專利名稱：：蛋白質(zhì)基質(zhì)疫苗及這種疫苗的制備和給藥方法蛋白質(zhì)基質(zhì)疫苗及這種疫苗的制備和給藥方法相關(guān)申請的交叉引用該申請要求保護(hù)來自2006年8月7日提交的美國臨時(shí)申請順序號60/835,944和2007年6月8日提交的美國臨時(shí)申請順序號60/933,764的益處，其說明書通過引用結(jié)合到本文中。關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明本發(fā)明是在國家健康研究所(NationalInstitutesofHealth)(NIH)授予的GrantNoU54AI057159下由J史府資助完成的。政府在本發(fā)明中擁有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及疫苗組合物、疫苗制備方法和疫苗給予方法。很多抗原特別是那些與病原體莢膜層相關(guān)的抗原對免疫應(yīng)答刺激很d、或不刺激，并使生成針對那些抗原的有效疫苗的努力變得復(fù)雜。莢膜是微生物的表面成分，通常由有機(jī)化合物如糖類、氨基酸或醇類的聚合物(polymer)組成。莢膜在化學(xué)上差異很大。構(gòu)成莢膜的單體單位(例如糖類)可以各種分子構(gòu)型連接在一起并進(jìn)一步用磷酸基(phosphate)、氮、硫酸基(sulfate)和其它化學(xué)修飾基團(tuán)取代。這些化學(xué)變化允許莢膜將眾多的抗原靶標(biāo)呈遞到微生物表面，從而允許避免宿主免疫系統(tǒng)靶向這些靶標(biāo)。莢膜還可以為防止微生物被宿主巨噬細(xì)胞和多核白細(xì)胞吞噬和殺死的毒力因子。針對莢膜的抗體通過使補(bǔ)體固定于微生物表面來提供針對莢膜生物有效的防御，補(bǔ)體可導(dǎo)致微生物溶解或其調(diào)理作用以及被有吞噬作用的宿主免疫細(xì)胞吸收并殺死。針對莢膜最有效的抗體是IgG抗體。不能誘導(dǎo)顯著水平IgG的莢膜叫做非T細(xì)胞依賴性抗原。蛋白質(zhì)與莢膜的共價(jià)偶聯(lián)致使其成為"T依賴性的"并且這種抗原可？1發(fā)IgG應(yīng)答。存在著對安全、易合成、具有成本效益的、針對莢膜和其它不會引發(fā)強(qiáng)烈免疫應(yīng)答或IgG抗體的非T細(xì)胞依賴性抗原疫苗的需求。需要這樣的疫苗預(yù)防各種由炭疽桿菌、肺炎球菌、乙型流感、腦膜炎球菌和鏈球菌感染所致的傳染病。發(fā)明概述本發(fā)明涉及含有被復(fù)合物中的載體蛋白包載的目標(biāo)抗原的疫苗組合物、制備這種疫苗的方法和疫苗的給予方法。因此，第一方面，本發(fā)明描述了含有目標(biāo)抗原和載體蛋白的疫苗組合物，其中(i)不超過50%的目標(biāo)抗原與載體蛋白交聯(lián)，并且(ii)其中所述抗原被載體蛋白包載形成復(fù)合物。在本發(fā)明第一方面期需的實(shí)施方案中，所述復(fù)合物直徑在10nm-100nm之間。在本發(fā)明第一方面更期需的實(shí)施方案中，所述復(fù)合物直徑在約100nm-100)im之間。在本發(fā)明第一方面還更期需的實(shí)施方案中，所述復(fù)合物直徑在約100nm-10|im之間。在本發(fā)明第一方面其它期需的實(shí)施方案中，當(dāng)將復(fù)合物給予哺乳動物時(shí)，引發(fā)哺乳動物中T-細(xì)胞依賴的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明第一方面另外期需的實(shí)施方案中，抗原與載體蛋白的摩爾比在1:10和10:1之間。理想地，所述載體蛋白是多聚體(multimer),例如，包含至少5個(gè)亞基的多聚體。在其他期需的實(shí)施方案中，所述多聚體是同多聚體。在本發(fā)明第一方面進(jìn)一步期需的實(shí)施方案中，所述載體蛋白與至少一個(gè)其它載體蛋白共價(jià)連接。理想地，所述共價(jià)連接包括在賴氨酸側(cè)鏈的伯氨基和天冬酰胺或谷氨酰胺側(cè)鏈的羧基之間的肽鍵。在其它CHO期需的實(shí)施方案中，所述共價(jià)連接包括式R!一CHo的化合物，其中Rn是1-12個(gè)碳原子的直連或支鏈烷基、1-12個(gè)原子的直連或支鏈雜烷基(heteroalkyl)、2-12個(gè)碳原子的直連或支鏈烯烴、2-12個(gè)碳原子的直連或支鏈炔烴、5-10個(gè)碳原子的芳族殘基、3-10個(gè)原子的環(huán)狀體系、-(0120120)<1012012-其中q為1-4、或連接兩個(gè)醛基的化學(xué)鍵。在另外期需的實(shí)施方案中，所迷共價(jià)連接含有戊二醛、間馬來酰亞胺基苯曱酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimideester)、碳二亞胺或雙偶氮聯(lián)苯胺。還有在其它期需的實(shí)施方案中，所述共價(jià)連接包括雙功能交聯(lián)劑(crosslinker)。理想地，所述雙功能交聯(lián)劑是戊二醛、雙[石黃酸基琥珀酰亞胺基]辛二酸酯(bis[sulfosuccinimidyl]suberate)或己二亞氨酸二甲酯。在本發(fā)明第一方面其它期需的實(shí)施方案中，所述載體蛋白是非共價(jià)連接的。在期需的實(shí)施方案中，所述非共價(jià)連接包括疏水作用、離子作用、范德華作用或氫鍵。在本發(fā)明第一方面另外期需的實(shí)施方案中，所述載體蛋白是白喉毒素或其突變體、白喉類毒素、破傷風(fēng)毒素或其突變體、破傷風(fēng)類毒素、銅綠假單胞菌(尸ww/omowcwaen^'wosa)外毒素A或其突變體、霍亂毒素B亞基、破傷風(fēng)毒素片段C、細(xì)菌鞭毛蛋白(例如霍亂弧菌(P^n'oc/w/erae)鞭毛蛋白)、肺炎球菌溶血素、腦膜炎奈瑟氏球菌0V^'Men'amewm'"g/"d&)夕卜月莫蛋白、4同鄉(xiāng)錄布I單月包菌(i^ew/cwow(Xsaen^giwosfl)Hcpl蛋白、大腸桿菌(￡^/^^/'"http://)熱不穩(wěn)定腸毒素、志賀樣毒素(例如志賀氏菌(幼/ge〃a)SltB2蛋白)、人LTB蛋白、肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O(或相關(guān)蛋白)、完整細(xì)菌細(xì)胞(例如銅綠假單胞菌(i^ewcfomowosaerwgz'woM)或《逸球菌GS&eptococca/)細(xì)月包)的蛋白質(zhì)才是耳又物、炭疽芽孢桿菌(^^7/^朋Ara^)保護(hù)抗原的顯性負(fù)突變體(DNI)、或大腸桿菌(五w/^n'c/^co/z')(3-半乳糖苷酶。在具體期需的實(shí)施方案中，所述載體蛋白是肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O、白喉毒素、白喉類毒素、破傷風(fēng)毒素或破傷風(fēng)類毒素。在本發(fā)明第一方面其它期需的實(shí)施方案中，所述目標(biāo)抗原是多糖、多元醇或聚氨基酸。理想地，所述多糖包含至少18個(gè)殘基。在其它期需的實(shí)施方案中，所述多糖是肺炎鏈球菌(&reptococcw5/"ewwow'fle)多糖、土拉熱弗朗西絲氏菌(Frawc&e〃fl/Wa""w'5)多糖、炭疽芽孑包一干菌(S"c/〃mstm//rac/>y)多4唐、流感嗜血菌(//aemo;/^7ws^/7wew^re)多糖、傷寒沙門氏菌(5^//nowe〃az^/w')多糖、沙門氏菌(&z/mo"e〃a印ec/as)多糖、志賀氏菌(57^e〃a)多糖或腦膜炎奈瑟氏球菌(7Vez'Men力wew"/"g"fcfo)多糖。在具體期需的實(shí)施方案中，所迷肺炎鏈球菌(&reptococc船；wewmom'ae)多糖是1-48型莢月莫中的任何一種，例如3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46。在其它具體期需的實(shí)施方案中，所述土拉熱弗朗西絲氏菌(尸^"\^//0^/areww'力多糖是O抗原。在本發(fā)明第一方面進(jìn)一步期需的實(shí)施方案中，所述目標(biāo)抗原是微生物莢膜聚合物。理想地，所述微生物莢膜聚合物是來自炭疽芽孢桿菌(5ad〃iw朋Ara"、)的聚-y-D-谷氨酸。在本發(fā)明第一方面其它期需的實(shí)施方案中，所述目標(biāo)抗原是由具有至少三個(gè)原子的單體組成的有機(jī)聚合物，其中每個(gè)原子獨(dú)立地選自碳、氧、氫、磷酸基、氮和硫酸基。理想地，所述有機(jī)聚合物源自于微生物。在其它期需的實(shí)施方案中，所述有機(jī)聚合物不是天然存在的。在另外期需的實(shí)施方案中，所述疫苗組合物進(jìn)一步包含第二目標(biāo)抗原。理想地，所述疫苗組合物還包含第三目標(biāo)抗原。在第二方面，本發(fā)明描述了制備疫苗組合物的方法。該方法包括(i)將目標(biāo)抗原與載體蛋白混合形成抗原和載體蛋白混合物并且(ii)以載體蛋白包載目標(biāo)抗原，其中不超過50%的目標(biāo)抗原與疫苗組合物中的載體蛋白交耳關(guān)。在本發(fā)明第二方面期需的實(shí)施方案中，所述疫苗組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。在本發(fā)明第二方面其它期需的實(shí)施方案中，所述包載包括從混合物中沉淀抗原和載體蛋白。理想地，所述沉淀包括使混合物的PH變化；往混合物中加三氯乙酸(TCA)或硫酸銨；通過增加或減少混合物中無機(jī)鹽的濃度改變混合物的離子強(qiáng)度；加熱混合物使載體蛋白和/或抗原凝結(jié)；或者用足夠通量的電離輻射輻照混合物《1起交聯(lián)。在本發(fā)明第二方面期需的實(shí)施方案中，所述疫苗組合物的抗原與載體蛋白的摩爾比在1:10-9:10之間。在本發(fā)明第二方面另外期需的實(shí)施方案中，所述載體蛋白是多聚體。理想地，多聚體包含至少5個(gè)亞基。在其它期需的實(shí)施方案中，所述多聚體是同多聚體。在本發(fā)明第二方面進(jìn)一步期需的實(shí)施方案中，所述載體蛋白非共價(jià)連接。理想地，所述非共價(jià)連接包括疏水作用、離子作用、范德華作用或氬鍵。在本發(fā)明第二方面另外期需的實(shí)施方案中，所述載體蛋白是白喉毒素或其突變體、白喉類毒素、破傷風(fēng)毒素或其突變體、破傷風(fēng)類毒素、銅綠假單胞菌(尸ww(iowomwaerwg^KWfl)外毒素A或其突變體、霍亂毒素B亞基、破傷風(fēng)毒素片段C、細(xì)菌鞭毛蛋白(例如霍亂弧菌(F,力n'ocAo/erae)鞭毛蛋白)、肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O、腦膜炎奈瑟氏王求菌(7Ve^sen'flmewm'wgi"'cfo)夕卜膜蛋白、銅纟錄^支單月包菌(i^et^o附o"(XSaerMg/wosa)Hcpl蛋白、大腸牙干菌C&c^er/c/n-flco/z〕熱不穩(wěn)、定腸毒素、志賀樣毒素(志賀氏菌(幼z'ge〃a)SltB2蛋白)、人LTB蛋白、來自完整纟田菌纟田胞(例如銅綠々支單胞菌(尸化M(i(9mo"(Xsaerwgz'"c^a)或鏈3求菌OSVr印tococca/j細(xì)胞)的蛋白質(zhì)提取物、炭疽芽孢桿菌(丑ac"/ws朋保護(hù)性抗原的顯性負(fù)性突變體(DNI)、或大腸桿菌(五sc/im'c/n力co/Z)(3-半乳糖苷酶。在具體期需的實(shí)施方案中，所述載體蛋白是肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O、白喉毒素、白喉類毒素、破傷風(fēng)毒素或破傷風(fēng)類毒素。在本發(fā)明第二方面其他期需的實(shí)施方案中，所述目標(biāo)抗原是多糖、多元醇或聚氨基酸。理想地，所述多糖包含至少18個(gè)殘基。在其它期需的實(shí)施方案中，所述多糖是肺炎鏈球菌(&^5toCOCCMjo"ewmom'ae)多糖、土拉熱弗朗西絲氏菌(Fnwc^e//a似/a"似&)多糖、炭疽芽孑包桿菌(Sflc"/wsawArac^)多糖、流感嗜血菌(i/aemo;/n7ws/"y7wewz"e)多4唐、傷寒沙門氏菌(S"/附o"e〃"多糖、志賀氏菌(5Tn'ge"a)多糖、沙門氏菌(5"a/wo"e〃aspecies)多糖或腦膜炎奈瑟氏球菌(A^&eWawew'"g/^fo)多糖。在具體期需的實(shí)施方案中，所述肺炎鏈球菌(&廠eptococc船/wewwom'ae)多糖是1-48型莢膜中的任何一種，例如3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46。在其它具體期需的實(shí)施方案中，所述土拉熱弗朗西絲氏菌(尸ra"c&e〃"似/g^"W力多糖是O抗原。在本發(fā)明第二方面另外期需的實(shí)施方案中，所述目標(biāo)抗原是微生物莢膜聚合物。理想地，微生物莢膜聚合物是來自炭疽芽孢桿菌(5a"7/t^awArac/力的聚-y-D-谷氨酸。在本發(fā)明第一方面其它期需的實(shí)施方案中，所述目標(biāo)抗原是由含有至少三個(gè)原子的單體組成的有機(jī)聚合物，其中每個(gè)原子獨(dú)立地選自碳、氧、氫、磷酸基、氮和硫酸基。理想地，所述有機(jī)聚合物來源于微生物。在其它期需的實(shí)施方案中，所述有機(jī)聚合物不是自然存在的。在本發(fā)明第二方面進(jìn)一步期需的實(shí)施方案中，步驟(i)中的混合包括第二目標(biāo)抗原乃至第三目標(biāo)抗原。在第三方面，本發(fā)明描述了另一個(gè)制備疫苗組合物的方法。該方法包括(i)將目標(biāo)抗原與載體蛋白混合并且(ii)加入使載體蛋白交聯(lián)的接頭(linker)，其中不超過50%的目標(biāo)抗原與疫苗組合物中的載體蛋白交聯(lián)。在本發(fā)明第三方面期需的實(shí)施方案中，所述疫苗組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。在本發(fā)明第三方面其它期需的實(shí)施方案中，所述疫苗組合物中抗原與載體蛋白的摩爾比在1:10和10:1之間。在本發(fā)明第三方面另外期需的實(shí)施方案中，所述載體蛋白是多聚體。理想地，所述多聚體包含至少5個(gè)亞基。在其它期需的實(shí)施方案中，所述多聚體是同多聚體。在本發(fā)明第三方面進(jìn)一步期需的實(shí)施方案中，所述方法包括還原載體蛋白中的席夫堿。在本發(fā)明第三方面更進(jìn)一步期需的實(shí)施方案中，所述載體蛋白與至少一種其它載體蛋白共價(jià)連接。理想地，所述共價(jià)連接包括在賴氨酸側(cè)鏈的伯氨基和天冬酰胺或谷氨酰胺側(cè)鏈的羧基之間的肽鍵。在其它期需的實(shí)施方案中，所述共價(jià)連接包括雙功能交聯(lián)劑。理想地，所述雙功能交聯(lián)劑是戊二醛、雙[磺酸基琥珀酰亞胺]辛二酸酯或己二亞氨酸二甲酯。CHO在本發(fā)明第三方面另外期需的實(shí)施方案中，所述接頭是式Rl—CHO的化合物，其中Rn是l-12個(gè)碳原子的直連或支鏈烷基、1-12個(gè)原子的直連或支鏈雜烷基、2-12個(gè)碳原子的直連或支鏈烯烴、2-12個(gè)碳原子的直連或支鏈炔烴、5-10個(gè)碳原子的芳族殘基、3-10個(gè)原子的環(huán)狀體系、-(0120120、012012-其中q是1-4、或者連接兩個(gè)醛基的化學(xué)鍵。在本發(fā)明第三方面其它期需的實(shí)施方案中，所述接頭是戊二醛、間馬來酰亞胺基苯曱?；?N-羥基琥珀酰亞胺基酯、碳二亞胺或雙偶氮聯(lián)苯胺。在本發(fā)明第三方面另外期需的實(shí)施方案中，所述載體蛋白是白喉毒素或其突變體、白喉類毒素、破傷風(fēng)毒素或其突變體、破傷風(fēng)類毒素、銅綠々i單胞菌(尸"W(iomomwaerag/"cwa)外毒素A或其突變體、霍亂毒素B亞基、破傷風(fēng)毒素片段C、細(xì)菌鞭毛蛋白(霍亂弧菌(F^Woc/o/erae)鞭毛蛋白)、肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O、腦膜炎奈瑟氏5求菌(7Ve/Men'amg"m'wg7力Ws)夕卜月莢蛋白、^^4^教卓y^^"「/^ewcfowo"cwaerag^os(^Hcpl蛋白、大腸沖干菌0&c/^n'c/nVzco/,)熱不穩(wěn)、定腸毒素、志賀樣毒素(志賀氏菌(幼〖ge〃a)SltB2蛋白)、人LTB蛋白、來自完整纟田菌纟田月包(銅綠"f叚單月包菌CPsewt/omo"fiwaen/gz'"cw<2)或豐連5求菌(5Vreptococca/)細(xì)胞)的蛋白質(zhì)提耳又物、炭疽芽孢桿菌CSa"'〃ws朋/力,""力18保護(hù)性抗原的顯性負(fù)性突變體(DNI)或大腸桿菌(EscAm'c/n'aco/z')卩-半乳糖苦酶。在本發(fā)明第三方面進(jìn)一步期需的實(shí)施方案中，所述目標(biāo)抗原是多糖、多元醇或聚氨基酸。理想地，所述多糖包含至少18個(gè)殘基。在其它期需的實(shí)施方案中，所述多糖是肺炎鏈球菌OSV印tococcw/wewwom'ae)多糖、土拉熱弗朗西絲氏菌(F廠awc^e〃fl加/arms7X)多糖、炭疽芽孑包桿菌(5ac/〃MS朋多糖、流感嗜血菌(//aewo//^7iw/w/7wewzae)多糖、傷寒沙門氏菌(Sa/mowe〃fl/>y>/u〕多糖、志賀氏菌(6Tn'ge〃aspecies)多糖、沙門氏菌(Sa/mowe〃aspecies)多糖或月畝月莫炎奈瑟氏球菌(A^'Men'amem'wg"z'fifa)多糖。在具體期需的實(shí)施方案中，所述肺炎鏈球菌OS"/^ftoc0ccM/wewmo"/ae)多糖是1-48型莢膜中的任何一種，例如3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46。在其它具體期需的實(shí)施方案中，所述土拉熱弗朗西絲氏菌(Fra"c^e〃a^/flre"W力多糖是O抗原。在本發(fā)明第三方面其它期需的實(shí)施方案中，所述目標(biāo)抗原是^f敖生物莢膜聚合物。理想地，所述微生物莢膜聚合物來自炭疽芽孢桿菌CSa"7/twtmArac&)的聚隱y-D隱谷氛酸。還有在本發(fā)明第三方面其它期需的實(shí)施方案中，所述目標(biāo)抗原是由具有至少三個(gè)原子的單體組成的有機(jī)聚合物，其中每個(gè)原子獨(dú)立選自碳、氧、氫、磷酸基、氮和硫酸基。理想地，所述有機(jī)聚合物來源于微生物。在另外期需的實(shí)施方案中，所述有機(jī)聚合物不是自然存在的。在本發(fā)明第三方面進(jìn)一步期需的實(shí)施方案中，步驟(i)中的混合包括第二目標(biāo)抗原乃至第三目標(biāo)抗原。在第四個(gè)方面，本發(fā)明描述了對受試對象進(jìn)行接種疫苗抵抗傳染性病原體的方法。該方法包括給予受試對象足夠量的本發(fā)明第一方面的疫苗組合物，以誘導(dǎo)受試對象產(chǎn)生抗體。在本發(fā)明第四方面期需的19實(shí)施方案中，所迷方法包括第二個(gè)給予步驟，其中將足夠量的本發(fā)明第一方面的疫苗組合物給予受試對象，以加強(qiáng)受試對象產(chǎn)生抗體。理想地，在本發(fā)明第四方面，抗體的產(chǎn)生是T細(xì)胞依賴性的。在本發(fā)明第四方面其它期需的實(shí)施方案中，所述抗體的產(chǎn)生足以預(yù)防或減少傳染性病原體對受試對象的感染。理想地，所述傳染性病原體是肺炎球菌、腦膜炎球菌、乙型流感嗜血菌(i/aemo//n7M"w/7MewzaTypeB)、銅綠々支單月包菌(jRsewt/o附o"osaerwgf"os")、土^立熱弗朗西絲氏菌(Fra鏡'"〃afw/flre肌'力、志賀氏菌(5Tn'ge〃aspecies)、沙門氏菌(5Vz/mowe〃aspecies)、不動4干菌(v4"'"etoZacterspecies)、伯克霍爾《老、氏菌(5wr/t》o/cfer/ai"/ec/es")或大腸^干菌(^!sr/^/7'c力^2在本發(fā)明第四方面其它期需的實(shí)施方案中，所述方法包括第二給予步驟，其中將足夠量的含有目標(biāo)抗原的第二疫苗組合物提供給受試對象加強(qiáng)受試對象產(chǎn)生抗體。理想地，所述抗體的產(chǎn)生足以預(yù)防或減少第二傳染性病原體對受試對象的感染。在本發(fā)明第四方面期需的實(shí)施方案中，所述抗體是IgG抗體。在本發(fā)明第四方面進(jìn)一步期需的實(shí)施方案中，所述受試對象是人。在本發(fā)明任何一個(gè)方面期需的實(shí)施方案中，所述肺炎鏈球菌(5Vr一ococcus;"e訓(xùn)應(yīng)'—多糖是在Kong等(J.Med.Microbiol.54:35-356,2005)中所描述的莢膜類型之一。例如，肺炎鏈球菌(&re;tococaw;wawiom'ae)多糖莢膜類型期需的是l(例如，l-g或l-q)、2(例如，2-g、2-q或2-41A)、3(例如，3-g、3-q、3-c或3-nz)、4、5(例^口5-q、5-c、5-qap或5-g)、6A(仿H口，6A-g、6A-cl、6A-c2、6A-n、6A-qap、6A-6B-g、6A-6B-q或6A腸6B-s)、6B(例如，6B-c、6A-6B-g、6A-6B-q或6A-6B-s)、7F(例如，7F-7A)、7A(例如7A-cn或7F-7A)、7B(例如，7B-40)、7C(例如，7C-19C-24B)、8(例如，8-g或8-s)、9A(例如，9A-9V)、9L、9N、9V(例如，9A-9V)、9V和14、10F(例如，10F-q、10F-ca或10F-10C)、10A(例如，10A-17A或10A-23F)、10B(例如，10B-10C)、IIF、IIA(例如，11A-nz或11A-11D-18F)、IIB(例如，11B-11C)、IIC(例如，11B-11C或11C-cn)、IID(例如，11A-11D-18F)、12F(例如，12F-q或12F-12A-12B)、12A(例如，12A-cn、12A-46、或12F-12A-12B)、12B(例如，12F-12A-12B)、13(例如，13-20)、14(例如，14-g、14-q、14-v或14陽c)、15F(例如，15F-cnl或15F-cn2)、15A(例如，15A-cal、15A-ca2、或15A-chw)、15B(例如，15B-c、15B-15C、15B-15C-22F-22A)、15C(例如，15C-ca、15C-ql、15C-q2、15C-q3、15C-s、15B-15C或15B-15C-22F-22A)、16F(例如，16F-q或16F-nz)、16A、17F(例如，17F-n和17F-35B-35C-42)、17A(例如，17A-ca或10A-17A)、18F(例如，18F-ca、18F-w或11A-11D-18F)、18A(例如，18A-nz或18A-q)、18B(例如，18B陽18C)、18C(例如，18B-18C)、19F(例如,19F-gl、19F-g2、19F-g3、19F-q、19F-n或19F-c)、19A(例如，19A-g、19A-或19A-ca)、19B、19C(例如，19C-cnl、19C-cn2或7C-19C-24B)、20(例如，13-20)、21(例如，21-ca或21-cn)、22F(例如，15B-15C-22F-22A)、23F(例如，23F-c,10A-23F或23F-23A)、23B(例如，23B-c或23B-q)、24F(例如，24F-cnl、24F-cn2或24F-cn3)、24A、24B(例如，7C-19C-24B)、25F(例如，25F-38),25A，27,28F(例如，28F-28A或28F-cn)、28A(例如，28F畫28A)、29(例如，29-caor29-q)、31、32F(例如，32F-32A)、32A(例如，32A-cn或32F-32A)、33F(例如，33F-g、33F-q、33F-chw、33F-33B或33F-33A-35A)、33A(例如，33F-33A-35A)、33B(例如，33B-q、33B-s或33F-33B)、33D、34(例如，34-ca或34s)、35F(例如，35F-47F)、35A(例如，33F-33A隱35A)、35B(例如，17F-35B-35C-42)、36、37(例如，37-gor37-ca)、38(例如，25F-38)、39(例如，39-cnl或39-cn2)、40(例如，7B-40)、41F(例如,41F-cn或41F-s)、41A(例如，2-41A)、42(例如，17B-35B-35C-42)、43、44、45、46(例如，46-s或12A-46)、47F(例^口，35F-47F)、47A、48(侈寸^口，48-cnl或48-cn2)、或GenBank登l^號AF532714或AF532715。21定義本文中與疫苗結(jié)合使用的"給藥，，，意指為受試對象提供足夠劑量的疫苗誘導(dǎo)受試對象體內(nèi)的免疫應(yīng)答，其中所述免疫應(yīng)答導(dǎo)致與疫苗所含抗原特異結(jié)合的抗體的產(chǎn)生。期需給藥包括肌肉注射、皮內(nèi)注射或經(jīng)皮注射，并且期需包括給予適當(dāng)?shù)拿庖咦魟＝o藥可包括疫苗的單次給藥或多劑量給藥。理想地，設(shè)計(jì)第二次給藥加強(qiáng)受試對象產(chǎn)生抗體，預(yù)防傳染性病原體的感染。疫苗給藥的頻率和量依賴于疫苗的比活性并且很容易通過常規(guī)試驗(yàn)確定。"交聯(lián)"意指在兩個(gè)分子、大分子或分子組合例如載體蛋白之間的共價(jià)鍵的形成，所述共價(jià)鍵的形成通過使用"零長度"接頭來直接實(shí)現(xiàn)，或者利用第三個(gè)分子即化學(xué)接頭來實(shí)現(xiàn)，所述化學(xué)接頭具有兩個(gè)官能團(tuán)，每個(gè)能夠與兩個(gè)單獨(dú)的分子之一形成共《介4建，或在同一分子的兩個(gè)單獨(dú)基團(tuán)之間形成共價(jià)連接(即它們將形成能夠環(huán)繞聚合物的"環(huán)")。例示性的接頭包括能夠交聯(lián)兩個(gè)載體蛋白的雙功能接頭。交聯(lián)還可發(fā)生在抗原和載體蛋白之間。本文所使用的"抗原"意指任何與抗體或抗體片段特異性結(jié)合的分子或分子組合。本文所使用的"雙功能接頭"意指有兩個(gè)官能團(tuán)的化合物，每個(gè)官能團(tuán)能分別與兩個(gè)單獨(dú)的分子、原子或分子集合形成共^介鍵。例如，G.T.Hermanson(BioconjugateTechniques,AcademicPress,1996)和Dick牙口Beurret(ConjugateVaccines.Contribu.Microbiol.Immunol"Karger,Basal10:48-114,1989)描述了例示性的雙功能接頭。理想地，雙功能接頭是戊二醛、雙pt酸基琥珀酰亞胺]辛二酸酯或己二亞氨酸二曱酯。本文所使用的"接頭"意指共價(jià)地連接兩個(gè)或多個(gè)分子的化合物或cho化學(xué)鍵。理想地，接頭是戊二醛或式d—cho的化合物，其中Rn是1-12個(gè)碳原子的直連或支鏈烷基、l-12個(gè)原子的直連或支鏈雜烷基、2-12個(gè)碳原子的直連或支鏈烯烴、2-12個(gè)碳原子的直連或支鏈炔烴、5-10個(gè)碳原子的芳族殘基、3-10個(gè)原子的環(huán)狀體系、_(CH2CH20)qCH2CH2-其中q為1-4、或連接兩個(gè)醛基的化學(xué)鍵?？刹皇褂眠B接分子直接進(jìn)行連接。例如，可用碳二亞胺化學(xué)或用催化這種交聯(lián)反應(yīng)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶促作用，來使蛋白質(zhì)的羧基與其氨基直接連接。"加強(qiáng)抗體產(chǎn)生，，意指發(fā)生在第二次暴露于抗原過程中的記憶B細(xì)胞的活化，稱為"加強(qiáng)應(yīng)答"，表明壽期長的"二次，，記憶免疫應(yīng)答，導(dǎo)致壽期長的抗體產(chǎn)生。"載體蛋白"意指用于疫苗的蛋白質(zhì)，其引起對其自身和/或?qū)εc載體蛋白復(fù)合的抗原的免疫應(yīng)答。理想地，所述抗原通過被載體蛋白包載在復(fù)合物中來與載體蛋白非共價(jià)締合。雖然如此，抗原和載體蛋白也可以彼此共價(jià)結(jié)合。理想地，所述載體蛋白包含被T-細(xì)胞識別的表位。作為分支肽的多抗原肽(MAP)也被"載體蛋白"的定義所包含。理想地，MAP包括賴氨酸。例示性的期需載體蛋白包括毒素和類毒素(化學(xué)的或基因的)，可以是突變體。理想地，載體蛋白是白喉毒素或其突變體、白喉類毒素、破傷風(fēng)毒素或其突變體、破傷風(fēng)類毒素、銅綠假單月包菌(i^ewdomowflsaeragj'wo^)外毒素A或其突變體、霍亂毒素B亞基、破傷風(fēng)毒素片段C、細(xì)菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O(和相關(guān)分子)、腦膜炎奈瑟氏球菌(A^/^en'ame"w'"g!'riifo)外部月莫蛋白、銅綠假單胞菌CPseMt/owo"a!flen/g/"wa)Hcpl蛋白、大腸桿菌(^yc/2^7'c/^"/,')熱不穩(wěn)定腸毒素、志賀樣毒素、人LTB蛋白、來自完整細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物、炭疽芽孢桿菌(S""7/w朋Arad力保護(hù)性抗原的顯性負(fù)性突變體(DNI)、或大腸桿菌(EscAm'c/n'flco//)卩-半乳糖苷酶、或任何其它可被4妻頭交聯(lián)的蛋白質(zhì)。"DNI"意指顯性負(fù)性突變體(DNI)蛋白，是炭疽芽孢桿菌C5.朋Arac&)保護(hù)性抗原(PA)的突變形式，如Benson等(Biochemistry37:3941-3948,1998)所描述的。本文所使用的有關(guān)抗原的"包載"意指在生理?xiàng)l件下保留在與載體蛋白所形成的復(fù)合物中的抗原。理想地，所述抗原包載于與載體蛋白所形成的復(fù)合物中，在抗原和載體蛋白之間不存在顯著共價(jià)連接。如在本文所使用的，不存在顯著共價(jià)連接是指不超過50%的抗原與載體蛋白共價(jià)結(jié)合。理想地，不超過40%、30%、10%或5%的抗原與載體蛋白共價(jià)連接。"感染，，意指受試對象被微生物如細(xì)菌、真菌、寄生蟲或病毒侵襲。感染可包括，例如，通常存在于受試對象體內(nèi)或體表的微生物的過度增殖或通常不存在于受試對象中或表面的#1生物的過度增殖。當(dāng)過量的微生物群體存在于受試對象體內(nèi)或體表或者當(dāng)微生物群體的存在傷害細(xì)胞或引起受試對象的組織出現(xiàn)病理癥狀時(shí)，受試對象遭受微生物的感染。"傳染性病原體"意指引起感染的微生物。"免疫原性的"意指在受試對象體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的化合物。理想地，所述免疫應(yīng)答是T-細(xì)胞依賴的免疫應(yīng)答，包括IgG抗體的產(chǎn)生。"微生物，，是指能夠引起受試對象感染的細(xì)菌、真菌、寄生蟲或病毒。"微生物莢膜聚合物"是指存在于微生物莢膜外衣內(nèi)部或表面的聚合物。理想地，微生物莢膜聚合物是有機(jī)聚合物如多糖、磷酸多糖、具有N-乙?；〈陌被堑亩嗵?、含有磺胺酰糖(sulfanylatedsugar)的多糖、其它硫酸基修飾的糖或磷酸基修飾的糖、多元醇、聚氨基酸、磷壁質(zhì)酸和脂多糖O側(cè)鏈。"單體，，是指能夠與相同單體形成兩個(gè)或多個(gè)鍵的分子結(jié)構(gòu)，當(dāng)作為"聚合物，，的一部分時(shí)，經(jīng)常產(chǎn)生重復(fù)單體結(jié)構(gòu)的鏈或一系列分支的、連接的鏈。"有機(jī)聚合物，，是指由共價(jià)連接的單體組成的聚合物，每個(gè)單體含有三個(gè)或更多個(gè)下列原子碳、氧、氫、磷酸基、氮和^琉酸基。理想地，所述有機(jī)聚合物是多糖、磷酸多糖、具有N-乙?；〈陌被堑亩嗵?、含有磺胺酰糖的多糖、其它硫酸基修飾的糖或磷S緣修飾的糖、糖、多元醇、聚氨基酸、磚壁質(zhì)酸和脂多糖O側(cè)鏈。24"多元醇"是指碳水化合物的氫化形式，其羰基被還原成伯羥基或仲羥基。例示性的多元醇是聚環(huán)氧烷烴(PAO),如聚亞烷基乙二醇(PAG)，包括聚亞曱基乙二醇、聚乙二醇(PEG)、曱氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇；聚乙烯醇(PVA);乙烯-馬來酸酐共聚物；苯乙烯-馬來酸肝共聚物；包括羧曱基葡聚糖在內(nèi)的葡聚糖；纖維素包括甲基纖維素、羧曱基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羧乙基纖維素和羥丙基纖維素；殼聚糖水解產(chǎn)物；淀粉如羥乙基淀粉和羥丙基淀粉；糖原；瓊脂糖及其衍生物；瓜爾膠；支鏈淀粉；菊淀粉；黃原膠；卡拉膠；果膠；海藻酸水解產(chǎn)物；山梨醇；葡萄糖醇、甘露醇、半乳糖醇、阿拉伯糖醇、古洛糖醇、木糖醇、蘇糖醇、山梨醇、果糖醇、甘油、麥芽糖醇、纖維二糖的醇、蔗糖的醇、支鏈淀粉的醇、支鏈淀粉的醇；或單丙二醇(MPG)。"聚氨基酸"是指由肽鍵連接的至少兩個(gè)氨基酸。理想地，所述聚氨基酸是含有重復(fù)氨基酸序列或相同氨基酸鏈的肽(即同聚物)。"還原席夫堿"是指將曱亞胺或式R,R2C二N-R3化合物(Ri、R2和R3是化學(xué)結(jié)構(gòu)，通常含有碳原子)暴露于用氬原子飽和席夫堿雙鍵的還原劑。還原的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。本文所使用的關(guān)于抗體或其片段的"特異性結(jié)合"是指抗體或抗體片段對相對于等量的任何其它蛋白質(zhì)而言的特定蛋白質(zhì)如抗原所增加的親和力。理想地，根據(jù)使用標(biāo)準(zhǔn)方法如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)所測定，抗體或抗體片段對其抗原的親和力至少2倍、5倍、10倍、30倍或100倍大于任何等量的其它抗原，包括相關(guān)抗原在內(nèi)。"受試對象"是指可被微生物感染的動物。期需受試對象是哺乳動物，如人、猴子、狗、貓、小鼠、大鼠、母牛、綿羊、山羊或馬。在期需的實(shí)施方案中，所述受試對象是人，如小孩。理想地，所述受試對象是嬰兒、學(xué)步兒童或青春期前兒童。"T-細(xì)胞非依賴性抗原，，是指在沒有T淋巴細(xì)胞協(xié)作下導(dǎo)致抗體生成的抗原。理想地，所述T-細(xì)胞非依賴性抗原直接刺激B淋巴細(xì)胞而無需T淋巴細(xì)胞的協(xié)作。例示性的期需T-細(xì)胞非依賴性抗原包括莢膜抗原聚-Y-D-谷氨酸(PGA)、藻酸酸(藻酸鹽)、葡聚糖、多糖(PS)、聚氨基酸、多元醇和核酸。優(yōu)點(diǎn)與現(xiàn)有的疫苗技術(shù)相比，本發(fā)明的疫苗制備簡單，不易有化學(xué)問題，不易有免疫問題，便宜，比綴合技術(shù)更適應(yīng)于不同的目標(biāo)抗原和載體蛋白，更加靈活地用于生成多價(jià)疫苗(抵御多種抗原的疫苗)。本發(fā)明疫苗不需要在載體蛋白和旨在誘發(fā)免疫應(yīng)答的抗原之間的共價(jià)連接，因而與綴合疫苗技術(shù)相比簡化了其制備方法并減少了制備成本。多糖(PS)-蛋白綴合疫苗由于過于昂貴而無法在發(fā)展中國家生產(chǎn)和銷售；由于每種疫苗所需的高度專業(yè)的化學(xué)以及PS和載體蛋白的生產(chǎn)和純化成本，傳統(tǒng)綴合疫苗很難便宜地生產(chǎn)。原的疫苗的需求。這些疫苗可以是單價(jià)的(具有單種抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答)或多價(jià)的(具有多種抗原誘導(dǎo)多種免疫應(yīng)答)。業(yè)已顯示含有TLR(Toll樣受體)配體的疫苗誘發(fā)對另外的難處理抗原的免疫應(yīng)答，但它們與本發(fā)明疫苗相比具有不安全的傾向，因?yàn)門LR配體常常促發(fā)炎癥，即使小劑量也有毒，具反應(yīng)原性，并且可能引起不良癥狀。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)根據(jù)下面詳述、附圖和權(quán)利要求將是顯而易見的。附圖筒述圖1是關(guān)于綴合疫苗(PS和載體蛋白破傷風(fēng)類毒素之間制備的綴合物)誘導(dǎo)抗PSIgG免疫應(yīng)答的非限制性提議性途徑的流程圖。在該模型中，只有展示識別PS的抗體受體的B細(xì)胞與PS蛋白綴合物結(jié)合。因此，載體蛋白被結(jié)合到展示正確PS結(jié)合特異性的B細(xì)胞表面。圖2是PCMV和對照制劑的蛋白印跡分析圖，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和用抗PA抗血清的蛋白印跡監(jiān)測交聯(lián)情況。DNI蛋白在戊二醛交聯(lián)之前移動到84kDa處。正如條帶遷移到分子量大于220kDa處所證實(shí)的一樣，PCVM1-PCMV3(泳道l-3)顯示DNI蛋白的廣泛交聯(lián)。不存在PGA下單獨(dú)交聯(lián)的DNI也顯示同樣的高分子量種類(species)(泳道5)。相反，與PGA混合但不用戊二醛處理的DNI顯示與DNI共同遷移的條帶或較低的分子量種類(泳道4)。圖3顯示用來測量經(jīng)過三個(gè)PCMV制劑(PCMV1-PCMV3，制劑l-3)和兩個(gè)抗原對照制劑4和5免疫接種的小鼠體內(nèi)IgM和IgG特異性抗DNI免疫應(yīng)答的ELISA測定結(jié)果。DNI蛋白在除了不與戊二醛(glut)交聯(lián)的對照制劑4之外的所有制劑中都具有高度的免疫原性。然而，這些特異的DNI免疫應(yīng)答是唯一基于IgG的。雖然甚至在免疫接種的第7天也沒有4全測出抗DNIIgM,但在用PCMV制劑免疫接種17天的老鼠和僅用交聯(lián)的DNI(制劑5)免疫接種的老鼠中可檢測出顯著的抗DNIIgG應(yīng)答。在第30天注意到用所有制劑包括制劑4誘導(dǎo)的針對DNI的強(qiáng)烈的加強(qiáng)應(yīng)答。圖4顯示用來測量經(jīng)過三個(gè)PCMV制劑(PCMV1-PCMV3，制劑l-3)和兩個(gè)抗原對照制劑4和5免疫接種的小鼠體內(nèi)IgM特異性抗PGA免疫應(yīng)答的ELISA測定結(jié)果。抗PGAIgM應(yīng)答顯示了典型的莢膜聚合物模式。對照制劑4在第7天產(chǎn)生可檢測的抗PGAIgM應(yīng)答，但該應(yīng)答在第17天或第30天沒有加強(qiáng)。所有PCMV制劑在第7天均誘導(dǎo)抗PGAIgM應(yīng)答，然后在第17天和30天唯獨(dú)產(chǎn)生更強(qiáng)的抗PGAIgM應(yīng)答。如所期望的，對照制劑5(僅為交聯(lián)的DNI)不產(chǎn)生基于IgM或基于IgG的抗PGA應(yīng)答。圖5顯示用來測量經(jīng)過三個(gè)PCMV制劑(PCMV1-PCMV3;制劑l-3)和兩個(gè)抗原對照制劑4和5免疫接種的小鼠體內(nèi)IgG特異性抗PGA免疫應(yīng)答的ELISA測定結(jié)果。PCMV1-3產(chǎn)生強(qiáng)烈的基于IgG的抗PGA應(yīng)答，其在第17天出現(xiàn)，然后在第30天明顯得到加強(qiáng)。圖6顯示免疫前和經(jīng)過含有DNI和藻酸鹽的PCMV(DNI-ALGC,DNIALGA)及含有與藻酸鹽(ALG)、葡聚糖(DEX)和PGA復(fù)合的DNI的"一鍋"("onepot，，)三價(jià)PCMV制劑免疫接種后30天的混合血清IgM抗體效《介。圖7顯示經(jīng)過含有DNI和藻酸鹽的PCMV(DNI-ALGC,DNIALGA)及含有與藻酸鹽(ALG)、葡聚糖(DEX)和PGA復(fù)合的DNI的"一鍋"三價(jià)PCMV制劑免疫接種之后60天的抗原特異血清IgG抗體效價(jià)。圖8顯示經(jīng)過含有DNI和藻酸鹽的PCMV(DNI-ALGC,DNIALGA)及含有與藻酸鹽(ALG)、葡聚糖(DEX)和PGA復(fù)合的DNI的"一鍋"三價(jià)PCMV制劑免疫接種后128天抗PSIgG抗體效價(jià)。圖9A和9B是用獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心并由Merck制備的肺炎鏈球菌(51./7weMmom'ae)多并唐(pss)或獲自SerumInstituteofIndia(SII)的pps進(jìn)行的IL-6測定圖。圖IO是顯示獲自SII的pss6B中的雜質(zhì)可用處理2(trt2;在IMNaOH中80。C保溫1小時(shí))去除的圖。處理l(trtl)是一連串5步苯酚提取，以將蛋白質(zhì)從多糖中去除。圖11顯示含有pss6B的PCMV在誘導(dǎo)IgG產(chǎn)生上比Prevnar⑧更有效。BSA-牛血清白蛋白；DT-白喉毒素；DTx-白喉類毒素；TTx=破傷風(fēng)類毒素。圖12顯示含有pss6B的PCMV在誘導(dǎo)IgM產(chǎn)生上與Prevna,—樣有效。圖13顯示含有pss6B的PCMV在誘導(dǎo)IgG產(chǎn)生上比Prevna,更有效。圖14-16顯示含有pss14的PCMV在誘導(dǎo)IgG產(chǎn)生上大約相當(dāng)于Prevnar(DTx=白喉類毒素；TTx-破傷風(fēng)類毒素)。詳迷本發(fā)明描述了疫苗組合物、所述組合物的制備方法和給藥方法，以提供免疫性對抗T細(xì)胞不依賴性抗原或通常51起微弱免疫應(yīng)答的抗原如多糖(PS)、多元醇、聚氨基酸和其它有機(jī)聚合物。本發(fā)明的疫苗具有典型PS蛋白綴合疫苗的有效的免疫特性，但又期需地不同于綴合疫苗，不同點(diǎn)在于無需顯著的共價(jià)原子連接來將目標(biāo)抗原如PS或莢膜有機(jī)聚合物連接到載體蛋白。相反，用載體蛋白包載目標(biāo)抗原如PS或莢膜有機(jī)聚合物。例如，可在可溶性抗原如PS或莢膜有機(jī)聚合物的存在下通過載體蛋白自身共價(jià)交聯(lián)形成蛋白質(zhì)基質(zhì)這些疫苗被稱作蛋白質(zhì)基質(zhì)疫苗。彼此高度交聯(lián)的載體蛋白可形成能夠捕獲抗原白基質(zhì)可為封住抗原的"網(wǎng)格"形式或其中的抗原是"繩"而蛋白質(zhì)或交聯(lián)蛋白復(fù)合物是"珠"的一系列"串珠"的形式。如果載體蛋白圍繞抗原形成環(huán)繞抗原的環(huán)或纏結(jié)抗原的三維網(wǎng)，則可使載體蛋白包載抗原。另外，所述載體和抗原可以是交聯(lián)的，例如通過使抗原鏈與載體蛋白進(jìn)行鏈內(nèi)交聯(lián)。在期需的實(shí)施方案中，所述抗原和載體蛋白是非共價(jià)連接的。這種非共價(jià)連接可包括疏水作用、離子作用、范德華作用或氬^^盍。非共價(jià)連接可包括抗原與蛋白質(zhì)復(fù)合物非共價(jià)締合的物理幾何結(jié)構(gòu)(見以上"串珠"的比喻)。載體蛋白無需自身進(jìn)行交聯(lián)來包載抗原。例如也可通過在水溶液中混合載體蛋白和抗原并沉淀載體蛋白，由此使抗原與蛋白共沉淀來包載抗原。也可通過沉淀來自抗原和載體蛋白混合物的化合物(例如明礬、六偏磷酸鈉、聚磷嗪或由疏水或離子作用驅(qū)動的對蛋白質(zhì)有親和力的其他聚合物)來用載體蛋白包載抗原。沉淀蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域是標(biāo)準(zhǔn)化的并且其中包括，例如，(l)改變混合物的pH,(2)通過增加或減少混合物中無機(jī)鹽的濃度改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度，(3)或者往混合物加入三氯乙酸(TCA)或硫酸銨，(4)加熱混合物造成蛋白質(zhì)凝固(即形成沉淀或凝膠)，(5)以一定方式化學(xué)修飾混合物中的蛋白質(zhì)使其不能溶解，和(6)以足夠通量的電離輻射(紫外線、Y射線或P射線)輻照蛋白質(zhì)溶液S1起蛋白質(zhì)的交聯(lián)和/或沉淀。當(dāng)使用病原體莢膜蛋白時(shí)，這種疫苗叫做蛋白莢膜基質(zhì)疫苗(PCMV)。如在實(shí)施例中所描述的，制備出PCMV，其包括基于模式T細(xì)胞非依賴性莢膜抗原聚個(gè)D-谷氨酸(PGA)以及海藻酸(藻酸鹽)和葡聚糖；和例示性載體蛋白DNI的PCMV。PGAPCMV易于大量制備并且發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)典型于PGA蛋白綴合疫苗的免疫應(yīng)答?？稍谌魏文繕?biāo)抗原存在下用任何很多可能的接頭對任何很多可能的載體蛋白進(jìn)行交聯(lián)來制備本發(fā)明的疫苗。本文討論了例示性和優(yōu)選的接頭、載體蛋白和目標(biāo)抗原。多糖(PS)是糖的聚合物。來源于莢膜的PS是涉及針對莢膜細(xì)菌病原體的j呆護(hù)性免疫的初次抗原組分(primaryantigeniccomponent),這些細(xì)菌病原體例如有腦膜炎奈瑟氏球菌(7Ve&en'amem'wg"W)、肺炎鏈球菌(5Vz-eptococcus/wewmow,fle)、4另寒:^少門氏菌(5^/mowe〃a(^P》0和乙型流感嗜血菌(/foewo//2z7i^i"/^e"zaeTypeB)。用基于孩i生物PS的疫苗的免疫接種青少年和成年人在減少疾病困擾方面已經(jīng)成功，但已證明對于提供幼齡兒童(即24個(gè)月以下的兒童)保護(hù)性免疫方面效果較低。幼齡兒童的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)全部還沒有發(fā)育成熟，而T細(xì)胞非依賴性抗原如莢膜PS的免疫原性弱且不能在這些年輕的疫苗受者中引起長期的保護(hù)性免疫應(yīng)答(即免疫記憶應(yīng)答)。T細(xì)胞非依賴性抗原如PS可通過PS與蛋白質(zhì)的化學(xué)偶聯(lián)被轉(zhuǎn)化為T細(xì)胞依賴性抗原；這一化學(xué)偶聯(lián)過程稱作"綴合"且涉及PS結(jié)構(gòu)中的原子和存在于"載體"蛋白氨基酸的側(cè)鏈原子之間的共價(jià)連接形成。這種"綴合疫苗"更有效地促進(jìn)誘導(dǎo)B細(xì)胞成熟和同種型轉(zhuǎn)換，引發(fā)具有正確的抗PS保護(hù)性概況(profile)的水平高得多的抗體。保護(hù)性抗體對其PS抗原有著高親和力，通常是免疫球蛋白G(IgG)亞類、具有補(bǔ)體固定活性和調(diào)理素效應(yīng)子活性的壽期長的抗體。圖1顯示了關(guān)于PS和載體蛋白破傷風(fēng)類毒素之間的綴合物誘導(dǎo)抗PSIgG免疫應(yīng)答的例示性非限制性途徑。在該模型中，只有展示可識別PS的抗體受體的B細(xì)胞與PS蛋白綴合物結(jié)合。因此，載體蛋白被結(jié)合至顯示正確PS結(jié)合特異性的B細(xì)胞表面。蛋白-PS復(fù)合物被這些B細(xì)胞吸收到分子內(nèi)液泡區(qū)室，在這里載體受到蛋白質(zhì)降解作用加工。得自蛋白質(zhì)載體的肽被轉(zhuǎn)運(yùn)并負(fù)載到MHCII類受體(MHC-n)的呈遞溝(presentationgroove)中。該MHC-II-載體肽復(fù)合物展示于B細(xì)胞的表面。當(dāng)MHC-II-肽復(fù)合物被T細(xì)胞受體(TCR)識別時(shí)，T細(xì)胞受激活并分泌為誘導(dǎo)B細(xì)胞分化提供"輔助"的細(xì)胞因子。B細(xì)胞在數(shù)量上得到擴(kuò)大并分化成現(xiàn)成分泌抗體的"漿細(xì)胞"。最初免疫球蛋白M(IgM)由漿細(xì)胞生成但最終T細(xì)胞的輔助致使?jié){細(xì)胞進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換并生成其它同種型類別的抗體如IgG。這一過程隨著漿細(xì)胞經(jīng)歷突變而繼續(xù)，導(dǎo)致產(chǎn)生對PS蛋白綴合物有更高親和力的抗體受體。當(dāng)抗原被清除時(shí)，只有高親和力的漿細(xì)胞被保留在循環(huán)中殘余的PS蛋白綴合物激活。漿細(xì)胞的T細(xì)胞依賴的成熟過程的繼續(xù)，導(dǎo)致漿細(xì)胞群的擴(kuò)張，產(chǎn)生高親和力的IgG類抗體。通過測量經(jīng)免疫接種的受試對象如人血清內(nèi)抗PSIgG抗體的水平，可以很容易地監(jiān)測到擴(kuò)張情況。最終成熟和轉(zhuǎn)換過程導(dǎo)致壽期長的并對PS特異的記憶B細(xì)胞的生成。記憶B細(xì)胞具有獨(dú)特的特性，即如果暴露于PS則立即被激活。激活引起記憶B細(xì)胞增殖并快速產(chǎn)生抗PSIgG。發(fā)生在第二次暴露于PS抗原過程中的記憶B細(xì)胞的激活稱作"加強(qiáng)應(yīng)答"并表現(xiàn)出壽期長的"二次"記憶免疫應(yīng)答。初次免疫可刺激IgM抗體和一些IgG抗體的產(chǎn)生。在二次免疫，即"加強(qiáng)"注射時(shí)，已經(jīng)被初次免疫程序化的記憶細(xì)胞受到刺激而產(chǎn)生大量的IgG,即記憶免疫應(yīng)答。T細(xì)胞非依賴性抗原通常不刺激持久性免疫，即IgG抗體的產(chǎn)生，但可刺激較低效的更為臨時(shí)性的IgM抗體的產(chǎn)生。因而，PS抗原通常不單獨(dú)產(chǎn)生IgG加強(qiáng)應(yīng)答。然而，如果用PS蛋白綴合物進(jìn)行初次免疫，PS就會產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答，因?yàn)橛删Y合物誘導(dǎo)的記憶細(xì)胞已經(jīng)被程序化產(chǎn)生IgG。的確，在被經(jīng)接種疫苗的動物或人體內(nèi)的加強(qiáng)應(yīng)答被認(rèn)為是模擬由于暴露于展示PS的微生物而產(chǎn)生的保護(hù)性反應(yīng)；這種長期的記憶對于用綴合疫苗免疫接種數(shù)年后在保護(hù)免疫對象方面起作用的疫苗是很關(guān)鍵的。因此，PS蛋白綴合物的價(jià)值在于(l)它們誘導(dǎo)抗PS抗原的高水平IgG的能力，(2)它們誘導(dǎo)針對PS抗原的記憶免疫應(yīng)答的能力。PS抗原通常不顯示這些特性因而是次等的抗原。在合成綴合抗原方面的困難以及它們的生產(chǎn)成本致使針對很多細(xì)菌疾病(其中對PS的免疫應(yīng)答可能是保護(hù)性)的綴合疫苗的開發(fā)進(jìn)展緩慢。其它T細(xì)胞非依賴性抗原包括氨基酸同聚物，如聚-，D-谷氨酸(PGA)和多元醇。的確，大多數(shù)生物聚合物是T細(xì)胞非依賴性抗原。聚合物由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)(表位)的重復(fù)特性可與識別它們的B細(xì)胞免疫球蛋白(Ig)受體交聯(lián)。因此聚合物可以與多糖同樣的方式激活B細(xì)胞產(chǎn)生抗聚合物的IgM。例如，氨基酸同聚物，炭疽芽孢桿菌CBac,〃wawArac^)的聚卞D-谷氨酸(PGA)，是免疫原性弱和T細(xì)胞非依賴性抗原的莢膜聚合物。由與蛋白質(zhì)載體綴合的PGA組成的疫苗是高度免疫原性的，能夠誘導(dǎo)抗PGAIgG并且對PGA有免疫記憶。因此。大多數(shù)聚合物在它們的免疫原性方面像PS—樣起反應(yīng)，因?yàn)樗鼈儾荒軌蛟贛HC-n背景下被加工和展示，因此不能募集T細(xì)胞的輔助。在一些天然存在的與另一個(gè)類稱作Toll樣受體(TLR)的受體相互作用的聚合物中發(fā)現(xiàn)例外。一旦被激活，TLR可通過宿主細(xì)胞來誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生并使適應(yīng)性免疫應(yīng)答產(chǎn)生改變。一些PS與TLR配體共價(jià)連接或受到這種配體污染(contaminate)。例如，脂多糖(LPS)是高度免疫原性的、誘導(dǎo)IgG和記憶應(yīng)答的PS;LPS的脂A部分是TLR配體，可負(fù)責(zé)免疫學(xué)特性。在另一個(gè)實(shí)例中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)少數(shù)肺炎球菌PS即使它們不與蛋白載體相連也展現(xiàn)綴合疫苗的某些免疫學(xué)特性，即它們誘導(dǎo)向IgG的同種型轉(zhuǎn)換。最近，商業(yè)多糖疫苗Pneumovax-23,以及來自肺炎鏈球菌0S&卬tococa^;wewmom'"e)不同菌林的個(gè)別PS,發(fā)現(xiàn)被TLR配體污染(Sen等，J.Immunol.175:3084_3091,2005)。這一發(fā)現(xiàn)可以解釋為什么這些PS制劑在不存在蛋白綴合下能夠誘導(dǎo)向IgG的同種型轉(zhuǎn)換。這些肺炎球菌PS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-6和TNF-a。然而，通過苯酚萃取提取經(jīng)進(jìn)一步純化的PS則不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。在免疫研究中，經(jīng)苯酚提取的PS免疫原性弱且不再誘導(dǎo)抗PSIgG。因此，苯酚提取除去負(fù)責(zé)該P(yáng)S制劑的這些異常免疫學(xué)特性的污染分子。污染分子似乎是提供激活巨噬細(xì)胞TLR依賴性細(xì)胞因子應(yīng)答能力的TLR配體。通過苯酚提取對PS的進(jìn)一步純化除去了所述污染TLR配體并且致使PS完全成為T細(xì)胞依賴性。以上實(shí)例說明PS抗原可以起到如PS-蛋白綴合抗原一樣的作用而無需蛋白質(zhì)與碳水化合物的共價(jià)連接。不幸的是，TLR配體通常是促炎癥的。例如，LPS即使是很小的劑量也是有毒的。因此，雖然將TLR配體與PS混合可能擴(kuò)大對PS的免疫應(yīng)答，但這一方法還可能產(chǎn)生具反應(yīng)原性的或引起疫苗受者不良癥狀的疫苗。綴合疫苗技術(shù)保留了用于制備具有所需免疫原性語和安全性的PS疫苗的可選方法。隨PS-蛋白綴合疫苗的開發(fā)已經(jīng)大大地減少了由侵襲性細(xì)菌病原體引起的兒童疾病負(fù)擔(dān)。為數(shù)較少的這些疫苗包括抗乙型流感嗜血菌(//aemo/)/7i^z'wyZwewzaeBType)疫苗和某些腦膜炎球菌和鏈球菌菌株在發(fā)達(dá)國家是市面可售的。這些PS-蛋白綴合疫苗在發(fā)展中國家由于過于昂貴而無法在發(fā)展中國家生產(chǎn)和銷售。例如，商業(yè)可售的七Y介肺炎球菌綴合疫苗價(jià)值約每劑$58(2006年時(shí)的美元)，并且需要服用四劑。單單價(jià)格就使這些疫苗為那些在發(fā)展中國家承擔(dān)疾病負(fù)擔(dān)的人們力所不及。由于所涉及的化學(xué)和PS和載體蛋白的生產(chǎn)及純化成本，傳統(tǒng)的綴合疫苗難以進(jìn)行低價(jià)生產(chǎn)。通常在綴合前二者都需要具有相當(dāng)?shù)募兌龋瘜W(xué)反應(yīng)才得以以合理的偶聯(lián)效率來進(jìn)行。通常，偶聯(lián)化學(xué)必須對在所選PS和載體蛋白的化學(xué)方面獨(dú)特的各種PS奏效。這種偶聯(lián)化學(xué)在PS中引入官能團(tuán)，后者其后可經(jīng)過賴氨酸的e氨基側(cè)鏈與載體蛋白連接。引入這些偶聯(lián)基團(tuán)的PS化學(xué)修飾可破壞PS上的表位并引入新的表位(例如，與接頭或修飾的糖基相關(guān)的表位)，其顯著性只有通過認(rèn)真仔細(xì)的免疫學(xué)分析才能評估。此外，對于傳統(tǒng)的PS-蛋白綴合疫苗，PS的大小、每個(gè)蛋白載體分子所連接的PS分子數(shù)目、所選性。因此，例如在肺炎球菌病(其中每種90+已知血清型都具有不同的PS結(jié)構(gòu)(Bentley等，PLOSGenetics2(3):e31262-269，2006))的情況下，一種單一的綴合方法可能不適合所有的血清型。重復(fù)合成(reproduciblysynthesize)具有重復(fù)免疫學(xué)特性(reproducibleimmunologicalproperty)的綴合疫苗涉及對PS的大小、每個(gè)載體蛋白分子所連接的PS分子數(shù)目、所選載體的性質(zhì)以及連接化學(xué)的類型進(jìn)行仔細(xì)控制，而這又顯著地增加了制造綴合疫苗的成本?？股乜剐缘某霈F(xiàn)使對開發(fā)安全有效的疫苗迫切性更為突出。制造廣泛可用的疫苗，尤其是對于發(fā)展中國家而言，還需要制造節(jié)省成本的疫苗。使針對來自一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌種類不同血清型的多種多糖抗原的綴合聯(lián)苗，合并到兒童期的免疫方案中，這將簡化高危人群的疫苗給藥。然而，現(xiàn)有的綴合疫苗技術(shù)是不劃算的，因此綴合聯(lián)苗(combinationconjugatevaccine)幾乎不可能在發(fā)展中國家普及。的確，甚至在已建立了強(qiáng)大市場的發(fā)達(dá)國家，最近Wyeth7-價(jià)綴合肺炎球菌疫苗的供應(yīng)短缺說明了生產(chǎn)和儲存需要復(fù)雜綴合疫苗合成技術(shù)的疫苗是多么困難。在期需的實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗是多價(jià)莢膜基質(zhì)疫苗(PCMV)，其中一種或多個(gè)細(xì)菌莢膜組分被包載到多價(jià)載體蛋白基質(zhì)中。制備PCMV很容易，因?yàn)樽鳛槠鹗疾牧现坏哪繕?biāo)抗原，例如莢膜，僅僅需要適當(dāng)?shù)募兌取＠?，Vedan聚卩D-谷氨酸(PGA)也是不純的(它在DNI上攜帶蛋白酶活性)，如在本文所描述的，其行為完全如同所料想的T細(xì)胞非依賴性抗原(實(shí)施例1)。在所有三種PCMV制劑(蛋白質(zhì)與PGA比率在其7倍以上范圍有所不同)中的PGA向PCMV的參入是成功的。因?yàn)橹苽浔景l(fā)明疫苗的方法不需要任何目標(biāo)抗原例如莢膜多糖的化學(xué)知識，該方法不依賴開發(fā)與目標(biāo)抗原和載體蛋白化學(xué)可容的交聯(lián)化學(xué)的需要。雖然某些抗原仍可能與接頭相互作用，但這不應(yīng)減損疫苗的效能，因?yàn)槟繕?biāo)抗原和載體蛋白的無意交聯(lián)無論如何將可料到是具有免疫原特性的。在本發(fā)明的疫苗中，目標(biāo)抗原與載體蛋白的交聯(lián)不是使疫苗有效所必需的。這與傳統(tǒng)綴合疫苗形成鮮明對比，因此在其制備和開發(fā)中受到阻礙。本發(fā)明的疫苗期需具有至少，例如1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%乃至100%交聯(lián)的載體蛋白，并且不超過，例如1%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90°/。的目標(biāo)抗原與載體蛋白交聯(lián)。理想地，不超過10%的抗原與載體蛋白交聯(lián)且至少50%的載體蛋白被交聯(lián)。本文所描述的制備疫苗的方法沒有導(dǎo)致目標(biāo)抗原例如莢膜聚合物被廣泛修飾?？乖ǔ１３滞瑯拥臓顟B(tài)，可能的修飾是例如對于在聚合物鏈的末端攜帶這種基團(tuán)的PS莢膜而言還原糖的還原(reduction)。這種微小的修飾不可能影響到大多數(shù)莢膜PS的免疫原性，因?yàn)榫酆衔飪?nèi)部殘基比末端糖豐富IOO-IOOO倍。相反，對于傳統(tǒng)的綴合疫苗，通常需要將接頭基團(tuán)引入抗原例如莢膜聚合物，用作載體蛋白的共價(jià)連接點(diǎn)。需要使用接頭，因?yàn)楹芏嗫乖缜v膜聚合物沒有作為其結(jié)構(gòu)的一部分的反應(yīng)基例如羧基或氨基。例如，將接頭化學(xué)引入PS可導(dǎo)致莢膜表位的破壞和由于其與宿主自身表位未知的免疫交叉反應(yīng)性而在疫苗制品中產(chǎn)生不期望的新的表位。本文所描述的疫苗制備方法不如綴合疫苗技術(shù)復(fù)雜，因?yàn)槠浠瘜W(xué)僅依賴載體蛋白(例如DNI，霍亂毒素B亞基，白喉毒素、破傷風(fēng)毒素片段C或大腸桿菌(Esc/^Wc/^co/Z)p-半乳糖苷酶)的交聯(lián)化學(xué)。例如，當(dāng)與DNI混合時(shí)莢膜聚合物雖然影響交聯(lián)率，但并不影響交聯(lián)的模式或程度，這兩者更多地受控于所使用的蛋白質(zhì)、濃度和所加入的交聯(lián)劑(例如戊二搭)濃度?？梢匀菀椎卣{(diào)整這些參數(shù)，,人而減少制備疫苗所需的時(shí)間和努力，節(jié)省費(fèi)用。可使用本文所描述的制備PCMV的方法，連同任何抗原例如任何莢膜聚合物或任何帶有少數(shù)氨基或無氨基的聚合物、和任何可被交聯(lián)的載體蛋白例如沒有可被硼氫化物還原作用破壞的關(guān)鍵表位的載體蛋白。在本文所描述方法中使用的載體蛋白期需具有至少2個(gè)賴氨酸殘基或開放的(unblocked)并經(jīng)化學(xué)修飾可進(jìn)行交聯(lián)的其它殘基。破傷風(fēng)類毒素是一種可能的載體蛋白。該毒素通過使用曱醛進(jìn)行解毒，曱醛是與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)的試劑。其它期需的載體蛋白包括霍亂毒素B亞基(購自SBLVaccinAB)、白喉毒素、破傷風(fēng)毒素片段C(購自SigmaAldrich)、DNI或來自大腸桿菌(&c/enWn'aco/z')的p-半乳糖苷酶(購自SigmaAldrich)。當(dāng)前多價(jià)綴合疫苗通過首先合成個(gè)別的綴合疫苗，隨后將它們混合產(chǎn)生"混合物"綴合疫苗來制備(例如，Wyeth七價(jià)肺炎球菌疫苗，Prevnar)。通過將化學(xué)不同的抗原例如莢膜有機(jī)聚合物混合到一起隨后用例如戊二醛使載體蛋白交聯(lián)，或者通過將分別合成的本發(fā)明特定疫苗混合，可以使用本發(fā)明制備疫苗的方法制備多價(jià)的疫苗。該靈活性為本發(fā)明制備多價(jià)疫苗的方法提供了顯著優(yōu)勢。在實(shí)施例中所討論的本發(fā)明例示性疫苗PCMV疫苗弁l-3，其性能有如綴合疫苗，盡管事實(shí)上這些疫苗經(jīng)過不預(yù)期產(chǎn)生任何共價(jià)4泉的方法來合成，所述共價(jià)^:在構(gòu)成PGA分子的原子和構(gòu)成DNI蛋白的原子之間形成。戊二醛專一地與由賴氨酸殘基的s氨基所代表的蛋白質(zhì)氨基側(cè)鏈起反應(yīng)。PGA聚合物沒有游離氨基且僅具有不與戊二醛反應(yīng)的羧的PGA分子被分子地包載在DNI蛋白質(zhì)分子交聯(lián)基質(zhì)內(nèi)部。按照非限制性模式，所述包載的作用是攜帶DNI蛋白和PGA進(jìn)入B細(xì)胞，而B細(xì)胞借助免疫識別PGA的Ig受體與這種基質(zhì)結(jié)合。一旦被這些B細(xì)胞吸收，所述基質(zhì)以與傳統(tǒng)的綴合疫苗相似的方式被降解，這會導(dǎo)致在相應(yīng)B細(xì)胞的MHC-II分子上展示的DNI衍生肽的產(chǎn)生。這隨即募集T細(xì)胞的附助從而導(dǎo)致這種B細(xì)胞的擴(kuò)增和成熟，成為產(chǎn)生對PGA特異的產(chǎn)IgG漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞。因此，根據(jù)非限制性模式，PCMV在免疫上起類似于蛋白-綴合莢膜疫苗的作用卻又截然不同，因?yàn)镻CMV缺乏載體蛋白和莢膜聚合物之間的顯著共價(jià)連接。包括PCMV在內(nèi)的本發(fā)明的疫苗可用于組合，例如用于兒科疫苗。另外，本發(fā)明的疫苗可用于接種對抗，例如，肺炎球菌感染、(A組和B組)鏈球菌感染、乙型流感嗜血菌(/7"ewo;/w7^z'"y7wewzcte7>/e釣("HiB")感染、腦膜炎球菌(例如，腦膜炎奈瑟氏球菌(A^wen'amem'"g故Je》)感染，并可用作來自革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，銅綠假單胞菌(尸wwci麵o""5"erwg7-"OJ^)、土拉熱弗朗西絲氏菌(Fra""W/a威r譜/5XThirumalap歸等，J.Med.Microbiol.54:693-695,2005;Vinogradov和Perry，Carbohydr.Res.339:1643-1648,2004;Vinogradov等，Carbohydr.Res.214:289-297,1991)、志賀氏菌GS/n'取〃aspecies)、沙門氏菌(5"<3/附0"6//"s;ea'es)、不動桿菌(Jcz力efc^"c/ers/e"'es)、伯克霍爾德、氏菌(5w^:AoWen'a5/ecz'as)禾口大腸才干菌0Esc力en'c力z'aco/z'))的0^元原、疫苗。本發(fā)明疫苗可通過以下方式制備在一種或多種例如在本文所描述的目標(biāo)抗原的存在下，使用任何例如那些在本文所描述的接頭使任何例如那些在本文所描述的載體蛋白交聯(lián)。如果4吏用一種目標(biāo)抗原，本發(fā)明蛋白基質(zhì)疫苗則被認(rèn)為是單價(jià)疫苗。如果使用多于一種目標(biāo)抗原，本發(fā)明的蛋白基質(zhì)疫苗則被認(rèn)為是多價(jià)疫苗。如果微生物莢膜聚合物是目標(biāo)抗原，本發(fā)明蛋白基質(zhì)疫苗則被認(rèn)為是蛋白莢膜基質(zhì)疫苗(PCMV)。接頭載體蛋白交聯(lián)在本
技術(shù)領(lǐng)域：
已為人熟知，包括戊二醛、間馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺基酯、碳二亞胺和雙偶氮聯(lián)苯胺。使用同質(zhì)雙功能或異質(zhì)雙功能接頭直接交聯(lián)載體蛋白的一般方'法禾口咅卩分已有4省述，侈')i口在G.T.HermansoninBioconjugateTechniques,AcademicPress,1996和Dick和BeurretinConjugateVaccines.Contribu.Microbiol.Immunol.,Karger,Basal10:48-114,1989中。例如，對于具有數(shù)目為n的賴氨酸部分的載體蛋白而言，理論上，有n+l個(gè)伯胺(包括末端胺)可用于與例示性交聯(lián)劑的羧基反應(yīng)。因此，若使用該直接綴合方法，產(chǎn)物僅限于具有所形成的n+l個(gè)酰胺鍵。在本發(fā)明期需的實(shí)施方案中所使用的接頭，最簡單不過，是連接兩個(gè)載體蛋白的鍵。所述接頭可以是直鏈、環(huán)狀或支鏈的分子骨架，帶有與兩個(gè)載體蛋白(A)和(B)共價(jià)連接的側(cè)基。任何給定的載體蛋白都可與多于一個(gè)載體蛋白連接，從而產(chǎn)生可封閉(enclose)抗原的互聯(lián)的載體蛋白基質(zhì)。術(shù)語連接基團(tuán)是指由接頭(L)的反應(yīng)部分與官能團(tuán)(A)和(B)結(jié)合所產(chǎn)生的共價(jià)鍵。所述連接基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于S旨、氨基曱酸酯、硫酯、亞胺、二硫化物、酰胺、醚、硫醚、磺酰胺、異脲、異硫脲、亞氨酸酯、脒、氨基磷酸酯、磷酸二酯、硫醚和腙。(A)與(B)的連接通過共價(jià)的方式實(shí)現(xiàn)，包括與位于(A)和(B)上的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)形成鍵(連接基團(tuán))。可用于此目的的化學(xué)反應(yīng)官能團(tuán)的實(shí)例包括但不限于氨基、羥基、巰基、羧基、羰基、硫醚(thioether)、胍基(guanidinyl)、咪唑基和酚基，所有這些基團(tuán)都存在于許多載體蛋白中的天然氨基酸中。因此可用含有反應(yīng)部分的接頭(L)影響(A)與(B)的共價(jià)連接，該反應(yīng)部分能與存在于(A)和(B)的所述官能團(tuán)反應(yīng)。該反應(yīng)的產(chǎn)物是連接基團(tuán)，其含有連接(L)與(A)以及連接(L)與(B)的新形成的鍵。例如，羥基(A)可與(L)羧基或其活化的衍生物反應(yīng)，參見下文，導(dǎo)致酯連接基團(tuán)的形成。能夠與巰基反應(yīng)的部分的實(shí)例包括XCH2CO-型(其中X=Br,Cl,或I)的a-卣代乙?；衔?，其顯示與巰基特定的反應(yīng)性，但還可用于修飾咪唑基、硫醚(thioether)、苯酚和氨基，這正如例如Gurd,Me,/w^^V^ymo/.11:532,1967所描述。N-馬來酰亞胺衍生物被認(rèn)為對巰基具有選擇性，但在特定條件下可另外用于偶聯(lián)氨基。如果連接通過形成二硫橋進(jìn)行，那么例如通過氨基轉(zhuǎn)換引入巰基的2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷的試劑(Traut等，所oc/^mz'5^y12:3266,1973)可考慮作為巰基試劑。能夠與氨基反應(yīng)的反應(yīng)部分的實(shí)例包括，例如，烷化和?；噭?。具代表性的烷化試劑包括(i)a-卣代乙酰基化合物，在活性巰基不存在時(shí)顯示對氨基的特異性并且為XCH2CO-型(其中X=C1,Br或I),這正如Wong(Biochemistry24:5337,1979)所描述；(ii)N-馬來酰亞胺衍生物，可通過Michael反應(yīng)或通過加入環(huán)羰基的?；饔门c氨基反應(yīng)，這正如Smyth等(J.Am.Chem.Soc.82:4600:1960和歷oc&m.91:589，1964)所描述;(iii)芳基鹵，例如反應(yīng)性硝基鹵芳族化合物；(iv)烷基卣，如例如McKenzie等(J.ProteinChem.7:581,1988)所描述的；(v)能夠與氨基反應(yīng)形成席夫堿的醛和酮，通常通過還原得到穩(wěn)定的胺使形成的加成物穩(wěn)定；(vi)環(huán)氧衍生物，如環(huán)氧氯丙烷和雙環(huán)氧乙烷，可與氨基、巰基或酚羥基反應(yīng)；(vii)s-三。秦的含氯衍生物，與親核試劑如氨基、巰基和羥基有很強(qiáng)的反應(yīng)活性；(viii)上述s-三噢化合物的氮丙啶，如Ross(J.Adv.CancerRes.2:1,1954)所描述，通過開環(huán)與親核試劑如氨基反應(yīng)；(ix)如Tietze(Chem.Ber.124:1215,1991)所描述的方酸二乙酯；和(x)a-卣代烷醚，是比一般的烷基卣更具反應(yīng)性的烷化試劑，因?yàn)槊蜒踉赢a(chǎn)生活化作用，這正如例如Benneche等(Eur.J.Med.Chem.28:463,1993)所描述。具代表性的氨基反應(yīng)?；噭┌?i)異氰酸酯和異硫氰酸酯，尤其是芳族衍生物，分別形成穩(wěn)定的脲和硫脲衍生物；(ii)磺酰氯，已由Herzig等(Biopolymers2:349，1964)作描述；(iii)?；u；(iv)活性酯，例如硝基苯酯或N-羥基琥珀酰亞胺酯；(v)酸酐，如混合酸酐、對稱酸酐或N-羧酸酐；(vi)其它對于酰胺4建形成有用的試劑，如M.Bodansky(PrinciplesofPeptideSynthesis,Springer-Verlag,1984)所描述的；(vii)?；B氮化合物，例如用亞硝酸鈉由預(yù)制的酰肼衍生物生成的疊氮基，如Wetz等(Anal.Biochem.58:347,1974)所描述；和(viii)亞氨酸酉旨，其與氨基反應(yīng)形成穩(wěn)定的脒，這如例如Hunter和Ludwig(J.Am.Chem.Soc.84:3491,1962)所描述。醛類例如戊二醛和酮可與胺反應(yīng)形成席夫;威，可通過還原胺化作用有利地進(jìn)行穩(wěn)定。烷氧氨基部分易于與酮和醛反應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定的烷氧基胺(alkoxamine),這如例如Webb等(BioconjugateChem.1:96,1990)所描述的。能夠與羧基反應(yīng)的活性部分的實(shí)例包括重氮化合物如重氮基乙酸酯和重氮基乙酰胺，它們以高度特異性進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生酯基，如Herriot(Adv.ProteinChem.3:169，1947)所描述。也可使用羧酸修飾試劑例如碳化二亞胺，其通過0-?；宓男纬稍偻ㄟ^酰胺^t的形成進(jìn)行反應(yīng)得到。在(A)和/或(B)中的官能團(tuán)，如有需要，可在反應(yīng)前轉(zhuǎn)化成其它官能團(tuán)，例如以賦予另外的反應(yīng)性或選擇性。用于此目的的方法實(shí)例包括使用如二元羧酸酐的試劑使胺轉(zhuǎn)換成羧酸；使用試劑如N-乙酰高半胱氨酸硫內(nèi)酯、S-乙酰巰基琥珀酸酐、2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷達(dá)到或含有硫羥基的琥珀酰亞胺基衍生物來使胺轉(zhuǎn)換成硫醇；使用例如a-鹵乙酸酯的試劑使硫醇轉(zhuǎn)換成羧酸；使用例如氮丙啶或2-溴乙胺的試劑使硫醇轉(zhuǎn)換成胺；使用例如碳二亞胺的試劑隨后使用二胺使羧酸轉(zhuǎn)換成胺；使用例如對曱苯磺酰氯的試劑隨后用硫代乙酸酯進(jìn)行酯交換作用并用乙酸鈉水解成硫醇來使醇轉(zhuǎn)換成硫醇。若有需要，可依照本發(fā)明使用所謂的零長接頭，其涉及活性化學(xué)基團(tuán)(A)與活性化學(xué)基團(tuán)(B)在不引入另外連接材料的情況下直接進(jìn)行共價(jià)連接。實(shí)例所包括的化合物，其中(L)代表連接(A)上的氧原子和存在于(B)上的羰基或硫代羰基部分的化學(xué)鍵，致使連接基團(tuán)是酯或硫酯。例如，可通過使用碳二亞胺化學(xué)產(chǎn)生A-L-B,使氨基(A)連接到羧基(B),其中L是酰胺鍵或連接到N-R的R-CK)，其中R是來自同一個(gè)或兩個(gè)不同蛋白質(zhì)分子的氨基酸側(cè)鏈的碳鏈。然而，最常見的是，所述接頭包括由上述間隔元件連接的兩個(gè)或更多個(gè)活性部分。間隔物的存在允許雙功能接頭與(A)和(B)中的特定官能團(tuán)反應(yīng)，產(chǎn)生這兩個(gè)化合物之間的共價(jià)連接。接頭(L)中的活性部分可以相同(同質(zhì)雙功能接頭)或者不同(異質(zhì)雙功能接頭、或者其中存在幾個(gè)相異活性部分的異質(zhì)多功能接頭)，這提供多種可在(A)和(B)之間產(chǎn)生共價(jià)連接的潛在試劑。間隔元件通常由鏈組成，這些鏈通過以下基團(tuán)有效地分離(A)和(B):1-10個(gè)碳原子的直連或支鏈烷基、1-10個(gè)原子的直連或支鏈雜烷基、2-10個(gè)碳原子的直連或支鏈烯烴、2-10個(gè)碳原子的直連或支鏈炔烴、5-10個(gè)碳原子的芳族殘基、3-10個(gè)原子的環(huán)狀體系或一(CH2CH20)nCH2CH2-(其中n為l隱4)。連接劑所引入的外來材料的性質(zhì)可能對最終疫苗制品的藥物動力學(xué)和/或活性有影響。因此，期需引入可裂解的接頭，它含有可生物降解或化學(xué)敏感的或摻入酶切位點(diǎn)的間隔臂。這些可裂解的接頭，例如在PCT公開WO92/17436(通過引用結(jié)合到本文中)中所描述的，在體內(nèi)易被生物降解。在某些情況下，連接基團(tuán)在酯酶的存在下被裂解，在這種酶不存在的情況下則保持穩(wěn)定。因此，可有利地將(A)和(B)連接以允許它們通過患病部位附近活;沃的酶而緩慢釋放。接頭可形成具有式I的可生物降解的二酯、二酰胺或二氨基曱酸酯基團(tuán)的連4妄基團(tuán)-(Z1)0-(YV(Z2)s-(R11HZ3)t-(Y2)v-(zVI其中，Z1、Z2、Z3和Z4中的每一個(gè)獨(dú)立選自O(shè)、S和NRu(其中R!2是氫或烷基)；Y4口Y"中的每一個(gè)獨(dú)立選自羰基、硫代羰基、磺?；⒘柞；蝾愃频乃嵝纬苫鶊F(tuán)；o、p、s、t、u和v中的每一個(gè)都獨(dú)立為0或者1;Rn是1-10個(gè)碳原子的直連或支鏈烷基、1-10個(gè)原子的直連或支鏈雜烷基、2-10個(gè)碳原子的直連或支鏈烯烴、2-10個(gè)碳原子的直連或支鏈炔烴、5-10個(gè)碳原子的芳族殘基、3-10個(gè)原子的環(huán)狀體系、-(CH2CH20)qCH2CH24tq為1-4、或者將-(Z"。-(Y、-(z2V連接到-(Z3)t-(Y2)V-(Z4)P-的化學(xué)鍵。本發(fā)明所使用的例示性的期需接頭(L)可用式n-ni中的任何一個(gè)分子來描述IIIII其中所述接頭與氧原子(A)和氧原子(B)共價(jià)連接。因此，式n-ni的接頭(L)通過二吡喃、酯或氨基曱酸酯連接基團(tuán)與載體蛋白(A)和(B)連接。在這些實(shí)施方案中，R43代表l-10個(gè)碳原子的直連或支鏈烷基、1-10個(gè)原子的直連或支鏈雜烷基、2-10個(gè)碳原子的直連或支鏈烯烴、2-10個(gè)碳原子的直連或支鏈炔烴、5-10個(gè)碳原子的芳族殘基、3-10個(gè)原子的環(huán)狀體系、其中n為1-4的-(CH2CH20)nCH2CH2-或連接兩個(gè)氮或兩個(gè)羰基的化學(xué)鍵。為形成腙鍵而設(shè)計(jì)的接頭具有化學(xué)式IV:們-(Z〕)w-(R!4)"^5IV其中Z5選自O(shè)、S或NRw;1116是氫或烷基；1115選自氫、烷基或雜烷基；Ys選自羰基、石危代羰基、磺?；?、磷?；蚺c氧原子(A)共價(jià)連接的類似的酸形成基團(tuán)；w是0或1;&4是1-10個(gè)碳原子的直連或支鏈烷基、l-10個(gè)原子的直連或支鏈雜烷基、2-10個(gè)碳原子的直連或支鏈烯烴、2-10個(gè)碳原子的直連或支鏈炔烴、5-10個(gè)碳原子的芳族殘基、3-10個(gè)原子的環(huán)狀體系、n是l-4的-(CH2CH20)nCH2CH2-、X4II或者將-(Y(zS)w-連接到"^"Ris的化學(xué)鍵；而X4是腙，由含有酰肼基的(B)和接頭II前體的縮合反應(yīng)產(chǎn)生，其中X4是酮或趁基的氧原子。載體蛋白一般而言，任何可以在生理?xiàng)l件下與抗原包載的載體蛋白可在本發(fā)明中可使用。理想地，所述抗原與載體蛋白包載在復(fù)合物中，而在抗原和載體蛋白之間不存在顯著的共價(jià)連接時(shí)。不存在顯著的共價(jià)連接，意指不超過50%的抗原與載體連接。在期需的實(shí)施方案中，不超過40%、30%、10%或5%的抗原與載體蛋白共^^連接。所述抗原/載體蛋白復(fù)合物可含有另一種化合物如明礬，并且這另一種化合物，在期需的實(shí)施方案中，可以包載抗原和載體蛋白。理想地，用于本發(fā)明疫苗的載體蛋白是那些單獨(dú)的或與抗原結(jié)合的蛋白質(zhì)，其引起受試對象的免疫應(yīng)答。理想地，所述載體蛋白含有至少一個(gè)被T細(xì)胞識別的表位。理想地，所述表位能夠誘導(dǎo)受試對象的T細(xì)胞應(yīng)答，并誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生針對整個(gè)目標(biāo)抗原的抗體。用于描述本發(fā)明的表位，包括負(fù)責(zé)與抗體分子或其片段進(jìn)行特異反應(yīng)的抗原上的任何決定蔟。表位決定蔟通常由諸如氨基酸或糖側(cè)鏈的分子的化學(xué)活性表面簇(grouping)組成，具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。為了具有免疫原性，蛋白質(zhì)或多肽通常能夠刺激T細(xì)胞。然而，缺乏被T細(xì)胞識別的表位的載體蛋白也可具有免疫原性。通過對已知S1起強(qiáng)烈免疫應(yīng)答的載體蛋白進(jìn)行選擇，可以用本文所述的PCMV治療不同群體的受試對象。載體蛋白期需與引起對疫苗的強(qiáng)烈免疫應(yīng)答完全無關(guān)(sufficientlyforeign)。典型地，所使用的載體蛋白是能夠賦予目標(biāo)抗原免疫原性的分子。在一個(gè)期需的實(shí)施方案中，載體蛋白本來具有高度免疫原性。因此，具有高度的免疫原性并能使針對與其復(fù)合的抗原的抗體產(chǎn)量最大化的載體蛋白是理想的。本發(fā)明的各種載體蛋白包括，例如，毒素和類毒素(化學(xué)的或遺傳的)，其可以是或者不是突變體，如炭疽熱毒素、PA和DNI(PharmAthene,Inc.)、白4矣類毒素(MassachusettsStateBiologicalLabs;SerumInstituteofIndia,Ltd.)或CRM197、破傷風(fēng)毒素、破傷風(fēng)類毒素(MassachusettsStateBiologicalLabs;SerumInstituteofIndia,Ltd.)、破傷風(fēng)毒素片段Z、銅綠假單胞菌(尸化Mcfowortw"erwg^o^)外毒素A或外毒素A突變體、細(xì)菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、腦膜炎奈瑟氏球菌(7Ve&en'amem'"g"^fo)夕卜膜蛋白(菌林由ATCC提供(美國典型培養(yǎng)物中心，Manassas，VA))、銅綠假單胞菌(尸wi^omowasaen^z'mwa)Hcpl蛋白、大腸桿菌(Esc/e"'c/n'aco/()熱不穩(wěn)'定腸毒素、志賀樣毒素、人LTB蛋白、來自完整細(xì)菌細(xì)胞的蛋白提取物、可通過接頭進(jìn)行交聯(lián)的任何其它蛋白。理想地，所述載體蛋白是霍亂毒素B亞基(由SBLVaccinAB提供)、白喉毒素(Connaught,Inc.)、破傷風(fēng)毒素片段C(由SigmaAldrich提供)、DNI、或來自大腸桿菌(Sc/^n'c/n-flco/z')的(3-半乳糖苷酶(由SigmaAldrich提供)。其它期需的載體蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、P40和雞核黃素。(除非另外指出，例示性載體蛋白從SigmaAldrich購得)其它例示性載體蛋白是作為分支肽的MAP(多抗原肽)。通過使用MAP，交聯(lián)密度由于多個(gè)分支的氨基酸殘基而達(dá)到最大化?？捎糜谛纬蒑AP的例示性氨基酸為但不限于賴氨酸。BSA和匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)在用動物進(jìn)行試驗(yàn)的疫苗開發(fā)中通常都被用作載體。已用于制備治療疫苗的載體蛋白包括，但不限于許多致病菌毒素和它們的類毒素。實(shí)例包括白喉和破傷風(fēng)毒素以及它們醫(yī)學(xué)上可接受的相應(yīng)的類毒素。其它候選載體蛋白是抗原上與稱為交叉反應(yīng)材料(CRM)的細(xì)菌毒素類似的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的載體蛋白還可包括任何非人源的和任何人類食物中不存在的蛋白。在本發(fā)明期需的實(shí)施方案中，形成環(huán)樣結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)用于制備PCMV。這些蛋白包括銅綠假單胞菌(尸"wcfomo/wwaerag^o^)的Hcpl蛋白、霍亂毒素的無毒"B亞基"、大腸桿菌(Eyc/^n'cAz'aco/0熱不穩(wěn)定腸毒素和志賀樣毒素。這種環(huán)樣蛋白復(fù)合物可形成"串珠"，其中線性的PS鏈穿透這些環(huán)形蛋白復(fù)合物的中央槽。在蛋白發(fā)生交聯(lián)后，預(yù)測這種復(fù)合物特別穩(wěn)定。蛋白的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示這些中央槽對于PS鏈來說足夠大以至可使其輕易進(jìn)入。例如，Hcpl六聚體環(huán)的中央槽為42埃(A)，其足夠?qū)捯灾量奢p易地容納若干個(gè)寬度為5.5埃的多糖鏈(Mougous等，Science312(5779):1526國1530,2006)。或者，蛋白環(huán)可環(huán)繞PS進(jìn)行裝配(例如，在特定的物理化學(xué)條件下，從天然裝配的單體載體蛋白亞基進(jìn)入環(huán))。這種可裝配進(jìn)環(huán)的單體蛋白在本
技術(shù)領(lǐng)域：
為人所知并且包括，例如，肺炎球菌溶血素(Walker等，Infect.Immun.55(5):1184-1189，1987;Kanclerski和Mollby,J.Clin.Microbiol.25(2):222-225，1987)、李斯特菌溶素O(Kayal和Charbit,FEMSMicrobiol.Rev.30:514-529,2006;Mengaud等，Infect.Immun.55(12):3225-3227，1987)、DNI、炭疽熱PA、Hcpl、霍亂毒素B亞基、志賀毒素B亞基、鞭毛蛋白和無數(shù)在本領(lǐng)域所熟知的由各種微生物制備的相關(guān)分子。在另一個(gè)期需的實(shí)施方案中，用Toll樣受體(TLR)激動劑作為載體蛋白。Toll樣受體(TLR)活化在形成獲得性免疫應(yīng)答方面是重要的，在抗體應(yīng)答的親和力成熟、同種型轉(zhuǎn)換和免疫記憶方面發(fā)揮作用?；魜y弧菌(F仏n'oc/w/erae)鞭毛蛋白(FLA)是TLR激動劑。超過20mg的FLA蛋白已從重組大腸桿菌(Esc/^n'c/u'aco/z')中純化得到，在本文所述的IL-6巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分析中顯示為有效的TLR活化劑。另外，稱作"肺炎球菌溶血素"的高度保守的肺炎鏈球菌OSfr印tococcM;wewmom'ae)蛋白也顯示能激活TLR4,而且還是保護(hù)性抗原。因此，該蛋白也可用作PCMV載體蛋白。此外，外膜蛋白(OMP)混合物(例如，腦膜炎奈瑟氏球菌(A^wen力mem'"g"W力的OMP)被用作由Merck生產(chǎn)的HIB綴合疫苗的載體蛋白，而來自完整月申炎鏈球菌《連球菌(6Vre;tococca//wewmom'"e)纟田菌細(xì)月包的蛋白提取物在動物感染模型中顯示為具有至少部分保護(hù)性。在本發(fā)明期需的實(shí)施方案中，這些蛋白混合物是PCMV載體蛋白的來源。在期需的實(shí)施方案中，所述PCMV方法與載體蛋白一起使用，所述載體蛋白具有，例如，至少2個(gè)賴氨酸殘基或開放的并經(jīng)化學(xué)修飾可進(jìn)行交聯(lián)的其它殘基。在另一個(gè)期需的實(shí)施方案中，所述載體蛋白是多聚體(例如，含有至少5個(gè)亞基的多聚體)。理想地，所述多聚體是同多聚體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用DNI作為載體蛋白，因?yàn)樗菬o毒的，不必在使用前將蛋白去毒。此外，DNI的使用是理想的，因?yàn)镈NI除誘導(dǎo)對目標(biāo)抗原的保護(hù)性免疫應(yīng)答之外，還可誘導(dǎo)對炭疽芽孢桿菌(及awArac&)的免疫應(yīng)答。此外，DNI沒有內(nèi)部二石;U定。這種4建對氫硼化物還原作用敏感，后者能夠使蛋白變性并導(dǎo)致誘導(dǎo)炭疽毒素中和抗體的表位的喪失。目標(biāo)抗原本發(fā)明的疫苗組合物和制備及給予這種疫苗的方法適用于任何目標(biāo)抗原，例如，多糖、多元醇或聚氨基酸。理想地，所述目標(biāo)抗原不攜帶可以被疫苗制備方法所采用的化學(xué)反應(yīng)破壞的初級基團(tuán)(primarygroup),所述化學(xué)反應(yīng)例如，通過氫硼化物還原作用破壞抗原二硫鍵引起抗原的變性。例示性目標(biāo)抗原包括有機(jī)聚合物如多糖(例如有至少18個(gè)殘基的多糖)、磷酸多糖、具有N-乙?；〈陌被堑亩嗵恰⒑谢前孵Ｌ堑亩嗵?、其它硫酸基修飾的糖或磷酸基修飾的糖、多元醇、聚氨基酸、磷壁質(zhì)酸和脂多糖O側(cè)鏈。例示性目標(biāo)抗原包括那些由微生物如細(xì)菌、真菌、寄生蟲、病毒合成的并用標(biāo)準(zhǔn)方法從這種生物來源提純的莢膜有機(jī)聚合物。例示性目標(biāo)抗原包括微生物莢膜有機(jī)聚合物，包括從以下微生物中純化的那些莢膜有機(jī)聚合物細(xì)菌生物體，例如芽孢桿菌(Bacillusspecies)(包括炭疽芽孢桿菌(及awAracZ》)(Wang和Lucas,Infect.Immun.72(9):5460-5463,2004)、月申炎鏈球菌(^SV，tococcws，e訓(xùn)畫—(Bentley等,PLoSGenet,2(3):e31:Epub2006;Kolkman等，J.Biochemistry123:937-945，1998;和Kong等,J.Med.Micorbiol.54:351-356,2005)、志賀氏菌(Shigella)(Zhao等,Carbohydr..Res.342(9):1275-1279,Epub2007)、流感嗜血菌(ifaemo//u7ws,^/7we"zae)、腦膜炎奈瑟氏玉求菌(7Ve&wWawem'wg"zW力、金黃色葡萄球菌(6Va/Ay/oc。ccM5flwm/)、傷寒沙門氏菌(Sa/膨"e〃"(ypA/)、酉良腺《連5求菌(/SVre;tococcus/yogewas1)、大腸4干菌(ElscAen'c/u'aco/z〕(Zhao等，Carbohydr.Res.342(9):1275-1279，Epub2007)和銅綠假單胞菌CPwMc;fomowasflen/g7'wosa);真菌生物體如隱球酵母和卡i絲酵母；以及4艮多其它孩支生物(見，例如Ovodov,Biochemistry(Mosc.)71(9):937-954,2006;Lee等,Adv.Exp.Med.Biol.491:453-471,2001;和Lee,Mol.Immunol.24(10):1005-1019,1987)。例示性目標(biāo)抗原還包括非天然存在的和非生物來源的聚合物。疫苗組合物包括PCMV在內(nèi)的本發(fā)明疫苗可用于組合，例如用于兒科疫苗。另外，本發(fā)明的疫苗可用于接種對抗例如肺炎球菌感染、乙型流感嗜血菌(/7"emo;/n7i^z'"ywe"zaeTypeB)("HiB")感染、(組A和組B)鏈球菌感染、腦膜炎5求菌(例如腦膜炎奈瑟氏^求菌(A^^en'amem'wg伯Was))感染，并可用作來自革蘭氏陰性細(xì)菌(例如銅綠々支單胞菌CP^w^moww土拉熱弗朗西絲氏菌(Fnmc&e〃a^/flrera^)、志賀氏菌(S7.ge〃aspecies)、沙門氏菌(5Vz/mcwe〃a，"'e力、不動桿菌(J"7z^o6ac,er5pe"'es)、伯克霍爾德、氏菌(^^A:Ao/(ien'a5/e"-^s)和大腸桿菌(￡sc/^n'c/'aco/0)的O抗原疫苗。疫苗制劑期需包含至少一種載體蛋白、一或多種目標(biāo)抗原以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑(例如磷酸鋁、氯化鈉和無菌水)。疫苗組合物還可包括用于增強(qiáng)制劑免疫原性的佐劑體系，例如水包油體系和在本領(lǐng)域已知的其它體系或藥學(xué)上可接受的其它賦形劑。在生理?xiàng)l件下不溶的載體/抗原復(fù)合物期需在給予受試對象后緩慢地釋放抗原。這種復(fù)合物期需釋;^丈到含有藥學(xué)上可接受的賦形劑的混懸液中。然而，載體/抗原復(fù)合物在生理?xiàng)l件下還可能是可溶性的。通常用于皮下注射的疫苗的體積約為0.5mL,皮內(nèi)注射為0.1mL，經(jīng)皮給藥為0.002-0.02mL。0.5mL劑量的疫苗可含有用約2-500嗎載體蛋白包載的約2-500(ig的抗原。在期需的實(shí)施方案中，在0.5mL的劑量中，用約10嗎載體蛋白包載約10嗎的抗原?？乖c載體蛋白的摩爾比期需在1:10(例如，1份抗原對2份載體或1份抗原對3份載體)到10:1(例如，3份抗原對1份載體或2份抗原對1份載體)之間。在期需的實(shí)施方案中，抗原與載體的摩爾比是1:1?；蛘撸乖c載體蛋白的干重比理是在1:10到10:1之間(例如1:1干重)。因?yàn)殡幕蚓Y合物在胃中可受到降解，因此所述疫苗期需經(jīng)胃腸外給藥(例如，通過皮下注射、月幾內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮內(nèi)注射)。當(dāng)期需通過物理滲透真皮層的方法進(jìn)行遞藥(例如，針、噴霧器或擦破)時(shí)，本發(fā)明的疫苗還可通過透皮吸收進(jìn)行給藥。特別地，本發(fā)明疫苗可以連同合適的免疫佐劑通過例如肌肉注射、皮內(nèi)注射或經(jīng)皮免疫接種來給予受試對象。本發(fā)明疫苗可經(jīng)一次或多次給藥，往往包括設(shè)計(jì)以促進(jìn)受試對象抗體產(chǎn)生的二次給藥，以防止傳染性病原體感染。疫苗給藥的頻率和量取決于疫苗的特定活性，并可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)容易地確定。例如，對于嬰兒來說，接種疫苗計(jì)劃可為三個(gè)0.5mL劑量每個(gè)劑量以約4-8周為間隔(從兩月齡開始)，接著在約12-15月齡用第四個(gè)0.5mL的劑量。對于一些疫苗來說，期需在四歲到六歲之間用第五個(gè)劑量。雖然第一次給藥的年齡通常是兩個(gè)月，但是可在6周齡時(shí)將疫苗給予嬰兒。對于超出常規(guī)嬰兒接種計(jì)劃年齡的兒童，可根據(jù)以下例示性的計(jì)劃表給予本發(fā)明的疫苗。首次給藥年齡接種計(jì)劃7-ll個(gè)月總共三個(gè)0.5mL劑量；頭兩個(gè)至少間隔四周，第三個(gè)在第二個(gè)之后至少兩個(gè)月12-23個(gè)月總共兩個(gè)0.5mL劑量，每個(gè)至少相隔兩個(gè)月24個(gè)月到9歲一個(gè)0.5mL劑量對于成年人，間隔2-8周的兩個(gè)或多個(gè)的0.5mL劑量通常足以提供長期的保護(hù)。對于先前經(jīng)免疫接種的成年人和11歲以上的兒童，期需每十年給一次加強(qiáng)劑量。所述制劑可存放于單劑量或多劑量的容器里例如密封的安瓿和小瓶，可在凍干(冷凍干燥)條件下保存，使用前只需立即加入無菌的液體載體。本發(fā)明的疫苗可以配制在藥學(xué)上可接受的載體中，所述載體例如氫氧化鋁凝膠、佐劑制劑、或鹽水，然后通過例如肌肉注射、皮內(nèi)注射、或利用合適免疫佐劑的透皮免疫接種來進(jìn)行給藥。本發(fā)明還包括含有本文所述疫苗(例如，PCMV)的藥盒。本發(fā)明藥盒還包括本文所述接種方法的藥盒^f吏用說明書。用標(biāo)準(zhǔn)方法通過測定受試對象的抗體效價(jià)可確定免疫接種計(jì)劃的功效。一般而言，認(rèn)為約1|ig/mL的平均抗體效價(jià)(期需為IgG效價(jià))表明有長期保護(hù)作用。用于本文所述疫苗組合物的抗原/載體蛋白復(fù)合物的直徑期需在10nm-100iim之間。病毒直徑可為100nm并具有免疫原性。完整細(xì)菌的直徑是1-10,并且也具有免疫原性。一小團(tuán)細(xì)菌的直徑可約為100!im。在具體的實(shí)施方案中，所迷疫苗組合物的抗原/載體蛋白復(fù)合物的直徑期需在100nm-10pm之間。該復(fù)合物可以是可溶性的或者不可溶性的。通過參照特定的實(shí)施例、實(shí)施方案和附圖，下文對本發(fā)明作出描述。以下實(shí)施例不解釋為限制性。實(shí)施例實(shí)施例1.疫苗和對照制劑莢膜聚Y-D-谷氨酸(PGA)購自Vedan(臺灣)或通過Rhie等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:10925-10930,2003)的方法進(jìn)行純化得到。顯性負(fù)性突變體(DNI)是炭疽芽孢桿菌(及aM^racz》保護(hù)抗原(PA)的突變形式，用Benson等的方法(Biochemistry37:3941-3948,1998)從大腸桿菌(Esc/^n'c^aco/0制得。PGA和DNI蛋白在使用前用0.05M、pH7.4磷酸鈉緩沖液(SP7.4)進(jìn)行徹底透析。DNI儲備液濃度為30mg/mL。PGA儲備液濃度為134mg/mL。接頭戊二酪購自Pierce，為25%的儲備液。蛋白莢膜基質(zhì)疫苗(PCMV)和對照匯集(assemble)在表1的反應(yīng)中。表1.用于制備PCMV制劑1-3和對照4和5的反應(yīng)的匯集(assembly)<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>516080.8P僅對照在沒有戊二醛的情況下于室溫下對五個(gè)反應(yīng)進(jìn)行裝入。在T-0時(shí)，所示的反應(yīng)中加入0.1mL25。/。的戊二醛(G25)。其后每30秒加入另外0.1mL的G25并重復(fù)，直到每個(gè)所示反應(yīng)達(dá)到總共0.8mL的G25。通過雙功能戊二醛分子進(jìn)行的DNI分子交聯(lián)情況可通過肉眼觀察到，這根據(jù)產(chǎn)生不同濁度和依照下列順序排列的不溶性粒子樣"凝膠"("gel"likeparticle)來判斷濁度最高和凝膠形成情況，反應(yīng)1>2>3>4，反應(yīng)5保持完全透明和可溶。l小時(shí)之后，將2mL含lM硼氫化鈉的0.5M硼酸鈉緩沖液pH9.3(SBH)加入到所有六個(gè)反應(yīng)中，以還原在DNI分子氨基側(cè)鏈和雙功能戊二醛分子之間形成的席夫堿。將有機(jī)硅消泡劑(O.OlmL)加入到每個(gè)反應(yīng)以控制反應(yīng)過程中的泡沫形成。反應(yīng)物于4。C保存72小時(shí)。然后將所有反應(yīng)物用SP7.4充分透析48小時(shí)。將最終產(chǎn)物離心除去不溶性物質(zhì)并于4。C保存待用。通過使用水溶性的碳二亞胺、EDAC(l-乙基-3-(3-二曱氨基丙基)碳二亞胺)將PGA的羧基與BSA的氨基偶聯(lián)，以合成在牛血清白蛋白(BSA)和PGA之間的傳統(tǒng)綴合物，步驟如下使5mL含30mg/mLBSA的水與1mL含134mg/mLPGA的NP7.5混合，加入50mgEDAC,允許反應(yīng)在室溫下進(jìn)行3個(gè)小時(shí)。使反應(yīng)于4。C用含有1mM甘氨酸的SP7.4透析18小時(shí)阻斷活性基團(tuán)，然后只在SP7.4中于4。C透析24小時(shí)。終產(chǎn)物被稱為PGA-BSA綴合物。在合成并透析PCMV和對照制劑之后，檢查DNI蛋白的分子狀態(tài)以證實(shí)無論是否存在不同含量PGA,戊二醛確實(shí)與蛋白發(fā)生了分子交聯(lián)。通過SDS(十二烷基磺酸鈉)聚丙烯酰胺凝膠電泳和用抗PA抗血清的蛋白印跡監(jiān)測PCMV和對照制劑的所述交聯(lián)情況。如圖2所示，在戊二醛交聯(lián)之前，DNI蛋白移動到84kDa處。如分子量大于220kDa的遷移帶所證實(shí)，PCVM1-PCMV3(泳道1-3)顯示DNI蛋白廣泛的交聯(lián)。不存在PGA下獨(dú)自交^:的DNI蛋白也顯示同樣的高分子量種類(泳道5)。相反，與PGA混合但不用戊二醛處理的DNI顯示與DNI共遷移的條帶或較低的分子量種類(泳道4)。因此，來自Vedan(臺灣)的PGA制劑似乎受到對DNI的蛋白酶活性污染。VedanPGA樣品在泳道6中進(jìn)行電泳，然而沒有顯示高水平的與抗PA抗血清反應(yīng)的污染蛋白，表明所觀察的條帶是各個(gè)反應(yīng)的DNI書f生產(chǎn)物。此外，將PGA和一或多種作為抗原的肺炎球菌PS用來探究是否FLA(霍亂弧菌(^n'oc/o/erae)鞭毛蛋白)是一種在PCMV背景下比DNI更好的載體蛋白。通過測量用各種PCMV免疫接種所得到的針對PS和PGA的IgG水平、以及載體蛋白基于蛋白重量計(jì)算的載體蛋白效能，來評價(jià)這些載體蛋白的效果。還可以通過不使用雙功能交聯(lián)劑直接使氨基與羧基進(jìn)行交聯(lián)的方法制備PCMV。具體而言，用碳二亞胺化學(xué)通過交聯(lián)載體蛋白的氨基和羧基制備PCMV。該化學(xué)使賴氨酸側(cè)鏈的伯氨基和天冬酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈的羧基之間形成肽鍵。雖然氨基大部分受到經(jīng)甲醛處理的類毒素封閉，但曱醛完全不與羧基反應(yīng)。因此，碳二亞胺化學(xué)可用于用甲醛類毒素來制備PCMV,所述甲醛類毒素可以對戊二醛交聯(lián)有抗性。通過SDS-PAGE很容易對交聯(lián)情況進(jìn)行檢測。依賴于交聯(lián)劑(如戊二醛)力。入的高分子量蛋白"污斑"的存在表明發(fā)生了交聯(lián)。表2.由SDS-PAGE分析法確定的栽體蛋白交聯(lián)<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>+號表示通過SDS-PAGE4企測到交聯(lián)，-號表示蛋白遷移在無戊-醛對照中所見到的情況無異。n.d.—(notdetermined)沒有測定(沒有進(jìn)行分析)。對于表2所示的實(shí)驗(yàn)，在50mMHEPESpH7.5中進(jìn)行200微升反應(yīng)并使其在室溫下保溫2小時(shí)。用120mM硼氫化鈉焊滅反應(yīng)。添加戊二醛至64mM,以15mg/mL使用牛血清白蛋白(BSA),以約5mg/mL使用白喉毒素、白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素至，以13.4mg/mL加入PGA，以4mg/mL加入6B和23F型肺炎J求菌PS。如表2所示，一些經(jīng)曱醛處理的蛋白(例如，白喉類毒素)不能與戊二醛很好地交聯(lián)，因此，需要使用其它交聯(lián)化學(xué)來制備PCMV。其它的蛋白載體像破傷風(fēng)類毒素能夠與戊二醛交聯(lián)，但與未修飾蛋白如白喉毒素和牛血清白蛋白的交聯(lián)程度不一樣。實(shí)施例2.免疫接種和抗DNI和抗PGA免疫應(yīng)答的分析調(diào)整表1所述5個(gè)反應(yīng)的可溶性產(chǎn)物至同樣的蛋白質(zhì)濃度(基于其280nm處的吸光率)。將來自CharlesRiver的約5-7周齡的BALB/c小鼠用于圖2所描述的所有免疫接種研究。在第O天通過腹膜內(nèi)注射用PCMV疫苗l-3和抗原制劑對照4和5以20嗎DNI蛋白的劑量免疫接種小鼠。在第7天對所有小鼠進(jìn)行放血，然后在第10天用同樣大小劑量的抗原制劑對其進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在第17天再次對小鼠放血，然后在第20天再次對其加強(qiáng)免疫。在第30天再對小鼠進(jìn)行放血并在這一次將其處死。待血液凝結(jié)后從血樣收集血清并于-20。C儲存。使用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)分析抗PGA血清抗體和抗DNI血清抗體的水平。簡而言之，對Immulon2HBELISA(VWR)微量滴定板包被體積為100(iL/孔的含0.5嗎/孔BSA-PGA或DNI的O.lM碳酸鈉緩沖液(pH9.6)。于4。C保溫過夜之后，通過用3。/oBSA(w/v)(溶解在TBS-0.1。/()吐溫(TBST))于室溫1小時(shí)或4。C過夜孵育，來封閉包被有抗原的板。將在每個(gè)加強(qiáng)免疫后的時(shí)間點(diǎn)時(shí)合并自四小鼠組別的血清樣品用TBST進(jìn)行系列稀釋，將其加入到包被有抗原的板中，孵育至少l小時(shí)。用針對與堿性磷酸酶(Zymed)綴合的鼠IgG或IgM的兔抗血清，測定抗DNI抗體應(yīng)答和抗PGA抗體應(yīng)答。將底物磷酸對硝基苯酯(PNPP)加到每個(gè)孔中并于405nm處用分光光度法來測定每個(gè)反應(yīng)的吸光率。數(shù)據(jù)以終點(diǎn)效價(jià)倒數(shù)的形式報(bào)道，后者定義為獲得的004()5讀數(shù)超過陰性對照讀數(shù)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的的最大稀釋度。用ELISA測定法測量在經(jīng)三種PCMV制劑1-3和兩個(gè)抗原對照制劑4和5(圖3-5)免疫4妄種的小鼠體內(nèi)的IgM和IgG特異的抗DNI和抗PGA免疫應(yīng)答。如圖3所示，除了未經(jīng)戊二醛交聯(lián)(無戊二醛)的對照制劑4之外，在所有制劑中的DNI蛋白具有高度免疫原性。然而，這些DNI特異性免疫應(yīng)答是唯獨(dú)以IgG為基礎(chǔ)的。雖然甚至在免疫接種的第7天也檢測不到抗DNIIgM，但在第17天，在經(jīng)PCMV制劑免疫接種的小鼠和那些只用交聯(lián)的DNI(制劑5)免疫接種過的小鼠體內(nèi)可檢測到顯著的抗DNIIgG應(yīng)答。在第30天觀察到經(jīng)接種包括制劑4在內(nèi)的所有制劑后針對DNI的強(qiáng)烈加強(qiáng)應(yīng)答?？筆GAIgM應(yīng)答顯示了典型莢膜聚合物模式(圖4)。對照制劑4在第7天產(chǎn)生可4企測的抗PGAIgM應(yīng)答，但在第17或30天該應(yīng)答沒有^皮加強(qiáng)。所有PCMV制劑在第7天誘導(dǎo)抗PGAIgM應(yīng)答，然后在第17天和第30天產(chǎn)生獨(dú)有的甚至更強(qiáng)的抗PGAIgM應(yīng)答。不出所料，對照制劑5(只有交聯(lián)的DNI)不產(chǎn)生基于IgM或基于IgG的抗PGA應(yīng)答。形成鮮明對比的是，PCMVl-3(制劑l-3)產(chǎn)生強(qiáng)烈的基于IgG的抗PGA應(yīng)答，該應(yīng)答在第7天表現(xiàn)明顯隨后在第30天顯著得到加強(qiáng)(圖5)。所見針對PCMV1-3的基于IgG抗PGA應(yīng)答明顯類似于Aulinger等報(bào)道觀察到的傳統(tǒng)PGA-DNI綴合疫苗所誘導(dǎo)的對PGA的免疫應(yīng)答(Infect.Immun.73:3408-3414，2005)和Rhie等)描述的PA-PGA綴合疫苗所誘導(dǎo)的應(yīng)答(Proc.Natl.Acad.Sci,USA100:10925-10930，2003。因此在誘導(dǎo)針對莢膜PGA(已知的T細(xì)胞非依賴性的炭疽芽孢桿菌(及朋溈ra"'力保護(hù)抗原(Wang等，Infect.Immun.72:5460-5463,2004))的IgG應(yīng)答方面，PCMV疫苗弁1、#2和#3都具有與傳統(tǒng)綴合PGA疫苗一樣好的性能。含有與PGA混合的DNI(非交聯(lián)的)的對照制劑5不誘導(dǎo)可檢測的針對PGA的IgG,表明DNI在刺激PCMV制劑1-3的IgG抗PGA應(yīng)答中不充當(dāng)TLR配體的作用。該結(jié)果也證實(shí)了文獻(xiàn)中的觀察，即PGA是低免疫原性的T細(xì)胞非依賴性免疫原，除非它通過共價(jià)連接與蛋白質(zhì)偶聯(lián)(Rhie等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:10925-10930,2003)。PCMV方法顯然將PGA轉(zhuǎn)化成T細(xì)胞依賴性的免疫原，盡管事實(shí)上該方法沒有導(dǎo)致DNI蛋白直接與PGA分子進(jìn)行交聯(lián)。這些數(shù)據(jù)支持PCMV方法能夠制備出特性與傳統(tǒng)綴合疫苗類似的免疫原。用本文所述的方法容易制備出PGAPCMV,并發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)PGA-蛋白綴合疫苗的典型免疫應(yīng)答。表1中詳述的小規(guī)模反應(yīng)制備出基于圖3描述的劑量方案足夠?qū)?000只小鼠進(jìn)行免疫接種的PCMV。這些數(shù)據(jù)支持由PGA和DNI制備的PCMV可以用作疫苗預(yù)防由炭疽芽孢桿菌CBaa7/wArac&)引起的炭疽熱。實(shí)施例3.附加PCMV的制備和表征PCMV技術(shù)可應(yīng)用于各種結(jié)構(gòu)和離子電荷的莢膜抗原。23種類型肺炎鏈球菌GS^eptococa^PS購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)并由Merck,Inc制造。這些PS在其分子結(jié)構(gòu)上有很大的不同，包括強(qiáng)陰離子型的、部分陽離子型的、中性電荷的、磷酸化的、線性的、有分支結(jié)構(gòu)的和經(jīng)各種其它方式修飾的PS。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，取對應(yīng)于Wyeth產(chǎn)品Prevnar中7個(gè)莢膜型的這些PS子集(4、6B、9V、14、18C、19F和23F),測定其誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的能力。4型的PS在測定中是活躍的；脂多糖(LPS)是TLR激動劑的對照。還測定了其它PS(例如，3型)、PGA和來自土拉熱弗朗西絲氏菌(F.^/areww'力的O抗原PS、以及由PGA-DNI制備而成的PCMV疫苗和無交聯(lián)的對照。該實(shí)驗(yàn)顯示了3型肺炎球菌PS(比PGA的程度較小)也受到TLR激動劑污染。來自土拉熱弗朗西絲氏菌(F.^/are"w'力的PS和PCMV在測定中同等干凈。苯酚萃取和乙醇沉淀可在兩次連續(xù)處理之后"清潔"(除去殘余的未知TLR激動劑)肺炎鏈球菌OS./"ewmom^)PS3型。因此，發(fā)現(xiàn)6種肺炎鏈球菌(X/wewmom'ae)PS和土拉熱弗朗西絲氏菌(F.fM/a^w^;y)O抗原PS對于IL6的產(chǎn)生而言已清潔干凈，這些已經(jīng)在本文所述的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了探究。通過類似于在實(shí)施例1中所描述的方法利用DNI作為載體蛋白，已經(jīng)對對于IL6產(chǎn)生而言已清潔干凈的7種PS進(jìn)行了PCMV合成?，F(xiàn)肺炎鏈球菌0S1.戶wewMom'ae)PS14的基于DNI的"單價(jià)"PCMV(14-PCMV)在第三次免疫之后誘導(dǎo)顯著增強(qiáng)的高效價(jià)抗PPS14IgG。顯然，當(dāng)14-PCMV與其它六種PCMV混合產(chǎn)生"混合"抗原時(shí)，可見到同樣的免疫應(yīng)答。因?yàn)镻revna,是吸附明礬的"佐劑化"疫苗，所以對六價(jià)PCMV混合物是否也能夠被明礬佐劑吸附進(jìn)行確定。通過免疫測定來定性測量在暴露于PCMV或?qū)φ栈旌衔?相同的PS與DNI蛋白混合但不進(jìn)行戊二醛交聯(lián))之后吸附于明礬的肺炎鏈球菌PS的量，結(jié)果顯示，在PCMV背景下吸附于明礬的PS比對照(PS+非交if關(guān)的DNI蛋白)要多得多(這正如的在免疫分析中進(jìn)一步稀釋的PCMV的免疫反應(yīng)性水平更高所表明)。對小鼠進(jìn)行免疫，以評價(jià)有或無吸附于明礬佐劑的七價(jià)PCMV的免疫原性。明鞏佐劑改善對PS14的免疫應(yīng)答動力學(xué)，與比無佐劑疫苗誘導(dǎo)針對這種PS的IgG要早7天。然而，在不存在明礬的七價(jià)PCMV比存在明礬的非交聯(lián)PS+DNI組合對照更具免疫原性。該結(jié)果證實(shí)了PCMV方法使PS對于小鼠更具免疫原性，并支持了PCMV方法可以用來制備免疫性能類似于綴合疫苗混合物的抗原混合物。在另外的實(shí)驗(yàn)中，使用苯酚萃取和乙醇沉淀以將污染性TLR激動劑從23種肺炎球菌多糖商業(yè)制劑中除去。用標(biāo)準(zhǔn)的方法根據(jù)誘導(dǎo)腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6來對經(jīng)經(jīng)處理的PS進(jìn)4亍測試，以證實(shí)污染物的去除情況。缺乏IL-6誘導(dǎo)活性的PS用于制備PCMV。用于PCMV的其它多糖包括從土拉熱弗朗西絲氏菌(F.^/aww'5)純化的O抗原PS和來自炭疽芽孢桿菌(及a"Araa'力的PGA莢膜。檢驗(yàn)了總共25個(gè)莢膜類型(23個(gè)肺炎球菌型，土拉菌病型和炭疽熱型各一個(gè))。25種莢膜型的每一種基本通過實(shí)施例1所描述的方法，用DNI蛋白來制備PCMV。將1:1比例的PS:蛋白用于(約1:1干重)這些初始PCMV制劑。通過SDS-PAGE對每種制劑進(jìn)行表征，以證實(shí)蛋白的交聯(lián)情況，蛋白莢膜型(例如6B和23F)，使用其它載體蛋白來制備PCMV。對于同樣的這些莢膜型(例如6B和23F),可使用備選的交聯(lián)化學(xué)。對證實(shí)了蛋白交聯(lián)(例如在SDS-PAGE中)的所有PCMV制劑的免疫原性進(jìn)行試驗(yàn)。例如，以下用5種不同的基質(zhì)蛋白和2種不同的抗原制備10種不同的PCMV。5種基質(zhì)蛋白的選擇基于它們當(dāng)前用于FDA批準(zhǔn)的疫苗，或者允許其作為示蹤物用于測量PCMV制劑穩(wěn)定性的其它特性。使用了以下基質(zhì)蛋白(l)霍亂毒素B亞基(SBLVaccinAB提供)，(2)白喉毒素,(3)破傷風(fēng)毒素片段C，"FragC"(SigmaAldrich提供)，(4)DNI，和(5)來自大腸桿菌C&c/zm'c/^co/z')的P-半乳糖苷酶(SigmaAldrich提供)。作為莢膜抗原，使用了來自炭疽芽孢桿菌CBac說wawAra"'力的莢膜抗原聚-D-谷氨酸和14型肺炎鏈球菌(&reptococa^莢膜(Suarez等,Appl.Environ.Micobiol.67:969-971，2001)。當(dāng)與作為基質(zhì)蛋白的DNI用于相應(yīng)的PCMV中時(shí)，這兩種莢膜抗原均具有高度免疫原性。每種莢膜抗原與5種經(jīng)選擇的基質(zhì)蛋白中的每一種組合，制成IO種不同的PCMV。如在傳統(tǒng)的綴合疫苗中所觀察到的，在小鼠體內(nèi)可以測試PCMV誘導(dǎo)同種型抗體轉(zhuǎn)換成IgG的能力?？梢允顾锌乖接诿鞯\然后典型地使用每種PCMV制劑對應(yīng)5只小鼠的組別。預(yù)先給小鼠》丈血獲得針對受試抗原的免疫應(yīng)答基線。然后通過標(biāo)準(zhǔn)的腹膜內(nèi)注射方案對小鼠三次免疫幾種(于第0、7、14天)，并于初次免疫之后的第10、20、30和60天收集血液。通過標(biāo)準(zhǔn)的ELISA測定方法，一艮據(jù)針對所用PS和載體蛋白的IgG的情況對小鼠血清進(jìn)行分析。在這些實(shí)驗(yàn)中，將只接受PS免疫接種的對照組小鼠包括在內(nèi)，用來評價(jià)各種PCMV制劑與應(yīng)該無免疫原性或免疫原性低的非綴合PS相比誘導(dǎo)抗PSIgG的能力。使有前景的PCMV(即誘導(dǎo)高水平抗PSIgG)經(jīng)過^^田的免疫學(xué)分析，設(shè)法建立小鼠對PCMV免疫應(yīng)答的動力學(xué)和劑量反應(yīng)狀況?；蛘?，將有前景的PCMV和其相應(yīng)的對照可送至商家以生產(chǎn)兔抗血清。進(jìn)行類似的免疫分析來評價(jià)免疫原性、所誘導(dǎo)的抗體的類別、兔的免疫應(yīng)答動力學(xué)。在這些實(shí)驗(yàn)中，對照是市售產(chǎn)品Prevnar,它是與CRM197偶聯(lián)的7種不同傳統(tǒng)綴合PS疫苗的吸附于明礬的混合物，CRM197為與白喉毒素相關(guān)的無毒蛋白突變體?？梢詫τ肞CMV誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答功能性進(jìn)行評價(jià)。例如，可以通過測量抗PS抗體調(diào)理莢膜肺炎鏈球菌(S.;"ewmococcw力并致使巨噬細(xì)胞通過吞噬作用殺死細(xì)菌的能力，來對功能性進(jìn)行評價(jià)。保護(hù)動物免受莢膜肺炎鏈球菌/WeMWOCOCCM)的致死攻擊是證明疫苗在經(jīng)PCMV免疫的動物中的功效的另一種方法。實(shí)施例4.PCMV與Prevnar的比較測定通過Merck獲自ATCC或直接來自SerumInstituteofIndia(Sn)的肺炎鏈球菌(5".;weMmo"z'ae)多糖(pps)6B、14和23F的相對清潔度。用IL-6表達(dá)作為pps清潔度的指示劑，用LPS作為"不潔"的陽性對照。如圖9A所示，Merckpps6B、14和23F是潔凈的，而如圖9B所示，來自SII的pps6B是"不潔的"。如圖10所示，處理2(在lMNaOH中80°C保溫1小時(shí))使SIIpps6B清潔。潔凈的pps6B用于比4交綴合物和PCMV的免疫特性。如表3所示，污染物不是LPS。表3.多糖內(nèi)毒素水平測定<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>圖11和13顯示Prevnar(以明礬為佐劑)誘導(dǎo)抗pps6BIgG抗體，并且以明礬為佐劑的PCMV(BSA和pps6B;白喉毒素和pps6B;白喉類毒素和pps6B;破傷風(fēng)類毒素和pps6B)所誘導(dǎo)的IgG應(yīng)答比用Prevna,所觀察到的IgG應(yīng)答更好。同樣，如圖12所示，以明礬為佐劑的PCMV所誘導(dǎo)的IgM應(yīng)答與用Prevna,所見的相近。另外，對于pps14(Prevnar⑧最具免疫原性的pps),如圖14-16所示，含有白喉類毒素和pps14或破傷風(fēng)類毒素和pps14的吸附于明礬的PCMV在誘導(dǎo)IgG應(yīng)答方面幾乎等效于Prevnar。實(shí)施例5.多價(jià)PCMV多價(jià)免疫原通過以下PCMV方法來制備化學(xué)地將不同莢膜有機(jī)聚合物混合，之后用戊二醛使DNI載體蛋白交聯(lián)("一鍋合成反應(yīng)")。用DNI作為載體，以三種有機(jī)聚合物PGA、藻酸鹽和葡聚糖制備這類三價(jià)免疫原。這些三價(jià)疫苗具有免疫原性并且產(chǎn)生針對三種莢膜有機(jī)聚合物的免疫應(yīng)答，該結(jié)果根據(jù)以下附圖中的指標(biāo)所示免疫前和30天后所分析的混合血清IgM(圖6)，免疫接種后60天出現(xiàn)的抗原特異性血清IgG抗體效價(jià)(圖7),免疫接種后128天出現(xiàn)的抗PS血清抗體效價(jià)(圖8)。此外如圖6-8所示，單價(jià)藻酸鹽PCMV制劑也在小鼠中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。還可通過混合特定的PCMV來配制多價(jià)PCMV免疫原，PCMV先經(jīng)過分開合成最后再混合在一起制成"混合物"疫苗。本說明書中所引用或涉及的所有專利、專利申請、專利申請公開和其它出版物通過引用合并到本文中，其類似程度有如每個(gè)專利、專利申請、專利申請公開或出版物逐一或單獨(dú)地指明通過51用合并到本文中。權(quán)利要求1.疫苗組合物，其包含目標(biāo)抗原和載體蛋白，其中(i)不超過50％的所述目標(biāo)抗原與所述載體蛋白交聯(lián)且(ii)其中用所述載體蛋白包載所述抗原形成復(fù)合物。2.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述復(fù)合物的直徑在lOnm-lOO,之間。3.權(quán)利要求2的疫苗組合物，其中所述復(fù)合物的直徑約為100nm-100jim。4.權(quán)利要求2的疫苗組合物，其中所述復(fù)合物的直徑約為100nm-10,。5.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述復(fù)合物在給予哺乳動物時(shí)在所述哺乳動物內(nèi)引發(fā)T細(xì)胞依賴性的免疫應(yīng)答。6.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述抗原對所述載體蛋白的摩爾比在1:10-10:1之間。7.權(quán)利要求l的疫苗組合物，其中所述載體蛋白是多聚體。8.權(quán)利要求7的疫苗組合物，其中多聚體包含至少5個(gè)亞基。9.權(quán)利要求7的疫苗組合物，其中所述多聚體是同多聚體。10.權(quán)利要求l的疫苗組合物，其中所述載體蛋白與至少一個(gè)其它的載體蛋白共價(jià)連接。11.權(quán)利要求10的疫苗組合物，其中所述共價(jià)連接包括在賴氨酸側(cè)鏈伯氨基和天冬酰胺或谷氨酰胺側(cè)鏈的羧基之間的肽鍵。cho12.權(quán)利要求10的疫苗組合物，其中所述共價(jià)連接包括式R!—cho的化合物，其中Rn是l-12個(gè)碳原子的直連或支鏈烷基、1-12個(gè)原子的直連或支鏈雜烷基、2-12個(gè)碳原子的直連或支鏈烯烴、2-12個(gè)碳原子的直連或支鏈炔烴、5-10個(gè)碳原子的芳族殘基、3-10個(gè)原子的環(huán)狀體系、-(0120120)9012012-其中q是l-4、或連接兩個(gè)醛基的化學(xué)鍵。13.權(quán)利要求IO的疫苗組合物，其中所述共價(jià)連接包括戊二醛、間馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯、碳二亞胺或雙偶氮聯(lián)苯胺。14.權(quán)利要求10的疫苗組合物，其中所述共價(jià)連接包含雙功能交聯(lián)劑。15.權(quán)利要求14的疫苗組合物，其中所述雙功能交聯(lián)劑是戊二醛、雙[磺酸基琥珀酰亞胺基]辛二酸酯或己二亞氨酸二曱酯。16.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述載體蛋白經(jīng)非共價(jià)連接。17.權(quán)利要求16的疫苗組合物，其中所述非共價(jià)連接包括疏水作用、離子作用、范德華作用或氬鍵。18.權(quán)利要求l的疫苗組合物，其中所述載體蛋白是白喉毒素或其突變體、白喉類毒素、破傷風(fēng)毒素或其突變體、破傷風(fēng)類毒素、銅綠假單胞菌CPsewcfowo"^flen^'wosa)外毒素A或其突變體、霍亂毒素B亞基、破傷風(fēng)毒素片段C、細(xì)菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、腦膜炎奈瑟氏球菌(A^^m'ame"m'"g/"Vfc)外膜蛋白、銅綠假單胞菌(尸sewc/cwowosaen^gi'wcwz)Hcpl蛋白、大腸4干菌(五sc/^n'c/n'aco/z')熱不穩(wěn)定腸毒素、志賀樣毒素、人LTB蛋白、肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O(或相關(guān)蛋白)、來自完整細(xì)菌細(xì)胞的蛋白提取物、炭疽芽孢桿菌(&c///waWArac的保護(hù)性抗原的顯性負(fù)性突變體(DNI)或大腸桿菌(Esc/^n'c/'aco//)卩-半乳糖苦酶。19.權(quán)利要求18的疫苗組合物，其中所述完整細(xì)菌細(xì)胞是銅綠假單月包菌Cfta^cwowawaen^7'"osa)或鏈球菌(5Ve;tococc"0纟田月包。20.權(quán)利要求18的疫苗組合物，其中所述細(xì)菌鞭毛蛋白是霍亂弧菌(P76n'oc/o/erae)鞭毛蛋白。21.權(quán)利要求18的疫苗組合物，其中所述志賀樣毒素是志賀氏菌(幼Zge〃fl)SltB2蛋白。22.權(quán)利要求18的疫苗組合物，其中所述載體蛋白是肺炎球菌溶血素。23.權(quán)利要求18的疫苗組合物，其中所述載體蛋白是李斯特菌溶素0。24.權(quán)利要求18的疫苗組合物，其中所述載體蛋白是白喉毒素。25.權(quán)利要求18的疫苗組合物，其中所述載體蛋白是白喉類毒素。26.權(quán)利要求18的疫苗組合物，其中所述載體蛋白是破傷風(fēng)毒素。27.權(quán)利要求18的疫苗組合物，其中所述載體蛋白是破傷風(fēng)類毒素。28.權(quán)利要求l的疫苗組合物，其中所述目標(biāo)抗原是多糖、多元醇或聚氨基酸。29.權(quán)利要求28的疫苗組合物，其中所述多糖包含至少18個(gè)殘基。30.權(quán)利要求28的疫苗組合物，其中所述多糖是肺炎鏈球菌(5V印tococcwpwewmom'ae)多糖、土拉熱弗朗西絲氏菌(Fra"c^e〃a/w/armW力多糖、炭疽芽孢桿菌CSad〃wsaw^rac/力多糖、流感嗜血菌(//aewo//7wsZ"y7t/ewzae)多糖、傷寒沙門氏菌(Sa/mo"e〃a(y//u')多糖、沙門氏菌(S"/wo"e/Zaspecies)多糖、志賀氏菌(幼/ge/Za)多糖或腦膜炎奈瑟氏球菌(臉/潔"'"me"Z"g""/cfo)多糖。31.權(quán)利要求30的疫苗組合物，其中所述肺炎鏈球菌(&"/tococcw/"ewwom'ae)多糖是莢膜型3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46。32.權(quán)利要求30的疫苗組合物，其中所述土拉熱弗朗西絲氏菌(尸rawc^e〃a似/flrem7、)多糖是O抗原。33.權(quán)利要求l的疫苗組合物，其中所述目標(biāo)抗原是微生物莢膜聚合物。34.權(quán)利要求33的疫苗組合物，其中所述微生物莢膜聚合物是來自炭疽芽孑包桿菌(5a"'〃t^aw^ra"'力的聚-y-D陽谷氨酸。35.權(quán)利要求l的疫苗組合物，其中所述目標(biāo)抗原是由具有至少3個(gè)原子的單體組成的有機(jī)聚合物，其中每個(gè)所述原子獨(dú)立選自碳、氧、氫、磷酸基、氮和硫酸基。36.權(quán)利要求35的疫苗組合物，其中所述有機(jī)聚合物來源于微生物。37.權(quán)利要求35的疫苗組合物，其中所述有機(jī)聚合物不是天然存在的有機(jī)聚合物。38.權(quán)利要求l的疫苗組合物，其中所述疫苗組合物進(jìn)一步包含第二目標(biāo)抗原。39.權(quán)利要求38的疫苗組合物，其中所述疫苗組合物進(jìn)一步包含第三目標(biāo)抗原。40.制備疫苗組合物的方法，其包括(i)將目標(biāo)抗原與載體蛋白混合形成所述抗原和所述載體蛋白的混合物和(ii)用所述載體蛋白包載所述目標(biāo)抗原，其中在所述疫苗組合物中不超過50%所述目標(biāo)抗原與所述載體蛋白交聯(lián)。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述疫苗組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。42.權(quán)利要求40的方法，其中所述包載包括從所述混合物中沉淀所述抗原和所述載體蛋白。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述沉淀包括使所述混合物的pH變化。44.權(quán)利要求42的方法，其中所述沉淀包括將三氯乙酸(TCA)或硫酸銨加入到所述混合物中。45.權(quán)利要求42的方法，其中所述沉淀包括通過增加或減少混合物中無機(jī)鹽濃度改變混合物的離子強(qiáng)度。46.權(quán)利要求42的方法，其中所述沉淀包括加熱混合物導(dǎo)致載體蛋白和/或抗原凝結(jié)。47.權(quán)利要求42的方法，其中所述沉淀包括用足夠通量的電離輻射輻照混合物引起交聯(lián)。48.權(quán)利要求40的方法，其中在所述疫苗組合物中，所述抗原和所述載體蛋白的摩爾比在1:10-9:10之間。49.權(quán)利要求40的方法，其中所述載體蛋白是多聚體。50.權(quán)利要求49的方法，其中所述多聚體包含至少5個(gè)亞基。51.權(quán)利要求49的方法，其中所述多聚體是同多聚體。52.權(quán)利要求40的方法，其中所述載體蛋白經(jīng)非共價(jià)連接。53.權(quán)利要求52的方法，其中所述非共價(jià)連接包括疏水作用、離子作用、范德華作用或氫鍵。54.權(quán)利要求40的方法，其中所述載體蛋白是白喉毒素或其突變體、白喉類毒素、破傷風(fēng)毒素或其突變體、破傷風(fēng)類毒素、銅綠假單月包菌CPsewc/owo"(XSaen^7zosa)外毒素A或其突變體、霍亂毒素B亞基、破傷風(fēng)毒素片段C、細(xì)菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O、腦膜炎奈瑟氏球菌(iVe^en'amewm'"g"Zcfc)外膜蛋白、銅綠々i單月包菌(尸sei/cfomowGWaen/gZwasa)Hcpl蛋白、大腸4干菌CEsc/en-c/u'aco/Z)熱不穩(wěn)定腸毒素、志賀樣毒素、人LTB蛋白、來自完整細(xì)菌細(xì)胞的蛋白提取物、炭疽芽孢桿菌(5ac/〃Rsa"Arac的保護(hù)性抗原的顯性負(fù)性突變體(DNI)或大腸桿菌Cfoc/^n'c/^co/0p-半乳糖苷酶。55.權(quán)利要求54的方法，其中所述完整細(xì)菌細(xì)胞是銅綠假單胞菌(尸5ewt/o廳was1am/gz'"05a)或鏈球菌(5^一ococca/)纟田胞。56.權(quán)利要求54的方法，其中所述細(xì)菌鞭毛蛋白是霍亂弧菌c/o/e聰)鞭毛蛋白。57.權(quán)利要求54的方法，其中所述志賀樣毒素是志賀氏菌(幼Zge〃a)SltB2蛋白。58.權(quán)利要求54的方法，其中所述載體蛋白是肺炎球菌溶血素。59.權(quán)利要求54的方法，其中所述載體蛋白是李斯特菌溶素O。60.權(quán)利要求54的方法，其中所述載體蛋白是白喉毒素。61.權(quán)利要求54的方法，其中所述載體蛋白是白喉類毒素。62.權(quán)利要求54的方法，其中所述載體蛋白是破傷風(fēng)毒素。63.權(quán)利要求54的方法，其中所述載體蛋白是破傷風(fēng)類毒素。64.權(quán)利要求40的方法，其中所述目標(biāo)抗原是多糖、多元醇或聚氨基酸。65.權(quán)利要求64的方法，其中所述多糖包含至少18個(gè)殘基。66.權(quán)利要求64的方法，其中所述多糖是肺炎鏈球菌(xSV邵tococcz^y/we謂om'ae)多糖、土拉熱弗朗西絲氏菌(Fra聰'je〃fl似/"""^;s)多糖、炭疽芽孑包桿菌(5ad〃wsfl^Ara"力多糖、流感嗜血菌(T/aemo//w7ws/w^/7we"zae)多糖、傷寒沙門氏菌(Sa/wowe〃a(y/A/)多糖、志賀氏菌(57^ge〃as/ecz'es)多糖、沙門氏菌(1^//0"6//0species)多糖或腦月莫炎奈瑟氏5求菌(iVW^en'awem'"gWcfo)多糖。67.權(quán)利要求66的方法，其中所述肺炎鏈球菌(&"/tococcz^/7"ewwom'ae)多糖是莢膜型3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46。68.權(quán)利要求67的方法，其中所述土拉熱弗朗西絲氏菌(尸ra蹈》e〃fl/M/"re;w/力多糖是O抗原。69.權(quán)利要求40的方法，其中所述目標(biāo)抗原是微生物莢膜聚合物。70.權(quán)利要求69的方法，其中所述微生物莢膜聚合物是來自炭癥芽孑包一干菌C5ad〃wsa"Arac&)的聚-y-D-谷氛酸。71.權(quán)利要求40的方法，其中所述目標(biāo)抗原是由具有至少3個(gè)原子的單體組成的有機(jī)聚合物，其中每個(gè)所述原子獨(dú)立選自碳、氧、氬、磷酸基、氮和硫酸基。72.權(quán)利要求71的方法，其中所述有機(jī)聚合物來源于微生物。73.權(quán)利要求71的方法，其中所述有機(jī)聚合物不是天然存在的有機(jī)聚合物。74.權(quán)利要求40的方法，其進(jìn)一步包含第二目標(biāo)抗原。75.權(quán)利要求74的方法，其進(jìn)一步包含第三目標(biāo)抗原。76.制備疫苗組合物的方法，其包括(i)將目標(biāo)抗原與載體蛋白混合和(ii)加入使所述載體蛋白交聯(lián)的接頭，其中在所述疫苗組合物中不超過50%的所述目標(biāo)抗原與所述載體蛋白交聯(lián)。77.權(quán)利要求76的方法，其中所述疫苗組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。78.權(quán)利要求76的方法，其中在所述疫苗組合物中，所述抗原對所述載體蛋白的摩爾比在1:10-10:1之間。79.權(quán)利要求76的方法，其中所述載體蛋白是多聚體。80.權(quán)利要求79的方法，其中所述多聚體包含至少5個(gè)亞基。81.權(quán)利要求79的方法，其中所述多聚體是同多聚體。82.權(quán)利要求76的方法，其中所述方法包括還原所述載體蛋白中的席夫堿。83.權(quán)利要求76的方法，其中所述載體蛋白與至少一個(gè)其它載體蛋白共價(jià)連接。84.權(quán)利要求83的方法，其中所述共價(jià)連接包括在賴氨酸側(cè)鏈的伯氨基和天冬酰胺或谷氨酰胺側(cè)鏈的羧基之間的肽鍵。85.權(quán)利要求83的方法，其中所述共價(jià)連接包括雙功能交聯(lián)劑。86.權(quán)利要求85的方法，其中所述雙功能交聯(lián)劑是戊二醛、雙[磺酸基琥珀酰亞胺基]辛二酸酯或己二亞氨酸二曱酯。CHO87.權(quán)利要求76的方法，其中所述接頭是式f4一CH0化合物，其中Rn是l-12個(gè)碳原子的直連或支鏈烷基、l-12個(gè)原子的直連或支鏈雜烷基、2-12個(gè)碳原子的直連或支鏈烯烴、2-12個(gè)碳原子的直連或支鏈炔烴、5-10個(gè)碳原子的芳族殘基、3-10個(gè)原子的環(huán)狀體系、-(CH2CH20)qCH2CH2-其中q是l-4，或連接兩個(gè)醛基的化學(xué)鍵。88.權(quán)利要求76的方法，其中所述接頭是戊二醛、間馬來酰亞胺基苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯、^友二亞胺或雙偶氮l關(guān)苯胺。89.權(quán)利要求76的方法，其中所述載體蛋白是白喉毒素或其突變體、白喉類毒素、破傷風(fēng)毒素或其突變體、破傷風(fēng)菌類毒素、銅綠々I單月包菌(i^ew/omomwaen^'"cwz)夕卜毒素A或其突變體、霍亂毒素B亞基、破傷風(fēng)毒素片段C、細(xì)菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O、腦膜炎奈瑟氏球菌(A^wm'ame"m'"g"W力外膜蛋白、銅綠f支單月包菌CP5ewcfowow(XSaen/g/"osa)Hcpl蛋白、大腸4干菌(EscAen'c/n'aco/Z)熱不穩(wěn)定腸毒素、志賀樣毒素、人LTB蛋白、來自完整細(xì)菌細(xì)胞的蛋白提取物、炭疽芽孢桿菌(5'〃^朋/Arac/力保護(hù)性抗原的顯性負(fù)性突變體(DNI)或大腸桿菌(&cAeWc^'aco//)(3-半乳糖苷酶。90.權(quán)利要求89的方法，其中所述完整細(xì)菌細(xì)胞是銅綠假單胞菌(i^ewt/畫o"asam^'"o犯)或鏈球菌(》，ococca/)纟田胞。91.權(quán)利要求89的方法，其中所述細(xì)菌鞭毛蛋白是霍亂弧菌(m〃'ocAo/erae)鞭毛蛋白。92.權(quán)利要求89的方法，其中所述志賀樣毒素是志賀氏菌0S/n'ge〃fl)SltB2蛋白。93.權(quán)利要求76的方法，其中所述目標(biāo)抗原是多糖、多元醇或聚氨基酸。94.權(quán)利要求93的方法，其中所述多糖包含至少18個(gè)殘基。95.權(quán)利要求93的方法，其中所述多糖是肺炎鏈球菌(5V廠e/tococcwj/"ewwo"/"e)多糖、土拉熱弗朗西絲氏菌(Fnz"c&e〃am/arms/力多糖、炭疽芽孢桿菌CSac"/船a"Arad力多糖、流感嗜血菌(//ae/wo//^7wsZw/t/e"加e)多糖、傷寒沙門氏菌(Sa/mo"e〃a(y;/n')多糖、志賀氏菌(幼/ge〃awedas)多糖、沙門氏菌(5^/附0"￡//0s/edas)多糖或月鹵膜炎奈瑟氏球菌(臉Z駕由wem'wg/"Vto)多糖。96.權(quán)利要求95的方法，其中所述肺炎鏈球菌(5Vre/tococctw多糖是莢膜型3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46。97.權(quán)利要求95的方法，其中所述土拉熱弗朗西絲氏菌(Frawc/se〃a,w/are朋z、)多糖是0抗原。98.權(quán)利要求76的方法，其中所述目標(biāo)抗原是微生物莢膜聚合物。99.權(quán)利要求98的方法，其中所述微生物莢膜聚合物是來自炭疽芽孢桿菌C8ac!'〃wArac/力的聚-y-D-谷氨酸。100.權(quán)利要求76的方法，其中所述目標(biāo)抗原是由具有至少3個(gè)原子的單體組成的有機(jī)聚合物，其中每個(gè)所述原子獨(dú)立選自碳、氧、氫、磷酸基、氮和硫酸基。101.權(quán)利要求100的方法，其中所述有機(jī)聚合物來源于微生物。102.權(quán)利要求100的方法，其中所述有機(jī)聚合物不是天然存在的有機(jī)聚合物。103.權(quán)利要求76的方法，其進(jìn)一步包含第二目標(biāo)抗原。104.權(quán)利要求103的方法，其進(jìn)一步包含第三目標(biāo)抗原。105.為受試對象接種疫苗抵抗傳染性病原體的方法，所述方法包括給予受試對象足夠量的權(quán)利要求1的疫苗組合物，以誘導(dǎo)抗體在所述受試對象中產(chǎn)生。106.權(quán)利要求105的方法，其中所述方法包括第二給藥步驟，其中將所述權(quán)利要求1的疫苗組合物以足夠的量給予所述受試對象，以加強(qiáng)抗體在所述受試對象中產(chǎn)生。107.權(quán)利要求106的方法，其中所述抗體的產(chǎn)生是T細(xì)胞依賴性的。108.權(quán)利要求105的方法，其中所述抗體的產(chǎn)生足以防止或減低傳染性病原體對所述受試對象的感染。109.權(quán)利要求105的方法，其中所述傳染性病原體是肺炎球菌、月S膜炎3求菌、乙型流感嗜血菌(Z/aewop/n7wsZ"y7we"zGeTypeB)、銅綠假單胞菌(尸wwc/owowfiwaen^力OM)、土拉熱弗朗西絲氏菌(Fr朋c^e〃a^/areww's)、志賀氏菌(幼z'ge〃aspecies)、沙門氏菌(/S"a/mowe〃ai^e"'e力、不動^干菌(Jc/we/oZa"erspecies)、伯克霍爾德、氏菌(^rMo/c/eWasj9ec^)和大腸軒菌(51scAm'c/n'aco/z')。110.權(quán)利要求105的方法，其中所述方法包括第二給藥步驟，其中將包含目標(biāo)抗原的第二疫苗組合物以足夠的量提供給所述受試對象，以加強(qiáng)抗體在所述受試對象中產(chǎn)生。111.權(quán)利要求110的方法，其中所述抗體的產(chǎn)生足以防止或減低第二傳染性病原體對所述受試對象的感染。112.權(quán)利要求105或110的方法，其中所述抗體是IgG抗體。113.權(quán)利要求105的方法，其中所述受試對象是人。全文摘要本發(fā)明涉及具有載體蛋白和包載在復(fù)合物中的目標(biāo)抗原的疫苗組合物、制備這種疫苗的方法和給予疫苗的方法。文檔編號A61K39/09GK101553246SQ200780037545公開日2009年10月7日申請日期2007年8月7日優(yōu)先權(quán)日2006年8月7日發(fā)明者J·J·梅卡拉諾斯申請人:哈佛大學(xué)校長及研究員協(xié)會