專利名稱：：草藥組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種單獨包含作為活性成分的治療有效量的蔞葉(P^w6"/e)葉子提取物，或者還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑的草藥組合物。所述草藥組合物適于治療對伊馬替尼(imatinib)(格列衛(wèi)(gleevec或glivec))的治療顯示出耐藥性的慢性髓樣白血病(chronicmyeloidleukemia)(CML;慢性骨蘧'l"生白血病(chronicmyelogenousleukemia))。本發(fā)明還涉及制備所述草藥組合物的方法以及對顯示伊馬替尼耐藥性的CML患者施用該組合物的方法。
背景技術(shù)：
：慢性髓樣白血病也被稱為慢性骨髓性白血病(下文稱為CML),是一種惡性骨髓癌癥，其特征在于骨髓中主要的髓樣細胞的增加的、不受控制的克隆產(chǎn)生。根據(jù)國家癌癥研究所(NCI)的研究(ChronicMyeloidLeukemia:Treatment:HealthProfessionalVersion:GeneralInformation2006),CML的特征在于染色體相互易位9:22，從而產(chǎn)生了費城染色體(Ph)。該事件發(fā)生在多能造血千細胞中，并且9號染色體上的編碼酪氨酸激酶(PTK)蛋白質(zhì)的c-abl原癌基因轉(zhuǎn)座到22號染色體上Bcr基因的第二個外顯子下游的新位置上。這種易位產(chǎn)生了一個新的融合基因Bcr-Abl,該基因編碼嵌合蛋白質(zhì)p210Bcr-Abl，與c-abl相比,該蛋白質(zhì)的PTK活性調(diào)節(jié)異常。Bcr-Abl融合蛋白質(zhì)引發(fā)了一系列不恰當?shù)脑煅毎鲋常虼藢?dǎo)致了白血病轉(zhuǎn)化(DruckerBJ等人；Chronicmyelogenousleukaemia.Hematology.Jm.Soc./fema^/.尸rog廠am,111-135(2002))。jl匕夕卜，在壽爭基因小鼠中表達p210Bcr-Abl顯示可以引發(fā)CML樣骨髓增生性疾病。因此，p210Bcr-Abl似乎作為CML的主要病因起重要的作用(ClarksonBD等人；丄ew&m&.:11:1404-1428(1997))。CML的發(fā)展分為三個階段。大部分患者在第一階段被診斷出來，該階段被稱為慢性期，持續(xù)時間的中位數(shù)為4-6年。隨著時間的推移，CML可以發(fā)展到被稱為加速期的第二階段，以及最終發(fā)展到了被稱為急變期或原始細胞危象(blastcrisis)的第三階段。在慢性期，血液和骨髓中的白細胞高于正常值。此時，大部分白細胞為可以正常工作的成熟細胞。隨著疾病的緩慢發(fā)展，會經(jīng)過一個加速期，此時的特征為在血液、骨髓和脾臟中出現(xiàn)未分化的母細胞(未成熟的白細胞)。隨后，加速期發(fā)展至疾病最終的原始細胞危象期。在這個階段中，患者存活時間的中位數(shù)為18周。急變期的特征為血液和骨髓細胞中存在多于30%的母細胞。患者經(jīng)診斷為CML后的存活時間的中位數(shù)為4-6年，范圍為不到1年至多于10年(NationalCancerInstitute:ChronicMyeloidLeukemia:Treatment:HealthProfessionalVersion:GeneralInformation2006)。CML患者的治療選擇非常有限，并且取決于白血病的發(fā)展階段以及患者的年齡和健康水平。該疾病可以通過骨髓移植(BMT)或藥物進行治療。BMT治療包括給予患者一種或多種極高劑量的藥物來殺死骨髓中的大部分癌細胞，并使用來自捐獻者的健康細胞代替毀壞的干細胞，該捐贈者的組織類型需要與患者的組織類型幾乎完全匹配。但是，使用這種治療受限于是否有捐獻者以及與治療相關(guān)的發(fā)病率和死亡率。CML患者的第二種治療選擇是藥物治療。已經(jīng)證明包括使用羥基脲或白消安的口服骨髓抑制性化療可以控制CML患者的血細胞計數(shù)并改善癥狀，但是對于生存時間的影響較小(HehlmannR等人；Blood:82:398-407(1993))。干擾素-a已經(jīng)成為治療CML的一種治療選擇，并已顯示出可以延長CML患者的生存時間。但是，有報導(dǎo)稱有些患者對干擾素-a的治療顯示耐藥性(KuhrT等人，i仏27(5):405-411(2003))。相對較新的藥物伊馬替尼(格列衛(wèi)(gleevec或glivec))是目前治療CML的最特效的藥物，并被認為是非常有效的治療藥物。上面已經(jīng)討論了Ph染色體產(chǎn)生了Bcr-Abl融合蛋白質(zhì)，因而產(chǎn)生了具有組成型活性并且不受調(diào)控的酪氨酸激酶蛋白質(zhì)。伊馬替尼通過抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶來發(fā)揮作用(BuchdungerE.等人；說oc/^m.爿da1551,Ml1-M18(2001))。該藥物具體通過竟爭性抑制酶上的ATP結(jié)合位點來發(fā)揮作用，因而導(dǎo)致了表達Bcr-Abl的細胞的生長停滯或細胞凋亡(RadfordIR等人；CurrentOpinionInvestigationaldrugs3，492-499(2002))。伊馬替尼對CML患者的有效性是基于總的血液和細胞遺傳響應(yīng)率。盡管有明顯的血液和細胞遺傳響應(yīng)，但是在CML患者中也觀察到了對伊馬替尼的耐藥性，特別是在那些已經(jīng)發(fā)展到加速期或急變期的患者中。美國專利申請公布No.20030158105("美國105專利申請")描述了關(guān)于CML患者的伊馬替尼耐藥性的可能的機理，并公開了一些與伊馬替尼耐藥性相關(guān)的Bcr-Abl突變。人們已經(jīng)嘗試尋找預(yù)防或克服這種耐藥性的治療新策略。最近發(fā)現(xiàn)兩種實驗性藥物，即尼羅替尼(nilotinib,AMN-107)和達沙替尼(dasatinib,BMS-354825)，可以有效地避免一些但不是全部形式的伊馬替尼耐藥性。發(fā)現(xiàn)尼羅替尼對CML患者的治療是有效的；但是，攜帶T315I突變的患者對該藥物耐藥(BocchiaM等人EmergingdrugsinCML;C^Z".￡mwgZ"gZ>w^(2006)11(4):651-664)。T315I突變是在伊馬替尼耐藥的患者中較為普遍的一種突變。已經(jīng)顯示T315I突變可以保留激酶活性，從而使得伊馬替尼與Bcr-Abl的結(jié)合無效。已發(fā)現(xiàn)，另外一種還處于臨床前階段的藥物ON-0122380既能夠抑制野生型也能夠抑制伊馬替尼耐藥的T315I突變體，但是，由于該藥還沒有進入臨床試驗階段，其安全性和防止出現(xiàn)伊馬替尼耐藥性的有效性還有待評價。但是，盡管有了這些進展，人們?nèi)孕枰獙ふ夷軌蛴行挂榴R替尼耐藥性CML的藥物。本發(fā)明人已經(jīng)進行了廣泛的研究，旨在發(fā)現(xiàn)能夠解決CML患者對伊馬替尼治療耐藥問題的解決方案。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)含蔞葉葉子提取物的組合物對伊馬替尼耐藥性Bcr-Abl突變細胞系顯示出強烈的抗增殖活性。本發(fā)明的優(yōu)勢在于，通過簡單的制備方法即可獲得該草藥混合6物。最重要的是，該組合物不僅顯示出理想的功效，同時還具有非常高的安全性。
發(fā)明內(nèi)容一方面，本發(fā)明涉及一種單獨包含治療有效量的蔞葉葉子提取物，或者還包含至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的草藥組合物，該組合物適于治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病(CML)。另一方面，本發(fā)明涉及一種包含治療有效量的蔞葉葉子提取物和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的草藥組合物，其中，當被用于治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病(CML)時，該組合物由于較高的安全性水平而具有優(yōu)勢。另一方面，本發(fā)明涉及一種用于治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病(CML)的單獨包含治療有效量的蔞葉葉子提取物，或者還包含至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物，其中，伊馬替尼耐藥性是由Bcr-Abl突變引起的。再一方面，本發(fā)明涉及一種制備包含治療有效量的蔞葉葉子提取物和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的草藥組合物的方法。再一方面，本發(fā)明涉及一種本發(fā)明的組合物的給藥方法，該組合物適于治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病。另一方面，本發(fā)明涉及一種單獨包含治療有效量的蔞葉葉子提取物作為活性成分，或者還包含至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的草藥組合物，其中，所述組合物被配制用于口服、腸胃外、腹膜內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或關(guān)節(jié)內(nèi)給藥。再另一方面，本發(fā)明涉及一種治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病的方法，該方法包括給需要這種治療的患者施用治療有效量的草藥組合物。再另一方面，本發(fā)明涉及所述草藥組合物在制備治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病的藥物中的用途。圖1示出了蔞葉葉子提取物對K-562細胞系的體外活性，證明了該提取物抑制Bcr-Abl激酶的活性。圖2示出了在伊馬替尼耐藥性Bcr-Abl突變細胞系中，蔞葉葉子提取物誘導(dǎo)的細胞凋亡。圖3a示出了在SCID小鼠的野生型Ba/F3Bcr-Abl/p210WT異種移植物模型中，蔞葉葉子提取物顯示出與伊馬替尼相當?shù)捏w內(nèi)有效性(第一套)。圖3b示出了在抑制SCID小鼠中最主要的突變Bcr-Abl形式(即Ba/F3Bcr-Abl/T315I)異種移植模型方面，蔞葉葉子提取物顯示出比伊馬替尼更高的體內(nèi)有效性(第二套)。具體實施例方式本發(fā)明是基于一種包含治療有效量的蔞葉葉子提取物作為活性成分的草藥組合物能夠有效對抗伊馬替尼耐藥的Bcr-Abl突變細胞系的發(fā)現(xiàn)，因此，本發(fā)明是癌癥(尤其是白血病)領(lǐng)域的重要發(fā)明。具體而言，本發(fā)明的意義在于其提供了解決目前出現(xiàn)的伊馬替尼(一種用于治療可怕的疾病CML的創(chuàng)新藥物)耐藥性的解決方案。以下是本發(fā)明中所使用的術(shù)語的定義的列表。除非在特殊情況下另外限定，在整個說明書中使用時，這些定義適用于這些術(shù)語。此處所使用的術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"是指賦形劑、稀釋劑和/或它們的鹽必須與制劑中的其它成分兼容，并對接受者無害。此處所使用的術(shù)語"藥學(xué)上可接受的賦形劑"是指無毒性的、惰性的固體、半固體、稀釋劑、包封材料或任何類型的配制助劑?？勺鳛樗帉W(xué)上可接收的賦形劑使用的材料的一些例子有糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，例如羧曱基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；麥芽；明膠；滑石；以及其它無毒性的兼容性潤滑劑，例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、涂層劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑；根據(jù)配制者的判斷，該組合物中還可以含有防腐劑和抗氧化劑。此處所使用的術(shù)語"治療有效量"是指足以顯著引起待調(diào)控或治療的疾病狀況改善的組合物(例如蔞葉葉子提取物)的量，但是在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，該量又足夠低而不會引起副作用(如果有的話(以合理的利益/風(fēng)險比))。化合物或組合物的治療有效量根據(jù)所治療的具體疾病、最終使用者的年齡和身體狀況、所治療/預(yù)防的疾病狀況的嚴重性、治療的持續(xù)時間、同時進行的治療的性質(zhì)、具體使用的化合物或組合物、具體使用的藥學(xué)上可接受的賦形劑等因素而變化。術(shù)語"蔞葉葉子的提取物"和"蔞葉葉子提取物"可互換使用。此處所使用的術(shù)語"提取物"是指蔞葉葉子的提取物。術(shù)語提取物或蔞葉葉子提取物是指蔞葉植物的葉子中存在的化合物的混合物。使用本領(lǐng)域公知的提取方法來制備提取物(例如使用有機溶劑(例如低級醇類、烷基酯類、烷基醚類、烷基酮類、氯仿、石油醚、己烷)和/或無機溶劑(例如水))。術(shù)語"草藥組合物"或"組合物"可互換使用，可以指單獨包含治療有效量的蔞葉葉子提取物或者還包含至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。術(shù)語"單獨"可以進一步指該組合物僅包含蔞葉葉子提取物，而不添加任何藥學(xué)上可接受的賦形劑。此處所使用的術(shù)語"大約，，是指一個特定值±20%的范圍。例如，用語"大約20，，包括20±20%,即16至24。除非另外明確說明，說明書和附加的權(quán)利要求書中所使用的單數(shù)形式"一個"、"一種"和"該"包括所指對象的復(fù)數(shù)形式。蔞葉(尸/p^6e"eL)是植物betelvine的植物學(xué)名。蔞葉植物的心形綠葉在印度被廣泛稱為。蔞葉屬于胡椒科(i^^rac^e),即黑胡椒科(GuntherE.:T7^五^e""a/o&，5:160-161(1952))。蔞葉植物的葉子也通常被稱為蔞葉(betelleaf)。已經(jīng)報導(dǎo)了使用蔞葉提取物(下文稱為"提取物")治療不同的疾病日本公布的專利申請JP2001098267公開了使用該提取物作為抗氧化劑；JP2002212086/>開了該提取物具有極好的抗細菌活性；JP9278666教導(dǎo)了該提取物可用于殺滅口腔內(nèi)的微生物和消除對齲齒病因的影響；JP200130685報告了使用該提取物作為抗過敏藥；PCT公布的專利申請WO0245730公開了利用該提取物的抗單核細胞活性；WO0245731教導(dǎo)了該提取物在治療內(nèi)臟利什曼病或黑熱病中的有效性，以及美國專利No.6967034教導(dǎo)了該提取物在治療CD33+急性和慢性髓樣白血病中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及單獨包含作為活性成分的蔞葉葉子提取物或者還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑的草藥組合物。蔞葉的葉子選自下述類型野生型、Climber型、Bangla型和Sweet型。一方面，根據(jù)本發(fā)明的草藥組合物單獨包含治療有效量的蔞葉葉子提取物("提取物")作為活性成分，或者還包含至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。該組合物中包含的提取物的治療量為組合物總重量的大約5%至大約50%(w/w)。本發(fā)明的組合物可以根據(jù)藥學(xué)領(lǐng)域公知的任何方法進行制備。所有的方法都包括將活性成分(即提取物)與適當選擇的藥學(xué)上可接受的賦形劑相結(jié)合的步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道或明白用于制備可施用的組合物的實際方法和受試者給藥所需的調(diào)節(jié)，例如在《Remington:TheScienceAndPracticeOfPharmacy》,Gennaro,A.，Lippincott,Williams&Wilkins，Philadelphia(2000)(以前稱為《RemingtonsPharmaceuticalSciences》)中有更詳細的描述。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種制備該草藥組合物的方法，包括以下步驟(a)制備蔞葉葉子提取物；(b)將步驟(a)中的提取物與至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑混合以獲得所述組合物。10本發(fā)明所使用的蔞葉葉子提取物是根據(jù)常規(guī)提取方法制備的。制備蔞葉葉子提取物的一般程序如下所述。本發(fā)明的草藥組合物可被配制用于口服給藥，即通過將活性成分(即提取物)與普通無毒性的藥學(xué)上可接受的賦形劑配制成為片劑、丸劑、顆粒劑、膠嚢劑、溶液、乳劑、懸浮劑和其它任何適宜使用的形式。本發(fā)明的制劑包括固體、半固體或液態(tài)形式的含有滑石、水、葡萄糖、乳糖、阿拉伯樹膠、明膠、甘露醇、淀粉糊、三硅酸鎂、玉米淀粉、角蛋白、膠態(tài)氧化硅、馬鈴薯淀粉、尿素和其它在制造制劑過程中適宜使用的賦形劑，此外，還可以使用助劑、穩(wěn)定劑、增稠劑和著色劑。為了制備固體組合物(例如片劑或膠嚢劑)，該提取物與藥物賦形劑(例如常規(guī)制片成分，例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠)和其它藥物稀釋劑(例如水)相混合以制成固體組合物。該固體組合物再被分成包含有效量的本發(fā)明組合物的單元提供具有延長作用的優(yōu)點的劑型。例如，片劑或丸劑可以包含內(nèi)劑量和外劑量組分，后者為前者上的包封的形式。這兩個組分可由腸衣層進行分隔，腸衣層可以起到防止在胃中崩解并可以使內(nèi)組分完整地穿過十二指腸或延遲釋放的作用。許多材料可被用于這樣的腸衣層或包衣中，包括許多聚合酸以及聚合酸和諸如蟲膠、十六烷醇和醋酸纖維素等材料的混合物。用于口服或注射的可添加所述提取物的液體形式包括水溶液、適當增香的糖漿、水性或油狀懸浮液、含食用油的香味乳化劑以及酏劑和類似藥物形式。用于水性懸浮液的合適的分散劑或懸浮劑包括合成天然樹膠，例如黃蓍膠、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、曱基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或明膠。口服液體制劑可以采取例如溶液、糖漿或懸浮液的形式，或者它們也可以是干品，在使用之前再用水或其它合適的載體重新配制。這樣的液體制劑可以通過常規(guī)方式與以下輔劑一起制備藥學(xué)上可接受的添加劑，例如懸浮劑(例如山梨醇糖漿、曱基纖維素或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水性載體(例如杏仁油、油狀酯或乙醇)；防腐劑(例如對羥基苯曱酸甲酯或?qū)αu基苯曱酸乙酯或山梨酸)；和人造或天然色素和/或甜味劑。本發(fā)明中包含蔞葉葉子提取物的組合物還可被配制用于腸胃外注射給藥，包括使用常規(guī)導(dǎo)管插入技術(shù)或輸注。用于注射的制劑可為單元劑量形式，例如存在于安瓿中，或存在于多劑量容器中，添加有防腐劑?；蛘撸钚猿煞挚梢詾榉勰┬问?，使用之前再使用合適的載體(例如滅菌無熱原水)重新配制。水性注射懸浮劑可以包含能夠增加其粘性的物質(zhì)，例如，羧曱基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。任選地，懸浮劑還可以包含穩(wěn)定劑。還可以使用脂質(zhì)體包封藥物，用于遞送至細胞內(nèi)。實施本發(fā)明時，可以單獨使用包含作為活性成分的蔞葉葉子提取物的組合物，或者還可以與其它治療劑聯(lián)合使用。在某些實施方式中，根據(jù)公認的醫(yī)學(xué)實踐，本發(fā)明的組合物可以與用于癌癥化療的其它典型藥物共施用。根據(jù)本發(fā)明，組合物的理想劑量根據(jù)受試者的狀況和體重、嚴重性、藥物形式、給藥途徑和給藥時間而不同，而熟練的開業(yè)醫(yī)生能夠^f艮容易地確定該劑量。但是，為了獲得理想的效果，一般推薦按照每天lg至20g的劑量，以單劑量形式或分開的多劑量形式施用本發(fā)明的組合物。根據(jù)本發(fā)明，該草藥組合物適于治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病(CML)。實驗結(jié)果已經(jīng)證明，本發(fā)明的組合物可有效治療伊馬替尼耐藥的CML。該組合物不僅容易制備，而且還對現(xiàn)有的昂貴的藥物、手術(shù)或這兩者提供了一個更優(yōu)的替代手段。更重要的是，該組合物不會產(chǎn)生常用的抗癌藥物都會產(chǎn)生的嚴重的不良反應(yīng)。本發(fā)明在其范圍內(nèi)提出了一種用于治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病的方法，包括給需要這種治療的患者施用治療有效量的草藥組合物。根據(jù)本發(fā)明，在用于治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病的方法中，推薦以單劑量形式或分開的多劑量形式、以每天lg至20g的劑量施用該組合物。12本發(fā)明人通過體外研究對本發(fā)明的草藥組合物的有效性進行了評價，觀察到本發(fā)明的組合物對Bcr-Abl突變的伊馬替尼耐藥性細胞系具有強烈的抑制活性。更加有意思的是，該組合物還顯示出對表達人Bcr-Abl/T315I的細胞系具有強烈的抗增殖活性，Bcr-Abl/T315I是伊馬替尼耐藥性Bcr-Abl的最常見的突變形式。這是本領(lǐng)域中一個顯著的進步，因為Bcr-Abl/T315I突變顯示耐受兩種最有前途的實驗性藥物尼羅替尼(AMN-107)和達沙替尼(BMS-354825)。這使得本領(lǐng)域的科學(xué)家一直在尋找解決該問題的方案。本發(fā)明人對此問題提供了一個實際的解決方案，即包含治療有效量的蔞葉葉子提取物的草藥組合物。在對Bcr-Abl/野生型(Bcr-Abl/WT)陽性K-562細胞系(來自慢性髓樣白血病患者的紅白血病細胞系)的體外有效性測試中，本發(fā)明人觀察到含蔞葉葉子4是取物的本發(fā)明的組合物是Bcr-Abl酪氨酸激酶的直接抑制劑，如圖1中的自磷酸化研究所示。該組合物對K-562細胞系中的激酶活性顯示劑量依賴性的明顯抑制作用。本發(fā)明人測試了該組合物對五種臨床觀察的伊馬替尼耐藥性細胞系的作用，并與伊馬替尼進行了對比。據(jù)觀察，該組合物有效地抑制突變的伊馬替尼耐藥性細胞系。該研究的結(jié)果將會在下文中進行詳述。表4中的結(jié)果表明該組合物的劑量保持恒定，而伊馬替尼的劑量會顯著變化。為了證明本發(fā)明組合物的有效性，本發(fā)明人在SCID小鼠的異種移植模型中使用表達全長野生型Bcr-Abl和突變Bcr-Abl/T3151細胞的細胞系Ba/F3轉(zhuǎn)染體(transfectants),測試了蔞葉葉子提取物的體內(nèi)抗腫瘤有效性。當^f吏用與表達野生型Bcr-Abl的異種移ti:物(即BAF3Bcr-Abl/p210WT)相同的劑量進行測試時，觀察到蔞葉葉子提取物在抑制絕大多數(shù)的Bcr-Abl突變形式(即T315I)方面顯示出比依馬替尼顯著更強的體內(nèi)有效性。圖3a和3b中的曲線證明了對野生型Bcr-Abl異種移植物有效的提取物劑量與對T315I突變異種移植物有效的提取物劑量一致。相反，依馬替尼顯示對野生型Bcr-Abl異種移植物具有顯著的活性，但是發(fā)現(xiàn)在相同劑量下對T315I突變異種移植模型是無效的。此外，蔞葉提取物還顯示對其它人類白血病細胞系(例如HL-60和Molt-4)具有抗增殖活性。參考下述用于說明本發(fā)明而不是限制其范圍的實施例，將會更加容易地理解本發(fā)明。實施例實施例l:用于制備蔞葉葉子提取物的一般過程。在避免太陽直射的庇蔭條件下制干蔞葉植物的葉子。使用適當?shù)哪肽C將葉子碾磨成6/8目顆粒大小的粉末。將大約100Kg的粉末置于合適的反應(yīng)器皿中，并添加8倍量的溶劑(80%的@|)。葉子粉末浸泡于溶劑混合物中一個小時，并頻繁攪動。使用合適的加熱裝置(蒸汽)并使用回流機構(gòu)在70。C±5。C下(在達到該溫度后)持續(xù)攪拌4個小時來提取內(nèi)容物。然后將內(nèi)容物冷卻至室溫，使用離心機、壓濾機、篩網(wǎng)或尼龍布過濾，得到澄清的濾液。去除濾渣并保留濾液。對過濾去除的濾渣重復(fù)上述過程。合并提取物并處理以進行溶劑回收。將澄清的濾液轉(zhuǎn)移至相同的反應(yīng)器皿中，并通過溶劑回收在70。C±5。C和25mm±5mm真空下蒸鎦濃縮，以獲得具有蜜樣稠度的軟提取物。該軟提取物可能包含最小或可忽略量的醇。然后將所得到的軟提取物轉(zhuǎn)移到一個合適的真空烤箱中，內(nèi)容物在70。C±5。C、25mm±5mm真空下進行干燥，得到稠的糊狀物。完全去除提取物中的溶劑(水和醇)。該提取物可以儲存在25。C/4(T/。相對濕度(RH)的條件下。實施例2:含蔞葉葉子提取物的草藥組合物的制備顆粒劑的制備該組合物包含下表1中所列出的含量的成分。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>步驟1:在一合適的容器中稱量特定量(如上表l所示)的蔞葉葉子提取物、甘露醇和異丙醇成分。均勻混合這些成分得到懸浮液。使用流化床干燥法進一步干燥該懸浮液。步驟2:在一合適的容器中稱量特定量(如上表所示)的硅膠、一水合檸檬酸、對羥基苯曱酸甲酯鈉、對羥基苯曱酸丙酯鈉、苯曱酸鈉、溴硝丙二醇、樹莓香料、焦糖色素、天冬甜素和薄荷醇成分。這些成分經(jīng)過充分混合后經(jīng)過40目大小的篩網(wǎng)。然后再均勻混合該混合物。步驟3:將步驟1所得的懸浮液和步驟2所得的混合物混合在一起，以獲得顆粒，并裝入小袋中。用于填裝顆粒的小袋可以具有下述規(guī)格。層壓材料玻璃紙(40gsm/鋁(9pm/Poly(150號)小袋的類型褶邊的(Gusseted)尺寸70x70mm±2mm封閉三邊為5mm士lmm,進行填裝的第四邊為5mm±1mm重量1.200gms±0.100gms。實施例3:含蔞葉葉子提取物的草藥組合物的制備懸浮劑的制備該組合物包含下表2中所列出的含量的成分。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>步驟1:在一合適的容器中精確稱量特定量(如表2所示)的丙二醇、甘露醇、樹莓香料和薄荷醇成分。通過持續(xù)攪拌均勻混合這些成分得到懸浮液。步驟2:在一合適的容器中精確稱量特定量(如表2所示)的對羥基苯曱酸曱酯鈉、對羥基苯曱酸丙酯鈉、苯曱酸鈉、溴硝丙二醇、軟化水和檸檬酸成分。充分混合這些成分得到溶液。步驟3:在一合適的容器中精確稱量特定量(如上表所示)的CMC鈉和DM水成分。通過持續(xù)攪拌均勻混合這些成分得到凝膠。步驟4:在一合適的容器中精確稱量特定量(如上表所示)的天冬甜素和DM水成分。充分混合這些成分得到溶液。步驟5:在一合適的容器中精確稱量特定量(如上表所示)的蔞葉葉子提取物、焦糖色素和DM水成分。通過持續(xù)攪拌均勻混合這些成分得到懸浮液。步驟6:將步驟1至步驟5所得到的所有內(nèi)容均勻混合，并填裝至琥珀色小瓶中。實施例4:提取物的體外抗增殖活性的測定細胞增殖分析七種造血細胞系來自不同的來源，具體信息在下述表3中給出。將這些細胞系維持在供應(yīng)商建議的最優(yōu)生長條件下。表3:不同造血細胞系的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*Ba/F3細胞僅包含載體(Ba/F3-pSRa),FBS是指胎牛血清。來源OHSU:美國俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)，ATCC:美國典型培養(yǎng)物保藏中心表3中的細胞系用于測試蔞葉葉子提取物的抗增殖活性。在依馬替尼耐藥性細胞系中使用^-胸苷攝入法，將該提取物作為抗增殖藥物的潛力與依馬替尼進行了對比。3H-胸苷摻入法是一種用于細胞增殖分析的方法。311-胸苷摻入與培養(yǎng)液中分裂細胞的數(shù)目成正比。方法在透明的96孔組織培養(yǎng)板(NUNC,美國)上接種細胞，密度為每孔3至5x103個(在0.09mL體積內(nèi))，在37。C、5%(:02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-6小時。依馬替尼購買于印度NatcoPharma。制備10mmol/L的依馬替尼的DMSO儲備液，用該儲備液的稀釋液進行實驗。該提取物和依馬替尼以各種濃度在合適的培養(yǎng)基中進行稀釋，向每個孔中添加O.OlmL的IOX儲備液，一式三4分。該培養(yǎng)板在37°C、5%0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，間斷地每隔24小時通過顯微鏡對其進行觀察。培養(yǎng)72小時之后，使用培養(yǎng)板離心機在1000rpm的轉(zhuǎn)速下對該培養(yǎng)板進;f亍離心10分鐘。小心吸出上清夜，向所有孔內(nèi)添加311-胸苷，濃度為每孔0.5iaCi,在0.100mL完全培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)板繼續(xù)在37。C、5%(:02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-14小時。培養(yǎng)結(jié)束后，使用細胞收集器(美國Packard)將96孔板中的細胞收集到96孔玻璃濾板(美國Packard,Cat#6005177,Unifilter-96,GF/B)上。該濾板在60°C下徹底干燥1小時或室溫下過夜干燥。干燥之后，板底被密封起來，并向每個孔添加0.05mL的閃爍液(Af/crajc/W-O,PacA:"niO。從板的上部密封該板，在閃爍計數(shù)器(TopCount，Packard)上讀數(shù)，與對照值進行比較，計算抑制百分比和IC5。。結(jié)果如表4所示。表4:蔞葉葉子提取物對Bcr-Abl野生型細胞系和依馬替尼耐藥性突變細胞系的體外活性<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>上述表2中的結(jié)果顯示蔞葉葉子提取物對依馬替尼耐藥性Bcr-Abl突變細胞系(T315I、E255K、H396P、M351T和F359V)具有顯著的抗增殖活性。從這些數(shù)據(jù)中值得注意的是本發(fā)明組合物的IC50值是一致的，而依馬替尼的IC5。值變化相當大。實施例5:蔞葉葉子提取物在另外的依馬替尼耐藥性Bcr-Abl突變細胞系中的細胞毒性的測定表5:其它的依馬替尼耐藥性Bcr-Abl突變細胞系的描述和生長條件序號細胞系來源Ph狀態(tài)增殖培養(yǎng)基(FBS。/。)1Ba/F3Bcr-Abl/E255VOHSU+ve野生型RPMI-1640(10%)2Ba/F3Bcr-Abl/F317VOHSU+ve突變RPMI-1640(10%)3Ba/F3Bcr-Abl/H396ROHSU+ve突變RPMI-1640(10%)4Ba/F3Bcr-Abl/M284VOHSU+ve突變RPMI-1640(10%)Ba/F3Bcr-Abl/Q252HOHSU+ve突變RPMI-1640(10%)6Ba/F3Bcr-Abl/Y253FOHSU+ve突變RPMI-1640(10%)7Ba/F3Bcr-Abl/Y253HOHSU+ve野生型RPMI-1640(10%)依馬替尼耐藥性細胞系的來源所有細胞系均來自美國俄勒岡州波特蘭市俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)癌癥研究院的霍華德.休斯醫(yī)學(xué)院的BrianDruker博士的實驗室。細胞毒性分析使用細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)研究該提取物的細胞毒性。CCK-8通過使用Dojindo的高水溶性四唑鹽可以進行非常方便的分析。在存在電子介體的情況下，WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑單鈉鹽]在還原后產(chǎn)生水溶性甲賸染料。在透明的96孔組織培養(yǎng)板(美國NUNC)上接種細胞，密度為每孔3至5x103個(0.09mL體積)，在37。C、5。/。C02的培養(yǎng)箱中19培養(yǎng)2-6小時。樣品在培養(yǎng)基中稀釋為不同的濃度，向每個孔中添加0.01mLIOX儲備液，一式三份。培養(yǎng)板在37。C、5%032的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，間斷地每隔24小時通過顯微鏡對其進行觀察。培養(yǎng)72小時之后，向每個孔中添加10|iLCCK-8溶液，該板在相同的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后使用讀板器在450nm處讀取分光光度吸收值。結(jié)果示于表6。表6:蔞葉葉子提取物對不同的Bcr-Abl野生型細胞系和依馬替尼耐藥性突變細胞系的細胞毒性的作用伊馬替尼敏感或耐藥狀態(tài)伊馬替尼蔞葉葉子提取物序號細胞系IC50一R/S比ic50(ig/mLR/S比1敏感Ba/F3Bcr-AblAVT0.917.412耐藥Ba/F3Bcr-Abl/T315I20.823.15.60.76耐藥Ba/F3Bcr-Abl/E255K10.011.15.20.704耐藥Ba/F3Bcr-Abl/E255V13.615.15.80.78耐藥Ba/F3Bcr-Abl/F317V2.42.75.00.686耐藥Ba/F3Bcr-Abl/F359V3.84.27.91.077耐藥Ba/F3Bcr-Abl/H396P1.61.84.40.598耐藥Ba/F3Bcr-Abl/H396R2.83.14.60.629耐藥Ba/F3Bcr-Abl/M284V4.65.15.00.6810耐藥Ba/F3Bcr-Abl/M315T2.22.45.00.6811耐藥Ba/F3Bcr-Abl/Q252H4.95.46.60.8912耐藥Ba/F3Bcr-Abl/Y253F8.69.69.61.3013耐藥Ba/F3Bcr-Abl/Y253H14.315.95.00.68R/S=耐藥性與敏感性的比值上述圖6中的結(jié)果顯示，依馬替尼對所有依馬替尼耐藥性Bcr-Abl突變細胞系比野生型細胞系的活性要差。然而，蔞葉葉子提取物對所有耐藥性Bcr-Abl突變細胞系都顯示出顯著的活性。實施例6:蔞葉葉子提取物對Bcr-Abl激酶活性的作用Bcr-Abl激酶分析為此目的，將來自K-562細胞裂解產(chǎn)物中的Bcr-Abl酪氨酸激20酶進行免疫沉淀。這些免疫復(fù)合物用于使用32P-ATP的激酶反應(yīng)中，并進一步經(jīng)SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳)和然后的放射自顯影進行表征。在存在或不存在提取物的情況下培養(yǎng)K-562細胞之后，在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘進行收集。使用0.2mL的細胞裂解緩沖液(CelLyticM細胞裂解試劑，SIGMA)在冰上裂解細胞。裂解產(chǎn)物在4°C和10000g下離心30分鐘，并收集上清夜。使用Bradford蛋白質(zhì)估算方法估計蛋白質(zhì)。向200-400pg蛋白質(zhì)中添加3pg針對c-abl的單克隆抗體，在4。C下溫育1至2小時。再向其中每)ig單克隆抗體添加3-5|il(1:1漿液)的蛋白A-瓊脂糖稀釋緩沖液，4。C下維持過夜。離心并使用0.5mL激酶分析緩沖液(激酶分析緣沖液50mMHEPES(pH7.5)，1mMDTT,2.5mMEGTA，10mM(3匿甘油磷酸，1mMNaF，10mMMgCl2)洗J朱子兩遍。由Bcr-Abl蛋白質(zhì)包裹的珠子重新懸浮于30iil激酶緩沖液中。使用(力"P-ATP、4X磷酸酶抑制劑(PI)在室溫下進行激酶分析30-40分鐘。對該反應(yīng)混合物進行SDS-PAGE，并使用放射自顯影進行檢測。圖l證明，在Bcr-Abl+veK-562細胞中，經(jīng)過24小時后，蔞葉葉子^是取物顯示出對Bcr-Abl激酶活性的劑量依賴性抑制。實施例7:使用流式細胞分析法測定蔞葉葉子提取物對依馬替尼耐藥性Bcr-Abl突變細胞系的細胞周期和細胞凋亡的作用用于流式細胞分析的細胞以10x104細胞/毫升的密度接種，并與該提取物/依馬替尼在37°C、5。/。C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，通過在lOOOrpm的轉(zhuǎn)速下離心IO分鐘來收集細胞，然后再使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞兩次。將最后一次洗滌之后的細胞沉淀緩慢地重新懸浮于70%水冷的乙醇中，以利于菌株的透化。在使用碘化丙啶(PI)染色之前，最少儲存細胞懸浮液4小時。在存在RNaseA(50pg/mL)的條件下，使用PI(80(ig/mL)對固定好的細胞進行染色，在BDFACS檢測儀(caliber)上讀數(shù)用于細胞周期分析。該研究的結(jié)果示于圖2中，結(jié)果清楚地顯示蔞葉葉子提取物在依馬替尼耐藥性細胞系中誘導(dǎo)的細胞凋亡是顯著的。實施例8:在慢性髓樣白血病(CML)患者細胞中蔞葉葉子提取物的有效小生所有樣品都是在知情同意和倫理委員會的批準下獲得的。本研究中對CML疾病的診斷是基于標準的形態(tài)學(xué)、免疫表型和細胞遺傳學(xué)標準完成的。血細胞經(jīng)過Ficoll-hypaque密度梯度離心，然后收集棕黃層(buffy畫coat)。CML樣品來自海得^立巴的Nizam'sInstituteofMedicalSciences。樣品在低溫運輸系統(tǒng)中運輸?shù)絅PRC。一旦收到樣品，立即處理樣品，使用Ficoll/Hapaque法通過密度梯度離心進行PBL(外周血淋巴細胞)分離。在RPMI-1640培養(yǎng)基中洗滌通過ficol得到的棕黃層兩次。將細胞重新懸浮于含10%FBS和濃度為0.02-0.08ng/mL的GM-CSF的培養(yǎng)基中。將獲得的細胞接種于組織培養(yǎng)瓶中，在37。C、5。/。C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2小時進行條件化。培養(yǎng)2小時后，用血細胞計數(shù)器對細胞進行計數(shù)，并接種在96孔板上，接種密度為每孔1-5x104個細胞，在0.180mL培養(yǎng)基中?；衔?提取物/依馬替尼)稀釋為10X儲備液，向每個孔中添加0,02mL這種儲備液，一式三份。這些板在37。C、5%C02的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24小時對用于臺盼藍細胞計數(shù)的板進行分析，直到96小時。用于311胸苷攝取的板進行胸苷攝入。該研究的結(jié)果示于下述表7中。表7:蔞葉葉子提取物對依馬替尼耐藥的CML患者樣品的效果序號樣品ic501蔞葉葉子提取物2依馬替尼8nM實施例9:在依馬替尼耐藥的和依馬替尼敏感的腫瘤模型中，蔞葉葉子提取物的體內(nèi)有效性測試22在本研究中使用表達全長野生型Bcr-Abl或突變Bcr-AblT315I的細胞系Ba/F3轉(zhuǎn)染體。這些重組細胞系來自美國俄勒岡州波特蘭市俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)癌癥研究院的霍華德'休斯醫(yī)學(xué)院的BrianDruker博士的實驗室。提取物的儲存所有的樣品(提取物/依馬替尼)均在4-8。C下儲存在琥珀色瓶中。樣品(提取物/依馬替尼)溶液也儲存在4-8。C的冰箱中。每日新鮮配制用于動物注射的樣品，并按照化學(xué)品處理SOP收集并處理剩余的液體。劑量的準備稱量樣品(提取物/依馬替尼)，并與0.5%(w/v)的羧曱基纖維素(CMC)相混合，與Tween-20(人工地)一起碾》卒，期間逐漸添加水，制成最終濃度。在SCID小鼠中有效性的研究使用一組85只重癥聯(lián)合免疫缺陷型(SCID抹-CBySmn.CB17-Prkdcscid/J，TheJacksonLaboratory,Stock#001803)雄性小鼠，小鼠年齡為6-8周，體重為大約20g。在含5%C02的37°C培養(yǎng)箱中,BAF3Bcr-Abl/p210WT細胞和BAF3Bcr-Abl/T315I細胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中生長。在1000rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘沉淀細胞。將細胞重新懸浮于鹽水中得到每毫升80-100X106個細胞的計數(shù)，給SCID小鼠皮下(s.c.)注射0.2mL該細胞懸浮液。每隔一天觀察小鼠可觸摸的腫瘤塊。一旦肺瘤大小長到直徑為5-7mm時，將動物隨才幾分到相應(yīng)的治療組中。每天給予一定劑量。以每2-5天的時間間隔記錄一次胂瘤大小。根據(jù)長橢球的公式({長(mm)x[寬(mm)2]x0.5})估算腫瘤的重量(mg)，其中假定比重為1,;r為3。在使用化合物治療的動物中，23根據(jù)T/C(治療/對照)x100%計算肺瘤的生長，根據(jù)[100-T/C。/。]計算生長抑制百分比(GI%)。相應(yīng)的治療組如表8所示。表8:治療組(第I套和第II套)(第I套)名稱Ba/F3Bcr-Abl/P210WT<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>數(shù)注射體積10mL/kg身體重量下述表9中的數(shù)據(jù)證明，當以與表達野生型Bcr-Abl的異種移植物(即BAF3Bcr-Abl/p210WT)相同的劑量進行檢測時，蔞葉葉子提取物在抑制大多數(shù)突變形式的Bcr-Abl(即T315I)方面顯示出比依馬替尼顯著更高的體內(nèi)有效性。這些結(jié)果如圖3a(第一套)和3b(第二套)中的曲線所示。表9:生長抑制(第一套和第二套)(第一套)名稱Ba/F3Bcr-Abl/p210WT組II組III組IV天數(shù)蔞葉葉子提取物蔞葉葉子提取物伊馬替尼500mg/kg500mg/kgbid150mg/kg6617-l83339391044545614506361(第二套)名稱Ba/F3Bcr-Abl/T315I天數(shù)組II蔞葉葉子提取物500mg/kg組III蔞葉葉子提取物500mg/kgbid組IV蔞葉葉子提取物1000mg/kgbid組V伊馬替尼150mg/kg2634962385546458228556156311262625532藥物有活性GI%250%藥物為高活性GI%>75%藥物無活性GI%<50%(突出顯示的數(shù)值顯示顯著的腫瘤抑制)根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明人認為顯示生長抑制(GI)%>50%的化合物為活性化合物；顯示生長抑制(GI)%>75%的化合物為高活性化合物，顯示生長抑制(GI)%<50%的化合物為無活性化合物。2權(quán)利要求1.一種草藥組合物，其單獨包含作為活性成分的治療有效量的蔞葉葉子提取物，或者還包含至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑，所述組合物適于治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草藥組合物，其中，所述組合物包含大約5%至大約50%(w/w)的蔞葉葉子提取物，所述組合物適于治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的草藥組合物，其中，伊馬替尼耐藥性是由Bcr-Abl突變引起的。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的草藥組合物，其中，所述組合物配制用于口服、腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)或關(guān)節(jié)內(nèi)給藥。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的草藥組合物，其中，所述組合物配制成片劑、膠嚢劑、顆粒劑、糖漿劑或懸浮劑用于口服給藥。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的草藥組合物，其中，所述組合物配制用于腸胃外給藥。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的草藥組合物，進一步包含至少一種化療劑。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的草藥組合物，其中所述組合物適于以每天大約1g至大約20g的劑量治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病。9.權(quán)利要求1或2所述的草藥組合物在制備治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病的藥物中的用途。10.—種治療伊馬替尼耐藥的慢性髓樣白血病的方法，包括給需要的患者施用治療有效量的權(quán)利要求1或2所述的草藥組合物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，伊馬替尼耐藥性是由Bcr-Abl突變引起的。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述草藥組合物是經(jīng)口服、腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)或關(guān)節(jié)內(nèi)給藥的。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述草藥組合物是經(jīng)口服給藥的。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述草藥組合物配制為片劑、膠嚢劑、顆粒劑、糖漿劑或懸浮劑的形式。15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述草藥組合物是經(jīng)腸胃外給藥的。16.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中，所述草藥組合物以每天大約1g至大約20g的劑量給藥。17.—種制備權(quán)利要求1所述的草藥組合物的方法，包含以下步驟(a)制備蔞葉葉子提取物；(b)將步驟(a)中的提取物與至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑混合以獲得所述組合物。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中在步驟(b)中，將大約5%至大約50%(w/w)的蔞葉葉子提取物與所述藥學(xué)上可接受的賦形劑相混合以獲得所述草藥組合物。全文摘要本發(fā)明公開了一種單獨包含作為活性成分的治療有效量的蔞葉(Piperbetle)葉子提取物，或者還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑的草藥組合物。本發(fā)明還提供了制備所述草藥組合物的方法。所述草藥組合物適于治療對伊馬替尼(gleevec或glivec)的治療顯示出耐藥性的慢性髓樣白血病(CML；慢性髓性白血病)。文檔編號A61K36/00GK101631556SQ200780051634公開日2010年1月20日申請日期2007年2月20日優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日發(fā)明者K·S·喬希,S·沙瑪,V·韋格申請人:皮拉瑪生命科學(xué)有限公司