專利名稱：用于血管造影術(shù)的多色的不同大小的顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于血管造影術(shù)的組合物和用于檢測血管泄漏和血流量的方 法。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法育調(diào)來評估血-視網(wǎng)膜屏障的完 整性和/或定量觀啶血-視網(wǎng)膜屏障內(nèi)的損壞程度。因此，本發(fā)明的組合物可以在 二維，三維成像和相似的技術(shù)中當(dāng)做造影劑l頓。
背景技術(shù)：
視網(wǎng)膜血管造影術(shù)是用于眼科學(xué)的--種石開究眼的生理和病理狀況的技術(shù)。 例如，已經(jīng)證明血管造影術(shù)在研究和臨床領(lǐng)域中對評估視網(wǎng)膜疾病有用，例如 糖尿病視網(wǎng)膜病和年齡相關(guān)的黃斑病變是兩種導(dǎo)致失明的主要原因。常規(guī)的， 一種熒光物質(zhì)，例如熒光素，靜脈內(nèi)給藥至患者，然后通過血管造影術(shù)觀察患 者的視網(wǎng)膜。在健康的眼睛里，眼睛屏障防止熒光素的泄漏通過視網(wǎng)膜血管進(jìn) 入玻璃體或者其他眼睛組織。然而，在患病的眼睛中，血液視網(wǎng)膜屏障損壞， 在糖尿病視網(wǎng)膜病的情況下導(dǎo)致熒光素泄漏進(jìn)玻璃體，或者在與年齡相關(guān)的黃 斑變性的情況下導(dǎo)致泄露至視網(wǎng)膜下間隙。
對常規(guī)使用的血管造影操作的限制之一是使用的熒光物質(zhì)只提供泄漏存在 的一種"全或無"的判定，或者在最好實施例中，血視網(wǎng)膜屏障損壞的一次主觀 評價。在血視網(wǎng)膜和血腦屏障中的損壞數(shù)量的定量測定將為疾病進(jìn)展提供更好 的評估，提高我們選擇適當(dāng)治療和齊糧的能力，并且允許我們監(jiān)控該治療和劑 量的效果。
發(fā)明和，
本發(fā)明涉及多色血管造影術(shù)(PCA)，使用不同的標(biāo)記物或粘附染料，吸附 到或者包裹在不同大小的顆粒、珠，膠體或者標(biāo)記物的可溶綴合物。這樣的標(biāo) 記物/染料的顆粒、珠，膠體和可溶綴合物在此統(tǒng)稱為顆粒。 一組一定大小的顆 ?？梢酝ㄟ^它們的標(biāo)記物或染料與不同尺寸的另一組顆粒區(qū)分。多組顆粒的組合能用來明確檢測并且定量觀啶血屏障的泄漏或者損壞。因此，來自血屏障泄 漏的顆粒大小提供了一種測定血屏障損壞程度的方法。當(dāng)除較小顆粒之外還有 顆粒泄露時，存在血屏障的較大損壞或機能障礙，反之，只有較小顆粒的 泄漏表明存在較小損壞或者機能障礙(參見，例如，附圖4)。
因此，本發(fā)明的一方面是包括一系列顆粒組的組合物，每一顆粒組具有不 同的平均直徑和提供獨特信號的獨特標(biāo)記物(例如，在獨特波長吸收或者發(fā)射 光的獨特?zé)晒饣鶊F(tuán))。
通常，在組合物里的每一顆粒組的顆?？扇苡谝环N水相環(huán)境。在一些實施 方案里，顆粒組使用可生物P絲軍的顆粒。在其他實施方案里，顆粒由不能生物 P絲軍的材料或者可生物卩絲軍和不能生物聯(lián)牟的材料的組合制成。例如，顆?？?br> 以由聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-先乙交酯)(PLGA)、聚亞烷基
二醇、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷、異丁烯酸酯、肽、蛋白質(zhì)、類蛋白微球體、 脂質(zhì)、脂質(zhì)體或者多糖制成。用于本發(fā)明顆粒的多糖可以包括纖維素和衍生化 的纖維素(例如，由各種低級烷基取代的纖維素)，或者糖、蘋果酸鹽、琥珀酸
鹽、檸檬酸鹽、異檸檬酸鹽，a-酮戊二酸、延胡索酸等其他聚合物。顆粒也可 包含聚合物，例如羥丙基異丁烯酸、馬來酸酐的均聚物或者混合聚合物、琥珀 酸酐等等。
在不同顆粒組中的顆粒具有不同的分子量或者尺寸。例如，顆?？赡芟?00 道爾頓或者800道爾頓、或者1000道爾頓或者5000道爾頓一樣小。顆粒也可 具有像IOO，OOO,OOO道爾頓或者1,000,000,000道爾頓一樣大的分子量。在一些實 施方案中，顆粒具有最多3微米的直徑。在其他實施方案中，顆粒能在尺寸方 面具有的直徑，例如從大約3皮米到大約3微米，或者大約10皮米到大約2.5 微米，或者大約100皮米到大約2微米，或者大約1納米到1微米。在一些實 例里，顆粒尺寸為至少大約10皮米、至少大約100皮米、至少大約1納 口/ 或至少大約10納米。
在顆粒組內(nèi)的顆粒上使用不同染料和標(biāo)記物。因此，例如顆粒能有熒光、 發(fā)光、紅外、有磁性、方婦射生標(biāo)記物或其組合。熒光標(biāo)記物的實例包括熒光素、 異硫氰酸熒光素、吲哚菁綠(indocyanine green)、若丹明紅(rhodamine red)、 太平洋藍(lán)(pac迅c blue)、德克薩斯紅(texas red)、 alexa-532、羥基香豆素、氨 基香豆素、甲氧基香豆素、氨基甲基香豆素、級聯(lián)藍(lán)(cascade blue)、熒光黃(luciferyellow)、 P-藻紅蛋白(P-phycoeiythrin)、 R-藻紅蛋白(R-phycoeiythrin)、麗絲 胺若丹明B GissaminerhodamineB)、別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin)、俄勒岡綠 (oregon green )、 四甲基若丹明 (tetramethylrhodamine )、 丹磺酰、 monochlorobimane、熒光蛋白、鈣黃綠素(calcein)或者其他連接其上的染料或 標(biāo)記物，吸附其上或者包裹其中。在其他實施方案中，至少一個顆粒組的標(biāo)記
物是鉻(m)、錳(n)、鐵(m)、鐵(n)、鈷(n)、鎳(n)、銅(n)、釹(ni)、 釤(m)、鐿(m)、軋(m)、釩(n)、鋱(m)、鏑(m)、鈥(m)、鉺(m)、 鑭(m)、金(m)、鉛(n)、鉍(m)、碘131、碘123、碘125、锝"、銦川、磷
32、錸1S8、錸版、鎵67、硫35、銅67、釔，氣3或者砹2U。
本發(fā)明的另一方面是一種在哺乳動物中用于定量測定血管泄漏的方法，包 括(a)將本發(fā)明的顆粒組合物給藥至哺乳動物；(b)觀察哺乳動物的血管外 部是否放出信號；以及(C)如果信號隨著哺乳動物的血管外部發(fā)出，在哺乳動 物體內(nèi)確定在哺乳動物血管外面放出信號的類型以定量觀啶血管泄漏。在一些 實施方案中，血管泄漏包括通過哺乳動物的血視網(wǎng)膜屏障的泄漏。例如，當(dāng)觀 察或者定量測定通過這種血視網(wǎng)膜屏障的血管泄漏時，這個信號可能是熒光信 號并且確定發(fā)射信號的類型可以包括確定信號的吸收或者發(fā)射波長。在其他實 施方案中，血管泄漏可以包括通過哺乳動物的血腦屏障的泄漏。當(dāng)^l察或者定 量測定通過血腦屏障的血管泄漏時，信號可能愚頓磁性或者方婦射生的信號。
在哺乳動物中用于定量測定血管泄漏的方法，也可包括定量測定血管泄漏 的一個步驟，通過將發(fā)出該信號的顆粒組的粒徑范圍與信號關(guān)聯(lián)，以在引起泄 漏的血管里鑒定孔徑大小，并且給該孔徑大小賦予數(shù)值。
本發(fā)明的另一方面是一種在哺乳動物中用于定量測定血管泄漏的方法，包 括(a)將本發(fā)明的多色顆粒組合物給藥至哺乳動物；(b)觀察哺乳動物的血 管外部是否放出色信號；以及(c)如果放出色l言號，檢測色信號吸收或者發(fā)射 波長，從而定量測定哺乳動物內(nèi)的血管泄漏；其中多色顆粒組合物包括一系列 顆粒組，每一顆粒組具有不同的平均直徑和獨特的色信號。如果哺乳動物的血 管外部發(fā)出色信號， 一個或多個色顆粒己經(jīng)從血管外滲(即，泄漏)。在一些實 施方案中，例如，血管泄漏包括通過哺乳動物的血腦屏障的泄漏。在其他實施 方案中，例如，血管泄漏包括通過哺乳動物的血視網(wǎng)膜屏障的泄漏。本發(fā)明的 方法可進(jìn)一步包括定量測定血管泄漏，通過將顆粒組的粒徑范圍與色信號的吸收或者發(fā)射波長關(guān)聯(lián)，在引起泄漏的血管里發(fā)射該波長以鑒定孔徑大小，并且 給孔徑大小賦予數(shù)值。在鑒定孔徑大小之后，合適的治療齊訴B/或程序可以被給 藥和/或執(zhí)行。
本發(fā)明的另一方面是一種用于觀察血在哺乳動物中流過血管的方法，包括: (a)將本發(fā)明的標(biāo)記顆粒組合物給藥至哺乳動物；(b)在哺乳動物的血管內(nèi)觀 劍言號；以及(c)檢測信號的類型以確定哺乳動物中血流的速度和/或血管的大 小；其中被標(biāo)記的顆粒組合物包括一系列顆粒組，每一顆粒組具有不同的平均
直徑和獨特的標(biāo)記物或者信號。這種方法可適于允許血流動問題的鑒定，例如 血管的部分或者全部阻塞。阻塞的程度或者血管的直徑可以通逝見察明附類型 的標(biāo)記物或者信號存在于血管被確定。血管里的阻塞可以通^^見察在一個獨特 的位點流過血管的粒徑的^顆粒的阻滯而鑒定。
本發(fā)明的另一方面是一個試劑盒或者制造的產(chǎn)品，含有包括一系列顆粒組 的組合物，每一顆粒組具有獨特的直徑粒徑范圍和獨特的標(biāo)記物或者染料(例 如，熒光團(tuán)，M獨特的波長吸收或者發(fā)射光)，以及4頓組合物的說明書。在 一些實施方案中，說明書描述怎樣在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)和/或定量測定血管泄漏。 在其他實施方案中，說明書描述怎樣檢測血流量，血管直徑和/或血管阻塞(既 包括部分也包括實質(zhì)上完全的血管阻塞)。試劑盒也可包含其他有用的工具，例 如注射器、針頭、藥簽、導(dǎo)管或者抗菌溶液)。
本發(fā)明的另一方面是一種用于在哺乳動物的血管里觀察血流量和/或血流速 的方法，其包括將本發(fā)明的組合物之一給藥至哺乳動物的血管，并檢測來自血 管里組合物的至少一組顆粒組的至少一個信號。方法也能包括使信號與發(fā)射的 顆粒組的粒徑范圍相關(guān)聯(lián)，鑒定血管的直徑的那個信號。另外，這種方法可包 括鑒定血管的直徑是否沿著血管的長度改變，或在隨后的時間改變。這種方法 也可包括鑒定血管是否有部分阻塞。
附圖簡述
附

圖1A-D描述了視網(wǎng)膜血管造影術(shù)的性質(zhì)，根據(jù)普通有效的操作使用熒光 素鈉(102)完成，其中熒光素(102)的分子量和有效粒徑為376道爾頓。熒 光素鈉(102)具有橙-棕色的顏色，最大X^為492nm，以及最大U為518nm。 視網(wǎng)膜(106)將含有內(nèi)部視網(wǎng)膜血管和外部視網(wǎng)膜血管的脈絡(luò)膜分開。附圖1A 是顯示熒光素和血槳蛋白質(zhì)(104)的混合物(100A)的圖解，說明20-30%的熒光素分子(102)是非結(jié)合的，而70-60%結(jié)合在血漿蛋白質(zhì)(104)上。附圖 1B是在正常視網(wǎng)膜(100B)里的熒光素(102)行為的圖解，并且顯示從脈絡(luò) 膜血管泄露到脈絡(luò)膜的游離熒光素分子(102)引起的背景熒光。附圖1C顯示 來自脈絡(luò)膜或者外部血視網(wǎng)膜屏障(100C)的泄漏，而附圖1D顯示來自血視 網(wǎng)膜屏障內(nèi)部(100D)的泄漏。因此，附圖1C和D說明不同的熒光素泄漏模 式和不同程度的血視網(wǎng)膜屏障機能障礙。
附圖2A-D描述M過吲哚菁綠(202 ; ICG)進(jìn)行的血管造影術(shù)，根據(jù)常 規(guī)的有效操作并且證明有效粒徑(30-70千道爾頓)的 ，在那里含有98%的 小柳朵菁綠分子(202)，其只有775道爾頓的分子量，被結(jié)合在更大的蛋白質(zhì)、 脂蛋白和磷脂類(204)上。注意到吲哚菁綠(202)具有綠顏色，最大U為 800nm，以及最大U為825nm。在這張圖解里，視網(wǎng)膜(206)將含有內(nèi)部視 網(wǎng)膜血管和外部視網(wǎng)膜血管的脈絡(luò)膜分開。附圖2A顯示卩引哚菁綠分子(202) 和血漿蛋白質(zhì)和其他等離子體顆粒(204)的混合物(200A)，說明幾乎所有的 吲哚菁綠^^子(202)被結(jié)合在血漿蛋白質(zhì)和其他等離子體顆粒(204)上，并 且這些大蛋白質(zhì)(204)通常在正常的視網(wǎng)膜內(nèi)防止ICG (202)從血視網(wǎng)膜屏 障里泄漏，如附圖2B中所示。附圖2C顯示來自脈絡(luò)膜或者外部血視網(wǎng)膜屏障 (200C)的泄漏，而附圖2D顯示來自內(nèi)部(200D)血視網(wǎng)膜屏障的泄漏。因此， 附圖1C和D說明不同的熒光素泄漏模式和不同程度的血視網(wǎng)膜屏P對幾能障礙。
附圖3描a^本發(fā)明的一個實施方案-組合物(300B)包含被結(jié)合在不同粒 徑的顆粒(302， 312， 314和316)上的一系列熒光團(tuán)，其中顆粒表示為大白環(huán)， 以及熒光團(tuán)表示為小圓點(302， 304, 306和308)。如圖所示，最終組合物由 含有不同粒徑顆粒的不同熒光團(tuán)(302， 304， 306和308)的一系列単4蟲混合物 (300A)制成。在混合并將熒光團(tuán)和顆粒(310)結(jié)合起來之后，三個熒光團(tuán)被 結(jié)合在不同粒徑的顆粒上(312， 314， 316，例如，具有從大約500個道爾頓至 1微米的粒徑范圍)。 一個熒光團(tuán)(302)是未結(jié)合的并且形成最小種類的顆粒。 因此，組合物(300B)包括眾多顆粒種類，每個都具有控制粒徑，齡都具有 不同的標(biāo)記物(或者熒光團(tuán))(302， 312， 314， 316)，其中標(biāo)記物或者熒光團(tuán) 標(biāo)志了珠粒的大小。
附圖4描述了本發(fā)明組合物的效用，為確定在血管機能障礙度或者在像血 視網(wǎng)膜屏障那樣的各種各樣的血屏障里的機能障礙程度。使用的組合物(300B)具有在這張示意圖內(nèi)說明的相同的標(biāo)記物顆粒(302， 312， 314， 316)，與如附 圖3顯示的那些相同。因此，在正常的健康血管(400A)里，實質(zhì)上沒有標(biāo)記 顆粒逃脫血管，基本上沒有機能障礙存在，以及機能障礙的程度會,，例如， 被標(biāo)記為第0階段或者(沒有機能障礙)。如果，最小機能障礙存在(400B)， 非常小的^l立(302)逃脫血管。這表明存在一些小程度的機能障礙f灘，例如， 作為最小或者第1等級機能障礙分級。如果中等機能障礙存在(400C)，有點更 大珠粒以及非常小的顆粒(302和312)逃脫血管。 明有點較^|呈度的機能 障礙會,，例如，被標(biāo)記為中等或者第2等級機能P韓尋。如果嚴(yán)重的機能障礙 存在(400D)，有點更大的顆粒(314)和更小的以前JI^粒(302和312)逃 脫血管。這表明存在^C程度機能障礙的能夠，例如，被標(biāo)記為嚴(yán)重或者第3 等級機能障礙。如果，非常嚴(yán)重機能障礙存在(400E),十分大的顆粒(316) 以及較小顆粒逃脫血管(302， 312禾口314X存在更巨^f呈度機能障礙的育^l多， 例如，被標(biāo)記為非常嚴(yán)重或者第4等級機能障礙。
附圖5描述了在體外實驗過程中用不同的發(fā)色團(tuán)顯示不同粒徑的顆粒制備 的分離，其中分離是通過具有0.2 大小孔徑的膜過濾實現(xiàn)。制備三組染料/ 混合物，其由被結(jié)合在尺寸不到0.2微米的PLGA顆粒上的熒光素，結(jié)合至尺 寸大于0.2微米PLGA顆粒的噴哚菁綠(ICG)以及兩種-，顆粒的混合物組成。 將每組分兩個等分進(jìn)行測試。 一個等分經(jīng)0.2微 L過濾器濾過，以及第二等分沒 被過濾。這排圖像底部/人左到右顯示非過濾的熒光素PLGA顆粒，非過濾的熒 光素PLGA和B引哚菁綠PLGA混合物的顆粒和非過濾的B引哚菁綠PLGA顆粒。 上排圖像/A^到右顯示被過濾的熒光素PLGA顆粒(自由i43131過濾器)，被過 濾的混合物，其中熒光素PLGA顆粒自由地3D131濾器，而n引哚菁綠PLGA顆 粒被阻斷以及被過濾的吲哚菁綠PLGA顆粒，其被過濾器全部阻斷。這一體外 實驗過程證明選擇性泄漏的概念。
附圖6A和6B比較由j頓吲哚菁綠(ICG)操作(附圖6A)和由靛青(ICG) 常規(guī)操作的結(jié)合PLGA顆粒(附圖6B)獲得的血管造影圖像。對于附圖6A實 驗來說，用1毫升生理鹽溶液的2.5毫克ICG給藥至兔，和對于圖6B的實驗， 用1毫升生理鹽溶液的2.5毫克ICG顆粒(裝載3.3%的ICG)給藥至兔。然后 觀察染料和/或顆粒在兔內(nèi)視網(wǎng)膜的體內(nèi)行為。如附圖6B中所示，顆粒結(jié)合的 ICG引起更明亮，更獨特的圖像。因為游離ICG結(jié)合至組織，而顆粒結(jié)合的ICG不會結(jié)合，顆粒結(jié)合ICG的i頓提供了^爐的、清晰的、獨特的血管圖像。
附圖7A和7B比較由j頓常規(guī)可用的游離熒光素血管造影術(shù)(附圖7A) 或者〗頓常規(guī)的操作被結(jié)合在顆粒上的熒光素血管造影(附圖7B)獲得的圖像。 兩種熒光素產(chǎn)物給藥至兔并觀察染料/顆粒在兔視網(wǎng)膜內(nèi)的體內(nèi)行為。正如所示， 顆粒結(jié)合的熒光素使得圖像沒有顯著的背景。因為游離熒光素結(jié)合組織，而顆 粒結(jié)合的熒光素不結(jié)合組織，顆粒結(jié)合熒光素的使用提供了改進(jìn)的、清晰的、 獨特的沒有背景熒光的血管圖像。
附圖8A-F描述了將組合物的混合物給藥至兔后，粒徑的不同標(biāo)記組在視網(wǎng) 膜中的選擇性泄漏。附圖8A-C在一禾中ICG結(jié)合顆粒和游離熒光素的混合物的 給藥之后，健康的視網(wǎng)膜血管的血管造影圖像。在附圖犯里發(fā)現(xiàn)ICG結(jié)合顆 粒，而在圖8C里發(fā)現(xiàn)熒光素結(jié)合顆粒。附圖8A顯示在正常的兔視網(wǎng)膜里從ICG 結(jié)合顆粒和游離熒光素發(fā)現(xiàn)熒光。附圖8D-F是在對一只兔的ICG結(jié)合顆粒和 游離熒光素的混合物的給藥之后，中等機能障礙的視網(wǎng)膜的血屏障的血管造影 圖像。在兔體內(nèi)通過LPS (脂多糖20納克)的玻璃體體內(nèi)注射，引起中等血視 網(wǎng)膜屏障機能障礙。在附圖8E檢觀倒該ICG結(jié)合顆粒，而在附圖8F中檢測到 游離熒光素。附圖8D顯示在這只中等機能障礙的兔視網(wǎng)膜的血屏障里從ICG 結(jié)合顆粒和游離熒光素發(fā)現(xiàn)熒光。注意，在正常兔視網(wǎng)膜內(nèi)(附圖8A-C)都沒 染料泄漏，而在中等機能障礙的血視網(wǎng)膜屏障模型里，更小的未結(jié)合的熒光素 顆粒從視網(wǎng)膜的血管泄漏(附圖8D和8F的綠色著色)，而顆粒結(jié)合的ICG (在 附圖8D & E里的紅色)沒有泄漏。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及一種不同的清楚大小基團(tuán)并且清楚地標(biāo)記顆粒或者小珠的組合 物。本發(fā)明的組合物可以用于定量評價血屏障(例如，血視網(wǎng)膜屏障)完整性 的方法，通過檢測在血屏障(例如，在玻璃體里)外邊發(fā)現(xiàn)顆粒的粒徑。顆粒 的大小通過觀察哪種類型的染料或者標(biāo)記物在血屏障的外部上存在而被鑒定。 本發(fā)明的組合物也可用于確定或者檢測通過血管的血流量的方法(例如，和在 血流量方面鑒定部分或者完全阻塞，或由于全身或者局部的問題減少血流的速 度)，ffiil檢測顆粒流過血管的速度和粒徑。因此，血管的部分阻塞可以經(jīng)iM: 觀察血管的粒徑突然改變而檢測。為檢測這些事件(例如，泄漏，部分阻塞)， 將不同的染料或者標(biāo)記結(jié)合到，吸附到或者加載到不同尺寸顆粒上，以產(chǎn)生本發(fā)明的組合物。
根據(jù)本發(fā)明，在血屏障中的,程度通過觀察從該血屏障中泄露的較大顆
粒的程度進(jìn)行評價。例如，在血視網(wǎng)膜屏障(BRB)輕微機能障礙的情況下只 有較小的顆粒泄漏，而當(dāng)BRB機能障礙更嚴(yán)重時， ;粒徑的顆粒泄漏。顆粒 的大小通過觀察逃脫血屏障的標(biāo)記物或者染料來測定。血屏障泄露或者機能障 礙的嚴(yán)重程度可以通過血屏障泄漏的粒徑將其分級。泄漏的顆粒在此反映血屏 障中孔的大小。在血管里的大多數(shù)組合物顆粒的存在是血管實質(zhì)上完整的證據(jù)。 因此，治療齊訴Q操作可用來洽當(dāng)鵬被檢測血管泄漏的程度。
經(jīng)過血管的血流量(以及在血流中可能的阻塞)也能使用本發(fā)明的顆粒組 合物進(jìn)行評價。因此，當(dāng)使用本發(fā)明的組合物觀察血流量時，在較大的血管里 將會檢測到較大顆粒和較小顆粒的混合物，但是在更小的血管里可能觀察到較 小的顆粒。然而，如果在較大血管里已經(jīng)發(fā)生阻塞，將會在阻塞下游觀察到粒 徑方面的變化。特別地，與阻塞的上游觀察相比，將在阻塞的下游觀察到較大 比例的較小顆粒。
顆粒
如上所述，本發(fā)明的組合物含有被標(biāo)記的不同大小的顆粒。特別地，組合 物包含一系列顆粒組，每一顆粒組具有在組合物里不同于其他顆粒組平均直徑 的平均直徑。而且，每一顆粒組具有獨特的標(biāo)記物，其發(fā)射在組合物里可容易 同其他顆粒組的標(biāo)記物/信號區(qū)分的特別信號。
選擇顆粒組尺寸以允許進(jìn)行血屏障或者血管泄漏的嚴(yán)重程度的評價。因此， 使用多種的尺寸。通常，組合物使用大約2到大約20或者大約2到大約10種 不同的顆粒組尺寸。在一些實施方案中，組合物中使用大約2到大約8，或者大 約2到大約6種不同的顆粒組尺寸。粒徑能隨分子量或者尺寸(例如直徑)而 變化。例如，顆?？赡芟?00道爾頓、或者800道爾頓、或者1000道爾頓或者 5000道爾頓一樣小。顆粒也能具有像100,000,000道爾頓或者l,OOO,OOO，OOO道 爾頓一樣大的分子量。在一些實施方案中，顆粒具有高至約3微米，或者高至 約2 或者高至約1微米的直徑。在其他實施方案中，顆粒能例如，具有直 徑像大約10皮米一樣小，或者大約100皮米，或者大約l納米。因此，例如， ^^立在尺寸方面范圍為從大約10皮米到大約3微米，或者大約100皮米到大約 2微米，或者大約1納米至大約1微米。在一些實施方案中，顆粒能在大約10皮米到900納米直徑或者大約1納米到大約1微米的范圍內(nèi)。
例如，在本發(fā)明的組合物里一組顆粒能有大約l-2微米的平均直徑，在組合 物里的另一組顆粒能有大約400~600納米的平均直徑，又一組顆粒能有大約 100-200納米的平均直徑，另一組顆粒能有大約40-60納米的平均直徑，更進(jìn)一 步的組能有大約5-20納米的平均直徑，以及一個最終的組能由一類游離標(biāo)記物 組成。
顆?？梢杂煽缮锖撇帕现瞥桑鋵⒅饾u在活體的身體里溶解?；蛘?， 顆粒可以由不能生物降解的材料或者可生物降解和不能生物糊軍的材料的組合 制成。而且，用于本發(fā)明顆粒的材料基本上沒有任何毒性或者其他對主體有害 的影響。通常，在顆粒中〗頓的顆粒和/或材料不充分^7K，以致吸收或者吸附 到組織和生物分子上。本發(fā)明的顆粒優(yōu)選容易懸浮或者溶解于水性溶液，且在 需要執(zhí)行本發(fā)明診斷方法的時間內(nèi)(例如，約6到約24個小時)基本上不會損 失標(biāo)記物/染料或其整體結(jié)構(gòu)。
合適的可生物卩絲率材料能在體內(nèi)(例如通過酶促作用)分解或者溶于身體 的水相環(huán)境。合適的可生物卩絲 材料的例子包括多糖、聚亞烷基二醇、蛋白質(zhì)、 肽、類蛋白微球體等等。在一些實施方案中，{細(xì)聚(D,L-丙交酯-共、乙交酯) (PLGA)、聚乳酸、聚乙醇酸、雙乳酸和乳酸乙醇酸共聚物，其可購自Poly Sciences Incorporated^ Moorington, PA或者Birmingham Polymers (Durect Corporation, Pelham, AL)。也可使用其他生物可卩絲率聚合物，例如，聚亞烷基二醇(例如， 聚乙二醇)、蛋白質(zhì)、類蛋白微球體(熱處理的氨基酸混合物)、脂質(zhì)體等等。
正如此處所述，載有熒光素鈉和吲哚菁綠的聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯) (PLGA)納米顆粒已經(jīng)成功生產(chǎn)并用于檢測血視網(wǎng)膜屏障泄露。
在本發(fā)明的組合物中不同顆粒組的濃度可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的期望而 改變。在一些實施方案中，組合物包含大約相同數(shù)量的每一顆粒組，象以顆粒 數(shù)目或者以標(biāo)記物信號評價的那樣。因此，組合物可具有顆粒組，其中每一顆 粒組具有大約相同數(shù)目的顆粒?？蛇x擇地，當(dāng)各種各樣的顆粒組包含有不同信 號強度的不同標(biāo)記物時，顆粒組的組合物可以被調(diào)整，以便每一顆粒組發(fā)射大 約相同數(shù)量的信號，不管顆粒數(shù)目。
標(biāo)記物
多種標(biāo)記物可用于本發(fā)明的顆粒上?；旧先魏晤愋偷臉?biāo)記物均可以使用。然而，它可能是便于全部能被單個的設(shè)備檢測的各種各樣的顆粒組選擇使用的 牛gi己物。因此，例如，不同的熒光團(tuán)或者發(fā)光分子可以混入各種各樣顆粒組中， 或者不同放射性同位素，或者不同金屬，或者不同有磁性或者順磁性原子，或 者不同的紅外線或者紫外線輻射吸收或者發(fā)射分子，或者不同的酶制劑都能用 于顆粒。
在一些實施方案中，不同的熒光團(tuán)用于不同的顆粒組。例如，顆粒組可具 有熒光素、異硫氰酸熒光素、吲哚菁綠、若丹明紅、太平洋藍(lán)、德克薩斯紅、
alexa-532、羥基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、氨基甲基香豆素、級聯(lián) 藍(lán)、熒光黃、P-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、麗絲胺若丹明B、別^M蛋白、俄勒岡 綠、四甲基若丹明、丹磺酰、monochlorobimane、鈣黃綠素和其他熒光團(tuán)標(biāo)記物。 當(dāng)前，視網(wǎng)膜血管造影術(shù)通常涉及熒光素血管造影術(shù)(FA)禾口/或吲哚菁綠 血管造影術(shù)(ICGA)。熒光素鈉，用于FA的染料是376.27 D橙褐色染料，其 是70-80%結(jié)合在血漿蛋白上，而其余20-30%是游離的。熒光素的最大吸收波 長是492nm，以及它的最大發(fā)射波長是518。另一方面，大約98%的吲哚菁綠 (ICG) -7750結(jié)合在血漿蛋白質(zhì)、月旨蛋白和磷脂類上，未結(jié)合的染料數(shù)量很少。 吲哚菁綠的最大吸收和發(fā)射波長分別是800nm和825nm。這兩種染料在吸收和 發(fā)射光譜上的差異，在血管造影術(shù)中描述它們的能見度中起主要作用。視網(wǎng)膜 色素上皮(RPE)層堵塞熒光素的短波長發(fā)光，因此脈絡(luò)膜血管不可見，只有 視網(wǎng)膜的血管可能被看見。另一方面，B引哚菁綠有更長的發(fā)光范圍并且沒有因 為RPE層被堵塞。這些性質(zhì)允許另外用吲哚菁綠將脈絡(luò)膜除視網(wǎng)膜血管之外的 血管可視化。
兩種顏料之間的第二種差異是其結(jié)合特性。在視網(wǎng)膜中，染料分配的運動， 部分取決于它的有效粒徑，特別是它的分子大小，如果未結(jié)合，或者在染料結(jié) 合的情況下顆粒染料的復(fù)合尺寸。ICG幾乎完全結(jié)合至蛋白質(zhì)、脂蛋白和磷脂 類上并且因]tbm隨這些顆粒的分配。另一方面，熒光素只是70-80%結(jié)合在血漿 蛋白質(zhì)上，乘1]下20-30%的針是未結(jié)合的，并且有能力滲透結(jié)合的ICG不能逃 脫的小孔(例如，來自不可透ICG的多孔的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的熒光素的泄漏)。 染料的結(jié)合與它們的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。然而，當(dāng)加載到顆粒上后，染料失去 其結(jié)合血漿蛋白質(zhì)的能力。因此，當(dāng)結(jié)合至本發(fā)明的顆粒時，與染料的組織吸 收相關(guān)的問題，包括高的背景信號和使用染料的高劑量的需要，得以解決。當(dāng)熒光的標(biāo)記物用于確定血管位置以便熒光團(tuán)能吸收并且發(fā)射光時，很多 血管不被那么方便地定位，以致于沒有侵入性的操作，就可檢測這一熒光信號。 因此，非熒光的標(biāo)記物和染料也能用于本發(fā)明的顆粒上，這些非熒光標(biāo)記物的 信號和染料可以被非侵入性操作檢測，例如方謝線照相術(shù)、超聲波、磁共振等 等。
例如，顆?？梢员豢刹⑷腩w粒內(nèi)腔的以下物質(zhì)標(biāo)記，放射性標(biāo)記物、有磁 性的標(biāo)記物、順磁標(biāo)記物、造影劑和/或氣體。
就頓磁離子而論，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇的離子例如，執(zhí),言，鉻(m)、 錳(n)、鐵on)、鐵(n)、鈷(n)、鎳(n)、銅(n)、釹(rn)、釤(ni)、 鐿(m)、 IL (ffl)、釩(n)、鋱(m)、鏑(m)、鈥(m)和鉺(m)，其中優(yōu)
選軋。適用于其他上下文內(nèi)容的離子，例如x射線成像，包括，但是不限于鑭 (m)、金(m)、鉛(n)，以及特別是鉍(m)。
就為診斷應(yīng)用的方効寸性同位素而論，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用碘131、碘123、 碘125、锝"、鋼川、磷32、錸188、錸186、鎵67、硫35、銅67、釔90、氚3或者砹
211
標(biāo)記物可i!31可用的操作被吸附或者共〗介連接至顆粒。在一些實施方案中， 顆粒同時形成并且被標(biāo)記。在其他實施方案中，生產(chǎn)顆粒以及在隨后的時間增 加標(biāo)記物。標(biāo)記物和染料可直接吸附或者附著至顆粒，或者那些標(biāo)記物和染料 可M31S接基團(tuán)或者合適附著的基團(tuán)間接附著。
因此，例如，納米顆?？梢允褂眉{米沉降技術(shù)(Chornyetal., 2002, Journal of Controlled Release 83:389400禾口 401-414)或者其變體進(jìn)行制備。例如，聚合物 (如聚(D,L-丙交酯-共、乙交酯)(PLGA))和標(biāo)記物可以溶于一種溶劑混和物(例 如丙酮、乙醇和二氯甲烷)，然后倒入在漏斗內(nèi)的含l %聚乙酸乙烯酯(PVA) 的水相中，使用適度攪拌蒸餾水。過夜蒸發(fā)有機相之后，過濾懸浮混懸液并離 心分離。顆粒球團(tuán)可在水中再混懸并凍干。顆?？杀恢匦聭腋≡诤线m的生理溶 劑中，例如水或者磷酸緩沖生理鹽水。
可選擇地，在生產(chǎn)期間可將合適的連接基團(tuán)增加至噘粒。例如，可以用于 連接基團(tuán)和/或標(biāo)記物和染料附著的官能團(tuán)。能形成共i纖的官能團(tuán)包括，例如， -COOH禾口-OH; -CCOH^BNH2;以及-COOH和-SH。例如，連接基團(tuán)可方便 地與檢測的標(biāo)記物或染料連接，1),安(-N(H)C(=0)-， -C(=0)N(H>)，2)酯(畫OC，O)畫，-C(=OP-)， 3)醚(-O-)， 4)硫醚(國S-)， 5)亞硫酰(-S(0》)，
或者6)磺酰基(-S (0) 2)。這樣的連接可以使用本領(lǐng)域公知的合成工藝由適 當(dāng)?shù)墓δ芑鹗荚现苽洹?血屏斷幾能障礙的檢測
根據(jù)本發(fā)明，在哺乳動物中的血屏障機能障礙可以被檢測并且通過觀察從 哺乳動物血管中逸出的顆粒確定數(shù)量。在顆粒上的不同標(biāo)記物允許檢測逃M 粒，并且那些逃M粒的不同尺寸允許診斷血屏斷幾能障礙的程度。因此，在 血屏障外邊檢測標(biāo)記物的類型和在一些實施方案中，標(biāo)記物的濃度使這樣的診 斷變得容易。
對定量測定這樣的機能障礙，可以基于逃脫的顆粒的類型來分配數(shù)值。因 此，如果基本上沒有檢測到顆^鵬脫，這個血屏障可鑒定為具有0級，或者沒 有血屏障機能障礙。如果較小的顆粒逃離血管，血屏障可以鑒定為級別1或者 輕度血屏障機能障礙。如果稍微有點更大的顆粒逃離血管，血屏障可以鑒定為 級別2或者中度血屏障機能障礙。如果有點更大的顆粒逃離血管，血屏障可以 鑒定為級別3或者有點嚴(yán)重血屏障機能障礙。如果更^粒逃離血管，血屏障 可以鑒定為級別4或者非常嚴(yán)重血屏障機能障礙，等等。
逃離血屏障的顆?？梢酝ㄟ^任何方便的方式進(jìn)行檢測。例如，顆粒的逃脫 可以通過以下方法檢測，使用斷層攝影術(shù)，改良的斷層攝影術(shù)，改良的光學(xué)結(jié) 合性斷層攝影術(shù)(Optical Coherence Tomography) (OCT)，改良的共焦掃描激光 眼底檢查法(SLO)，改良的復(fù)合裝置(SLOIOCT)或者能夠在體內(nèi)檢測標(biāo)記物 或者染料(例如熒光團(tuán))的任何其他設(shè)備。
可在多種組織里檢測血屏障機能障礙，例如，在眼、腦和其他組織里。在 一些實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法用來檢測血視網(wǎng)膜屏障完整和/或機能 障礙。
本發(fā)明的組合物和方法可以檢測很多類型的血屏障機能障礙。可以檢測的 血屏障機能障礙的例子包括，例如，糖尿病視網(wǎng)膜病、黃斑變性、CMV眼感染、 視網(wǎng)膜炎、脈絡(luò)膜局部缺血、急性的扇形脈絡(luò)膜局部缺血、缺血性視祌經(jīng)萎縮 和其他疾病。
方法
如上所述，本發(fā)明的一方面是一種在哺乳動物中用于定量測定血管泄漏的方法，包括(a)向哺乳動物給藥多色顆粒的組合物；(b)觀察是否對哺乳動 物的血管外部發(fā)出色信號；以及(C)如果色信號被^l寸，確定是什么發(fā)出的色 信號，并由此定量測定哺乳動物內(nèi)的血管泄漏；其中多色顆粒的組合物包括一
系列顆粒組，每個顆粒組有一個獨特的直徑粒徑范圍和提供獨特信號的獨特發(fā) 色團(tuán)。如果色信號鄉(xiāng)于哺乳動物的血管外部， 一個或多個已經(jīng)由血管外滲(即， 泄漏)。
本發(fā)明皿一步為鑒定能調(diào)節(jié)血屏障完整的試劑提供方法。這樣的方法可 以不僅用于鑒定提高血屏障完整的有益試劑，還用于評估試劑是否有毒或者導(dǎo) 致血屏障機能障礙。
因此，本發(fā)明的一方面是用于鑒定能在哺乳動物中調(diào)節(jié)血屏障完整的試劑 的方法，其包括向哺乳動物給藥測試試劑和本發(fā)明的顆粒組合物，并且定量測 定逃離哺乳動物血屏障的顆粒，與向哺乳動物給藥僅有本發(fā)明的顆粒組合物(如 果沒有測試試劑)時所觀察到的顆粒逃離相比較。增加顆粒逃脫的測試試劑可 能是有毒的。
可選擇地，減少顆粒逃脫的測試試劑可以是用于血屏障機能障礙和不適當(dāng) 血管泄漏治療的有益治療劑。因此，在一些實施方案中，哺乳動物能具有機能 障礙的血屏障(例如，機能障礙的視網(wǎng)膜的血屏障)，并且該方法用來篩選改進(jìn) 血障礙功能的測試試劑(g卩，抑制顆^m脫)。因此，本發(fā)明的另一方面是用于 鑒定能在哺乳動物中皿血屏障完整的試劑的方法，其包括向哺乳動物給藥測
試試齊訴n本發(fā)明的顆粒組合物，并且定量測定逃離哺乳動物血屏障的顆粒，與
向哺乳動物給藥僅有本發(fā)明的顆粒組合物(如果沒有測試試劑)時所觀察到的 顆粒逃離相比較。在本發(fā)明的篩選過程中，患有血屏障機能障礙的哺乳動物顯 示顆粒逃離自血屏障。
本發(fā)明的另一方面是檢測和/或監(jiān)控在哺乳動物中經(jīng)過血管的血流量的方 法。這種方法包括把本發(fā)明的顆粒組合物給藥至哺乳動物，之后觀察在哺乳動 物中M血管的顆粒流的速度和類型。
雖然當(dāng)光能夠通過血管(例如，視網(wǎng)膜血管)時，顆粒可以用熒光染料標(biāo) 記，但是當(dāng)血管沒那么容易被觀察時可以使用非熒光標(biāo)記物。因此，沒有侵入
性的操作，光不可能/AI茵、心臟、附肢和其他組織里的血管以容易能檢測的方
式吸收并且發(fā)射。為避免這樣的侵入性的操作，顆?？梢杂梢韵驴刹⑷腩w粒內(nèi)腔的物質(zhì)標(biāo)記放射性標(biāo)記物、有磁性的標(biāo)記物、順磁標(biāo)記物、造影劑和/或氣 體。
就頃磁離子而論，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇的離子例如，剩列而言，鉻(m)、 錳(n)、鐵(m)、鐵(n)、鈷(n)、鎳(n)、銅(n)、釹(m)、釤(m)、 鐿(m)、軋(m)、釩(n)、鋱(m)、鏑(m)、鈥(m)和鉺(m)， 軋。 適用于其他上下文的離子，例如x射線圖像，包括，但不限于鑭(m)、金(ni)、 鉛(n),以及特別是鉍(m)。而且，就為診斷應(yīng)用的放射性同位素而論，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以使用碘131、碘123、碘125、锝"、銦111、磷32、錸188、錸186、鎵
67、硫35、銅67、釔90、氖3或者砹2"。
因此，本發(fā)明的組合物能用于確定或者監(jiān)護(hù)血管中的血流量。例如，可以 監(jiān)控心臟、大腦、內(nèi)臟(例如肝、腎、腸、胃)，以及附肢中的血流量。另外， 《柳本發(fā)明的組合物和方法，也能夠監(jiān)控通往心臟、大腦、內(nèi)臟(例如肝、腎、 腸、胃)以及附肢的血管中的血流量。
可以用于測試、檢查或者診斷的哺乳動物包括人和家畜，例如兔、小鼠、 大鼠、狗、貓、綿羊、山羊、牛、馬和動物園的動物。
組合物
給藥本發(fā)明被標(biāo)記的顆粒組合物，以允許血屏障的完整和/或機能障礙的分 析和/，控血流量。
為了允許分析，組合物通常以單個劑量或者兩個劑量或者分開的劑量給藥。
劑量可以變化，例如，可以至少是大約0.01毫彌千克到大約500至750毫彌 千克，至少大約0.01毫彌千克到大約300至500毫彌千克，至少大約0.1毫克 /千克到大約100至300毫彌千克或者至少大約1毫彌千克到大約50到100毫 彌千克顆粒組合物每體重，盡管其他劑量可以提供有益效果。給藥量將依賴各 種各樣的因素而變化，包括但不限于，什么 的標(biāo)記物用于顆粒、給藥途徑、 血屏障損壞的進(jìn)展或缺乏進(jìn)展、體重、血壓、物理條件、健康以及病人的年齡。 臨床醫(yī)師可以使用動物模型或者其他本領(lǐng)域常規(guī)的測試系統(tǒng)容易的確定這些因 素。
組合物可以通過在此描述的方法或者通過本領(lǐng)域常規(guī)的步驟制備，并且根 據(jù)需要或者想要的那樣純化。之后，將該顆粒組合物凍干或者穩(wěn)定；它們的濃 度可以被調(diào)整至合適的量，并且可以任選的加入其他試劑。因此，給出的顆粒組或者其組合物的纟艦重量，是可以大幅度地變化的齊糧單位。例如，大約O.Ol
至大約2個克，或者大約0.1至大約500毫克，其中兩個顆粒組至少可以被給藥。 可選擇地，單位劑型可以變化，至少兩顆粒組從大約0.01克到大約50克，從大 約0.01克到大約35克，從大約0.1克到大約25克，從大約0.5克到大約12克， 從大約0.5克到大約8克，從大約0.5克到大約4克，或者從大約0.5克到大約 2克。
本發(fā)明的顆粒組中可以包含藥學(xué)上可接受的載體。"藥學(xué)上可接受"，它的
意思是載體、稀釋抓賦形劑、和/或鹽與制齊啲其他成分相落而對其受體無
毒。在本發(fā)明組合物中i頓的非限制的載體和/彌釋劑的例子，包括水、7K溶
性糖溶液、生理學(xué)可接受的緩沖生理鹽水，例如，pH值7.0-8.0的磷酸鹽緩沖生 理鹽水等等。
本發(fā)明的組合物可以制備為靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或者內(nèi)部血管給藥。 試劑盒
本發(fā)明進(jìn)一步關(guān)于包裝的組合物，例如試劑盒或者為檢測血屏障健全和/或 損壞或者為檢測血流量的其他容器。試劑盒或者容器裝有包括一系列顆粒組的 組合物，每一顆粒組具有不同的平均直徑和獨特的標(biāo)記物。在試劑盒或者容器 里提供用于檢測血屏障健全和/或血屏障損壞的說明書。
可選擇地，這^H式劑盒可設(shè)計為用于檢測和/，控血流量和適合檢測血流 量的問題。試劑盒或者容器裝有包括一系列顆粒組的組合物，每一顆粒組具有 不同的平均直徑和獨特的標(biāo)記物。試劑盒或者容器里提供用于檢測和/或監(jiān)控血 流量和檢測血流量問題的說明書。
本發(fā)明的試劑盒也可包括用于給藥本發(fā)明組合物的工具。這樣的工具包括 注射器、藥簽、導(dǎo)管、抗菌溶液等等。
下列實施例更進(jìn)一步說明本發(fā)明并且目的不在于限制本發(fā)明。
實施例1材料和方法
材料聚(D,L畫丙交酉旨畫丼乙交酯)(PLGA)， Mw= 10,000 Da (固有粘度 0.17dL/g),購自Birmingham Polymers (Durect Corporation, Pelham， AL)。 吲哚菁綠，熒光素鈉和聚(乙烯醇)(PVA)得自Sigma-Aldnch (StLoms， MO)。 二氯甲垸得自Acros (Moms Plains,NJ)。全部其他化學(xué)制品為分析等級并且得自 地方來源。納米顆粒制劑用稍加改良的納米沉淀技術(shù)(Chomy et al., 2002, Journal of Controlled Release)制備PLGA納米顆粒。簡單的說，將聚合物(70毫克)和 吲哚菁綠或者熒光素(30毫克)溶于15.5毫升丙酮、4毫升乙醇和0.5毫升二 氯甲烷的混合物中，并且倒入濾出的ie/。PVA水相中，在適度攪拌下加入蒸餾水 (40毫升)。在加熱的水浴器(Buchi Heat Bath B490)內(nèi)^fOT Rotovap (Buchi Rotavapor R200, Buchi Analytical Inc., New Castle, DE) 37。C下過夜蒸發(fā)有機相之 后，將混懸MM過0.2Mm過濾器(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)過濾，隨后在 4'C下35,000g離心分離30射中。顆粒片狀物在雙蒸水(20ml)中再混懸并冷凍 干燥。
納米顆粒表征
粒徑分析在雙蒸水內(nèi)稀釋的顆粒懸浮液以高速離心(Vortex Genie, Scientific Industries, Bohemia^ NY)使顆粒再懸浮變得容易。使用C分粒器檢測粒 徑，大小分布和正電勢，基于動態(tài)的光散射的粒徑分析器(Brookhaven Instruments Co.,Holtsville,NY)。
藥物裝載在玻璃Kimble管中，向1毫克凍干的吲哚菁綠或者熒光素裝載 的PLGA顆粒，加入l毫升二氯甲烷并將試管密封。將試管高速(VortexGenie, Scientific Industries, Bohemia^ NY)離心。離心l小時之后，使用N-Evap蒸發(fā)二 氯甲烷萃取物。殘余物質(zhì)在1毫升雙蒸水中經(jīng)5併中高速離心重構(gòu)。然后使用 紫外分光光度計或者熒光分光光度計分析溶液。在二氯甲烷中的含有或不含聚 合物的相同量染料對照品(吲哚菁綠或者熒光素)也進(jìn)^1同樣的處理，并確保 溶質(zhì)的接近完整的回收。
動物研究
Male Dutch Belted兔用于動物研究。分別使用一氯胺酮和賽拉嗪的組合物 35和5毫彌千克體動每兔麻醉。{頓托吡卡胺和脫羥腎上腺素擴大每只兔的 右眼。然后M31近耳的葉脈注入熒光素，n引哚菁綠、熒光素PLGA、吲哚菁綠 PLGA或其組合。通過HRAII激光掃描眼底檢查法(Heidelberg Engineering, HeKielberg Germany)同時使用熒光素和靛青模塊捕獲并且記錄圖像和錄像。在 一些實例里，更進(jìn)一步使用Adobe Photoshop (7.0)增強視網(wǎng)膜血管造影照片。
Association of Research in Vision禾口 Ophthalmology的指導(dǎo)方針進(jìn)碑亍處理。實施例2:檢測血視網(wǎng)膜屏障機能障礙 這個實施例顯示i頓不同大小、不同標(biāo)記的顆粒的組合物來檢測血4見網(wǎng)膜 屏障損壞。
過濾研究說明不同的粒徑
如圖5中所示，不同粒徑的顆粒制劑與不同的發(fā)色團(tuán)一起產(chǎn)生。不同粒徑 的顆粒的分離和檢測數(shù)U具有不同孔徑大小的膜的過濾的影響。因此，制備了 兩個顆粒組的組合物，如圖5中所示(下排，最右側(cè))。該組合物顯示于圖5 (下
排，中間)。組合物包含較小的，熒光素標(biāo)記的PLGA顆粒以分開的形式顯/i 圖5 (下排，左)，和較大的吲哚菁綠PLGA顆粒顯示于圖5 (底部，右側(cè))。因 此，組合物包含熒光素PLGA和吲哚菁綠PLGA混合物和剛哚菁綠PLGA。
圖5的上排說明熒光素標(biāo)記的顆粒是較小的顆粒和吲哚菁綠標(biāo)記的顆粒是 較大的顆粒。因此，熒光素PLGA顆粒自由地濾過0.2微孔的過濾器(圖5，上， 左)，而吲哚菁綠PLGA未通過0.2微孔的過濾器(圖5，上，右)。當(dāng)兩個顆粒 的混合物被過濾時，吲哚菁綠PLGA未通過，但是熒光素PLGAffl51 (圖5， 上，中間)。因此，n引哚菁綠PLGA顆粒具有平均直徑比0.2貨妹大，而熒光素 PLGA顆粒具有比0.2 小的平均直徑。
本發(fā)明的組合物檢測血視網(wǎng)膜屏障機能障礙
圖6顯示通過常規(guī)可行操作的以本發(fā)明的組合物和方法檢測的健康的，0 級血視網(wǎng)膜屏障對照圖。圖6A顯示4頓常規(guī)可用的操作制備和游離B引哚菁綠 (ICG)獲得的一系列血管造影圖像。圖6B顯示^ffi有靛青(ICG)結(jié)合PLGA 顆粒的常規(guī)操作獲得的一系列血管造影圖像。這兩個ICG制劑被給藥至兔的耳 靜脈，并在兔視網(wǎng)膜里觀察該ICG產(chǎn)物的體內(nèi)行為。正如所示，顆粒結(jié)合的ICG 弓胞更明亮，更獨特的圖像。因為游離ICG結(jié)合組織，而顆粒結(jié)合的ICG不， 顆粒結(jié)合的ICG的使用提供改進(jìn)的清楚和獨特的血管圖像。
圖7顯示血管造影圖像的比較，通過常規(guī)可用的游離熒光素血管造影術(shù)(圖 7A)或者本發(fā)明的組合物，其中熒光素被結(jié)合 粒上(圖7B)獲得。兩種熒 光素制劑被給藥至兔的耳靜脈，并觀察在兔視網(wǎng)膜內(nèi)的體內(nèi)行為。顆粒結(jié)合的 熒光素引起圖像沒有顯著的背景(圖7B)。因為游離熒光素結(jié)合組織，而顆粒 結(jié)合的熒光素不，顆粒結(jié)合熒光素的〗頓，提供了改進(jìn)的、清晰的、獨特的沒 有背景熒光的血管圖4象。圖8A-F說明組合物的混合物給藥至兔后，不同粒徑標(biāo)記組在視網(wǎng)膜內(nèi)的選 擇性泄漏。圖8A-C為在ICG結(jié)合顆粒和游離熒光素的混合物給藥之后，健康 的視網(wǎng)膜血管的血管造影圖像。在圖8B里，檢測ICG結(jié)合顆粒，而在圖8C里 檢測熒光素結(jié)合的顆粒。附圖8A顯示正常的兔視網(wǎng)膜里從ICG結(jié)合顆粒和游 離熒光素檢測熒光。圖8D-F為在對正常兔的ICG結(jié)合顆粒和游離熒光素的混 合物給藥之后，輕度機能障礙視網(wǎng)膜的血屏障的血管造影圖像。fflil玻璃體內(nèi) 注射LPS (脂多糖20納克)誘導(dǎo)Uvietis，在兔中弓胞輕微視網(wǎng)膜的血屏障機能 障礙。在圖8E里檢測游離熒光素，而在圖8E里檢測ICG結(jié)合顆粒。圖8D顯 示在這只輕度機能障礙的兔視網(wǎng)膜的血屏障里從ICG結(jié)合顆粒和游離熒光素檢 測熒光。注意，在正常兔視網(wǎng)膜內(nèi)(附圖8A-C)沒有染料泄漏，當(dāng)在輕度機能 障礙的血視網(wǎng)膜屏障模型里時，從視網(wǎng)膜血管中泄漏最小的未結(jié)合熒光素顆粒 (在圖8D和8F血管外的亮區(qū)(在原物里的綠色))，而顆粒結(jié)合的ICG (附8D & E中較亮的血管(在原物里的紅色))未泄漏。
用兔執(zhí)行下一步操作，其用于說明在血視網(wǎng)膜屏障里的第3等級的機能障 礙。用單獨的游離熒光素或者與B引哚菁綠PLGA顆粒和游離熒光素的組合物來 檢測這樣的機能障礙。通過玻璃體內(nèi)注射LPS (脂多糖20納克)誘導(dǎo)Uvietis， 在兔中弓胞視網(wǎng)膜的血屏P對幾能損壞。當(dāng)給藥游離熒光素和U引哚菁綠PLGA顆 粒時，僅有游離的未結(jié)合的熒光素滲透出血視網(wǎng)膜屏障，而吲哚菁綠顆粒沒有 泄漏。
此處引用或者提及的全部專利和出版物都預(yù)示著本發(fā)明所述技術(shù)領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員的技術(shù)水平，并且每一篇弓間的專利或出版物在此弓l入作為參考， 就像其已經(jīng)通過分別引用全部合為一體或全文陳列于此。申請人保留完全的向 本說明書并入來自任何上述引用的專禾蜮者出版物的任意和全部材料和信息的 權(quán)利。
在此描述的具體方法和成分是lt選實施例的代表，并且是可以效仿的并且 不會成為對本發(fā)明范圍柳艮制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過考慮本發(fā)明可以想到 其他物體，方面和實施方案，并且包含在如權(quán)利要求定義范圍的本發(fā)明的精神 之內(nèi)。此處公開的本發(fā)明的變化置換和改良對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見 的，其不會超出本發(fā)明的范圍和精神。本發(fā)明在此說明性質(zhì)描述可以在缺乏一 種或任意元素、限制條件的情況下適當(dāng)進(jìn)行，其作為基礎(chǔ)不在此處特定公開。在此說明性質(zhì)描述的方法和過程，可以按照不同的步驟順序執(zhí)行，并且沒有必 要限制到此處說明的步驟順序或者權(quán)利要求。如此處所用以及在所附權(quán)利要求 中，除非上下文中有明確的指示，否則"一"、"一種"和"一個"包括復(fù)數(shù)引用。因 此，例如，提到"寄主細(xì)服'包括復(fù)數(shù)的這種寄主細(xì)胞(例如，細(xì)胞培養(yǎng)或者種 群)，等等。本申請無論如何不可以被解釋為局限于在此明確公開的具體實施例 或者實施方案或者方法。本申請無論如何不愿被任何審查員或者專利和商標(biāo)局 的任何其他官員或者雇員解釋為被任何陳述限制，除非這些陳述是申請人在答 復(fù)中明確而且在限制之外或明確保留14^用。
已經(jīng)被使用的那些術(shù)語和表達(dá)方式被用作描述術(shù)語而不是限制，并且，在 使用這樣的術(shù)語和表達(dá)方式過程中沒有目的排除任何由此顯示和描述的特征或 者其中部分的等價物，但是公認(rèn)的是，如權(quán)利要求所述本發(fā)明范圍內(nèi)的各種各 樣的改良是可能的。因此，可以理解為雖然本發(fā)明已經(jīng)明確公開為優(yōu)選實施例 和可選擇的特征，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠勝任改進(jìn)和變化此處公開的概念，并且 這些改進(jìn)和變化認(rèn)為是在本發(fā)明范圍內(nèi)，正如附加權(quán)利要求所定義。
本發(fā)明已經(jīng)被廣泛而通f谷的在此描述。屬于普通的公開的每個更狹窄的種 類和亞屬的基團(tuán)也成為本發(fā)明的一部分。這包括申請的非專利性描述，包括在 此被明確列舉的從種類中斜?；蜇?fù)限制排除的主題，不管是否被刪除的材料。
另外，本發(fā)明的特征或者方面被依據(jù)馬庫什族描述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 將認(rèn)識到，本發(fā)明也因此描述為依據(jù)馬庫什族成員的任何個別的成分或者亞類 型。
其他實施方案在如下內(nèi)容禾又利要求內(nèi)。另外，本發(fā)明的特征或者方面被依 據(jù)馬庫什族描述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明也因此描述為依據(jù)馬
庫什族成員的任何個另啲成分或者亞M。
權(quán)利要求
1、一種組合物，其包括一系列顆粒組，每一顆粒組包含具有獨特標(biāo)記物的顆粒，與在組合物里的其他顆粒組相比，所述標(biāo)記物提供獨特的信號和不同的平均直徑。
2、 根據(jù)豐又利要求1的組合物，其中至少一個顆粒組包括生物可糊軍的顆粒。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中至少一個顆粒組包括非生物可糊軍的顆粒。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中至少一個顆粒組包括非生物可,狩口可 生物糊早材料的組合。
5、 權(quán)利要求1"4任意一項的組合物，其中每一顆粒組可溶于ZK環(huán)境。
6、 權(quán)利要求1-5任意一項的組合物，其中標(biāo)記物是共價結(jié)合在顆粒上、吸 附至噘粒上、包封娜粒內(nèi)或其組合。
7、 權(quán)利要求l-6任意一項的組合物，其中標(biāo)記物是熒光的、發(fā)光的、紅外 的、有磁性的、力婦寸性的或其組合。
8、 權(quán)利要求1-7任意一項的組合物，其中至少一個顆粒組含有聚(丙交酯)、 聚(乙交酯)、聚(丙交酯-^乙交酯)、聚亞烷基二醇、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯 烷酮、肽、蛋白質(zhì)、類蛋白微球體、月旨質(zhì)、月旨質(zhì)體、多糖或其組合。
9、 根據(jù)豐又利要求8的組合物，其中蛋白質(zhì)是白蛋白。
10、 權(quán)利要求1-9任意一項的組合物，其中組合物含有平均直徑為從1皮米 到3微米的顆粒組。
11、 權(quán)利要求l-9任意一項的組合物，其中組合物含有平均直徑為從10皮 米到900納米的顆粒組。
12、 權(quán)利要求1-9任意一項的組合物，其中組合物含有平均直徑為從1納米 到1檳 的顆粒組。
13、 權(quán)利要求1-12任意一項的組合物，其中至少一個顆粒組的標(biāo)記物包括 熒光素、異硫氰酸熒光素、吲哚菁綠、若丹明紅、太平洋藍(lán)、德克薩斯紅、 alexa-532、羥基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、氨基甲基香豆、級聯(lián)藍(lán)、 熒光黃、P-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、麗絲胺若丹明B、別藻藍(lán)蛋白、俄勒岡綠、 四甲基若丹明、丹磺酰、monochlorob皿ane、鈣黃綠素、熒光蛋白或其組合。
14、 權(quán)利要求1-13任意一項的組合物，其中至少一個顆粒組的標(biāo)記物是順 磁離子。
15、 根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中順磁離子是鉻(m)、錳(n)、鐵(m)、 鐵(n)、鈷(n)、鎳(n)、銅(n)、釹(m)、釤(m)、鐿(m)、軋(m)、 釩(n)、鋱(m)、鏑(m)、鈥(m)或者鉺(m)。
16、 權(quán)禾腰求1-14任意一項的組合物，其中至少一個顆粒組的標(biāo)記物是鑭(m)、金(m)、鉛(n)或者鉍(m)。
17、 權(quán)利要求1-14任意一項的組合物，其中至少一個顆粒組的標(biāo)記物是碘 131、碘123、碘125、锝"、銦111、磷32、錸188、錸186、鎵67、硫35、銅67、,乙90、 氖3或者砍211。
18、 一種試劑盒或者制造的物品，其包括權(quán)利要求1-17任意一項的組合物和有關(guān)在哺乳動物內(nèi)使用組合物以定量測定血管泄漏的說明書。
19、 一種試劑盒或者制造的物品，其包括權(quán)禾腰求1-17任意一項的組合物，以及有關(guān)在哺乳動物中1頓組合物以監(jiān)控血流量和/或血^I的說明書。
20、 根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的試劑盒，其還包括注射器、針頭、藥簽、 導(dǎo)管或者消毒液。
21、 一種在哺乳動物中用于定量觀啶血管泄漏的方法，所述方、 跑括(a) 把權(quán)禾腰求1-17任意一項的組合物給藥至哺乳動物；(b)觀察哺乳動物的血管 外部是否放出信號；以及(c)如果信號在哺乳動物的血管夕卜部發(fā)出，在哺乳動 物體內(nèi)確定哺乳動物血管外放出的信號的類型以定量測定血管泄漏。
22、 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中血管泄漏包括通過哺乳動物的血視網(wǎng)膜 屏障的泄漏。
23、 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中血管泄漏包括通過哺乳動物的脈絡(luò)膜、 視網(wǎng)膜色素上皮或者內(nèi)部血視網(wǎng)膜屏障的泄漏。
24、 權(quán)利要求21-23任意一項的方法，其中信號是熒光、發(fā)光、紅外、有磁 性、方婦射生或其組合。
25、 權(quán)利要求21-24任意一項的方法，其中至少一個顆粒組的標(biāo)記物包括熒 光素、異硫氰酸熒光素、吲哚菁綠、若丹明紅、太平洋藍(lán)、德克薩斯紅、alexa-532、 羥基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、氨基甲基香豆素、級聯(lián)藍(lán)、熒光黃、 P-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、麗絲胺若丹明B、別藻藍(lán)蛋白、俄勒岡綠、四甲基若丹明、丹磺酰、monochlorobimane或者鈣黃綠素。
26、 權(quán)利要求21-25任意一項的方法，其中測定發(fā)射的信號的，包括測定 信號的吸收或者，波長。
27、 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中血管泄漏包括通過哺乳動物血腦屏障的 泄漏。
28、 根據(jù)權(quán)利要求21或者27的方法，其中信號愚頓磁或者方i(l寸性的信號。
29、 根據(jù)權(quán)利要求21或者27的方法，其中至少一個顆粒組的標(biāo)記物是鉻(m)、錳(n)、鐵(m)、鐵(n)、鈷(n)、鎳(n)、銅(n)、釹(m)、釤(m)、 鐿(m)、軋(m)、釩(n)、鋱(m)、鏑(m)、鈥(m)、鉺on)、鑭(m)、 金(m)、鉛(n)、鉍(m)、碘131、碘123、碘125、锝"、銦111、磷32、錸188、 錸186、鎵67、硫35、銅67、釔90、氚3或者砹211。
30、 權(quán)利要求21-29中的任何一項的方法，其中方法還包括定量測定血管泄漏，im將發(fā)出該信號的顆粒組的粒徑范圍與信號關(guān)聯(lián)，以在引起泄漏的血管 里鑒定孔徑大小，并且給該孔徑大小賦予數(shù)值。
31、 一種在哺乳動物中用于定量測定血視網(wǎng)膜屏障損壞的方法，所述方法 包括(a)將多色熒光顆粒組合物靜脈內(nèi)給藥至哺乳動物；(b)觀察在哺乳動 物的視網(wǎng)膜里是否發(fā)射熒光；以及(c)如果^l寸熒光，測定熒光吸收或者發(fā)射 波長以便定量測定在哺乳動物內(nèi)的血-視網(wǎng)膜屏障損壞；其中多色顆粒組合物包 括-一系列顆粒組，每一顆粒組具有獨特的直徑粒徑范圍和在獨特的波長發(fā)射光 的獨特的熒光團(tuán)。
32、 一種在哺乳動物中用于觀察血管里血流量和/或血^3I的方法，所述方 法包括把權(quán)利要求1-17中的任何-一項的組合物給藥至哺乳動物的血管，并檢測 來自在血管里的組合物的至少一個顆粒組的至少一個信號。
33、 根據(jù)權(quán)利要求32的方法，還包括將信號與^M那個信號的顆粒組的粒 徑范圍相關(guān)聯(lián)以鑒定血管直徑。
34、 根據(jù)權(quán)利要求32或者33的方法，還包括鑒定是否血管的直徑沿著血 管的長度改變，或者在隨后的時間改變。
35、 權(quán)利要求32-34任意一項的方法，還包括鑒定血管是否部分阻塞。
36、 一系列顆粒組在制備用于在哺乳動物中檢測和/或定量測定血屏障損壞 的組合物中的用途，每一顆粒組包含具有不同平均直徑，并且?guī)в刑峁┆毺匦盘柕莫毺貥?biāo)記物的顆粒。
37、一系列顆粒組在制備用于在哺乳動物中檢測和/或定量測定血流量的組合物中的用途，每一顆粒組包含具有不同平均直徑，并且?guī)в刑峁?蟲特信號的 獨特標(biāo)記物的顆粒。
全文摘要
本發(fā)明包括用于評估血流量、血屏障泄露和血管泄漏的不同粒徑的多色顆粒。
文檔編號A61K49/00GK101616692SQ200780033040
公開日2009年12月30日 申請日期2007年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月6日
發(fā)明者G·R·巴里萊, S·R·塔里, U·B·科姆佩拉 申請人:紐約市哥倫比亞大學(xué)信托人;內(nèi)布拉斯加大學(xué)評議會