專利名稱：抗再吸收的和造骨的食物增補劑和使用方法
專利說明抗再吸收的和造骨的食物增補劑和使用方法 本申請要求2006年10月24日提交的美國臨時申請順序號60/854,312和2007年4月23日提交的美國臨時申請順序號60/925,914的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
背景
健康的骨連續(xù)地進行重建過程，其中通過活性骨細胞，即形成骨的成骨細胞和再吸收骨的破骨細胞的協(xié)調(diào)作用，在骨再吸收和骨形成之間達到平衡。骨的重建過程開始于覆蓋未礦化的骨的細胞即襯細胞的活化。襯細胞再吸收未礦化的骨，然后回縮并為再吸收舊的、礦化的骨的破骨細胞留出空間，并創(chuàng)造吸引成骨細胞至相同位置的環(huán)境。然后成骨細胞沉降有機基質(zhì)，該有機基質(zhì)隨后礦化以形成新骨。因此骨量(bone mass)取決于破骨細胞的骨再吸收與成骨細胞的骨形成之間的平衡。
骨中礦物質(zhì)的量主要負責其硬度，而如結(jié)構(gòu)蛋白膠原的物質(zhì)也促成骨的機械強度。致密的最外面的骨稱為骨皮質(zhì)，而更具多孔性的內(nèi)部形式稱為骨松質(zhì)或骨小梁。
大多數(shù)骨疾病歸因于骨重建過程的平衡的受破環(huán)。一般地，該破裂為骨再吸收的增加。例如，骨質(zhì)疏松癥，最常見骨疾病中的一種，其特征為伴隨骨顯微結(jié)構(gòu)變化的骨量下降，但對引起骨折易感性增加的骨本身的化學成分沒有影響。具體地說，骨皮質(zhì)變薄且多孔，同時骨小梁變薄、穿孔、和分離。骨質(zhì)疏松癥可認為是骨重建循環(huán)中負平衡的結(jié)果，即形成的骨少于再吸收的骨。
因此，用于治療骨病癥的治療劑針對抑制骨再吸收和增加骨形成。骨的重建過程涉及許多不同的分子和途徑，當前可用的各種治療劑靶向不同的分子和途徑。例如，雙膦酸鹽(如阿侖膦酸鹽和利塞膦酸鹽)通過阻斷破骨細胞的活性而抑制骨再吸收。其它治療劑設法通過阻斷與TNF受體/配體家族的成員的結(jié)合來抑制骨再吸收，所述成員例如作為活化破骨細胞的細胞因子的細胞核因子κB受體激活蛋白配體(Receptor Activator for Nuclear Factor κB Ligand)(RANK-L)，而破骨細胞是與骨再吸收有關的細胞。抑制RANK-L的釋放可防止骨礦物質(zhì)流失。
還有其它治療劑以增加骨形成為目標。例如，已知激活的骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因?qū)σl(fā)成骨細胞分化和促進骨形成有直接作用。業(yè)已顯示重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的釋放誘導骨或軟骨的形成。然而，藥物制劑和生物制劑，例如重組BMP-2的全身用藥，可對腸和其它組織產(chǎn)生有害作用。因此，在本領域中需要可用于食物增補劑介入以通過抑制骨再吸收和/或增加骨形成來預防和/或治療骨病癥的天然的和植物來源的提取物。
概述
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)各種天然的和植物來源的提取物的新組合可以(1)通過抑制、減少、或預防RANK-L的表達和/或釋放，和/或通過預防鈣從骨釋放而抑制骨再吸收；(2)通過增加或刺激BMP-2的基因和/或蛋白表達而增加骨生長；和(3)改善或維持骨強度。
在一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長的組合物，該組合物包含天然的、植物來源的提取物，該提取物包括以下中的至少兩種的組合二水合槲皮素、脫水槲皮素、地黃(Rehmannia sp.)提取物、地黃(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亞人參(Siberian ginseng)提取物、槐角(Sophora fructus japonica)提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、和依普黃酮，其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達。
在另一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長的組合物，該組合物包含脫水槲皮素或二水合槲皮素、西伯利亞人參提取物、槐(Sophora japonica)提取物、和甘草提取物的組合，其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達。
在另一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長的組合物，該組合物包含約10-1000mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素、約100-800mg的西伯利亞人參提取物、和約10-500mg的甘草提取物的組合，其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達。
在又一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長的組合物，該組合物包含約10-1000mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素、和約10-500mg的甘草提取物的組合，其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達。
在另一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長的組合物，該組合物包含約10-1000mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素、和約100-800mg的西伯利亞人參提取物的組合，其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達。
在又一個實施方案中，本發(fā)明為在受試者中增加或刺激骨生長的方法，該方法包括將包含以下中的至少兩種的組合的組合物給予該受試者脫水槲皮素、二水合槲皮素、地黃(Rehmannia sp.)提取物、地黃(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亞人參提取物、槐(Sophorajaponica)提取物、甘草提取物、和依普黃酮，其中該組合增加受試者中的BMP-2的基因或蛋白表達。
本發(fā)明的又一個實施方案為在受試者中增加或刺激骨生長的方法，該方法包括給予該受試者包含約10-1000mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素、約100-800mg的西伯利亞人參提取物、和約10-500mg的甘草提取物的組合的組合物，其中該組合增加受試者中的BMP-2的基因或蛋白表達。
本發(fā)明的另一個實施方案為在受試者中增加或刺激骨生長的方法，該方法包括給予該受試者包含約10-1000mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素、和約10-500mg的甘草提取物的組合的組合物，其中該組合增加受試者中BMP-2的基因或蛋白表達。
本發(fā)明的另一個實施方案為在受試者中增加或刺激骨生長的方法，該方法包括給予該受試者包含約10-1000mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素、和約10-800mg的西伯利亞人參提取物的組合的組合物，其中該組合增加受試者中BMP-2的基因或蛋白表達。
在另一個實施方案中，本發(fā)明可為用于抑制、減少、或預防骨再吸收的組合物，該組合物包含與以下中的一種或多種組合的石榴提取物、安石榴甙(punicalagin)、或兩者二水合槲皮素、脫水槲皮素、地黃(Rehmannia sp.)提取物、地黃(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亞人參提取物、槐角(Sophora fructus japonica)提取物、槐(Sophorajaponica)提取物、甘草提取物、和依普黃酮，其中石榴提取物、安石榴甙、或兩者抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生和/或釋放。
在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法使用含有稱為安石榴甙的化合物的石榴(Punica granatum)果實和果皮提取物，以抑制或減少骨再吸收。本發(fā)明使用的石榴提取物，例如包含安石榴甙的石榴提取物，可以在用于抑制、減少、或預防骨再吸收的組合物和方法中使用，其中該石榴提取物抑制、減少或預防RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明為用于抑制、減少、或預防骨再吸收的組合物，該組合物包含石榴提取物、至少一種安石榴甙、或兩者。備選地，本發(fā)明考慮抑制、減少、或預防骨再吸收的方法，該方法包括給予包含石榴提取物、至少一種安石榴甙、或兩者的組合物，其中該組合物抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放中的一個。
在還另一個實施方案中，本發(fā)明為用于抑制、減少、或預防骨再吸收的組合物，該組合物包含天然的、植物來源的提取物，該提取物包括以下中的至少兩種的組合優(yōu)選包含安石榴甙的石榴提取物、橄欖提取物、西伯利亞人參提取物、銀杏(Ginkgo biloba)提取物、綠茶提取物、槐(Sophora japonica)提取物、地黃(Rehmannia sp.)提取物、葡萄籽提取物、當歸(Dong Quai)提取物、和依普黃酮，其中該組合抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放。
在還一個實施方案中，本發(fā)明為用于抑制、減少、或預防骨再吸收的組合物，該組合物包含石榴提取物、葡萄籽提取物、依普黃酮、和綠茶提取物的組合，其中該組合抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放。
在另一個實施方案中，本發(fā)明為用于抑制、減少、或預防骨再吸收的組合物，該組合物包含約10-2000mg的石榴提取物、約35-250mg的葡萄籽提取物、和約400-700mg的依普黃酮的組合，其中該組合抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放。
在還另一個實施方案中，本發(fā)明為用于抑制、減少、或預防骨再吸收的組合物，該組合物包含約10-2000mg的石榴提取物、約35-250mg的葡萄籽提取物、和約400-700mg的依普黃酮，其中該組合物抑制鈣從骨釋放。
本發(fā)明的另一個實施方案為在受試者中抑制、減少、或預防骨再吸收的方法，該方法包括給予該受試者包含天然的、植物來源的提取物的組合物，該提取物包括以下提取物中的至少兩種石榴提取物、橄欖提取物、西伯利亞人參提取物、銀杏(Ginkgo biloba)提取物、綠茶提取物、槐(Sophora japonica)提取物、地黃(Rehmannia sp.)提取物、葡萄籽提取物、當歸提取物、和依普黃酮，其中該組合抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放。
在還一個實施方案中，本發(fā)明為在受試者中抑制、減少、或預防骨再吸收的方法，該方法包括給予該受試者包含石榴提取物、葡萄籽提取物、依普黃酮、和綠茶提取物的組合的組合物，其中該組合抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放。
在還一個實施方案中，本發(fā)明為在受試者中抑制、減少、或預防骨再吸收的方法，該方法包括給予該受試者包含約10-2000mg的石榴提取物、約35-250mg的葡萄籽提取物、和約400-700mg的依普黃酮的組合的組合物，其中該組合抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放。
在還另一個實施方案中，本發(fā)明為在受試者中抑制、減少、或預防骨再吸收的方法，該方法包括給予該受試者包含約10-2000mg的石榴提取物、約35-250mg的葡萄籽提取物、和約400-700mg的依普黃酮的組合的組合物，其中該組合抑制鈣從骨釋放。
在還一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長和抑制、減少、或預防骨再吸收的食物增補療法，該療法包括第一組合物和第二組合物，該第一組合物包含以下中的至少兩種的組合二水合槲皮素、脫水槲皮素、地黃(Rehmannia sp.)提取物、地黃(Rehmanniasp.)根提取物、西伯利亞人參提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、和依普黃酮，其中該第一組合物的組合增加BMP-2的表達和/或活性；該第二組合物包含以下中的至少兩種的組合石榴提取物、橄欖提取物、西伯利亞人參提取物、銀杏(Ginkgo biloba)提取物、綠茶提取物、槐(Sophora japonica)提取物、地黃(Rehmannia sp.)提取物、葡萄籽提取物、當歸提取物、和依普黃酮，其中該第二組合物的組合抑制RANK-L的表達。
詳述
應理解本發(fā)明不限于本文描述的具體組合物、方法、或方案。此外，除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語具有如本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的意義。還應理解的是，本文使用的術語僅為了描述具體實施方案的目的，不意欲限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅由權(quán)利要求書限定。
本發(fā)明基于令人意想不到的發(fā)現(xiàn)下文更充分描述的包括以下中的兩種或多種的成分的獨特組合通過增加或刺激BMP-2的啟動子、基因、和/或蛋白質(zhì)的表達和/或活性而增加骨生長，或者通過抑制、減少、或預防RANK-L的表達、產(chǎn)生、或釋放，或通過抑制、減少、或預防鈣從骨的釋放而抑制骨再吸收脫水槲皮素、二水合槲皮素、地黃(Rehmannia sp.)提取物、地黃(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亞人參提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、依普黃酮提取物、石榴提取物、橄欖提取物、銀杏(Ginkgo biloba)提取物、綠茶提取物、葡萄籽提取物、和當歸提取物。
BMP-2是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的成員，骨形態(tài)發(fā)生蛋白是擴展的轉(zhuǎn)化生長因子B超家族中的新因子。當局部注入大鼠的皮下組織時，重組BMP-2和BMP-4可以誘導新骨形成(Wozney J.Molec(1992)32160-67)。BMP-2和BMP-4隨著正常的成骨細胞的分化而被表達，其已顯示在體外刺激成骨細胞分化和骨小結(jié)(bone nodule)形成以及在體內(nèi)刺激骨形成。因此，通過增加或刺激BMP-2的啟動子活性、基因表達、和/或蛋白表達，本發(fā)明的獨特組合物用于增加或刺激骨生長和治療或預防各種骨病癥。
腫瘤壞死因子(TNF)家族成員RANK-L，即細胞核因子(NF)-κB受體激活蛋白配體(也作為護骨蛋白配體，OPGL)，是成熟破骨細胞形成的主要刺激因子，對其生存必不可少，破骨細胞是幫助骨再吸收的骨細胞。RANK-L由成骨細胞的譜系細胞(osteoblasticlineage cell)和活化的T淋巴細胞產(chǎn)生。它激活位于破骨細胞和樹突狀細胞上的特異性受體RANK。本發(fā)明制劑的一種策略為當用IL-1刺激時直接抑制RANK-L表達。當用IL-1刺激時，RANK-L的激活可以直接觸發(fā)破骨細胞形成(從而觸發(fā)骨再吸收)。因此，通過抑制、減少、或預防RANK-L表達、產(chǎn)生、或釋放，本發(fā)明的獨特組合物用于抑制、減少、或預防骨再吸收和治療或預防包括骨丟失、骨質(zhì)疏松癥、溶骨等各種骨病癥。
槲皮素，涉及槲皮素提取物和各種形式的槲皮素，例如二水合槲皮素、脫水槲皮素等，是用于本發(fā)明的獨特組合物中的一種化合物。槲皮素是形成許多其它類黃酮，包括柑橘類黃酮蕓香苷、橙皮苷、柚皮苷和柑桔黃酮的″骨架″的類黃酮。在研究中發(fā)現(xiàn)槲皮素是最具活性的類黃酮，許多藥用植物的大部分活性歸因于其高槲皮素含量。槲皮素因為對炎癥的幾個初始過程的直接抑制已顯示出顯著的抗炎活性。例如，它同時抑制組胺和其它過敏性/炎性介體的產(chǎn)生和釋放。此外，它產(chǎn)生有效的抗氧化劑活性和節(jié)省維生素C的作用。
槲皮素也在對抗或幫助預防癌癥、前列腺炎、心臟病、白內(nèi)障、變態(tài)反應、炎癥、和呼吸系統(tǒng)疾病例如支氣管炎和哮喘有積極的作用。此外，依照美國專利第5,478,579號，當按50-1500mg/天的量使用時，脫水槲皮素和/或二水合槲皮素可以增強鈣進入骨組織的吸收。
富含槲皮素的食物包括蘋果、紅茶和綠茶、洋蔥、覆盆子、紅酒、紅葡萄、柑橘類水果、青花椰菜、蠶豆、其它多葉青菜、和櫻桃。
如下文更充分地論述，本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)槲皮素是BMP-2啟動子活性和蛋白表達的有效激活劑。此外，下文論述的試驗結(jié)果表明當將二水合槲皮素與西伯利亞人參、甘草、或兩者聯(lián)合給藥時，達到意想不到的協(xié)同作用，引起超過任何成分所單獨能達到的BMP-2啟動子活性和蛋白表達。
用于本發(fā)明的槲皮素成分可市購自各種來源，包括例如Twinlab(American Fork，Utah)、Jarrow Formulas(Los Angeles，California)、Natural Factors(Coquitlam，British Columbia，Canada)、和NOW Foods(Bloomingdale，Illinois)。此外，槲皮素可由下文更充分討論的、或在本領域中描述的或已知的任何提取方法來獲得。
地黃(Rehmannia)，用于本發(fā)明的獨特組合物中的另一植物，是中國特有的唇形目(Lamiales)中六個種的有花植物的屬。在中文稱為dihuang(地黃)，該草藥用于許多種疾病例如貧血、眩暈和便秘。地黃(Rehmannia)包含維生素A、B、C、和D，以及其它有用的化合物。
地黃(Rehmannia sp.)提取物即地黃(Rehmannia sp.)的提取物包括地黃(Rehmannia sp.)根提取物即地黃(Rehmannia sp.)根的提取物，可購自各種來源，包括EUL Herb Manufacturing(La Verne，California)和NuPharma Neutraceuticals(Miami Beach，F(xiàn)lorida)。此外，地黃(Rehmannia sp.)提取物可由下文更充分討論的、或在本領域中描述的或已知的任何提取方法來獲得。
西伯利亞人參，用于本發(fā)明的獨特組合物的化合物中的一種，也稱為刺五加(Eleutherococcus senticosus)，是原產(chǎn)于東北亞的五加科(Araliaceae)中的一類小的、木質(zhì)灌木。西伯利亞人參是具有許多健康益處的有效滋補藥草。例如，西伯利亞人參具有抗乳(乳腺)癌、胃癌、口腔癌、皮膚黑素瘤和卵巢癌的免疫保護性作用。發(fā)現(xiàn)它對T淋巴細胞，主要是輔助型/誘導型T淋巴細胞有顯著影響，而且還對細胞毒細胞和自然殺傷細胞有顯著影響。此外，已知西伯利亞人參具有抗骨質(zhì)疏松癥的保護作用。見，例如，Kropotov等，″西伯利亞人參提取物和依普黃酮對糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì)疏松癥發(fā)展的作用″(“Effects of Siberian ginseng extract and ipriflavone on the developmentof glucocorticoid-induced osteoporosis.”)Bull Exp Biol Med.，2002.133(3)252-4。
如下文更充分地論述，本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)西伯利亞人參的提取物(即西伯利亞人參提取物)是BMP-2的啟動子活性、BMP-2的基因表達和BMP-2的蛋白表達的有效激活劑。此外，下文論述的試驗結(jié)果表明，當將西伯利亞人參提取物與二水合槲皮素聯(lián)合給藥時，這樣的組合獲得意想不到的協(xié)同作用，引起超過任一成分所單獨達到的BMP-2的啟動子活性、基因表達和蛋白表達。
西伯利亞人參提取物可購自多個供應商例如Xi′anTianxingjian Natural Bio-products Group(Xi′an，Shaanxi，China)。此外，西伯利亞人參(Rehmannia ginseng)提取物可使用下文更充分討論的、或在本領域中描述的或已知的任何提取技術獲得。在一個實例中，西伯利亞人參提取物可作為西伯利亞人參根和/或根莖的醇提取液而獲得。
槐(Sophora japonica)、或槐角(Sophora fructus japonica)，用于本發(fā)明的獨特組合物中的另一種化合物，也稱為Pagoda Tree，原產(chǎn)于東亞。蕓香苷，可在槐(Sophora japonica)提取物中找到的活性化合物，可用于增加毛細血管的通透性(例如，擴張的再溶解和多孔性)。除蕓香苷之外，可從自槐(Sophora japonica)植物，包括葉、莖、花、種子、根等中提取脫水槲皮素和二水合槲皮素。
如下文所更充分地討論，本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)槐(Sophora japonica)的提取物(即槐(Sophora japonica)提取物)是BMP-2的啟動子活性、基因表達和蛋白表達的有效激活劑。
槐(Sophora japonica)提取物可購自各種供應商例如NuPharma Nutraceuticals(Miami Beach，F(xiàn)lorida)。此外，槐(Sophorajaponica)提取物可使用下文更充分討論的、或在本領域中描述的或已知的任何提取技術獲得。在一個實施方案中，可使用槐(Sophorajaponica)的成熟種子來獲得用于本發(fā)明的槐(Sophora japonica)提取物。
用于本發(fā)明的獨特組合物的甘草提取物，一般廣泛地用于治療支氣管問題例如卡他、支氣管炎和咳嗽。甘草也在控制消化性潰瘍生成、胃炎和潰瘍中形成重要的成分。依照日本專利2002 179585和美國專利20020009506，當按50-100mg/日給藥時，甘草可以用于治療骨質(zhì)疏松癥、改善骨代謝、和促進鈣化。
如下文更充分地論述，本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)甘草提取物(即甘草的提取物)，例如甘草的乙醇提取物和乙醇-水提取物，是BMP-2的啟動子活性、基因表達和蛋白表達的有效激活劑。此外，下文討論的分析結(jié)果表明當將甘草提取物與二水合槲皮素聯(lián)合給藥時，這樣的組合達到意想不到的協(xié)同作用，引起超過任一成分所單獨達到的BMP-2的啟動子活性、基因表達和蛋白表達。
甘草提取物可購自多個供應商例如Herbs Forever，Inc.(LosAngeles，California)。此外，甘草提取物可使用下文更充分討論的或在本領域中已知的任何提取技術獲得。在一個實施方案中，甘草提取物可以是得自洋甘草(Glycyrrhiza glabra)的根、長匐莖、和/或根莖的甘草的乙醇提取物。
依普黃酮，用于本發(fā)明的獨特組合物中的另一化合物是異黃酮。雖然可在豆科植物例如苜蓿中發(fā)現(xiàn)少量的依普黃酮，但是依普黃酮一般使用多酚類作為起始材料，合成制備為7-異丙氧基異黃酮。
如下文所更充分地討論，本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)依普黃酮是RANK-L表達的有效抑制劑。依普黃酮可購自各種來源。例如，
是得自Technical Sourcing International，Inc.(Missoula，Montana)的合成的依普黃酮化合物。
可以提取石榴，以產(chǎn)生用于本發(fā)明的獨特組合物的石榴提取物(石榴提取物)。當提取時，石榴，稱為Punica granatum，一般被標準化為鞣花酸或安石榴甙含量。安石榴甙以2，3，六羥基二苯甲酰基-沒食子酸基-D-葡萄糖的異構(gòu)體存在。例示性結(jié)構(gòu)顯示如下
石榴提取物還可富含多酚類，例如可水解的鞣質(zhì)，特別是安石榴甙，安石榴甙可為造成石榴汁的自由基清除能力的原因。
在日本，石榴已被用于抑制骨量減少。見日本專利19990049884。本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)石榴提取物是RANK-L表達、產(chǎn)生、或釋放的有效抑制劑。在一個實例中，于石榴提取物中存在的安石榴甙抑制或減少RANK-L的表達。因此，包含安石榴甙、鞣花酸或兩者的石榴提取物在用于抑制、減少、或預防RANK-L的產(chǎn)生、釋放、和/或表達的組合物和方法中使用。
石榴提取物可購自各種來源，包括Nature′s Way(Springville，Utah)、Nature′s Herbs(AmericanFork，Utah)，Swansen′sHealth Products(Fargo，North Dakota)和Doctor′s Trust Vitamins(Orlando，F(xiàn)lorida)。此外，石榴提取物可使用下文更充分討論的或在本領域中已知的任何提取技術獲得。
銀杏(Ginkgo biloba)的提取物(即銀杏(Ginkgo biloba)提取物)，用于本發(fā)明的獨特組合物的另一提取物，已知具有三種作用(1)改善血液流到大多數(shù)組織和器官(包括小毛細血管中的微循環(huán))；(2)防止自由基損害氧化細胞(抗氧化劑)；和(3)阻斷血小板聚集和血液凝固的作用。
銀杏(Ginkgo biloba)提取物可購自各種來源，包括Puritan′sPride(Long Island，New York)。此外，銀杏(Ginkgo biloba)提取物可使用本文公開的或在本領域中已知的任何提取方法獲得。例如，銀杏(Ginkgo biloba)提取物可使用本文公開的或在本領域中已知的任何提取方法提取銀杏(Ginkgo biloba)的干燥或新鮮葉子、或種子獲得。
綠茶，可經(jīng)提取以產(chǎn)生用于本發(fā)明的獨特組合物中的一種化合物，一直就被中國人用作藥物來治療頭痛、身體疼痛、消化不良、促進健康和延年益壽。綠茶提取物富含生物類黃酮，包括抗氧化劑表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。綠茶提取物中的EGCG防止消化道和呼吸道感染，阻斷致癌物質(zhì)的作用，可以起抗菌劑的作用，也可以幫助降低膽固醇含量。
如下文所更充分地討論，本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)綠茶提取物(或綠茶的提取物)是RANK-L表達的有效抑制劑。綠茶提取物可購自各種來源，包括Life Extension(Fort Lauderdale，F(xiàn)lorida)。此外，綠茶提取物可使用下文更充分討論的或在本領域中已知的任何提取技術獲得。
葡萄籽提取物(或葡萄籽的提取物)，用于本發(fā)明的獨特組合物中的另一種化合物，含有在人體內(nèi)充當抗氧化劑(自由基清除劑)的被稱為低聚原花色素或OPC的一類類黃酮復合物。OPC可幫助防止內(nèi)部應激和環(huán)境應激(即，吸煙、污染、和支持正常的身體代謝過程)的作用。
用于本發(fā)明的葡萄籽提取物可得自市售的來源。例如，葡萄籽提取物可得自Kikkoman Corporation(Tokyo，Japan)、Polyphenols，Inc.(Madera，California)、Bio Serae Laboratories SA(Bram，F(xiàn)rance)、OptiPure(Los Angeles，California)、Dry Creek Nutrition，Inc.(Modesto，California)、或其它合適的來源。此外，可使用下文更充分討論的、或在本領域中已知的或描述的那些提取技術以產(chǎn)生用于本發(fā)明的葡萄籽提取物。
當歸，用于本發(fā)明的獨特組合物中的一種提取物，也稱為Angelica sinensis或″femail ginseng″，是傘形科(Apiaceae)的草藥，原產(chǎn)于中國。它的根中文通常稱為當歸或danggui(中文當歸；拼音dāngguī)，并被廣泛地用于中國傳統(tǒng)醫(yī)學中以治療婦科疾病、疲勞、輕度貧血和高血壓。當歸具有止痛、抗炎、止痙和鎮(zhèn)靜作用。該植物的植物化學成分包含香豆素、植物甾醇、多糖、阿魏酸鹽、和類黃酮。
當歸提取物(即當歸的提取物)可購自各種不同來源，包括Capricorns Lair(Ogden，Utah)。此外，當歸可使用下文更充分描述的任何提取技術、或在本領域中已知的任何提取技術提取。
雖然用于本發(fā)明的每一提取物均為市售，但有許多提取方法可以用來制備用于本發(fā)明提取物而不需要市購該提取物?？捎脕懋a(chǎn)生用于本發(fā)明提取物的提取方法的一些實例在下文描述。其它實例為已知的，在本領域包括各種出版物和專利中描述。下文更充分地描述的提取方法為例示性的，本領域的普通技術人員應理解可以使用其它提取技術和方法來獲得用于本發(fā)明提取物。
用于本發(fā)明提取物可從許多來源中獲得，包括不同的品種和物種。例如，得自任何顏色或品種的葡萄的葡萄籽均可用來獲得葡萄籽提取物。此外，可提取植物的任何部分，包括果實、果皮、種子、莖、葉、根、莖皮、根莖、長匐莖等。
在一個實施方案中，可使用有機溶劑萃取技術獲得用于本發(fā)明的獨特組合物提取物。更具體地講，用于本發(fā)明提取物，例如甘草提取物或甘草根提取物，可以通過用有機溶劑，例如己烷、醋酸乙酯、乙醇、或水-乙醇提取甘草或甘草根來制備。
在另一個實施方案中，可用溶劑順序分級分離法(solventsequential fractionation)獲得用于本發(fā)明的獨特組合物提取物。例如，使用該技術，可用己烷、醋酸乙酯、乙醇、和水-乙醇相繼提取葡萄籽來獲得葡萄籽提取物。在所述順序的每一步之后獲得的提取物(級分(fraction))將會含有極性類似于用來提取它們的溶劑且極性次序遞增的化合物。將所述級分干燥以蒸發(fā)溶劑，得到葡萄籽提取物。本領域的那些技術人員應理解許多其它溶劑可用于實行溶劑順序分級分離提取法。
也可使用總水-乙醇提取技術(total hydro-ethanolicextraction technique)以獲得用于本發(fā)明的獨特組合物提取物?？偠灾?，這稱為一次性提取(lump-sum extraction)。該方法所產(chǎn)生的提取物包含在提取材料中存在的多種植物化學成分，包括脂溶物和水溶物。在收集提取溶液之后，將溶劑蒸發(fā)，得到提取物。在一個實施方案中，可使用該技術提取石榴。
總乙醇提取法也可用于本發(fā)明。該技術使用乙醇作為溶劑，而不是水-乙醇(hydro-ethanol)。該提取技術產(chǎn)生的提取物除包括水溶性化合物之外還可包括脂溶性的和/或親脂化合物。綠茶提取物可使用該技術獲得。
可用來獲得用于本發(fā)明提取物的提取技術的另一實例是超臨界流體二氧化碳萃取法(SFE)。在該提取方法中，被提取材料不暴露于任何有機溶劑。相反，提取溶劑為超臨界條件(＞31.3℃和＞73.8巴)下的二氧化碳，含或不含改性劑。本領域技術人員應理解可改變溫度和壓力條件以獲得最好提取物產(chǎn)量。該技術產(chǎn)生脂溶性的化合物和/或親脂化合物提取物，類似于上述總己烷和醋酸乙酯提取技術。
本領域的那些技術人員應理解有許多其它提取方法，在本領域中已知的和在各種專利和出版物中描述的提取方法都可用來獲得用于實踐本發(fā)明提取物。例如，在以下文獻中描述的提取方法可用于實踐本發(fā)明Murga等，″使用超臨界的二氧化碳和乙醇的混合物從葡萄籽中提取天然復合酚類和鞣質(zhì)?！?“Extraction of naturalcomplex phenols and tannins from grape seeds by using supercriticalmixtures of carbon dioxide and alcohol.”)J.Agric Food Chem.2000年8月48(8)3408-12；Hong等，″葡萄籽中酚類化合物微波輔助提取?！?“Microwave-assisted extraction of phenolic compounds from grapeseed.”)Nat Prod Lett.2001；15(3)197-204；Ashraf-Khorassani等，″通過使用基于CO2流體的單一系統(tǒng)將葡萄籽順序分級分離成油、多酚、和原花青素?！?“Sequential fractionation of grape seeds into oils，polyphenols，and procyanidins via a single system employing CO2-basedfluids.”)J.Agric Food Chem.，2004年5月；52(9)2440-4，這些文獻通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明的組合物
本發(fā)明的組合物可在可接受的載體中配制，并可制備、包裝和貼簽，用于增加或刺激骨生長，抑制、減少、或預防骨再吸收，增加骨強度，改善骨結(jié)構(gòu)，改善骨構(gòu)造，或各種骨病癥的治療、預防或處理，所述骨病癥包括但不限于骨折、骨質(zhì)疏松癥、牙周病、轉(zhuǎn)移性骨病、和溶骨性骨病。
在一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長的組合物，該組合物包含以下中的至少兩種的組合脫水槲皮素、二水合槲皮素、地黃(Rehmannia sp.)提取物、西伯利亞人參提取物、槐(Sophorajaponica)提取物、甘草提取物、和依普黃酮，其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達。
在另一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加骨生長的組合物，該組合物包含以下中的至少兩種的組合脫水槲皮素、二水合槲皮素、地黃(Rehmannia sp.)提取物、西伯利亞人參提取物、槐(Sophorajaponica)提取物、甘草提取物、和依普黃酮，其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達，并還其中，假如存在下列組分的話，那么脫水槲皮素或二水合槲皮素，則占約10-1000mg，更優(yōu)選占約200-750mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；地黃(Rehmannia sp.)提取物占約10-1000mg，更優(yōu)選占約100-900mg，更優(yōu)選占約200-800mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；西伯利亞人參提取物占100-800mg，更優(yōu)選占約200-750mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；槐(Sophora japonica)提取物占10-1000mg，更優(yōu)選占約100-900mg，更優(yōu)選占約200-800mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；甘草提取物占約10-500mg，更優(yōu)選占約25-450mg，更優(yōu)選占約50-400mg，更優(yōu)選占約75-350mg，更優(yōu)選占約100-300mg，更優(yōu)選占約125-250mg，更優(yōu)選占約25-175mg；而依普黃酮占200-700mg，更優(yōu)選占約250-650mg，更優(yōu)選占約300-600mg，更優(yōu)選占約400-500mg，更優(yōu)選占約600mg。
在另一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長的組合物，該組合物包含脫水槲皮素、二水合槲皮素、西伯利亞人參提取物、槐(Sophora japonica)提取物、和甘草提取物的組合，其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達，并還其中脫水槲皮素或二水合槲皮素占約10-1000mg，更優(yōu)選占約200-750mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；西伯利亞人參提取物占約100-800mg，更優(yōu)選占約200-750mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；槐(Sophora japonica)提取物占約10-1000mg，更優(yōu)選占約100-900mg，更優(yōu)選占約200-800mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；而甘草提取物占10-500mg，更優(yōu)選占約25-450mg，更優(yōu)選占約50-400mg，更優(yōu)選占約75-350mg，更優(yōu)選占約100-300mg，更優(yōu)選占約125-250mg，更優(yōu)選占約25-175mg。
在另一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長的組合物，該組合物包含以下的組合約10-1000mg的脫水槲皮素、二水合槲皮素，更優(yōu)選約250-750mg，更優(yōu)選約300-700mg，更優(yōu)選約400-600mg，更優(yōu)選約500mg的脫水槲皮素、二水合槲皮素；約100-800mg的西伯利亞人參，更優(yōu)選約200-750mg，更優(yōu)選約300-700mg，更優(yōu)選約400-600mg，更優(yōu)選約500mg的西伯利亞人參；和約10-500mg的甘草提取物，更優(yōu)選約25-450mg，更優(yōu)選約50-400mg，更優(yōu)選約75-350mg，更優(yōu)選約100-300mg，更優(yōu)選約125-250mg，更優(yōu)選約25-175mg的甘草提取物，其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達。
在還一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長的組合物，該組合物包含脫水槲皮素或二水合槲皮素、西伯利亞人參提取物、和甘草提取物的組合，其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達，并還其中脫水槲皮素或二水合槲皮素、西伯利亞人參提取物、和甘草提取物占等份量，更優(yōu)選其中西伯利亞人參提取物以脫水槲皮素或二水合槲皮素量的1/2的量存在，甘草提取物以脫水槲皮素或二水合槲皮素量的1/10的量存在。
在另一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長的組合物，該組合物包含脫水槲皮素或二水合槲皮素、和西伯利亞人參提取物的組合，其中脫水槲皮素或二水合槲皮素占該組合物的約10-75％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約50％w/w，西伯利亞人參提取物占該組合物的約10-75％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約50％w/w，其中脫水槲皮素或二水合槲皮素和西伯利亞人參提取物的組合增加BMP-2的基因或蛋白表達。
在還另一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長的組合物，該組合物包含以下中的至少兩種的組合脫水槲皮素、二水合槲皮素、西伯利亞人參提取物、槐(Sophora japonica)提取物、和甘草提取物，其中假如存在下列組分的話，那么脫水槲皮素或二水合槲皮素占該組合物的約10-75％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約50％w/w；西伯利亞人參提取物占該組合物的約10-75％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約50％w/w；槐(Sophora japonica)提取物占該組合物的約1-50％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約2-15％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約5-10％w/w；而甘草提取物占該組合物的約1-50％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約2-15％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約5-10％w/w，還其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達。
在還一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長的組合物，該組合物包含以下的組合約10-1000mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素，更優(yōu)選約250-750mg，更優(yōu)選約300-700mg，更優(yōu)選約400-600mg，更優(yōu)選約500mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素；和約10-500mg的甘草提取物，更優(yōu)選約20-125mg，更優(yōu)選約20-100mg，更優(yōu)選約25-75mg，更優(yōu)選約50mg的甘草提取物，其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達。
在另一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長的組合物，該組合物包含以下的組合約10-1000mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素，更優(yōu)選約250-750mg，更優(yōu)選約300-700mg，更優(yōu)選約400-600mg，更優(yōu)選約500mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素；和約100-800mg的西伯利亞人參提取物，更優(yōu)選約200-750mg，更優(yōu)選約300-700mg，更優(yōu)選約400-600mg，更優(yōu)選約500mg的西伯利亞人參提取物，其中脫水槲皮素或二水合槲皮素、和西伯利亞人參提取物的組合增加BMP-2的基因或蛋白表達。
在還一個實施方案中，本發(fā)明為在受試者中增加或刺激骨生長的方法，該方法包括給予該受試者包含以下中的至少兩種的組合的組合物脫水槲皮素、二水合槲皮素、地黃(Rehmannia sp.)提取物、地黃(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亞人參提取物、槐(Sophorajaponica)提取物、甘草提取物、和依普黃酮，其中該組合增加受試者的BMP-2的基因或蛋白表達。
本發(fā)明的還一個實施方案是在受試者中增加或刺激骨生長的方法，該方法包括給予該受試者包含以下組合的組合物約10-1000mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素，更優(yōu)選約250-750mg，更優(yōu)選約300-700mg，更優(yōu)選約400-600mg，更優(yōu)選約500mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素；約100-800mg的西伯利亞人參提取物，更優(yōu)選約200-750mg，更優(yōu)選約300-700mg，更優(yōu)選約400-600mg，更優(yōu)選約500mg的西伯利亞人參提取物；和約10-500mg的甘草提取物，更優(yōu)選約25-450mg，更優(yōu)選約50-400mg，更優(yōu)選約75-350mg，更優(yōu)選約100-300mg，更優(yōu)選約125-250mg，更優(yōu)選約25-75mg的甘草提取物，其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達。
本發(fā)明的另一個實施方案是在受試者中增加或刺激骨生長的方法，該方法包括給予該受試者包含以下組合的組合物約10-1000mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素，更優(yōu)選約250-750mg，更優(yōu)選約300-700mg，更優(yōu)選約400-600mg，更優(yōu)選約500mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素；和約10-500mg的甘草提取物，更優(yōu)選約20-125mg，更優(yōu)選約20-100mg，更優(yōu)選約25-75mg，更優(yōu)選約50mg的甘草提取物，其中該組合增加BMP-2的基因或蛋白表達。
本發(fā)明的還一個實施方案是在受試者中增加或刺激骨生長的方法，該方法包括給予該受試者包含以下組合的組合物約10-1000mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素，更優(yōu)選約250-750mg，更優(yōu)選約300-700mg，更優(yōu)選約400-600mg，更優(yōu)選約500mg的脫水槲皮素或二水合槲皮素；和約100-800mg的西伯利亞人參提取物，更優(yōu)選約200-750mg，更優(yōu)選約300-700mg，更優(yōu)選約400-600mg，更優(yōu)選約500mg的西伯利亞人參提取物，其中脫水槲皮素或二水合槲皮素、和西伯利亞人參提取物的組合增加受試者的BMP-2基因或蛋白的表達和/或活性。
在另一個實施方案中，本發(fā)明為用于抑制、減少、或預防骨再吸收的組合物，該組合物包含石榴提取物和以下天然的、植物來源的提取物中的至少一種西伯利亞人參提取物、銀杏(Ginkgo biloba)提取物、綠茶提取物、槐(Sophora japonica)提取物、地黃(Rehmannia sp.)提取物、葡萄籽提取物、當歸提取物、和依普黃酮，其中該組合物抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放，并還其中石榴提取物占約10-2000mg，更優(yōu)選占約300-1700mg，更優(yōu)選占約400-1500mg，更優(yōu)選占約500-1250mg，更優(yōu)選占約600-1000mg，更優(yōu)選占約700-900mg；更優(yōu)選占約500mg；并且假如存在下列組分的話，那么西伯利亞人參提取物占約100-2000mg，更優(yōu)選占約300-1700mg，更優(yōu)選占約400-1500mg，更優(yōu)選占約500-1250mg，更優(yōu)選占約600-1000mg，更優(yōu)選占約700-900mg；更優(yōu)選占約500mg；銀杏(Ginkgo biloba)提取物占約10-1000mg，更優(yōu)選占約100-900mg，更優(yōu)選占約200-800mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；綠茶提取物占約300-700，更優(yōu)選占約350-650mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；槐(Sophora japonica)提取物占10-1000mg，更優(yōu)選占約100-900mg，更優(yōu)選占約200-800mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；地黃(Rehmannia sp.)提取物占約10-1000mg，更優(yōu)選占約100-900mg，更優(yōu)選占約200-800mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；葡萄籽提取物占35-250mg，更優(yōu)選占約50-150mg，更優(yōu)選占約75-125mg；當歸提取物占約10-1000mg，更優(yōu)選占約100-900mg，更優(yōu)選占約200-800mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；而依普黃酮占約400-700mg，更優(yōu)選占約450-650mg，更優(yōu)選占約500-600mg，更優(yōu)選占約600mg；其中該組合抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生和/或釋放或抑制鈣從骨的釋放。
在還一個實施方案中，本發(fā)明為用于抑制、減少、或預防骨再吸收的組合物，該組合物包含以下的組合約10-2000mg的石榴提取物，更優(yōu)選約400-1700mg，更優(yōu)選約500-1500mg，更優(yōu)選約600-1250mg，更優(yōu)選約700-1000mg，更優(yōu)選約800-900mg的石榴提取物；約35-250mg的葡萄籽提取物，更優(yōu)選約50-150mg，更優(yōu)選約75-125mg的葡萄籽提取物；約400-700mg的依普黃酮，更優(yōu)選約450-650mg，更優(yōu)選約500-600mg，更優(yōu)選約600mg的依普黃酮；和約300-700mg的綠茶提取物，更優(yōu)選約350-650mg，更優(yōu)選約400-600mg，更優(yōu)選約500mg的綠茶提取物，其中該組合抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放或者抑制鈣從骨的釋放。
在另一個實施方案中，本發(fā)明為用于抑制、減少、或預防骨再吸收的組合物，該組合物包含以下的組合約10-2000mg的石榴提取物，更優(yōu)選約400-1700mg，更優(yōu)選約500-1500mg，更優(yōu)選約600-1250mg，更優(yōu)選約700-1000mg，更優(yōu)選約800-900mg的石榴提取物；約35-250mg的葡萄籽提取物，更優(yōu)選約50-150mg，更優(yōu)選約75-125mg的葡萄籽提取物；和約400-700mg的依普黃酮，更優(yōu)選約450-650mg，更優(yōu)選約500-600mg，更優(yōu)選約600mg的依普黃酮，其中該組合抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放或者抑制鈣從骨的釋放。
在另一個實施方案中，本發(fā)明為用于抑制、減少、或預防骨再吸收的組合物，該組合物包含石榴提取物、葡萄籽提取物、和依普黃酮的組合，其中葡萄籽提取物占約1/10，石榴提取物和依普黃酮占約400-700mg，更優(yōu)選占約450-650mg，更優(yōu)選占約500-600mg，更優(yōu)選占約600mg，其中該組合抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放或者抑制鈣從骨的釋放。
在還一個實施方案中，本發(fā)明為用于抑制、減少、或預防骨再吸收的組合物，該組合物包含石榴提取物、葡萄籽提取物、依普黃酮、和綠茶提取物中的至少兩種的組合，其中，假如存在下列組分的話，那么石榴提取物占該組合物的約25-100％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約30-90％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約40-80％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約45-60％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約50％w/w；葡萄籽提取物占該組合物的約1-25％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約2-15％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約5-10％w/w；依普黃酮占該組合物的約25-100％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約30-90％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約40-80％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約45-60％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約50％w/w；而綠茶提取物占該組合物的約1-25％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約2-15％w/w，更優(yōu)選占該組合物的約5-10％w/w，還其中該組合抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放或者抑制鈣從骨的釋放。
本發(fā)明的另一個實施方案是在受試者中抑制、減少、或預防骨再吸收的方法，該方法包括給予該受試者包含天然的、植物來源的提取物的組合物，該提取物包括以下提取物中的至少一種石榴提取物、西伯利亞人參提取物、銀杏(Ginkgo biloba)提取物、綠茶提取物、槐(Sophora japonica)提取物、地黃(Rehmannia sp.)提取物、葡萄籽提取物、當歸提取物、和依普黃酮，其中該組合物抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放或者抑制鈣從骨的釋放。
在還一個實施方案中，本發(fā)明為在受試者中抑制、減少、或預防骨再吸收的方法，該方法包括給予該受試者包含以下的組合的組合物約10-2000mg的石榴提取物，更優(yōu)選約400-1700mg，更優(yōu)選約500-1500mg，更優(yōu)選約600-1250mg，更優(yōu)選約700-1000mg，更優(yōu)選約800-900mg的石榴提取物；約35-250mg的葡萄籽提取物，更優(yōu)選約50-150mg，更優(yōu)選約75-125mg的葡萄籽提取物；約400-700mg的依普黃酮，更優(yōu)選約450-650mg，更優(yōu)選約500-600mg，更優(yōu)選約600mg的依普黃酮；和約300-700mg的綠茶提取物，更優(yōu)選約350-650mg，更優(yōu)選約400-600mg，更優(yōu)選約500mg的綠茶提取物，其中該組合抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放或者抑制鈣從骨的釋放。
在還一個實施方案中，本發(fā)明為在受試者中抑制、減少、或預防骨再吸收的方法，該方法包括給予該受試者包含以下的組合的組合物約10-2000mg的石榴提取物，更優(yōu)選約400-1700mg，更優(yōu)選約500-1500mg，更優(yōu)選約600-1250mg，更優(yōu)選約700-1000mg，更優(yōu)選約800-900mg的石榴提取物；約35-250mg的葡萄籽提取物，更優(yōu)選約50-125mg，更優(yōu)選約75-100mg的葡萄籽提取物；和約400-700mg的依普黃酮，更優(yōu)選約450-650mg，更優(yōu)選約500-600mg，更優(yōu)選約600mg的依普黃酮，其中該組合抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、和/或釋放或者抑制鈣從骨的釋放。
在還一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加刺激骨生長并抑制、減少、或預防骨再吸收的食物增補劑療法，該食物增補劑療法包括第一組合物和第二組合物，該第一組合物包含以下中的至少兩種的組合二水合槲皮素、脫水槲皮素、西伯利亞人參提取物、甘草提取物、和槐(Sophora japonica)提取物，其中該第一組合物的組合增加BMP-2的表達和/或活性；該第二組合物包含以下中的至少兩種的組合石榴提取物、葡萄籽提取物、依普黃酮、和綠茶提取物，其中該第二組合物的組合抑制RANK-L的表達或者抑制鈣從骨的釋放。
在還一個實施方案中，本發(fā)明為用于增加或刺激骨生長并抑制、減少、或預防骨再吸收的食物增補劑療法，該食物增補劑療法包括第一組合物和第二組合物，該第一組合物包含以下中的至少兩種的組合脫水槲皮素、二水合槲皮素、西伯利亞人參提取物、甘草提取物、和槐(Sophora japonica)提取物，其中，假如存在的話，則脫水槲皮素或二水合槲皮素占約10-1000mg，更優(yōu)選占約200-750mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；其中，假如存在的話，則西伯利亞人參提取物占約100-800mg，更優(yōu)選占約200-750mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg；其中，假如存在的話，則甘草提取物占10-500mg，更優(yōu)選占約25-450mg，更優(yōu)選占約50-400mg，更優(yōu)選占約75-350mg，更優(yōu)選占約100-300mg，更優(yōu)選占約125-250mg，更優(yōu)選占約25-175mg；和其中假如存在的話，則槐(Sophora japonica)提取物占約10-1000mg，更優(yōu)選占約100-900mg，更優(yōu)選占約200-800mg，更優(yōu)選占約300-700mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg，并還其中該第一組合物的組合增加BMP-2的表達和/或活性；該第二組合物包含以下中的至少兩種的組合石榴提取物、葡萄籽提取物、依普黃酮、和綠茶提取物，其中，假如存在的話，則石榴提取物占約10-2000mg，更優(yōu)選占約400-1700mg，更優(yōu)選占約500-1500mg，更優(yōu)選占約600-1250mg，更優(yōu)選占約700-1000mg，更優(yōu)選占約800-900mg；其中，假如存在的話，則葡萄籽提取物占約35-250mg，更優(yōu)選占約50-150mg，更優(yōu)選占約75-125mg；其中，假如存在的話，則依普黃酮占約400-700mg，更優(yōu)選占約450-650mg，更優(yōu)選占約500-600mg，更優(yōu)選占約600mg；和其中，假如存在的話，則綠茶提取物占約300-700mg，更優(yōu)選占約350-650mg，更優(yōu)選占約400-600mg，更優(yōu)選占約500mg，并還其中該第二組合物的組合抑制RANK-L的表達或者釋放或抑制鈣從骨的釋放。
給藥方式
本發(fā)明的組合物可全身給藥或局部給藥。對于全身使用，本發(fā)明的組合物經(jīng)配制用于依照常規(guī)方法的胃腸外(例如，靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或經(jīng)皮)遞藥或腸內(nèi)(例如，經(jīng)口或直腸)遞藥。靜脈內(nèi)給藥可以通過一系列的注射或通過較長時間內(nèi)的連續(xù)輸注。注射給藥或其它途徑的分開間隔給藥可以按從每周一次到每天三次的間隔來進行行。備選地，本文所公開的組合物可以以循環(huán)的方式(給予所公開的組合物；隨后不給藥；隨后再給予所公開的組合物；等)來給予?？梢赃B續(xù)進行治療直至達到所需效果。備選地，本發(fā)明的組合物的給藥可以是持續(xù)的，因此它是預防性給藥，而不是用于治療的給藥。
一般而言，本發(fā)明的組合物可以包括化妝品上或藥學上可接受的載體，例如鹽水、緩沖鹽水、5％葡萄糖水、含有痕量金屬的硼酸-緩沖鹽水等。本發(fā)明的組合物還可包括一種或多種輔料，例如，維生素A、維生素D、或鈣；防腐劑；增溶劑；緩沖劑；白蛋白以預防小瓶表面上的蛋白質(zhì)損失；潤滑劑；填充劑；穩(wěn)定劑；等。配制方法為本領域熟知的，在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton PA，1990中公開，該文獻通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明內(nèi)使用的組合物可為無菌的、無熱原的液體溶液或混懸液、包衣的膠囊、栓劑、凍干粉劑、透皮貼劑的形式或本領域已知的其它形式。局部給藥可通過在受傷或損傷部位注射、或通過在該部位的固體載體的插入或附著、或通過粘性液體的直接、局部施用等來進行。對于局部給藥，遞藥載體優(yōu)選提供用于使骨或軟骨生長的基質(zhì)，并更優(yōu)選為可以被受試者吸收而沒有不良反應的載體。
水懸浮液可包含本發(fā)明提取物成分與以下物質(zhì)的混合物藥理學上可接受的賦形劑例如維生素A、維生素D、和鈣；懸浮劑例如甲基纖維素；和潤濕劑例如軟磷脂、溶血卵磷脂或長鏈-脂肪醇。所述水懸浮液還可包含依照工業(yè)標準的防腐劑、著色劑、矯味劑、甜味劑等。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物以丸劑、片劑、粉末、條、食物、飲料、錠劑等形式口服。另外，本發(fā)明的組合物可作為干燥的或粉狀的制品存在，以在使用之前用水或其它合適的溶媒重新配制。可用以下藥學上可接受的添加劑通過常規(guī)方法制備液體制劑例如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；無水載體(例如，扁桃仁油、油酯、或經(jīng)分餾的植物油)；和防腐劑(例如，對羥基苯酸甲酯或?qū)αu基苯酸丙酯或山梨酸)。
當以飲料的形式給藥時，本發(fā)明的組合物可基于水、基于奶、基于茶、基于果汁、或它們的一些組合。
本發(fā)明的組合物也可以通過常規(guī)方法用以下藥學上可接受的賦形劑制備的固體形式口服例如粘合劑(例如，預膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或硅石)；崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或淀粉羥基乙酸鈉)；或潤濕劑(例如，十二烷基硫酸鈉)?？赏ㄟ^本領域熟知的方法包衣該固體。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物可采取雙片型硬殼膠囊(two-piece hard shell capsule)、軟膠膠囊、或粉末的形式，以溶于用于口服的液體中。可適當?shù)嘏渲朴糜诳诜闹苿?，以實現(xiàn)活性化合物的控釋。
口服給藥的本發(fā)明組合物還可包含增稠劑，所述增稠劑包括黃原膠、羧甲基-纖維素、羧乙基-纖維素、羥丙基-纖維素、甲基-纖維素、微晶纖維素、淀粉、糊精、發(fā)酵乳清、豆腐、麥芽糖糊精、多元醇包括糖醇(例如，山梨醇和甘露醇)、碳水化合物(例如乳糖)、藻酸丙二醇酯、結(jié)冷膠(gellan gum)、瓜爾豆膠(guar)、果膠、黃蓍膠、阿拉伯膠、槐豆膠、阿拉伯膠、明膠，以及這些增稠劑的混合物。這些增稠劑典型地以至多約0.1％的水平包含在本發(fā)明的制劑中，視所包含的具體增稠劑和所需粘性效果而定。
口服給藥的本發(fā)明組合物可以，且典型地將會，含有有效量的一種或多種甜味劑，包括碳水化合物甜味劑和天然的和/或人造的無/低熱量甜味劑。用于本發(fā)明的制劑的甜味劑的量將有所不同，但通常取決于使用的甜味劑的類型和所需的甜度。
除先前描述的制劑之外，該化合物也可配制為持續(xù)的和/或定時釋放的制劑。常見的定時和/或控釋釋放系統(tǒng)包括，但不限于淀粉、滲透泵、或明膠微膠囊。
若有需要，所述組合物可存在于包裝或分配裝置中，該包裝或分配裝置可包含一個或多個含本發(fā)明的組合物的單位劑型。所述包裝可例如包含金屬或塑料薄片，例如泡罩包裝。包裝或分配裝置可附有給藥說明書。
局部(topical and local)施用的本發(fā)明組合物的制劑包括在化妝品上或藥學上合適的載體中的氣溶膠噴霧劑、洗劑、凝膠劑和軟膏劑，所述載體可包含低級脂族醇、聚乙二醇類(polyglycol)例如甘油、聚乙二醇、脂肪酸酯、油和脂肪、和硅酮。該制劑還可包含抗氧化劑例如抗壞血酸或生育酚，和防腐劑例如對羥基苯甲酸酯。
胃腸外制劑尤其包含無菌的或已滅菌的制品。
可提供包含本發(fā)明提取物和任何已知的可注射載體的組合的可注射組合物。這些組合物可含有調(diào)節(jié)滲透壓的鹽。
其它有用的劑型可以通過本領域的那些技術人員充分了解的方法和技術制備，并可包括在制備片劑、膠囊、或液體劑型時使用的附加成分。雖然本文討論了例示性的劑量、給藥頻率、和給藥方法，但這些僅僅是例示性的，并且應理解的是，劑量、給藥頻率、和給藥方式可依照個體消費者或患者的年齡、體重、條件和反應、及所使用的本發(fā)明的具體組合物而改變。
實施例
進行動物試驗不是申請人的策略。然而，申請人通過本發(fā)明的組合物和方法所使用的潛在成分的體外試驗得到了顯著結(jié)果，雖然體外試驗可以提供有用的信息，但是這樣的試驗不能代替動物研究，因為骨作為器官連同控制它的復雜機制不能在實驗室中被模仿。因此，申請人進行了如下所述的幾個動物研究，以確定用于本發(fā)明的組合物和方法的活性。在進行所有的動物研究中，申請人遵循如以下文獻所概述的對動物的操作和人道處理的指南例如，由Food andDrug Administration在1994年4月公布的Guidelines for Preclinical andClinical Evaluation of Agents Used in the Prevention or Treatment ofPostmenopausal Osteoporosis，Division of Metabolic and Endocrine DrugProducts，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。也見World HealthOrganization在1998年公布的Guidelines for Preclinical Evaluation andClinical Trials in Osteoporosis(ISBN號9789241545228)和Wark，JohnD.和Westmore，Ann的Studies of drugs and other measures to preventand treat osteoporosis；可在www.who.int/entity/ageing/publications/noncommunicable/alc_osteoporosis_bhef.pdf-(最后訪問時間2007年10月21日)得到為非專家提供的指南，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
實施例1BMP-2的啟動子、基因、和蛋白質(zhì)的表達/活性
使用具有1％青霉素/鏈霉素和1％谷酰胺的10％FCS的α-MEM培養(yǎng)2T3-BMP2-螢光素酶細胞，并每周分出1/5一次，所述細胞為轉(zhuǎn)染有與螢光素酶標記基因連接的BMP-2啟動子的鼠成纖維細胞。以5×103細胞/100μl/孔的細胞密度將該細胞接種到微量滴定板中。經(jīng)過5％CO2 37℃下的24小時預孵育期允許細胞粘附和穩(wěn)定。去除培養(yǎng)基，用50μl的4％FCS的α-MEM代替。將包含待測試化合物或因子(2x)的50μl無血清培養(yǎng)基(Serum Free)(0.1％BSA)加入每個孔中。最終體積為100ul，最終血清濃度為2％FCS。使用的常規(guī)陽性對照是以重組人BMP2(″rhBMP2″)或中國倉鼠卵巢-BMP2(″CHO-BMP2″)為條件的培養(yǎng)基。然后在37℃、5％CO2下將所處理的細胞孵育48小時。然后去除培養(yǎng)基，用PBS將細胞洗滌3次。將過量的PBS從孔中去除，將100μl的細胞培養(yǎng)物溶解劑(Promega #E153A)加入到每一孔中，并孵育至少10分鐘。將10μl的細胞溶解產(chǎn)物加入到含100μl有底物(Promega # E152A)的螢光素酶測定緩沖液的96孔白色發(fā)光測定板(Dynatech Labs # 0010107100)中。使用Dynatech ML2250自動96孔發(fā)光計讀取螢光素酶活性。然后將該數(shù)據(jù)表示為螢光素酶活性/孔的百分數(shù)或者螢光素酶活性/μg蛋白質(zhì)的百分數(shù)。
測試以下化合物激活BMP-2的啟動子的能力槲皮素、地黃(Rehmannia sp.)提取物、地黃(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亞人參提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、依普黃酮、和cal-z-bone。測試的結(jié)果和濃度報道于下面的表1中 表1BMP2的啟動子分析(與對照的比例)
在表1中，R-1＝地黃(Rehmannia sp.)提取物(EUL)，R-2＝地黃(Rehmannia sp.)提取物(Draco)，R-3＝地黃(Rehmannia sp.)根(NuPharma)，SFJ＝槐角(Sophora fructus japonica)，SJ＝槐(Sophorajaponica)(NuPharma)，SG＝西伯利亞人參，Q＝槲皮素，I＝依普黃酮，L＝甘草，CZB＝Cal-Z-bone。*注意如果倍數(shù)值為2或更大，那么該處理顯著地激活BMP-2啟動子。如果倍數(shù)值小于2，那么該處理對BMP-2啟動子無效。因此，依照該試驗，二水合槲皮素和依普黃酮是BMP-2啟動子的最有效激活劑。
也可能使用類似于上述用于測試BMP-2啟動子活性的那些測定法來測試BMP-2基因表達和蛋白表達。具體而言，對于基因表達而言，在37℃和5％CO2下將人骨肉瘤細胞系，MG-63(ATCC#CRL-1427)維持在含酚紅的MEM(如由ATCC所推薦的)中。在實驗之前24小時，將3×105個細胞接種到不含酚紅的MEM中的12孔板中。對于每一實驗，按10、1、和0.1μg/ml的處理濃度，用試驗提取物處理細胞。經(jīng)過夜孵育之后，使用常規(guī)的基于trizol/異硫氰酸胍的溶胞作用提取RNA。分離得到的RNA用不含RNA酶的DNA酶I消化，以去除任何DNA污染物，然后依照制造廠家(Stratagene)的說明書，使用隨機六聚體以及寡脫氧胸苷(oligo(dT))引物逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。使用對BMP-2的FAM-標記的特異性引物和對18S rRNA的HEX-標記的特異性引物(Invitrogen)進行定量實時PCR測定。所有的反應進行三個重復，并使用Applied Biosystems(2001)建立的比較Cτ方法，計算處理的樣品中的mRNA與未處理的樣品中的mRNA比較的相對量。2倍或更大的基因表達變化被認為是顯著的。
為了測量BMP-2蛋白表達，以1×104細胞/孔的密度將Hu09細胞接種到96孔培養(yǎng)板中，用補充了10％FCS的a-MEM培養(yǎng)24小時。用不同的蛋白酶體抑制劑將細胞處理24小時。在孵育之后，將經(jīng)以上條件處理的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移入微量離心管中，于14,000rpm離心2-3分鐘，以去除細胞碎屑。然后使用標準BMP-2酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(R & D ELISA KIT DBP200)測定上清液中BMP-2蛋白的濃度。將重組體hBMP-2(R & D)用作標準。
測試以下化合物增加BMP-2的基因表達和蛋白表達的能力槲皮素、地黃(Rehmannia sp.)提取物、地黃(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亞人參提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、依普黃酮、和cal-z-bone。在蛋白表達測定中測試的結(jié)果和濃度報道于下面的表2中。
表2BMP-2的蛋白表達分析
在表2中，R-1＝地黃(Rehmannia sp.)提取物(EUL)，R-2＝地黃(Rehmannia sp.)提取物(Draco)，R-3＝地黃(Rehmannia sp.)根(NuPharma)，SFJ＝槐角(Sophora fructus japonica)，SJ＝槐(Sophorajaponica)(NuPharma)，SG＝西伯利亞人參，Q＝槲皮素，I＝依普黃酮，L＝甘草，CZB＝CaI-Z-bone。*注意如果倍數(shù)值為2或更大，那么該處理顯著地激活BMP-2蛋白表達。如果倍數(shù)值小于2，那么該處理對BMP-2的蛋白表達無效。
在基因表達測定中測試的結(jié)果和濃度于下面的表3中列出。2倍變化或更多的基因表達增加被認為是顯著的。
表3BMP-2的基因表達分析，10μg/ml
基因表達測定的另外結(jié)果于下面的表4中列出。在表4中，Q＝槲皮素，SG＝西伯利亞人參，SJ＝槐(Sophora japonica)，L＝甘草。2倍的基因表達增加或更多被認為是顯著的。發(fā)現(xiàn)在槲皮素對甘草的比值為10∶5即2∶1和10∶10即1∶1時超過單獨的槲皮素，起協(xié)同作用。
表4BMP-2的基因表達分析
實施例2測量骨生長的顱蓋分析
從4天大的瑞士白鼠上切除新生鼠顱蓋，放入BGJ培養(yǎng)基(Sigma)，沿中縫(midline suture)切成兩半。將一毫升補充了0.1％牛血清白蛋白(BSA)的BGJ培養(yǎng)基加入到12孔組織培養(yǎng)板(Costar)的每一孔，其中添加了相關的因子或載體。將每一半顱蓋放在位于培養(yǎng)基上方的培養(yǎng)基/空氣接觸面上的不銹鋼網(wǎng)格(stainless steel grid)上。通常每個實驗組使用4塊骨頭?？梢杂弥亟MBMP-2(5μg/ml)、FGF(100ng/ml)或胰島素(10μg/ml)作為骨形成的陽性刺激物。在第0天(解剖那天)加入待測試的因子，在24和96小時時改變培養(yǎng)基(如果需要7天的試驗)。將顱蓋保持在37℃的濕潤空氣(5％CO2)中。在培養(yǎng)期之后，然后將顱蓋取出，在10％福爾馬林中固定(fixed)過夜。然后在14％EDTA中將顱蓋脫鈣過夜，然后包埋在石蠟中。然后使用標準切片機，沿中縫進行切片，以顯示冠縫和在該縫后方的區(qū)域。最初在兩個連續(xù)的400nm深處取四微米切片。將切片置于涂布的載玻片上(Superfrost plus，F(xiàn)isherScientific，Pittsburgh，PA)，用蘇木精和曙紅染色。在矢狀縫后方的切片中測定總骨面積和新骨面積(表示為mm2)、縫厚度(mm)、和襯在骨表面的細胞數(shù)目。使用Osteomeasure系統(tǒng)(Osteometries INC，Atlanta，GA)進行組織形態(tài)計量學分析。
在該測定中測試的提取物包括槐角(Sophora fructusjaponica)提取物、西伯利亞人參提取物、二水合槲皮素、脫水槲皮素、依普黃酮、甘草、和Cal-Z-bone。顱蓋試驗中提取物的測試結(jié)果于下面的表5和表6中報道。在表5中，SJ＝槐角(Sophora fructus japonica)，SG＝西伯利亞人參，Q＝槲皮素，I＝依普黃酮，L＝甘草，CZB＝Cal-Z-Bone。BMP-2和辛伐他汀(Simvastatin)被用作陽性對照。在下面的表格中，上標a(a)指該結(jié)果顯著不同(p＜0.05)于空白試樣(濃度為0μg/ml)。p＜0.05的差異(即其中誤差界限小于或等于5％)被認為是顯著的。表5中的前四行數(shù)據(jù)基于各種比值的成分的混合物，例如″Q∶SG″下的1∶1表示二水合槲皮素和西伯利亞人參以相同的量存在于該混合物中。
表5顱蓋分析結(jié)果-骨形成
顯然，上述結(jié)果表明槲皮素和提取物之間的協(xié)同作用不止是累加的。具體而言，假定是累加作用，那么預期在1μg/ml的濃度下有約12mm2×10-3的新骨形成。因此，在50％濃度的槲皮素和西伯利亞人參提取物時，預期結(jié)果為約6mm2×10-3，但上述結(jié)果顯示槲皮素和西伯利亞人參提取物的組合實現(xiàn)約13mm2×10-3的新骨形成。
使用用于本發(fā)明組合物提取物的各種組合重復上述顱蓋試驗。對于表6，Q＝槲皮素，SG＝西伯利亞人參，L＝甘草。在下面的表格中，上標a(a)指該結(jié)果顯著不同(p＜0.05)于空白試樣(濃度為0μg/ml)。p＜0.05的差異被認為是顯著的。每一制劑的結(jié)果于下面的表6中報道。
表6顱蓋分析結(jié)果-由提取物組合激發(fā)的骨形成
實施例3測量骨生長的體內(nèi)研究
在涉及約12-14周齡、近似體重為200-250克的雌性、完整大鼠的體內(nèi)試驗中測試三種不同的配方。配方1包括以下劑量的脫水槲皮素和甘草，250mg槲皮素250mg甘草的乙醇提取物和500mg槲皮素500mg甘草的乙醇提取物。配方2包括以下劑量脫水槲皮素和甘草，250mg槲皮素125mg甘草的乙醇提取物；500mg槲皮素250mg甘草的乙醇提取物；和1000mg槲皮素500mg甘草的乙醇提取物。配方3包括以下劑量的脫水槲皮素和甘草，1000mg槲皮素200mg甘草的乙醇提取物。該研究持續(xù)35天。試驗了八個單獨組別的大鼠，每組15只大鼠。試驗的八組大鼠中的兩組為作對照組進行檢測。一組是安慰劑對照組，另一組接受50μg/kg(10μg/200g)/每周3次的甲狀旁腺素。甲狀旁腺素，被稱為同化激素類藥，用作陽性對照。見，例如，Turner等，″Disuse in adult male rats attenuates thebone anabolic response to a therapeutic dose of parathyroid hormone.″J.Appl Physiol.2006，第101卷881-886，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
下面的表7標明給予8個試驗組中每一組的配方。表7中的劑量基于推薦的人每日劑量。使用FDA劑量換算公式(人等效劑量(HED，mg/kg)＝大鼠劑量mg/kg×(大鼠重量kg/人重量kg)0.33)，以將人劑量轉(zhuǎn)換至大鼠劑量。
HED＝大鼠NOAEL×(W-大鼠/W-人)(1-b)，b＝0.67。
在表7中，Q＝槲皮素，L＝甘草。
表7在體內(nèi)研究中測試的配方
使用雌性、Sprague Dawley大鼠(每只200-250gm，約12-14周齡)。以15gm/天喂養(yǎng)動物，包括安慰劑飲食或上述配方中的一種，從實驗的開始持續(xù)35天。每天早上以15克/大鼠/天的比例對大鼠喂食。在整個實驗過程中，允許大鼠自由獲取水，并將其關養(yǎng)在合適的籠子中。在整個實驗期間允許無限制的活動，持續(xù)35天。
通過測量結(jié)果評估所述配方對骨形成的作用，該測量結(jié)果包括生物力學測量(以評估骨強度與功能信息)、微-CT(以分析實際的骨質(zhì)量(bone quality)和功能信息)、和組織形態(tài)學測量(以分析骨質(zhì)量和功能信息)。實施組織形態(tài)學測量的方法在Pa Revell，″骨的組織形態(tài)學″(“Histomorphometry of Bone”)J.Cline.Pathol.，1983年，第36卷1321-1331中描述，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。使用的術語和單位是由the Histomorphometry Nomenclature Committee of theAmerican Society for Bone and Mineral Research推薦的。實施微CT測量的方法在以下文獻中描述Jiang等，″動物骨骼3D結(jié)構(gòu)的微CT和微MR影像″(“Micro CT and Micro MR imagining of 3D architectureof animal skeleton.”)，J.Musculoskel Neuron Interact.2000.第1卷45-51，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。在處理35天之后測定這些測量結(jié)果。
在處理之后的第35天處死每一組中的六只動物。股骨用于組織形態(tài)學分析。為了測定不同配方對骨形成的作用，通過組織形態(tài)學技術評估骨小梁體積(trabecula bone volumn)、小梁細胞數(shù)目(trabecular cell number)和小梁間距(trabecular separation)。在下面的表8中，上標a(a)指該結(jié)果顯著不同于(p＜0.05)安慰劑組(空白處理)。p＜0.05的差異被認為是顯著的。如下面的表8所示，與安慰劑組相比，陽性對照組即PTH(旁甲狀腺素)顯示在用PTH處理之后骨體積顯著增加(55.83％)、梁細胞數(shù)目顯著增加(19.57％)、小梁間距減少(38.30％)。同樣地，與安慰劑組相比，給予組3的配方表明骨體積顯著增加(47.59％)、小梁細胞數(shù)目顯著增加(24.19％)、小梁間距減少(23.52％)，其效果可比得上PTH處理。
表8組織形態(tài)學測量結(jié)果
表8說明給予組5的配方與安慰劑相比顯示骨小梁骨體積有顯著的差異(P＜0.05)。
此外，表8報道了對骨小梁骨厚度的測量。數(shù)值更高的骨厚度表明骨中有更大量的礦物質(zhì)沉積，可以引起骨量增加。與安慰劑組相比，給予組3的配方顯著地增加骨小梁厚度(13.04％)，其效果可比得上PTH處理(7.35％)。
骨礦物質(zhì)沉積率(bone mineral apposition rate)(MAR)，也在表8中報道，通過測量平均標記間距除以兩次給予flurorchrome之間的時間間隔(5天)來測定。更大的骨礦物質(zhì)沉積率(或礦化表面)意味著有更多的新骨沉積。該結(jié)果應與骨小梁厚度結(jié)果相對應。實際上，經(jīng)35天的處理之后，與安慰劑組相比，給予組3的配方顯示骨礦物質(zhì)沉積率顯著增加(26.60％)，其效果可比得上PTH處理(28.51％)。
表8另外提供骨形成率(BFR)的值。BFR由用四環(huán)素(使用表面熒光觀察)標記的骨表面的范圍和其中2種標記(鈣黃綠素和四環(huán)素)所存在的區(qū)域中的標記之間的距離計算，它表示為平方微米每立方微米每天(μm2/mm3/天)。較高的骨形成率意味著可以形成較多的新的骨組織。骨形成率的結(jié)果與觀察到的骨礦物質(zhì)沉積率的變化一致。與安慰劑組相比，給予組3的配方顯示骨形成率顯著增加(51.37％)，其效果可比得上PTH處理(45.83％)。
用于本研究的另一效能測定技術是微-CT測量，微-CT測量可提供實際的骨質(zhì)量、結(jié)構(gòu)和功能信息。該分析的結(jié)果于下面的表9中報道。
對于定量和定性的骨結(jié)構(gòu)評估，從許多參數(shù)例如骨礦物質(zhì)密度(BMD)、骨體積(％骨體積/總體積)、小梁數(shù)目、和小梁間距獲取信息是關鍵的。在這些參數(shù)中，骨體積、小梁數(shù)目、和小梁間距的結(jié)果與骨健康有關。
表9中報道的結(jié)果表明，與安慰劑組相比，給予組2和組5的配方有效地增強成骨細胞發(fā)生，顯著地增加骨礦物質(zhì)密度(BMD)，且它們的效果可比得上PTH處理。結(jié)果還表明，與安慰劑組相比，給予組1、2、和5的配方顯著增加骨體積和小梁細胞數(shù)目，減少小梁間距，且它們的效果可比得上PTH處理。在表9中，上標a(a)表示該結(jié)果顯著不同(p＜0.05)于安慰劑組。p＜0.05的差異被認為是顯著的。
表9微-CT測量結(jié)果
除了骨量和骨體積評價之外，使用兩個不同的參數(shù)對骨強度進行力學測試。一個參數(shù)測量使骨斷裂所需要的最大力，另一個測定骨的剛度(彈性)。測定骨強度和剛度的方法在Sturmer等，″正常的和骨質(zhì)疏松的大鼠干骺端脛骨的標準化彎曲試驗和斷裂試驗雌二醇、睪酮、和雷洛昔芬的作用″(“Standardized Bending and Breaking Testfor the Normal and Osteoporotic Metaphyseal Tibias of the RatEffectof Estradiol，Testosterone，and Raloxifene”)J.Bone and MineralResearch，2006，第21卷(1)89-96中描述，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
在表10中，結(jié)果表明在使骨斷裂所需要的最大力和骨的剛度方面，在包括陽性對照組(PTH)和安慰劑組在內(nèi)的任何處理組之間沒有統(tǒng)計學差異。陽性對照組沒有起作用可能是因為僅以3次/周的頻率施用相對低劑量的PTH。雖然PTH是強效的同化激素類藥，但PTH劑量是經(jīng)過特別地選擇，以提供對骨形成的適度作用而不誘導任何不良反應。
表10生物力學測量結(jié)果
實施例4RANK-L的抑制研究
稱重150-250mg的每一成分，放入15ml錐形底管。使其溶于50％DMSO30％乙醇20％水的溶液，以得到50μg/ml的最終儲液。對于溶劑對照，混合1.5ml DMSO、0.9ml乙醇、和0.6ml水。充分渦旋混勻。在室溫下在水浴中聲處理10分鐘。再次充分渦旋混勻。在新鮮的不含酚紅的培養(yǎng)基中稀釋成分儲液。
在37℃和5％CO2時將人骨肉瘤細胞系，MG-63(ATCC#CRL-1427)維持在含有酚紅的MEM(如ATCC推薦)中。在實驗之前24小時，將3×105個細胞接種到不含酚紅的MEM中的12孔板中。將消耗的培養(yǎng)基從孔中去除，在37℃、5％CO2下用1、0.1、0.01μg/ml的各測試成分或30ng/ml的TGF-β(陽性(+)對照)將MG-63細胞(ATCC編號CRL-1427)預處理4小時。TGF-β的儲液為30μg/ml(得自R & D Systems，目錄編號100-B-001)。
在預處理培養(yǎng)期之后，將10μg/ml的IL-1b(Calbiochem(目錄編號407615)和10μg/ml的儲液，目錄編號407615)加入到細胞培養(yǎng)物中，37℃18小時。去除經(jīng)處理和刺激的細胞的上層培養(yǎng)基，如制造廠商(來自APOTECH，目錄編號APO-54N-016-k101)所述，使用RANK-L ELISA(重復三次)測量總RANK-L蛋白。將得到的蛋白量與經(jīng)培養(yǎng)基(空白)處理刺激的細胞的蛋白量相比，以測定總RANK-L蛋白減少的百分數(shù)。
上述測定方法用于測定以下提取物抑制RANK-L的表達、產(chǎn)生、或釋放的能力銀杏(Ginkgo biloba)提取物、綠茶提取物、槐角(Sophora fructus japonica)提取物、地黃(Rehmannia sp.)提取物、石榴提取物、西伯利亞人參提取物、依普黃酮、葡萄籽提取物、當歸提取物、和槐(Sophora japonica)提取物。該測定的結(jié)果于下面的表11中報道。10％或更多的減少被認為是顯著的。
表11RANK-L蛋白的產(chǎn)生/釋放(相對于未處理的對照)
基于表11報道的結(jié)果，可確定石榴提取物、依普黃酮(Ostivone)、葡萄籽提取物(40％原花色素)和綠茶提取物(40％EGCG)顯示對RANK-L產(chǎn)生/釋放的抑制有積極效應。因此，使用如上所述的RANK-L抑制試驗測試這些成分的各種組合，以確定可以獲得什么水平的RANK-L產(chǎn)生/釋放抑制。結(jié)果于下面的表12中報道。如這些報道說明，發(fā)現(xiàn)10μg/ml的石榴提取物、10μg/ml依普黃酮、1μg/ml葡萄籽提取物、和1μg/ml綠茶提取物的組合是使對響應成骨細胞IL-1B蛋白質(zhì)刺激的RANK-L合成的抑制最大化的配方。該結(jié)果也顯示具有石榴的任何組合一般均效果良好。此外，在該成分之中沒有發(fā)現(xiàn)主要干擾(major interference)。
表12RANK-L抑制
實施例5從石榴分離安石榴甙
將新鮮石榴剝皮以使種子和果皮分離。使用水和乙醇組合(80∶20)分別提取種子、果皮、和果肉。果皮、種子、和果肉中的每一種都產(chǎn)生有安石榴甙提取物，但石榴果皮提取物得到最高水平的安石榴甙。此外，水顯示為用于提取安石榴甙的最好提取溶劑。
實施例6安石榴甙對RANK-L的抑制
使用100％DMSO以100mg/ml從石榴，包括從石榴果皮、外殼、肉果、和種子提取安石榴甙試樣。不去除提取物中的顆粒物質(zhì)。在不含酚紅(雌激素)的MEM和0.1％FBS中稀釋安石榴甙試樣，以降低本底信號至十倍最終濃度。使最終DMSO濃度保持低于0.2％，在處理期間保持恒定。在未處理組中使用DMSO溶劑對照。
以200,000細胞每孔將MG63細胞(ATCC編號CRL-1472)，來源于人的骨肉瘤細胞系接種到10％FBS的不含酚紅的MEM的12孔板中。第二天將培養(yǎng)基改為0.1％FBS的不含酚紅的MEM。將細胞孵育四小時，然后以1、10、和100μg/ml的安石榴甙濃度處理試樣。
在四小時的處理之后，將加入IL-1b(Calbiochem(目錄編號407615)，10μg/ml的儲液，目錄編號407615)至3ng/mL的最終濃度。然后允許處理的細胞和刺激物IL-1b在37℃下孵育16小時。
在16小時之后將細胞溶解，用RNasy純化試劑盒(Qiagen)從細胞提取RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，使用2-步驟qRT-PCR試劑(Invitrogen)和4μl的純化的RNA通過qPCR定量。在50μL反應中，在具有1μl的RANK-L基因特異性引物的Stratagene Mx4000中退火溫度為57℃(初始濃度10μM；HLUX3013920，Invitrogen Inc.)。
獲得RANK-L和GAPDH基因表達Ct數(shù)據(jù)。用對GAPDH表達的調(diào)節(jié)來定量RNA。使用RANK-L表達的未處理對照值來評估處理影響。結(jié)果于下面的表13中報道。
表13安石榴甙對RANK-L表達的影響
如表13所示，從石榴提純的安石榴甙以劑量依賴的形式抑制IL-1b刺激的RANK-L基因表達，在100μg/mL時完全抑制RANK-L表達。
實施例7石榴的安石榴甙對IV型膠原酶(MMP9)蛋白表達的抑制。
在含有0.5％BSA的DMEM中共培養(yǎng)角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞。將共培養(yǎng)物暴露于各種濃度的從石榴中提取的安石榴甙(0.1％-10％)中。具體地說，測試濃度為1.0μg/ml、10μg/ml、和100μg/ml的石榴提取物抑制IV型膠原酶蛋白(基質(zhì)金屬蛋白酶-9/MMP9)表達的能力。在暴露于石榴提取物之后，用10ng/ml的IL-1B刺激共培養(yǎng)細胞18小時。在用IL-1B刺激18小時之后，測定培養(yǎng)基中的MMP9濃度，如下面的表14所示。
表14石榴提取物對MMP9(IV型膠原酶)蛋白表達的影響
表14報道的結(jié)果說明在體外，石榴的安石榴甙抑制IL-1B刺激的膠原酶(MMP9)從角質(zhì)形成細胞釋放。這些結(jié)果表明，安石榴甙抑制炎癥-刺激的胞外基質(zhì)的分解。激活的破骨細胞通過分泌基質(zhì)溶解酶(MMP)降低骨強度并增加骨丟失，以分解骨的膠原/磷酸鈣構(gòu)架。期望阻斷對骨膠原/鈣結(jié)構(gòu)的破壞，以維持/改善骨強度和骨結(jié)構(gòu)。增加的骨強度和骨結(jié)構(gòu)的特點在于增加骨礦物質(zhì)密度、增加骨體積、增加小梁細胞數(shù)目、減少小梁間距、改善骨構(gòu)造、增加使斷裂骨所需的最大力、和增加骨的剛度。
實施例8葡萄籽提取物和石榴提取物對溶組織梭菌膠原酶活性的抑制
通過量取100mg的粉末制備樣品。然后通過按順序加入5∶3∶2比值的DMSO∶乙醇∶水制備50mg/ml的總樣品提取物。因此對于100mg的粉末，可使用1ml DMSO、0.6ml乙醇、和0.4ml水。通過渦旋將溶液充分混合，然后在有聲水浴中孵育10分鐘。將樣品由50mg/ml的儲液濃度稀釋至測試濃度。
使用市售的試劑盒(Molecular Probes，Eugene，OR)測定對膠原酶活性的抑制。該試劑盒基于消化用熒光標簽標記的膠原底物的能力。在消化之前，將底物的熒光猝滅(quench)。在暴露于膠原酶之后，底物被切割，猝滅效應終止，結(jié)果熒光增強。首先將樣品(依照上述方法制備)加入到試劑盒提供的膠原酶(0.2單位/ml)中。然后加入熒光底物(50μg/ml)，在室溫下反應孵育1小時。在光吸收酶標儀(platereader)上在495/515nm的激發(fā)/發(fā)射波長處讀取熒光。將數(shù)據(jù)表示為與不添加任何抑制劑的MMP相比的％對照。100％總的酶活性降低被認為是陽性反應。
對于石榴提取物和葡萄籽提取物，均觀察到趨向于膠原酶活性減小的劑量依賴性反應(Table 15)。
激活的破骨細胞通過分泌基質(zhì)消化酶(MMP)而降低骨強度和增加骨丟失，以分解骨的膠原/磷酸鈣構(gòu)架。依據(jù)本文提出的機制，發(fā)現(xiàn)特別是葡萄籽和石榴提取物為膠原酶活性的有效抑制劑。依據(jù)該活性，可獲得膠原產(chǎn)生的凈正平衡，引起骨強度和骨完整性的維持或改善。
表15葡萄籽提取物和石榴提取物對C.溶組織膠原酶活性的抑制
實施例9測量骨再吸收的抑制的顱蓋分析
為了在子宮內(nèi)標記新生小鼠的細胞，用45Ca(25uCi/小鼠)注射懷孕的CD-1雌性小鼠(在按時間計算的第15天)。對4天大的小鼠進行解剖，取出顱蓋(顱骨)，切成兩半。將切開的一半顱蓋置于1ml的BGJ生長培養(yǎng)基(Sigma)中的金屬網(wǎng)格(在表面)上，該BGJ生長培養(yǎng)基包含0.1％BSA且添加有谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素。在37℃下在5％CO2增濕培養(yǎng)器中使骨孵育24小時，然后轉(zhuǎn)移至含有1ml培養(yǎng)基且加有因子(IL-1、PTH和/或化合物)的孔中。在上述條件下將處理過的骨再孵育72小時。在該孵育期之后，取出骨，并放置在含20％TCA的閃爍瓶中1.5小時(以測量保留在骨中的標記的鈣)，然后用閃爍液計數(shù)。此外，也對0.4ml的培養(yǎng)基計數(shù)(以測定從骨釋放的標記的鈣的量)。將結(jié)果表示為45Ca釋放的％，并還可以報道為T/C比值。
對于一些因子和化合物，可以使用該方法的修改。因為大部分破骨細胞在預孵育期之后在顱蓋中形成，所以影響破骨細胞形成的因子在預孵育期間可能具有更大的作用。因此，對于許多化合物而言，將它們包括進預孵育培養(yǎng)基中。
在該試驗中測試提取物包括銀杏(Ginkgo biloba)提取物、綠茶提取物、槐角(Sophora fructus japonica)提取物、地黃(Rehmanniasp.)提取物、石榴提取物、西伯利亞人參、依普黃酮、葡萄籽提取物、和當歸提取物。在顱蓋試驗中測試這些提取物的結(jié)果于下面的表16中報道。
在表16中，R-1＝地黃(Rehmannia sp.)(EUL)，SFJ＝槐角(Sophora fructus japonica)，SG＝西伯利亞人參，SJ＝槐(Sophorajaponica)(NuPharma)，I＝依普黃酮，GB＝銀杏(Ginkgo biloba)，GT＝綠茶，P-1＝石榴提取物，P-2＝石榴提取物(Naturex)，GS＝葡萄籽，DQ＝當歸提取物。在下面的表中，上標a(a)指該結(jié)果顯著不同于(p＜0.05)空白試樣(濃度為0μg/ml)結(jié)果。p＜0.05的差異(即其中誤差界限小于或等于5％)被認為是顯著的。如表16所顯示，石榴、依普黃酮、綠茶提取物、和葡萄籽提取物抑制IL-1b誘導的骨再吸收/鈣釋放。
表16顱蓋的數(shù)據(jù)-骨再吸收/Ca2+釋放的抑制
用本發(fā)明的組合物中有用的提取物的各種組合重復上述顱蓋試驗。每一制劑的結(jié)果于下面的表16中報道。
在表17中，P＝石榴，I＝依普黃酮，GS＝葡萄籽，GT＝綠茶。阿倫膦酸鹽用作陽性對照。在下面的表中，上標a(a)指該結(jié)果顯著不同于(p＜0.05)空白試樣(濃度為0μg/ml)的結(jié)果。p＜0.05的差異(即其中誤差界限小于或等于5％)被認為是顯著的。如表17所示，所有的測試組合抑制IL-1b誘導的骨再吸收/鈣的釋放。
表17顱蓋的數(shù)據(jù)-提取物的組合對骨再吸收/鈣釋放的抑制
實施例10測量對RANK-L的抑制和對骨再吸收的抑制的體內(nèi)研究
在涉及約12-14周齡、近似體重為200-250克的雌性、完整大鼠的體內(nèi)研究中，試驗兩種不同的配方。配方1包括不同劑量的依普黃酮、石榴提取物、和葡萄籽提取物，如在表18中所報道。配方2包括不同劑量的石榴提取物和葡萄籽提取物和固定劑量的依普黃酮，如在表18中所報道。對于每個配方試驗三個劑量。該研究使用8組大鼠、每組15只大鼠，持續(xù)約35天。
下表18標明給予8個試驗組中的每一個的配方。表18中的劑量基于推薦的人劑量，使用FDA換算公式人等效劑量(HED，mg/kg)＝大鼠劑量mg/kg x(大鼠重量kg/人重量kg)0.33，以轉(zhuǎn)換成合適的相應大鼠劑量。
HED＝大鼠NOAEL x(W-大鼠/W-人)(1-b)，b＝0.67。
在表18中，I＝依普黃酮，P＝石榴提取物，GS＝葡萄籽提取物。
表18用于體內(nèi)分析的劑量和配方
為了引入由雌激素禁斷(estrogen withdrawal)引起的快速骨再吸收，在該研究中使用切除卵巢的(OVX)大鼠模型。見，例如Alam等，″紅花籽油在誘導骨質(zhì)疏松癥的切除卵巢的大鼠中的作用″(“Effects of Safflower Seed Oil in Osteoporosis-induced OvariectomizedRats，”)Am.J.Chinese Medicine，2006，第34卷(4)601-612，其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。重要的是評估由卵巢切除步驟引起的骨再吸收的作用，因此在該研究中還包括假手術對照(n＝6)，一組沒有經(jīng)過卵巢切除術的雌性大鼠。
該研究使用隨機化安慰劑作對照的劑量響應設計。將總共120個12-14周齡、體重約200-250克的大鼠(n＝15每組)隨機分配到各組，持續(xù)35天。以15克/天喂養(yǎng)動物，包括安慰劑飲食或上述配方中的一種，從實驗的開始持續(xù)35天。每天早上以15克/大鼠/天的比例對大鼠喂食。對于整個實驗過程，允許大鼠自由獲取水，將其關養(yǎng)在適當?shù)幕\子中。在整個實驗期間允許無限制的活動。
通過測量結(jié)果評價該配方對抗再吸收的效果，所述測量結(jié)果包括DEXA掃描(以測定骨礦物質(zhì)密度)、生物力學測量(以收集骨強度和功能信息)、微-CT測量(以評估實際的骨質(zhì)量和功能信息)、和組織形態(tài)學測量(以評估骨質(zhì)量和功能信息)。Pa Revell，″骨的組織形態(tài)測定術，″(“Histomorphometry of Bone，”)J.Clin.Pathol.，1983.第36卷1321-1331描述了進行組織形態(tài)學測量的方法，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。使用的術語和單位是由the HistomorphometryNomenclature Committee of the American Society for Bone and MineralResearch推薦的。在以下文獻中描述了進行微-CT測量的方法Jiang等，″動物骨骼3D結(jié)構(gòu)的微CT和微MR影像″(“Micro CT and MicroMR imagining of 3D architecture of animal skeleton.”)，J.MusculoskelNeuron Interact.2000.第1卷45-51，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。在35天的處理之后測定這些測量結(jié)果。
DEXA掃描和微-CT測量結(jié)果都表明與假手術對照的(不切除卵巢的)大鼠相比，切除卵巢的(OVX)大鼠中的骨礦物質(zhì)密度大量損失。如使骨斷裂的最大力和骨剛度測量值所表明，骨強度也顯著地降低，OVX大鼠的骨體積/總體積％和小梁細胞數(shù)目也降低。此外，在OVX大鼠中也觀察到小梁間距(小梁彼此之間的平均距離)明顯增加。用阿倫膦酸鹽藥物(已知減少破骨細胞發(fā)生的有效的抗再吸收劑)處理陽性對照組ALD。見，例如，Iwamoto等，″切除卵巢的大鼠中阿倫膦酸鹽和阿法骨化醇對骨松質(zhì)和骨密質(zhì)質(zhì)量和骨力學性質(zhì)的影響的比較″(“Comparative effects of alendronate and alfacalcidol oncancellous and cortical bone mass and bone mechanical properties inovariectomized rats.”)Exp.Anim.2006.第55卷(4)357-67，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。陽性對照組(ALD)的骨礦物質(zhì)密度、骨體積/總體積％、和小梁數(shù)目得到增加，小梁間距得到顯著減小。
用于本研究的一種效能測定技術是微-CT測量，微-CT測量提供實際的骨質(zhì)量、結(jié)構(gòu)和功能信息。如下面表19所示，在35天的處理之后，在預防骨再吸收上，給予組2、3、4、5、和6的配方比安慰劑(空白處理)更有效。骨礦物質(zhì)密度(BMD)、骨體積、小梁數(shù)目和小梁間距的結(jié)果與骨健康有關。上標a(a)指該結(jié)果顯著不同于安慰劑組。p＜0.05的差異被認為是顯著的。
表19組織形態(tài)學測量結(jié)果
在表20中，骨礦物質(zhì)密度的結(jié)果表明給予組2、3、和4的配方有效地降低破骨細胞發(fā)生和增加骨礦物質(zhì)密度。結(jié)果還表明給予組1、2、3、和4的配方有效地減少破骨細胞發(fā)生、增加骨體積、增加小梁細胞數(shù)目和減小小梁細胞間距。上標a(a)指該結(jié)果顯著不同于安慰劑組。p＜0.05的差異被認為是顯著的。
表20DEXA測量結(jié)果
組織形態(tài)學測量也用作測定配方1和2的效能的工具，其中定量來自每組的骨小梁體積。該分析的結(jié)果報道于表21中。上標a(a)表明該結(jié)果顯著不同于安慰劑組。p＜0.05的差異被認為是顯著的。
如表21所示，與安慰劑組相比，配方1引起骨小梁體積顯著增加(61.4％)。在組2(13.5％)和組3(13.1％)中雖然觀察到骨小梁體積增加，但幅度較小。
表21組織形態(tài)學測量結(jié)果
除了骨量和骨體積評價之外，依據(jù)兩個不同的參數(shù)對骨強度進行力學測試。一項測試用以測定使骨斷裂所需的最大力，另一項測試用以測定骨的剛度(彈性)。在Sturmer等，″用于正常的和骨質(zhì)疏松的大鼠干骺端脛骨的標準化彎曲試驗和斷裂試驗雌二醇、睪酮、和雷洛昔芬的作用″“Standardized Bending and Breaking Test for theNormal and Osteoporotic Metaphyseal Tibias of the RatEffect ofEstradiol，Testosterone，and Raloxifene，”J.Bone and Mineral Research，2006.第21卷(1)89-96中描述了測定骨強度和剛度的方法，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。該分析結(jié)果于下面的表22中報道。上標a(a)指該結(jié)果顯著不同于安慰劑組。p＜0.05的差異被認為是顯著的。
表22中列出的結(jié)果表明根據(jù)與安慰劑組相比，給予組2和3的配方1致使斷裂骨所需的最大力增加8.3％和8.1％。相對于安慰劑處理，給予組3的配方1致使骨剛度增加16.0％。
表22生物力學測量結(jié)果
得自DEXA掃描、生物力學測量、微-CT測量、和組織形態(tài)學測量的結(jié)果清楚地說明在雌激素禁斷期間，由石榴和葡萄籽提取物組成的配方1顯示出改善骨結(jié)構(gòu)和構(gòu)造并增加骨強度的能力。
意欲將以上詳細描述視為例證性的而非限制性，并理解以上的權(quán)利要求，包括所有的同等物，意欲定義本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.用于增加骨生長的組合物，所述組合物包含槲皮素和甘草提取物的組合。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合包含約10-1000mg的槲皮素和約10-500mg的甘草提取物。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述組合包含約250mg的槲皮素和約125mg的甘草提取物。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述甘草提取物為乙醇提取物。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述組合物增加骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的啟動子活性、基因表達、或蛋白表達。
6.權(quán)利要求1的組合物，所述組合物還包含西伯利亞人參提取物和槐(Sophora japonica)提取物中的一種或多種。
7.在受試者中增加骨生長的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1的組合物給藥所述受試者。
8.權(quán)利要求7的方法，其中給予權(quán)利要求1的組合物導致以下中的一項或多項骨礦物質(zhì)密度增加、骨體積增加、小梁細胞數(shù)量增加、小梁間距減少、骨厚度增加、骨礦物質(zhì)沉積率增加、骨形成率增加、骨構(gòu)造改善、和骨強度增加。
9.用于增加骨生長的組合物，所述組合物包含以下中的至少兩種的組合槲皮素、西伯利亞人參提取物、槐(Sophora japonica)提取物、和甘草提取物，其中所述組合增加骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的基因表達、啟動子活性、或蛋白表達。
10.在受試者中增加骨生長的方法，所述方法包括將權(quán)利要求9的組合物給予所述受試者。
11.用于抑制骨再吸收的組合物，所述組合物包含石榴提取物和葡萄籽提取物的組合。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述組合還包含依普黃酮。
13.權(quán)利要求11的組合物，其中所述組合包含約10-2000mg的石榴提取物和約35-200mg的葡萄籽提取物。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述組合包含約1250mg的石榴提取物和約125mg的葡萄籽提取物。
15.權(quán)利要求11的組合物，其中所述石榴提取物包含至少一種安石榴甙。
16.權(quán)利要求11的組合物，其中所述組合物抑制、預防或減少RANK-L的釋放或表達。
17.在受試者中抑制骨再吸收的方法，所述方法包括將權(quán)利要求11的組合物給予所述受試者。
18.權(quán)利要求17的方法，其中給予權(quán)利要求11的組合物導致以下中的一項或多項增加骨硬度、增加骨強度、改善骨構(gòu)造和增加骨小梁體積。
19.在受試者中抑制骨再吸收的方法，所述方法包括將權(quán)利要求11的組合物給予所述受試者，其中權(quán)利要求11的組合物抑制、預防或減少RANK-L的釋放或表達。
20.用于增加骨生長和抑制骨再吸收的食物增補劑，所述食物增補劑包含以下的組合槲皮素、甘草提取物；石榴提取物和葡萄籽提取物。
21.權(quán)利要求20的食物增補劑，其中所述組合包含約10-1000mg的槲皮素、約10-500mg的甘草提取物、約10-2000mg的石榴提取物和約35-250mg的葡萄籽提取物。
22.在受試者中增加骨生長和抑制骨再吸收的方法，所述方法包括將權(quán)利要求20的食物增補劑給予所述受試者。
23.權(quán)利要求22的方法，其中將權(quán)利要求20的食物增補劑給予受試者導致以下中的一項或多項骨礦物質(zhì)密度增加、骨體積增加、小梁細胞數(shù)量增加、小梁間距減少、骨厚度增加、骨礦物質(zhì)沉積率增加、骨形成率增加、骨構(gòu)造改善、骨強度增加和骨硬度增加。
全文摘要
本文公開用于增加或刺激骨生長，減少或預防骨再吸收，增加骨強度，改善骨結(jié)構(gòu)，和改善骨構(gòu)造的食物增補劑組合物和方法，該組合物包含第一組合物和第二組合物，該第一組合物包含以下中的至少兩種的組合槲皮素、地黃(Rehmannia sp.)、地黃(Rehmannia sp.)根、西伯利亞人參、槐(Sophora japonica)、甘草和依普黃酮，其中該第一組合物的組合增加骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的基因、啟動子或蛋白表達；而該第二組合物包含石榴提取物與以下中的至少一種的組合西伯利亞人參、銀杏(Ginkgo biloba)、綠茶、槐(Sophora japonica)、地黃(Rehmannia sp.)、葡萄籽、當歸(Dong Quai)和依普黃酮，其中該第二組合物的組合抑制RANK-L的表達。
文檔編號A61K31/352GK101646433SQ200780039411
公開日2010年2月10日 申請日期2007年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者戴維·W·克雷姆平, 瑪麗·A·默里, 林幼梅, 凱文·W·格倫貝克, 西爾維亞·R·達科斯塔, 利昂·M·威爾金斯, 黑里·羅-施米特, 賈廷德·拉納, 約翰·F·里布亨, 戴維·J·法斯特 申請人:戴維·W·克雷姆平, 瑪麗·A·默里, 林幼梅, 凱文·W·格倫貝克, 西爾維亞·R·達科斯塔, 利昂·M·威爾金斯, 黑里·羅-施米特, 賈廷德·拉納, 約翰·F·里布亨, 戴維·J·法斯特