專利名稱：：Ard1的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及針對ARD1的單克隆抗體及其制備方法、分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞系、所述單克隆抗體或其生物活性片段的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及利用所述單克隆抗體檢測樣品ARD1水平的試劑盒以及抗腫瘤藥物。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤的發(fā)病率近年來在全球范圍內(nèi)繼續(xù)呈上升之勢。由于惡性腫瘤的發(fā)病大多較為隱匿，早期沒有明顯癥狀，病人就診時往往已經(jīng)到了晚期，并且許多在臨床傳統(tǒng)病理及TNM分期表現(xiàn)相近的病人，其預(yù)后也差異很大，反映出惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的復(fù)雜性。目前尚缺乏能用于診斷或預(yù)后判斷的理想腫瘤標(biāo)志物。如幾十年來作為消化道腫瘤的標(biāo)志物CEA,在一些非腫瘤性疾病如胃炎、肝硬化、潰瘍性結(jié)腸炎中也可有升高，其特異性并不理想。因此，尋找與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物和(或)腫瘤抗原，對惡性腫瘤的臨床診斷、監(jiān)視病情發(fā)展及判斷預(yù)后均有重要意義，同時對腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制也有重要意義。蛋白質(zhì)乙?；腿ヒ阴；羌?xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后修飾過程，這一過程調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和腫瘤形成(FuM,WangC,WangJ，ZafonteBT,LisantiMP,PestellRG.Acetylationinhormonesignalingandthecellcycle.CytokineGrowthFactorRev2002;13:259-76)。蛋白氨基乙酰化作為一種重要的修飾過程影響著多種生物學(xué)行為。蛋白去乙酰酶抑制劑可提高組蛋白的乙?；剑醪脚R床研究提示這類抑制劑有望成為潛在的抗腫瘤藥物。Arrestdefective1protein(阻滯缺陷蛋白1，Ard1p)最初是在酵母中發(fā)現(xiàn)的，它參與酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期、生長、孢子形成等過程(WhitewayM，SzostakJW.TheARD1geneofyeastfunctionsintheswitchbetweenthemitoticcellcycleandalternativedevelopmentalpathways.CelM985;43:483-92.)。酵母Ard1p在人類的同源物稱為ARD1(阻滯缺陷蛋白1，Arrestdefectiveprotein1)，它可與NATH相互作用，形成功能性的氨基-乙酰轉(zhuǎn)移酶(N-acetyltransferase)(ArnesenT，AndersonD，BaldersheimC'LanotteM,VarhaugJE，LillehaugJR.IdentificationandcharacterizationofthehumanARD1-NATHproteinacetyltransferasecomplex.BiochemJ2005;386:433-43.)，并在氨基肽酶去除首位甲硫氨酸的翻譯過程之后，特異性乙?；z氨酸、蘇氨酸、甘氨酸或丙氨酸的氨基端。氨基酸比對結(jié)果提示ARD1屬于GNAT(GCN5相關(guān)的氨基末端乙酰轉(zhuǎn)移酶)家族成員，GNAT家族包括了超過50個家族成員，它們都擁有一個保守的乙?；?CoA結(jié)合區(qū)域(Q/R)XXGX(G/A〉(NeuwaldAF,LandsmanD.GCN5-relatedhistoneN-acetyltransferasesbelongtoadiversesuperfamilythatincludestheyeastSPT10protein.TrendsBiochemSci.1997;22:154-5.)。從低等生物酵母到高等生物人都擁有這一保守功能區(qū)。在線蟲，RNA干擾ARD1和NATH將導(dǎo)致線蟲胚胎死亡，同時ARD1基因在錐蟲寄生蟲的生長中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)ARD1可與缺氧誘導(dǎo)因子1a(hypoxia-induciblefactor1a，HIF-1a)相互作用，在體外可乙?；疕IF-1a532位賴氨酸，從而對其起到負(fù)調(diào)控作用。同時，小鼠ARD1可變剪切體(mARD1"s)對HIF-1a的乙?；贖IF-1a降解過程中發(fā)揮重要作用(JeongJW，BaeMK,AhnMY，etal.RegulationanddestabilizationofHIF-1alphabyARD1-mediatedacetylation.Cell2002;111:709-20.)。然而，在人類細(xì)胞中沒有觀察到類似的ARD1對HIF-1a的調(diào)節(jié)作用。5盡管哺乳動物細(xì)胞中ARD1的生物學(xué)功能尚未完全闡明，研究結(jié)果初步提示ARD1與細(xì)胞增殖和生長直接相關(guān)。Lim等人研究發(fā)現(xiàn)ARD1通過激活(3-catenin參與細(xì)胞增殖，而卩-catenin可以進(jìn)一步誘導(dǎo)參與細(xì)胞周期調(diào)控的cyclinD1(LimJH，ParkJW,ChunYS.Humanarrestdefective1acetylatesandactivatesbeta-catenin,promotinglungcancercellproliferation.CancerRes2006;66:10677-82.)。此夕卜，ARD1干擾RNA可抑制細(xì)胞增殖，并使細(xì)胞周期阻滯于G1期，這一過程調(diào)節(jié)了參與細(xì)胞增殖的多種基因。此外，干擾NATH禾BARD1的表達(dá)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并促使細(xì)胞對柔紅霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加敏感(ArnesenT,GrormykoD，PendinoF,RyningenA，VarhaugJE，LillehaugJR.InductionofapoptosisinhumancellsbyRNAi-mediatedknockdownofhARD1andNATH,componentsoftheproteinN-alpha-acetyltransferasecomplex.Oncogene2006;25:4350-60.)。越來越多的研究表明，ARD1是一個參與細(xì)胞功能調(diào)節(jié)，和腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子。它也有望成為腫瘤治療的一個新靶點。通過應(yīng)用抗ARD1兔多抗、以及Northemblot的研究結(jié)果表明，ARD1穩(wěn)定表達(dá)于多種組織、腫瘤細(xì)胞系和內(nèi)皮細(xì)胞(BiltonR，MazureN，TrottierE,etal.Arrest-defective-1protein,anacetyltransferase,doesnotalterstabilityofhypoxia-induciblefactor(HIF)-1alphaandisnotinducedbyhypox舊orHIRJBiolChem2005;280:31132-40.)。目前對腫瘤組織ARD1蛋白水平檢測的相關(guān)報道很少。最近的研究表明，ARD1相互作用蛋白NATH在乳頭狀甲狀腺癌和胃癌中高表達(dá)。因此，對ARD1表達(dá)的檢測有望成為腫瘤診斷和評估預(yù)后的重要臨床指標(biāo)。但目前國內(nèi)外關(guān)于ARD1的研究均是利用ARD1的多克隆抗體進(jìn)行，未見ARD1單克隆抗體的報道。多克隆抗體的特異性差，用于免疫組化時顯色背景高，質(zhì)量不易控制，難以在臨床應(yīng)用推廣。而用PCR方法檢測ARD1的基因表達(dá)又存在易被污染產(chǎn)生假陽性的缺點，同時不能準(zhǔn)確反映蛋白質(zhì)的實際水平，從而極大地限制了ARD1檢測在臨床中的應(yīng)用。單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點，在臨床檢測中應(yīng)用廣泛，可以在免疫組化、ELISA等多種方法中使用。Abnova公司(中國臺灣)提供一種商品化抗ARD1單抗(M01;4B7-H4)，但其不能用于檢測哺乳動物細(xì)胞中的ARD1、或在免疫組化中應(yīng)用。目前臨床迫切需要能滿足上述要求的ARD1單克隆抗體，以及能夠分泌高效價上述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，以便有助于腫瘤的臨床診斷、預(yù)后判斷，并指導(dǎo)臨床治療。同時，單克隆抗體可作為ARD1生物學(xué)功能研究的重要工具，用于Westernblot、免疫沉淀、免疫細(xì)胞化學(xué)等實驗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供針對ARD1蛋白質(zhì)的單克隆抗體或者來源于該抗體的能夠特異性結(jié)合ARD1的生物活性片段。本發(fā)明的一個目的是提供分泌針對ARD1蛋白質(zhì)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本發(fā)明的另一目的是提供ARD1蛋白質(zhì)的單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測ARD1蛋白質(zhì)水平的試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供一種抗腫瘤藥物。本發(fā)明的另一目的是提供本發(fā)明的單克隆抗體或其生物活性片段在體外檢測樣品中ARD1蛋白質(zhì)表達(dá)水平中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供本發(fā)明的單克隆抗體或其生物活性片段在制備用于輔助診斷和/或監(jiān)測腫瘤的試劑中的應(yīng)用。一方面，本發(fā)明提供一種針對ARD1蛋白質(zhì)的單克隆抗體，或者來源于該抗體的能夠特異性結(jié)合ARD1的生物活性片段，所述單克隆抗體由保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號為CGMCCNO.2354或CGMCCNO.2355的雜交瘤細(xì)胞分泌。經(jīng)鑒定，所述單克隆抗體的亞類分別是IgG2a、IgG1。此夕卜，ELISA、Westernbolt結(jié)果提示當(dāng)加入抗體濃度相同時，單抗14D4與原核重組蛋白GST-ARD1的反應(yīng)性較已有的ARD1單克隆抗體(單抗4B7-H4)強(qiáng)；WesternBlot結(jié)果提示單抗4B7-H4不能檢測真核細(xì)胞內(nèi)源性的ARD1，或轉(zhuǎn)染的外源性myc-ARD1;免疫沉淀實驗提示，與單抗4B7-H4相比，單抗10C12與LoVo細(xì)胞中天然的ARD1蛋白有更強(qiáng)的相互作用；同時單抗14D4可用于免疫組化檢測，而單抗4B7-H4則不能用于組化檢測。所以本發(fā)明的單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點，能夠用于免疫組化、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀、免疫印跡(蛋白質(zhì)印跡，WesternBlot)和酶聯(lián)免疫吸附實驗等免疫學(xué)的檢測，從而可檢測結(jié)腸癌、胃癌、食管癌等腫瘤及多種腫瘤細(xì)胞系的ARD1表達(dá)水平，進(jìn)而用于對上述多種胂瘤的輔助診斷和相關(guān)的實驗研究，以及指導(dǎo)臨床治療。本發(fā)明單克隆抗體可以在普通培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)或者在液氮長時間保存。另一方面，本發(fā)明還提供分泌針對ARD1蛋白質(zhì)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系其以保藏號CGMCCNO.2354或CGMCCNO.2355被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞系具有較強(qiáng)的分泌本發(fā)明的單克隆抗體的能力，能穩(wěn)定、大量分泌本發(fā)明的單克隆抗體。從雜交瘤細(xì)胞收集本發(fā)明的單克隆抗體時，可以從雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)上清液中獲得抗體，或者將雜交瘤細(xì)胞注入適宜的哺乳動物并從動物腹水中獲取抗體。前一種方法適于獲得高純度的抗體，后一種方法適于大量獲取抗體。通過上述方法獲得的抗體，可以用常規(guī)方法純化，例如鹽析、凝膠過濾、親合色譜層析等方法。另一方面，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，可以直接釆用ARD1蛋白質(zhì)作為抗原，獲得本發(fā)明的單克隆抗體。也可以將本發(fā)明ARD1蛋白質(zhì)與己知的標(biāo)簽形成重組蛋白作為抗原，獲得本發(fā)明的單克隆抗體。所述的于，組氨酸標(biāo)簽(His標(biāo)簽)、谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽(GST標(biāo)簽)、HA標(biāo)簽、HSV標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽或VSV-G-標(biāo)簽等。在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明通過原核表達(dá)獲得純化的GST-ARD1融合蛋白，并通過雜交瘤技術(shù)獲得ARD1的單克隆抗體。因此，本發(fā)明還提供本發(fā)明單克隆抗體的制備方法，該方法包括用融合蛋白GST-ARD1免疫小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出能夠分泌對ARD1有反應(yīng)性、對谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)沒有反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤上清液中或從注射雜交瘤細(xì)胞后的動物腹水中獲取單克隆抗體。上述方法僅是示例性的，例如可以用同樣的方法免疫其他哺乳動物，大鼠、兔子、豚鼠或倉鼠等。在本發(fā)明的一個實施方式中，以ARD1基因(GenBankAccessionNo.NM一003491)的cDNA為模板，從起始密碼子處設(shè)計正義引物，從終止密碼子處設(shè)計反義引物，用PCR方法擴(kuò)增ARD1基因的cDNA片段。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物定向克隆到原核表達(dá)載體pGEX-5X-3上，構(gòu)建原核重組質(zhì)粒pGEX-5X-3-ARD1，并在大腸桿菌中表達(dá)。挑選單克隆陽性菌，大量誘導(dǎo)表達(dá)GST-ARD1蛋白并純化。參照Kohler和Milstein建立的B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(KohlerG,MilsteinC,Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.Nature.1975Aug7;256(5517):495-7.)，本發(fā)明用純化的GST-ARD1蛋白免疫BALB/c小鼠。將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，制備雜交瘤細(xì)胞。用ELISA方法篩選陽性細(xì)胞克隆。本發(fā)明人經(jīng)過多次試驗，獲得了多株陽性細(xì)胞克隆。對這些陽性克隆所分泌的單克隆抗體進(jìn)行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)一株雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的ARD1單克隆抗體14D4在免疫組化試驗中呈陽性。該雜交瘤細(xì)胞株已于2008年1月24日以保藏號CGMCCNO.2354被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路，9中國科學(xué)院微生物研究所)。在天然狀態(tài)下，抗原決定簇的構(gòu)象保持較好，抗原容易與抗體結(jié)合。因此，在EL1SA、免疫沉淀、冰凍切片等抗原為天然狀態(tài)的檢測實驗中，對單克隆抗體的要求相對不高。但在臨床最常用的石蠟切片免疫組織(細(xì)胞)化學(xué)(簡稱免疫組化)檢測中，組織經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋以及酒精脫水等處理后，由于蛋白質(zhì)變性而使抗原決定簇的空間構(gòu)象被部分破壞，因此對單克隆抗體的特異性識別和結(jié)合能力要求高。同樣的原因，在石蠟切片免疫組化中需要較高的抗體效價。而本發(fā)明的單克隆抗體14D4經(jīng)實驗驗證，能很好地滿足免疫組化試驗要求。免疫組化是在保持組織和細(xì)胞原有形態(tài)和結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，用特定抗原的抗體與其反應(yīng)，然后通過示蹤的方法使抗原抗體反應(yīng)得以顯現(xiàn)的一項專門技術(shù)。由于該方法不僅能直觀地顯示某種特定抗原在受檢的組織或細(xì)胞中是否存在，更重要的是能直觀地顯示抗原在組織或細(xì)胞中存在的部位以及相對含量。因此免疫組化在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。經(jīng)鑒定，單克隆抗體14D4的亞類是IgG2a。還發(fā)現(xiàn)一株雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的ARD1單克隆抗體10C12可用于ELISA、免疫印跡、免疫沉淀等免疫學(xué)檢測。該雜交瘤細(xì)胞株已于2008年1月24日以保藏號CGMCCNO.2355被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)。經(jīng)鑒定，單克隆抗體10C12的亞類是IgG1。另一方面，本發(fā)明提供一種檢測ARD1蛋白質(zhì)水平的試劑盒，其含有本發(fā)明的單克隆抗體。該試劑盒除了含有本發(fā)明的單克隆抗體外，還可進(jìn)一步含有合適的試劑和/或緩沖液。本發(fā)明的單克隆抗體可以用任何已知的方法與檢測信號結(jié)合，作為檢測信號的標(biāo)記物可以是放射性同位素、熒光化合物、生物素和酶等。所述酶包括，但不限于，辣根過氧化物酶(horseradishPeroxidase,HRP)、堿性磷酸酶(alkalinephosphatease，AP)、葡萄糖氧化酶、P-D-半乳糖苷酶和脲酶等，優(yōu)選辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，針對不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于，鄰苯二胺(QPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、ABTS、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)、等。堿性磷酸酶的底物一般采用對硝基苯磷酸酯(p-NPP)、堿性磷酸酶紅(alkalinephosphatase-red,AP-Red,又稱FastRed,快紅)，AP也有發(fā)熒光底物(磷酸4-甲基傘酮)。本發(fā)明的試劑盒可用于檢測結(jié)腸癌、胃癌、食管癌等腫瘤及多種腫瘤細(xì)胞系及血清中的ARD1表達(dá)水平，進(jìn)而用于對上述多種腫瘤的輔助診斷和相關(guān)的實驗研究以及指導(dǎo)臨床治療。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，本發(fā)明的試劑盒除了所述單克隆抗體外，還含有第二抗體、顯色系統(tǒng)、或可被檢測的熒光和/或放射標(biāo)記，以及適宜的緩沖液。優(yōu)選其中第二抗體上標(biāo)記有生物素，并進(jìn)一步含有結(jié)合辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶的鏈霉親和素，顯色底物為鄰苯二胺(OPD)和/或堿性磷酸酶紅；或優(yōu)選其中第二抗體上直接標(biāo)有辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶，顯色底物為鄰苯二胺和/或堿性磷酸酶紅。標(biāo)記的第二抗體，現(xiàn)已有商品出售，可以直接商購獲得。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，本發(fā)明的試劑盒含有用純化的ARD1多克隆抗體包被的微量滴定板、ARD1標(biāo)準(zhǔn)抗原、本發(fā)明單克隆抗體、標(biāo)記有生物素的能夠與ARD1單克隆抗體結(jié)合的第二抗體、辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素、辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的相應(yīng)顯色底物，以及適宜的緩沖液。上述ARD1多克隆抗體可以利用本領(lǐng)域已知技術(shù)獲得，例如通過用ARD1蛋白質(zhì)或其與標(biāo)簽的融合蛋白免疫動物，取血，分出抗血清并純化制得。上述ARD1標(biāo)準(zhǔn)抗原可以利用本領(lǐng)域已知技術(shù)獲得，例如利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法。在本發(fā)明的另一個具體實施方式中，本發(fā)明的試劑盒含有用純化的ARD1多克隆抗體包被的微量滴定板、ARD1標(biāo)準(zhǔn)抗原、本發(fā)明單克隆抗體、直接標(biāo)記有辣根過氧化物酶或的能夠與ARD1單克隆抗體結(jié)合的第二抗體、辣根過氧化物酶和/或堿堿性磷酸酶性磷酸酶的相應(yīng)顯色底物，以及適宜的緩沖液。在本發(fā)明的另一個具體實施方式中，本發(fā)明的試劑盒含有本發(fā)明單克隆抗體、直接標(biāo)記有辣根過氧化物酶或的能夠與ARD1單克隆抗體結(jié)合的第二抗體、辣根過氧化物酶和/或堿堿性磷酸酶性磷酸酶的相應(yīng)顯色底物，以及適宜的緩沖液。在微量滴定板用于作標(biāo)準(zhǔn)抗原曲線的各孔中依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液，在樣品孔中加入待測血清樣品，溫育一段時間以使ARD1蛋白與ARD1多克隆抗體充分結(jié)合。洗滌微量滴定板，加入第一抗體，溫育一段時間，以使ARD1單克隆抗體與固定于微量滴定板上的ARD1蛋白充分結(jié)合。洗滌微量滴定板，加入第二抗體，溫育一段時間，以使第二抗體與固定于微量滴定板上的ARD1單克隆抗體充分結(jié)合。洗滌微量滴定板，加入辣根過氧化物酶/堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素，溫育一段時間，以使鏈霉親和素與生物素充分結(jié)合。洗滌微量滴定板，加入鄰苯二胺，室溫避光顯色。用酶標(biāo)儀讀取每個反應(yīng)孔的00492值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣品中ARD1的濃度。在本發(fā)明一個具體實施方式中，采用免疫組化方法利用本發(fā)明的試劑盒檢測組織或細(xì)胞ARD1的表達(dá)。所用試劑盒包括所述ARD1單克隆抗體，生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠lgG的抗體或兔抗小鼠lgG的抗體，結(jié)合辣根過氧化物酶/堿性磷酸酶的鏈霉親和素，酶相應(yīng)的顯色底物鄰苯二胺/堿性磷酸酶紅，以及適用于免疫組化的緩沖液。制備結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo的細(xì)胞爬片，固定細(xì)胞后，滴加分泌14D4抗體的雜交瘤上清液，溫育。用緩沖液沖洗爬片，然后滴加生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠lgG的抗體(第二抗體)，溫育。用緩沖液沖洗爬片，然后滴加結(jié)合辣根過氧化物酶/堿性磷酸酶的鏈霉親和素，溫育?；蛘叩诙贵w上直接標(biāo)記有辣根過氧化物酶/堿性磷酸酶，而不再滴加結(jié)合辣根過氧化物酶/堿性磷酸酶的鏈霉親和素。然后用DAB/AP-「ed進(jìn)行顯色反應(yīng)。如果細(xì)胞表達(dá)ARD1，則顯色反應(yīng)結(jié)果為細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕黃色/紅色，否則不顯色。另一方面，本發(fā)明提供一種抗腫瘤藥物，該抗腫瘤藥物含有本發(fā)明所述的單克隆抗體或其生物活性片段。如下述附圖和實施例中所證實的，本發(fā)明的ARD1單克隆抗體能夠與ARD1特異性、高效結(jié)合。因此，給予腫瘤患者本發(fā)明的單克隆抗體或該抗體的能夠與ARD1蛋白特異性結(jié)合的生物活性片段，可能抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)ARD1的活性，從而起到抑制腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的作用。因此，本發(fā)明還提供一種治療動物(包括人)腫瘤的方法，包括給予需要治療的動物治療有效量的本發(fā)明單克隆抗體或其生物活性片段。對此處所用"腫瘤"沒有特別限制，只要與ARD1的過表達(dá)相關(guān)即可，但優(yōu)選為結(jié)腸癌、食管癌、直腸癌或肺癌。所述藥物的制備方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法，例如將本發(fā)明的單克隆抗體或其生物活性片段與適當(dāng)?shù)馁x形劑混合。所述賦形劑是本領(lǐng)域常規(guī)用于抗體藥物制備的賦形劑，如水、鹽水、緩沖劑等。所述藥物的給藥途徑可以是任何抗體藥物的常規(guī)給藥途徑，例如，靜脈內(nèi)注射、皮下注射、腫瘤內(nèi)注射等。另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的單克隆抗體或其生物活性片段在體外檢測樣品中ARD1蛋白質(zhì)表達(dá)水平中的應(yīng)用。所用檢測方法包括可以使用本發(fā)明抗體的所有免疫方法，例如ELISA、WesternBlot、免疫沉淀、免疫組化、免疫熒光等，優(yōu)選為免疫組化。優(yōu)選所述樣品可為來自受試個體的生物流體(例如血液、組織液)和組織樣品(例如結(jié)腸癌組織、食管癌組織、直腸癌組織、肺癌組織)，更優(yōu)選所述樣品為血清。所述組織樣品經(jīng)福爾馬林固定、酒精脫水、石蠟包埋，制成35jjm的切片。實驗方法同上述檢測細(xì)胞株ARD1表達(dá)的方法。另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的單克隆抗體或其生物活性片段在制備用于輔助診斷和/或監(jiān)測腫瘤的試劑中的應(yīng)用。通過本發(fā)明的單克隆抗體或其生物活性片段體外檢測組織樣品中ARD1蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和/或監(jiān)測腫瘤患者樣本中ARD1蛋白質(zhì)水平的動態(tài)變化，可用于輔助診斷和/或監(jiān)測腫瘤。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，如上所述用本發(fā)明單克隆抗體對取自患者的可能為腫瘤的組織進(jìn)行免疫組化染色，在顯微鏡下觀察組織染色結(jié)果來確定是否表達(dá)ARD1蛋白質(zhì)，從而對組織是否為腫瘤作出診斷。通過判斷ARD1陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的比例以及表達(dá)的多少(陽性信號的強(qiáng)弱)可以進(jìn)一步協(xié)助腫瘤的分期。例如在結(jié)腸直腸癌、食管癌、肺癌中，大部分癌細(xì)胞表達(dá)ARD1，染色結(jié)果通常為強(qiáng)陽性。在本發(fā)明的一個具體實施例中，如上所述，用純化的ARD1多克隆抗體及本發(fā)明ARD1單克隆抗體進(jìn)行夾心ELISA對取自腫瘤患者的血清進(jìn)行常規(guī)ELISA實驗等免疫學(xué)實驗，從而可監(jiān)測樣本中尤其是血清中ARD1蛋白質(zhì)的動態(tài)變化水平。下面結(jié)合附圖和具體實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不受這些附圖和實施例的限制。圖1:12%SDS-PAGE電泳鑒定14D4抗體的純度。其中第1，2，3道電泳為66KD的蛋白質(zhì)分子量Marker(BSA，1BSA，2pg;BSA，3jjg)。4，5道為純化單抗14D4(1pg;2)jg);6，7道為純化單抗10C12(1ijg;2|jg)。電泳方向為從上到下。電泳速度快的條帶(下面的條帶)為分子量較小的單克隆抗體輕鏈，電泳速度慢的條帶(上面的條帶)為分子量較大的單克隆抗體重鏈。結(jié)果顯示，篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞株所分泌的抗體純度高，無雜帶。圖2:用包被GST-ARD1重組蛋白的微量滴定板以ELISA方法分析14D4抗體的效價。用包被GST的微量滴定板為陰性對照。將濃度分別為O、0,18、0.37、0.625、1.25、2.5、5^g/ml的純《七抗體14D4力口至U微量滴定板中。縱坐標(biāo)為OD492處的吸光度數(shù)值，橫坐標(biāo)為14D4抗體濃度。結(jié)果顯示14D4只特異結(jié)合GST-ARD1,與其它蛋白如GST無交叉反應(yīng)。圖3A和圖3B:用Western-Blot的方法檢測原核蛋白GST-ARD1以及結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo中內(nèi)源性ARD1的表達(dá)，其中，1:10C12;2:14D4;3:陽性對照(+);4:IgG。12%SDS-PAGE電泳，GST-ARD1每孔上樣量為100ng(GST純化蛋白每孔100ng為陰性對照)，LoVo細(xì)胞總蛋白上樣量50iJg，一抗為14D4、10C12濃度2.5pg/ml(正常小鼠血清純化IgG為陰性對照)檢測。結(jié)果顯示14D4、10C12可與GST-ARD1結(jié)合，而不結(jié)合GST(圖3A)。同時應(yīng)用14D4、10C12可檢測到LoVo細(xì)胞中內(nèi)源性ARD1的表達(dá)(圖3B)。圖4:免疫沉淀(IP)檢測LoVo細(xì)胞中ARD1的表達(dá)，其中，1:10C12;2:14D4;3:陽性對照(+);4:IgG。結(jié)果提示，抗體10C12可用于免疫沉淀反應(yīng)，而單抗14D4則不能進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。圖5:用14D4抗體或10C12抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)方法以檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo中ARD1的表達(dá)。結(jié)果顯示LoVo的細(xì)胞漿顯色為棕黃色，說明LoVo細(xì)胞株表達(dá)ARD1。圖6:用免疫熒光的方法檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo中ARD1的定位。一抗為14D4或10C12,二抗為FITC標(biāo)記的熒光二抗，同時應(yīng)用Hoechest染料染細(xì)胞核。結(jié)果綠色熒光主要分布于細(xì)胞漿中，少量分布于細(xì)胞核。從而提示ARD1主要定位于細(xì)胞漿，少量定位于細(xì)胞核。圖7:夾心ELISA檢測LoVo細(xì)胞中的ARD1。結(jié)果顯示抗ARD1兔多抗與單抗10C12配對的夾心ELISA，可用于檢測樣品，如血清中的ARD1。圖8:用免疫組化方法檢測結(jié)腸癌和結(jié)腸良性病變中ARD1的表達(dá)。結(jié)果顯示結(jié)腸癌癌旁正常組織(圖8C)及結(jié)腸良性病變中不表達(dá)ARD1(圖8D)，而結(jié)腸癌組織中可檢測到ARD1表達(dá)(圖8A、8B)。圖9:用免疫組化方法檢測食管癌、直腸癌和肺癌中ARD1的表達(dá)。結(jié)果顯示癌組織中可檢測到ARD1表達(dá)(癌)，而癌旁正常組織中不表達(dá)ARD1(癌旁)。圖10:應(yīng)用ELISA對單抗14D4與商品化單抗4B7-H4進(jìn)行比較。分別以GST-ARD1和GST包被96孔板。以不同濃度的單抗14D4、4B7-H4(0、0.18、0.37、0.625、1.25、2.5、5pg/ml)為一抗、進(jìn)行常規(guī)ELISA檢測。圖中縱坐標(biāo)為OD492處的吸光度數(shù)值，橫坐標(biāo)為抗體濃度。結(jié)果顯示2種單抗均可特異結(jié)合GST-ARD1，而與GST無交叉反應(yīng)；同時單抗14D4與原核重組蛋白GST-ARD1的反應(yīng)性明顯強(qiáng)于4B7-H4同GST-ARD1的反應(yīng)性。圖11:應(yīng)用WesternBlot和免疫沉淀對單抗14D4、10C12與商品化單抗4B7-H4進(jìn)行比較。12%SDS-PAGE電泳，GST-ARD1每孔上樣量為100ng，瞬時轉(zhuǎn)染pCMV-myc-ARD1質(zhì)粒的Hela細(xì)胞總蛋白上樣量100jjg，常規(guī)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗，分別為14D4、4B7-H4、正常小鼠血清純化lgG、或抗myc抗體進(jìn)行常規(guī)WesternBlot檢測。結(jié)果顯示單抗14D4、4B7-H4均可特異結(jié)合GST-ARD1，而單抗14D4與原核重組蛋白GST-ARD1的反應(yīng)性較4B7-H4強(qiáng)(圖11A);應(yīng)用14D4可檢測到Hela細(xì)胞中內(nèi)源性ARD1的表達(dá)(圖11B)。單抗4B7-H4不能檢測真核細(xì)胞內(nèi)源性的ARD1，或轉(zhuǎn)染的外源性myc-ARD1(圖"B)。免疫沉淀實驗提示，與單抗4B7-H4相比，單抗10C12與LoVo細(xì)胞中天然的ARD1蛋白有更強(qiáng)的相互作用(圖11C)。圖12:用不同抗體進(jìn)行免疫組化，檢測結(jié)腸癌中ARD1的表達(dá)。結(jié)果顯示單抗14D4可檢測到結(jié)腸癌組織中ARD1表達(dá)，而商品化單抗4B7-H4不能用于組化檢測。用于專利程序的生物材料保藏信息抗ARD1(Humanarrestdefective1)的雜交瘤細(xì)胞株(分泌本發(fā)明單克隆抗體14D4)保藏單位全稱及簡稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏編號CGMCCNO.2354;保藏日期2008年1月24日抗ARD1(Humanarrestdefective1)的雜交瘤細(xì)胞株(分泌本發(fā)明單克隆抗體10C12)保藏單位全稱及簡稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏編號CGMCCNO.2355;保藏日期2008年1月24日具體實施例方式實施例1抗人ARD1單克隆抗體的制備1、ARD1抗原的制備分別設(shè)計ARD1基因(GenBankAccessionNo.NM—003491)cDNA片段的5'端正義引物5'-A丌GGATCCTCGCCACCATGAACATCCGCAATGCG-3'(SEQIDNo.1)和3'端反義引物5'-AATGAATTCTAGGAGGCTGAGTCGGAG-3'(SEQIDNo.2)(引物由上海生工生物工程公司合成)，并于引物兩端分別引入SamHI和EcoRI酶切位點。用Trizol(購自lnvitrogen公司)提取人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo(ATCC編號CCL-229)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并應(yīng)用上述17引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增ARD1cDNA片段，產(chǎn)物長度為712bp。將PCR產(chǎn)物和pGEX-5X-3載體(購自AmershamBiosciences公司)分別都用SamHI和EcoRI酶切后進(jìn)行連接，將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21菌株并挑取單克隆進(jìn)行酶切鑒定，同時送測序。原核表達(dá)載體pGEX-5X-3的SD序列下游就是谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因，而克隆的外源ARD1基因則與GST基因相連。當(dāng)基因表達(dá)時，表達(dá)產(chǎn)物為GST和ARD1基因產(chǎn)物的融合體GST-ARD1，以方便ARD1的純化。挑選測序正確陽性克隆的BL21菌株進(jìn)行GST-ARD1重組蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)。取小量誘導(dǎo)表達(dá)鑒定為陽性的菌株進(jìn)行GST-ARD1重組蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)明人對ARD1的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了探索，使用大腸桿菌BL21菌株，溫度為27°C，誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為0.2mmol/L，誘導(dǎo)時間為3小時。在此條件下，GST-ARD1的表達(dá)量最高，而且表達(dá)的蛋白主要是分泌型蛋白。用能夠吸附GST融合蛋白的谷胱甘肽珠子(GlutathioneSepharose4B，購自AmershamBiosciences公司)純化GST-ARD1重組蛋白，并回收、鑒定。2、ARD1單克隆抗體的制備用純化的GST-ARD1重組蛋白免疫68周齡的BALB/c小鼠，6周后強(qiáng)化免疫。將免疫好的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。用ELISA方法篩選分泌抗ARD1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。再用有限稀釋法對陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行多次亞克隆。選取強(qiáng)陽性的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)、建株，其中一株所分泌的抗ARD1單克隆抗體命名為14D4，而該雜交瘤細(xì)胞株即為14D4細(xì)胞株。該雜交瘤細(xì)胞株已于2008年1月24日以保藏號CGMCCNQ.2354被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)；另一株所分泌的抗ARD1單克隆抗體命名為10C12,而該雜交瘤細(xì)胞株即為10C12細(xì)胞株。該雜交瘤細(xì)胞株己于2008年1月24日以保藏號CGMCCNO.2355被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)。將14D4細(xì)胞或10C12細(xì)胞接種于10周齡BALB/C小鼠的腹腔中，至腹水形成增多腹部特別膨隆時處死小鼠取腹水，其內(nèi)含大量14D4或10C12抗體。實施例2鑒定14D4抗體或10C12抗體的純度用常規(guī)ELISA方法鑒定14D4抗體或10C12抗體的亞類，證實其分別為lgG2a、IgG1，因此選用Pro.AS印harose-4B柱進(jìn)行純化，并用12%SDS-PAGE電泳鑒定其純度。結(jié)果見圖1，顯示14D4抗體或10C12抗體純度高、無雜帶。實施例3測定14D4抗體的效價用PBS緩沖液透析純化的14D4抗體，用紫外線分光光度計在280nm處測定抗體的濃度。1、在GST-ARD1蛋白包被的微量滴定板中分別加入濃度為0、0.18、0.37、0.625、1.25、2.5、5|ag/ml的14D4抗體。并將同樣濃度的14D4抗體加入GST蛋白包被的微量滴定板中作為陰性對照。室溫溫育1小時。2、0.05%Tween-20/PBS洗滌反應(yīng)孔3次，PBS洗滌反應(yīng)孔2次。3、加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG的抗體，室溫溫育1小時。4、0.05%Tween-20/PBS洗滌反應(yīng)孔3次，PBS洗滌反應(yīng)孔2次。5、向反應(yīng)孔中加入辣根過氧化物酶底物OPD，室溫顯色30分鐘后，加入終止液(12.5%H2S04)。用酶標(biāo)儀測量OD492處的吸光度值。結(jié)果見圖2，14D4抗體特異結(jié)合GST-ARD1，并且與GST無交叉反應(yīng)。對10C12抗體進(jìn)行類似的效價實驗，結(jié)果未顯示。實施例4Western-Blot檢測ARD1的表達(dá)。1、Western-Blot檢測GST畫ARD11)取純化的GST-ARD1和GST蛋白行12%的SDS-PAGE電泳，每孔蛋白上樣量為100ng。2)至溴酚藍(lán)達(dá)到膠的最下緣時停止，進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。3)轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，麗春紅染色，檢測轉(zhuǎn)膜效果以及做好標(biāo)記。4)5%脫脂奶粉封閉，4。C過夜。5)加一抗14D4或10C12抗體，濃度為2.5jug/ml，正鼠lgG為陰性對照，室溫1小時。6)0.1。/。Tween-20/PBS洗滌7次。7)加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG的抗體，室溫溫育40分鐘。8)0.1%Tween-20/PBS洗滌7次，PBS洗滌1次。9)發(fā)光顯影。結(jié)果見圖3A，14D4抗體或10C12抗體特異結(jié)合GST-ARD1，并且與GST無交叉反應(yīng)。2、Western-Blot檢測LoVo細(xì)胞中內(nèi)源性ARD1表達(dá)。細(xì)胞裂解液RIPA(Tris(pH7.4),150mMNaCI，1%TritonX-100，1%sodiumdeoxycholate，0.1%SDS)裂解LoVo細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，行12%的SDS-PAGE電泳，每孔蛋白上樣量為50昭。其余步驟同前。結(jié)果顯示14D4抗體、10C12抗體能檢測到人結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo中內(nèi)源性ARD1(圖3B)。實施例5免疫沉淀(IP)檢測LoVo細(xì)胞中ARD1的表達(dá)1、細(xì)胞裂解液RIPA裂解LoVo細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。2、取200叩細(xì)胞總蛋白分別與單抗10C12或14D4雜交瘤上清0.5ml4。C孵育2h。3、力口入ProteinGSepharose4FastFlow(GEHealthcare'Uppsala,Sweden),4°C孵育2h。4、反應(yīng)混合物用PBST洗滌3遍后，行常規(guī)12%的SDS-PAGE電泳。5、轉(zhuǎn)膜封閉后，以單抗14D4為一抗進(jìn)行常規(guī)Westernblot檢測。結(jié)果見圖4，10C12可與LoVo細(xì)胞中天然構(gòu)象的ARD1反應(yīng)，而單抗14D4則不能進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。實施例6免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo中ARD1的表達(dá)1、常規(guī)方法制備結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo的細(xì)胞爬片，冷丙酮/甲醇(體積比1:1)固定。2、將爬片浸泡于3%1~1202(PBS稀釋)內(nèi)10分鐘，以去除內(nèi)源性過氧化物酶。3、PBS洗漆爬片2次。然后用1%BSA(PBS稀釋)在37。C下封閉30分鐘。滴加適宜濃度的14D4抗體或10C12抗體，在37"C下反應(yīng)1小時。4、PBS洗滌爬片3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG的抗體工作液(DAKOENVISION+SystemHRPMouse),在37。C下反應(yīng)1小時。5、用PBS洗滌爬片3次，在辣根過氧化物酶底物DAB的溶液中顯色20分鐘。6、用PBS終止顯色，將爬片反蓋在載玻片上，顯微鏡下觀察，以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀為陽性。結(jié)果見圖5，顯示LOVO細(xì)胞漿為棕黃色，說明LOVO細(xì)胞株表達(dá)ARD1。實施例7免疫熒光檢測ARD1在結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo中的定位。1、常規(guī)方法制備結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo的細(xì)胞爬片，冷丙酮/甲醇(體積比1:1)固定。2、將爬片浸泡于3%1~1202(PBS稀釋)內(nèi)10分鐘，以去除內(nèi)源性過氧化物酶。3、PBS洗滌爬片2次。然后用1。/。BSA(PBS稀釋)在37'C下封閉30分鐘。滴加適宜濃度的14D4抗體或10C12抗體在37'C下反應(yīng)1小時。4、用PBS洗滌爬片3次。5、50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察照相。如圖，LoVo細(xì)胞漿可見大量綠色熒光，胞核中隱約可見少量綠色熒光，藍(lán)色熒光為Hoechest著染的細(xì)胞核。結(jié)果顯示ARD1主要定位于細(xì)胞漿中，小部分定位于細(xì)胞核中(圖6)。實施例8夾心ELISA方法檢測結(jié)腸癌細(xì)胞中ARD1的表達(dá)1、以抗ARD1純化兔多抗10|jg/ml包被96孔板，4°C包被過夜。2、封閉后加入LoVo細(xì)胞裂解液50叩，室溫反應(yīng)1h。同時以25ng純化的His-ARD1蛋白作為陽性對照，PBS作為陰性對照(Control)。3、PBST洗滌5遍后，加入1ijg/ml的抗ARD1單抗10C12，室顯反應(yīng)1h。4、PBST洗滌5遍后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG的抗體，室溫孵育1h。5、PBST洗滌5遍后，常規(guī)OPD現(xiàn)色，并測定OD啦處的吸光度值。結(jié)果見圖7，應(yīng)用夾心ELISA可檢測到LoVo細(xì)胞中的ARD1。實施例9免疫組化檢測結(jié)腸癌和結(jié)腸良性病變、食管癌、直腸癌和肺癌中ARD1的表達(dá)1、選取結(jié)腸癌和結(jié)腸良性病變組織進(jìn)行常規(guī)福爾馬林固定、酒精脫水、石蠟包埋，切成4pm厚的切片。在6CTC烘烤4小時，以使切片牢固地附著于載玻片上。2、用二甲苯對切片進(jìn)行脫蠟處理，梯度酒精使切片水化，用PBS洗滌切片2次。3、將切片浸泡于3%1~1202(PBS稀釋)內(nèi)10分鐘，以去除內(nèi)源性過氧化物酶。然后用PBS洗滌切片3次。4、將切片浸泡于pH6.0的0.1M枸櫞酸鈉緩沖液中，在92°C~10CTC煮10分鐘，進(jìn)行抗原修復(fù)。待切片自然冷卻至室溫后，用去離子水洗滌切片2次，再用PBS洗滌切片2次。5、將5%脫脂奶粉(PBS稀釋)滴加于切片上，在37。C下溫育1小時，進(jìn)行抗原封閉。6、在切片上滴加適宜濃度的14D4抗體，4'C孵育過夜。然后用PBS洗滌切片3次。7、在切片上滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠lgG的抗體工作液(DAKOENVISION+SystemHRPMouse),在37。C下溫育1小時。8、用PBS洗滌切片2次，將切片浸泡于在辣根過氧化物酶底物DAB的溶液中顯色20分鐘。9、用PBS終止顯色，用蘇木精對切片進(jìn)行復(fù)染。用1%鹽酸酒精分化切片，梯度酒精脫水，二甲苯透明，然后將蓋玻片蓋在組織切片上，顯微鏡下觀察。結(jié)果見圖8，顯示癌旁正常組織(圖8C)結(jié)腸良性病變中不表達(dá)ARD1(圖8D)，而結(jié)腸癌組織中有ARD1的高表達(dá)(圖8A，8B)。用與上述類似的步驟采用免疫組化方法檢測食管癌、直腸癌和肺癌中ARD1的表達(dá)。結(jié)果顯示癌組織中可檢測到ARD1表達(dá)(癌)，而癌旁正常組織中不表達(dá)ARD1(癌旁)。(結(jié)果具體參見圖9)。實施例10單抗14D4、10C12與Abnova公司商品化抗ARD1單抗(M01;4B7-H4)的比較分別應(yīng)用ELISA、Westernblot、免疫沉淀、免疫組化對抗體進(jìn)行比較，具體方法同實施例3，4，5，9。ELISA、Westernbolt結(jié)果提示當(dāng)加入抗體濃度相同時，單抗14D4與原核重組蛋白GST-ARD1的反應(yīng)性較4B7畫H4強(qiáng)(圖10、圖11A);WesternBlot結(jié)果提示單抗4B7-H4不能檢測真核細(xì)胞內(nèi)源性的ARD1，或轉(zhuǎn)染的外源性myc-ARD1(圖"B);免疫沉淀實驗提示，與單抗4B7-H4相比，單抗10C12與LoVo細(xì)胞中天然的ARD1蛋白有更強(qiáng)的相互作用(圖11C);同時單抗14D4可用于免疫組化檢測，而單抗4B7-H4則不能用于組化檢測(圖12)。因此本發(fā)明的單抗在應(yīng)用方面優(yōu)于商品化的單抗。實施例11ARD1表達(dá)與多種腫瘤臨床病理特征的相關(guān)分析本發(fā)明人利用本發(fā)明的單抗14D4對收集的50對臨床結(jié)腸癌,及20例腸炎組織進(jìn)行石蠟切片免疫組化分析。結(jié)果，50例結(jié)腸癌組織中有41例表達(dá)ARD1(82%);50例癌旁正常組織中有12例表達(dá)ARD1(24。/o);而20例良性病變(腸炎組織)中，均無ARD1表達(dá)(0%)。經(jīng)PearsonX2檢驗，ARD1在結(jié)腸良性病變和結(jié)腸癌組織中的表達(dá)具有顯著性差異(PO.001)(表1)。結(jié)果提示ARD1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)的比例很高，因此它為一個新的結(jié)腸癌腫瘤標(biāo)志物。同時我們對食管癌、直腸癌、肺癌中ARD1的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果提示ARD1在這三種腫瘤的癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)具有顯著性差異(P<0.001)(表2、3、4)。表1.免疫組化檢測ARD1在結(jié)腸組織中的表達(dá)。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>序歹lj表<110>北京市腫瘤防治研究所<120>ARD1的單克隆抗體及其應(yīng)用<130>GAI08CN0224C<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1attggstcctcgccaccatga3catccgcaatgcg35<210>2<2">27<212>DNA<213>人工序列<220><223>弓|物<400>2aatgaattctaggaggctgagtcggag2權(quán)利要求1.針對ARD1蛋白質(zhì)的單克隆抗體或者來源于該抗體的能夠特異性結(jié)合ARD1的生物活性片段，所述單克隆抗體由保藏號為CGMCCNO.2354或CGMCCNO.2355的雜交瘤細(xì)胞分泌。2.分泌權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其保藏號為CGMCCNO.2354或CGMCCNO.2355。3.權(quán)利要求1的單克隆抗體的制備方法，該方法包括用融合蛋白GST-ARD1免疫小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出能夠分泌對ARD1有反應(yīng)性、對谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶沒有反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤上清液中或從注射雜交瘤細(xì)胞后的動物腹水中獲取單克隆抗體。4.一種檢測ARD1蛋白質(zhì)水平的試劑盒，其含有權(quán)利要求1的單克隆抗體。5.權(quán)利要求4的試劑盒，其還含有第二抗體、顯色系統(tǒng)、或可被檢測的熒光和/或放射標(biāo)記，以及適宜的緩沖液。6.權(quán)利要求5的試劑盒，其中第二抗體上標(biāo)記有生物素，并進(jìn)一步含有結(jié)合辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶的鏈霉親和素，顯色底物為鄰苯二胺和/或堿性磷酸酶紅；或其中第二抗體上直接標(biāo)有辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶，顯色底物為鄰苯二胺和/或堿性磷酸酶紅。7.權(quán)利要求4的試劑盒，該試劑盒含有用純化的ARD1多克隆抗體包被的微量滴定板、ARD1標(biāo)準(zhǔn)抗原、權(quán)利要求1所述單克隆抗體、標(biāo)記有生物素的能夠與ARD1單克隆抗體結(jié)合的第二抗體、辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素、辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的相應(yīng)顯色底物，以及適宜的緩沖液；或該試劑盒含有用純化的ARD1多克隆抗體包被的微量滴定板、ARD1標(biāo)準(zhǔn)抗原、權(quán)利要求1所述單克隆抗體、直接標(biāo)記有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的能夠與ARD1單克隆抗體結(jié)合的第二抗體、辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶的相應(yīng)顯色底物，以及適宜的緩沖液；或該試劑盒含有ARD1標(biāo)準(zhǔn)抗原、權(quán)利要求1所述單克隆抗體、直接標(biāo)記有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的能夠與ARD1單克隆抗體結(jié)合的第二抗體、辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶的相應(yīng)顯色底物，以及適宜的緩沖液。8.—種抗腫瘤藥物，該抗腫瘤藥物含有權(quán)利要求1的單克隆抗體或其生物活性片段。9.權(quán)利要求1的單克隆抗體或其生物活性片段在體外檢測樣品中ARD1蛋白質(zhì)表達(dá)水平中的應(yīng)用；優(yōu)選所述樣品為血液、結(jié)腸癌組織、食管癌組織、直腸癌組織或肺癌組織等腫瘤組織，更優(yōu)選所述樣品為血清。10.權(quán)利要求1的單克隆抗體或其生物活性片段在制備用于輔助診斷和/或監(jiān)測腫瘤的試劑中的應(yīng)用；優(yōu)選所述的腫瘤為結(jié)腸癌、食管癌、直腸癌或肺癌。全文摘要本發(fā)明涉及ARD1的單克隆抗體及其應(yīng)用。具體地說，本發(fā)明涉及由保藏號為CGMCCNO.2354或CGMCCNO.2355的雜交瘤細(xì)胞分泌的針對ARD1蛋白質(zhì)的單克隆抗體以及分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本發(fā)明的單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點，能夠用于免疫組化、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀、免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗等免疫學(xué)檢測，從而可檢測結(jié)腸癌、胃癌、食管癌等腫瘤及多種腫瘤細(xì)胞系的ARD1表達(dá)水平，進(jìn)而用于對上述多種腫瘤的輔助診斷和相關(guān)的實驗研究，以及指導(dǎo)臨床治療。文檔編號A61K39/395GK101514230SQ20081005777公開日2009年8月26日申請日期2008年2月18日優(yōu)先權(quán)日2008年2月18日發(fā)明者任婷婷,健吳,姜北海,壽成超申請人:北京市腫瘤防治研究所