.41(1H,dd，6.6,8,4,c0,35.6
2.99(1H,dd，6.0,12.6,/ )
1789.8
18174.6
191.38(3H，s)21.2
2086.6
211.76(3H，s)18.9
224,34(1H，m,ot)80.7
232.01(2H,m)28,5
241.62(2H,m)38,5
2581.4
261.21(3H,s)28.7
271.19(3H,s)27.4
301.13(3H,s)16.8
311.28(3H,s)28.4
321.68(3H,s)20.3
Xyl :木糖，Gic :葡萄糖，J值偶合常數(shù)本發(fā)明還提供了從黑乳海參提取分離NobilisideB的方法，其步驟如下
(1) 提取將黑乳海參洗凈，切碎，用5倍量(重量)95%乙醇浸泡7天， 濾出提取液，再用85%乙醇浸泡提取2次，每次7天，合并3次提取液，減壓回 收乙醇，得流浸膏。將流浸膏溶于水中，通過大孔樹脂柱，依次用水和50%乙醇 洗脫。收集50%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，得總皂苷提取物。
(2) 分離將上述總皂苷提取物應(yīng)用硅膠柱層析，以二氯甲垸甲醇水
為8~5 : 1~4 : 1混合溶劑洗脫，薄層層析檢測，收集含NobilisideB的流份，再 經(jīng)Zorbax SBC18高效液相柱層析，以甲醇水為48 : 52為流動相洗脫，得 NobilisideB純品。
本發(fā)明對黑乳海參皂苷NobilisideB進行了體外抗腫瘤試驗，表明其具有明 顯的抑制腫瘤的效果。試驗所用細胞株為國際通用的A-549肺腫瘤細胞株。
試驗方法為國際通用的SRB法根據(jù)細胞生長速率，將處于對數(shù)生長期的 腫瘤細胞以90一孔接種于96孔培養(yǎng)板，貼壁生長24小時再加藥10pl/孔。每個 濃度設(shè)三復(fù)孔。并設(shè)相應(yīng)濃度的生理鹽水溶媒對照及無細胞調(diào)零孔。腫瘤細胞在 37°C、 5%<:02條件下培養(yǎng)72小時，然后傾去培養(yǎng)液，用10%冷TCA固定細胞， 4'C放置1小時后用蒸餾水洗滌5次，空氣干燥。最后加入150^d/孔的Tris溶液， 酶標(biāo)儀520nm波長下測定OD值。試驗結(jié)果見表2。
表2 NobilisideB對腫瘤細胞的抑制作用
腫瘤細胞株A-549
IC50 (嗎/ml)2.2
ic50:表示本發(fā)明化合物的半數(shù)有效抑制濃度
上述實驗結(jié)果表明，Nobiliside B對A-549肺腫瘤細胞株顯示明顯的抑制作用。
本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，為開發(fā)利用中國的海洋藥用生物資源具有重要意義。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例進一步描述Nobiliside B的分離制備。
將黑乳海參1000克洗凈，切碎，分別用5倍量(重量)的95%、 85%、 85% 乙醇依次浸泡，每次浸泡7天，合并乙醇浸出液，減壓回收乙醇，得流浸膏。將 流浸膏溶于3倍量水中，過濾，濾液通過DA201-B大孔樹脂柱，依次用水和50% 乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至干，得總皂苷5.6克。將總皂
苷進行硅膠柱層析，以二氯甲烷甲醇水為7.6 : 2.4 : l的溶劑洗脫，收集含
Nobiliside B的流份。再經(jīng)Zorbax SBC18高效液相柱層析，以甲醇水為48 : 52 為流動相洗脫，得Nobiliside B純品140毫克。
權(quán)利要求
1. 一種抑制腫瘤的化合物，其特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
2. 權(quán)利要求l所述抑制腫瘤的化合物的制備方法，其具體步驟如下(1) 提取將原料黑乳海參洗凈，切碎，用95%乙醇浸泡7天，濾出提取液，再用85%乙醇浸泡2次，每次7天；合并3次提取液，減壓回收乙醇，得流 浸膏；將流浸膏溶于水中，通過大孔樹脂柱，依次用水和50%乙醇洗脫；收集 50%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，得總皂苷提取物；(2) 分離將上述總皂苷提取物應(yīng)用硅膠柱層析，以二氯甲垸甲醇水 為8 5: 1~4 : i混合溶劑洗脫，薄層層析檢測，收集含權(quán)利要求i所述化合物的流份，再經(jīng)Zorbax SBC18高效液相柱層析，以甲醇水為48 : 52為流動相洗 脫，得權(quán)利要求l所述化合物純品。
3. 權(quán)利要求l所述抑制腫瘤的化合物用于制備抗腫瘤藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種從黑乳海參中分離的抗癌化合物Nobiliside B，分子式C₄₁H₆₃O₁₇SNa。經(jīng)多種現(xiàn)代光譜分析，特別是應(yīng)用先進的二維核磁共振譜和高分辨質(zhì)譜的綜合解析，確定了該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)型。體外抗腫瘤試驗表明，該化合物對A-549肺腫瘤細胞株有明顯的抑制作用。本發(fā)明可為研制新的抗腫瘤藥物提供先導(dǎo)化合物，對開發(fā)利用中國的海洋藥用生物資源具有重要價值。
文檔編號A61K36/56GK101440119SQ200810121088
公開日2009年5月27日 申請日期2008年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月6日
發(fā)明者丁萍月, 軍 巫, 張佳佳, 王忠華, 陳莉莉 申請人:寧波保稅區(qū)欣諾生物技術(shù)有限公司