專利名稱：：用于防止、治療葡萄糖耐受不良相關(guān)病癥的人epo受體激動(dòng)劑、組合物、方法及應(yīng)用的制作方法用于防止、治療葡萄糖耐受不良相關(guān)病癥的人EPO受體激動(dòng)劑、組合物、方法及應(yīng)用發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及至少一種人EPO受體激動(dòng)方法用于預(yù)防或治療葡萄糖耐受不良(glucoseintolerance)和/或腎病相關(guān)貧血，包括治療組合物、方法和裝置。相關(guān)技術(shù)某些疾病狀態(tài)包括異常的紅細(xì)胞生成。在許多國家中，重組人EPO(rHuEPO)正在臨床上使用。在美國，美國食品及藥物管理局(FDA)已經(jīng)批準(zhǔn)了rHuEPO在治療與晚期腎病相關(guān)的貧血中的應(yīng)用。經(jīng)歷血液透析以治療該疾病的患者通常會(huì)患嚴(yán)重的貧血，這是由于因?yàn)橥肝鎏幚淼募t細(xì)胞破裂和未成熟死亡而造成的。EPO還可以用于治療其他類型的貧血?？梢允褂肊PO治療例如化療誘導(dǎo)的貧血、與脊髓發(fā)育不良相關(guān)的貧血、與各種先天性紊亂相關(guān)的貧血、AIDS相關(guān)的貧血和早熟相關(guān)貧血。此外，EPO在其他領(lǐng)域發(fā)揮了作用，例如幫助快速在骨髓移植患者中、在準(zhǔn)備自體同源輸血的患者中、以及患有鐵負(fù)荷過多紊亂的患者中恢復(fù)正常的血球密度。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是糖蛋白激素，其由165個(gè)氨基酸和四條烴鏈構(gòu)成，其通過結(jié)合到紅細(xì)胞前體細(xì)胞表面上的特異性受體而作為紅細(xì)胞生成的主要調(diào)節(jié)劑。這種結(jié)合發(fā)出信號(hào)使他們增殖并分化成成熟血紅細(xì)胞。促紅細(xì)胞生成素受體是對(duì)促紅細(xì)胞生成素具有高親和力的484個(gè)氨基酸的糖蛋白。對(duì)于促紅細(xì)胞生成素受體，配體誘導(dǎo)的同型二聚化可以是管理激活的關(guān)鍵事件之一。促紅細(xì)胞生成素具有相對(duì)短的半衰期。靜脈給藥的促紅細(xì)胞生成素以與一級(jí)動(dòng)力學(xué)一致的速度被除去，其中循環(huán)半衰期在CRF患者中在大約34小時(shí)之間。在治療劑量范圍內(nèi)，血漿促紅細(xì)胞生成素的可檢測水平唄維持至少24小時(shí)。在皮下給藥促紅細(xì)胞生成素后，在524小時(shí)內(nèi)達(dá)到了峰值血清水平，并之后緩慢下降。貧血治療市場的主導(dǎo)是紅細(xì)胞生成刺激劑(ESA)，其將受體靶向生長因子促紅細(xì)胞生成素(EPO)，這刺激了血紅細(xì)胞的產(chǎn)生。重組EPO依泊丁(印oetin)-a(Epogen；AmgenandProcrit/Eprex；Johnson&Johnson)禾口依泊丁-β(NeoRecormon/Eprex;Roche)已經(jīng)上市許多年了。Amgen的darb印oetin(Aranesp)是EPO的高糖基化變體(來自兩個(gè)氨基酸置換)，并且與依泊丁相比具有較長的半衰期，這實(shí)現(xiàn)了使得darb印oetin能夠通過較低頻率的給藥而保持靶血紅蛋白水平(每34周一次，而依泊丁為一周一次)。Roche的糖基化依泊丁CERA(連續(xù)紅細(xì)胞生成受體激活劑)正經(jīng)歷臨床實(shí)驗(yàn)，并且也具有比EPO長的半衰期。Hematide包含在序列上與原始或上市的EPO無關(guān)的二聚肽，其結(jié)合EPO受體并刺激紅細(xì)胞生成。許多團(tuán)體已經(jīng)通過對(duì)隨機(jī)噬菌體展示庫進(jìn)行篩選與促紅細(xì)胞生成素受體的親和力鑒定了促紅細(xì)胞生成素的小分子肽模擬物(ρ印tidomimetics)。這些序列與促紅細(xì)胞生成素沒有同源性。在功能檢驗(yàn)中，這些肽中的一些顯示了活性，但僅有重組促紅細(xì)胞生成素的1/100，000。盡管已經(jīng)進(jìn)行了許多努力來通過制備肽模擬物的共價(jià)二聚體或多聚體提高這些肽的能力，但這些化合物在摩爾基礎(chǔ)上活性可以是促紅細(xì)胞生成素的1/10，0001/1，000，并且具有非常短的半衰期，這使得它們不適于用作治療劑。目前正在開發(fā)許多用于貧血、CHF和其他適應(yīng)癥的EPO受體激動(dòng)劑藥物公司適應(yīng)癥階段促紅細(xì)胞生成素Darbepoetin-α(Aranesp)Amgen癌癥相關(guān)貧血III期充血性心力衰竭II期CERA(連續(xù)促紅細(xì)胞生成素受體激活劑)RocheCKDBLA提交CIAIII期NE-180(GlycoPEG-促紅細(xì)胞生成素)NeoseCKD，CIAI期EPO-FcSyntonixCKD,CIAI期AMG114(darbepoetin的高糖基化類似物)AmgenCIAI期合成的促紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑HematideAffymax/Takeda*CKD，CIA，PRCA患者中的貧血II期促紅細(xì)胞生成素替代品FG-2216FibroGenCKD,CIAII期FG-4592FibroGen由于鐵處理缺陷的貧血I期(CIA，化療誘導(dǎo)的貧血；CKD，慢性腎?。籔EG，聚乙二醇；PRCA，單純紅細(xì)胞再生障礙)然而，需要提供新型的EPO受體激動(dòng)劑的應(yīng)用，這克服了現(xiàn)有技術(shù)中已知的這些和其他問題的一個(gè)或多個(gè)，并發(fā)現(xiàn)新的適應(yīng)癥和治療。發(fā)明概述正如本文所描述和/或?qū)崿F(xiàn)的結(jié)合本領(lǐng)域已知的，本發(fā)明提供了人EPOR激動(dòng)劑，包括小分子激動(dòng)劑、肽或蛋白質(zhì)激動(dòng)劑、激動(dòng)劑抗體或經(jīng)修飾的免疫球蛋白、切割產(chǎn)物和它們的其他特定部分和變體；以及編碼它們的核酸、載體和宿主細(xì)胞；以及制備它們和使用它們用于防止或治療葡萄糖耐受不良和相關(guān)癥狀和/或腎病相關(guān)貧血的EPOR激動(dòng)劑組合物、制劑、聯(lián)合治療等、編碼或互補(bǔ)核酸、載體、宿主細(xì)胞、組合物、制劑、裝置和方法。本發(fā)明還提供了用于防止或治療葡萄糖耐受不良和/或腎病相關(guān)貧血的組合物、方法和裝置，其使用至少一種本發(fā)明所描述和/或本領(lǐng)域已知的分離的EPO受體(EPOR)激動(dòng)劑或特定部分或變體。EPOR激動(dòng)劑是本領(lǐng)域中公知的，包括但不限于EPO或EPOR激動(dòng)劑(或者具有激活EPOR效果的激動(dòng)劑，例如HIF)，肽、蛋白質(zhì)、化學(xué)化合物或小分子等，以及編碼這些肽或蛋白質(zhì)的核酸、載體和宿主細(xì)胞，例如但不限于ΕΡ0、經(jīng)修飾的EPO、EPO蛋白和小分子模擬物、EPO或EPOR激動(dòng)劑抗體或它們的片段或融合物。本發(fā)明還提供了至少一種用于防止或治療葡萄糖耐受不良和/或腎病相關(guān)貧血的組合物，其包括(a)至少一種分離的EPOR激動(dòng)劑；和(b)適當(dāng)?shù)妮d體或稀釋劑。任選地，根據(jù)已知的方法，所述載體或稀釋劑可以是藥物上可以接受的。任選地，所述組合物還包含至少一種其他的化合物、蛋白質(zhì)或組合物。本發(fā)明在方法或組合物中還提供了至少一種EPOR激動(dòng)劑、特定的部分或變體，其在以治療上有效的量給藥時(shí)，用于調(diào)節(jié)、用于治療或減輕至少一種葡萄糖耐受不良和/或腎病相關(guān)貧血的癥狀。(參見，例如TheMerckManual，第17版，MerckResearchLaboratories,MerckandCo.，WhitehouseStation,NJ(1999)，通過參照將其全部并入本文)，正如本領(lǐng)域中已知的，根據(jù)在許多情況中所需要的，例如但不限于在相關(guān)疾病或治療病癥之前、之后或過程中。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明還提供了至少一種組合物、裝置和/或方法遞送治療或預(yù)防有效量的至少一種EPOR激動(dòng)劑或特定部分或變體，用于防止或治療葡萄糖耐受不良和/或腎病相關(guān)貧血。本發(fā)明還提供了至少一種組合物，其包括(a)本文所述的編碼分離的EPOR激動(dòng)劑的核酸和/或EPOR激動(dòng)劑；和(b)適當(dāng)?shù)妮d體或稀釋劑，用于防止或治療葡萄糖耐受不良和/或腎病相關(guān)貧血。任選地，根據(jù)已知的載體或稀釋劑，所述載體或稀釋劑可以任選地是藥物上可以接受的。任選地，組合物還包含至少一種其他的化合物、蛋白質(zhì)或組合物。還提供了一種組合物，其包含至少一種分離的人EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體(mimetibody)以及至少一種藥物上可以接受的載體或稀釋劑。該組合物任選地可以包含有效量的至少一種選自下列的化合物或蛋白質(zhì)可檢測標(biāo)記或受體、抗感染藥物、葡萄糖耐受不良相關(guān)藥物、腎缺血相關(guān)藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、流體或電解質(zhì)平衡的藥物、血液病藥物、TNFa拮抗劑、肌肉松弛藥、鎮(zhèn)靜劑、非留體抗炎藥(NTHE)、止痛劑、麻醉劑、鎮(zhèn)靜藥、局部麻醉藥、神經(jīng)肌肉阻斷劑、抗菌劑、抗銀屑病藥、皮質(zhì)類固醇、促蛋白合成甾類(anabolicsteroid)、葡萄糖調(diào)節(jié)劑、免疫接種、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥物、放射性藥物、抗抑郁劑、安定藥、興奮劑、哮喘藥物、β激動(dòng)劑、吸入類固醇、腎上腺素素或類似物、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑。還提供了一種方法用于診斷、防止或治療細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物中的葡萄糖耐受不良和/或腎病相關(guān)貧血，其包括(a)將包含有效量的至少一種EPOR激動(dòng)劑的組合物與細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物接觸，或者為所述細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物給藥包含有效量的至少一種EPOR激動(dòng)劑的組合物。該方法任選地可以還包括為細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物使用有效量0.00001-500mg/千克。該方法任選地可以還包括通過選自下列的至少一種模式進(jìn)行接觸或給藥腸胃外的、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)(intracerebroventricular)、大腸內(nèi)、頸管內(nèi)、胃內(nèi)的、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、快速濃注、陰道、直腸、經(jīng)頰、舌下、鼻內(nèi)或者透皮途徑。本發(fā)明還提供了本文所描述的任何發(fā)明。圖1A-B.糖尿病小鼠(db/db)被靜脈給藥CNTO530(0.3mg/kg)或陰性對(duì)照MMB(缺少肽)。A.在給藥后10分鐘進(jìn)行IPGTT。B.在給藥7天后進(jìn)行IPGTT。圖2A-B.糖尿病小鼠(DIO)被靜脈給藥CNTO530(0.3mg/kg)或陰性對(duì)照MMB(缺少肽).A.在給藥后10分鐘進(jìn)行IPGTT。B.在給藥7天后進(jìn)行IPGTT。圖3.糖尿病小鼠(DIO)被靜脈給藥CNTO530(0.3mg/kg)或陰性對(duì)照MMB(缺少肽)。給藥七天后，處死動(dòng)物并取血樣。圖4A-F.糖尿病小鼠(DIO)被靜脈給藥CNTO530(0.3mg/kg)或PBS。在10分鐘后(A)、7天后(B)、14天后(C)、21天后⑶、28天后(E)、35天后(F)進(jìn)行IPGTT。圖5A-C.糖尿病小鼠(DIO)被靜脈給藥CNTO530(0.3mg/kg)或PBS。在各種時(shí)間后處死動(dòng)物，并收集血液進(jìn)行血液學(xué)測量。顯示給藥后A.21天，B.28天和C.35天的血紅蛋白水平。圖6A-C.糖尿病小鼠(DIO)被靜脈給藥CNTO530(0.3mg/kg)或PBS。在各種時(shí)間后處死動(dòng)物，并收集血液進(jìn)行胰島素測量。還顯示了給藥后A.21天，B.28天和C.35天的循環(huán)胰島素水平。圖7A-B.糖尿病小鼠(DIO)被靜脈給藥EPO(0.03,0.1,0.3mg/kg)或PBS。五天后進(jìn)行IPGTT。(A)整個(gè)IPGTT的葡萄糖水平，(B)來自A的曲線以下的面積。圖8A-B.糖尿病小鼠(DIO)被靜脈給藥EPO(0.03,0.1,0.3mg/kg)或PBS05天后測量(A)血紅蛋白水平和(B)網(wǎng)織紅細(xì)胞。圖9A-B.糖尿病小鼠(DIO)被靜脈給藥Darbepoetin(0.01,0.03,0.lmg/kg)或PBS07天后進(jìn)行IPGTT。(A)整個(gè)IPGTT的葡萄糖水平，(B)來自A的曲線以下的面積。圖10.糖尿病小鼠(DIO)被靜脈給藥Darb印oetin(0.01，0.03，0.lmg/kg)或PBS。7天后測量空腹血糖。圖11A-B.糖尿病小鼠(DIO)被靜脈給藥Darb印oetin(0.03，0.1,0.3mg/kg)或PBS07天后測量(A)血紅蛋白和(B)網(wǎng)織紅細(xì)胞。圖12.野生型(C57B16小鼠)或過表達(dá)人EPO的轉(zhuǎn)基因小鼠(雜合子或純合子)的空腹血糖。圖13.野生型(C57B16小鼠)或過表達(dá)人EPO的轉(zhuǎn)基因小鼠(雜合子或純合子)的GTT。圖14A-B.糖尿病小鼠(DIO)被靜脈給藥CNTO530(0.3mg/kg)或PBS。在斷食過夜和葡萄糖活化(challenge)20分鐘后測量葡萄糖(A)和胰島素水平(B)。圖15.圖14中所顯示的空腹葡萄彈和胰島素水平被用于計(jì)算Η0ΜΑ。圖16.在基線HbAlC水平超過6.0的患者中EPO給藥對(duì)血紅蛋白的影響。圖17.在基線HbAlC水平超過6.0的患者中EPO給藥對(duì)血紅蛋白AlC的影響。圖18.在基線HbAlC水平超過6.0的患者中EPO給藥對(duì)對(duì)空腹血糖的影響。圖19在基線HbAlC水平超過6.0的患者中EPO給藥對(duì)HbAlC水平的影響。圖20=EPO給藥和基線HbAlC水平對(duì)12和46月HbAlC水平的影響(縱向數(shù)據(jù))。圖21:在基線(ΕΡ0給藥前2個(gè)月)以及在后續(xù)時(shí)間段(13個(gè)月和46個(gè)月，在可得到數(shù)據(jù)的患者中EPO對(duì)12和46月空腹血糖水平的影響。發(fā)明描述本發(fā)明涉及至少一種人EPO受體激動(dòng)方法用于防止或治療葡萄糖耐受不良和/或腎病相關(guān)貧血，包括治療組合物、方法和裝置。EPOR激動(dòng)劑是本領(lǐng)域中公知的，并且包括但不限于EPO或EPOR激動(dòng)劑(或具有激活EPOR效果的激動(dòng)劑，例如HIF)肽、蛋白質(zhì)、化學(xué)化合物或小分子等，例如但不限于ΕΡ0、經(jīng)修飾的ΕΡ0、ΕΡ0蛋白質(zhì)和小分子模擬物、EPO或EPOR激動(dòng)劑抗體或它們的片段或融合物。在下表中相關(guān)的所列舉PCT公開中提供了如何制備和使用EPOR拮抗劑的非限制性例子，通過參照將這些公開全部并入本文，因?yàn)樗麄冿@示了如何制備和使用用于本發(fā)明的方法和治療的EPO受體的現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)。本領(lǐng)域中已知的EPO受體激動(dòng)劑的非限制性例子包括ΕΡ0、它們的活性片段和模擬物和化學(xué)EPO受體激動(dòng)劑，其也被公開在下列公開中，通過參照將這些公開并入本文PCT公開標(biāo)題W09818926A1循環(huán)變換的促紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑W006017772A1促紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑的穩(wěn)定懸浮液制劑W006017773A1促紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑的穩(wěn)定顆粒制劑W005025606A1保持內(nèi)源性促紅細(xì)胞生成素組織保護(hù)活性的長效促紅細(xì)胞生成素W004022577A2保持內(nèi)源性促紅細(xì)胞生成素組織保護(hù)活性的長效促紅細(xì)胞生成素W002062843A2免疫原性降低的經(jīng)修飾促紅細(xì)胞生成素(Epo)W09533057A1用于造血刺激的分子式Gm-Csf-L-Epo或Epo-L-Gm-Csf的雜交分子W004033651A2促紅細(xì)胞生成素促紅細(xì)胞生成素的重建和糖基化綴合W003053997A2提高內(nèi)源性促紅細(xì)胞生成素(Epo)的方法W00243572A2促紅細(xì)胞生成素和促紅細(xì)胞生成素受體在人類癌癥中的表達(dá)W09928346A1高特異性活性的促紅細(xì)胞生成素W006055412A1治療促紅細(xì)胞生成素-抗性的方法W006014466A2新型氨甲?；疎PO和其制備方法W006002646A2新型氨甲?；疎PO和其制備方法W005121173A1純化促紅細(xì)胞生成素的方法W005070451A1包含非糖基化促紅細(xì)胞生成素的藥物組合物W005063808A1改善藥物動(dòng)力學(xué)的Fc-促紅細(xì)胞生成素融合蛋白W005051327A2糖基PEG化促紅細(xì)胞生成素W005021579A2Epo模擬肽和融合蛋白W00402476IAlHAS化的多肽，特別是HAS化的促紅細(xì)胞生成素W003029291A2PEG化和二糖基化促紅細(xì)胞生成素W002085940A2促紅細(xì)胞生成素基因的新多核苷酸和多肽W00138342A2作為促紅細(xì)胞生成素(Epo)受體激動(dòng)劑的新型肽二聚體以及相關(guān)的合成和應(yīng)用方法W00061164A1通過外周給藥促紅細(xì)胞生成素調(diào)節(jié)易興奮組織功能W09938890A1生物學(xué)活性改變的促紅細(xì)胞生成素W09911781A1具有有利糖基化特征的重組人促紅細(xì)胞生成素W09907401A2促紅細(xì)胞生成素和鐵制劑用于生產(chǎn)治療風(fēng)濕性疾病的藥物聯(lián)合制劑的應(yīng)用W09905268A1通過內(nèi)源性基因激活生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素W09858660A1藥物聯(lián)合制劑，其含有促紅細(xì)胞生成素和經(jīng)修飾的血紅蛋白W09709996A1促紅細(xì)胞生成素和鐵制劑的藥物組合物制劑W09635718A1用于生產(chǎn)不含動(dòng)物蛋白的促紅細(xì)胞生成素的方法W006062685A2結(jié)合促紅細(xì)胞生成素受體的新型肽W006060148A2結(jié)合促紅細(xì)胞生成素受體的新型肽W006029094A2免疫原型改變的促紅細(xì)胞生成素衍生物W006014349A2生產(chǎn)完全氨基甲?；偌t細(xì)胞生成素的方法W005112998A2防止促紅細(xì)胞生成素相關(guān)高血壓的組合物和方法W005103076A2促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)變體W005100403A2針對(duì)促紅細(xì)胞生成素受體的抗體及其應(yīng)用W005099773A1促紅細(xì)胞生成素用于治療癌癥的應(yīng)用W005097167A1促紅細(xì)胞生成素的聯(lián)合給藥方案W005092369A2羥乙基淀粉和促紅細(xì)胞生成素的綴合物W005087804A1促紅細(xì)胞生成素液體制劑W005079232A2促紅細(xì)胞生成素類似物-人IgG融合蛋白在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物奶中的生產(chǎn)方法W005063809A1天然一致的促紅細(xì)胞生成素W005058347A1促紅細(xì)胞生成素在治療慢性炎癥腸病中鐵分布波動(dòng)的應(yīng)用W005053745A1促紅細(xì)胞生成素溶液制劑W005032460A2人Epo模擬鉸鏈核心模擬抗體、組合物、方法和應(yīng)用W005014025A1無白蛋白促紅細(xì)胞生成素的制劑W005001136A1調(diào)節(jié)促紅細(xì)胞生成素表達(dá)的方法和組合物W005000340A1包含促紅細(xì)胞生成素和琥珀酸(鹽)的協(xié)同組合物W004108681A1含氮雜芳基化合物以及它們在提高內(nèi)源性促紅細(xì)胞生成素中的應(yīng)用W004108667A2使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的新型促紅細(xì)胞生成素綴合物的制劑W004108152A1不含血清白蛋白的人促紅細(xì)胞生成素的穩(wěn)定水溶液W004106373A1半衰期延長的促紅細(xì)胞生成素綴合化合物W004101611A2結(jié)合促紅細(xì)胞生成素受體的新型肽W004101606A2結(jié)合促紅細(xì)胞生成素受體的新型肽W004091495A2生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素地組合物和相關(guān)方法W004043382A2增強(qiáng)的促紅細(xì)胞生成素變體及其應(yīng)用方法W004035603A2促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合抗體W004006958A1包含促紅細(xì)胞生成素的穩(wěn)定藥物組合物W004006948A1包含促紅細(xì)胞生成素的穩(wěn)定藥物組合物W004005323A2Epo受體的親和小分子W004002493A1促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)增效劑W003094858A2Ctp-延長的促紅細(xì)胞生成素W003064664A1生理調(diào)節(jié)的表達(dá)促紅細(xì)胞生成素的載體用于治療貧血W003055526A2促紅細(xì)胞生成素綴合物W003048210A1增強(qiáng)體內(nèi)促紅細(xì)胞生成素活性的融合蛋白W003046013A1促紅細(xì)胞生成素體內(nèi)活性增強(qiáng)的融合蛋白W003037273A2使用促紅細(xì)胞生成素治療缺血性急性腎功能衰竭的方法W003012432A1促紅細(xì)胞生成素和抗腫瘤壞死因子α聯(lián)合治療W002089799A2二氫吡唑用于提高促紅細(xì)胞生成素和血管化的應(yīng)用W002064085A2包括吡喃果糖氨基磺酸鹽和促紅細(xì)胞生成素的治療神經(jīng)學(xué)功能紊亂W002053580A2促紅細(xì)胞生成素-應(yīng)答細(xì)胞、組織和器官的保護(hù)、復(fù)原和增強(qiáng)W00249673A2促紅細(xì)胞生成素綴合物W00248194A1促紅細(xì)胞生成素體內(nèi)活性增強(qiáng)的融合蛋白W00214356A2使用活性高副作用少的重組促紅細(xì)胞生成素治療對(duì)象的方法W00187329A1含有促紅細(xì)胞生成素衍生物的液體藥物組合物W00159074A1生產(chǎn)人促紅細(xì)胞生成素的轉(zhuǎn)基因豬的方法以及轉(zhuǎn)基因豬W00136489A2改善性能的促紅細(xì)胞生成素形式W00129178A2Epo初級(jí)應(yīng)答基因1，EprglW00107075A2多劑量促紅細(xì)胞生成素制劑W00102017A2促紅細(xì)胞生成素衍生物W00067776A1紅細(xì)胞生成素給藥的藥物動(dòng)力學(xué)和藥物動(dòng)態(tài)模型W00061637A1促紅細(xì)胞生成素受體抗體W00061169A1促紅細(xì)胞生成素的藥物組合物W00028066A1表達(dá)重組人促紅細(xì)胞生成素的宿主細(xì)胞W00027997A1生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞的大量培養(yǎng)方法W00027869A1從細(xì)胞培養(yǎng)物傷情純化重組人促紅細(xì)胞生成素的方法W00027419A1獲得重組人促紅細(xì)胞生成素的在室溫下穩(wěn)定的凍干藥物組合物的方法W00014261A1人促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生W00009713A1編碼促紅細(xì)胞生成素的腺病毒載體以及它們在基因治療中的應(yīng)用W09966054A2促紅細(xì)胞生成素類似物-人血清白蛋白融合物W09954279A1作為促紅細(xì)胞生成素模擬物的被取代氨基酸W09952543A2包含促紅細(xì)胞生成素的用于治療癌癥的藥物組合物W09947151A1促紅細(xì)胞生成素受體的肽配體W09921966A1促紅細(xì)胞生成素-介導(dǎo)的神經(jīng)形成W09906063AlEpo初級(jí)應(yīng)答基因，Eprg3ptW09902709A1重組促紅細(xì)胞生成素/免疫球蛋白融合蛋白W09823643A1生物活性提高的多聚促紅細(xì)胞生成素W09819695A1遞送促紅細(xì)胞生成素的裝置和方法W09807442A1包含促紅細(xì)胞生成素和聚交酯羥基乙酸的持續(xù)釋放制劑W09749729A1模擬促紅細(xì)胞生成素活性的多肽W09748729A1二價(jià)分子，其與促紅細(xì)胞生成素受體形成激活復(fù)合物W09741526A1促紅細(xì)胞生成素的小分子模擬物W09727219A1促紅細(xì)胞生成素結(jié)合蛋白的純化和使用方法W09708200A1促紅細(xì)胞生成素結(jié)合蛋白，其可以用于調(diào)節(jié)紅血球生成Andan檢驗(yàn)用于其測定W09640749A1結(jié)合促紅細(xì)胞生成素受體的化合物和肽W09640073A2持續(xù)釋放非聚集促紅細(xì)胞生成素的組合物W09632413A1純化糖蛋白類促紅細(xì)胞生成素的方法W09619573A1促紅細(xì)胞生成素的重組DNA分子和表達(dá)載體W09618647A1噴霧干燥的促紅細(xì)胞生成素W09603438A1激活促紅細(xì)胞生成素受體的抗體W09505469A1人促紅細(xì)胞生成素受體片段及其抗體W09505465A1促紅細(xì)胞生成素類似物W09425055A1促紅細(xì)胞生成素類似物組合物和方法W09424160A2活性增強(qiáng)的促紅細(xì)胞生成素突變蛋白W09417784A1促紅細(xì)胞生成素的肺部給藥W09402611A2生物活性改變的重組人促紅細(xì)胞生成素W09325221A1促紅細(xì)胞生成素藥物遞送系統(tǒng)W09305807A2促紅細(xì)胞生成素增效劑和它們的應(yīng)用方法W09118973A1促紅細(xì)胞生成素-依賴性成紅細(xì)胞小鼠細(xì)胞系W09111200A1改善的基于環(huán)糊精的促紅細(xì)胞生成素制劑W09106630A1因子依賴性造血細(xì)胞系，其展現(xiàn)出Epo誘導(dǎo)的紅細(xì)胞成熟化W09105867A1促紅細(xì)胞生成素同工型TO9008822A1促紅細(xì)胞生成素受體W08800241A1人促紅細(xì)胞生成素基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高水平表達(dá)W08604068A1均質(zhì)促紅細(xì)胞生成素W08603520A1生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法W08503079A1人促紅細(xì)胞生成素CDA克隆W08403152AlAtccHb8209及其針對(duì)促紅細(xì)胞生成素的單克隆抗體目前正在開發(fā)許多用于貧血、CHF和其他適應(yīng)癥的EPO受體激動(dòng)劑，其可以用作本發(fā)明方法的中的EPO受體激動(dòng)劑藥物公司適應(yīng)癥階段促紅細(xì)胞生成素Darbepoetin-α(Aranesp)Amgen癌癥相關(guān)貧血III期充血性心力衰竭II期CERA(連續(xù)促紅細(xì)胞生成素受體激活劑)RocheCKDBLA提交CIAIII期NE-180(GlycoPEG-促紅細(xì)胞生成素)NeoseCKD，CIAI期EPO-FcSyntonixCKD,CIAI期AMG114(darbepoetin的高糖基化類似物)AmgenCIAI期合成的促紅細(xì)胞生成素受體激動(dòng)劑HematideAffymax/Takeda*CKD,CIA,PRCA患者中的貧血II期促紅細(xì)胞生成素替代品FG-2216FibroGenCKD,CIAII期FG-4592FibroGen由于鐵處理缺陷的貧血I期本發(fā)明的其他EPO受體拮抗劑包括融合蛋白，其含有任何可以根據(jù)本發(fā)明使用的EPO受體激動(dòng)劑肽。非限制性例子包括EPO模擬抗體，例如在美國專利申請nos.10/609,783(2003年6月30日提交)和10/935，005(2004年9月3日提交)中所公開的EPO模擬抗體，均通過參照全部并入本文中?？梢杂糜诒景l(fā)明方法的EPOR激動(dòng)劑的另一個(gè)非限制性例子，本發(fā)明還提供了至少一種本文所描述和/或本領(lǐng)域已知的分離的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或特定的部分或變體。任選地，EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體可以含有至少一個(gè)CH3區(qū)，所述CH3區(qū)與至少一個(gè)CH2區(qū)直接連接，所述CH2區(qū)與至少一個(gè)鉸鏈區(qū)或其片段(H)直接連接，所述鉸鏈區(qū)或其片段(H)與任選的接頭序列(L)直接連接，所述接頭序列直接連接到至少一個(gè)治療肽(P)，所述治療肽任選地進(jìn)一步與至少一個(gè)可變(V)抗體序列的至少一部分直接連接。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體包含式⑴((V(m)-P(n)-L(ο)-H(ρ)_CH2(q)_CH3(r))(s)，其中V是至少一部分免疫球蛋白可變區(qū)的N-末端，P是至少一種生物活性肽，L是通過使模擬抗體具有可選擇方向以及結(jié)合性質(zhì)而提供結(jié)構(gòu)柔性的多肽，H是至少一部分免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)，CH2是至少一部分免疫球蛋白CH2恒定區(qū)，CH3是至少一部分免疫球蛋白CH3恒定區(qū)，m、n、0、p、q、i^Ps可以獨(dú)立地是0、1或2與10之間的整數(shù)，模擬不同類型的免疫球蛋白分子，例如但不限于IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD、IgE等或其組合。m=1的單體可以通過締合或共價(jià)鍵連接到其他單體，例如但不限于Cys-Cys二硫鍵或其他免疫球蛋白分子。本發(fā)明的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體模擬抗體結(jié)構(gòu)具有其固有性質(zhì)和功能，同時(shí)提供一種治療肽和其固有或獲得的體外、體內(nèi)或原位性質(zhì)或活性。本發(fā)明抗體的各種部分和至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體的治療肽部分可以根據(jù)本文所述結(jié)合本領(lǐng)域中已知的而變化。本文所使用的“ΕΡ0模擬鉸鏈核心模擬抗體”“ΕΡ0模擬鉸鏈核心模擬抗體部分”或"ΕΡ0模擬鉸鏈核心模擬抗體片段”和/或“ΕΡ0模擬鉸鏈核心模擬抗體變體”等模擬物在體夕卜、原位和/或優(yōu)選體內(nèi)具有或刺激至少一種配體結(jié)合或至少一部分的至少一種生物學(xué)活性，例如配體結(jié)合或活性，例如但不限于SEQIDNOS1-30的至少一種。例如，本發(fā)明適當(dāng)?shù)腅PO模擬鉸鏈核心模擬抗體、特定的部分或變體能夠結(jié)合至少一種蛋白質(zhì)配體并且包含至少一種蛋白質(zhì)配體、受體、可溶受體等。適當(dāng)?shù)腅PO模擬鉸鏈核心模擬抗體、特定的部分或變體還能夠調(diào)節(jié)、提高、激活至少一種蛋白質(zhì)受體信號(hào)或其他可測量或可檢測活性?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法和組合物的模擬抗體的特征在于與蛋白質(zhì)配體或受體結(jié)合的適當(dāng)親和力，并任選地且優(yōu)選具有低毒性。特別的，在本發(fā)明中可以使用EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體，其中單獨(dú)的組分例如一部分可變區(qū)、恒定區(qū)(沒有CHl區(qū))和框架或者他們的任何部分(例如重鏈和輕鏈可變區(qū)的J、D或V區(qū)的一部分；至少一個(gè)鉸鏈區(qū)的至少一部分、重鏈和輕鏈恒定區(qū)等)單獨(dú)地和/或全體任選地并優(yōu)選具有低免疫原性。任選地，可以用于本發(fā)明的模擬抗體的特征在于它們長期治療患者的能力，其能夠良好至優(yōu)異地緩解癥狀和低毒性。低免疫原性和/或高親和力以及其他未確定的性質(zhì)可以有助于所獲得的治療結(jié)果?！暗兔庖咴浴痹诒疚闹斜欢x為在低于大約75%或優(yōu)選低于大約50、45、40、35、30、35、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2和/或1%所治療的患者中產(chǎn)生顯著的HAMA、HACA或HAHA應(yīng)答，和/或在所治療的患者中產(chǎn)生低滴度(使用雙抗原酶免疫檢驗(yàn)測量為低于大約300，優(yōu)選低于大約100)(參見例如Elliott等人，Lancet3441125-1127(1994))。實(shí)用性本發(fā)明的分離的核酸可以用于生產(chǎn)至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體、它們的片段或特定的變體，其(或者其編碼DNA)可以用于在細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物(包括哺乳動(dòng)物和人)中實(shí)現(xiàn)對(duì)選自但不限于至少一種葡萄糖耐受不良和/或腎病相關(guān)貧血以及其他抑制或特定的蛋白質(zhì)相關(guān)病癥的至少一種病癥的癥狀的調(diào)節(jié)、治療、緩解、輔助防止發(fā)生或減輕。該方法可以包括為需要該調(diào)節(jié)、治療、緩解、防止或減輕癥狀、效果或機(jī)制的細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者給藥有效量的包含至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或特定部分或變體的組合物或藥物組合物。根據(jù)如本文所述或相關(guān)領(lǐng)域中已知方法所進(jìn)行并測定的，有效量可以包括每單次給藥或多次給藥大約0.0001500mg/kg的量，或者達(dá)到血清濃度為每單次給藥或多次給藥大約0.0001-5000μg/ml血清濃度的量，或者其中的任何有效的范圍或數(shù)值。引用本文所提到的全部出版物或?qū)＠纪ㄟ^參照全部并入本文，因?yàn)樗麄冿@示了本發(fā)明申請時(shí)的技術(shù)狀態(tài)并且/或者提供對(duì)本發(fā)明的描述和實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。出版物是指任何科學(xué)或?qū)＠霭嫖?，或者任何以任何模式獲得的其他信息，包括所有記錄的、電子的或印刷模式的。通過參照將下列參考文獻(xiàn)整體并入本文Ausubel，等人，ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.，NY,NY(1987-2006)；Sambrook,等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NY(1989)；HarlowandLane,Antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY(1989)；Colligan,等人，eds.,CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY(1994-2006)；Colligan等人，CurrentProtocolsinProteinScience,Johnffiley&Sons,NY,NY,(1997-2006)。本發(fā)明的模擬抗體或EPO受體激動(dòng)劑EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體可以任選地包含至少一個(gè)CH3區(qū)，所述CH3區(qū)與至少一個(gè)CH2區(qū)直接連接，所述CH2區(qū)與包含至少一個(gè)核心鉸鏈區(qū)的至少一個(gè)鉸鏈區(qū)片段(H)直接連接，所述鉸鏈區(qū)片段(H)與任選的接頭序列(L)直接連接，所述接頭序列直接連接到至少一個(gè)治療肽(P)，所述治療肽任選地進(jìn)一步與至少一個(gè)可變抗體序列(V)的至少一部分直接連接。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，一對(duì)CH3-CH2-H-L-V，其通過締合鍵或共價(jià)鍵連接在一起。因此，本發(fā)明的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體模擬抗體結(jié)構(gòu)，具有其固有性質(zhì)和功能，同時(shí)提供一種治療肽和其固有或獲得的體外、體內(nèi)或原位性質(zhì)或活性。根據(jù)本文所述以及結(jié)合本領(lǐng)域中已知的，至少一種本發(fā)明的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體的抗體和治療肽部分的各種部分可以變化。因此，本發(fā)明的模擬抗體與已知蛋白質(zhì)相比提供了至少一種適當(dāng)?shù)男再|(zhì)，例如但不限于提高的半衰期、提高的活性、更特異性的活性、提高的親合力、提高的或降低的消耗速度(offrate)、選定的或更適當(dāng)?shù)幕钚宰蛹?subset)、較低的免疫原性、提高的質(zhì)量或至少一種期望治療效果的持續(xù)時(shí)間、較少的副作用等的至少一種。可以通過本領(lǐng)域中已知的和/或本文所描述的酶切、合成或重組技術(shù)生產(chǎn)根據(jù)式(I)的模擬抗體的片段。也可以使用在天然終止位點(diǎn)上游引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子的抗體基因，生產(chǎn)各種截?cái)嘈问降哪M抗體?？梢酝ㄟ^傳統(tǒng)技術(shù)利用化學(xué)手段將模擬抗體的各個(gè)部分連接在一起，或者可以使用遺傳工程技術(shù)將模擬抗體的各個(gè)部分制備為連續(xù)的蛋白質(zhì)。例如，可以將表達(dá)至少一個(gè)人抗體恒定區(qū)的核酸進(jìn)行表達(dá)以產(chǎn)生用于本發(fā)明模擬抗體的連續(xù)蛋白質(zhì)。參見例如關(guān)于單鏈抗體的Ladner等人，美國專利No.4，946，778以及Bird，R.Ε.等人，Science,242:423_426(1988)。本文所使用的術(shù)語“人模擬抗體”是指一種抗體，其中基本上蛋白質(zhì)的每個(gè)部分(例如EPO模擬肽、框架、CL、Ch結(jié)構(gòu)域(例如Ch2，Ch3)、鉸鏈、(VL,Vh))都被預(yù)計(jì)在人類中以非常小的序列改變或變化而基本上沒有免疫原性。任選地并優(yōu)選這些改變或變化相對(duì)于本發(fā)明未修飾的人抗體或模擬抗體保持或降低在人類中的免疫原性。因此，人抗體和相應(yīng)的本發(fā)明的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體與嵌合抗體或人源化抗體不同。需要指出，可以由能夠表達(dá)人免疫球蛋白(例如重鏈和/或輕鏈)基因的非人動(dòng)物或細(xì)胞生產(chǎn)人抗體和EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定的部分或變體是由至少一種細(xì)胞系、混合細(xì)胞系、永生化細(xì)胞或永生化細(xì)胞的克隆群體和/或培養(yǎng)細(xì)胞所產(chǎn)生的?？梢允褂眠m當(dāng)?shù)姆椒óa(chǎn)生永生化的產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞。優(yōu)選，至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定的部分或變體是通過下列產(chǎn)生的提供包含DNA的核酸或載體，該包含DNA來自至少一個(gè)被功能性重排的人免疫球蛋白基因座或與該人免疫球蛋白基因座具有基本相似的序列，其中所述核酸或載體可以經(jīng)歷功能性重排，并且正如本領(lǐng)域已知的，其進(jìn)一步包含本文所描述的模擬抗體結(jié)構(gòu)，例如但不限于式(I)，其中C-末端和N-末端可變區(qū)部分可以用于V、鉸鏈區(qū)用于H、CH2用于CH2以及CH3用于CH3。核酸分子使用本文所提供的信息以及本領(lǐng)域已知的信息，例如可以使用本文所描述的方法或本領(lǐng)域中已知的方法獲得編碼各種EPOR肽或蛋白質(zhì)激動(dòng)劑的核苷酸序列，本發(fā)明編碼至少一種EPOR激動(dòng)劑的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式的，例如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式，或者是DNA形式的包括但不限于通過克隆或合成生成的cDNA以及基因組DNA，或任何它們的組合。DNA可以是三鏈的、雙鏈的或單鏈的或者任何它們的組合。DNA或RNA的至少一條鏈的任何部分都可以是編碼鏈，也被稱作有義鏈，或者其可以使非編碼鏈，也被稱作反義鏈。本發(fā)明的分離的核酸分子可以包括核酸分子，其包含任選地具有一個(gè)或者多個(gè)內(nèi)含子的開放閱讀框(ORF)，包含EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體編碼序列的核酸分子；以及核酸分子，其包含與上述基本上不同的核苷酸序列，但由于遺傳密碼子的簡并性，其仍能夠編碼本文所述和/或本領(lǐng)域中已知的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑。當(dāng)然，遺傳密碼是本領(lǐng)域中公知的。因此，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員產(chǎn)生這些編碼本發(fā)明具體EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的簡并核酸變體是常規(guī)的。參見例如Ausubel，等人，同上，并且這些核酸變體也包括在本發(fā)明中。正如本文所述，本發(fā)明的包含編碼EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的核酸的核酸分子可以包括但不限于自身編碼EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑片段的氨基酸序列的那些；整個(gè)EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或其一部分的編碼序列；EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑，片段或一部分的編碼序列，以及其他序列，例如至少一個(gè)信號(hào)導(dǎo)肽(signalleader)或融合蛋白的編碼序列，具有或不具有前述的其他編碼序列，例如至少一個(gè)內(nèi)含子，連同其他的非編碼序列，包括但不限于非編碼5’和3’序列，例如轉(zhuǎn)錄的非翻譯序列，其在轉(zhuǎn)錄、mRNA處理中發(fā)揮作用，包括剪接和多聚腺苷酸化信號(hào)(例如-mRNA的核糖體結(jié)合和穩(wěn)定性)；其他的編碼序列，其編碼其他的氨基酸，例如提供額外功能的那些。因此，編碼EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的序列可以與標(biāo)記序列融合，例如編碼輔助純化融合的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的肽的序列，其中所述融合的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體包含EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑片段或其一部分。與本文所述多核苷酸選擇性雜交的多核苷酸本發(fā)明提供了分離的核酸，其在選擇性雜交條件下與本文所公開的或其他本文公開的多核苷酸雜交，包括他們的特定的變體或部分。因此，該實(shí)施方式的多核苷酸可以用于分離、檢測和/或定量包含這些多核苷酸的核酸。低或中等嚴(yán)格的雜交條件通常但不唯一地用于相對(duì)于互補(bǔ)序列具有低序列同一性的序列。中等和高嚴(yán)格條件可以任選地用于較高同一性的序列。低嚴(yán)格條件允許具有大約4099%序列同一性的序列的選擇性雜交，并且可以用于鑒定直向同源或共生同源序列。任選地，本發(fā)明的多核苷酸會(huì)編碼至少一部分本文所述多核苷酸所編碼的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體。本發(fā)明的多核苷酸包括核酸序列，其可以用于與編碼本發(fā)明EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的選擇性雜交的核酸序列。參見例如Ausubel，同上；Colligan，同上，均通過參照全部并入本文。核酸的構(gòu)建正如本領(lǐng)域公知的，可以使用(a)重組方法、(b)合成技術(shù)、(C)純化技術(shù)或它們的組合制備本發(fā)明的分離的核酸。除了本發(fā)明的多核苷酸外，核酸還可以便利地包含其他序列。例如，包含一個(gè)或者多個(gè)核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)可以被插入到核酸中以輔助分離所述多核苷酸。同樣，可以插入可翻譯序列以輔助分離所翻譯的本發(fā)明的多核苷酸。例如，六聚組氨酸標(biāo)記序列提供了純化本發(fā)明蛋白質(zhì)的便利手段。本發(fā)明的核酸_不包括編碼序列-任選地是載體、連接物或接頭用于克隆和/或表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸?？梢詫⑵渌男蛄刑砑拥竭@些克隆和/或表達(dá)序列以優(yōu)化它們在克隆和/或表達(dá)中的功能，輔助分離多核苷酸，或改善將多核苷酸引入到細(xì)胞中?？寺≥d體、表達(dá)載體、連接物和接頭的使用是本領(lǐng)域中公知的。參見例如Ausubel，同上；或Sambrook，同上。構(gòu)建核酸的重組方法可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何克隆方法從生物來源獲得本發(fā)明的分離的核酸組合物例如RNA、cDNA、基因組DNA，或者任何它們的組合。在某些實(shí)施方式中，將在適當(dāng)?shù)膰?yán)格條件下與本發(fā)明的多核苷酸雜交的寡核苷酸探針用于鑒定cDNA或基因組DNA庫中的期望序列。RNA的分離、cDNA和基因組庫的構(gòu)建是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。(參見例如Ausubel,同上；或Sambrook,同上)。構(gòu)建核酸的合成方法也可以通過已知的方法利用直接化學(xué)合成制備本發(fā)明的分離的核酸(參見例如Ausubel，等人，同上)。化學(xué)合成通常產(chǎn)生單鏈寡核苷酸，其可以通過與互補(bǔ)序列雜交而被轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA，或者使用單鏈作為模板利用DNA聚合酶進(jìn)行聚合而轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到DNA的化學(xué)合成可以被限制為大約100或更多堿基的序列，通過連接較短的序列可以獲得較長的序列。重組表達(dá)盒本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明核酸的重組表達(dá)盒。本發(fā)明的核酸序列例如編碼本發(fā)明EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的序列的cDNA或基因組可以用于構(gòu)建重組表達(dá)盒，其可以被引入到至少一種期望的宿主細(xì)胞中。重組表達(dá)盒通常包括本發(fā)明的多核苷酸，其可操作地連接到轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控序列，這將指導(dǎo)多核苷酸在期望宿主細(xì)胞中的直接轉(zhuǎn)錄。可以采用異源和非異源(即內(nèi)源)啟動(dòng)子以指導(dǎo)本發(fā)明核酸的表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，可以將作為啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其他元件的分離的核酸引入到本發(fā)明多核苷酸非異源形式的適當(dāng)位置中(內(nèi)含子的上游、下游)，以上調(diào)或下調(diào)本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)。例如，正如本領(lǐng)域中已知的，可以通過突變、缺失和/或置換在體內(nèi)或體外改變內(nèi)源性啟動(dòng)子。如果期望，可以以有義方向或者反義方向表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。能夠理解，以有義方向或者反義方向控制基因表達(dá)都能夠?qū)捎^察的特征造成直接的影響。另一種抑制方法是有義抑制。在有義方向上引入設(shè)定的核酸已經(jīng)顯示是一種阻斷靶基因轉(zhuǎn)錄的的有效手段。載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的核酸分子的載體，、被重組載體遺傳改造的宿主細(xì)胞以及通過本領(lǐng)域公知的重組技術(shù)生產(chǎn)至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體。參見例如Sambrook，等人，同上；Ausubel，等人，同上，均通過參照全部并入本文。多核苷酸能夠任選地被連接到含有可選擇標(biāo)記的載體用于在宿主中傳代。通常，使用適當(dāng)?shù)囊阎椒?，將質(zhì)粒載體引入到細(xì)胞中，例如電穿孔法等，其他已知的方法包括以沉淀使用載體例如磷酸鈣沉淀，或者以與帶電荷的脂類的復(fù)合物。如果載體是病毒，則其可以在體外使用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系，接著轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞中。DNA插入物應(yīng)該被可操作地連接到適當(dāng)?shù)膯?dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體(construct)將進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄區(qū)域中包含任選地用于轉(zhuǎn)錄起始、終止至少之一的位點(diǎn)，以及用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建體所表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄子的編碼部分將優(yōu)選地在起點(diǎn)包括翻譯起始密碼子，終止密碼子(例如UAA、UGA或UAG)適當(dāng)?shù)匚挥诒环g的mRNA的末端，其中對(duì)于哺乳動(dòng)物或真核細(xì)胞表達(dá)UAA和UAG是優(yōu)選的。表達(dá)載體將優(yōu)選但任選地包含至少一個(gè)選擇標(biāo)記。這些標(biāo)記包括但不限于甲氨蝶呤(MTX)、二氫葉酸還原酶(DHFR,美國專禾IjNos.4，399，216；4，634，665；4，656，134；4，956，288；5,149，636；5,179，017)、氨芐青霉素，新霉素(G418)，霉酚酸，或谷氨酰胺合成酶(GS，美國專利Nos.5，122，464；5,770，359；5,827，739)抗性用于真核細(xì)胞培養(yǎng)，以及四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因用于在大腸桿菌(E.coli)或其他細(xì)菌或原核細(xì)胞培養(yǎng)(通過參照將上述專利全部并入本文)。上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域中已知的。適當(dāng)?shù)妮d體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是容易明顯的。可以通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂類介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其他已知方法實(shí)現(xiàn)將載體構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞中。這些方法被描述在現(xiàn)有技術(shù)中，例如Sambrook，同上，Chapters1_4和16-18；Ausubel,同上，Chapters1,9,13，15，16。可以以經(jīng)修飾的形式表達(dá)本發(fā)明的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體，例如融合蛋白，并且可以不僅包括分泌信號(hào)，還有其他的異源功能區(qū)。例如，額外的氨基酸區(qū)，特別是帶電荷的氨基酸，能夠被加入到EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的N-末端，以提高純化過程中或后續(xù)處理和儲(chǔ)存過程中宿主細(xì)胞的穩(wěn)定性和持續(xù)。同樣，肽模擬物可以被添加到本發(fā)明的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體，以輔助純化。這些區(qū)域可以在最后制備EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或它們的至少一種片段之前被除去。這些方法被描述在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊中，例如Sambrook，(2003)同上，Chapters17.29-17.42和18.1-18.74；Ausubel(2003)，同上，Chapters16，17和18。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知道許多表達(dá)載體可以用于表達(dá)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸?？梢杂糜谏a(chǎn)模擬抗體、其特定部分或變體的細(xì)胞培養(yǎng)的例子是哺乳細(xì)胞。哺乳細(xì)胞系統(tǒng)通常是以單層細(xì)胞的形式，盡管也可以使用哺乳細(xì)胞懸浮液或生物反應(yīng)器?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)開發(fā)了許多適當(dāng)?shù)哪軌虮磉_(dá)完整(intact)糖基化蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞系，并且包括C0S-1(例如，ATCCCRL1650)，C0S-7(例如，ATCCCRL-1651)，HEK，HEK293，BHK21(例如，ATCCCRL-10)，CHO(例如，ATCCCRL1610，DG—44)禾口BSC—1(例如，ATCCCRL-26)細(xì)胞系，h印G2細(xì)胞，P3X63Ag8.653，SP2/0_Agl4，293細(xì)胞，HeLa細(xì)胞等，其容易從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),Manassas，Va獲得。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括淋巴來源的細(xì)胞，例如骨髓瘤和淋巴瘤細(xì)胞。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞是P3X63Ag8.653細(xì)胞(ATCC索取號(hào)CRL-1580)和SP2/0_Agl4細(xì)胞(ATCC索取號(hào)CRL-1851)。這些細(xì)胞的表達(dá)載體可以包括下列表達(dá)控制序列的一種或者多種，例如但不限于復(fù)制的起點(diǎn)；啟動(dòng)子(例如，晚期或早期SV40啟動(dòng)子，CMV啟動(dòng)子(例如，美國專利Nos.5,168,062;5，385，839)JPHSVtk啟動(dòng)子，pgk(磷酸甘油酯激酶)啟動(dòng)子，EF-Iα啟動(dòng)子(例如，美國專利No.5，266，491)，至少一種人免疫球蛋白啟動(dòng)子；增強(qiáng)子，和/或處理信息位點(diǎn)，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，RNA剪接位點(diǎn)，多聚腺苷酸化位點(diǎn)(例如，SV40大TAg多聚A添加位點(diǎn))，和轉(zhuǎn)錄終止子序列。參見例如Ausubel等人，同上；Sambrook，等人，同上。其他可以用于生產(chǎn)本發(fā)明核酸或蛋白質(zhì)的細(xì)胞是已知和/或可得到的，例如來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心的細(xì)胞系和雜交瘤目錄(AmericanTypeCultureCollectionCatalogueofCellLinesandHybridomas)(www.atcc.org)或其他已知或商業(yè)來源。如果采用真核宿主細(xì)胞，則通常將多聚腺苷酸或轉(zhuǎn)錄終止子序列加入到載體中。終止子序列的例子是來自牛生長激素基因的多聚腺苷酸序列。還包括用于精確剪接轉(zhuǎn)錄子的序列。剪接序列的例子是來自SV40的VPl內(nèi)含子(Sprague，等人，J.Virol.45773-781(1983))。另外，正如本領(lǐng)域中已知的，在宿主細(xì)胞中控制轉(zhuǎn)錄的基因序列可以被加入到載體中。EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或其特定部分或變體的純化可以通過公知方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體，包括但不限于蛋白質(zhì)A純化、硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析和植物凝集素層析。也可以采用高效液相層析(“HPLC”)進(jìn)行層析。參見例如Colligan,CurrentProtocolsinImmunology,或CurrentProtocolsinproteinScienceiJohnWiley&Sons,NY,NY,(1997-2006)，例如，Chapters1，4，6，8，9，10，均通過參照并入本文。本發(fā)明的模擬抗體或特定部分或變體包括天然純化的產(chǎn)品、化學(xué)合成程序的產(chǎn)品和重組技術(shù)從真核宿主包括例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)品。根據(jù)在重組生產(chǎn)程序中所采用的宿主，本發(fā)明的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體可以被糖基化，或者是非糖基化的，其中優(yōu)選糖基化。這些方法被描述在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊中，例如Sambrook，同上，Sectionsl7.37-17.42；Ausubel,同上，Chapters10,12,13,16,18禾口20,Colligan,proteinScience,同上，Chapters12-14,均通過參照全部并入本文。模擬抗體、特定片段和/或變體本發(fā)明的分離的模擬抗體包括由本文充分討論的本發(fā)明的任何一種多核苷酸編碼的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體，或者任何分離的或制備的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或其特定部分或變體。優(yōu)選，EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或配體結(jié)合部分或變體結(jié)合至少一種EPO蛋白質(zhì)配體或受體，并進(jìn)而提供了相應(yīng)蛋白質(zhì)或其片段的至少一種EPO生物學(xué)活性。不同的治療或診斷顯著蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域中公知的，并且這些蛋白質(zhì)的適當(dāng)檢驗(yàn)或生物學(xué)活性也是本領(lǐng)域中公知的。下表1中提供了本發(fā)明適當(dāng)EPO模擬肽的非限制性例子?？梢酝ㄟ^本文所公開的和/或本領(lǐng)域中已知的方法制備這些肽。大多數(shù)情況中使用單字母氨基酸縮寫。這些序列中(以及本說明書中，除非特別說明)x的意思是可以存在任何20種天然存在或已知氨基酸殘基或已知衍生物的，或者任何其經(jīng)修飾的氨基酸。任何這些肽都可以串聯(lián)連接(即連續(xù)地)，具有或不具有接頭，在表中提供了一些串聯(lián)連接的例子。接頭被以“Δ”列出，并且可以使本文所述的任何接頭。為了清楚，虛線分別顯示串聯(lián)重復(fù)和接頭。所有含有半胱氨酸殘基的肽都可以任選地與含有Cys的肽交聯(lián)，其中所述Cys之一或兩個(gè)Cys都被連接到媒介上。在表中提供了一些交聯(lián)的例子。任何具有多個(gè)Cys殘基的肽也可以形成肽內(nèi)二硫鍵；參見，例如表1中的EPO-模擬肽。表中詳細(xì)說明了一些肽內(nèi)二硫鍵肽的例子。根據(jù)本文所屬，所有這些肽都可以被衍生化，表中提供了一些衍生的例子。對(duì)于，羧基末端可以被氨基加帽(capped)，其中加帽氨基被顯示為-ΝΗ2。對(duì)于，氨基酸殘基被氨基酸殘基以外的部(moiety)取代的衍生物，取代被表示為，其代表任何本領(lǐng)域中已知的部，例如，在Bhatnagar等人(1996)，J.Med.Chem.39:3814_9和Cuthbertson等人(1997)，J.Med.Chem.402876-82中所述的，通過參照將其并入本文。J取代基和Z取代基(Z5，Z6，..Z40)是在美國專利Nos.5，608，035，5，786，331和5，880，096中所定義的，通過參照將其全部并入本文。對(duì)于EPO-模擬序列(表1)，取代基X2Xll以及整數(shù)”η”是在WO96/40772中所限定的，通過參照將其全部并入本文。黑體表示的殘基是D-氨基酸，但可以任選地為L-氨基酸。除非明確說明，所有肽都是通過肽鍵連接的。在本說明書的最后列舉了縮寫。在”SEQIDNO.”列中，”NR”的意思是對(duì)于給定序列，不需要序列表。表1-EP0-模擬肽序列序列/結(jié)構(gòu)SEQIDNO:YXCXXGPXTWXCXP1YXCXXGPXTWXCXP-YXCXXGPXTWXCXP2YXCXXGPXTWXCXP-A-YXCXXGPXTWXCXP3YXCXXGPXTWXCXP-Λ-(ε-胺)4YXCXXGPXTWXCXP-Λ-(α-胺)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG5GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG6GGVYACRMGPITWVCSPLGG7VGNYMCHFGPITWVCRPGGG8GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG9GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG10GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG11GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-A-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG12GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK13GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK14GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK-A-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK15GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSS(ε-胺)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSS(α-胺)16GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(-A-生物素)17CX4X5GPX6TWX7C18GGTYSCHGPLTWVCKPQGG19VGNYMAHMGPITWVCRPGG20GGPHHVYACRMGPLTWIC21GGTYSCHFGPLTWVCKPQ22GGLYACHMGPMTWVCQPLRG23TIAQYICYMGPETWECRPSPKA24YSCHFGPLTWVCK25YCHFGPLTWVC26X3X4X5GPX6TWX7X827.YX2X3X4X5GPX6TWX7X828X1YX2X3X4X5GPX6X7X8X9X10Xn29X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X1130GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG31GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG32VGNYMCHFGPITWVCRPGGG33GGVYACRMGPITWVCSPLGG34TIAQYICYMGPETWECRPSPKA35YSCHFGPLTWVCK36YCHFGPLTWVC37SCHFGPLTWVCK38(AX2)nX3X4X5GPX6TWX7X839EPO生物學(xué)活性是本領(lǐng)域中公知的。參見例如AnagnostouA等人，促紅細(xì)胞生成素對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞具有致有絲分裂和正趨化作用.ProceedingsoftheNationalAcademyofScience(USA)875978-82(1990)；FandreyJ和JelkmanWE，白介素-1和腫瘤壞死因子-α抑制促紅細(xì)胞生成素體外生成.AnnalsoftheNewYorkAcademyofScience628250-5(1991)；GeisslerK等人，重組人促紅細(xì)胞生成素體內(nèi)和體外多潛能造血生長因子·Contrib.Nephrol.87:1_10(1990)；GregoryCJ,造血系統(tǒng)中作為分化標(biāo)記的促紅細(xì)胞生成素敏感性.培養(yǎng)物中三個(gè)促紅細(xì)胞生成集落反應(yīng)的研究.JournalofCellularPhysiology89:289-301(1976)JelkmanW等人，在人肝癌培養(yǎng)物和分離的灌注大鼠腎中抑制促紅細(xì)胞生成素生成的單核因子LifeSci.50=301-8(1992)；KimataH等人，人重組促紅細(xì)胞生成素直接刺激無血清培養(yǎng)基中B細(xì)胞免疫球蛋白生成和增殖.ClinicalandExperimentalImmunology85:151-6(1991)；KimataH等人，促紅細(xì)胞生成素在無血清培養(yǎng)基中增強(qiáng)免疫球蛋白生成和通過人漿細(xì)胞的增殖.Clin.ImmunologyImmunopathol.59495-501(1991)；KimataH等人，重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)于體外人IgE生成的影響，ClinicalandExperimentalImmunology83:483_7(1991)；KouryMJ禾口BondurantMC,在紅細(xì)胞祖細(xì)胞中促紅細(xì)胞生成素延遲DNA斷裂并且阻止程序化細(xì)胞死亡.Science248:378-81(1990)；LimVS等人，重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)于人腎功能的影響.KidneyInternational37:131—6(1990)；MitjavilaMT等人，促紅細(xì)胞生成素的自分泌刺激以及人紅細(xì)胞白血病細(xì)胞在體外的自發(fā)生長.JournalofClinicalInvestigation88:789-97(1991)；AndreM等人，促紅細(xì)胞生成素的免疫放射分析性能以及對(duì)于取自貧血和紅細(xì)胞增多癥患者的樣品的結(jié)果.ClinicalChemistry38:758-63(1992)；HankinsWD等人，促紅細(xì)胞生成素依賴性和促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生性細(xì)胞系.研究以及白血病治療的涉及·AnnalsoftheNewYorkAcademyofScience554:21-8(1989)；KendallRGT等人，促紅細(xì)胞生成素放射免疫分析樣本的貯存和制備.Clin.Lab.Haematology13189-96(1991)；KrumviehD等人，測定生物活性促紅細(xì)胞生成素的相關(guān)生物測定的比較.Dev.Biol.Stand.69=15-22(1988)；MaDD等人，測定人血清促紅細(xì)胞生成素的評(píng)估以與RIA和體外生物測定比較.BritishJournalofHaematology80:431-6(1992);NoeG等人，用于測定人血清中促紅細(xì)胞生成素的敏感性夾心ELISA.BritishJournalofHaematology80:285-92(1992)；PaulyJU等人，用于抗血清中人白介素3(IL3)和人促紅細(xì)胞生成素(EPO)的抗體的高特異性和高敏感性酶免疫測定.BehringInstitutMitteilungen90:112-25(1991)；SakataS和EnokiY，基于CFU-E集落形成的用于血漿促紅細(xì)胞生成素的改善的微生物測定.Ann.Hematology64=224-30(1992)；SanengenT等人，得自高輸血新生和成年小鼠的血漿中的免疫反應(yīng)性促紅細(xì)胞生成素和紅細(xì)胞生成刺激因子.用關(guān)于促紅細(xì)胞生成素的放射免疫分析和細(xì)胞培養(yǎng)分析進(jìn)行的研究.ActaPhysiol.Scand.13511-6(1989)；WidnessJA等人，敏感性和特異性促紅細(xì)胞生成素免疫沉淀測定應(yīng)用于藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)·JournalofLab.Clin.Med.119=285-94(1992)；關(guān)于進(jìn)一步信息，還可以參見在每個(gè)生物檢驗(yàn)中所使用的單獨(dú)的細(xì)胞系。上述參考文獻(xiàn)均通過參照全部并入本文?？梢酝ㄟ^采用對(duì)該因子應(yīng)答的細(xì)胞系例如HCD57，NFS-60,TF-I和UT-7對(duì)EPO進(jìn)行檢驗(yàn)。還可以在集落形成檢驗(yàn)中獲取EPO活性，其通過從骨髓細(xì)胞測定CFU-E的數(shù)目?；蛘吆屯耆煌臋z測方法是細(xì)胞因子的RT-PCR定量。部分并優(yōu)選基本上提供蛋白質(zhì)或片段的至少至少一種生物學(xué)活性的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或其特定的部分或變體能夠結(jié)合蛋白質(zhì)或片段配體，進(jìn)而提供了至少一種活性，而這是通過蛋白質(zhì)結(jié)合至少一種蛋白質(zhì)配體或受體而介導(dǎo)的，或者通過其他蛋白質(zhì)依賴性或蛋白質(zhì)介導(dǎo)機(jī)制而介導(dǎo)的。本文所使用的，術(shù)語“EP0模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑活性”是指EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑，根據(jù)檢驗(yàn)，其能夠調(diào)節(jié)或造成至少一種蛋白質(zhì)依賴性活性至少大約60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000%或更多。EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體提供至少一種蛋白質(zhì)依賴性活性的能力優(yōu)選是通過本文所述和/或本領(lǐng)域中已知的至少一種適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)生物學(xué)檢驗(yàn)所評(píng)估的。本發(fā)明的人EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體可以類似于任何類別(IgG、IgA、IgM等)或同功型，并且可以包括至少一部分κ或λ輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，人EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體包含IgG重鏈可變片段，鉸鏈區(qū)，CH2和CH3，例如同功型IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的至少一種。本發(fā)明的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體結(jié)合對(duì)至少一種蛋白質(zhì)、亞基、片段、部分或它們的組合特異性的至少一種特定的配體。本發(fā)明至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑、特定部分或變體的至少一種EPO模擬肽能夠任選地結(jié)合配體的至少一種特定的配體表位。結(jié)合表位可以包含至少一種至少13個(gè)氨基酸的氨基酸序列至選自蛋白質(zhì)配體例如EPO受體或其部分的序列連續(xù)氨基酸的整個(gè)特定部分的任意組合。可以使用已知的技術(shù)通過將EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑的式(I)的各個(gè)部分連接在一起，使用已知的重組DNA技術(shù)的技術(shù)通過制備和表達(dá)至少一種(即一種或多種)編碼EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑的核酸分子，或者通過使用任何適當(dāng)?shù)姆椒ɡ缁瘜W(xué)合成，而制備這些模擬抗體。正如本領(lǐng)域中已知的和/或本文所述的，可以使用適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽浣Y(jié)合人EPO配體或受體并且包含至少一部分特定重鏈和輕鏈可變區(qū)的模擬抗體，例如噬菌體展示(Katsube，Y.，等人，IntJMol.Med,1(5):863_868(1998))或者采用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法?？梢允褂镁幋a核酸或其部分在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑。優(yōu)選，這些模擬抗體或配體結(jié)合片段可以以高親和力(例如低于或等于大約ICT7M的Kd)結(jié)合人EPO配體或受體。與本文所述序列基本相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸取代以及氨基酸缺失和和/或插入的的序列。保守氨基酸取代是指第一氨基酸被具有與第一氨基酸相似的化學(xué)和/或物理性質(zhì)(例如電荷、結(jié)構(gòu)、極性、疏水性/親水性)的第二氨基酸所替代。保守取代包括一個(gè)氨基酸被另一個(gè)下列組中的氨基酸所替代賴氨酸(K)、精氨酸(R)和組氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E;丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W禾口Y；C、S禾口T。氨基酸代碼正如本領(lǐng)域公知的，構(gòu)成本發(fā)明模擬抗體或特定部分或變體的氨基酸通常被簡寫?？梢詾榘被嶂概善鋯巫帜复a、其三字母代碼、命名或三核苷酸密碼子而描述氨基酸名稱(參見Alberts，B.，等人，MolecularBiologyofTheCell，第三版，GarlandPublishing,Inc.，NewYork,1994)，如下表所示表2<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>本發(fā)明EPO模擬鉸鏈核心模擬體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體可包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或添加，是來自突然突變或如本文所述的人工操作?？捎糜诒景l(fā)明的這樣的序列或其他序列包括但不限于在表3中列出的那些，如2003年9月30日提交的美國臨時(shí)申請60/507，349的圖1-42中進(jìn)一步描述，該申請全文引入本文以供參考，相當(dāng)于2004年6月17日提交的PCT申請US04/19783的圖1-41，該申請全文引入本文以供參考，其具有相應(yīng)的SEQIDNOS:31-720這些參考的圖1-42(SEQIDNOS31-72)或PCTUS04/19783的圖1-41顯示了重/輕鏈可變/恒定區(qū)序列、框架/亞域和取代及其可用于本發(fā)明Ig衍生蛋白的部分。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)根據(jù)許多因素包括上面所描述的得到氨基酸取代的數(shù)目。通常而言，如本文所述，對(duì)于至少一種模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑的氨基酸取代、插入或缺失的數(shù)目將不超過40、30、20，19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個(gè)氨基酸，例如1_30或任何其中的范圍或數(shù)值。下面對(duì)本發(fā)明的EPO鉸鏈核心模擬抗體的組分的描述是基于使用本發(fā)明的式I，((V(m)-P(n)-L(ο)-H(ρ)_CH2(q)_CH3(r))(s)，其中V是至少一部分免疫球蛋白可變區(qū)的N-末端，P是至少一種生物活性肽，L是至少一種接頭多肽，H是至少一種免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一部分，CH2是至少一部分免疫球蛋白CH2恒定區(qū)，CH3是至少一部分免疫球蛋白CH3恒定區(qū)，m、n、0、p、q、r和s可以獨(dú)立地是0、1或2與10之間的整數(shù)，模擬不同類型的免疫球蛋白分子，例如但不限于IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD、IgE等或任何它們的亞類或任何它們的組合。在本發(fā)明的鉸鏈核心模擬抗體中，任選的N-末端V部分可以包含至少一種重鏈可變區(qū)框架I(FRl)區(qū)的120個(gè)氨基酸，例如在2003年9月30日提交的美國臨時(shí)申請60/507，349(通過參照全部并入本文)的圖1030中所提供的(SEQIDN0S:40_61)，這對(duì)應(yīng)2004年6月17日提交的PCT申請No.US04/1978的圖141(通過參照全部并入本文)，如在這些圖中所提供的，其包含取代、缺失或插入，其中圖5、6和8是優(yōu)選的。同樣優(yōu)選的是包含序列Q-X-Q的可變區(qū)序列。P部分可以包含至少一種本領(lǐng)域中已知的或本文所述的任何治療肽，例如但不限于在表1、EQIDNOS:1-30中所提供的，或者本領(lǐng)域中已知的，或者任何它們的組合或連續(xù)序列，或任何它們的融合蛋白。任選的接頭序列可以是任何本領(lǐng)域中已知的適當(dāng)肽接頭。優(yōu)選的序列包括G和S的任何組合，例如Χ1-Χ2-Χ3-Χ4-ΧΠ，其中X可以是G或S，η可以是5_30。非限制性例子包括GS、GGGS、GSGGGS、GSGGGSGG等。在本發(fā)明中，不使用CHl部分，并且鉸鏈區(qū)N-末端的不同數(shù)目氨基酸被缺失，例如參照2003年9月30日提交的美國臨時(shí)申請60/507，349(通過參照全部并入本文)的圖142，對(duì)應(yīng)2004年6月17日提交的PCT申請No.US04/19783(通過參照全部并入本文)的圖141，以及表3。用于本發(fā)明模擬抗體的鉸鏈核心部分的氨基酸的不同數(shù)目包括但不限于至少一種鉸鏈區(qū)的N-末端氨基酸的任何下列缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或1-3、2_5、2_7、2-8、3-9、4-10、5-9、5-10、5-15、10-20、2-30、20-40、10-50或其中的任何范圍或數(shù)值，例如2003年9月30日提交的美國臨時(shí)申請60/507，349(通過參照全部并入本文)的圖3240中所提供的，這對(duì)應(yīng)2004年6月17日提交的PCT申請No.US04/19783(通過參照全部并入本文)的圖141，或者上面的表3，例如但不限于缺失任何至全部2003年9月30日提交的美國臨時(shí)申請60/507，349(通過參照全部并入本文)的圖3240中的氨基酸99-105、99-108、99-111、99-112、99-113、99-114、99-115、99-119、99-125、99-128、99-134、99-140、99-143、99-149、99-155和99-158的氨基酸99-101105-157，其對(duì)應(yīng)2004年6月17日提交的PCT申請No.US04/19783(通過參照全部并入本文)的圖1-41，對(duì)應(yīng)SEQIDNOS62-70，其包含2003年9月30日提交的美國臨時(shí)申請60/507，349(通過參照全部并入本文)的圖32-40中所描述的取代、插入或缺失，這對(duì)應(yīng)2004年6月17日提交的PCT申請No.US04/19783(通過參照全部并入本文)的圖141。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的鉸鏈核心區(qū)包括鉸鏈區(qū)N-末端的缺失以提供包括缺失最高達(dá)到但不包括Cys或者最高達(dá)到但不包括序列Cys-Pro-Xaa-Cys的鉸鏈核心區(qū)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，在本發(fā)明的鉸鏈核心模擬抗體中使用的這些鉸鏈核心序列包括氨基酸109-113或者112-113(SEQIDNO66)(IgGl)；105-110或者109-110(SEQIDNO67)(IgG2)；111-160、114-160、120_160、126-160、129-160、135-160、141-160、144-160、150-160、156-160和159-160(SEQIDNO:68)(IgG3)；或者106-110或者109-110(SEQIDNO69)(IgG4)。CH2、CH3和任選的CH4序列可以是任何適當(dāng)?shù)娜嘶蛉思嫒莸男蛄?，例?003年9月30日提交的美國臨時(shí)申請60/507，349(通過參照全部并入本文)的圖1_42中提供的，這對(duì)應(yīng)2004年6月17日提交的PCT申請No.US04/19783(通過參照全部并入本文)的圖142，以及表3，或者本領(lǐng)域中已知的，或任何它們的組合或連續(xù)序列，或它們的任何融合蛋白。可以通過本領(lǐng)域中已知的方法鑒定本發(fā)明EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體中對(duì)于功能重要的氨基酸，例如定點(diǎn)突變或丙氨酸掃描突變(例如，Ausubel，同上，Chapters8，15；Cunningham禾口Wells，Science2441081-1085(1989))。后一方法在分子中的每個(gè)殘基引入了單個(gè)丙氨酸突變。接著根據(jù)本文所述或本領(lǐng)域中已知的對(duì)所得到的突變分子測試生物學(xué)活性，例如但不限于至少一種蛋白質(zhì)相關(guān)活性。也可以通過結(jié)構(gòu)分析鑒定對(duì)于EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體結(jié)合關(guān)鍵的位點(diǎn)，例如結(jié)晶、核磁共振或光親和標(biāo)記(Smith，等人，J.Mol.Biol.224:899-904(1992)和deVos，等人，Science255:306-312(1992))。本發(fā)明的模擬抗體或特定部分或變體可以包含選自SEQIDNOS:1_30至少一種的3個(gè)或全部的至少一部分、序列或組合作為式(I)的P部分?？梢栽鰪?qiáng)或保持至少一種所列活性的非限制性變體包括但不限于任何上述多核苷酸，其進(jìn)一步包含至少一個(gè)突變，這對(duì)應(yīng)于至少一個(gè)取代、插入或缺失，其不會(huì)顯著影響所述EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑的適當(dāng)生物學(xué)活性。EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體可以任選地進(jìn)一步包含至少一種多肽的至少一個(gè)功能部分作為式(I)的P部分，SEQIDN0S:l-30之一的至少90%。EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑可以任選地進(jìn)一步包含選自SEQIDNOS:1-30之一或更多的氨基酸序列作為式(I)的P部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，P氨基酸序列或其部分與SEQIDNOS:1_30至少之一的相應(yīng)部分的相應(yīng)氨基酸序列具有大約90-100%的同一性(即:90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中的任何范圍或數(shù)值)。優(yōu)選，使用本領(lǐng)域中已知的適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)算法測定90-100%的氨基酸同一性即:90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中的任何范圍或數(shù)值)。本發(fā)明的抗體或特定部分或變體可以包含來自本發(fā)明EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)或特定部分或變體的任意數(shù)目連續(xù)氨基酸，其中該數(shù)目選自EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑中連續(xù)殘基數(shù)目的10100%的整數(shù)。任選地，該連續(xù)氨基酸的子序列長度為至少大約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或更多個(gè)氨基酸，或者其中的任何范圍或數(shù)值。進(jìn)一步，這些子序列的數(shù)目可以是選自120的任何整數(shù)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的，本發(fā)明包括至少一種本發(fā)明的生物學(xué)活性EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定的部分或變體。生物學(xué)活性的模擬抗體或特定部分或變體具有原始(非合成)內(nèi)源性或相關(guān)和已知被插入或融合蛋白或特定部分或變體的特異性活性的至少20%、30%或40%，優(yōu)選至少50%、60%或70%，最優(yōu)選至少80%、90%或95%-1000%。檢驗(yàn)和定量測量酶活性和底物特異性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及人模擬抗體和配體結(jié)合片段，正如本文所述的，其通過共價(jià)結(jié)合有機(jī)部而被修飾。這類修飾可以產(chǎn)生具有改進(jìn)的藥物動(dòng)力學(xué)特征(例如提高的體內(nèi)血清半衰期)的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或配體結(jié)合片段。有機(jī)部可以是直鏈或直鏈親水聚合物基團(tuán)、脂肪酸基團(tuán)或脂肪酸酯基團(tuán)。在特定的實(shí)施方式中，親水聚合物基團(tuán)可以具有大約800大約120，000道爾頓的分子量，并且可以是聚烷二醇(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、糖類聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯基吡咯烷酮和脂肪酸或脂肪酸酯基團(tuán)可以包含大約8大約40個(gè)碳原子。本發(fā)明經(jīng)修飾的模擬抗體和配體結(jié)合片段可以包含一種或多種有機(jī)部分，其直接或間接共價(jià)鍵合到EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體。鍵合到本發(fā)明EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或配體結(jié)合片段的的每個(gè)有機(jī)部都可以獨(dú)立地是親水聚合物基團(tuán)、脂肪酸基團(tuán)或脂肪酸酯基團(tuán)。本文所使用的，術(shù)語“脂肪酸”包括單羧酸和二羧酸。本文所使用的術(shù)語“親水聚合物基團(tuán)”是指有機(jī)聚合物，其在水中的溶解度比在辛烷中高。例如，聚賴氨酸在水中比在辛烷中的溶解度高。因此，本發(fā)明包括了通過共價(jià)結(jié)合聚賴氨酸而被修飾的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑。適于修飾本發(fā)明模擬抗體的親水聚合物可以是直鏈或支鏈的，包括例如聚烷二醇(例如PEG、單甲氧基聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、糖類(例如葡聚糖、纖維素、寡糖、多糖等)、親水氨基酸的聚合物(例如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚烷基氧化物(polyalkaneoxide)(例如聚氧化乙烯、聚氧化丙烯等)聚乙烯基吡咯烷酮。優(yōu)選修飾本發(fā)明EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑的親水聚合物作為獨(dú)立的分子實(shí)體的分子量為大約800大約150，000道爾頓。例如可以使用PEG25c，PEG5000,PEG7500,PEG9000,PEG10000,PEG12500,PEG15000和PEG2acitltl,其中下標(biāo)是以道爾頓為單位的平均分子量。親水聚合物基團(tuán)可以被1大約6個(gè)烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基團(tuán)取代?？梢允褂眠m當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽浔恢舅峄蛑舅狨セ鶊F(tuán)取代的親水聚合物。例如含有氨基的聚合物可以連接到脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸上，并且脂肪酸或脂肪酸酯上激活的羧酸(例如被N，N-羰基二咪唑激活)可以連接到聚合物上的羥基基團(tuán)。適于修飾本發(fā)明模擬抗體的脂肪酸和脂肪酸酯可以是飽和的，或者可以含有一個(gè)或者多個(gè)不飽和單元。適于修飾本發(fā)明模擬抗體的脂肪酸包括例如正十二酸酯(C12，月桂酸酯)、正十四酸酯(C14，豆蔻酸酯)、正十八酸酯(C18，硬脂酸酯)、正二十酸酯(C2tl，花生酸酯(arachidate))、正二十二酸酯(C22，山崳酸酯)、正三十酸酯(C3tl)、正四十酸酯(C4tl)、順式-9-十八碳烯酸酯(C18，油酸酯)、所有順式-Δ5，8，11，14-二十碳四烯酸酯(C2tl，花生四烯酸酯)、辛二酸、十四碳二元酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。適當(dāng)?shù)闹舅狨グǘ人岬膯熙?，其包含直鏈或直鏈低?jí)烷基。低級(jí)烷基可以包含1大約12個(gè)優(yōu)選1大約6個(gè)碳原子?？梢允褂眠m當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽浣?jīng)修飾的人模擬抗體和配體結(jié)合片段，例如通過與一種或多種修飾劑反應(yīng)。本文所使用的術(shù)語“修飾劑”是指適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)基團(tuán)(例如親水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，其包含激活基團(tuán)?！凹せ罨鶊F(tuán)”是一種化學(xué)部或功能團(tuán)，其在適當(dāng)?shù)臈l件下能夠與第二基團(tuán)反應(yīng)，進(jìn)而在修飾劑和第二化學(xué)基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵。例如胺反應(yīng)性激活基團(tuán)包括親電子基團(tuán)例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、鹵素(氯、溴、氟、碘)、N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)等?？梢耘c硫醇反應(yīng)的激活基團(tuán)包括例如馬來酰亞胺、碘乙?；⒈┐蓟?acrylolyl)、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛功能團(tuán)可以連接到含有氨基或酰胼的分子上，并且疊氮基可以與三價(jià)磷基團(tuán)反應(yīng)形成氨基磷酸酯或磷酰亞胺鍵。將激活基團(tuán)引入到分子中的適當(dāng)方法是本領(lǐng)域中已知的(參見，例如Hermanson,G.T.,BioconjugateTechniques，AcademicPressSanDiego，CA(1996))。激活基團(tuán)可以直接鍵合到有機(jī)基團(tuán)(例如親水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，或者通過接頭部，例如二價(jià)C1-C12基團(tuán)，其中一個(gè)或者更多個(gè)碳原子可以被雜原子替換例如氧、氮或硫。適當(dāng)?shù)慕宇^部包括例如四甘醇、_(CH2)3">-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2_NH_和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-0-CH-NH-?？梢岳缤ㄟ^將單-Boc-烷基二胺(例如單-Boc-乙二胺、單-Boc-二氨基己烷)與脂肪酸在存在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)時(shí)反應(yīng)以在自由胺和脂肪酸羧酸酯之間形成酰胺鍵而制備包含接頭部的修飾劑?？梢酝ㄟ^使用三氟乙酸(TFA)處理除去Boc保護(hù)基團(tuán)，以暴露伯胺，其可以被連接到所述的另一個(gè)羧酸酯上，或者可以與馬來酸酐反應(yīng)，并且所得到的產(chǎn)物進(jìn)行循環(huán)以產(chǎn)生脂肪酸的激活的馬來酰亞胺(maleimido)衍生物(參見例如Thompson，等人，WO92/16221，將其全部教導(dǎo)通過參照并入本文)?？梢酝ㄟ^將人EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或配體結(jié)合片段與修飾劑反應(yīng)而制備本發(fā)明經(jīng)修飾的模擬抗體。例如，可以以非位點(diǎn)特異性模式而將有機(jī)部鍵合到EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑，其通過采用胺反應(yīng)性修飾齊IJ，例如PEG的NHS酯。也可以通過還原EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或配體結(jié)合片段的二硫鍵(例如鏈內(nèi)二硫鍵)而制備經(jīng)修飾的人模擬抗體或配體結(jié)合片段。接著可以將經(jīng)還原的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或配體結(jié)合片段與硫醇反應(yīng)性修飾劑反應(yīng)以產(chǎn)生本發(fā)明經(jīng)修飾的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑?？梢允褂眠m當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽浣?jīng)修飾的人模擬抗體和配體結(jié)合片段，其含有鍵合到本發(fā)明EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的有機(jī)部，例如反向蛋白質(zhì)水解(Fisch等人，BioconjugateChem.，3147-153(1992)；Werlen等人，BioconjugateChem.，5:411-417(1994)；Kumaran等人，ProteinSci.6(10)2233-2241(1997)；Itoh等人，Bioorg.Chem.,24(1):59_68(1996)；Capellas等人，Biotechnol.Bioeng.，56(4):456_463(1997))以及描述在Hermanson，G.T.，BioconjugateTechniques,AcademicPressSanDiego,CA(1996)中的方法。EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑組合物本發(fā)明還提供了至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物，其包含至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種或更多本文所述和/或本領(lǐng)域中已知的模擬抗體或它們的特定部分或變體，其是以非天然組合物、混合物或形式提供的。根據(jù)本領(lǐng)域中已知的或本文所述的，這些組合物的百分比是以重量、體積、濃度、摩爾或重量摩爾濃度、作為液體或干溶液、混合物、懸浮液、乳化液或膠體的。根據(jù)本領(lǐng)域中已知的或本文所述的，這些組合物可以含有0.00001-99.9999%按照重量、體積、濃度、摩爾或重量摩爾濃度作為液體、氣體或干溶液、混合物、懸浮液或膠體，以及其中的任何范圍或數(shù)值，例如但不限于0.00001,0.00003,0.00005,0.00009,0.0001、0.0003,0.0005,0.0009,0.001,0.003,0.005,0.009,0.01,0.02,0.03,0.05,0.09,0.1、0.2、0·3、0·4.、0·5、0·6、0·7、0·8、0.9、1.0、1.Ul.2、1·3、1·4、1·5、1·6、1·7、1·8、1·9、2.0、2·1>2·2>2·3>2.4>2.5、2·6>2·7、2·8、2·9>3·0、3·1、3·2、3·3、3·4、3·5、3·6>3·7、3·8、3·9>4.0、4·3、4·5、4·6、4·7、4·8、4·9、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99·1,99.2,99.3,99.4,99.5,99.6,99.7,99.8、99·9%。因此，本發(fā)明的這些組合物包括但不限于0.00001-100mg/ml和/或0.00001-100mg/g。任選地，該組合物還可以包含有效量的至少一種化合物或蛋白質(zhì)，其選自至少一種抗感染藥物、心血管(CV)系統(tǒng)藥物、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)藥物、自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、流體或電解質(zhì)平衡的藥物、血液學(xué)藥物、抗癌藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、眼用藥物、耳用藥物或鼻用藥物、局部用藥物、營養(yǎng)性藥物等。這些藥物是本領(lǐng)域中公知的，其中包括制劑、適應(yīng)癥、劑量給藥和給藥均在本文中被提供(參見例如，Nursing2001HandbookofDrugs,第21版，SpringhouseCorp.,Springhouse,ΡΑ,2001；HealthProfessional'sDrugGuide2001,ed.,Shannon,Wilson,Stang,Prentice-Hall,Inc,UpperSaddleRiver,NJ；PharmcotherapyHandbook,Wells等人，ed.，Appleton&Lange，Stamford,CT，均通過參照全部并入本文)。本發(fā)明的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物還可以包含至少一種任何適當(dāng)?shù)妮o助物，例如但不限于稀釋劑、粘結(jié)劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑等。優(yōu)選藥物上可以接受的輔助物。制備這些無菌溶液的非限制性例子和方法是本領(lǐng)域中公知的，例如但不限于Germaro，Ed.，Remington'sPharmaceuticalSciences，第18版，MackPublishingCo.(Easton，PA)1990。可以常規(guī)地選擇藥物上可以接受的載體，其適于本領(lǐng)域中公知的本文所述EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑組合物的給藥模式、溶解度和/或穩(wěn)定性?？梢杂糜诒景l(fā)明的藥物賦形劑和添加劑包括但不限于蛋白質(zhì)、肽和糖類(例如糖包括單糖、雙糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖例如醛醇、醛糖酸、酯化糖等；多糖或糖聚合物)，其可以分別提供，或者組合提供，包括單獨(dú)的或以1-99.99重量或體積％的組合。示范性的蛋白質(zhì)賦形劑包括血清白蛋白例如人血清白蛋白(HSA)、重組人血清白蛋白(rHA)、凝膠、酪蛋白等。也可以發(fā)揮緩沖能力的代表性氨基酸/EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜堿、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯等。優(yōu)選的氨基酸是甘氨酸。適于用于本發(fā)明的糖類賦形劑包括例如單糖例如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；雙糖例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖例如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及醛醇例如甘露醇、木糖醇、乳糖春、山梨醇(葡萄糖醇)、肌醇等。用于本發(fā)明的優(yōu)選糖類賦形劑是甘露醇、海藻糖和棉子糖。EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑組合物還可以含有緩沖液或pH調(diào)節(jié)劑；通常，緩沖液是從有機(jī)酸或堿制備的鹽。代表性的緩沖液包括有機(jī)酸鹽例如檸檬酸、抗壞血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、醋酸或鄰苯二甲酸的鹽；Tris、三羧甲基氨甲烷鹽酸鹽或磷酸鹽緩沖液。用于本發(fā)明的優(yōu)選緩沖液是有機(jī)酸鹽例如檸檬酸鹽。此外，本發(fā)明的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物可以包括聚合物賦形劑/添加劑例如聚乙烯基吡咯烷酮、水溶性聚蔗糖(ficoll)(聚合物糖)、葡萄糖結(jié)合劑(dextrate)(例如，環(huán)糊精例如2-羥丙基-β-環(huán)糊精)、聚乙二醇、調(diào)味劑、抗菌劑、甜味劑、抗氧化劑、抗靜電劑、表面活性劑(例如聚山梨醇酯如“吐溫20”和“吐溫80”)、脂類(例如磷酸脂、脂肪酸)、類固醇(例如膽固醇)和螯合劑(例如，EDTA)。適用于本發(fā)明EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑組合物的這些和其他已知藥物賦形劑和/或添加劑是本領(lǐng)域中已知的，例如，在“Remington=TheScience&PracticeofPharmacy",19thed.,Williams&Williams,(1995)中以及在“Physician’sDeskReference",52nded.，MedicalEconomics,Montvale,NJ(1998)中列舉的,其公開內(nèi)容被通過參照全部并入本文。優(yōu)選的載體或賦形劑材料是糖類(例如糖和醛醇)和緩沖液(例如檸檬酸鹽)或聚合試劑。制劑如上所述，本發(fā)明提供了穩(wěn)定制劑，其優(yōu)選包含適當(dāng)?shù)木彌_液以及鹽水或選擇的鹽，以及任選地儲(chǔ)存的溶液和含有防腐劑的制劑，以及適用于藥物或獸醫(yī)用途的多用途儲(chǔ)存的制劑，其在藥物上可以接受的制劑中包含至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體。儲(chǔ)存的制劑含有至少一種已知的防腐劑或任選地選自至少一種苯酚、間甲酚、對(duì)甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苯甲醇、苯汞基亞硝酸鹽、苯氧乙醇、甲醛、氯代丁醇、氯化鎂(例如六水合物)、尼泊金烷基酯類(alkylparaben)(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、氯化苯甲烴銨、氯化芐乙氧銨、脫氫醋酸鈉和乙基汞硫代水楊酸鈉或者其在水稀釋液中的混合物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何適當(dāng)?shù)臐舛然蚧旌衔?，例?.001-5%，或其中的任何范圍或數(shù)值，例如但不限于0.001,0.003,0.005,0.009,0.01,0.02,0.03,0.05、0.09、0·1、0·2、0·3、0·4·、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1·0、1·1、1·2、1·3、1·4、1·5、1·6、1·7、1.8、1·9、2·0、2·1、2·2、2·3、2·4、2·5、2·6、2·7、2·8、2·9、3·0、3·1、3·2、3·3、3·4、3·5、3·6、3.7,3.8,3.9,4.0,4.3,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9或其中的任何范圍或數(shù)值。非限制性例子包括沒有防腐劑、0.1-2%間甲酚(例如0·2、0·3、0·4、0·5、0·9、1·0%)、0·1-3%苯甲醇(例如0.5、0.9、1.1.、1.5、1.9、2.0、2.5%)、0.0010.5%乙基汞硫代水楊酸鈉(例如0.005、0.01)、0·001-2.0%苯酚例如0.05,0.25,0.28,0.5,0.9,1.0%)、0·0005-1.0%烷基尼泊金酯類(alkylparaben)(例如0.00075,0.0009,0.001,0.002,0.005,0.0075,0.009,0.01，0.020.050.0750.09,0.1,0.2,0.3,0.5,0.75,0.9,1.0%)等。如上所述.發(fā)明提供一種制品，其包含包裝材料和至少一個(gè)小瓶，小瓶中包含至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的溶液以及指定的緩沖液和/或防腐劑，任選地在水稀釋液中，其中所述包裝材料包括標(biāo)簽，其表明了這類溶液可以被保持1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72個(gè)小時(shí)或更長。本發(fā)明還提供了一種制品，其包含包裝材料、第一小瓶和第二小瓶，其中第一小瓶含有凍干的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體，第二小瓶含有指定的緩沖液和/或防腐劑的水稀釋液，其中所述包裝材料包括標(biāo)簽，其指導(dǎo)患者在水稀釋液中重建至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體以形成可以被保持24小時(shí)以上或更長時(shí)間的溶液。如本文所述或本領(lǐng)域中已知的，可以通過重組手段制備本發(fā)明所使用的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體，包括從哺乳動(dòng)物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因制劑或可以從其他生物來源純化。在本發(fā)明的產(chǎn)品中至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的量的范圍包括如果在濕/干系統(tǒng)中在重建之后產(chǎn)生了大約1.0μg/ml大約1000mg/ml濃度的量，盡管也可以使用更低或更高的濃度，并且依賴期望的遞送載體，例如溶液制劑會(huì)與透皮貼劑、肺部、跨粘膜或滲透性或微型泵方法不同。優(yōu)選，水稀釋液任選地還包含藥物上可以接受的防腐劑。優(yōu)選的防腐劑包括選自苯酚、間甲酚、對(duì)甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苯甲醇、尼泊金烷基酯類(alkylparaben)(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、氯化苯甲烴銨、氯化芐乙氧銨、脫氫醋酸鈉和乙基汞硫代水楊酸鈉活或他們的混合物的那些。在制劑中所使用的防腐劑的濃度是足以產(chǎn)生抗菌效果的濃度。這些濃度依賴于所選擇的防腐劑并且容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員所確定。其他的賦形劑例如等滲劑、緩沖液、抗氧化劑、防腐劑增強(qiáng)劑可以任選地并優(yōu)選地被加到稀釋液中。通常以已知的濃度使用等滲劑例如甘油。生理學(xué)忍耐的緩沖液優(yōu)選地被加入以提供改善的PH控制。制劑可以覆蓋各類的pH，例如大約pH4到大約pH10，并優(yōu)選在大約PH5到大約pH9的范圍內(nèi)，最優(yōu)選的范圍是大約6.0到大約8.0的范圍。優(yōu)選地本的制劑具有大約6.8和大約7.8之間的pH。優(yōu)選的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液，最優(yōu)選磷酸鈉，特別是磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。其他的添加劑如藥物上可以接受的增溶劑如吐溫20(聚氧化乙烯20)單月桂酸山梨聚糖)、吐溫40(聚氧乙烯(20)單棕櫚酸山梨聚糖)、吐溫80(聚氧乙烯(20)單油酸山梨聚糖)、普盧蘭尼克F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇或者非離子型表面活性劑例如吐溫20或者80或者泊洛沙姆184或者188、Pluronicpolyls、其他的嵌段共聚物)和螯合劑例如EDTA和EGTA可以任選地被加入到制劑或組合物中以減少聚集?？梢酝ㄟ^一種方法制備本發(fā)明的制劑，其包括將至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體與選自石炭酸、間甲酚、對(duì)甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苯甲醇、烷基尼泊金酯類(甲基、乙基、丙基、丁基等等)、氯化苯甲烴銨、氯化芐乙氧銨、脫氫醋酸鈉和乙基汞硫代水楊酸鈉或者它們混合物的防腐劑在水稀釋液中混合。使用傳統(tǒng)的溶解和混合程序進(jìn)行將至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體與防腐劑在水稀釋劑中混合。為了制備適當(dāng)?shù)闹苿?，例如將緩沖溶液中經(jīng)測量量的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體與緩沖液中期望的防腐劑混合，其量足以提供期望濃度的蛋白質(zhì)和防腐劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解該方法的變化。例如，組分加入的順序，是否使用其他的添加劑、制備制劑的溫度都是可以根據(jù)所使用的濃度和給藥手段進(jìn)行優(yōu)化的因素?？梢詫⑺蟊Ｗo(hù)的制劑作為清澈的溶液或者作為兩個(gè)小瓶提供給患者，其中在所述兩個(gè)小瓶之一含有凍干的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體，其被第二小瓶重建，所述第二小瓶中含有水、在水稀釋劑中的防腐劑和/或賦形劑，優(yōu)選磷酸鹽緩沖液和/或鹽水和所選擇的鹽。單一溶液或者需要重建的兩個(gè)小瓶都可以被重復(fù)使用多次，并且能夠滿足單次或多次治療患者，因此能夠提供比目前可利用的便利的治療方案。本發(fā)明要求保護(hù)的制品可以用于經(jīng)過一段時(shí)間給藥，從立即到24小時(shí)或更長。因此，本發(fā)明要求保護(hù)的制品提供了對(duì)患者的顯著優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的制劑可以任選地被保存在大約2大約40°C的溫度下，并長時(shí)間保持蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，因此包裝標(biāo)簽標(biāo)示溶液可以被保持和/或使用6、12、18、24、36、48、72或96小時(shí)或更長。如果使用儲(chǔ)存的稀釋劑，則標(biāo)簽可以包括使用最高達(dá)到至少112個(gè)月、半年、一年半和/或兩年的至少之一。本發(fā)明中至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的溶液可以通過一種方法制備，該方法包括在水稀釋劑中將至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體進(jìn)行混合。使用傳統(tǒng)的溶解和混合程序進(jìn)行混合。為了制備適當(dāng)?shù)南♂寗?，例如將水或緩沖液中的測量量的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體以足以提供期望濃度的蛋白質(zhì)和任選地防腐劑或緩沖液的量進(jìn)行組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解該方法的變化。例如，組分加入的順序，是否使用其他的添加劑、制備制劑的溫度都是可以根據(jù)所使用的濃度和給藥手段進(jìn)行優(yōu)化的因素。可以將所要求保護(hù)的制劑作為清澈的溶液或者作為兩個(gè)小瓶提供給患者，其中在所述兩個(gè)小瓶之一含有凍干的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體，其被第二小瓶重建，所述第二小瓶中含有水稀釋劑。單一溶液或者需要重建的兩個(gè)小瓶都可以被重復(fù)使用多次，并且能夠滿足單次或多次治療患者，因此能夠提供比目前可利用的便利的治療方案。可以通過提供給藥店、門診部或其他這類機(jī)構(gòu)和機(jī)關(guān)而間接地為患者提供所要求保護(hù)的產(chǎn)品，作為清澈的溶液或兩個(gè)小瓶，其中在所述兩個(gè)小瓶之一含有凍干的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體，其被第二小瓶重建，所述第二小瓶中含有水稀釋劑。在這種情況中，清澈的溶液體積最高可以達(dá)到1升，提供了大儲(chǔ)藏器(reservoir)，從該大儲(chǔ)藏器可以一次或者多次取出較小部分的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體溶液用于轉(zhuǎn)移到較小的小瓶中，并由藥店或門診部提供給他們的消費(fèi)者和/或患者。包括這些單個(gè)小瓶系統(tǒng)的公認(rèn)裝置包括單或雙小瓶筆式注射器(pen-injector)裝置，用于遞送用于本發(fā)明的藥物溶液，并且任選地進(jìn)一步包括雙小瓶系統(tǒng)(dualvialsystem)包括那些筆式注射器系統(tǒng)用于在筒中重建凍干的藥物以遞送藥物溶液，這正如本領(lǐng)域中公知的，例如在美國專利No.6，203，530、5，026，349、5，567，160、5，954，738、5，879，327,5，599，302,6，015，438,6，461，333,6，517，517,6，077，247,6，099，504,6，428，528,6，387，078,5，868，711,5，960，797,5，176，643,5，271，744,5，405，362,5，451，210,5，137，516,5，176，643,5，300，030,5，295，965,5，425，715,5，478，316,5，575，777,5,599，309,5,681，291,5,709，662,5,779，677,5,913，843,5,843，036、5，957，897,6，428，528,6，086，562,6，099，503,6，221，044,6，270，479,6，258，068,6，391，003,6，280，421,6，045，534,6，371，939,6，090，078,5，267，963,5，487，732,5，425，715,6，575，939,6，565，540,6，159，181,6，179，812,6，544，234,6，572，581,6，676，630,6，083，197,6，203，530,6，270，479,6，371，939,5，575，777,6，090，078,6，743，199,6，589，210,6，689，093,6，783，509,6，645，170,6，641，554,6，796，967,6，645，181,6，641，565,6，575，939,6，569，115,6，673，049,6，641，560,6，569，124,6，699，220,6，638，256,6，607，508,6，607，510,6，776，777,6，767，336,6，595，962,6，740，062,6,565，553,6,746，429,6,569，123,6,595，957,6,770，056中所公開的，均被通過參照并入本文。本發(fā)明要求保護(hù)的產(chǎn)品包括包裝材料。除了管理機(jī)構(gòu)所要求的信息外，包裝材料還提供了產(chǎn)品可以使用的情況。本發(fā)明的包裝材料為患者提供了在水稀釋液中重建至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的指導(dǎo)，對(duì)于雙小瓶、濕/干產(chǎn)品，以形成溶液，并使用該溶液經(jīng)過224小時(shí)或更長的時(shí)間。對(duì)于單小瓶，溶液產(chǎn)品，標(biāo)簽表明這些溶液可以使用經(jīng)過2-24小時(shí)或更長時(shí)間。本本發(fā)明要求保護(hù)的產(chǎn)品可以用于人類藥物產(chǎn)品應(yīng)用。可以通過一種方法制備本發(fā)明的知己，該方法包括將至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體和所選擇的緩沖液優(yōu)選含有鹽水或所選擇鹽的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行混合。使用傳統(tǒng)的溶解和混合程序進(jìn)行在水稀釋劑中混合至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體和緩沖液。為了制備適當(dāng)?shù)闹苿?，例如將水或緩沖溶液中經(jīng)測量量的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體與水中期望的緩沖劑混合，其量足以提供期望濃度的蛋白質(zhì)和緩沖液。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解該方法的變化。例如，組分加入的順序，是否使用其他的添加劑、制備制劑的溫度都是可以根據(jù)所使用的濃度和給藥手段進(jìn)行優(yōu)化的因素?？梢詫⒁蟊Ｗo(hù)的穩(wěn)定或儲(chǔ)藏的制劑提供給患者，作為清澈的溶液或者作為兩個(gè)小瓶提供給患者，其中在所述兩個(gè)小瓶之一含有凍干的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體，其被第二小瓶重建，所述第二小瓶中含有水、在水稀釋劑中的防腐劑和/或賦形劑。單一溶液或者需要重建的兩個(gè)小瓶都可以被重復(fù)使用多次，并且能夠滿足單次或多次治療患者，因此能夠提供比目前可利用的便利的治療方案。如本文所述，在穩(wěn)定或儲(chǔ)藏的知己或溶液中的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體可以根據(jù)本發(fā)明通過各種遞送方法為患者給藥，包括SC或IM注射；透皮、肺部、跨粘膜、植入、滲透壓泵、藥筒(cartridge)、微型泵或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的以及本領(lǐng)域公知的手段。治療應(yīng)用對(duì)于模擬抗體，本發(fā)明還提供了用于在細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者中調(diào)節(jié)或治療葡萄糖耐受不良相關(guān)紊亂和/或腎病相關(guān)貧血的方法。發(fā)明還提供了用于在細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者中調(diào)節(jié)或治療葡萄糖耐受不良相關(guān)紊亂和/或腎病相關(guān)貧血或血細(xì)胞相關(guān)病癥的方法，其中所述貧血或血細(xì)胞相關(guān)病癥與至少一種包括但不限于下列的相關(guān)至少一種免疫相關(guān)疾病、心血管疾病、感染、惡性腫瘤和/或神經(jīng)性疾病。這類方法可以任選地包括為需要這類調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者給藥至少一種組合物或藥物組合物，其包含至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體。本發(fā)明的所有方法都可以包括為需要這類調(diào)節(jié)、處理或治療的細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物或患者給藥有效量的組合物或藥物組合物，其包含至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體。這類方法可以任選地還包括共給藥或聯(lián)合治療用于治療這些免疫疾病，其中給藥所述至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑、它們特定的部分或變體還包括在之前、同時(shí)和/或之后給藥至少一種選自至少一種TNF拮抗劑(例如但不限于TNF抗體或片段、可溶性TNF受體或片段、抗癌蛋白質(zhì)、其融合蛋白或小分子TNF拮抗劑)、抗風(fēng)濕藥、肌肉松弛藥、麻醉藥、非類固醇抗炎藥藥(NSAID)、止痛藥、麻醉劑、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉藥、神經(jīng)肌肉阻斷劑、抗菌劑(例如氨基糖苷類、抗真菌齊U、抗寄生物藥、、抗病毒劑、卡巴盤尼姆(carbapenem)、頭孢菌素、flurorquinolone、大環(huán)內(nèi)酯、青霉素、磺胺藥、四環(huán)素、其他抗菌劑)、抗銀屑病藥、皮質(zhì)類固醇、促蛋白合成甾類、糖尿病相關(guān)藥物、礦物、營養(yǎng)性甲狀腺藥物、維生素、鈣相關(guān)激素、止瀉藥、止咳藥、止吐藥、抗?jié)兯帯⒕彏a藥、抗凝血?jiǎng)?、促紅細(xì)胞生成素(erythropieitin)例如印oetina)非格司亭(filgrastim)例如G—CSF，Neupogen)、沙格司亭(sargramostim)(GM-CSF,Leukine)、免疫接種、免疫球蛋白、免疫抑制劑(例如basiliximab、cyclosporine、daclizumab)、生長激素、激素替換藥、雌激素受體調(diào)節(jié)劑、散瞳藥、睫狀肌麻痹藥、烷化劑、抗代謝物、有絲分裂抑制劑、防輻射藥物、抗抑郁劑、抗躁狂藥、安定藥、抗焦慮藥、安眠劑、擬交感神經(jīng)藥、興奮劑、多奈哌齊(Don印ezil)、塔克林(tacrine)、哮喘藥物、β激動(dòng)劑、吸入類固醇、白細(xì)胞三烯抑制劑、甲基黃嘌呤、cromolyn、腎上腺素或類似物鏈球菌DNA酶α(pulmozyme),細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑。適當(dāng)?shù)呐渌幨潜绢I(lǐng)域中公知的。參見例如Wells等人，eds.,PharmacotherapyHandbook,第2版，AppletonandLange,Stamford,CT(2000)；PDRPharmacopoeia,TarasconPocketPharmacopoeia2000,DeluxeEdition,TarasconPublishing,LomaLinda,CA(2000)，均被通過參照全部并入本文。本文所使用的“腫瘤壞死因子抗體”、“TNF抗體”、“TNFα抗體”或片段等體外、原位和/或優(yōu)選體內(nèi)降低、阻斷、抑制、取消(abrogate)和/或干擾TNFα活性。例如，本發(fā)明適當(dāng)?shù)腡NF人抗體可以結(jié)合TNF并包括抗TNF抗體、其抗原結(jié)合片段、其特異性結(jié)合TNFα的特定突變體或結(jié)構(gòu)域。適當(dāng)?shù)腡NF抗體片段還降低、阻斷、取消(abrogate)、干擾、防止和/或抑制TNFRNA,DNA或蛋白質(zhì)合成、TNF釋放、TNF受體信號(hào)傳遞、膜TNF切割、TNF活性、TNF產(chǎn)生和/或合成。典型地，治療病例狀態(tài)是通過給藥有效量或劑量的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑組合物而實(shí)現(xiàn)的，其總共平均含有每劑量至少大約0.001500毫克的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體/千克患者，優(yōu)選每單次給藥或多次給藥至少大約0.01100毫克EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體/千克患者，這依賴于組合物中所含有的具體活性?；蛘撸行У难鍧舛瓤梢园繂未谓o藥或多次給藥0.001-5000μg/ml血清濃度。適當(dāng)?shù)挠昧渴菆?zhí)業(yè)醫(yī)生已知的，并且當(dāng)然依賴于特定的疾病狀態(tài)、被給藥的組合物的具體活性以及經(jīng)歷治療的特定患者。在某些情況中，為了達(dá)到期望的治療量，可能必須提供重復(fù)給藥，即重復(fù)的單獨(dú)給藥特定的監(jiān)控或測量的劑量，其中重復(fù)單次給藥知道達(dá)到期望的每日劑量或效果。優(yōu)選的劑量任選地包括0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,009,0.1、0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29，和/或30mg/kg/給藥或任何其中的范圍或數(shù)值，或者以達(dá)到每單次或多次給藥血清濃度為0.1,0.5,0.9,1.0,1.1、1.2,1.5,1.9,2.0,2.5、2.9、3·0、3·5、3·9、4·0、4·5、4·9、5·0、5·5、5·9、6·0、6·5、6·9、7·0、7·5、7·9、8·0、8·5、8·9、9.0,9.5,9.9、10、10.5,10.9、11、11.5、11.9,20,12.5,12.9,13.0,13.5,13.9,14.0,14.5、4·9、5·0、5·5·、5·9、6·0、6·5、6·9、7·0、7·5、7·9、8·0、8·5、8·9、9·0、9·5、9·9、10、10·5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5,12.9,13.0,13.5,13.9、14、14.5、15、15.5,15.9、16、16.5、16.9、17、17.5,17.9、18、18.5,18.9、19、19.5,19.9,20,20.5,20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或5000μg/ml血清濃度，或其中的任何范圍、數(shù)值或部分?；蛘撸o藥的劑量可以根據(jù)已知的因素改變，例如特定藥物的藥物動(dòng)力學(xué)特征、其給藥路線；受體的年齡、健康和體重；癥狀的性質(zhì)和程度、同時(shí)治療的類型、治療的頻率以及期望的效果。通常，活性成分的劑量可以為大約0.1100毫克/千克體重。通常，以持續(xù)釋放形式的0.150，優(yōu)選0.110毫克/千克體重能有效獲得期望結(jié)果。作為非限制性例子，治療人或動(dòng)物可以被提供為一次或周期給藥至少一種本發(fā)明的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體0.01100mg/kg例如0.5,0.9,1.0,1.1、1·5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg/天，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39.或40天之一，或或者，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周之一，或者任何它們的組合，其使用單次、灌輸或重復(fù)給藥。適于內(nèi)部給藥的劑型(組合物)通常每單位或容器含有大約0.0001毫克大約500毫克的活性成分。在這些藥物組合物中，活性成分將通常以基于組合物總重量的大約0.5-95重量％的量存在。對(duì)于腸胃外給藥，可以將EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體配置為溶液、懸浮液、乳液或凍干粉末，其與藥物上可以接受的腸胃外載體結(jié)合或分別提供。這些載體的例子是水、鹽水、林格溶液(Ringer'ssolution)、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。還可以使用脂質(zhì)體和非水載體例如不揮發(fā)性油。載體或凍干粉末可以含有維持等滲性(例如氯化鈉、甘露醇)和化學(xué)穩(wěn)定性(例如緩沖液和防腐劑)的添加齊U。通過已知的或適當(dāng)?shù)募夹g(shù)對(duì)制劑進(jìn)行滅菌。適當(dāng)?shù)乃幬镙d體被描述在最近版本的Remington'sPharmaceuticalSciences,A.Osol中，這是該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)。治療給藥根據(jù)本發(fā)明可以使用許多已知的和先進(jìn)的模式用于給藥藥物上有效量的本發(fā)明的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體。盡管在下面的描述中采用肺部給藥，但根據(jù)本發(fā)明也可以使用其他給藥模式得到適當(dāng)?shù)慕Y(jié)果?？梢栽谳d體中遞送本發(fā)明的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑，作為溶液、乳液、交替或懸浮液或作為粉末，其使用任何適于通過吸入或其他本文所描述或本領(lǐng)域已知的給藥的裝置和方法。腸胃外制劑和給藥用于腸胃外給藥的制劑可以含有作為常用賦形劑的無菌水或鹽水、聚烷二醇例如聚乙二醇、植物來源的油，氫化萘等?？梢酝ㄟ^使用適當(dāng)?shù)娜榛瘎┗蛟鰸駝┖蛻腋└鶕?jù)已知的方法制備用于注射的水懸浮液或油懸浮液。用于注射的試劑可以是無毒、非口服給藥的稀釋劑例如水溶液或無菌可注射溶液或溶劑中的懸浮液。作為可以使用的載體或溶劑，可以使用水、林格溶液、等滲鹽水等；作為常用的溶劑或懸浮溶劑，可以使用無菌不揮發(fā)油。對(duì)于這些目的，可以使用任何類型的不揮發(fā)油和脂肪酸，包括天然或合成的或半合成脂肪油或脂肪酸；天然或合成的或半合成單_或二-或三-甘油酯。腸胃外給藥是本領(lǐng)域中已知的，并且包括但不限于注射、氣壓無針注射裝置的手段如在美國專利No.5，851，198中所描述的，以及激光穿孔裝置如在美國專利No.5，839，446中所描述的，通過參照全部并入本文。另外的遞送本發(fā)明進(jìn)一步涉及給藥至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體，其通過腸胃外、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、快速濃注、陰道、直腸、經(jīng)頰、舌下、鼻內(nèi)或透皮手段。EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物可以被制備為用于腸胃外(皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi))給藥，特別是以液體溶液或懸浮液的形式；用于陰道或直腸給藥中，特別是以半固體形式例如霜?jiǎng)┖退▌?；用于口腔或舌下給藥，特別是以片劑或膠囊的形式；或鼻內(nèi)，特別是以粉末、鼻滴劑或氣溶膠或某些試劑的形式；或透皮給藥，特別是以凝膠、藥膏、洗劑、懸浮液或貼劑遞送系統(tǒng)，其具有化學(xué)增強(qiáng)劑例如二甲基亞砜以修飾皮膚結(jié)構(gòu)或者提高透皮貼片中的藥物濃度(Jimginger，等人In"DrugPermeationEnhancement“；Hsieh,D.S.,Eds.,pp.59-90(MarcelDekker,Inc.NewYork1994，通過參照全部并入本文)，或者具有氧化劑其能夠?qū)⒑械鞍踪|(zhì)和肽的制劑應(yīng)用到皮膚上(W098/53847)，或者應(yīng)用電場以形成暫時(shí)的運(yùn)輸途徑例如電穿孔，或者提高帶電藥物通過皮膚的移動(dòng)性例如離子電滲療法，或者應(yīng)用超聲波例如超聲療法(sonophoresis)(美國專利Nos.4，309,989和4，767，402)(通過參照將上述公開和專利全部并入本文)。肺部/經(jīng)鼻給藥為了肺部給藥，優(yōu)選至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物被以有效達(dá)到肺部或鼻竇的粒度進(jìn)行遞送。根據(jù)本發(fā)明，可以通過任何本領(lǐng)域中已知的吸入或經(jīng)鼻裝置遞送至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體，用于通過吸入給藥治療劑。能夠在患者鼻腔或肺胞中沉積煙霧化制劑的裝置包括計(jì)量式吸入器(metereddoseinhaler)、噴霧器、干粉發(fā)生器、噴射器(sprayer)等。適于引導(dǎo)肺部或經(jīng)鼻給藥EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的其他裝置也是本領(lǐng)域中已知的。所有這些裝置可以使用適于以氣溶膠給藥以分配EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的制劑。這些氣溶膠可以包括溶液(水溶液和非水溶液)或固體顆粒。計(jì)量式吸入器如Ventolin計(jì)量式吸入器，通常使用推進(jìn)氣體并在吸入的過程中需要驅(qū)動(dòng)(參見例如W094/16970，WO98/35888)。干粉吸入器如InhaleTherapeutics銷售的裝置Turbuhaler(Astra)、R0tahaler(Glaxo),Diskus(Glaxo)、Spiros吸入器(Dura)，以及Spinhaler粉末吸入器(Fisons)，使用呼吸驅(qū)動(dòng)混合的粉末(US4668218Astra,EP237507Astra,WO97/25086Glaxo,W094/08552Dura,US5458135Inhale,WO94/06498Fisons，通過參照全部并入本文)。噴霧器如AERxAradigm、Ultravent噴霧器(Mallinckrodt)禾口AcornΠ噴霧器(MarquestMedicalProducts)(US5404871Aradigm，WO97/22376)(通過參照將上述參考文獻(xiàn)全部并入本文)，從溶液產(chǎn)生氣溶膠，而計(jì)量式吸入器、干粉吸入器等則產(chǎn)生小顆粒氣溶膠。商業(yè)上可以利用的吸入裝置的具體例子被認(rèn)為是適于實(shí)施本發(fā)明的具體裝置的代表，并且不被認(rèn)為限制本發(fā)明的范圍。優(yōu)選，含有至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的組合物是通過干粉吸入器或噴射器而遞送的。用于給藥本發(fā)明至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的吸入裝置存在許多期望的特征。例如，有利地，通過吸入裝置遞送是可靠的、可再生的和精確的。任選地，吸入裝置可以遞送小的干顆粒例如低于大約10μm，優(yōu)選大約1-5μm，達(dá)到良好的適合呼吸。作為噴劑給藥EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物可以通過將至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的懸浮液或溶液施壓在壓力下通過噴嘴而產(chǎn)生包括EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)的噴劑。可以對(duì)噴嘴尺寸和形狀以及所施加的壓力和液體供給速度進(jìn)行選擇以達(dá)到期望的輸出和粒度。例如可以通過電場結(jié)合毛細(xì)管或噴嘴供給產(chǎn)生電噴射。有利地，通過噴射器產(chǎn)生至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)的顆粒，其粒度低于大約10μm,優(yōu)選在大約1μm大約5μm的范圍內(nèi)，最優(yōu)選大約2μm大約3μm。適于利用噴射器使用的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)的制劑通常包括在水溶液中的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)，其濃度為每毫升溶液大約Img大約20mg至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)。制劑可以包含試劑例如賦形劑、緩沖液、等滲劑、防腐劑、表面活性劑，以及優(yōu)選鋅。該制劑還可以包含賦形劑或者用于穩(wěn)定EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)的試劑，例如緩沖液、還原劑、本體蛋白質(zhì)(bulkprotein)或糖類。可以用于配制EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物的本體蛋白質(zhì)包括白蛋白、精蛋白等。可以用于配制EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)的典型糖類包括蔗糖、甘露糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)制劑還可以包括表面活性劑，其能夠減低或防止由于形成氣溶膠中溶液霧化所造成的表面誘導(dǎo)的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)的聚集?？梢圆捎酶鞣N傳統(tǒng)的表面活性劑例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。量通常在制劑的0.00114重量％之間。對(duì)于本發(fā)明的目的，特別優(yōu)選的表面活性劑是聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯、山梨聚糖80、山梨聚糖20等。在制劑中還可以包括其他本領(lǐng)域中已知的配制蛋白質(zhì)的其他試劑例如模擬抗體或特定部分或變體。通過噴霧器給藥EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物可以通過噴霧器給藥EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)，例如噴氣式噴霧器或超聲噴霧器。典型地，在噴氣式噴霧器中，壓縮空氣源被用于通過孔形成高速氣流。當(dāng)氣體膨脹超過噴嘴時(shí)，形成低壓區(qū)，這拉動(dòng)EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)溶液通過與液體儲(chǔ)藏器連接的毛細(xì)管。來自毛細(xì)管的液體流在其離開管時(shí)，被剪切成不穩(wěn)定的細(xì)流和液滴，這形成了氣溶膠?？梢圆捎枚喾N結(jié)構(gòu)、流速和隔板類型以從給定的噴霧器達(dá)到期望的性能特征。在超聲噴霧器中，使用高頻電能形成震動(dòng)、機(jī)械能，典型地采用壓電式換能器。將該能量直接或通過連接流體傳遞給EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)制劑，這形成了含有EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)的氣溶膠。有利地，通過氣霧劑遞送的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)的粒度低于大約10μm,優(yōu)選在大約1μm大約5μm的范圍內(nèi)，最優(yōu)選大約2μm大約3μm。適于使用噴霧器(噴氣式或超聲)的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的制劑典型地包括水溶液中的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)，其濃度為每毫升溶液大約Img大約20mg至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)。制劑可以包含試劑例如賦形劑、緩沖液、等滲劑、防腐劑、表面活性劑，以及優(yōu)選鋅。該制劑還可以包含賦形劑或者用于穩(wěn)定EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)的試劑，例如緩沖液、還原劑、本體蛋白質(zhì)(bulkprotein)或糖類。可以用于配制EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物的本體蛋白質(zhì)包括白蛋白、精蛋白等?？梢杂糜谂渲艵PO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)的典型糖類包括蔗糖、甘露糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)制劑還可以包括表面活性劑，其能夠減低或防止由于形成氣溶膠中溶液霧化所造成的表面誘導(dǎo)的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)的聚集?？梢圆捎酶鞣N傳統(tǒng)的表面活性劑例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。量通常在制劑的0.0014重量％之間。對(duì)于本發(fā)明的目的，特別優(yōu)選的表面活性劑是聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯、山梨聚糖80、山梨聚糖20等。在制劑中還可以包括其他本領(lǐng)域中已知的配制蛋白質(zhì)的其他試劑例如模擬抗體或特定部分或變體。通過計(jì)量式吸入器給藥EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物在計(jì)量式吸入器(MDI)中，在筒中含有作為混合物的推進(jìn)劑、至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體和任何賦形劑或其他添加劑包括液化的壓縮氣體。驅(qū)動(dòng)計(jì)量閥釋放作為氣溶膠的混合物，優(yōu)選含有粒度在低于大約10μm，優(yōu)選在大約1μm大約5μm的范圍內(nèi)，最優(yōu)選大約2μm大約3μm范圍內(nèi)的顆粒。通過采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法所產(chǎn)生的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物蛋白質(zhì)的知己，可以獲得期望的氣溶膠粒度，包括噴氣研磨(jet-milling)、噴射干燥、臨界點(diǎn)冷凝等。優(yōu)選的計(jì)量式吸入器包括3M或Glaxo制造的采用氟代烴推進(jìn)劑的那些。用于計(jì)量式吸入器裝置的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的制劑通常包括精細(xì)分開的粉末，其含有在非水介質(zhì)中作為懸浮液的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體，懸浮在借助表面活性劑的推進(jìn)劑中。推進(jìn)劑可以是任何為此目的的傳統(tǒng)材料，例如氯氟烴、氟代烴或烴包括三氯氟代甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2_四氟乙烷、HFA-134a(氫氟烷-134a)、HFA-227(氫氟烷-227)等。優(yōu)選，推進(jìn)劑是氟代烴?？梢赃x擇表面活性劑以穩(wěn)定推進(jìn)劑中作為懸浮液的至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體以保護(hù)活性劑免于化學(xué)降解等。適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┌ㄉ嚼婢厶侨退狨?、大豆卵磷脂、油酸等。在某些情況中，優(yōu)選使用溶劑如乙醇的溶液氣溶膠。制劑中?？梢园绢I(lǐng)域中已知用于配體蛋白質(zhì)的其他試劑如蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解可以利用本文沒有描述的裝置通過肺部給藥至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體組合物而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。粘膜制劑和給藥為了通過粘膜表面吸收，給藥至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的組合物和方法包括含有許多亞微米顆粒的乳液、粘膜吸附大分子、生物活性肽和水連續(xù)相，其促進(jìn)通過達(dá)到粘膜吸附粘膜顆粒而通過粘膜表面吸附(美國專利No.5，514，670)。適于施用本發(fā)明乳液的粘膜表面包括角膜、角膜的、結(jié)膜的、口腔的、舌下的、經(jīng)鼻、陰道的、肺部的、胃的、腸的和直腸的給藥途徑。用于陰道的或者直腸給藥的制劑例如栓劑可以含作為賦形劑的例如聚烷二醇、凡士林、可可脂等。用于鼻內(nèi)給藥的制劑可以是固體的并含作為賦形劑的例如乳糖，或者可以是鼻滴劑的含水的或者油溶液。用于口腔給藥的賦形劑包括糖、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、預(yù)凝膠化(pregelinatined)淀粉等(美國專利No.5，849，695)?？谇恢苿┖徒o藥用于口腔的制劑依賴共同給藥助劑(例如間苯二酚和非離子型表面活性劑例如聚氧乙烯油烯基醚和正六乙?；垡蚁┟岩匀斯さ厝藶榈靥岣吣c壁的滲透性，以及共同給藥酶抑制劑例如胰腺胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟磷酸(DFF)和抑肽酶)以抑制酶催降解。用于口服給藥的固體型劑型的活性組分化合物可以與至少一種添加劑混合，包括蔗糖、乳糖、纖維素、甘露糖醇、海藻糖、棉子糖、麥芽糖醇、葡聚糖、淀粉、瓊脂、精氨酸鹽(arginate)、殼多糖、脫乙酰殼多糖、果膠、黃蓍樹膠、阿拉伯樹膠、凝膠、膠原、酪蛋白、白蛋白、合成或者半合成的聚合物和甘油酯。這些劑型還可以含其他類型的添加劑例如惰性的稀釋劑，潤滑劑例如硬脂酸鎂、對(duì)羥苯甲酸酯(paraben)，防腐劑例如山梨酸、抗壞血酸、α-生育酚，抗氧化劑例如半胱氨酸，崩解劑(disintegrator)，粘合劑，增稠劑，緩沖劑，脫硫劑，增香劑，芳香劑，等等。片劑和丸劑可以被進(jìn)一步加工為腸溶(enteric-coated)制品。用于口服給藥的液體藥劑液體藥劑液體藥劑包括允許用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用的乳液、糖漿、酏劑、懸浮液和溶液制品。最近，人造混合氨基酸(類蛋白)的聚合體的微球體已經(jīng)用于遞送藥物(美國專利No.4，925，673)。而且，在美國專利No.5，879，681和美國專利No.5，871，753中描述的載體化合物被用于口服遞送本領(lǐng)域中已知的生物活性劑。透皮制劑和給藥對(duì)于透皮給藥，至少一種EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或者其他EPO受體激動(dòng)劑或者特定部分或者變體被封裝在遞送裝置中例如脂質(zhì)體或者聚合物納米顆粒、微粒、微膠囊或者微球體(除非另有說明，被統(tǒng)稱為微粒)。許多適當(dāng)?shù)难b置是已知的，其包括合成聚合物制成的微粒例如聚羥基酸例如聚乳酸、聚羥基乙酸和其共聚物、聚原酸酯、聚酐、和聚磷腈、和天然的天然聚合物例如膠原、聚氨基酸、白蛋白及其他蛋白質(zhì)、藻酸鹽及其他多糖和其組合(美國專利Nos.5，814，599)。延長給藥和制劑有時(shí)，期望將本發(fā)明的化合物通過單次給藥而長時(shí)間遞送到對(duì)象，例如持續(xù)一周到一年?？梢岳酶鞣N緩釋、貯庫(Cbpot)或插入劑型。例如劑型可以包含在體內(nèi)具有低溶解度的化合物的藥物上可以接受的無毒鹽，例如(a)與多元酸的酸加成鹽例如磷酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、鞣酸、雙羥萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘單或者二磺酸、多聚半乳糖醛酸等；(b)具有多價(jià)金屬陽離子的鹽例如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘等，或者與具有有機(jī)陽離子的由例如N，N’-二芐基-乙二胺或者乙二胺形成的鹽；或者(c)(a)和(b)的組合例如丹寧酸鋅鹽。另外，本發(fā)明的化合物優(yōu)選相對(duì)不溶性鹽例如剛描述的那些可以被配制在適于注射的凝膠中，例如具有例如芝麻油的單硬脂酸鋁凝膠。特別優(yōu)選的鹽是鋅鹽、丹寧酸鋅鹽、雙羥萘酸鹽等。另一個(gè)用于注射的緩釋儲(chǔ)存制劑將包含封裝在緩慢降解、無毒、非抗原性聚合物中的化合物或者分散的鹽，例如聚乳酸/聚羥基乙酸聚合物例如在美國專利No.3，773，919中所描述的?；衔锘蛘邇?yōu)選相對(duì)不溶性鹽例如上面描述的那些還可以被配置在膽固醇基質(zhì)硅橡膠小球中，特別是用于動(dòng)物中。其他緩釋、儲(chǔ)存或者插入制劑例如氣體或者液體脂質(zhì)體是文獻(xiàn)中已知的。(美國專禾UNos.5，770，222和“SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems",J.R.Robinsoned·,MarcelDekker,Inc.,N.Y.，1978)。已經(jīng)整體上對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，通過參考下面的實(shí)施例也能夠容易對(duì)本發(fā)明進(jìn)行理解，其中實(shí)施例是通過說明的方式提供的，并不是為了限制。實(shí)施例1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中克隆和表達(dá)EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或者其他EPO受體激動(dòng)劑典型的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含至少一種啟動(dòng)子元件，其介導(dǎo)mRNA、EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或者其他EPO受體激動(dòng)劑或者特定部分或者變體編碼序列的轉(zhuǎn)錄起始，以及轉(zhuǎn)錄子的轉(zhuǎn)錄和聚腺苷酸化終止所需的信號(hào)。其他元件包括增強(qiáng)子、Kozak序列和內(nèi)含子序列，其兩側(cè)帶有用于RNA剪接的供體和受體位點(diǎn)?？梢允褂脕碜許V40的早期和晚期啟動(dòng)子，來自反轉(zhuǎn)錄病毒例如RSV、HTLVI,HIVI的長末端重復(fù)(LTRS)，以及細(xì)胞巨化病毒(CMV)的早期啟動(dòng)子來達(dá)到高效轉(zhuǎn)錄。然而，也可以使用細(xì)胞元件(例如，人肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。用于實(shí)施本發(fā)明的適當(dāng)表達(dá)載體包括例如載體如pIRESlneo、pRetro_0ff、pRetro_0n、PLXSN或pLNCX(ClonetechLabs,PaloAlto,CA)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala,Sweden)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)?？梢允褂玫牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞包括人Hela293、H9和Jurkat細(xì)胞、小鼠NIH3T3和C127細(xì)胞、Cos1、Cos7和CV1、鵪鶉(quail)QCl-3細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。或者，可以在含有整合到基因組的基因的穩(wěn)定細(xì)胞系中表達(dá)基因。共轉(zhuǎn)染選擇標(biāo)記例如dhfr、gpt、新霉素或潮霉素能夠鑒定和分離被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。還可以對(duì)被轉(zhuǎn)染的基因進(jìn)行擴(kuò)增儀表達(dá)大量的所編碼的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體。DHFR(二氫葉酸還原酶)標(biāo)記可以用于產(chǎn)生攜帶幾百個(gè)或者甚至幾千個(gè)基因拷貝的細(xì)胞系。另一種可以使用的選擇標(biāo)記是酶谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy，等人，Biochem.J.227:277_279(1991)；Bebbington，等人，Bio/Technology10169-175(1992))。使用這些標(biāo)記，哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以生長在選擇培養(yǎng)基中，并選擇具有最高抗性的細(xì)胞。這些細(xì)胞含有整合到染色體的經(jīng)擴(kuò)增的基因。中國倉鼠卵巢(CHO)和NSO細(xì)胞通常用于生產(chǎn)EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體。表達(dá)載體pCl和pC4含有勞氏肉瘤病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子(LTR)(Cullen，等人，Molec.Cell.Biol.5:438_447(1985))加上CMV-增強(qiáng)子的片段(Boshart,等人，Cell41521-530(1985))。多克隆位點(diǎn)例如具有限制性酶切割位點(diǎn)BamHI、XbaI和Asp718輔助克隆感興趣的基因。除了3’內(nèi)含子外，載體還含有多聚腺苷酸化信號(hào)和大鼠前胰島素原基因的終止信號(hào)。在CHO細(xì)胞中克隆和表達(dá)載體pC4用于表達(dá)EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體。質(zhì)粒pC4是質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC索取號(hào)No.37146)的衍生物。該質(zhì)粒含有小鼠DHFR基因，其受到SV40早期啟動(dòng)子的控制?？梢酝ㄟ^在選擇培養(yǎng)基(例如，α-ΜΕΜ，LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)中培養(yǎng)細(xì)胞而選擇被轉(zhuǎn)染這些質(zhì)粒的中國倉鼠卵巢細(xì)胞或缺少二氫葉酸活性的其他細(xì)胞，其中所述選擇培養(yǎng)基中補(bǔ)充了化療藥物甲氨蝶呤。細(xì)胞中擴(kuò)增對(duì)甲氨蝶呤(MTX)有抗性的DHFR基因已經(jīng)被充分證明(參見例如F.W.Alt，等人，J.Biol.Chem.2531357-1370(1978)J.L.HamlinandC.Ma,Biochem.etBiophys.Actal097107-143(1990)；禾口Μ·J.PageandΜ.A.Sydenham,Biotechnology964-68(1991))。在不斷提高濃度的MTX中培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生了對(duì)藥物的抗性，其通過過表達(dá)靶酶DHFR，作為擴(kuò)增DHFR基因的結(jié)果。如果將第二基因連接到DHFR基因，則通常會(huì)共擴(kuò)增和過表達(dá)。本領(lǐng)域中已知該方法可以用于產(chǎn)生細(xì)胞系，其攜帶超過1，000個(gè)擴(kuò)增基因的拷貝。這樣，當(dāng)撤走氨甲喋呤時(shí)，所獲得的細(xì)胞系含有整合到宿主細(xì)胞的一個(gè)或者多個(gè)染色體中的擴(kuò)增的基因。質(zhì)粒pC4含有用于表達(dá)感興趣基因的勞氏肉瘤病毒長末端重復(fù)(LTR)的強(qiáng)啟動(dòng)子(Cullen，等人，Molec.Cell.Biol.5=438-447(1985))加上從人細(xì)胞巨化病毒(CMV)直接早期基因的增強(qiáng)子分離的片段(CMV)(Boshart，等人，Cell41:521_530(1985))。啟動(dòng)子的下游是BamHI、XbaI和Asp718限制性酶切位點(diǎn)，其允許基因的整合。在這些克隆位點(diǎn)的后面，質(zhì)粒含有3'內(nèi)含子和大鼠前胰島素原基因的多聚腺苷酸化位點(diǎn)。還可以使用其他高效啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)例如，人b-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、SV40早期或晚期啟動(dòng)子或來自其他反轉(zhuǎn)錄病毒例如HIV和HTLVI的長末端重復(fù)。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)或類似的系統(tǒng)可以用于以調(diào)控的方式在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)(M.Gossen和H.Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89=5547-5551(1992))對(duì)于mRNA，還可以使用其他信號(hào)的多聚腺苷酸化，例如來自人生長激素或球蛋白基因。也可也在與選擇標(biāo)記例如gpt、G418或潮霉素共轉(zhuǎn)染后對(duì)攜帶整合到染色中的感興趣基因的穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行選擇。有利的是，在一開始使用多種選擇標(biāo)記，例如G418加氨甲喋呤。使用限制性酶消化質(zhì)粒pC4，接著使用牛腸內(nèi)磷酸酶通過本領(lǐng)域已知的程序進(jìn)行去磷酸化。接著從的瓊脂糖凝膠分離載體。根據(jù)已知的步驟，使用編碼完整EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑或特定部分或變體的DNA序列，其對(duì)應(yīng)本發(fā)明EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體或其他EPO受體激動(dòng)劑的HC和LC可變區(qū)。在該構(gòu)建體(construct)中還使用編碼適當(dāng)人恒定區(qū)(即HC和LC區(qū))的分離的核酸。接著使用T4DNA連接酶連接分離的編碼可變區(qū)和恒定區(qū)的DNA以及去磷酸化的載體。接著轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)HBlOl或XL-IBlue細(xì)胞，并使用例如限制性酶分析鑒定含有插入到質(zhì)粒PC4中的片段的細(xì)菌。使用缺少活性DHFR基因的人倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。使用陽離子脂質(zhì)體(Iipofectin)，將5μg表達(dá)質(zhì)粒pC4與0.5μg質(zhì)粒pSV2_neo共轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒pSV2neo含有主導(dǎo)的選擇標(biāo)記，來自Tn5的neo基因，其編碼一種酶提供了對(duì)一組包括G418的抗生素的抗性。漿細(xì)胞接種在補(bǔ)充1μg/mlG418的α-MEM中。2天后，使用胰蛋白酶處理細(xì)胞，并接種在雜交瘤克隆平板中(Greiner,Germany)在補(bǔ)充10、25或50ng/ml甲氨蝶呤加1μg/mlG418的α-ΜΕΜ中。在大約1014天后，對(duì)單克隆進(jìn)行胰蛋白酶處理，并借著接種在6_孔皮氏培養(yǎng)皿(Petridish)中或IOml培養(yǎng)瓶中，其使用不同濃度的甲氨蝶呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)。接著將在最高濃度甲氨蝶呤下生長的克隆轉(zhuǎn)移到新的6孔平板中，其含有更高濃度的甲氨蝶呤(lmM、2mM、5mM、10mM、20mM)。重復(fù)相同的程序，直到獲得了在100200mM濃度下生長的細(xì)胞。對(duì)期望基因產(chǎn)物的表達(dá)進(jìn)行分析，例如通過SDS-PAGEandWestern印跡或反向HPLC分析。實(shí)施例2本發(fā)明EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體的非限制性例子背景ΕΜΡ-1(ΕΡ0模擬肽-1)是20氨基酸的肽，其與人促紅細(xì)胞生成素(HuEPO)沒有序列同源性，但具有激活EPO受體的能力(作為二聚體)(Wrighton等人，1996，Science,vol.273,458-463)。然而具有相對(duì)低活性(HuEPO的1/10，0001/100，000)以及短半衰期(離體(ex-vivo)半衰期為在50%血清中8小時(shí)，體內(nèi)半衰期未知)破壞了其作為治療劑的實(shí)用性。因此，需要一種方法為該肽提供較長的半衰期，而不會(huì)破壞并且可能還會(huì)改善其效力。為此，已經(jīng)進(jìn)行了許多常識(shí)以提高EMP-I的活性，其通過穩(wěn)定肽的二句話，或者通過將肽摻入到較大的結(jié)構(gòu)中以提高半衰期。Wrighten等人.(1997，NatureBiotechnology,vol.15,1261-65)將生物素標(biāo)記的EMP-I與鏈霉素結(jié)合以穩(wěn)定二聚化。它們觀察到在體外細(xì)胞增殖檢驗(yàn)中活性提高了100倍。他們還是用抗生物素抗體來穩(wěn)定肽二聚體，然而僅觀察到活性提高了10倍。該作者制備了EMP-I的化學(xué)限定二聚體形式。在該情況中，體內(nèi)觀察到活性提高了100倍。另一組尋求通過共價(jià)連接聚乙二醇(PEG)而改善EMP-I的活性(PEG)(Johnson等人，1997，Chem.&Bio.，vol.4(12)，939-50)。它們報(bào)道能力提高了最高達(dá)到1000倍，然而該構(gòu)建體被發(fā)現(xiàn)在小鼠中是免疫原性的(抗體針對(duì)該肽)(DanaJohnson,Personalcommunications).Kuai等)κ.(2000,J.肽Res.，vol.56,59-62)MEMP-I月太_入到血纖維蛋白溶酶原，激活劑抑制劑-I(PAI-I)的序列中。被認(rèn)為，將EMP-I插入到該框架中會(huì)穩(wěn)定二聚體并且提高半衰期。在體內(nèi)檢驗(yàn)中，該構(gòu)建體的能力被觀察到比單獨(dú)EMP-I顯著地高，例如超過2500倍。需要注意，在這些研究中使用不同的體外檢驗(yàn)和體內(nèi)模型，并且所報(bào)道的能力不能相互比較，或者比不上本文所提供的結(jié)果。實(shí)施例3本發(fā)明的EPO模擬鉸鏈核心模擬抗體本發(fā)明的具體非限制性例子是EMP-鉸鏈核心模擬抗體構(gòu)建體，其中V是第一天然存在的HC或LC抗體的多個(gè)N-末端氨基酸，P是單拷貝的生物活性EMP-I肽，L是Gly-Ser或Gly-Gly-Gly-Ser柔性接頭的串聯(lián)重復(fù)，H是鉸鏈核心區(qū)，CH2&CH3是IgGl或IgG4同種型亞類的。認(rèn)為該結(jié)構(gòu)能夠約束EMP-I肽，但允許充分的柔性，以便肽作為組裝均二聚體一部分的二聚化被穩(wěn)定化。作為這一點(diǎn)的支持，在體外細(xì)胞增殖檢驗(yàn)中EMP-鉸鏈核心模擬抗體的活性是EMP-I肽的500倍，并且基本上與重組HuEPO(rHuEPO)相似。此外，預(yù)料到該構(gòu)建體的半衰期是rHuEPO或單獨(dú)EMP-I肽的幾倍，與IgG類似。一致的是，與使用rHuEPO處理的小鼠相比，在提供相同的活性單位時(shí)，使用EMP-鉸鏈核心模擬抗體處理的正常小鼠獲得了顯著高的最大血細(xì)胞密度，并且高水平維持了更長的時(shí)間。該結(jié)構(gòu)能有效地從細(xì)胞分泌，并且似乎被正確折疊；這克服了與第一代模擬抗體相關(guān)的問題。除了上述的基本結(jié)構(gòu)外，對(duì)具有可能有利生物學(xué)特征的變體進(jìn)行描述。這些包括具有自聯(lián)合傾向降低、降低效應(yīng)子功能或降低免疫原性的傾向的構(gòu)建體。預(yù)計(jì)了其他提供期望特征的修飾，例如改善的生活活性肽的構(gòu)型，以及轉(zhuǎn)運(yùn)通過血腦屏障。所提出的這些變體和修飾可以以任何方式組合以產(chǎn)生具有期望活性的構(gòu)建體。使用重組DNA法，將EMP-I肽插入到免疫球蛋白信號(hào)肽和人J序列之間的中間載體中。這是使用互補(bǔ)的合成寡核甘酸進(jìn)行的，其末端與載體中出現(xiàn)的限制性位點(diǎn)兼容。這些寡核苷酸包括信號(hào)肽酶共有位點(diǎn)(QIQ)的編碼序列，EMP-I肽(SEQIDNO:2)，和GS或GGGS構(gòu)成的柔性接頭。接著將含有上述功能元件的限制性片段轉(zhuǎn)入到表達(dá)載體內(nèi)。該載體含有抗-CD4免疫球蛋白啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及人IgGl鉸鏈核心序列的編碼序列，一部分IgGl鉸鏈核心區(qū)，CPPCP(SEQIDNO66的109-113，如圖36C所示)，HC恒定區(qū)2(CH2)恒定區(qū)3(CH3)以及在細(xì)菌中質(zhì)粒復(fù)制和選擇以及用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中選擇穩(wěn)定表達(dá)所必要的元件。將該質(zhì)粒線性化，并通過電穿孔引入到NSO小鼠骨髓瘤細(xì)胞系中。選擇抗性細(xì)胞，并通過對(duì)培養(yǎng)物上清進(jìn)行ELISA檢驗(yàn)而鑒定EMP-鉸鏈核心模擬抗體的高表達(dá)。通過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)A親和層析完成從細(xì)胞培養(yǎng)物上清純化構(gòu)建體。在變性和還原條件下將純化的產(chǎn)物通過含有SDS聚丙烯酰胺凝膠確認(rèn)了所純化產(chǎn)物的期望大小。通過質(zhì)譜和N-末端測序確認(rèn)所純化蛋白質(zhì)的身份。下面顯示了EMP-鉸鏈核心模擬抗體的氨基酸序列。功能結(jié)構(gòu)域是上面所注解的肽編碼序列。三個(gè)氨基酸信號(hào)肽共有序列對(duì)應(yīng)天然存在免疫球蛋白的最先3個(gè)氨基酸。這些氨基酸被認(rèn)為有助于有效地在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被信號(hào)肽酶除去信號(hào)肽。該序列之后立即是EMP-I編碼序列。EMP-I序列的兩個(gè)C-末端氨基酸與接下來的6個(gè)氨基酸形成特征為Gly-Gly-Gly-Ser重復(fù)的柔性接頭。之后是人結(jié)合(J)區(qū)序列。認(rèn)為J序列會(huì)提供更高的柔性以允許EMP-I二聚體呈現(xiàn)正確的構(gòu)型，并允許二聚體從免疫球蛋白的球狀結(jié)構(gòu)突出并探入到兩個(gè)EPO之間的凹陷(cleft)內(nèi)。在構(gòu)建體中還包括HC鉸鏈區(qū)，其直接在J區(qū)之后。在IgGl鉸鏈區(qū)(高亮的)中存在3個(gè)半胱氨酸。第一個(gè)會(huì)與免疫球蛋白輕鏈(LC)正常配對(duì)，另外兩個(gè)參與兩個(gè)HC之間的鏈內(nèi)鍵。序列的其余部分是CH2&CH3區(qū)，其構(gòu)成了蛋白質(zhì)的本體(bulk)。免疫球蛋白被認(rèn)為具有長血清半衰期的原因之一是他們結(jié)合FcRn的能力，其通過將胞飲的免疫球蛋白返回到細(xì)胞外空間而延長了血清半衰期。FcRn的結(jié)合位點(diǎn)與CH2和CH3區(qū)的的結(jié)合處重疊(Sheilds等人，2001，J.Biol.Chem.，vol.276(9)，6591-6604)。EMP-鉸鏈核心模擬抗體的肽序列，其顯示了重要的功能結(jié)構(gòu)域。VEMP-I肽接頭鉸鏈IgGlCH21QlQGGTYSCHFGPLTffVCKPQGGGSCPPCPAPELLGGPIgGlCH2-----------------------------------------------------61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSI^^ιCti3122TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELIgGlCH3183TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQIgGlCH3241QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO82)VEMP-I肽接頭鉸鏈IgGlCH21QlQGGTYSCHFGPLTffVCKPQGGGGGSCPPCPAPELLGGPIgGlCH2-----------------------------------------------------61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSI^^ιCti3122TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELIgGlCH3183TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQIgGlCH3241QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO83)VEMP-I肽接頭鉸鏈IgGlCH21QlQGGTYSCHFGPLTffVCKPQGGGSGGGSCPPCPAPELLGGPIgGlCH2-----------------------------------------------------61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS一一一一一一一一一一一一一IgGlCH3122TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELIgGlCH3183TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQIgGlCH3241QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO84)VEMP-I肽接頭鉸鏈IgGlCH21QlQGGTYSCHFGPLTffVCKPQGGGSCPPCPAPEAAGGPIgGlCH2------------------------------------------------------61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSIgGlCH3122TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELIgGlCH3183TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQIgGlCH3241QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO85)VEMP-I肽接頭鉸鏈IgGlCH21QlQGGTYSCHFGPLTffVCKPQGGGGGSCPPCPAPEAAGGPIgGlCH2-----------------------------------------------------61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS一一一一一一一一一一一一一IgGlCH3122TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELIgGlCH3183TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQIgGlCH3241QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO86)VEMP-I肽接頭鉸鏈IgG4CH21QlQGGTYSCHFGPLTffVCKPQGGGSCPPCPAPEFLGGPIgG4CH2-----------------------------------61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSIgG4CH3121TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMIgG4CH3183TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQIgG4CH3241EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO87)VEMP-I肽接頭鉸鏈IgG4CH21QlQGGTYSCHFGPLTffVCKPQGGGSCPPCPAPEAAGGPIgG4CH2---------------------------------61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSIgG4CH3121TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMIgG4CH3183TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQIgG4CH3241EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO88)VEMP-I肽接頭鉸鏈IgG4CH21QlQGGTYSCHFGPLTffVCKPQGGGGGSCPPCPAPEAAGGPIgG4CH2----------------------------------61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSIgG4CH3121TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMIgG4CH3183TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQIgG4CH3241EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO89)公知兩條IgG重鏈在細(xì)胞代謝處理的過程中通過半胱氨酸之間的二硫鍵被組合在一起以形成同源二聚體，其中所述半胱氨酸位于絞鏈區(qū)。預(yù)計(jì)這也會(huì)發(fā)生在經(jīng)修飾的肽之間以形成組裝EMP-鉸鏈核心模擬抗體構(gòu)造體。另外，預(yù)計(jì)EMP-I肽中兩個(gè)半胱氨酸之間的鏈內(nèi)二硫鍵也會(huì)形成。預(yù)期的EMP-鉸鏈核心模擬抗體結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)EMP-I肽。N-末端的肽空間排列空間排列連同鄰接序列鄰接柔性將允許肽形成生物活性二聚體。首先在體外生物活性檢驗(yàn)中測試EMP-鉸鏈核心模擬抗體的活性。對(duì)于該檢驗(yàn)，使用來自患有急性成巨核細(xì)胞白細(xì)胞患者的EPO依賴性UT-7/EP0細(xì)胞系(Komatsu等人，1993，Blood,Vol.82(2)，456-464)。在從補(bǔ)充rHuEPO的培養(yǎng)基撤回后4872小時(shí)，這些細(xì)胞經(jīng)歷程序式細(xì)胞死亡。如果使用rHuEPO或EPOR激動(dòng)劑處理，則已經(jīng)在不存在rHuEPO時(shí)進(jìn)行孵育24小時(shí)的細(xì)胞能夠存活。將EMP-鉸鏈核心模擬抗體加入到不使用rHuEPO饑餓的細(xì)胞，并在處理后48小時(shí)使用四唑化合物MTS(CellTiter96AqueousOneSolution,Promega)測定細(xì)胞活力，其中MTS被活細(xì)胞代謝以產(chǎn)生能夠被測量吸光度的產(chǎn)品。典型檢驗(yàn)的結(jié)果顯示EMP-鉸鏈核心模擬抗體的效力在摩爾基礎(chǔ)上時(shí)EMP-I肽的500倍，是rHuEPO的1/5。此外，使用EMP-鉸鏈核心模擬抗體刺激這些細(xì)胞，并通過將細(xì)胞裂解液通過聚丙烯酰胺凝膠而觀察酪氨酸磷酸化特征。EMP-鉸鏈核心模擬抗體所表現(xiàn)的特征與rHuEPO類似，這說明EMP-鉸鏈核心模擬抗體對(duì)這些細(xì)胞發(fā)揮作用的機(jī)制與rHuEPO類似。在正常小鼠中進(jìn)行體內(nèi)研究以比較EMP-鉸鏈核心模擬抗體和rHuEPO的半衰期，并比較它們對(duì)紅細(xì)胞生成的影響。如果小鼠的劑量相同，則EMP-鉸鏈核心模擬抗體提供了較高的最大應(yīng)答，并且與rHuEPO相比，其應(yīng)答被延長。通過ELISA測量rHuEPO和EMP-鉸鏈核心模擬抗體二者的血清濃度。EMP鉸鏈核心模擬抗體的大概半衰期是rHuEPO的至少幾倍。已經(jīng)顯示IgGl較低鉸鏈區(qū)中的兩個(gè)賴氨酸殘基(L)L234&L235突變成丙氨酸(A)會(huì)破壞免疫球蛋白介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)以及抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力(Hezereh等人，2001，J.Virol.，vol.75(24)，12161-68)。初步研究已經(jīng)顯示EMP-鉸鏈核心模擬抗體不會(huì)介導(dǎo)表達(dá)EPO受體的補(bǔ)體裂解。這可能是由于在紅細(xì)胞類祖細(xì)胞(erythriodprogenitor)上發(fā)現(xiàn)了少數(shù)量的受體。此外，正如證據(jù)證明的，紅細(xì)胞類祖細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)展顯著提高了血球密度，這支持了免疫效應(yīng)子功能可能的功能無關(guān)性。然而，盡管沒有觀察到效應(yīng)子功能相關(guān)的效果，但仍對(duì)將這些突變引入作為預(yù)防步驟存在興趣。會(huì)導(dǎo)致介導(dǎo)免疫效應(yīng)子功能降低的另一種修飾是出去糖基化附著位點(diǎn)。這可以通過將297位的天冬酰胺(N297)突變成谷氨酰胺(Q)達(dá)到這一點(diǎn)。其他的變化可以任選地包括將蘇氨酸(T)替換為或者氨基酸以降低或修飾0-糖基化，例如T34或T47替換為A，IgGl亞類的糖基化版本已知是免疫效應(yīng)子功能差的介導(dǎo)子(Jefferis等人1998，Immol.Rev.，vol.163，50-76)。優(yōu)點(diǎn)上面所描沭的新型構(gòu)津體EMP-鉸鏈核心模擬抗體提供了展示生物活性肽EMP-I的可替換方式。該構(gòu)建體的活性在rHuEPO的范圍內(nèi)，并且體內(nèi)半衰期與IgG類似。此夕卜，除了EMP-鉸鏈核心模擬抗體的新特征之外，并結(jié)合EMP-鉸鏈核心模擬抗體的新特征，所提出的修飾會(huì)增強(qiáng)EMP-鉸鏈核心模擬抗體構(gòu)建體的實(shí)用性。實(shí)施例4支持缺少鉸鏈的EPO模擬抗體在治療葡萄糖耐受不良和/或腎病相關(guān)貧血中應(yīng)用的數(shù)據(jù)優(yōu)點(diǎn)上面所描述的新型構(gòu)建體EMP-NfusCGl提供了展示生物活性肽EMP-I的可替換方式。該構(gòu)建體的活性的活性和體內(nèi)半衰期與IgG類似。此外，除了EMP-NfusCGl的新特征外并結(jié)合EMP-NfusCGl的新特征，所提出的修飾增強(qiáng)了EMP-NfusCG1構(gòu)建體的實(shí)用性。背景許多臨床研究顯示晚期腎病的患者通常會(huì)有胰島素抗性(Mak.，1996；Spaia等人，2000；Tuzcu等人，2004)，這可能引起尿毒癥毒素、貧血或繼發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)(Spaia等人，2000)。有意思的是，在這些患者人群中使用EPO進(jìn)行治療已經(jīng)顯示會(huì)提高胰島素抗體，并伴隨血液甘油三酯、總膽固醇和LDL水平的提高(Mak.，1996；Spaia等人，2000)。一個(gè)研究組暗示胰島素靈敏度的提高可能會(huì)促進(jìn)EPO自身，而不是矯正貧血(Spaia等人，2000)。最近，Thomas等人，(2005)公開了一項(xiàng)研究，其中對(duì)722名患者篩選糖尿病并發(fā)癥和他們的EPO水平。在這些患者中，大約23%患有貧血。作者總結(jié)針對(duì)血紅蛋白水平降低的不能產(chǎn)生EPO是患有糖尿病的患者中貧血的共同原因。它們還得出結(jié)論缺少EPO產(chǎn)生可能引起糖尿病性腎病。CNTO530是一種EPO模擬物，其將EPO-模擬肽(EMP-1)引入到包含抗體Fc部分的結(jié)構(gòu)域中。EMP-I與EPO沒有序列同源性，但其與125I-標(biāo)記的EPO競爭與EPO受體的結(jié)合。CNTO530還會(huì)誘導(dǎo)EPO應(yīng)答細(xì)胞的增，并且刺激與EPO相同的胞內(nèi)磷酸化特征。CNTO530與親代分子CNTO528不同，其中EMP-I肽被嫁接到IgG4框架(而不是IgGl)上。相對(duì)于CNTO528，該框架缺少V-結(jié)構(gòu)域，并且具有顯著短的鉸鏈和接頭區(qū)。CNTO530的鉸鏈引入了3個(gè)在親代分子中不存在的點(diǎn)突變(Ala/Ala和S228P)。這些改變的各自作用是減少效應(yīng)子功能可以預(yù)見的問題，以及穩(wěn)定該分子。所得到的分子在嚙齒動(dòng)物和猴子中與CNT0528相比具有顯著改善的藥物藥物動(dòng)力學(xué)和藥效。因此，所保持的CNTO530體內(nèi)活性提供了與EPO和其他EPO類似物相比性質(zhì)改善的潛力。文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)暗示利用EPO的干涉會(huì)有利于大部分腎功能衰退的糖尿病患者。本文所提供的數(shù)據(jù)顯示長效EPO模擬物例如CNTO530還可以對(duì)腎功能衰退的糖尿病患者有利。然而，CNTO530具有長半衰期以外的附加性質(zhì)。一月一次給藥CNTO530將是治療患有貧血的糖尿病患者的新型方式。參考文獻(xiàn)MakRH,等人，J.Pediatrics,129:97_104，1996.SpaiaS,等人，N印hron，84:320_325，2000.ThomasMC,等人，Arch,Int.Med.，165466-469,2005.TuzcuΑ,等人，Horm.Metab.Res.，36:716_720，2004.實(shí)施例5=EPO模擬抗體CNTO530提高db/db小鼠中給藥7天后提高葡萄糖耐受將小鼠(db/db；η=7)禁食過夜，并測量空腹血糖(FBG)。根據(jù)FBG對(duì)動(dòng)物進(jìn)行任意排列。為小鼠靜脈給藥CNTO530(0.3mg/kg)，并在10分鐘后，腹膜內(nèi)提供葡萄糖(0.5mg/g)。在各種時(shí)間測量血糖(提供葡萄糖后10、20、30、60、90、120、150、180分鐘)。7天后，如上所述重復(fù)IPGTT。圖1中所示的數(shù)據(jù)暗示CNTO530在研究的第一天對(duì)血糖耐受幾乎沒有影響，但在單次給藥后7天具有非常顯著的影響。實(shí)施例6.在DIO小鼠中給藥7天后，CNTO530提高葡萄糖耐受。在DIO(飲食誘導(dǎo)肥胖)小鼠中在給藥CNTO530(0.3mg/kg)之后重復(fù)實(shí)施例1中所描述的實(shí)驗(yàn)。該鼠模型被認(rèn)為是人類疾病非常好的代表，因?yàn)檫@些小鼠在喂養(yǎng)高脂肪飲食后變成了糖尿病(PurinaTestDiet#58126，包括60.9%千卡脂肪和20.8%千卡糖類)。正如在實(shí)施例1中所描述的，在給藥時(shí)和給藥天后，進(jìn)行IPGTT。IPGTT過程中的時(shí)間點(diǎn)為葡萄糖活化(challenge)后15、30、60、90、120、150、和180分鐘。在第7天，完成IPGTT后，處死小鼠，并通過心臟穿刺收集全血(在EDTA中)進(jìn)行血液學(xué)研究。圖2顯示給藥后7天，CNTO530提高了葡萄糖耐受，而不是在給藥后立刻(10分鐘)。圖3說明使用CNT0530處理的小鼠相對(duì)于對(duì)照動(dòng)物具有高水平血紅蛋白。詳細(xì)描述實(shí)施例7單次給藥CNTO530在給藥后7、14、21和28天提高了葡萄糖耐受將小鼠(DI0；η=7)禁食過夜，并測量空腹血糖(FBG)。根據(jù)FBG對(duì)動(dòng)物進(jìn)行任意排列。為小鼠靜脈給藥CNTO530(0.3mg/kg)，并在10分鐘后，腹膜內(nèi)提供葡萄糖(0.5mg/g)。在各種時(shí)間測量血糖(提供葡萄糖后10、20、30、60、90、120、150、180分鐘)。在起始單次給藥后7、14、21和28天重復(fù)IPGTT。在IPGTT之后處死，被處理21、28和35天組中的動(dòng)物，并收集全血進(jìn)行血液學(xué)測量。血液學(xué)研究后，將血液離心，并收集血漿進(jìn)行胰島素測量。在使用CNTO530處理的動(dòng)物中在14、21和28天后存在相對(duì)于對(duì)照動(dòng)物，血糖清除的顯著減少(圖7)。在處理的動(dòng)物中21天和28天后(早期未檢測到)，血紅蛋白水平得到提高。令人感興趣的是，在處理的動(dòng)物中21天后，胰島素水平顯著降低。因?yàn)樵诮o藥21天后，葡萄糖水平低得多，因此胰島素水平較低也并不驚奇。然而，這說明所觀察到的現(xiàn)象是真實(shí)的，而不是葡萄糖測量的假象。實(shí)施例8.單次給藥EPO在給藥后5天提高了葡萄糖耐受將小鼠(DI0;n=7)禁食過夜，并測量空腹血糖(FBG)。根據(jù)FBG對(duì)動(dòng)物進(jìn)行任意排列，并靜脈給藥EPO(0.03,0.1,0.3mg/kg)。在給藥后5天進(jìn)行IPGTT(如上所述)。在IPGTT之后處死動(dòng)物，并收集全血進(jìn)行血液學(xué)測量。在被給藥0.03和0.3mg/kgEPO的動(dòng)物中有最輕微葡萄糖耐受的提高(圖7)，盡管沒有觀察到空腹血糖的統(tǒng)計(jì)上顯著的降低。圖8顯示血紅蛋白未被顯著提高，但網(wǎng)織紅細(xì)胞以劑量依賴性模式被顯著提高。實(shí)施例9.單次給藥Darb印oetin在給藥7天后提高了葡萄糖耐受將小鼠(DI0；η=7)禁食過夜，并測量空腹血糖(FBG)。根據(jù)FBG對(duì)動(dòng)物進(jìn)行任意排列，并靜脈給藥darbepoetin(0.01，0.03，0.lmg/kg)。在給藥后7天進(jìn)行IPGTT(如上所述)。在IPGTT之后處死動(dòng)物，并收集全血進(jìn)行血液學(xué)測量。在被給藥darbe的動(dòng)物中存在劑量依賴性葡萄糖耐受的提高(圖9)，并且觀察到空腹血糖的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低(圖10)。圖11顯示血紅蛋白和網(wǎng)織紅細(xì)胞都被顯著提尚O實(shí)施例10.轉(zhuǎn)基因小鼠中的IPGTT將表達(dá)人EPO的轉(zhuǎn)基因小鼠(雜合子或純合子)和C57B16小鼠(年齡與轉(zhuǎn)基因小鼠匹配)禁食過夜。第2天早上測量空腹血糖，并腹膜內(nèi)為小鼠提供葡萄糖(1.0mg/g)。在各種時(shí)間測量血糖(提供葡萄糖后10、20和30分鐘)。圖12顯示，相對(duì)于對(duì)照，轉(zhuǎn)基因小鼠中空腹血糖顯著地低。此外，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，在葡萄糖耐受測試過程中，曲線下的面積被顯著提高(圖13)。實(shí)施例11.單次給藥CNTO530提高胰島素靈敏度將小鼠(DI0；η=7)禁食過夜，并測量空腹血糖(FBG)。根據(jù)FBG對(duì)動(dòng)物進(jìn)行任意排列，并靜脈給藥CNTO530(0.3mg/kg)。給藥14天后，將小鼠禁食過夜，并收集血液進(jìn)行葡萄糖和胰島素測量。為動(dòng)物腹膜內(nèi)提供葡萄糖，并在20分鐘后收集血液進(jìn)行葡萄糖和胰島素測量。圖14顯示在禁食之后即刻，以及在葡萄糖活化20分鐘后，葡萄糖和胰島素水平的顯著降低。使用HOMA分析，并且所處理的動(dòng)物顯示了HOMA降低10倍以上，這暗示提高了胰島素靈敏度(圖15)。實(shí)施例12.臨床數(shù)據(jù)分析概沭GEHealthcare，sClinicalDataServices數(shù)據(jù)庫含有去身份(de-identified)、標(biāo)準(zhǔn)化、縱向(longitudinal)、患者水平電子醫(yī)學(xué)記錄數(shù)據(jù)，其來自在門診(ambulatorysetting)行醫(yī)的使用GECentricityEMR系統(tǒng)的大約4，000名美國醫(yī)生。該數(shù)據(jù)庫含有關(guān)于>4.7M活患者的數(shù)據(jù)。平均隨訪時(shí)間為大約3年。該數(shù)據(jù)庫含有關(guān)于患者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、醫(yī)學(xué)歷史、訪問類型、臨床觀察(包括診斷代碼)、實(shí)驗(yàn)室測試結(jié)果和所處方藥物的信息。JNJ已經(jīng)購買了對(duì)該數(shù)據(jù)庫的許可，并對(duì)其進(jìn)行分析以尋找關(guān)于被處方EPO用于貧血的患者中的糖尿病參數(shù)。開始的分析工作顯示⑶S數(shù)據(jù)庫含有總共4，700,156名患者，其中4，331，836名被分類為活躍患者(activepatient)0根據(jù)下列感興趣的變量，對(duì)人群進(jìn)一步進(jìn)行過濾以鑒定具有前EPO測量隨后有后EPO測量的患者-血糖，禁食-血紅蛋白Alc占總血紅蛋白的百分比-血紅蛋白，血液-血球密度，血液考慮對(duì)具有至少1次前_(最高達(dá)到之前60天)和1次后_(最高達(dá)到之后6個(gè)月)ΕΡ0治療測量的患者進(jìn)行分析。符合該標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)目會(huì)隨著不同變量的數(shù)目和時(shí)間區(qū)域而變化。進(jìn)行EPO治療并且HbAlc數(shù)值為6.0或更高的患者被認(rèn)為是糖尿病。圖16顯示EPO對(duì)患者血紅蛋白水平的影響。正如所預(yù)料的，血紅蛋白水平在開始給藥EPO后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)之前的3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定提高。圖17顯示EPO對(duì)患者HbAlC水平的影響。在給藥EPO后的第一個(gè)月，HbAlC水平平均降低0.5%，并且在恢復(fù)成最初狀態(tài)之前在隨后的兩個(gè)月內(nèi)保持低水平。比較圖16和17，似乎EPO對(duì)HbAlC的影響依賴于其對(duì)整體血紅蛋白水平的影響，因?yàn)閳D16僅顯示在開始給藥EPO后的第一個(gè)月內(nèi)血紅蛋白的非常微弱的提高。圖18顯示在起始EPO給藥達(dá)到最大值后在恢復(fù)到最初狀態(tài)之前的4各月內(nèi)，空腹血糖濃度降低了大約30mg.dL。空腹血糖的降低似乎比圖17中所顯示的HbAlC的降低更持續(xù)和持續(xù)地更長。圖19顯示EPO對(duì)作為基線糖尿病嚴(yán)重程度函數(shù)的HbAlC水平的影響。在4種基線HbAlC水平上對(duì)數(shù)據(jù)庫中的糖尿病人群進(jìn)行分級(jí)6-7%、7-8%、8-9%和>9%。該圖顯示EPO的抗糖尿病效果(定義為HbAlC水平下降的幅度)似乎在最高疾病嚴(yán)重程度的人群(即基線HbAlC>9%)中最大，其在第一個(gè)月中達(dá)到了導(dǎo)致大約降低1.69%(10.18%至8.49%)0相反，從較溫和的疾病水平開始(即基線HbAlC=8%-9%和7%-8%)，抗糖尿病效果也是較低，分別為0.84%(8.35%至7.51%)以及0.39%(7.38%至6.99%)。在基線水平最低的人群(6.0%-7.0%)中沒有觀察到降低。EMR數(shù)據(jù)的缺點(diǎn)之一可能是沿著時(shí)間過程的觀察缺少/不完整。為了確保，我們實(shí)際上觀察了更長期的糖尿病中的治療效果，我們進(jìn)一步分析了數(shù)據(jù)庫以僅分離那些被EPO治療的病人，其在開始EPO給藥之前2各月中具有基線HbAlC數(shù)值，并且其在后續(xù)時(shí)間段中具有HbAlC數(shù)值(1-3個(gè)月和46個(gè)月)。使用該縱向數(shù)據(jù)組獲得的結(jié)果確認(rèn)了圖19中所觀察到的結(jié)果。對(duì)于基線HBAlC數(shù)值>8，在EPO給藥后的最初3個(gè)月內(nèi)，HbAlC下降幅度為0.95%(9.41%至8.46%)。在后面的3個(gè)月內(nèi)，效果達(dá)到平穩(wěn)，而沒有觀察到進(jìn)一步的下降。在較低基線HbAlC數(shù)值(7-8%)時(shí)，最初3個(gè)月內(nèi)下降的量為0.46%(7.47%至7.01%),隨后在后面的3各月內(nèi)沒有顯著的進(jìn)一步變化。重復(fù)使用縱向患者的分析在起始EPO給藥后的空腹血糖數(shù)據(jù)。圖21顯示對(duì)基線水平高于或低于126mg/dL(根據(jù)AmericanDiabetesAssociation(ADA)的建議，基線空腹血糖水平126mg/dL用作診斷糖尿病患者的標(biāo)準(zhǔn))的患者的空腹血糖水平的影響。結(jié)果顯示對(duì)于糖尿病患者(FBG>126mg/dL)，空腹血糖數(shù)值整個(gè)時(shí)間過程中穩(wěn)定的降低為平均28mg/dL(173mg/dL至145mg/dL)。基線數(shù)值低于126mg/dL的患者沒有顯示任何PBG水平的降低。而是，在時(shí)間過程的最后顯示出等于5mg/dL(102mg/dL至107mg/dL)的稍稍提高。所提供的數(shù)據(jù)暗示能夠使用EPO受體激動(dòng)劑治療糖尿病患者以提高他們的空腹血糖和胰島素靈敏度。圖7和8以及圖1618中所顯示的數(shù)據(jù)暗示血紅蛋白的提高可能不是必須的，以提高葡萄糖耐受，這暗示可能使用低劑量的ERA來治療糖尿病而不提高血紅蛋白水平。這是重要的，因?yàn)橐阎狤RA會(huì)在顯著提高血紅蛋白的水平上提高血栓的風(fēng)險(xiǎn)。臨床數(shù)據(jù)也暗示這是可能的。臨床數(shù)據(jù)顯示能夠允許最輕微提高血紅蛋白(<)的EPO劑量會(huì)顯著提高空腹血糖和HbAlc。優(yōu)點(diǎn)俥用ERA作為治療劑治療糖尿病患者中的葡萄糖耐受能夠提供許多優(yōu)點(diǎn)?！ぴ撝委熆梢蕴峁┬滦偷淖饔脵C(jī)理用于治療糖尿病?！ぴ撝委煏?huì)引起雙重治療貧血和糖尿病?！び捎谝葝u素靈敏度的提高，ERA還可能達(dá)到脂類的提高(HDL，LDL,TG)。對(duì)高血糖正的持續(xù)效果可能導(dǎo)致HbAlc的顯著提高，以及糖尿病患者中胰島b細(xì)胞損失的延遲。目前對(duì)II型糖尿病的治療需要至少每日給藥。使用ERA治療該患者人群可以允許較低頻率的給藥，因此提高了順從性(compliance)。使用半衰期長的EPO受體激動(dòng)劑例如CNTO530作為治療劑治療腎病患者中的貧血和葡萄糖耐受能夠提供許多相對(duì)于其他EPO受體激動(dòng)劑(ERA)的優(yōu)點(diǎn)。該治療被認(rèn)為可以用于雙重治療貧血和糖尿病。與其他ERA相比，半衰期長的EPO受體激動(dòng)劑如CNTO530的半衰期可以用于治療糖尿病腎功能障礙患者中的高血糖癥。對(duì)高血糖癥的持續(xù)效果被認(rèn)為可以用于治療胰島β細(xì)胞損失，其通過延遲或降低該過程。CNTO530的長半衰期導(dǎo)致了與其他ERA相比較低頻率的給藥。CNTO530與EPO之間同源性的缺少降低了在該患者人員中PRCA的可能性。葡萄糖耐受效果能夠使得該患者組對(duì)其他糖尿病藥物的需求最小化。清楚的是，可以以與前面說明書和實(shí)施例中所特別描述不同的方式實(shí)施本發(fā)明。根據(jù)上述教導(dǎo)，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多修改和變化，因此仍在本發(fā)明的范圍內(nèi)。權(quán)利要求治療細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物中葡萄糖耐受不良的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物與至少一種促紅細(xì)胞生成素(EPO)受體激動(dòng)劑接觸，或?yàn)樗鏊黾?xì)胞、組織、器官或動(dòng)物給藥至少一種促紅細(xì)胞生成素(EPO)受體激動(dòng)劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述EPO受體激動(dòng)劑選自EPO受體激動(dòng)劑生物劑和EPO受體激動(dòng)劑小分子化合物。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述EPO受體激動(dòng)劑生物劑選自多肽、抗體和抗體融合多肽。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述多肽是EPO或天然存在的變體。5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述多肽還包含至少一個(gè)聚乙二醇分子。6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述多肽是非天然存在的EPO變體。7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述非天然存在的EPO變體是darb印oetin-α。8.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述抗體是針對(duì)EPO受體或EPO的激動(dòng)劑抗體。9.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述多肽是EPO的功能模擬物。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述EPO的功能模擬物是選自SEQIDNOS:1_39的至少一種。11.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述多肽是hematide。12.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述抗體融合多肽包括重鏈抗體序列的至少一部分和至少一種EPO受體激動(dòng)劑多肽。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述多肽是EPO的功能模擬物。14.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述小分子是化學(xué)化合物，其為EPO受體激動(dòng)劑。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述小分子選自re-2216和re-4592。16.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)的方法，其中0.001-50mg所述EPO受體激動(dòng)劑的所述有效量是0.000001-500mgo17.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)的方法，其中所述接觸或所述給藥是通過選自下列的至少一種途徑進(jìn)行的腸胃外、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)(intracerebroventricular)、大腸內(nèi)、頸管內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視剛莫內(nèi)、脊柱內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、快速濃注、陰道、直腸、經(jīng)頰、舌下、鼻內(nèi)或者透皮途徑。18.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括在所述(a)接觸或給藥之前、同時(shí)或之后，給藥至少一種包含有效量的至少一種化合物或多肽的組合物，所述至少一種化合物或多肽選自至少一種可檢測標(biāo)記或報(bào)告分子、TNF拮抗劑、抗感染藥物、心血管(CV)系統(tǒng)藥物、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)藥物、自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、流體或電解質(zhì)平衡的藥物、血液學(xué)藥物、抗癌藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、眼用藥物、耳用藥物或鼻用藥物、局部用藥物、營養(yǎng)性藥物、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑。全文摘要本發(fā)明涉及至少一種人EPO受體激動(dòng)方法用于防止或治療葡萄糖耐受不良和/或腎病相關(guān)貧血，包括治療組合物、方法和裝置。文檔編號(hào)A61K38/18GK101801403SQ200780043795公開日2010年8月11日申請日期2007年9月28日優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日發(fā)明者I·E·賈梅斯,K·皮查申請人:森托科爾奧索生物科技公司