專利名稱：制備復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物的方法
專利說明制備復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物的方法 發(fā)明領(lǐng)域 本公開涉及制造多價(jià)免疫原性結(jié)合物的方法，以及按照這樣的方法制造的結(jié)合物。
優(yōu)先權(quán)聲明
本申請要求2006年3月17日提交的美國臨時(shí)申請No.60/783,490的權(quán)益，該臨時(shí)申請?jiān)诖艘云淙囊秊閰⒖肌?br> 與相關(guān)申請的交叉參考
本申請涉及2004年8月6日提交的WO 2005/014037和2004年8月6日提交的WO 2005/037320，這兩份專利在此以其全文引為參考。
背景技術(shù)：
細(xì)菌多糖(PS)是T細(xì)胞非依賴性抗原，在較大的兒童以及成年人中誘導(dǎo)短期的免疫，但在年齡小的嬰幼兒中通常沒有。PS不能與主要組織相容性復(fù)合物分子結(jié)合，而這是抗原呈遞到輔助性T淋巴細(xì)胞并刺激它所必需的。PS能夠在沒有輔助性T淋巴細(xì)胞的幫助下刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。B淋巴細(xì)胞的T細(xì)胞非依賴性刺激的結(jié)果是，在被這些抗原免疫后，沒有記憶性誘導(dǎo)。
T細(xì)胞非依賴性多糖抗原可以通過多糖與蛋白分子的共價(jià)結(jié)合而轉(zhuǎn)變成T細(xì)胞依賴性抗原。與結(jié)合物疫苗的多糖成分結(jié)合的B細(xì)胞，可以被特異性針對作為結(jié)合的載體蛋白的一部分的肽的輔助性T細(xì)胞所激活。輔助性T細(xì)胞對載體蛋白的反應(yīng)可以用于增加針對多糖的抗體的產(chǎn)生。PS-結(jié)合物疫苗是通過蛋白與PS共價(jià)結(jié)合而形成的多糖-蛋白雜合體。在結(jié)合前一般需要對PS進(jìn)行化學(xué)修飾，因?yàn)榇蠖鄶?shù)天然細(xì)菌PS不首先經(jīng)過一些化學(xué)修飾(“活化”)，就不能與蛋白化學(xué)連接。
與蛋白結(jié)合使得PS具有了蛋白的許多T細(xì)胞表位的免疫性質(zhì)。這些T細(xì)胞表位與CD4輔助性T細(xì)胞相互作用，極大地促進(jìn)了針對被結(jié)合的多糖的抗體反應(yīng)。針對結(jié)合物的輔助性T細(xì)胞依賴性反應(yīng)產(chǎn)生血清IgG抗體和免疫記憶，即使是在嬰兒、例如不到兩歲的嬰兒中。此外，PS-結(jié)合物的免疫原性，與天然PS相比，對于被結(jié)合的PS的大小的依賴性較小。因此，使用PS或寡糖制備的結(jié)合物可以具有相似的免疫原性。
已經(jīng)有許多結(jié)合反應(yīng)被用于共價(jià)連接多糖與蛋白。三種比較常用的方法包括1)還原胺化，其中在一種反應(yīng)成分上的醛基或酮基與另一種成分上的氨基或酰肼基進(jìn)行反應(yīng)，然后使用還原劑將形成的C＝N雙鍵還原成C-N單鍵；2)氰基化結(jié)合，其中用溴化氰(CNBr)或1-氰基-4-二甲基銨吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)活化多糖，以便向羥基基團(tuán)導(dǎo)入氰酸酯基團(tuán)，該基團(tuán)在加入蛋白成分后與氨基或酰肼基形成共價(jià)鍵；以及3)碳二亞胺反應(yīng)，其中碳二亞胺活化了結(jié)合反應(yīng)的一種成分上的羧基基團(tuán)，被活化的羰基基團(tuán)與另一種成分上的氨基或酰肼基反應(yīng)。這些反應(yīng)通常也被用于在結(jié)合反應(yīng)之前活化結(jié)合物的成分。
b型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)(Hib)結(jié)合物疫苗代表了第一種被生產(chǎn)用于臨床應(yīng)用的PS-蛋白結(jié)合物疫苗。Robbins及其同事在1980年利用生物技術(shù)工藝將Hib糖類化學(xué)結(jié)合到蛋白載體上，這種理念在50年前就已經(jīng)建立了。參見Avery等，J.Exp.Med.1929；50533-SSO；Schneerson等，J.Exp.Med 1980；152361-376。現(xiàn)在，在美國已經(jīng)注冊了四種不同的Hib結(jié)合物疫苗，每種都不相同，每種都具有它們自己的物理、化學(xué)和免疫學(xué)性質(zhì)，正如在表A中總結(jié)的那樣。在這些疫苗中使用的結(jié)合化學(xué)和質(zhì)量控制的詳細(xì)綜述已經(jīng)出版。參見Kniskern等的“結(jié)合設(shè)計(jì)、化學(xué)與分析”(“Conjugationdesign，chemistry，and analysis”)，在Ellis等的《b型嗜血桿菌結(jié)合物疫苗的開發(fā)與臨床應(yīng)用》一書中(Development and clinical uses of Haemophilusb conjugate vaccines.New YorkMarcel Dekker，199437-69)。
表A 第一個(gè)商業(yè)化的Hib結(jié)合物，多聚磷酸核糖基核糖醇白喉類毒素結(jié)合物(PRP-D)，由使用Schneerson等J.Exp.Med.1980；152361-376中的程序通過6碳分隔物己二酸二酰肼(ADH)與白喉類毒素連接的、大小被部分減小了的Hib PS組成。在該方法中白喉類毒素的ADH衍生物是通過在存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的情況下，與ADH反應(yīng)而獲得的。然后通過使用CNBr在羥基基團(tuán)上產(chǎn)生氰酸酯基團(tuán)來活化Hib PS?；罨腜S被結(jié)合到ADH-類毒素上(氰基化(cyanylation)結(jié)合)，但是該過程產(chǎn)生的鍵合不穩(wěn)定，結(jié)合物具有溶解度的問題。
后來對Robbins結(jié)合化學(xué)進(jìn)行了修改，使得ADH分隔物被首先加到多糖上，然后再在存在EDC的情況下結(jié)合到純化的蛋白上(碳二亞胺反應(yīng))。參見Chu等，Infect.Immun 1983；40245-256；Schneerson等，Infect.Immun.1986，52519-528。這種修改改善了結(jié)合效率和產(chǎn)物的溶解性。疫苗多聚磷酸核糖基核糖醇破傷風(fēng)蛋白結(jié)合物(PRP-T)利用了改進(jìn)的化學(xué)來將Hib多糖共價(jià)連接到破傷風(fēng)類毒素上(參見表1)。
多聚磷酸核糖基核糖醇交叉反應(yīng)突變型白喉類毒素結(jié)合物(PRP-CRM)疫苗，也被稱為嗜血桿菌b寡糖結(jié)合物(HbOC)，不含有Hib PS。它利用了大約20個(gè)重復(fù)單位的寡糖來代替，這些寡糖是通過核糖醇部分中二醇官能團(tuán)的高碘酸氧化得到的。然后將被氧化的寡糖在氰基硼氫化鈉存在下直接連接到白喉類毒素的無毒性突變體形式CRM197上(還原胺化)。參見Anderson等，J.Immunol.1989；1422464-8和Anderson，Infect.Immun.1983，39233-238。在這種結(jié)合方法中，發(fā)現(xiàn)寡糖與蛋白的比率對于最適的抗體反應(yīng)來說是關(guān)鍵的。參見Kniskern等的“結(jié)合設(shè)計(jì)、化學(xué)與分析”(“Conjugationdesign，chemistry，andanalysis”)，在Ellis等的《b型嗜血桿菌結(jié)合物疫苗的開發(fā)與臨床應(yīng)用》一書中(Development and clinical uses of Haemophilus b conjugatevaccines.New YorkMarcel Dekker，199437-69)；Anderson等，J.Immunol.1989；1422464-8。
與其它的Hib結(jié)合物疫苗相比，Hib多糖-腦膜炎奈瑟菌外膜蛋白復(fù)合物結(jié)合疫苗(PRP-OMPC)有許多獨(dú)特的性質(zhì)。蛋白載體不是白喉、破傷風(fēng)和百日咳(DTP)疫苗的成分，而是由除去了脂多糖的腦膜炎球菌外膜囊泡構(gòu)成，所述囊泡通過硫醚鍵與大小被減小了的Hib PS連接。參見Marburg等，J.Amer.Chem.Soc.1986；1085282-5287；Kniskern等的“結(jié)合設(shè)計(jì)、化學(xué)與分析”(“Conjugationdesign，chemistry，andanalysis”)，在Ellis等的《b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的開發(fā)與臨床應(yīng)用》一書中(Development and clinical uses of Haemophilus b conjugatevaccines.New YorkMarcel Dekker，199437-69)；Anderson等，J.Immunol.1989；1422464-8。在該方法中，各個(gè)接頭與蛋白和Hib多糖連接，然后將接頭融合以形成硫醚鍵。
腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)是世界上細(xì)菌性腦膜炎和敗血癥的主要病因。病原性腦膜炎球菌被連接到生物體的外膜表面上的多糖莢膜所包裹。在莢膜多糖的免疫特異性的基礎(chǔ)上已經(jīng)鑒定了13種不同血清型的腦膜炎球菌(Frasch，C.E.等，1985)。在這13種血清型中，5種引起了大多數(shù)腦膜炎球菌疾病它們包括血清型A、B、C、W135和Y。血清型A是造成大部分流行性疾病的原因。血清型B、C和Y引起大部分地方性疾病和局部爆發(fā)。宿主對侵染性腦膜炎球菌的防御依賴于補(bǔ)體介導(dǎo)的溶菌作用。負(fù)責(zé)補(bǔ)體介導(dǎo)的溶菌作用的血清抗體大部分針對外莢膜多糖。
基于腦膜炎球菌多糖的常規(guī)疫苗引發(fā)針對莢膜多糖的免疫應(yīng)答。這些抗體能夠?qū)ρ逍吞禺惖哪X膜炎球菌進(jìn)行補(bǔ)體介導(dǎo)的溶菌作用。腦膜炎球菌多糖疫苗在兒童和成年人中被顯示是有效的。但是，在嬰兒和幼兒中效果有限，在較年輕的人群中后續(xù)劑量的多糖引起弱的加強(qiáng)反應(yīng)或不能引起加強(qiáng)反應(yīng)。
已經(jīng)有許多方法被用于活化腦膜炎球菌PS和用于結(jié)合，正如在表B中所總結(jié)的那樣。每種活化模式都具有改變重要表位的潛力，即使是PS分子上只活化了相對少的位點(diǎn)的情況下。例如，C群腦膜炎球菌PS的高碘酸活化導(dǎo)致了鏈斷裂，產(chǎn)生了具有末端醛基基團(tuán)的較小糖類單元，所述醛基可以通過還原胺化與蛋白相連。Richmond等，J.Infect.Dis.1999；1791569-72。
表B a.己二酸的羥基琥珀酰亞胺二酯 b.脫乙?；腜S僅在C群腦膜炎球菌中有報(bào)道 關(guān)于C群腦膜炎球菌結(jié)合物的生產(chǎn)和優(yōu)化的最初研究在Hib結(jié)合物的商業(yè)化以前就有充分報(bào)道了。參見Beuvery等，infect.Immun.1982；3715-22；Beuvery等，Infect.Immun.1983；4039-45；Beuvery等，J.Infect.1983；6247-55；Jennings等，J.Immunol.1981；1271011-8。
已經(jīng)報(bào)道了兩種不同的將C群PS與蛋白載體進(jìn)行化學(xué)連接的結(jié)合方法。參見Jennings等，J.Immunol.1981；1271011-8；Beuvery等，Infect.Immun.1983；4039-45。第一種方法使用了部分解聚的PS，它通過高碘酸氧化產(chǎn)生末端醛基基團(tuán)而被活化(表2中的方法#1)。然后醛在氰基硼氫化鈉的存在下通過還原胺化與蛋白、主要是賴氨酸上的游離氨基基團(tuán)反應(yīng)。參見Jennings等，J Immunol 1981；127101 1-8。在該方法中，活化發(fā)生在C群PS的一個(gè)特定的脫氧乙酰化位點(diǎn)上。
第二種方法利用了碳二亞胺反應(yīng)(表2中的方法#2)，將高分子量PS中的羧基基團(tuán)與載體蛋白上的賴氨酸ε-氨基基團(tuán)共價(jià)連接。在該方法中活化位點(diǎn)與高碘酸活化相比更加隨機(jī)。
通過這兩種方法制備的C群腦膜炎球菌結(jié)合物已經(jīng)在動(dòng)物中進(jìn)行了評估。參見Beuvery等，Dev.Biol.Stand.1986；65197-204；和Beuvery等，J.Infect.1983；6247-55。結(jié)合物在最初的免疫后同時(shí)刺激T細(xì)胞不依賴性和T細(xì)胞依賴性反應(yīng)。參見Beuvery等，J.Infect.1983；6247-55。但是，研究顯示，PS必須與載體蛋白共價(jià)連接以誘導(dǎo)T細(xì)胞依賴性抗體反應(yīng)。
在臨床試驗(yàn)中使用的第一種A群和C群腦膜炎球菌結(jié)合物由Chiron Vaccines制備，報(bào)道于1992年(表2中的方法#3)。參見Costantino等，Vaccine 1992；10691-8。結(jié)合方法基于通過溫和的酸水解產(chǎn)生的小的寡糖的選擇性末端基團(tuán)活化，然后通過碳?xì)浞指粑锱c蛋白相連。白喉毒素的無毒性突變體CRM被用作蛋白載體。為了活化寡糖進(jìn)行結(jié)合，在寡糖的末端加上了氨基基團(tuán)，然后與己二酸的N-羥基琥珀酰亞胺二酯反應(yīng)產(chǎn)生活化的酯。然后將該活化的酯共價(jià)結(jié)合到CRM197蛋白中賴氨酸的ε-氨基基團(tuán)上，產(chǎn)生結(jié)合物。
用于制備PS-蛋白結(jié)合疫苗的常規(guī)方法在還原胺化結(jié)合反應(yīng)中不使用酰肼化學(xué)，盡管ADH形式的酰肼已經(jīng)被用于活化多糖。這些現(xiàn)有技術(shù)的方法利用蛋白上賴氨酸殘基的ε-氨基基團(tuán)與被活化的PS上的功能性基團(tuán)例如醛基基團(tuán)(還原胺化)和羧基基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)的效率低，一般僅僅為大約20％。為了完成結(jié)合，反應(yīng)還需要進(jìn)行2到3天，必需使用純化步驟將結(jié)合物從未反應(yīng)的PS中分離出來。參見Guo等的“蛋白-多糖結(jié)合”(″Protein-polysaccharide conjugation″)，在Pollard等的《分子醫(yī)學(xué)方法》第66卷的《腦膜炎球菌疫苗方法與規(guī)程》中(Methods in Molecular Medicine，Vol.66Meningococcal Vaccinesmethods and Protocols，Humana Press，Totowa，NJ，2001，pg 49-54)。對于觀察到的低產(chǎn)率已經(jīng)提出了許多解釋。首先，賴氨酸的ε-氨基基團(tuán)(pKa＝10.5)在結(jié)合條件下(pH 6.5-7.4)具有低反應(yīng)性。參見Inman等，Biochemistry 1969；84074-4082。第二，大多數(shù)結(jié)合方法使用類毒素作為載體蛋白。類毒素源自于用甲醛脫毒的毒素，甲醛與毒素的氨基基團(tuán)結(jié)合，只剩下有限數(shù)量的氨基基團(tuán)可用于結(jié)合。第三，得到的活化蛋白和蛋白-PS結(jié)合物的溶解性降低能夠?qū)е鲁恋怼?br> 因此，以高產(chǎn)率合成和生產(chǎn)多糖-蛋白結(jié)合疫苗的方法是符合需要的。此外，其中快速進(jìn)行反應(yīng)、減少不需要的副產(chǎn)物產(chǎn)生、和減少反應(yīng)結(jié)束時(shí)剩余的未反應(yīng)的蛋白和多糖的量的方法也是符合需要的。
現(xiàn)有的基于PS的疫苗在年齡小的兒童中的用途有限，并且在成年人中不能提供長期持續(xù)的保護(hù)。因此，對于能夠在處于例如細(xì)菌性腦膜炎、肺炎、破傷風(fēng)和其它細(xì)菌性感染的風(fēng)險(xiǎn)下的兒童和成年人中提供針對疾病的長期保護(hù)作用的蛋白-PS結(jié)合疫苗，存在著需求。優(yōu)選實(shí)施方案中的蛋白-PS結(jié)合物可以用于制備能夠?yàn)閶雰?、兒童和成年人提供長期保護(hù)作用的疫苗制劑。
最近，由于經(jīng)濟(jì)和物流的優(yōu)點(diǎn)以及在野外應(yīng)用中更好的患者順從性，施用含有多種疫苗的多價(jià)(或聯(lián)合)疫苗變得更加流行。對于結(jié)合疫苗來說也發(fā)生了同樣的趨勢。這樣的聯(lián)合的結(jié)合疫苗的典型例子是七價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗Prevnar(Wyeth Lederle)和四價(jià)的腦膜炎球菌結(jié)合疫苗Menactra(Aventis Pasteur)。
發(fā)明簡述 本文描述了用于制造復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物、包括結(jié)合疫苗的方法。
在一種實(shí)施方案中，描述了用于制造復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物的方法，包括 將多種免疫原性不同的多糖與氧化劑進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生了多種醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物； 將至少一種蛋白與肼、碳酰肼、鹽酸肼、二酰肼或其混合物在足以產(chǎn)生至少一種酰肼活化的蛋白的溶液的條件下進(jìn)行反應(yīng)； 將多種醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物與至少一種酰肼活化的蛋白在pH大約5到大約8下相接觸，以便多種醛活化的免疫原性不同的多糖同時(shí)與至少一種酰肼活化的蛋白發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生復(fù)合的多價(jià)結(jié)合物，該結(jié)合物包含在每個(gè)結(jié)合的免疫原性不同的多糖和蛋白之間形成的至少一個(gè)C＝N雙鍵；以及 將復(fù)合的多價(jià)結(jié)合物中基本上所有的C＝N雙鍵還原成C-N鍵，產(chǎn)生復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合產(chǎn)物。
在另一種實(shí)施方案中，描述了用于制造復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物的方法，包括 將多種免疫原性不同的多糖與氰基化劑進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生多種氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物； 將至少一種蛋白與肼、碳酰肼、鹽酸肼、二酰肼或其混合物在足以產(chǎn)生至少一種酰肼活化的蛋白的溶液的條件下進(jìn)行反應(yīng)；以及 將多種氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物與至少一種酰肼活化的蛋白在pH大約6到大約8下相接觸，以便多種氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖能夠同時(shí)與至少一種酰肼活化的蛋白發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生復(fù)合的多價(jià)結(jié)合物，該結(jié)合物包含在每個(gè)結(jié)合的免疫原性不同的多糖和蛋白之間形成的至少一個(gè)C-N鍵。
在另一種實(shí)施方案中，描述了用于制造復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物的方法，包括 將蛋白與1-氨基-2，3-丙二醇(ADPO)在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基鹽酸碳二亞胺存在下在pH大約6到大約7下進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生ADPO修飾的蛋白的溶液； 將ADPO修飾的蛋白與氧化劑進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生醛活化的蛋白的溶液； 將多種酰肼活化的免疫原性不同的多糖的混合物與醛活化的蛋白在pH大約5到大約8下相接觸，以便多種酰肼活化的免疫原性不同的多糖能夠同時(shí)與至少一種醛活化的蛋白發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生復(fù)合的多價(jià)結(jié)合物，該結(jié)合物包含在每個(gè)結(jié)合的免疫原性不同的多糖和蛋白之間形成的至少一個(gè)C＝N雙鍵；以及 將復(fù)合的多價(jià)結(jié)合物中基本上所有的C＝N雙鍵還原成C-N鍵，產(chǎn)生復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合產(chǎn)物。
本文還公開了用于制備酰肼活化的蛋白的方法，包括 將蛋白與肼、碳酰肼、鹽酸肼、二酰肼或其混合物在存在下述物質(zhì)的情況下進(jìn)行反應(yīng)(i)碳二亞胺以及(ii)至少一種氨基酸、至少一種肽、或至少一種氨基酸和至少一種肽的混合物。
本文公開的另一種用于制造復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物的實(shí)施方案包括 (a)將至少一種第一種醛活化的免疫原性不同的多糖與至少一種酰肼活化的蛋白在足以形成第一種結(jié)合物中間體的條件下相接觸，以便在第一種免疫原性不同的多糖與蛋白之間形成至少一個(gè)C＝N雙鍵； (b)將至少一種第二種醛活化的免疫原性不同的多糖與第一種結(jié)合物中間體相接觸，以便在第二種免疫原性不同的多糖與蛋白之間形成至少一個(gè)C＝N雙鍵；以及 (c)將基本上所有的C＝N雙鍵還原成C-N鍵，產(chǎn)生復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物產(chǎn)物(優(yōu)選還原是單一步驟，以便所有的C＝N雙鍵基本上同時(shí)被還原)； 其中第一種醛活化的免疫原性不同的多糖與酰肼活化的蛋白的反應(yīng)性比第二種醛活化的免疫原性不同的多糖與酰肼活化的蛋白的反應(yīng)性低。
根據(jù)參考隨附的圖進(jìn)行的下面的詳細(xì)描述，上述的以及其它的目的、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加明顯。
附圖簡述

圖1、不同的EDC濃度和反應(yīng)時(shí)間下催化的、破傷風(fēng)類毒素與肼或己二酸二酰肼(ADH)的活化產(chǎn)物(TTH)的HPLC圖譜(280nm，使用Superose 6柱)。反應(yīng)條件是(A)肼，24mM EDC反應(yīng)4小時(shí)；(B)肼，12mM EDC，反應(yīng)過夜；(C)ADH，36mM EDC反應(yīng)4小時(shí)；(D)ADH，48mM EDC反應(yīng)2小時(shí)。在圖譜(A)中產(chǎn)物的分子量太高而不能通過柱子，因此沒有顯示出TTH信號(hào)。在圖譜(B)中，只有少量的產(chǎn)物通過了柱子，在34分鐘處顯示出少許TTH峰。在圖譜(C)和(D)中，產(chǎn)物通過了柱子，在34分鐘處顯示出TTH峰。
圖2、在不同的賴氨酸濃度存在下的不同EDC濃度和反應(yīng)時(shí)間所催化的、破傷風(fēng)類毒素與肼或己二酸二酰肼(ADH)的活化產(chǎn)物(TTH)的HPLC圖譜(280nm，使用Superose 6柱)。反應(yīng)條件是(A)肼，24mM EDC，36mM賴氨酸，反應(yīng)2小時(shí)；(B)肼，12mM EDC，144mM賴氨酸，反應(yīng)2小時(shí)；(C)ADH，12mM EDC，36mM賴氨酸，反應(yīng)1小時(shí)；以及(D)ADH，12mM EDC，72mM賴氨酸，反應(yīng)4小時(shí)。在圖譜(A)中，只有少量的產(chǎn)物通過柱子，并在34分鐘處顯示出少許峰。在圖譜(B)、(C)和(D)中，產(chǎn)物通過了柱子，在34分鐘處顯示出單體的主峰，在31分鐘處顯示出二體的次峰。
圖3、在72mM谷氨酸存在下的不同EDC濃度催化不同的反應(yīng)時(shí)間下，破傷風(fēng)類毒素與肼或己二酸二酰肼(ADH)的活化產(chǎn)物(TTH)的HPLC圖譜(280nm，使用Superose 6柱)。其它的反應(yīng)條件是(A)肼，24mM EDC，反應(yīng)1小時(shí)；(B)肼，48mM EDC，反應(yīng)1小時(shí)；(C)ADH，24mM EDC，反應(yīng)1小時(shí)；以及(D)ADH，48mM EDC，反應(yīng)2小時(shí)。產(chǎn)物通過了柱子，在34分鐘處顯示出單體的主峰，在31分鐘處顯示出二體的次峰。
圖4、(A)活化的破傷風(fēng)類毒素(TTH)、以及(B)通過結(jié)合方法A制備的聯(lián)合的合成多價(jià)多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物(Conj.)的HPLC圖譜(280nm，使用Waters Ultrahydrogel線性柱)。一旦與活化的多糖混合物結(jié)合，蛋白的信號(hào)從低分子量(17.5分鐘)遷移到了高分子量(13.5分鐘)。
圖5、圖4中聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合疫苗(B)中包含的結(jié)合成分多糖的ELISA檢測。在HPLC級份中只有含有蛋白的物質(zhì)(即結(jié)合物和游離TTH)在包被過程中附著到ELISA板上。然后用特異性針對每種相應(yīng)的PS但是不與破傷風(fēng)類毒素發(fā)生交叉反應(yīng)的抗血清來檢測結(jié)合的多糖。對于所有4種多糖來說，主峰在12-15分鐘處被檢測到，與圖4中(B)的蛋白信號(hào)重疊。
圖6、(A)活化的破傷風(fēng)類毒素(TTH)、以及(B)通過結(jié)合方法B制備的聯(lián)合的合成多價(jià)多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物(Conj.)的HPLC圖譜(280nm，使用Waters Ultrahydrogel線性柱)。一旦與活化的多糖混合物結(jié)合，蛋白的信號(hào)從低分子量(17.5分鐘)遷移到了高分子量(13.5分鐘)。在產(chǎn)物混合物中還剩余一些游離的未結(jié)合的TTH。
圖7、圖6中聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合疫苗(B)中結(jié)合成分多糖的ELISA檢測。在HPLC級份中只有含有蛋白的物質(zhì)(即結(jié)合物和游離TTH)在包被過程中附著到ELISA板上，然后用特異性針對每種相應(yīng)的PS但是不與破傷風(fēng)類毒素發(fā)生交叉反應(yīng)的抗血清來檢測結(jié)合的多糖。對于所有4種多糖來說，主峰在12-15分鐘處被檢測到，與圖6中(B)的蛋白信號(hào)重疊。
圖8、(A)活化的破傷風(fēng)類毒素(TTH)、以及(B)通過結(jié)合方法C制備的聯(lián)合的合成多價(jià)多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物(Conj.)的HPLC圖譜(280nm，使用Waters Ultrahydrogel線性柱)。一旦與活化的多糖混合物結(jié)合，蛋白的信號(hào)從低分子量(17.5分鐘)遷移到了高分子量(13.5分鐘)。在產(chǎn)物混合物中還剩余一些游離的未結(jié)合的TTH。
圖9、圖8中聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合疫苗(B)中結(jié)合成分多糖的ELISA檢測。HPLC級份中只有含有蛋白的物質(zhì)(即結(jié)合物和游離的TTH)在包被過程中附著到ELISA板上，然后用特異性針對每種相應(yīng)的PS但是不與破傷風(fēng)類毒素發(fā)生交叉反應(yīng)的抗血清來檢測結(jié)合多糖。對于所有4種多糖來說，主峰在12-15分鐘處被檢測到，與圖8中(B)的蛋白信號(hào)重疊。
圖10、(A)活化的破傷風(fēng)類毒素(TTH)、以及(B)通過結(jié)合方法A制備的聯(lián)合的合成多價(jià)多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物(Conj.)的HPLC圖譜(280nm，使用Waters Ultrahydrogel線性柱)。一旦與活化的多糖混合物結(jié)合，蛋白信號(hào)從低分子量(17.5分鐘)遷移到了高分子量(13.5分鐘)。
圖11、圖10中聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合疫苗(B)中結(jié)合成分多糖的ELISA檢測。HPLC級份中只有含有蛋白的物質(zhì)(即結(jié)合物和游離TTH)在包被過程中附著到ELISA板上，然后用特異性針對每種相應(yīng)的PS但是不與破傷風(fēng)類毒素發(fā)生交叉反應(yīng)的抗血清來檢測結(jié)合多糖。對于所有4種多糖來說，高的ELISA信號(hào)在12-19分鐘處被檢測到。在12-15分鐘處的高ELISA信號(hào)與圖10中(B)的蛋白信號(hào)重疊，而15-19分鐘處的高ELISA信號(hào)是由殘留的小分子量結(jié)合物所引起。
圖12、(A)活化的破傷風(fēng)類毒素(TTH)、以及(B)通過結(jié)合方法B制備的聯(lián)合的合成多價(jià)多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物(Conj.)的HPLC圖譜(280nm，使用Waters Ultrahydrogel線性柱)。一旦與活化的多糖混合物結(jié)合，蛋白的信號(hào)從低分子量(17.5分鐘)遷移到了高分子量(13.5分鐘)。在產(chǎn)物混合物中剩有大量游離的未結(jié)合的TTH。
圖13、圖12中聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合疫苗(B)中結(jié)合成分多糖的ELISA檢測。HPLC級份中只有含有蛋白的物質(zhì)(即結(jié)合物和游離TTH)在包被過程中附著到ELISA板上，然后用特異性針對每種相應(yīng)的PS但是不與破傷風(fēng)類毒素發(fā)生交叉反應(yīng)的抗血清來檢測結(jié)合的多糖。對于所有4種多糖來說，高的ELISA信號(hào)在12-18分鐘處被檢測到。在12-15分鐘處的高的ELISA信號(hào)與圖12中(B)的蛋白信號(hào)重疊，而15-18分鐘處的高ELISA信號(hào)是由殘留的小分子量結(jié)合物所引起。
圖14、在批次TTHACWY061126的聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合疫苗中結(jié)合成分多糖的ELISA檢測。通過HPLC分析了含有0.05mg/mL蛋白(破傷風(fēng)類毒素)和Mn A、C、W135和Y PS各0.0125mg/mL的25μL結(jié)合物樣品。HPLC級份中只有含有蛋白的物質(zhì)(即結(jié)合物和游離TTH)在包被過程中附著到ELISA板上，然后用特異性針對每種相應(yīng)的PS但是不與破傷風(fēng)類毒素發(fā)生交叉反應(yīng)的抗血清來檢測結(jié)合的多糖(實(shí)心符號(hào))。Mn A、W135和Y PS顯著摻入到結(jié)合物中則由它們對應(yīng)的ELISA信號(hào)與Mn C PS的弱ELISA信號(hào)相比較來說明。這是由于與活化的Mn A、W135和Y PS相比，與TTH結(jié)合的活化Mn C PS的反應(yīng)性較弱。該觀察與顯示了Mn C的效率較低的結(jié)合物的免疫原性數(shù)據(jù)相符合。天然的多糖混合物樣品也平行地進(jìn)行了分析(空心符號(hào))。與該ELISA檢測中的結(jié)合物相比，只有天然的Mn A PS顯示出弱信號(hào)。
圖15、在批次TTH2C/A/WY070209的聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合疫苗中結(jié)合成分多糖的ELISA檢測。通過HPLC分析了含有0.05mg/mL蛋白(破傷風(fēng)類毒素)和Mn A、C、W135和Y PS各0.0125mg/mL的25μL結(jié)合物樣品。HPLC級份中只有含有蛋白的物質(zhì)(即結(jié)合物和游離TTH)在包被過程中附著到ELISA板上，然后用特異性針對每個(gè)相應(yīng)的PS但是不與破傷風(fēng)類毒素發(fā)生交叉反應(yīng)的抗血清來檢測結(jié)合的多糖(實(shí)心符號(hào))。天然的多糖混合物樣品也平行地進(jìn)行了分析(空心符號(hào))。所有4種PS顯著摻入到結(jié)合物中則由它們對應(yīng)的ELISA信號(hào)與它們的天然PS的ELISA信號(hào)相比來說明。在圖14中顯示出的與TTH結(jié)合的活化Mn C PS的反應(yīng)性較弱則用較高的劑量(在該情況下是加倍)和與活化的Mn A、W135和Y PS反應(yīng)之前較早暴露于TTH來進(jìn)行補(bǔ)償。
發(fā)明詳述 本文中使用的單數(shù)形式術(shù)語″a″、″an″和″the″包括了復(fù)數(shù)形式的所指物，除非在上下文中明確表示不是這樣。同樣，單詞“或”旨在包括“和”，除非在上下文中明確表示不是這樣。此外，本文使用的術(shù)語“包含”意味著“包括”。因此，“包含A或B”意味著包括A、B或A和B。此外，還應(yīng)該理解，對于核酸或多肽或其它化合物給出的所有的核苷酸大小或氨基酸大小、以及所有的分子量或分子質(zhì)量數(shù)值都是大約的，僅供說明。盡管與本文中描述的相似或等價(jià)的方法和材料也可用于本公開的實(shí)踐或試驗(yàn)中，但合適的方法和材料將在下面描述。此外，材料、方法和例子僅僅是說明性的，并非意在限制。除非特別指明，本文所述的方法和過程不限于任何具體的序列或步驟中的實(shí)施。例如，多糖的活化可以在蛋白的活化之前、之后或平行地進(jìn)行。
為了便于對本公開中的各種不同的實(shí)施例進(jìn)行綜述，提供了下列對特定的術(shù)語的解釋 “動(dòng)物”包括活的多細(xì)胞脊椎動(dòng)物生物體，該門類包括例如哺乳動(dòng)物和鳥類。術(shù)語哺乳動(dòng)物包括人類和非人類哺乳動(dòng)物。同樣地，術(shù)語“對象”包括人類和獸醫(yī)對象，例如人類、非人類靈長動(dòng)物、狗、貓、嚙齒動(dòng)物、馬和牛。
“抗原”是可以被特定的體液或細(xì)胞免疫的產(chǎn)物、例如抗體分子或T細(xì)胞受體特異性結(jié)合的化合物、組合物或物質(zhì)?？乖梢允侨魏晤愋偷纳锓肿?，包括，例如，簡單的中間代謝物、糖類(例如寡糖)、脂類和激素以及大分子例如復(fù)合糖(例如多糖)、磷脂、核酸和蛋白。抗原的常見類別包括但不限于病毒抗原，細(xì)菌抗原，真菌抗原，原生動(dòng)物和其它寄生蟲抗原，腫瘤抗原，參與自身免疫性疾病、過敏和移植排斥的抗原，毒素以及其它的各種抗原。
“載體”是免疫原性分子，其可以結(jié)合半抗原或抗原例如多糖。當(dāng)與載體結(jié)合時(shí)，結(jié)合的分子可變得更具有免疫原性。載體可以被選擇，以增加結(jié)合的分子的免疫原性，和/或引發(fā)在診斷、分析和/或治療上有益的針對載體的抗體。將分子共價(jià)連接到載體上提供了增強(qiáng)的免疫原性和T細(xì)胞依賴性(Pozsgay等，PNAS 965194-97，1999；Lee等，J.Immunol 116171 1-18，1976；Dintzis等，PNAS 733671-75，1976)。有用的載體包括聚合物載體，它們可以是天然的(例如來自細(xì)菌或病毒的蛋白)、半合成的或合成的物質(zhì)，含有一個(gè)或多個(gè)可以結(jié)合反應(yīng)劑部分的功能性基團(tuán)。
用作載體的細(xì)菌產(chǎn)物的例子包括細(xì)菌毒素，例如炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)PA(包括能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的含有至少一個(gè)抗原性表位的片段和類似物或衍生物)、LF和LeTx，以及其它的細(xì)菌毒素和類毒素，例如破傷風(fēng)毒素/類毒素、白喉毒素/類毒素、綠膿桿菌(P.aeruginosa)外毒素/類毒素、百日咳毒素/類毒素以及產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)外毒素/類毒素。病毒蛋白例如乙肝表面抗原和核心抗原也可以用作載體。
“共價(jià)鍵”是兩個(gè)原子之間的原子間鍵，其特征為原子共享一對或多對電子。術(shù)語“共價(jià)結(jié)合的”或“共價(jià)連接的”是指使兩個(gè)分離的分子成為一個(gè)相接的分子。
“表位”是抗原性決定簇。它們是分子上的特定化學(xué)基團(tuán)或毗連的或非毗連的肽序列，具有抗原性，即引發(fā)特定免疫應(yīng)答?？贵w在抗體和匹配(或識(shí)別)表位的三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上結(jié)合特定的抗原性表位。
“連接”、“接合”、“結(jié)合”或“聯(lián)結(jié)”是指多糖與載體蛋白的共價(jià)鍵連接。共價(jià)鍵連接可以是直接的或間接的，例如通過分隔物分子連接。
“復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物”或“復(fù)合的多價(jià)結(jié)合疫苗”包含一個(gè)以上的抗原性表位。在第一種實(shí)施方案中，本文公開的復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物包括不同分子的混合物，每個(gè)分子含有不同的免疫原性不同的多糖，其中每個(gè)不同的免疫原性不同的多糖被結(jié)合到分離的蛋白載體上。在第二個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物包括的分子中多種免疫原性不同的多糖被結(jié)合到單個(gè)蛋白分子或單個(gè)蛋白構(gòu)建物(該蛋白構(gòu)建物本身包含一種以上的不同蛋白)上。第三個(gè)實(shí)施方案包括第一種實(shí)施方案的結(jié)合物和第二個(gè)實(shí)施方案的結(jié)合物的混合物。第一種實(shí)施方案的例子可以描述為下式表示的不同結(jié)構(gòu)的混合物 P1-PS1；P1-PS2；以及P1-PS3 其中P1是載體蛋白；PS1、PS2和PS3各是免疫原性不同的多糖。
第二個(gè)實(shí)施方案的例子可以被描述為下式表示的結(jié)構(gòu)
其中P1是載體蛋白；PS1、PS2和PS3各是共價(jià)連接到P1上的免疫原性不同的多糖。
上式中的蛋白和多糖可以是單個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元，在蛋白和多糖之間形成至少一個(gè)鍵。
“免疫應(yīng)答”是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞例如B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞對刺激的反應(yīng)。免疫應(yīng)答可以包括身體中參與宿主防御反應(yīng)的任何細(xì)胞，例如分泌干擾素或細(xì)胞因子的上皮細(xì)胞。免疫應(yīng)答包括但不限于先天性免疫應(yīng)答或炎癥。
本文中使用的術(shù)語“免疫原性結(jié)合物或組合物”是指用于在脊椎動(dòng)物中刺激或引發(fā)特定的免疫應(yīng)答(或免疫原性反應(yīng))的組合物。在某些實(shí)施方案中，免疫原性反應(yīng)是保護(hù)性的或提供了保護(hù)性免疫，因?yàn)樗辜棺祫?dòng)物能夠更好地抵抗由免疫原性組合物所對抗的生物體造成的感染或疾病進(jìn)程。一類免疫原性組合物的一個(gè)具體例子是疫苗。
“免疫原”是指在適當(dāng)條件下能夠在動(dòng)物中刺激抗體的產(chǎn)生或T細(xì)胞反應(yīng)的化合物、組合物或物質(zhì)，包括被注射或吸收到動(dòng)物中的組合物。
“免疫原性不同的多糖”包括了引發(fā)的免疫應(yīng)答與另一種類型的多糖引發(fā)的免疫應(yīng)答不同的多糖。免疫原性不同的多糖可以是來自不同的有莢膜的細(xì)菌的兩種或多種多糖。例如，與腦膜炎球菌多糖相比，肺炎球菌多糖是免疫原性不同的多糖。免疫原性不同的多糖也包括來自不同的血清組或血清型的兩種或多種多糖。例如，與血清組B的腦膜炎球菌多糖相比，血清組A的腦膜炎球菌多糖是免疫原性不同的多糖。
“抑制或治療疾病”包括在處于疾病例如炭疽病風(fēng)險(xiǎn)的對象中，抑制疾病或病狀的全面發(fā)展。“治療”是指在疾病或病理性狀況開始發(fā)展之后緩解疾病或病狀的征象或癥狀的治療性干預(yù)。本文中使用的術(shù)語“緩解”對于疾病、病理性狀況或癥狀來說，是指治療的任何可以觀察到的有益效果。有益的效果可以被例如在易感對象中疾病臨床癥狀的延遲發(fā)作、疾病的某些或所有臨床癥狀的嚴(yán)重性降低、疾病的進(jìn)程減慢、疾病的復(fù)發(fā)次數(shù)減少、對象的整體健康或舒適改善、以及本技術(shù)領(lǐng)域中熟知的對于具體疾病來說是特異性的其它參數(shù)所證明。
“肽”包括其中結(jié)構(gòu)單元是至少兩個(gè)通過酰胺鍵連接到一起的氨基酸殘基的分子。肽包括二肽、三肽或寡肽。術(shù)語“殘基”或“氨基酸殘基”包括對摻入到肽中的氨基酸的指代。
“治療有效量”是指特定藥劑在用該藥劑治療的對象中足以產(chǎn)生所需效果的量。例如，它可以是在對象中用于對感染和細(xì)菌感染引起的疾病增加抵抗、預(yù)防、緩解和/或治療的多價(jià)多糖結(jié)合物的量。理想情況下，藥劑的治療有效量是足以在對象中對感染和感染引起的疾病增加抵抗、預(yù)防、緩解和/或治療而在對象中不引起顯著的細(xì)胞毒性效果的量。用于在對象中對感染和感染引起的疾病增加抵抗力、預(yù)防、緩解和/或治療的有效藥劑量將依賴于被治療的對象、疾病的嚴(yán)重性、以及治療性組合物的給藥方式。
疫苗是在對象中引發(fā)預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答的藥物組合物。在某些情況下，免疫應(yīng)答是保護(hù)性反應(yīng)。典型情況下，疫苗引發(fā)針對病原體例如細(xì)菌或病毒病原體的抗原、或針對與病理狀況相關(guān)的細(xì)胞組分的抗原特異性免疫應(yīng)答。疫苗可以包括多核苷酸、肽或多肽、多糖、病毒、細(xì)菌、細(xì)胞或一種或多種細(xì)胞組分。在某些情況下，病毒、細(xì)菌或細(xì)胞可以被失活或減毒，以防止或降低感染的可能性，同時(shí)維持疫苗組分的免疫原性。
本發(fā)明公開了制備復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物和結(jié)合疫苗的新方法。在一種實(shí)施方案中，多價(jià)結(jié)合物和結(jié)合疫苗是通過使用酰肼化學(xué)方法，將一種以上的多糖的混合物以所需的多糖成分比率與至少一種載體蛋白相結(jié)合來合成的。由于酰肼化學(xué)在結(jié)合中的高效率，多糖被有效結(jié)合到載體蛋白上，使得獲得的復(fù)合的合成疫苗結(jié)合產(chǎn)物不需要繁瑣和復(fù)雜的純化步驟例如色譜和/或硫酸銨沉淀，就能夠在小鼠中有效誘導(dǎo)針對每種多糖成分的抗體。本文公開的某些實(shí)施方案中的方法，通過在包含至少兩種免疫原性不同的多糖的單個(gè)反應(yīng)混合物或批次中使用同時(shí)的結(jié)合反應(yīng)，簡化了多價(jià)結(jié)合疫苗的制備。這種單批同時(shí)反應(yīng)消除了制造多價(jià)結(jié)合疫苗的常規(guī)方法中使用的對每種多肽疫苗結(jié)合物組分的多種平行合成工藝的需要。換句話說，按照常規(guī)的方法，每個(gè)單獨(dú)的多糖結(jié)合物組分通過單獨(dú)的過程來制備，然后將獲得的單個(gè)多糖結(jié)合物組分混合在一起成為單劑制劑(參見例如US 2005/0002948A1的段落
)。按照這里公開的本發(fā)明方法合成多價(jià)結(jié)合物和疫苗將顯著降低生產(chǎn)成本并便于接種免疫的野外應(yīng)用，因此極大地促進(jìn)了公眾健康。
在本公開的方法中，高效率的化學(xué)被用于多價(jià)結(jié)合疫苗的組合合成，這樣的話，所有活化的多糖成分都能夠與活化的蛋白形成結(jié)合物，這通過HPLC結(jié)合ELISA檢測，使用相應(yīng)的PS特異性的抗體進(jìn)行檢測。
在某些實(shí)施方案中，首先將反應(yīng)性較低的多糖與活化的蛋白進(jìn)行反應(yīng)。然后將反應(yīng)性較高的多糖與反應(yīng)性較低的PS/蛋白中間體結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng)。首先用反應(yīng)性較低的多糖進(jìn)行反應(yīng)以提供較長的沒有反應(yīng)性較高的多糖進(jìn)行競爭的反應(yīng)時(shí)間，以便有較大量的反應(yīng)性較低的多糖被結(jié)合。
活化的多糖與活化的蛋白的相對反應(yīng)性是指結(jié)合的多糖的反應(yīng)速度和/或量。達(dá)到較高反應(yīng)速度和/或較大量的結(jié)合表明多糖反應(yīng)性較高。活化的多糖的反應(yīng)性依賴于至少幾個(gè)因素活化的程度(結(jié)合的功能性基團(tuán)越多，反應(yīng)性越高)；鏈的長度(在同樣的活化程度下，含有較多功能性基團(tuán)的較長鏈具有較高的反應(yīng)性)；以及多糖的結(jié)構(gòu)(空間位阻、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等)。
在還原胺化結(jié)合的具體情況下，多糖的活化程度由活化劑(例如NaIO4)、溫度、反應(yīng)時(shí)間和多糖的結(jié)構(gòu)來控制?；罨瘎嗔袽n C多糖鏈，但是不斷裂Mn A、Mn W 135和Mn Y多糖的鏈。在氰基化結(jié)合的具體情況下，多糖的活化程度由活化劑、pH、反應(yīng)時(shí)間和多糖的羥基基團(tuán)密度來控制。相對于Mn W135和Mn Y多糖來說，Mn A和Mn C多糖具有較低的羥基密度。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一般來說，相對于Mn W135和Mn Y多糖的反應(yīng)性來說，活化的Mn C和Mn A多糖的反應(yīng)性較低。
如上所述，本文中還公開了活化載體蛋白的新方法，包括將蛋白與肼、碳酰肼、二鹽酸肼、二酰肼(例如琥珀酰二酰肼或己二酸二酰肼)或其混合物在(i)1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和(ii)至少一種氨基酸、至少一種肽、或至少一種氨基酸和至少一種肽的混合物存在下進(jìn)行反應(yīng)。正如下面描述的那樣，新的蛋白活化方法對于可用于結(jié)合單價(jià)結(jié)合疫苗的多糖或多價(jià)(或復(fù)合的多價(jià))結(jié)合疫苗的多糖混合物。有用的氨基酸包括α-L形式(或異構(gòu)體，通常稱為L-氨基酸)的蛋白氨基酸。其它氨基酸包括α-D形式(D-氨基酸)、β-形式(β-氨基酸)、γ-形式、δ-形式和ε-形式等。示例性的氨基酸包括賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、半胱氨酸及其混合物。在活性組合物中存在的氨基酸的寬的、優(yōu)選的和更優(yōu)選的濃度范圍分別為1-500mM、20-300mM和36-144mM。
盡管不受任何理論的束縛，但相信在活化反應(yīng)過程中氨基酸也可以象肼一樣摻入到蛋白分子中。被摻入的氨基酸殘基可能擾亂蛋白的水合環(huán)境并提供空間位阻，導(dǎo)致阻止了蛋白的聚集和沉淀。
在一個(gè)例子中，該方法包括在受控條件下，通過用碳二亞胺催化將蛋白與過量的肼、碳酰肼、琥珀酰二酰肼或ADH進(jìn)行反應(yīng)，在載體蛋白上引入至少一個(gè)酰肼基團(tuán)，受控條件包括1)反應(yīng)時(shí)間、2)EDC的濃度和3)反應(yīng)中的氨基酸或氨基酸混合物的濃度。獲得的酰肼活化的載體蛋白可以在延長的時(shí)期中(例如至少大約1年)在中性pH下保持可溶。
合成和生產(chǎn)多糖-蛋白結(jié)合疫苗的常規(guī)方法一般使用的結(jié)合反應(yīng)效率較低(典型為大約20％)。這意味著多達(dá)80％的添加的活化多糖損失了。此外，通常需要從未結(jié)合的PS中純化結(jié)合物的色譜過程。優(yōu)選實(shí)施方案的合成方法利用了一種反應(yīng)劑上的酰肼基團(tuán)的特征性的化學(xué)性質(zhì)與另一種反應(yīng)劑上的醛基或氰酸酯進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)合物產(chǎn)率提高(通常高達(dá)大約60％)。
當(dāng)結(jié)合反應(yīng)以較高的結(jié)合效率進(jìn)行時(shí)，反應(yīng)后殘留的未結(jié)合的蛋白和多糖的量可能會(huì)足夠低，使得不需要移除它們。因此，純化結(jié)合產(chǎn)物的過程可以被簡化成例如除去小分子副產(chǎn)物的透濾步驟?；邗ｋ碌慕Y(jié)合反應(yīng)可以在1到3天內(nèi)進(jìn)行到完成，反應(yīng)劑的濃度為從大約1到大約50、特別是大約1到大約40mg/mL，或大約1到大約50mg/mL，PS/蛋白的重量比從大約1∶5到大約5∶1，優(yōu)選從大約1∶2到大約2∶1，最優(yōu)選大約1∶1，盡管在某些實(shí)施方案中更高或更低的比率可能是優(yōu)選的。結(jié)合反應(yīng)優(yōu)選在從大約4℃到大約40℃的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選從大約4、10、15或20℃到大約25、30或35℃，pH為大約6到大約8.5，優(yōu)選從大約6.1、6.2、6.3、6.4或6.5到大約6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3或8.4，最適的條件根據(jù)多糖而變化。因此，當(dāng)使用基于酰肼的結(jié)合反應(yīng)時(shí)，可以以較低的成本生產(chǎn)結(jié)合疫苗。
為了克服合成結(jié)合疫苗的常規(guī)方法的某些缺點(diǎn)，提供了在還原胺化和氰基化結(jié)合反應(yīng)中使用酰肼化學(xué)將PS與載體蛋白結(jié)合的方法。具有-NH-NH2結(jié)構(gòu)的酰肼基團(tuán)通過與肼、ADH、碳酰肼或琥珀酰二酰肼的碳二亞胺反應(yīng)被引入到蛋白分子的天冬氨酸和/或谷氨酸殘基的羧基基團(tuán)上。在一種實(shí)施方案中，活化的蛋白在結(jié)合前，與濃度為大約3以下到大約10mM以上、優(yōu)選從大約4或5mM到大約6、7、8或9mM的緩沖液在pH從大約10到大約11.5下維持可溶，優(yōu)選pH從大約10.1、10.2、10.3、或10.4到大約10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3或11.4，最優(yōu)選為大約10.5。適合的緩沖液包括但不限于Na2CO3、3-(環(huán)己胺)-1-丙磺酸(CAPS)和2-(N-環(huán)己胺)乙磺酸(CHES)。在另一種實(shí)施方案中，通過在至少一種上述的氨基酸存在下活化蛋白，活化的蛋白在中性或近似中性的pH(例如pH大約7到大約7.5)下維持可溶，下文將更詳細(xì)地舉例。
然后將活化的蛋白與含有醛(還原胺化)或氰酸酯(氰基化結(jié)合)基團(tuán)的活化多糖在緩沖液存在下進(jìn)行反應(yīng)，pH為大約6到大約8.5，優(yōu)選從大約6.1、6.2、6.3、6.4或6.5到大約6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0，緩沖液的濃度為大約100mM以下到大約200mM，優(yōu)選從大約110、120、130、140或150mM到大約160、170、180或190mM。適合的緩沖液包括但不限于N-(2-羥基乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、2-嗎啉基丙磺酸(MOPS)和N，N-雙(2-羥基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)。
或者，PS可以用酰肼基團(tuán)功能化?；罨腜S可以在使用強(qiáng)緩沖液獲得的pH6.5-7.5下與含有醛基(還原胺化)的活化蛋白結(jié)合。蛋白在用弱緩沖液的pH大約10.5下維持可溶直到結(jié)合點(diǎn)。由于在中性/弱酸性條件下與賴氨酸的ε-氨基基團(tuán)(pKa＝10.5)相比，酰肼基團(tuán)(pKa-2.6)具有較高的反應(yīng)性，并且使用結(jié)合之前在大約pH10.5下維持可溶的活化蛋白增加結(jié)合物的溶解性，極大地提高了結(jié)合反應(yīng)的產(chǎn)率。
通過這些方法制備的結(jié)合物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中具有免疫原性，這被對小鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。此外，結(jié)合反應(yīng)可以無需氰基硼氫化鈉而有效地進(jìn)行，因此避免了在結(jié)合物產(chǎn)物中引入氰化物離子。反應(yīng)可以在弱酸性或中性pH條件下在4℃進(jìn)行1-3天或在室溫進(jìn)行過夜，與此相比常規(guī)的還原胺化結(jié)合方法要進(jìn)行幾天。這再次確保了對于不穩(wěn)定的多糖、例如來自b型流感嗜血桿菌、19F型肺炎鏈球菌(Streptocuccuspneumonias)和A類腦膜炎奈瑟菌的多糖的高產(chǎn)率結(jié)合疫苗的生產(chǎn)。優(yōu)選的實(shí)施方案的方法可以用于生產(chǎn)較廉價(jià)的復(fù)合多價(jià)結(jié)合疫苗，因此極大地促進(jìn)了公眾健康。
多糖 術(shù)語“多糖”用于本文中時(shí)是一個(gè)廣義的術(shù)語并以其通常的意義使用，包括但不限于含有多個(gè)重復(fù)單元的糖類，包括但不限于具有50個(gè)以上重復(fù)單元的多糖以及具有50個(gè)以下的重復(fù)單元的寡糖。通常，多糖具有從大約50、55、60、65、70、75、80、85、90或95個(gè)重復(fù)單元到大約2000個(gè)以上的重復(fù)單元，優(yōu)選從大約100、150、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900或1000個(gè)重復(fù)單元到大約1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800或1900個(gè)重復(fù)單元。寡糖通常大約從大約6、7、8、9或10個(gè)重復(fù)單元到大約15、20、25、30或35到大約40或45個(gè)重復(fù)單元。
適合用于優(yōu)選實(shí)施方案的多糖包括來自有莢膜的細(xì)菌的多糖或寡糖。多糖和寡糖可以來自任何來源，例如它們可以來自于天然存在的細(xì)菌、遺傳工程的細(xì)菌，或者可以是合成生產(chǎn)的。多糖和寡糖在活化前可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)處理步驟，例如純化、功能化、使用溫和的氧化條件解聚化、脫乙酰化等。如果需要，也可以使用后處理步驟。本技術(shù)領(lǐng)域中已知的用于合成、制備和/或純化適合的多糖和寡糖的任何適合的方法都可以使用。
用于優(yōu)選實(shí)施方案的多糖和寡糖包括例如血清組1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的肺炎球菌多糖，血清型A、B、C、W 135和Y的腦膜炎球菌多糖，b型流感嗜血桿菌多糖多聚磷酸核糖基核糖醇，血清型III和V的B類鏈球菌多糖以及傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)Vi多糖。其它肺炎球菌和B類鏈球菌血清型以及腦膜炎球菌血清組的多糖也適合用于本發(fā)明，其它的T細(xì)胞不依賴性多糖和寡糖抗原也是同樣，例如來自A類鏈球菌、葡萄球菌(Staphylococci)、腸球菌(Enterococci)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌(E.coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)的多糖和寡糖。盡管特別優(yōu)選細(xì)菌多糖和寡糖，但革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖和脂寡糖以及它們的多糖和寡糖衍生物、以及病毒的多糖和寡糖也可以使用。
具有側(cè)鏈磷和/或骨架磷的多糖適合用于優(yōu)選的實(shí)施方案中。優(yōu)選實(shí)施方案的結(jié)合反應(yīng)特別適合于使用在骨架中具有磷的多糖。這樣的多糖對于片段化和降解敏感，因此低溫(4℃)反應(yīng)條件和快速的結(jié)合反應(yīng)由于減少了多糖的降解而產(chǎn)生了較高質(zhì)量的結(jié)合物。
在完成了任何前加工步驟之后，將多糖或寡糖進(jìn)行“活化”步驟。術(shù)語“活化”是指對多糖進(jìn)行化學(xué)處理以提供能夠與蛋白反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，活化包括用與功能化的蛋白上的酰肼基團(tuán)反應(yīng)的醛基、酮基或氰酸酯基使多糖或寡糖功能化?；蛘撸嗵呛凸烟且部梢杂门c功能化的蛋白上的醛基或酮基反應(yīng)的酰肼基團(tuán)來功能化。
按照一種實(shí)施方案，一種以上的多糖的混合物可以通過與單一的活化劑(或活化劑的混合物)在單一批式步驟中反應(yīng)而同時(shí)被活化。例如，Mn A、Mn C、Mn W 135和Mn Y多糖的混合物可以與醛功能化劑在單一批式反應(yīng)中進(jìn)行反應(yīng)。按照另一種實(shí)施方案，每個(gè)個(gè)體多糖可以通過在單獨(dú)的步驟中與活化劑反應(yīng)來活化。然后可以在結(jié)合步驟之前將單獨(dú)活化的多糖混合在一起，以便活化的多糖可以在單一過程中同時(shí)進(jìn)行結(jié)合。
任何適合的功能化反應(yīng)都可以用于用氰酸酯基團(tuán)活化多糖或寡糖。優(yōu)選多糖或寡糖與1-氰基-4-二甲基銨吡啶四氟硼酸鹽在三乙醇胺存在下進(jìn)行反應(yīng)。
任何適合的功能化反應(yīng)都可以用于用醛基活化多糖或寡糖。某些多糖或寡糖具有能夠參與結(jié)合反應(yīng)的末端醛基。如果用醛基活化多糖或寡糖，優(yōu)選的反應(yīng)包括與氧化劑例如NaIO4反應(yīng)。氧化劑具有使多糖或寡糖斷裂的潛力。不利的斷裂可以通過選擇具體的氧化劑和使用的氧化劑的濃度來避免或控制。酮基也能夠與酰肼反應(yīng)，因此在某些實(shí)施方案中可以采用以酮基來活化多糖或寡糖。
任何適合的功能化反應(yīng)都可以用于用酰肼基團(tuán)活化多糖或寡糖。優(yōu)選的功能化反應(yīng)是還原胺化，其中多糖或寡糖在高碘酸活化反應(yīng)中與NaIO4進(jìn)行反應(yīng)以產(chǎn)生醛基，然后醛基與肼和己二酸二酰肼反應(yīng)，接著用NaBH4后續(xù)還原?；蛘?，也可以使用氰基化結(jié)合反應(yīng)，其中多糖或寡糖與溴化氰或1-氰基-4-二甲基銨吡啶四氟硼酸鹽進(jìn)行反應(yīng)以導(dǎo)入氰酸酯基團(tuán)，氰酸酯基團(tuán)然后與肼和己二酸二酰肼反應(yīng)。也可以使用碳二亞胺反應(yīng)，其中多糖或寡糖與己二酸二酰肼在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽存在下進(jìn)行反應(yīng)。
強(qiáng)緩沖的(在pH從大約6.5到大約8下，使用從大約100mM到大約200mM的高緩沖液濃度)活化多糖的溶液優(yōu)選以強(qiáng)緩沖的溶液形式用于結(jié)合反應(yīng)中?？梢允褂萌魏芜m合的緩沖液，優(yōu)選的緩沖液例如N-(2-羥基乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)或磷酸鹽緩沖鹽水。
蛋白 活化的多糖或寡糖與蛋白結(jié)合以產(chǎn)生結(jié)合疫苗。適合的蛋白包括細(xì)菌毒素，它們是免疫有效的載體，并已經(jīng)通過化學(xué)或遺傳的手段使其在用于對象時(shí)是安全的。例子包括失活的細(xì)菌毒素例如白喉類毒素、CRM197、破傷風(fēng)類毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST以及來自銅綠假單胞菌的外毒素A。細(xì)菌的外膜蛋白例如外膜復(fù)合物e(OMPC)、膜孔蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血素(pneumolysis)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附素蛋白(PsaA)或肺炎球菌表面蛋白BVH-3和BVH-11也可以使用。其它的蛋白，例如炭疽芽胞桿菌的保護(hù)性抗原(PA)和炭疽芽胞桿菌的脫毒的水腫因子(EF)和致死因子(LF)、卵清蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和結(jié)核菌素的純化蛋白衍生物(PPD)也可以使用。優(yōu)選蛋白是無毒性和無反應(yīng)原性的蛋白，并且可以依照優(yōu)選實(shí)施方案的結(jié)合方法以足夠的量和純度獲得。例如，白喉毒素可以從白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)的培養(yǎng)物中純化，并使用甲醛進(jìn)行化學(xué)脫毒以產(chǎn)生適合的蛋白。
含有至少一個(gè)T細(xì)胞表位的天然毒素或類毒素的片段也可以使用，外膜蛋白復(fù)合物以及上面列出的各種不同蛋白的某些類似物、片段和/或類似物片段也可以使用。蛋白可以從天然來源獲得，可以通過重組技術(shù)生產(chǎn)，或者通過本技術(shù)領(lǐng)域中已知的合成方法來生產(chǎn)。類似物可以通過各種手段獲得，例如蛋白中的某些氨基酸可以用其它的氨基酸取代，而不會(huì)引起可察覺的與結(jié)構(gòu)例如抗體的抗原結(jié)合區(qū)域或底物分子上的結(jié)合位點(diǎn)的相互結(jié)合能力的喪失。其它的蛋白也可以使用，例如含有表面暴露的谷氨酸或天冬氨酸基團(tuán)的蛋白。
任何適合的功能化反應(yīng)都可以用于用酰肼基團(tuán)活化蛋白。制備酰肼修飾的蛋白的常規(guī)方法包括EDC催化和使用N-琥珀酰亞胺基碘乙酸酯和巰基酰肼通過蛋白的賴氨酸ε-氨基基團(tuán)的兩步工藝。參見King等，Biochemistry 1986；255774-5779。通過EDC催化制備的修飾蛋白通常需要被分級以便使它適合用于結(jié)合，并且兩步工藝是繁瑣的。因此，一般來說不優(yōu)選使用這樣的方法制備酰肼修飾的蛋白。但是，在某些實(shí)施方案中這樣的方法是可以接受的或甚至是理想的。
優(yōu)選酰肼基團(tuán)通過蛋白上天冬氨酸和谷氨酸殘基的羧基基團(tuán)使用碳二亞胺反應(yīng)導(dǎo)入到蛋白中，例如，通過在EDC存在下與肼、碳酰肼、琥珀?；ｋ隆⒓憾岫ｋ?、鹽酸肼(例如二鹽酸肼)或任何其它的二酰肼進(jìn)行反應(yīng)。EDC被用作催化劑，用肼或二酰肼活化和修飾蛋白反應(yīng)劑。任何水溶性的碳二亞胺包括EDC都可以用作催化劑。EDC催化的蛋白一般具有聚合和沉淀的趨勢。參見Schneerson等，Infect.Immun.1986，52519-528；Shafer等，Vaccine 2000；18(13)1273-1281；和Inman等，Biochemistry 1969；584074-4082。活化蛋白的聚集和沉淀部分依賴于其pH環(huán)境。因此，聚合和沉淀的趨勢可以通過使這些酰肼修飾的蛋白在緩沖溶液中保持溶解來進(jìn)行控制。通過對反應(yīng)混合物進(jìn)行緩沖液交換以維持活化蛋白在大約10.5的pH下，活化的蛋白保持溶解和穩(wěn)定以用于結(jié)合。任何適合的緩沖液都可以使用。優(yōu)選使用弱緩沖液，例如從大約3mM到大約10mM的低濃度的Na2CO3。
然后可以將緩沖的酰肼修飾的蛋白用于制備蛋白-多糖結(jié)合物，這樣的蛋白當(dāng)在pH從大約6到8.5、優(yōu)選從大約6.5到大約8下加入到活化的多糖中時(shí)，不會(huì)沉淀。任何適合的功能化反應(yīng)都可以用于用醛基活化蛋白。優(yōu)選蛋白在EDC存在下與1-氨基-2，3-丙二醇進(jìn)行反應(yīng)，然后用NaIO4進(jìn)行氧化。氨基糖例如葡萄糖胺、半乳糖胺等可用于代替1-氨基-2，3-丙二醇。在該反應(yīng)中也是用EDC作為催化劑，用氨基二醇通過蛋白的天冬氨酸和谷氨酸殘基的羧基基團(tuán)活化和修飾蛋白。
蛋白也可以在上述氨基酸或氨基酸混合物存在下進(jìn)行活化，并在大約7到大約7.5的中性pH下維持可溶。
通過還原胺化制備結(jié)合物 結(jié)合物可以通過醛和酰肼基團(tuán)的反應(yīng)(還原胺化)來制備。還原胺化結(jié)合反應(yīng)可以用于將酰肼修飾的反應(yīng)劑(蛋白或多糖)與另一個(gè)含有醛基基團(tuán)的成分進(jìn)行結(jié)合。
在常規(guī)的還原胺化中，醛基和氨基之間的反應(yīng)是可逆的和不利的，以至于需要氰基硼氫化鈉通過將C＝N雙鍵轉(zhuǎn)化為C-N單鍵使得整個(gè)還原胺化事件不可逆，來促進(jìn)結(jié)合。相比之下，優(yōu)選實(shí)施方案的還原胺化結(jié)合反應(yīng)不需要氰基硼氫化鈉的幫助就能夠進(jìn)行，這是由于酰肼-醛反應(yīng)的高效率。在還原胺化結(jié)合反應(yīng)結(jié)束時(shí)，硼氫化鈉或另一種適合的還原劑被用于將C＝N雙鍵還原成C-N單鍵，同時(shí)將任何殘留的醛基還原成醇基。優(yōu)選實(shí)施方案的還原胺化結(jié)合反應(yīng)避免了獲得的結(jié)合物被氰基硼氫化鈉的副產(chǎn)物氰化物污染。
為了在結(jié)合反應(yīng)過程中減少活化蛋白的沉淀，活化蛋白優(yōu)選是具有從大約3mM到大約10mM的低緩沖液濃度的弱緩沖溶液的形式，加入到強(qiáng)緩沖的(pH從大約6.5到大約7.5，具有從大約100mM到大約200mM的高緩沖液濃度)活化多糖溶液中。優(yōu)選活化蛋白溶液的pH被緩沖到大約pH 10到大約pH 11.5，最優(yōu)選到大約pH 10.5?；罨亩嗵侨芤簝?yōu)選被強(qiáng)緩沖到從大約pH 6到大約pH 8，最優(yōu)選從大約pH6.5到大約pH 7.5。酰肼-醛還原胺化反應(yīng)快速進(jìn)行，pH低于10.5(例如pH低至從大約8.5到大約9.5)對活化蛋白的沉淀效應(yīng)被反應(yīng)性活化多糖的分子性質(zhì)所克服。
通過氰基化結(jié)合制備結(jié)合物 結(jié)合物可以通過酰肼和氰酸酯基團(tuán)的反應(yīng)(氰基化結(jié)合)來制備。氰基化結(jié)合反應(yīng)是有效和可逆的，有利于產(chǎn)物的形成。在某些實(shí)施方案中，使用了阻斷劑以除去殘留的氰酸酯基團(tuán)。但是，在反應(yīng)混合物中加入阻斷劑驅(qū)使結(jié)合反應(yīng)向反向進(jìn)行，使結(jié)合產(chǎn)率降低了5-12％。研究了各種不同阻斷劑對產(chǎn)率的影響。將肺炎球菌多糖Pn 18C PS用CDAP活化，然后與酰肼活化的破傷風(fēng)類毒素(TTH)結(jié)合過夜。5份等份試樣加入水或阻斷劑到0.2M。孵育4小時(shí)后，通過HPSEC使用Waters Ultrahydrogel 2000柱子用280nm監(jiān)測器分析樣品。表C中提供的每個(gè)樣品的結(jié)合產(chǎn)率被測定為15.5分鐘處結(jié)合物峰占總蛋白、即結(jié)合物峰加上游離TTH峰(在22分鐘處)中的面積％。盡管在某些實(shí)施方案中可能希望使用阻斷劑淬滅剩余的殘留氰酸酯基團(tuán)，但是通常優(yōu)選避免使用它們以避免降低結(jié)合物產(chǎn)率。
表C 為了不使用阻斷劑移除結(jié)合產(chǎn)物中殘留的氰酸酯基團(tuán)，可以延長結(jié)合時(shí)間。優(yōu)選結(jié)合在溫度從大約0℃到大約5℃下進(jìn)行大約36到大約48小時(shí)，最優(yōu)選在大約4℃進(jìn)行大約36小時(shí)，然后在從大約20℃到大約25℃的溫度下再進(jìn)行大約18到24小時(shí)，最優(yōu)選在大約20到24℃下進(jìn)行大約18小時(shí)，使得殘留的氰酸酯基團(tuán)與水反應(yīng)并分解。如果需要，可以使用更長或更短的結(jié)合時(shí)間和/或更高或更低的結(jié)合溫度，并可以進(jìn)行各種不同的時(shí)間和溫度下不同的步驟順序。但是，希望至少在開始時(shí)在低溫下進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，優(yōu)選從大約0℃到大約5℃，更優(yōu)選在大約4℃，以便減少結(jié)合物沉淀的程度。
由于結(jié)合產(chǎn)物具有高結(jié)合產(chǎn)率和高免疫原性，可以不需要純化步驟，例如柱層析和/或?qū)⒔Y(jié)合物從未結(jié)合的多糖中進(jìn)行硫酸銨沉淀。但是，在某些實(shí)施方案中可能希望進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)純化步驟。
結(jié)合物 兩種反應(yīng)劑每個(gè)分子都含有多個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)?；罨亩嗵欠肿涌梢耘c一個(gè)以上的活化蛋白分子反應(yīng)并與其形成一個(gè)以上的鍵。同樣地，活化的蛋白分子可以與一個(gè)以上的活化多糖分子反應(yīng)并與其形成一個(gè)以上的鍵。
因此，結(jié)合物產(chǎn)物是各種交聯(lián)的基質(zhì)類型的晶格結(jié)構(gòu)的混合物。例如可以存在單一的鍵，或者可以存在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)或更多的鍵。優(yōu)選情況下，在多糖和蛋白之間的平均鍵數(shù)可以被調(diào)節(jié)。優(yōu)選的平均鍵數(shù)可以依賴于多糖的類型、蛋白的類型、結(jié)合方法、反應(yīng)條件等。一般來說，存在平均1個(gè)鍵到大約2、3、4或5個(gè)鍵，以便避免由于過度結(jié)合而干擾蛋白刺激免疫系統(tǒng)的能力，同時(shí)不引起多糖結(jié)構(gòu)的變化。但是，在某些實(shí)施方案中，5個(gè)以上的鍵是可以接受的或甚至是希望的。
如上所述，復(fù)合的多價(jià)結(jié)合物通過本文公開的方法生產(chǎn)。復(fù)合的多價(jià)結(jié)合物中包含的免疫原性不同的多糖的數(shù)量沒有限制，在某些實(shí)施方案中可以在從2到28個(gè)的范圍內(nèi)，優(yōu)選5到25個(gè)，最優(yōu)選15個(gè)。復(fù)合的多價(jià)結(jié)合物中包含的不同載體蛋白的數(shù)量也沒有限制，在某些實(shí)施方案中可以在從1到10個(gè)的范圍內(nèi)，優(yōu)選4到6個(gè)，最優(yōu)選5個(gè)。例如，一個(gè)載體蛋白分子可以與2、3、4、5、6個(gè)等免疫原性不同的多糖結(jié)合。構(gòu)建的結(jié)合物可以包含晶格結(jié)構(gòu)，其中包含了兩個(gè)以上彼此結(jié)合的不同蛋白分子和2、3、4、5、6個(gè)等免疫原性不同的多糖。
結(jié)合后，可以通過任何適合的方法純化結(jié)合物。純化被用于除去未反應(yīng)的多糖、蛋白或小分子反應(yīng)副產(chǎn)物。純化方法包括超濾、體積排阻色譜、密度梯度離心、疏水相互作用色譜、硫酸銨沉淀等，這些在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。正如上面討論的那樣，優(yōu)選實(shí)施方案的結(jié)合反應(yīng)以高產(chǎn)率進(jìn)行，并產(chǎn)生較少的不需要的小分子反應(yīng)副產(chǎn)物。因此，純化可能不是必需的，或者可能只需要很小程度的純化例如透濾。按照需要，結(jié)合物可以被濃縮或稀釋或加工成任何適合的形式用于藥物組合物中。
治療方法 按照優(yōu)選實(shí)施方案制備的結(jié)合物以適合的形式、以免疫有效的劑量施用于對象以預(yù)防和/或治療感染性疾病。本文中使用的術(shù)語“對象”是指動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物。例如，被考慮到的哺乳動(dòng)物包括人類、靈長類、狗、貓、綿羊、牛、山羊、豬、馬、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等。術(shù)語“對象”、“患者”和“宿主”可以互換使用。本文中使用的結(jié)合疫苗的“免疫有效的”劑量是適合引發(fā)免疫應(yīng)答的劑量。具體的劑量依賴于被治療的對象的年齡、體重和醫(yī)療狀況，并依賴于給藥的方法。適合的劑量可以被本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員容易地確定。
含有優(yōu)選實(shí)施方案的結(jié)合疫苗的藥物組合物可以提供超過傳統(tǒng)疫苗的各種優(yōu)點(diǎn)，包括增強(qiáng)免疫原性弱的抗原的免疫原性、可能減少抗原的使用量、降低加強(qiáng)接種免疫的頻率、改進(jìn)功效、對免疫的優(yōu)先刺激、或可能定向免疫應(yīng)答。疫苗可以通過各種途徑給藥于對象，正如下面討論的那樣，包括但不限于腸胃外(例如通過腦池內(nèi)注射和輸注技術(shù))、真皮內(nèi)、跨膜、經(jīng)皮(包括局部外用)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、病變內(nèi)、皮下、口服和鼻內(nèi)(例如吸入)給藥途徑。結(jié)合疫苗可以通過推注或通過連續(xù)輸注進(jìn)行給藥，以及通過局部給藥，例如在疾病或損傷的位點(diǎn)。結(jié)合疫苗也可以任選在藥物或生理可接受的介質(zhì)中給藥。
本文使用的術(shù)語“疫苗”是廣義術(shù)語，以其平常的意義來使用，包括但不限于優(yōu)選實(shí)施方案的結(jié)合物或用佐劑、稀釋劑、賦形劑、載體和其它可藥用的物質(zhì)配制的其它抗原。術(shù)語“可藥用的”被用于指稱與生物系統(tǒng)例如細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或生物體相容的無毒性的物質(zhì)。
使用優(yōu)選實(shí)施方案的結(jié)合物的免疫方案為預(yù)防或治療對象中的疾病、病癥和/或感染提供了組合物和方法。本文中使用的術(shù)語“治療”是廣義術(shù)語，以其平常的意義來使用，包括但不限于治愈性、防止性、預(yù)防性、姑息性和/或緩解性治療。
優(yōu)選疫苗組合物是無菌的，并且在適合給對象施用的重量或體積單位中含有治療或預(yù)防有效量的結(jié)合物。本文使用的術(shù)語“可藥用的載體”是指適合于在對象中施用的一種或多種相容的固體或液體填充劑、稀釋劑或包囊物質(zhì)。術(shù)語“載體”表示天然的或合成的有機(jī)或無機(jī)成分，活性成分與其組合以方便應(yīng)用。載體的特性依賴于給藥途徑。生理可接受或可藥用的載體包括稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和其它本技術(shù)領(lǐng)域中熟知的物質(zhì)。
藥物組合物的成分也能夠與優(yōu)選實(shí)施方案的結(jié)合物以及彼此之間共混，使得沒有明顯損害所需的藥物功效的相互作用。
將優(yōu)選實(shí)施方案的結(jié)合疫苗配制成藥物組合物可以使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法來完成。疫苗組合物也可以含有一種或多種佐劑。適合的佐劑包括，例如，鋁佐劑如氫氧化鋁或磷酸鋁、弗氏佐劑、BAY、DC-chol、pcpp、單磷酰脂A、CpG、QS-21、霍亂毒素和甲酰甲硫氨酰肽。參見例如《疫苗設(shè)計(jì)，亞基和佐劑方法》(Vaccine Design，theSubunit and Adjuvant Approach，1995(M.F.Powell和M.J.Newman主編，Plenum Press，N.Y.))。
給對象施用的結(jié)合疫苗的劑量和用藥方案，可以依照藥物和獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在考慮各種因素例如所打算的應(yīng)用、具體的抗原、佐劑(如果存在的話)、年齡、性別、體重、物種、大體狀況、之前的疾病和/或治療、以及給藥途徑后，進(jìn)行確定。初步的劑量可以根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來確定，對于人類用藥的劑量的縮放按照本技術(shù)領(lǐng)域接受的實(shí)踐方法例如標(biāo)準(zhǔn)的劑量試驗(yàn)來進(jìn)行。例如，治療有效劑量最初可以從血清抗體水平測試來估計(jì)。劑量依賴于結(jié)合物的比活性，并可以通過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)容易地測定。
在實(shí)施免疫方案治療和/或預(yù)防具體疾病中，給對象施用治療有效量的結(jié)合物?！坝行Я俊笔侵缸阋燥@示出對對象有意義的益處的的治療劑(例如結(jié)合物)和其它活性成分的總量，其中有意義的益處例如增強(qiáng)的免疫應(yīng)答、相關(guān)醫(yī)學(xué)病況(疾病、感染等)的治療、治愈、防止或緩解、或增加了這些病況的治療、治愈、防止或緩解的速度。當(dāng)“有效量”被用于單獨(dú)給藥的個(gè)體治療藥劑時(shí)，該術(shù)語只是指該治療劑。當(dāng)用于組合時(shí)，該術(shù)語是指產(chǎn)生治療效果的成分的組合量，不論是組合、連續(xù)還是同時(shí)給藥。本文中使用的詞組“施用有效量”的治療劑，是指用所述治療劑治療對象的量和時(shí)間足以誘導(dǎo)反映疾病、感染或病癥的嚴(yán)重性的至少一種指標(biāo)的改善、優(yōu)選為持續(xù)的改善。
如果患者在相隔一段時(shí)間的至少兩個(gè)時(shí)機(jī)表現(xiàn)出了改善，這種改善可以被認(rèn)為是“持續(xù)的”。改善的程度可以根據(jù)例如免疫學(xué)數(shù)據(jù)或疾病、感染或病癥的征象或癥狀來確定?？梢詫Ω鞣N不同的反映患者的疾病程度的指標(biāo)進(jìn)行評估以確定治療的量和時(shí)間是否充分?？梢愿鶕?jù)對患者在第一劑治療劑用藥之前進(jìn)行的檢查、或根據(jù)從健康的患者群體中產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)學(xué)值來建立選擇性指標(biāo)的基線值。如果施用治療劑治療急性癥狀，第一劑用藥應(yīng)該盡可能快。通過施用治療藥劑誘導(dǎo)改善，直到對象對于所選的指標(biāo)顯示出超過了基線的改善。在治療慢性病癥中，這種程度的改善通過在一段時(shí)期內(nèi)、例如1、2或3個(gè)月或以上或無限期地重復(fù)施用治療藥劑來獲得。單劑藥劑可能就足以治療或預(yù)防某些疾病。如果需要的話，不論患者的病癥如何，治療可以以同樣的水平或以減少的劑量或頻率無限期地持續(xù)。一旦治療被減少或中止，以后如果癥狀重新出現(xiàn)，治療可以恢復(fù)。
一般來說，為針對細(xì)菌感染的預(yù)防接種提供有效劑量或治療有效劑量的結(jié)合物的量為每公斤體重從大約1μg以下到大約100μg以上，優(yōu)選從大約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50μg到大約55、60、65、70、75、80、85、90或95μg。如果感染后經(jīng)過的時(shí)間短，有效劑量可能需要較少的抗體，因?yàn)榧?xì)菌增殖的時(shí)間較少。有效劑量也可以依賴于診斷時(shí)的細(xì)菌載量。對于治療性應(yīng)用來說，可以考慮在幾天的時(shí)期內(nèi)進(jìn)行多次注射給藥。
結(jié)合疫苗可以作為單劑或者系列施用，包括一次或多次加強(qiáng)。例如，嬰兒或兒童可以在幼時(shí)接受單劑，然后使用加強(qiáng)劑直到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年后。加強(qiáng)劑從接觸過抗原的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，即記憶應(yīng)答。也就是說，結(jié)合疫苗在嬰兒或兒童中引發(fā)了高的初級功能性抗體反應(yīng)，并在加強(qiáng)劑給藥后能夠引發(fā)記憶應(yīng)答，這證實(shí)了結(jié)合疫苗引發(fā)的保護(hù)性免疫應(yīng)答是持久的。
結(jié)合疫苗可以配制成液體制劑用于例如口、鼻、肛門、直腸、頰、陰道、經(jīng)口、胃內(nèi)、粘膜、經(jīng)舌、肺泡、牙齦、嗅覺道或呼吸道粘膜給藥。適合這樣給藥的形式包括懸浮液、糖漿和酏劑。結(jié)合疫苗也可以配制成用于腸胃外、皮下、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥、可注射給藥、從植入物持續(xù)釋放、或通過滴眼液給藥。適合用于這樣的給藥形式包括無菌懸浮液和乳液。這樣的結(jié)合疫苗可以與適合的載體、稀釋劑或賦形劑例如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等混合。結(jié)合疫苗也可以被冷凍干燥。結(jié)合疫苗可以含有輔助性物質(zhì)、例如增濕劑或乳化劑、Ph緩沖劑、增加膠凝或粘度的添加劑、防腐劑、調(diào)味劑、色素等，這依賴于給藥途徑和所需的制劑?？梢詤⒖紭?biāo)準(zhǔn)的教科書不需過度的實(shí)驗(yàn)來制備適合的制劑，例如《雷氏藥物科學(xué)與實(shí)踐》(″RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy″)，LippincottWilliams & Wilkins，第20版，2003年6月1日)和《雷氏藥物學(xué)》(″Remington′s Pharmaceutical Sciences″)，Mack Pub.Co.，第18和19版(分別為1985年12月和1990年6月)，在此以其全文引為參考。這樣的制劑可以包含絡(luò)合劑、金屬離子、聚合化合物例如聚乙酸、聚羥基乙酸、水凝膠、葡聚糖等、脂質(zhì)體、微乳液、微團(tuán)、單層或多層介質(zhì)、紅細(xì)胞血影或球芽。適合用于脂質(zhì)體制劑的脂類包括但不限于甘油單酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、膽汁酸等。這些附加成分的存在可以影響物現(xiàn)狀態(tài)、溶解性、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速度以及體內(nèi)清除速度，因此可以根據(jù)所需的應(yīng)用進(jìn)行選擇，以便載體的特性適合于所選的給藥途徑。
結(jié)合疫苗優(yōu)選被提供成液體懸浮液或冷凍干燥的產(chǎn)品。適合的液體制劑包括例如被緩沖到選定pH的等滲水性溶液、懸浮液、乳液或粘性組合物。經(jīng)皮制劑包括洗劑、凝膠、噴霧劑、膏劑或其它適合的技術(shù)。如果希望進(jìn)行鼻或呼吸道(粘膜)給藥(例如氣溶膠吸入或吹入)，組合物可以采用通過擠壓噴霧分配器、泵式分配器或氣溶膠分配器分配的形式。氣溶膠通常在通過碳?xì)浠衔镄纬傻膲毫ο隆１檬椒峙淦鲀?yōu)選分配定量的劑量或具有特定顆度的劑量，正如下面討論的那樣。
當(dāng)采取溶液、懸浮液和凝膠形式時(shí)，結(jié)合物的制劑除了活性成分之外通?？梢院写罅康乃?優(yōu)選為純水)。少量的其它成分例如pH調(diào)節(jié)劑、乳化劑、分散劑、緩沖劑、防腐劑、增濕劑、膠凝劑、色素等也可以存在。
組合物優(yōu)選與受者的血液或其它體液等滲。組合物的等滲性可以使用酒石酸鈉、丙二醇或其它無機(jī)或有機(jī)溶質(zhì)來獲得。氯化鈉是特別優(yōu)選的?？梢允褂镁彌_劑，例如乙酸及其鹽、檸檬酸及其鹽、硼酸及其鹽以及磷酸及其鹽。腸胃外介質(zhì)包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer′s)葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化的林格液或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)介質(zhì)包括流體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。
組合物的粘度可以使用可藥用的增稠劑維持在選定的水平。甲基纖維素是優(yōu)選的，因?yàn)樗梢匀菀撞⑶伊畠r(jià)地獲得且易于操作。其它適合的增稠劑包括例如黃原膠、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、卡波姆等。增稠劑的優(yōu)選濃度可以依賴于所選的試劑。要點(diǎn)是使用量可以獲得選定的粘度。粘性組合物通常通過在溶液中加入這些增稠劑來制備。
可藥用的防腐劑可以用來增加組合物的保存期限。苯甲醇是適合的，盡管各種不同的防腐劑包括例如對羥苯甲酸酯、乙基汞硫代水楊酸鈉、氯代丁醇或苯扎氯銨也可以使用。適合的防腐劑的濃度可以為總重量的0.02％到2％，盡管根據(jù)所選的試劑可以有相當(dāng)大的改變。
也可以采用結(jié)合物的肺部投送。結(jié)合物在吸入時(shí)被投送到哺乳動(dòng)物的肺部，并透過肺的上皮層進(jìn)入血流。有廣泛的被設(shè)計(jì)用于肺部投送治療產(chǎn)品的機(jī)械裝置可以使用，包括但不限于噴霧器、定量吸入器和粉末吸入器，所有這些對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說都是熟悉的。這些裝置使用適合于分配結(jié)合物的制劑。通常，每種制劑都特異性對應(yīng)于所使用的裝置類型，并且除了在治療中有用的稀釋劑、佐劑和/或載體之外，可以包括適合的推進(jìn)物質(zhì)的使用。
為了肺部投送，結(jié)合物可以被有利地制備成顆粒的形式，對于肺部投送來說平均的粒度從0.1μm以下到10μm以上，更優(yōu)選從大約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9μm到大約1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0或9.5μm。用于肺部投送結(jié)合物的可藥用載體包括碳水化合物例如海藻糖、甘露糖醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨糖醇。其它在制劑中使用的成分可以包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC?？梢允褂锰烊坏幕蚝铣傻谋砻婊钚詣ň垡叶己推暇厶?，例如環(huán)狀糊精。膽鹽和其它相關(guān)的增強(qiáng)劑以及纖維素和纖維素衍生物和氨基酸也可以使用。脂質(zhì)體、微囊、微球、包合物和其它類型的載體也可以使用。
適合用于噴射或超聲的噴霧器的制劑通常包含溶解或懸浮在水中的結(jié)合物，結(jié)合物濃度為每毫升溶液大約0.01以下到100mg以上，優(yōu)選為每毫升溶液大約0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg到大約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90mg結(jié)合物。制劑也可以包含緩沖液和簡單的糖(例如用于蛋白穩(wěn)定化和調(diào)節(jié)滲透壓)。噴霧器制劑也可以含有表面活性劑，以減少或防止結(jié)合物在形成氣溶膠時(shí)由于溶液的原子化所引起表面誘導(dǎo)的聚集。
用于定量吸入裝置的制劑一般來說含有分得很細(xì)的粉末，其中含有在表面活性劑的幫助下懸浮在推進(jìn)劑中的本發(fā)明的化合物。推進(jìn)劑可以包含常規(guī)的推進(jìn)劑，例如氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴和烴類，例如三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷以及它們的組合。
適合的表面活性劑包括失水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂和油酸。
從粉末吸入裝置分配的制劑通常含有包含了結(jié)合物的分得很細(xì)的干燥粉末，任選包含增量劑例如乳糖、山梨糖醇、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或木糖醇，其量能夠促進(jìn)粉末從裝置中分散，通常為制劑的大約1重量％以下到99重量％以上，優(yōu)選為制劑的大約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50重量％到大約55、60、65、70、75、80、85或90重量％。
當(dāng)結(jié)合物通過靜脈內(nèi)、皮膚、皮下或其它注射方式給藥時(shí)，結(jié)合疫苗優(yōu)選無熱原的腸胃外可接受的水性溶液的形式。具有適合的pH、等滲性、穩(wěn)定性等的腸胃外可用溶液的制備屬于本技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)。優(yōu)選的用于注射的藥物組合物優(yōu)選含有等滲的介質(zhì)例如氯化鈉注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、乳酸林格氏注射液以及其它在本技術(shù)領(lǐng)域中已知的介質(zhì)。藥物組合物還可以含有穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖劑、抗氧化劑或本技術(shù)領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的其它添加劑。
注射的時(shí)程可以依賴于各種因素而變化，并包括在幾秒鐘以下的過程中單次注射給藥，到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時(shí)以上的連續(xù)靜脈內(nèi)用藥。
結(jié)合物可以通過液體或凝膠、或作為植入物或裝置局部外用、全身地或局部給藥。
優(yōu)選實(shí)施方案的結(jié)合物或優(yōu)選實(shí)施方案的結(jié)合方法可以用于制備治療各種細(xì)菌性感染的疫苗，所述感染包括由幽門螺旋桿菌(Helicobacter pyloris)、博氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophilia)、分枝桿菌菌種(例如結(jié)核分枝桿菌(M.tubercidosis)、鳥分枝桿菌(M.avium)、At.Intracellulare、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、戈登分枝桿菌(M.gordonae))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、單核細(xì)胞增多性李氏桿菌(Listeria monocytogenes)、化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)(A類鏈球菌)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(B類鏈球菌)、鏈球菌(草綠色類，viridans group)、糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)、牛鏈球菌(Streptococcus bovis)、鏈球菌(厭氧種類，anaerobicsps.)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性彎曲桿菌(pathogenic Campylobacter sp.)、腸球菌(Enterococcus sp.)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)、白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、棒桿菌(Corynebacteriumsp.)、紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoiae)、多殺巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、類桿菌(BacteroidesAt.)、具核梭桿菌(Fusobacterhim nucleatum)、念珠狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis)、梅毒螺旋體(Treponema pallidum)、細(xì)弱螺旋體(Treponema pertenue)、鉤端螺旋體(Leptospira)和伊氏放線菌(Actinomyces israelii)引起的感染。
優(yōu)選實(shí)施方案的某些方法也可以用于制備針對癌癥對對象進(jìn)行治療或免疫的疫苗，所述癌癥例如哺乳動(dòng)物肉瘤或癌，如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏(Ewing′s)腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、威爾姆氏(Wilms’s)腫瘤、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽覺神經(jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦脊膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、白血病例如急性淋巴細(xì)胞白血病和急性髓細(xì)胞白血病(成髓細(xì)胞、前髓細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞、單核細(xì)胞和紅細(xì)胞白血病)、慢性白血病(慢性髓細(xì)胞(粒細(xì)胞)白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病)、以及真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤(霍奇金氏病和非霍奇金氏病、多發(fā)性骨髓瘤、華氏(Waldenstrom′s)巨球蛋白血癥、以及重鏈病、淋巴組織增生性病癥包括自身免疫性淋巴組織增生綜合癥(ALPS)、慢性淋巴母細(xì)胞白血病、多毛細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、外周T細(xì)胞淋巴瘤、小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、伯奇氏(Burkitt′s)淋巴瘤、EB病毒陽性T細(xì)胞淋巴瘤、組織細(xì)胞性淋巴瘤、霍奇金氏病、彌散性進(jìn)展性淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞性白血病、Tγ淋巴組織增生病、皮膚性B細(xì)胞淋巴瘤、皮膚性T細(xì)胞淋巴瘤(即蕈樣肉芽腫)和塞扎里氏(Szary)綜合征。
結(jié)合物可以與各種不同的目前使用的或正在開發(fā)的、用于人類或非人類對象的疫苗組合使用。用于人類對象并針對感染性疾病的疫苗的例子包括組合的白喉和破傷風(fēng)類毒素疫苗、百日咳全細(xì)胞疫苗、失活的流感疫苗、23價(jià)肺炎球菌疫苗、麻疹活疫苗、腮腺炎活疫苗、風(fēng)疹活疫苗、卡介苗(BCG)I肺結(jié)核疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、狂犬病疫苗(例如人類二倍體細(xì)胞疫苗)、失活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗、腦膜炎球菌多糖疫苗、四價(jià)腦膜炎球菌結(jié)合疫苗、黃熱病活病毒疫苗、傷寒殺全細(xì)胞疫苗、霍亂疫苗、日本B型腦炎殺病毒疫苗、腺病毒疫苗細(xì)胞、肥大病毒疫苗、輪狀病毒疫苗、水痘疫苗、炭疽熱疫苗、天花疫苗以及其它的可商購的和實(shí)驗(yàn)的疫苗。
結(jié)合物可以以試劑盒的形式提供給用藥的醫(yī)生或其它的衛(wèi)生護(hù)理專業(yè)人員。試劑盒是容納著容器的包裝，容器中含有結(jié)合疫苗和對象施用結(jié)合疫苗的說明書。試劑盒也可以任選含有一種或多種其它的治療劑。試劑盒可任選含有一種或多種診斷工具和使用說明書。例如，可以包括含有兩種或多種疫苗的疫苗混合物，或含有不同的疫苗或治療劑的分離的藥物組合物。試劑盒也可以含有分開劑量的結(jié)合疫苗，用于連續(xù)或順序地給藥。試劑盒可以含有適合的投送裝置，例如注射器、吸入裝置等，以及治療劑給藥的說明書。試劑盒可以任選含有用于儲(chǔ)存、復(fù)溶(如果可行的話)和所包含的任何或所有治療劑給藥的說明書。試劑盒可以含有多個(gè)容器，這反映了給對象用藥的次數(shù)。如果試劑盒含有第一個(gè)和第二個(gè)容器，則可以存在多個(gè)。
實(shí)施例——材料和方法 材料——破傷風(fēng)類毒素(TT)來自Lederle Vaccines，Pearl River，NY和Serum Institute of India，Pune，India。腦膜炎球菌A群和C群多糖(分別為Mn A PS和Mn C PS)來自Bio-Manguinhos，Rio de Janeiro，Brazil。Mn A PS也從SynCo Bio Partners，Amsterdam，The Netherlands獲得。Mn W135和Y PS從Aventis Pasteur and Chiron獲得。肼、碳酰肼、己二酸二酰肼(ADH)、乙酰肼、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-(2-羥基乙基)哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、高碘酸鈉、硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、4-氰基-二甲基氨基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)和1-氨基-2，3-丙二醇以及各種氨基酸從Sigma/AldrichChemical Company購買。TNBSA(2，4，6-三硝基苯磺酸)和BCA(二辛可寧酸)分析試劑盒從Pierce購買。
方法——如上所述，本文公開了由碳二亞胺在氨基酸、氨基酸混合物、肽和肽混合物存在下催化的用酰肼基團(tuán)活化蛋白的方法，以及將多糖和多糖混合物與蛋白結(jié)合的三種通用方法。用于通過這些方法與蛋白結(jié)合的細(xì)菌多糖包括腦膜炎球菌血清組A、C、W 135和Y的多糖。
由碳二亞胺在氨基酸、氨基酸混合物、肽和肽混合物存在下催化的用酰肼基團(tuán)活化蛋白 1.將蛋白(破傷風(fēng)類毒素或TT，4mg/mL，通過Lowry分析[26]或BCA分析[35]測定)與0.36 M肼或己二酸二酰肼(ADH)在12-72mM EDC、0.2 M MES、pH 5-6.5和0-144mM氨基酸或氨基酸混合物存在下反應(yīng)1-24小時(shí)。
2.用1N NaOH中和反應(yīng)混合物，對30mM NaCl、10mMHEPES、pH 7.5在4℃透析。
3.透析后，記錄樣品的沉淀形成。
4.將樣品在4℃儲(chǔ)存1-8周，檢查并記錄沉淀的形成。
5.顯示出很少或沒有沉淀的樣品用Superose 6柱進(jìn)行HPLC分析。
6.通過BCA分析[35]測定蛋白濃度，酰肼的濃度通過TNBS分析[34]測定。計(jì)算每個(gè)TT分子的酰肼基團(tuán)的數(shù)量，即活化程度(DA)。
通用結(jié)合方法A——醛活化的PS或PS混合物與酰肼活化的蛋白反應(yīng)(還原胺化結(jié)合) 1.兩種方法被用于活化破傷風(fēng)類毒素。將破傷風(fēng)類毒素用肼或己二酸二酰肼在EDC存在下在pH 5.5-6.5下進(jìn)行活化，然后緩沖液用30mM NaCl、3mM Na2CO3、pH大約10.5進(jìn)行交換?；蛘?，將破傷風(fēng)類毒素用肼或己二酸二酰肼在pH 5.5、EDC和0-144mM氨基酸或氨基酸混合物的存在下進(jìn)行活化，然后緩沖液用30mM NaCl、10mM HEPES、pH7.5在4℃進(jìn)行交換。
2.將多糖或多糖混合物(以成分多糖的所需重量比率)用NaIO4進(jìn)行活化，然后緩沖液用pH 7.5的10mM HEPES緩沖液在4℃進(jìn)行交換。
3.將酰肼活化的TT與醛活化的多糖或多糖混合物以2∶1到1∶2的比例和1-40mg/mL的濃度范圍在pH 6.5-7.5、4-40℃下反應(yīng)過夜。
4.然后加入NaBH4(起始反應(yīng)劑中醛基的10倍摩爾量)6小時(shí)到過夜，以便將C＝N雙鍵還原成C-N單鍵并將未反應(yīng)的醛基還原成醇。
5.使用截留分子量為12-14KDa的膜，用鹽水、10mM HEPES、pH 7.5、1mM EDTA對溶液進(jìn)行緩沖液交換。
6.測定樣品的體積。
7.根據(jù)用Lowry分析[26]或BCA分析[35]測量的最初的起始量，計(jì)算蛋白的濃度。
8.根據(jù)通過適合的分析方法在混合前對每種成分多糖測量的最初的起始量，計(jì)算多糖的濃度，例如用于Mn A和C PS的間苯二酚分析[27]、用于Mn W135和Y PS的蒽酮分析[32]、用于Mn A PS的磷分析[33]和用于Mn W135和Y PS的purpald分析[31]。
通用結(jié)合方法B——氰酸酯活化的PS或PS混合物與酰肼活化的蛋白反應(yīng)(氰基化結(jié)合) 1.兩種方法被用于活化破傷風(fēng)類毒素。將破傷風(fēng)類毒素用肼或己二酸二酰肼在EDC存在下在pH 5.5-6.5下進(jìn)行活化，然后用30mMNaCl、3mM Na2CO3、pH大約10.5進(jìn)行緩沖液交換?；蛘?，將破傷風(fēng)類毒素用肼或己二酸二酰肼在pH 5.5、EDC和0-144mM氨基酸或氨基酸混合物存在下進(jìn)行活化，然后用30mM NaCl、10mM HEPES、pH7.5在4℃進(jìn)行緩沖液交換。
2.將多糖或多糖混合物(以成分多糖的所需重量比率)用CDAP在三乙胺存在下在20-24℃活化2-2.5分鐘。
3.4℃下，將酰肼活化的TT與氰酸酯活化的多糖或多糖混合物以2∶1到1∶2的比例和0.2-1mg/mL的濃度范圍在pH 6.5-7.5進(jìn)行反應(yīng)。
4.在4℃反應(yīng)3個(gè)通宵后(延長的孵育是為了確保剩下的殘留未反應(yīng)的氰酸酯基團(tuán)分解)，使用截留分子量為12-14KDa的膜，用鹽水、10mM HEPES、pH 7.5、1mM EDTA對溶液進(jìn)行緩沖液交換。
5.測定樣品的體積。
6.根據(jù)用Lowry分析[26]或BCA分析[35]測量的最初的起始量，計(jì)算蛋白的濃度。
7.根據(jù)在混合前通過適合的分析方法對每種成分多糖測量的最初的起始量，計(jì)算多糖的濃度，例如用于Mn A和C PS的間苯二酚分析[27]、用于Mn W135和Y PS的蒽酮分析[32]、用于Mn A PS的磷分析[33]和用于Mn W135和Y PS的purpald分析[31]。
不使用阻斷劑制備聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合疫苗的方法B的結(jié)合反應(yīng)時(shí)間在4℃下是3個(gè)通宵。由于結(jié)合產(chǎn)物的高結(jié)合產(chǎn)率和高免疫原性，需要純化步驟，例如柱色譜和/或結(jié)合物從未結(jié)合的多糖中的硫酸銨沉淀。
通用結(jié)合方法C——酰肼活化的PS或PS混合物與醛活化的蛋白反應(yīng)(還原胺化結(jié)合) 1.兩種方法被用于活化破傷風(fēng)類毒素。將破傷風(fēng)類毒素與1-氨基-2，3-丙二醇(APDO)在EDC存在下在pH 5.5-6.5下進(jìn)行反應(yīng)，然后用30mM NaCl、3mM Na2CO3、pH大約10.5在4℃進(jìn)行緩沖液交換。TT-APDO與NaIO4反應(yīng)產(chǎn)生醛基，然后用30mM NaCl、3mM Na2CO3、pH大約10.5在4℃進(jìn)行緩沖液交換?；蛘撸瑢⑵苽L(fēng)類毒素與1-氨基-2，3-丙二醇(APDO)在pH5.5-6.5、EDC和0-144mM氨基酸或氨基酸混合物存在下進(jìn)行反應(yīng)，然后用30mM NaCl、10mM HEPES、pH7.5在4℃進(jìn)行緩沖液交換。TT-APDO與NaIO4反應(yīng)產(chǎn)生醛基，然后用30mM NaCl、10mM HEPES、pH7.5在4℃進(jìn)行緩沖液交換。
2.三種方法被用于制備酰肼活化的多糖或多糖混合物(以成分多糖的所需的重量比率)a)PS或PS混合物與NaIO4反應(yīng)，然后與肼或己二酸二酰肼反應(yīng)，然后用NaBH4還原(還原胺化)；b)PS或PS混合物用CDAP活化，然后與肼或己二酸二酰肼反應(yīng)(氰基化結(jié)合反應(yīng))；以及c)PS或PS混合物與肼或己二酸二酰肼在EDC存在下反應(yīng)(碳二亞胺反應(yīng))。
3.醛活化的TT與酰肼活化的PS或PS混合物以2∶1到1∶2的比率和1-5mg/mL的濃度范圍在pH 6.5-7.5和4-40℃下反應(yīng)18小時(shí)。
4.然后加入NaBH4(起始反應(yīng)劑中醛的10倍摩爾量)6小時(shí)到過夜，以便將C＝N雙鍵還原成C-N單鍵并將未反應(yīng)的醛基還原成醇。
5.使用截留分子量為12-14Kda的膜，用鹽水、10mM HEPES、pH 7.5、1mM EDTA對溶液進(jìn)行緩沖液交換。
6.測定樣品的體積。
7.根據(jù)用Lowry分析[26]或BCA分析[35]測量的最初起始量，計(jì)算蛋白的濃度。
8.根據(jù)在混合前通過適合的分析方法對每種成分多糖測量的最初的起始量，計(jì)算多糖的濃度，例如用于Mn A和C PS的間苯二酚分析[27]、用于Mn W135和Y PS的蒽酮分析[32]、用于Mn A PS的磷分析[33]和用于Mn W135和Y PS的purpald分析[31]。
活化的蛋白和結(jié)合產(chǎn)物的物理化學(xué)分析 高效液相體積排阻色譜(HPSEO) 用鹽水、10mM Tris、pH 7.5、1mM EDTA溶液，以0.5mL/分鐘在使用Chromelean軟件和280nm UV檢測器的Dionex HPLC系統(tǒng)中將蛋白、多糖和結(jié)合產(chǎn)物的樣品(25μL，0.05-1mg/mL)在WatersUltrahydrogel 2000或Ultrahydrogel線性柱或Superose 6柱中跑柱。UV檢測器在280nm處監(jiān)測含有蛋白的物質(zhì)以及含有芳香部分的化合物的信號(hào)。RI檢測器測量蛋白、多糖、結(jié)合物和鹽的信號(hào)。當(dāng)用HPLC分析聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合疫苗時(shí)，每分鐘收集級份，用于通過ELISA檢測多糖-蛋白結(jié)合物。
檢測PS-蛋白結(jié)合物的ELISA方法 將Immunolon I板(Dynatech)用20μL各HPLC級份加上80μL 1xPBS(總體積為100μL包被溶液)包被3小時(shí)。只有含有蛋白的分子種類(即結(jié)合物和未結(jié)合的游離蛋白)附著于聚苯乙烯板上。在用150μL清洗緩沖液(含有0.05％Tween 20、0.02％NaN3的PBS)清洗3次后，在每個(gè)孔中加入100μL相應(yīng)的PS特異性(但是不與載體蛋白交叉反應(yīng))抗血清(用含有PBS、5％新生牛血清、0.02％NaN3的緩沖液1/100-1/250稀釋)。孵育過夜后，將板洗3次，與100μL結(jié)合了堿性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG Fc(在稀釋緩沖液中1/10,000稀釋)孵育3小時(shí)。清洗后(3x150μL)，將板與100μL對硝基苯磷酸(1mg/mL，在1 M Tris，pH 9.8，0.3mM MgCl2中)孵育30-180分鐘，使用讀板器在405nm測量ELISA讀數(shù)。減去背景之后，讀數(shù)代表了每個(gè)級份中被結(jié)合的PS，因?yàn)槲唇Y(jié)合的游離PS在板包被過程中不能粘附或附著到板上。因此證實(shí)了在聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合疫苗中所有的成分多糖種類的存在。
多糖-蛋白結(jié)合物在小鼠中的免疫原性 小鼠的免疫 除非指明，小鼠(NIH-Swiss；每組5或10只)在第0、14和28天用每種多糖(在PS混合物中或在通過結(jié)合方法A、B和C制備的結(jié)合物中)1μg/劑進(jìn)行免疫，并在第42天收集抗血清。進(jìn)行ELISA以測定針對相應(yīng)的天然多糖的抗體的水平。
測定抗體滴度的ELISA方法 將Immunolon I板(Dynatech)用100μL含有多糖(5μg/mL的Mn A、C、W 135或Y)的包被溶液包被18小時(shí)。在用150μL清洗緩沖液(含有0.05％Tween 20、0.02％NaN3的PBS)清洗3次后，在每個(gè)孔中加入100μL特異的抗血清樣品和參比血清(任意指定為3200單位/mL的抗多糖抗體；雙份)，從1/200開始進(jìn)行連續(xù)的兩倍稀釋(在肺炎球菌的情況下用含有PBS、4％新生牛血清、0.02％NaN3和2μg/mL細(xì)胞壁多糖的稀釋緩沖液稀釋)。孵育過夜后，將板洗3次，與100μL結(jié)合了堿性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG Fc(在稀釋緩沖液中1/10,000稀釋)孵育2小時(shí)。清洗后(3x150μL)，將板與100μL對硝基苯磷酸(1mg/mL，在1M Tris，pH 9.8，0.3mM MgCl2中)孵育30-45分鐘，用50μL 1N NaOH終止反應(yīng)。使用讀板器在405nm測量ELISA讀數(shù)，抗血清樣品的抗多糖抗體水平根據(jù)它們的ELISA讀數(shù)和在同樣的板中共同分析的參比血清的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算。計(jì)算每個(gè)小鼠組的抗體水平的幾何平均值。
測定抗體的生物功能性(殺菌滴度)的殺菌分析 通過誘導(dǎo)的抗血清對同源的細(xì)菌菌株的殺菌分析測定誘導(dǎo)的抗體的生物功能，根據(jù)的方法為[Maslanka SE，Gheesling LL，Libutti DE，Donaldson KB，Harakeh HS，Dykes JK等“腦膜炎奈瑟菌血清組A和C血清殺菌分析的標(biāo)準(zhǔn)化和多實(shí)驗(yàn)室比較”(Standardization and amultilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and Cserum bactericidal assays.)The Multilaboratory Study Group.Clin DiagnLab Immunol 1997；4(2)156-167]，做了少量的修改。簡單來說，首先將細(xì)菌在腦心浸液(BHI)/5％正常馬血清(NHS)平板上培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)移到新板上培養(yǎng)4-5小時(shí)。在來自新鮮的4-5小時(shí)培養(yǎng)物的DPBS中制備在530nm處透光率為80％的細(xì)菌懸浮液，將它用DPBS稀釋到50-80個(gè)菌落形成單位(CFU)/25μL(稀釋度為大約1∶50,000)。在制備細(xì)菌稀釋液的同時(shí)將補(bǔ)體在室溫融化，并保存在冰上直到使用。在96孔組織培養(yǎng)板中，用含有0.5mM MgCl2和0.9mM CaCl2的DPBS對測試和對照樣品進(jìn)行系列的2倍稀釋。在每個(gè)孔中加入25μL細(xì)菌懸浮液，然后加入25μL補(bǔ)體(Lot # 34426-A，Pel-Freez，Rogers，Aakansas)。在沒有CO2下在37℃孵育30分鐘后，每個(gè)孔中的10μL細(xì)菌懸浮液被鋪板。在5％CO2和37℃下孵育過夜后，對菌落計(jì)數(shù)。殺菌滴度是與含有補(bǔ)體但沒有抗血清的對照孔相比導(dǎo)致CFU減少50％的測試樣品的最高稀釋度。
具體實(shí)施例 在包括反應(yīng)時(shí)間、EDC濃度和氨基酸與氨基酸混合物的濃度的受控的條件下由碳二亞胺催化的用肼或酰肼進(jìn)行的蛋白活化 已經(jīng)報(bào)道了通過EDC催化的蛋白與肼或二酰肼的反應(yīng)傾向于導(dǎo)致產(chǎn)物的聚集和沉淀。調(diào)查了幾種將4mg/mL TT與0.36 M肼或ADH進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)條件，以獲得沒有沉淀的反應(yīng)產(chǎn)物。
不存在氨基酸的情況下的活化反應(yīng) 在不存在氨基酸的情況下，反應(yīng)在存在12-48mM EDC下進(jìn)行1-24小時(shí)。用30mM NaCl、10mM HEPES、pH 7.5對反應(yīng)混合物進(jìn)行緩沖液交換，并儲(chǔ)存在4℃。這些反應(yīng)的某些產(chǎn)物在反應(yīng)過程中或透析過的產(chǎn)物在4℃儲(chǔ)存1-8周之后形成了沉淀。測定了剩余的樣品的活化程度(DA；每個(gè)TT分子的酰肼基團(tuán)數(shù)量)，并列于表3中。某些這些產(chǎn)物的HPLC圖譜顯示在圖1中。
表3、不存在氨基酸的情況下從各種不同的活化條件下獲得的活化的破傷風(fēng)類毒素的活化程度(DA；每個(gè)TT分子的酰肼基團(tuán)數(shù)量)。
[EDC] 與肼的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) 與ADH的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) (mM)1 2 4 24 1 2424 12 -a - - (92)b 49--- 18 - (110) (81) (99) 24 - (83)(90) (107)---- 36 (77) (96)(102) (112)--75 66 48 - - - - -76 77 (103) a.對于顯示沉淀的樣品沒有測定DA。
b.括號(hào)中的數(shù)字是沒有沉淀但是在HPLC圖譜(圖1，A和B圖譜)中顯示出蛋白信號(hào)明顯降低的樣品的DA值。
在賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸以及賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸和半胱氨酸的混合物的存在下的活化反應(yīng) 破傷風(fēng)類毒素(4mg/mL)與0.36M肼或ADH的反應(yīng)由12和24mM EDC催化，在36、72和144mM氨基酸賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸或由等摩爾量的賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、谷氨酸和半胱氨酸組成的氨基酸混合物的存在下進(jìn)行1、2、4和24小時(shí)的反應(yīng)。測定了沒有沉淀的反應(yīng)產(chǎn)物的活化程度(DA)，并列于表4中。某些這些產(chǎn)物的HPLC圖譜顯示在圖2中。
表4、在氨基酸賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸或氨基酸混合物的存在下從各種不同的活化條件獲得的活化的破傷風(fēng)類毒素的活化程度(DA；每個(gè)TT分子的酰肼基團(tuán)數(shù)量)。
[EDC] 賴氨酸與肼的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí))與ADH的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) (mM) (mM) 1 24 241 2 424 12 36 -a-- - 47- -- 72 - -- - 394057 - 144 32-- - 344343 58 24 36 - (95)b(88) (93) - - (92) (90) 72 - -(103) (106) - - -- 144 - - - -- - -- [EDC] 精氨酸 與肼的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) 與ADH的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) (mM) (mM)12 4 24 124 24 12 36 -- - - 48 -- - 72 -- - - 40 46 56 - 14436 - - - 36 42 48 57 24 36 -(86) (83) (92)--(87)(93) 72 -- (105) (101) ---- 144-- - - ---- [EDC] 蘇氨酸 與肼的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) 與ADH的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) (mM) (mM)124 24 124 24 12 36 --- - 47 -- - 72 --- - 38 46 52- 144 35 -- - 32 42 4648 24 36 -(112)(88) (96)--(87) (88) 72 --- - --- - 144 --- - --- - [EDC] 絲氨酸 與肼的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) 與ADH的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) (mM) (mM)124 24 124 24 12 36 --- - 47 -- - 72 32 -- - 39 43 51 57 144 35 -- - 41 40 44 47 24 36 -(114)(82) (91) - -(91) (93) 72 --- -- -- - 144 --- -- -- - [EDC] 甘氨酸 與肼的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) 與ADH的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) (mM) (mM)124 24 124 24 12 36 --- -49 -- - 72 35 -- -37 45 4754 144 32 32 32 33 35 40 3947 24 36 --- ---- (82) 72 --- ---- - 144 --- ---- - [EDC] 組氨酸 與肼的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) 與ADH的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) (mM) (mM)124 24 124 24 12 36 41 -- -44 46 58- 72 28 36 46 -27 35 41 46 1442127 3039 24303340 24 36 - (85)- - - - - - 72 - - - - 22- - - 14465- 48- 404458- [EDC] 混合物 與肼的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) 與ADH的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) (mM) (mM) 1 2 4 241 2 4 24 12 36 40- - - 455162- 72 1212 13 1719171822 144108 9 1313131417 24 36 - - - - 48- - - 72 - - - - - - - - 1442629 27 - 50586480 a.對于顯示沉淀的樣品沒有測定DA。
b.括號(hào)中的數(shù)字是沒有沉淀但是在HPLC圖譜(圖2，圖譜A)中顯示出蛋白信號(hào)明顯降低的樣品的DA值。
谷氨酸(和天冬氨酸)存在下的活化反應(yīng) 破傷風(fēng)類毒素(4mg/mL)與0.36 M肼或ADH的反應(yīng)由12、24、48和72mM EDC催化，在36、72和144mM谷氨酸存在下反應(yīng)進(jìn)行1、2、4和24小時(shí)。測定了沒有沉淀的反應(yīng)產(chǎn)物的活化程度(DA)，并列于表5中。某些這些產(chǎn)物的HPLC圖譜顯示在圖3中。
表5、谷氨酸存在下從各種不同的活化條件獲得的活化的破傷風(fēng)類毒素的活化程度(DA；每個(gè)TT分子的酰肼基團(tuán)數(shù)量)。
[EDC] 谷氨酸 與肼的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí))與ADH的反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) (mM) (mM)1 24 241 2 4 24 12 36 19 21 262735353539 72 16 76 8 21212025 144 5 5121516171821 24363335-a - 41 37 3941 72232325 3036373641 144 172016 2330293334 4836- - - - - - - - 7249- - - - 544959 144 252627 3338394044 7236- (98)b (80)(92) - - - - 72- - --- - - - 144 343537 -46 46 4653 a.對于顯示沉淀的樣品沒有測定DA。
b.括號(hào)中的數(shù)字是沒有沉淀但是在HPLC圖譜中顯示出蛋白信號(hào)明顯降低的樣品的DA值。
多糖混合物與蛋白的結(jié)合 方法A——聯(lián)合的合成多價(jià)腦膜炎球菌A、C、W 135和Y群多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物批次ACWY040228a1 活化TT以含有酰肼基團(tuán) 1.破傷風(fēng)類毒素(4.2mg/mL)用0.42M肼在存在20mM EDC、0.1M MES、pH 6.5的情況下在20-24℃下活化。
2.反應(yīng)4小時(shí)后，用1 N NaOH將反應(yīng)混合物的pH升高到7.5-10以終止反應(yīng)。
3.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大約10.5對反應(yīng)混合物進(jìn)行緩沖液交換。
活化Mn A、C、W135和Y PS混合物以含有醛基 1.將Mn A、C、W135和Y PS混合物(10mg/mL總PS；2.5mg/mL每種成分PS)與6mM NaIO4在20-24℃下反應(yīng)4小時(shí)。
2.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用pH 7.5的10mM HEPES對樣品進(jìn)行透析。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物與活化的TT結(jié)合 1.通過冷凍干燥和溶解在0.04mL水中，將含有酰肼的TT的等份試樣(0.4mg)調(diào)整到10mg/mL。
2.通過冷凍干燥和溶解在0.04mL 0.2M HEPES、pH 7.5、30mMEDTA中，將含有醛的Mn A、C、W135和Y PS混合物的等份試樣調(diào)整到10mg/mL。
3.將活化的TT加入到等體積的活化的Mn PS混合物中并渦旋振蕩。
4.將反應(yīng)混合物在20-24℃下孵育過夜。
5.用6μL 1 M NaBH4(相當(dāng)于活化的PS中起始醛濃度的10倍摩爾量)將反應(yīng)混合物處理6小時(shí)。
6.使用截留分子量為12-14KDa的膜，用鹽水、10mM HEPES、pH 7.5、1mM EDTA的緩沖液對溶液進(jìn)行緩沖液交換。
7.測定透析的結(jié)合物的體積，根據(jù)投入的質(zhì)量計(jì)算蛋白(TT)和每種多糖(Mn A、C、W 135和Y)的濃度。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次ACWY040228a1的性質(zhì) 圖4顯示了結(jié)合物批次ACWY040228a1的HPSEC洗脫圖譜譜(在280nm處監(jiān)測)。在結(jié)合后，觀察到蛋白信號(hào)從17.5分鐘移向13分鐘，在結(jié)合后幾乎沒有留下未結(jié)合的游離蛋白。在HPLC圖譜中每個(gè)級份中每種腦膜炎球菌血清組A、C、W135或Y的結(jié)合多糖都通過使用相應(yīng)的特異性針對每種多糖的抗體進(jìn)行了ELISA檢測(圖5)。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次ACWY040228a1的免疫原性 結(jié)合物以1μg多糖/劑在第0、14和28天被用于免疫每組10只小鼠的組，天然多糖作為對照。通過ELISA測定的第三次注射后2周時(shí)誘導(dǎo)的抗體水平的幾何平均值(單位/mL)，對于對照組來說是Mn A為11(1，195；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為672(328，1379)、Mn W135為72(32，162)、Mn Y為298(105，844)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為9291(3535，24421)、Mn C為4080(1694，9824)、Mn W135為17450(9502，32050)、Mn Y為114429(60462，216566)，假定每種血清組PS的參比血清為3200單位/mL(表6)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的抗Mn PS特異性抗體高6-845倍。通過殺菌分析測定的在第三次注射后2周時(shí)誘導(dǎo)的殺菌滴度的幾何平均值，對于對照組來說是Mn A為329(113，598；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為329(163，668)、Mn W135為2743(1851，4066)、Mn Y為12958(10197，16559)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為9699(3373，27895)、Mn C為1657(854，3214)、Mn W135為6625(2076，21143)、Mn Y為77262(32824，181863)(表6b)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的殺菌滴度高2.4-29倍。
表6a、使用多價(jià)結(jié)合物批次ACWY040228a1中的每種Mn PS以1μg/劑對小鼠組(每組10只小鼠)進(jìn)行第三次免疫后2周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)的抗Mn PS抗體水平的幾何平均值a 多糖 天然PS混合物批次ACWY040228a1 增加的倍數(shù) A 11(1，195) 9291(3535，24421)845 C 672(328，1379) 4080(1694，9824) 6 W135 72(32，162)17450(9502，32050) 242 Y 298(105，844) 114429(60462，216566)384 a.與指定的抗Mn PS抗體水平為3200單位/mL的每種PS參比血清相比。
表6b、使用多價(jià)結(jié)合物批次ACWY040228a1中每種Mn PS 1μg/劑對小鼠組(每組10只小鼠)進(jìn)行第三次免疫后2周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)殺菌滴度的幾何平均值。
多糖天然PS混合物批次ACWY040228a1 增加的倍數(shù) A 329(113，598) 9699(3373，27895) 29 C 329(163，668) 1657(854，3214) 5 W1352743(1851，4066)6625(2076，21143) 2.4 Y 12958(10197，16559) 77262(32824，181863) 6 方法B——聯(lián)合的合成多價(jià)腦膜炎球菌A、C、W 135和Y群多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物批次ACWY040723B5 活化TT以含有酰肼基團(tuán) 1.破傷風(fēng)類毒素(4.2mg/mL)用0.42M肼在存在20mM EDC、0.1M MES、pH 6.5的情況下在20-24℃下活化。
2.反應(yīng)4小時(shí)后，用1 N NaOH將反應(yīng)混合物的pH升高到7.5-10以終止反應(yīng)。
3.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大約10.5對反應(yīng)混合物進(jìn)行緩沖液交換。
活化Mn A、C、W135和Y PS混合物以含有氰酸酯基團(tuán) 1.將Mn A、C、W135和Y PS混合物(0.04mL，10mg/mL總PS；2.5mg/mL每種成分PS)以5μL CDAP(100mg/mL，在乙腈中)在5μL 0.2M三乙胺存在下在20-24℃下活化2-2.5分鐘。
2.將活化的多糖與0.625mL冰冷的0.2M HEPES、pH 7.5、30mMEDTA混合，并馬上用于結(jié)合。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物與活化的TT結(jié)合 1.將活化的多糖加入到0.25mg活化的TT(冰冷，0.0.065mL，3.84mg/mL)中；渦旋振蕩。
2.將反應(yīng)混合物在4℃下輕輕搖動(dòng)孵育3個(gè)通宵。(延長孵育是為了確保剩余的殘留未反應(yīng)的氰酸酯基團(tuán)分解) 3.使用截留分子量為12-14KDa的膜，用鹽水、10mM HEPES、pH 7.5、1mM EDTA對溶液進(jìn)行緩沖液交換。
4.測定透析過的結(jié)合物的體積，根據(jù)投入的質(zhì)量計(jì)算蛋白(TT)和每種多糖(Mn A、C、W 135和Y)的濃度。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次ACWY040723B5的性質(zhì) 圖6顯示了結(jié)合物批次ACWY040723B5的HPSEC洗脫圖譜(在280nm處監(jiān)測)。在結(jié)合后，觀察到了蛋白信號(hào)從17.5分鐘移向14.5分鐘，在結(jié)合后留下了大量的未結(jié)合的游離蛋白。在HPLC圖譜的每個(gè)級份中每種腦膜炎球菌血清組A、C、W135或Y的結(jié)合多糖都通過使用相應(yīng)的特異性針對每種多糖的抗體進(jìn)行了ELISA檢測(圖7)。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次ACWY040723B5的免疫原性 結(jié)合物以1μg多糖/劑在第0、14和28天被用來免疫每組10只小鼠的組，天然多糖作為對照。通過ELISA測定的在第三次注射后2周時(shí)誘導(dǎo)的抗體水平的幾何平均值(單位/mL)，對于對照組來說是Mn A為11(1，195；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為672(328，1379)、Mn W135為72(32，162)、Mn Y為298(105，844)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為5214(2532，10739)、Mn C為6430(1797，23008)、Mn W135為8211(490，137609)、Mn Y為81833(26489，252808)，假定每種血清組PS的參比血清為3200單位/mL(表7)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的抗Mn PS特異性抗體高10-474倍。通過殺菌分析測定的在第三次注射后2周時(shí)誘導(dǎo)的殺菌滴度的幾何平均值，對于對照組來說是Mn A為329(113，598；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為329(163，668)、Mn W135為2743(1851，4066)、Mn Y為12958(10197，16559)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為1255(696，2263)、Mn C為3203(1536，6679)、Mn W135為33774(9346，122041)、Mn Y為171471(93450，314632)(表7b)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的殺菌滴度高4-13倍。
表7a、使用多價(jià)結(jié)合物批次ACWY040723B5中每種Mn PS 1μg/劑對小鼠組(每組10只小鼠)進(jìn)行第三次接種免疫后2周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)抗Mn PS抗體水平的幾何平均值a 多糖 天然PS混合物批次ACWY040723B5 增加的倍數(shù) A 11(1，195) 5214(2532，10739) 474 C 672(328，1379) 6430(1797，23008) 10 W135 72(32，162) 8211(490，137609) 114 Y 298(105，844) 81833(26489，252808) 275 a.與指定的抗Mn PS抗體水平為3200單位/mL的每種PS參比血清相比。
表7b、使用多價(jià)結(jié)合物批次ACWY040723B5中每種Mn PS 1μg/劑對小鼠組(每組10只小鼠)進(jìn)行第三次接種免疫后2周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)殺菌滴度的幾何平均值。
多糖天然PS混合物 批次ACWY040723B5 增加的倍數(shù) A 329(113，598)1255(696，2263) 4 C 329(163，668)3203(1536，6679) 10 W1352743(1851，4066) 33774(9346，122041) 12 Y 12995(10197，16559) 171471(93450，314632)13 方法C——聯(lián)合的合成多價(jià)腦膜炎球菌A、C、W 135和Y群多糖—破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物批次ACWY040723C5 活化TT以含有醛基基團(tuán) 1.破傷風(fēng)類毒素(4.2mg/mL)用0.42 M 1-氨基-2，3-丙二醇(APDO)在存在20mM EDC、0.1 M MES、pH 6.5的情況下在20-24℃下活化。
2.反應(yīng)4小時(shí)后，用1 N NaOH將反應(yīng)混合物的pH升高到7.5-10以終止反應(yīng)。
3.使用12-14 KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大約10.5對反應(yīng)混合物進(jìn)行緩沖液交換。
4.通過purpald分析[31]和Lowry分析[26]測定TT被APDO修飾的程度。
5.將TT-APDO的等份試樣與6mM NaIO4反應(yīng)3小時(shí)，然后用30mM NaCl、3mM Na2CO3、pH大約10.5進(jìn)行緩沖液交換。
活化Mn A、C、W135和Y PS混合物以含有酰肼基團(tuán) 1.將Mn A、C、W135和Y PS混合物(0.04mL，10mg/mL總PS；2.5mg/mL每種成分PS)用5μL CDAP(100mg/mL，在乙腈中)在5μL 0.2M三乙胺存在下在20-24℃下活化2-2.5分鐘。
2.在活化結(jié)束時(shí)，加入0.01mL pH 7的5M肼并混合。
3.將反應(yīng)混合物在20-24℃下孵育4小時(shí)。
4.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用pH 7.5的10mM HEPES對樣品進(jìn)行透析。
5.測定被活化的PS混合物的體積(0.12mL)。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物與活化的TT結(jié)合 1.將含有酰肼的Mn A、C、W135和Y PS混合物(0.5mg，0.12mL)與0.03mL pH 7.5的1M HEPES混合。
2.將含有醛的TT的等份試樣(0.5mg；0.148mL 3.38mg/mL)加入到活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物中。(總體積0.298mL) 3.將反應(yīng)混合物在20-24℃下孵育18小時(shí)。
4.將反應(yīng)混合物用5μL 1 M NaBH4處理6小時(shí)。
5.使用截留分子量為12-14KDa的膜，用鹽水、10mM HEPES、pH 7.5、1mM EDTA對溶液進(jìn)行緩沖液交換。
6.測定透析過的結(jié)合物的體積，根據(jù)投入的質(zhì)量計(jì)算蛋白(TT)和每種多糖(Mn A、C、W 135和Y)的濃度。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次ACWY040723C5的性質(zhì) 圖8顯示了結(jié)合物批次ACWY040723C5的HPSEC洗脫圖譜(在280nm處監(jiān)測)。在結(jié)合后，觀察到了蛋白信號(hào)從17.5分鐘移向14分鐘，在結(jié)合后留下了殘余的未結(jié)合的游離蛋白。在HPLC圖譜的每個(gè)級份中每種腦膜炎球菌血清組A、C、W135或Y的結(jié)合多糖都通過使用相應(yīng)的特異性針對每種多糖的抗體進(jìn)行了ELISA檢測(圖9)。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次ACWY040723C5的免疫原性 結(jié)合物以1μg多糖/劑在第0、14和28天被用來免疫每組10只小鼠的組，天然多糖作為對照。通過ELISA測定的在第三次注射后2周時(shí)誘導(dǎo)的抗體水平的幾何平均值(單位/mL)，對于對照組來說是Mn A為11(1，195；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為672(328，1379)、Mn W135為72(32，162)、Mn Y為298(105，844)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為17250(6786，43847)、Mn C為11035(5996，20309)、Mn W135為8321(3505，19755)、Mn Y為84643(46669，153517)，假定每種血清組PS的參比血清為3200單位/mL(表8)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的抗Mn PS特異性抗體高16-1568倍。通過殺菌分析測定的在第三次注射后2周時(shí)誘導(dǎo)的殺菌滴度的幾何平均值，對于對照組來說是Mn A為329(113，598；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為329(163，668)、Mn W135為2743(1851，4066)、Mn Y為12958(10197，16559)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為3941(921，16862)、Mn C為6860(2812，16733)、Mn W135為72403(39288，133431)、Mn Y為82832(43591，157400)(表8b)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的殺菌滴度高6-26倍。
表8a、使用多價(jià)結(jié)合物批次ACWY040723C5中每種Mn PS 1μg/劑對小鼠組(每組10只小鼠)進(jìn)行第三次免疫后2周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)抗Mn PS抗體水平的幾何平均值a 多糖 天然PS混合物批次ACWY040723C5 增加的倍數(shù) A 11(1，195) 17250(6786，43847) 1568 C 672(328，1379) 11035(5996，20309) 16 W135 72(32，162) 8321(3505，19755) 116 Y 298(105，844) 84643(46669，153517)284 a.與具有指定的抗Mn PS抗體水平為3200單位/mL的每種PS的對照血清相比，。
表8b、使用多價(jià)結(jié)合物批次ACWY040723C5中每種Mn PS 1μg/劑對小鼠組(每組10只小鼠)進(jìn)行第三次接種免疫后2周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)殺菌滴度的幾何平均值。
多糖天然PS混合物 批次ACWY040723C5增加的倍數(shù) A 329(113，598) 3941(921，16862)12 C 329(163，668) 6860(2812，16733) 21 W1352743(1851，4066) 72403(39288，133431)26 Y12958(10197，16559)82832(43591，157400)6 方法A——聯(lián)合的合成的多價(jià)腦膜炎球菌A、C、W 135和Y群多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物批次MnACWYTTD(K72)050131A6 活化TT以含有酰肼基團(tuán) 1.破傷風(fēng)類毒素(4.2mg/mL)用0.36M己二酸二酰肼在存在72mM賴氨酸、12mM EDC、0.1M MES、pH 5.5的情況下在20-24℃下活化。
2.反應(yīng)2小時(shí)后，使用12-14 KDa的透析膜在4℃下用30mMNaCl、10mM HEPES、pH大約7.5對反應(yīng)混合物進(jìn)行緩沖液交換。
3.測定樣品的體積，并計(jì)算被活化的TT的濃度(3.48mg/mL)。
活化Mn A、C、W135和Y PS混合物以含有醛基 1.將Mn A、C、W135和Y PS混合物(10mg/mL總PS；2.5mg/mL每種成分PS)與6mM NaIO4在4℃下反應(yīng)過夜。
2.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用pH 7.5的10mM HEPES對樣品進(jìn)行透析。
3.測定樣品的體積，并計(jì)算被活化的PS混合物的濃度(7.25mg/mL總PS)。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物與活化的TT結(jié)合 1.加入含有醛的Mn A、C、W135和Y PS混合物的等份試樣(1mg；0.138mL，7.25mg/mL)和0.0284 mL pH 7.5的1 M HEPES和0.0189mL 0.5 M EDTA。
2.將混合物置于冰上。
3.在冰上將含有酰肼的TT的等份試樣(1mg；0.288mL，3.475mg/mL)加入到活化的PS混合物中并混合。
4.將反應(yīng)混合物在4℃孵育過夜。
5.用10μL 1M NaBH4將反應(yīng)混合物處理6小時(shí)。
6.使用截留分子量為12-14KDa的膜，在4℃下用鹽水、10mMHEPES、pH 7.5、1mM EDTA對溶液進(jìn)行緩沖液交換。
7.測定透析過的結(jié)合物的體積，根據(jù)投入的質(zhì)量計(jì)算蛋白(TT)和每種多糖(Mn A、C、W135和Y)的濃度。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次MnACWYTTD(K72)050131A6的性質(zhì) 圖10顯示了結(jié)合物批次MnACWYTTD(K72)050131A6的HPSEC洗脫圖譜(在280nm處監(jiān)測)。在結(jié)合后，觀察到蛋白信號(hào)從17.5分鐘移向13分鐘，在結(jié)合后幾乎沒有留下未結(jié)合的游離蛋白。在HPLC圖譜的每個(gè)級份中每種腦膜炎球菌血清組A、C、W135或Y的結(jié)合多糖都通過使用相應(yīng)的特異性針對每種多糖的抗體進(jìn)行了ELISA檢測(圖11)。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次MnACWYTTD(K72)050131A6的免疫原性 結(jié)合物以每種多糖1μg/劑在第0、14和28天被用來免疫5只小鼠的組，天然多糖混合物(10只小鼠)作為對照。通過ELISA測定的在第三次注射后2周時(shí)誘導(dǎo)的抗體水平的幾何平均值(單位/mL)，對于對照組來說是Mn A為11(1，195；1SD置信區(qū)間)、Mn C為672(328，1379)、Mn W135為72(32，162)、Mn Y為298(105，844)，對于結(jié)合物來說是Mn A為8308(5282，13071)、Mn C為4090(1424，11746)、Mn W135為11314(5981，21403)、Mn Y為90779(63135，130528)，假定每種PS的參比血清為3200單位/mL(表9)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的抗Mn PS特異性抗體高6-305倍。
表9、使用多價(jià)結(jié)合物批次MnACWYTTD(K72)050131A6中每種Mn PS 1μg/劑對小鼠組(天然PS混合物對照組10只小鼠，實(shí)驗(yàn)組5只小鼠)進(jìn)行第三次接種免疫后2周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)抗Mn PS抗體水平的幾何平均值a 多糖天然PS混合物批次MnACWYTTD(K72)050131A6 增加的倍數(shù) A 11(1，195) 8308(5282，13071) 755 C 672(328，1379) 4090(1424，11746) 6 W13572(32，162) 11314(5981，21403) 157 Y 298(105，844) 90779(63135，130528)305 a.與指定抗Mn PS抗體水平為3200單位/mL的每種PS的參比血清相比。
方法B——聯(lián)合的合成多價(jià)腦膜炎球菌A、C、W 135和Y群多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物批次MnACWYTTD(K72)050201B6 活化TT以含有酰肼基團(tuán) 1.破傷風(fēng)類毒素(4.2mg/mL)用0.36 M己二酸二酰肼在存在72mM賴氨酸、12mM EDC、0.1 M MES、pH 5.5的情況下在20-24℃下活化。
2.反應(yīng)2小時(shí)后，使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mMNaCl、10mM HEPES、pH大約7.5對反應(yīng)混合物進(jìn)行緩沖液交換。
3。測定樣品的體積，并計(jì)算被活化的TT的濃度(3.48mg/mL)。
活化MnA、C、W135和Y PS混合物以含有氰酸酯基團(tuán) 1.將Mn A、C、W135和Y PS混合物(0.1mL，10mg/mL總PS；2.5mg/mL每種成分PS)用6μL CDAP(100mg/mL，于乙腈中)在6μL0.2M三乙胺存在下在20-24℃活化2-2.5分鐘。
2.將活化的多糖與1.25mL冰冷的0.2M HEPES、pH 7.5、30mMEDTA溶液混合，并馬上用于結(jié)合。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物與活化的TT結(jié)合 1.將活化的多糖加入到0.5mg活化的TT(冰冷的，0.144mL，3.84mg/mL)中；渦旋振蕩。
2.將反應(yīng)混合物在4℃下輕輕搖動(dòng)孵育3個(gè)通宵。(延長孵育是為了確保剩余的殘留未反應(yīng)的氰酸酯基團(tuán)分解) 3.使用截留分子量為12-14Kda的膜，用鹽水、10mM HEPES、pH 7.5、1mM EDTA對溶液進(jìn)行緩沖液交換。
4.測定透析過的結(jié)合物的體積，根據(jù)投入的質(zhì)量計(jì)算蛋白(TT)和每種多糖(Mn A、C、W 135和Y)的濃度。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次MnACWYTTD(K72)050201B6的性質(zhì) 圖12顯示了結(jié)合物批次MnACWYTTD(K72)050201B6的HPSEC洗脫圖譜(在280nm處監(jiān)測)。在結(jié)合后，觀察到蛋白信號(hào)從17.5分鐘移向14和16分鐘，在結(jié)合后留下了相當(dāng)量的未結(jié)合的游離蛋白。在HPLC圖譜的每個(gè)級份中每種腦膜炎球菌血清組A、C、W135或Y的結(jié)合多糖都通過使用相應(yīng)的特異性針對每種多糖的抗體進(jìn)行了ELISA檢測(圖13)。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次MnACWYTTD(K72)050201B6的免疫原性 結(jié)合物以每種多糖1μg/劑在第0、14和28天被用來免疫5只小鼠的組，天然多糖混合物(10只小鼠)作為對照。通過ELISA測定的在第三次注射后2周時(shí)誘導(dǎo)的抗體水平的幾何平均值(單位/mL)，對于對照組來說是Mn A為11(1，195；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為672(328，1379)、Mn W135為72(32，162)、Mn Y為298(105，844)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為2752(1355，5589)、Mn C為2930(1190，7212)、Mn W135為4755(1455，15542)、Mn Y為22494(10466，48347)，假定每種PS的參比血清為3200單位/mL(表10)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的抗Mn PS特異性抗體高4-250倍。
表10、使用多價(jià)結(jié)合物批次MnACWYTTD(K72)050201B6中的每種Mn PS 1μg/劑對小鼠組(天然PS混合物對照組10只小鼠，實(shí)驗(yàn)組5只小鼠)進(jìn)行第三次接種免疫后2周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)抗Mn PS抗體水平的幾何平均值a 多糖天然PS混合物 批次MnACWYTTD(K72)050201B6 增加的倍數(shù) A 11(1，195)2752(1355，5589)250 C 672(328，1379)2930(1190，7212)4 W13572(32，162) 4755(1455，15542) 66 Y298(105，844)22494(10466，48347) 75 a.與指定抗Mn PS抗體水平為3200單位/mL的每種PS的參比血清相比。
方法A——聯(lián)合的合成多價(jià)腦膜炎球菌A、C、W 135和Y群多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物批次TTHACWY061126 活化TT以含有酰肼基團(tuán) 1.破傷風(fēng)類毒素(4.2mg/mL)用0.42M肼在存在20mM EDC、的0.1 M MES、pH 5.5的情況下在20-24℃下活化。
2.反應(yīng)4小時(shí)后，用1 N NaOH將反應(yīng)混合物的pH升高到7.5-10以終止反應(yīng)。
3.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大約10.5對反應(yīng)混合物進(jìn)行緩沖液交換。
用NaIO4活化個(gè)體Mn A、C、W135和Y PS以含有醛基 1.將Mn A PS(10mg/mL)用15mM NaIO4在4℃活化72小時(shí)，用25mM甘油淬滅并在4℃下用水透析。
2.將Mn C PS(10mg/mL)用6mM NaIO4在室溫活化4小時(shí)，用25mM甘油淬滅并在4℃下用水透析。
3.將Mn W135 PS(10mg/mL)用3mM NaIO4在4℃活化過夜，用25mM甘油淬滅并在4℃下用水透析。
4.將Mn Y PS(10mg/mL)用3mM NaIO4在4℃活化過夜，用25mM甘油淬滅并在4℃下用水透析。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物與活化的TT結(jié)合 1.將活化的含醛Mn A、C、W135和Y PS的等份試樣以1∶1∶1∶1的比例混合(W/W，總PS＝0.1mg)。
2.將PS混合物置于冰上并與1μL pH6的1 M MES混合。
3.將PS的總體積用冰冷的水調(diào)整到36.8μL。
4.在冰上將含有酰肼的TT的等份試樣(1mg；29.9μL，3.41mg/mL)加入到活化的PS混合物中并混合。
5.將反應(yīng)混合物在4℃孵育兩個(gè)通宵。
6.加入1μL pH6.5的1M MES。
7.用2μL 1M NaBH4將反應(yīng)混合物在4℃處理過夜。
8.使用截留分子量為12-14KDa的膜，在4℃下用鹽水、10mMHEPES、pH 7.5、1mM EDTA對溶液進(jìn)行緩沖液交換。
9.測定透析的結(jié)合物的體積，根據(jù)投入的質(zhì)量計(jì)算蛋白(TT)和每種多糖(Mn A、C、W 135和Y)的濃度。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次TTHACWY061126的性質(zhì) 結(jié)合物批次TTHACWY061126進(jìn)行了HPSEC洗脫圖譜分析(在280nm處監(jiān)測)。在結(jié)合后，觀察到蛋白信號(hào)從17.5分鐘移向14分鐘，在結(jié)合后幾乎沒有留下未結(jié)合的游離蛋白。在HPLC圖譜的每個(gè)級份中每種腦膜炎球菌血清組A、C、W135或Y的結(jié)合多糖都通過使用相應(yīng)的特異性針對每種多糖的抗體進(jìn)行了ELISA檢測(圖14)。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次TTHACWY061126的免疫原性 結(jié)合物以每種多糖1μg/劑在第0、14和28天被用來免疫一組15只小鼠，天然多糖混合物(5只小鼠)作為對照。通過ELISA測定的在第三次注射后2周時(shí)誘導(dǎo)的抗體水平的幾何平均值(單位/mL)，對于對照組來說是Mn A為108(39，296；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為416(221，784)、Mn W135為52(29，96)、Mn Y為386(232，644)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為29819(18049，49266)、Mn C為1319(372，4674)、Mn W135為11075(4610，26607)、Mn Y為39901(24295，65530)，假定每種PS的參比血清為3200單位/mL(表11a)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的抗Mn PS特異性抗體高了3-268倍。通過殺菌分析測定的在第三次注射后2周時(shí)誘導(dǎo)的殺菌滴度的幾何平均值，對于對照組來說是Mn A為394(114，1358；1SD置信區(qū)間)、Mn C為226(97，529)、Mn W135為10396(6146，17585)、Mn Y為9050(9050，9050)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為12125(3800，38689)、Mn C為1811(621，5282)、Mn W135為89595(28643，280251)、Mn Y為128062(25097，653452)(表11b)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的殺菌滴度高了8-31倍。
表11a、使用多價(jià)結(jié)合物批次TTHACWY061126中每種Mn PS 1μg/劑對小鼠組(天然PS混合物對照5只小鼠，實(shí)驗(yàn)組15只小鼠)進(jìn)行第三次接種免疫后2周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)抗Mn PS抗體水平的幾何平均值a 多糖 天然PS混合物 批次TTHACWY061126 增加的倍數(shù) A 108(39，296) 29819(18049，49266)268 C 416(221，784) 1319(372，4674)3 W135 52(29，96) 11075(4610，26607) 213 Y 386(232，644) 39901(24295，65530)103 a.與指定抗Mn PS抗體水平為3200單位/mL的每種PS的參比血清相比，。
表11b、使用多價(jià)結(jié)合物批次TTHACWY061126中每種Mn PS 1μg/劑對小鼠組(天然PS混合物對照5只小鼠，實(shí)驗(yàn)組1 5只小鼠)進(jìn)行第三次接種免疫后2周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)殺菌滴度的幾何平均值。
多糖 天然PS混合物批次TTHACWY061126增加的倍數(shù) A394(114，1358) 12125(3800，38689) 31 C226(97，529)1811(621，5282) 8 W135 10396(6146，17585) 89595(28643，280251) 9 Y9050(9050，9050)128062(25097，653452)14 方法B——聯(lián)合的合成多價(jià)腦膜炎球菌A、C、W 135和Y群多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物批次TTHVIIACWYa060922B(2:2) 活化TT以含有酰肼基團(tuán) 1.破傷風(fēng)類毒素(4.2mg/mL)用0.42 M肼在存在30mM EDC、0.1 M MES、pH 5.5的情況下在20-24℃下活化。
2.反應(yīng)1小時(shí)后，用1 N NaOH將反應(yīng)混合物的pH升高到7.5-10以終止反應(yīng)。
3.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大約10.5對反應(yīng)混合物進(jìn)行緩沖液交換。
活化Mn A、C、W135和Y PS混合物以含有氰酸酯基團(tuán) 將Mn A、C、W135和Y PS混合物(1∶1∶1∶1，W/W；0.0125mL，10mg/mL)用0.75μL CDAP(100mg/mL，在乙腈中)在0.5μL 0.2M三乙胺存在下在20-24℃下活化2-2.5分鐘。
活化的MnA、C、W135和Y PS混合物與活化的TT的結(jié)合 1.將活化的多糖與50μL冰冷的pH 7.4的2x PBS混合，然后加入0.125mg TTH(32.3μL，3.87mg/mL，冰冷的)。
2.將反應(yīng)混合物在4℃下輕輕搖動(dòng)孵育3個(gè)通宵。(延長孵育是為了確保結(jié)合完全以及剩余的殘留未反應(yīng)的氰酸酯基團(tuán)分解) 3.使用截留分子量為12-14KDa的膜，用鹽水、10mM HEPES、pH 7.5、1mM EDTA對溶液進(jìn)行緩沖液交換。
4.測定透析的結(jié)合物的體積，根據(jù)投入的質(zhì)量計(jì)算蛋白(TT)和每種多糖(Mn A、C、W135和Y)的濃度。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次TTHVIIACWYa060922B(2:2)的性質(zhì) 結(jié)合物批次TTHVIIACWYa060922B(2:2)通過HPSEC洗脫圖譜(在280nm處監(jiān)測)分析。在結(jié)合后，觀察到蛋白信號(hào)從17.5分鐘移向14分鐘，在結(jié)合后幾乎沒有留下未結(jié)合的游離蛋白。在HPLC圖譜的每個(gè)級份中每種腦膜炎球菌血清組A、C、W135或Y的結(jié)合多糖都通過使用相應(yīng)的特異性針對每種多糖的抗體進(jìn)行了ELISA檢測。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次TTHVIIACWYa060922B(2:2)的免疫原性 結(jié)合物以每種多糖1μg/劑在第0、14和28天被用來免疫一組5只小鼠，天然多糖作為對照。通過ELISA測定的在第三次注射后2周時(shí)誘導(dǎo)的抗體水平的幾何平均值(單位/mL)，對于對照來說是Mn A為108(39，296；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為416(221，784)、Mn W135為52(29，96)、Mn Y為386(232，644)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為24828(16738，36829)、Mn C為10641(6118，18506)、Mn W135為15068(7374，30788)、Mn Y為99827(56810，175416)，假定每種PS的參比血清為3200單位/mL(表1 2a)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的抗Mn PS特異性抗體高了26-290倍。通過殺菌分析測定的在第三次注射后2周時(shí)誘導(dǎo)的殺菌滴度的幾何平均值，對于對照組來說是Mn A為394(114，1358；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為226(97，529)、Mn W135為10396(6146，17585)、Mn Y為9050(9050，9050)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為5970(3212，11099)、Mn C為19400(8185，45985)、Mn W135為68593(19473，241620)、Mn Y為111431(45134，275106)(表12b)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的殺菌滴度高了7-86倍。
表12a、使用多價(jià)結(jié)合物批次TTHVIIACWYa060922B(2:2)中每種Mn PS 1μg/劑對小鼠組(天然PS混合物對照5只小鼠，實(shí)驗(yàn)組5只小鼠)進(jìn)行第三次接種免疫后2周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)抗Mn PS抗體水平的幾何平均值a 多糖 天然PS混合物 批次增加的倍數(shù) TTHVIIACWYa060922B(2:2) A 108(39，296) 24828(16738，36829) 230 C 416(221，784)10641(6118，18506) 26 W135 52(29，96) 15068(7374，30788) 290 Y 386(232，644)99827(56810，175416)259 a.與指定抗Mn PS抗體水平為3200單位/mL的每種PS的參比血清相比。
表12b、使用多價(jià)結(jié)合物批次TTHVIIACWYa060922B(2:2)中每種Mn PS 1μg/劑對小鼠組(每組5只小鼠)進(jìn)行第三次接種免疫后2周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)殺菌滴度的幾何平均值。
多糖天然PS混合物 批次TTHVIIACWYa060922B(2:2)增加的倍數(shù) A 394(114，1358)5970(3212，11099) 15 C 226(97，529) 19499(8185，45985) 86 W13510396(6146，17585)68593(19473，241620) 7 Y 9050(9050，9050) 111431(45134，275106) 12 方法A——聯(lián)合的合成多價(jià)腦膜炎球菌A、C、W 135和Y群多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物批次TTH2C/A/WY070209 活化TT以含有酰肼基團(tuán) 1.破傷風(fēng)類毒素(4.2mg/mL)用0.42M肼在存在20mM EDC、0.1M MES、pH 5.5的情況下在20-24℃下活化。
2.反應(yīng)4小時(shí)后，用1 N NaOH將反應(yīng)混合物的pH升高到7.5-10以終止反應(yīng)。
3.使用12-14 KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大約10.5對反應(yīng)混合物進(jìn)行緩沖液交換。
用NaIO4活化個(gè)體Mn A、C、W135和Y PS以含有醛基 1.將Mn A PS(10mg/mL)用15mM NaIO4在4℃活化72小時(shí)，用25mM甘油淬滅并在4℃下用水透析。
2.將Mn C PS(10mg/mL)用6mM NaIO4在室溫活化4小時(shí)，用25mM甘油淬滅并在4℃下用水透析。
3.將Mn W135 PS(10mg/mL)用3mM NaIO4在4℃活化過夜，用25 mM甘油淬滅并在4℃下用水透析。
4.將Mn Y PS(10mg/mL)用3mM NaIO4在4℃活化過夜，用25mM甘油淬滅并在4℃下用水透析。
活化的Mn A、C、W135和Y PS混合物與活化的TT結(jié)合 1.活化的Mn C PS的等份試樣(0.1mg)被冷凍干燥并重新溶解在1μL pH6的1 M MES中。
2.含有酰肼的TT的等份試樣(0.2mg)被冷凍干燥并重新溶解在2μL水中。
3.在第—天在4℃下將蛋白溶液加入到活化的Mn C PS溶液中；混合；在4℃孵育過夜。
4.在第二天在4℃下將2-7μL的0.05mg活化的Mn A PS加入到含有酰肼的TT/活化的Mn C PS反應(yīng)混合物中；混合；在4℃孵育過夜。
5.在第三天在4℃下，將冰冷的鹽水和0.05mg每種活化的MnW135和Y PS加入到第(4)步的反應(yīng)混合物中，使總體積為200μL；混合；在4℃孵育過夜。
6.加入2μL pH6.5的1 M MES。
7.用3μL1 M NaBH4將反應(yīng)混合物在4℃處理過夜。
8.使用截留分子量為12-14KDa的膜，在4℃下用鹽水、10mMHEPES、pH 7.5、1mM EDTA對溶液進(jìn)行緩沖液交換。
9.測定透析的結(jié)合物的體積，根據(jù)投入的質(zhì)量計(jì)算蛋白(TT)和每種多糖(Mn A、C、W 135和Y)的濃度。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次TTH2C/A/WY070209的性質(zhì) 結(jié)合物批次TTH2C/A/WY070209通過HPSEC洗脫圖譜(在280nm處監(jiān)測)分析。在結(jié)合后，觀察到蛋白信號(hào)從17.5分鐘移向14分鐘，在結(jié)合后幾乎沒有留下未結(jié)合的游離蛋白。在HPLC圖譜的每個(gè)級份中每種腦膜炎球菌血清組A、C、W135或Y的結(jié)合多糖都通過使用相應(yīng)的特異性針對每種多糖的抗體進(jìn)行了ELISA檢測(圖15)。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次TTH2C/A/WY070209的免疫原性 結(jié)合物在第0、7和14天被用來免疫一組15只小鼠，使用天然多糖混合物(5只小鼠)作為對照，對于Mn A、W 135和Y來說為每種PS 0.1μg/劑，對于Mn C來說為0.2μg/劑。通過ELISA測定的在第三次注射后1周時(shí)誘導(dǎo)的抗體水平的幾何平均值(單位/mL)，對于對照組來說是Mn A為1(1，1；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為34(10，109)、Mn W135為1(1，1)、Mn Y為28(5，166)，對于結(jié)合物來說是Mn A為10303(5480，19371)、Mn C為12815(7350，22343)、Mn W135為3111(1490，6494)、Mn Y為9457(4280，20894)，假定每種PS的參比血清為3200單位/mL(表13a)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的抗Mn PS特異性抗體高了338-10303倍。通過殺菌分析測定的在第三次注射后1周時(shí)誘導(dǎo)的殺菌滴度的幾何平均值，對于對照組來說是Mn A為260(127，533；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為92(76，111)、Mn W135為858(587，1254)、Mn Y為462(53，3998)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為4321(2192，8521)、Mn C為1755(931，3310)、Mn W135為20030(4288，93566)、Mn Y為7728(2811，21244)(表13b)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的殺菌滴度高了17-23倍。
表13a、使用多價(jià)結(jié)合物批次TTH2C/A/WY070209中Mn A、W 135和Y每種PS 0.1μg/劑和Mn C 0.2μg/劑對小鼠組(天然PS混合物對照5只小鼠，實(shí)驗(yàn)組15只小鼠)進(jìn)行第三次接種免疫后1周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)抗Mn PS抗體水平的幾何平均值a。
多糖 天然PS混合物批次TTH2C/A/WY070209增加的倍數(shù) A1(1，1) 10303(5480，19371) 10303 C34(10，109) 12815(7350，22343) 377 W135 1(1，1) 3111(1490，6494)3111 Y28(5，166) 9457(4280，20894) 338 a.與指定抗Mn PS抗體水平為3200單位/mL的每種PS的參比血清相比。
表13b、使用多價(jià)結(jié)合物批次TTH2C/A/WY070209中Mn A、W 135和Y每種PS 0.1μg/劑和Mn C 0.2μg/劑對小鼠組(天然PS混合物對照5只小鼠，實(shí)驗(yàn)組15只小鼠)進(jìn)行第三次接種免疫后1周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)殺菌滴度的幾何平均值。
多糖 天然PS混合物批次TTH2C/A/WY070209增加的倍數(shù) A260(127，533) 4321(2192，8521)17 C92(76，111) 1755(931，3310) 19 W135 858(587，1254) 20030(4288，93566) 23 Y462(53，3998) 7728(2811，21244) 17 方法B——聯(lián)合的合成多價(jià)腦膜炎球菌A、C、W 135和Y群多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物批次TTHIAC/WY070210B(2:2) 活化TT以含有酰肼基團(tuán) 1.破傷風(fēng)類毒素(4.2mg/mL)用0.42 M肼在存在30mM EDC、0.1 M MES、pH 5.5的情況下在20-24℃下活化。
2.反應(yīng)3小時(shí)后，用1 N NaOH將反應(yīng)混合物的pH升高到7.5-10以終止反應(yīng)。
3.使用12-14KDa的透析膜在4℃下用30mM NaCl、3mMNa2CO3、pH大約10.5對反應(yīng)混合物進(jìn)行緩沖液交換。
活化Mn A和C PS混合物以含有氰酸酯基團(tuán) 將Mn A和C PS混合物(1∶1，W/W；0.025mL，10mg/mL)用1.5μL CDAP(100mg/mL，在乙腈中)在1μL 0.2M三乙胺存在下在20-24℃下活化2-2.5分鐘。
活化的Mn A和C PS混合物與活化的TT結(jié)合 1.將活化的多糖與200μL冰冷的pH 7.4的2x PBS混合，然后加入0.5mg冰冷的TTH。
2.將反應(yīng)混合物在4℃下輕輕搖動(dòng)孵育過夜。
活化Mn W1 35和Y PS混合物以含有氰酸酯基團(tuán) 將Mn W135和Y PS混合物(1∶1，W/W；0.025mL，10mg/mL)用1.5μL CDAP(100mg/mL，在乙腈中)在1μL 0.2M三乙胺存在下在20-24℃下活化2-2.5分鐘。
活化的Mn W135和Y PS混合物與活化的TT在TTH+活化的Mn A和C反應(yīng)混合物中的結(jié)合 1.將活化的Mn W135和Y混合物與TTH+活化的Mn A和C反應(yīng)混合物在冰上混合。
2.將反應(yīng)混合物在4℃下輕輕搖動(dòng)孵育3個(gè)通宵。(延長孵育是為了確保結(jié)合完全以及剩余的殘留未反應(yīng)的氰酸酯基團(tuán)分解) 3.使用截留分子量為12-14KDa的膜，用鹽水、10mM HEPES、pH 7.5、1mM EDTA對溶液進(jìn)行緩沖液交換。
4.測定透析的結(jié)合物的體積，根據(jù)投入的質(zhì)量計(jì)算蛋白(TT)和每種多糖(Mn A、C、W 135和Y)的濃度。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次TTHIAC/WY070210B(2:2)的性質(zhì) 結(jié)合物批次TTHIAC/WY070210B(2:2)通過HPSEC洗脫圖譜(在280nm處監(jiān)測)分析。在結(jié)合后，觀察到蛋白信號(hào)從17.5分鐘移向14分鐘，在結(jié)合后幾乎沒有留下未結(jié)合的游離蛋白。在HPLC圖譜的每個(gè)級份中每種腦膜炎球菌血清組A、C、W135或Y的結(jié)合多糖通過使用相應(yīng)的特異性針對每種多糖的抗體進(jìn)行了ELISA檢測。
聯(lián)合的合成多價(jià)結(jié)合物批次TTHIAC/WY070210B(2:2)的免疫原性 結(jié)合物以每種多糖0.1μg/劑在第0、7和14天被用來免疫一組5只小鼠，使用天然多糖作為對照。通過ELISA測定的在第三次注射后1周時(shí)誘導(dǎo)的抗體水平的幾何平均值(單位/mL)，對于對照組來說是Mn A為1(1，1；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為34(10，109)、Mn W135為1(1，1)、Mn Y為28(5，166)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為5873(3966，8699)、Mn C為3465(2109，5695)、Mn W135為3798(2090，6900)、Mn Y為22423(11933，42133)，假定每種PS的參比血清為3200單位/mL(表14a)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的抗Mn PS特異性抗體高了102-5873倍。通過殺菌分析測定的在第三次注射后1周時(shí)誘導(dǎo)的殺菌滴度的幾何平均值，對于對照組來說是Mn A為260(127，533；1 SD置信區(qū)間)、Mn C為92(76，111)、Mn W135為858(587，1254)、Mn Y為462(53，3998)，對于結(jié)合物組來說是Mn A為4127(2196，7756)、Mn C為1331(588，3010)、Mn W135為38508(17971，82515)、Mn Y為11506(7700，17194)(表14b)。與天然的Mn PS對照相比，結(jié)合物在小鼠中誘導(dǎo)的殺菌滴度高了14-45倍。
表14a、使用多價(jià)結(jié)合物批次TTHIAC/WY070210B(2:2)中每種Mn PS 0.1μg/劑對小鼠組(天然PS混合物對照5只小鼠，實(shí)驗(yàn)組5只小鼠)進(jìn)行第三次接種免疫后1周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)抗Mn PS抗體水平的幾何平均值a。
多糖天然PS混合物批次 增加的倍數(shù) TTHIAC/WY070210B(2:2) A 1(1，1)5873(3966，8699)5873 C 34(10，109)3465(2109，5695)102 W1351(1，1)3798(2090，6900)3798 Y 28(5，166) 22423(11933，42133)801 a.與指定抗Mn PS抗體水平為3200單位/mL的每種PS的參比血清相比。
表14b、使用多價(jià)結(jié)合物批次TTHIAC/WY070210B(2:2)中每種Mn PS 0.1μg/劑對小鼠組(每組5只小鼠)進(jìn)行第三次接種免疫后1周時(shí)，在1個(gè)SD置信區(qū)間內(nèi)殺菌滴度的幾何平均值。
多糖 天然PS混合物 批次 增加的倍數(shù)TTHIAC/WY070210B(2:2) A 260(127，533)4127(2196，7756) 16 C 92(76，111) 1331(588，3010)14 W135 858(587，1254) 38508(17971，82515)45 Y 462(53，3998)11506(7700，17194) 25 鑒于可以應(yīng)用本發(fā)明公開的原理的許多可能的實(shí)施方案，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到所說明的實(shí)施方案僅僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，而不應(yīng)該被當(dāng)作對本發(fā)明的范圍的限制。相反，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求來限定。因此我們對所有在這些權(quán)利要求的范圍和精神之內(nèi)的發(fā)明要求權(quán)利。
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35.Pierce目錄2003-2004，241和305頁。
36.國際專利2005/014037 A權(quán)利要求
1.用于制造復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物的方法，包括
將多種免疫原性不同的多糖與氧化劑進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生多種醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物；
將至少一種蛋白與肼、碳酰肼、鹽酸肼、二酰肼或其混合物在足以產(chǎn)生至少一種酰肼活化的蛋白的溶液條件下進(jìn)行反應(yīng)；
將多種醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物與至少一種酰肼活化的蛋白在pH大約5到大約8下相接觸，使得多種醛活化的免疫原性不同的多糖同時(shí)與至少一種酰肼活化的蛋白發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生復(fù)合的多價(jià)結(jié)合物，該結(jié)合物含有在每種結(jié)合的免疫原性不同的多糖和蛋白之間形成的至少一個(gè)C＝N雙鍵；以及
將基本上所有的復(fù)合的多價(jià)結(jié)合物的C＝N雙鍵還原成C-N鍵，產(chǎn)生復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1中的方法，其中至少一種酰肼活化的蛋白在中性pH下基本可溶。
3.權(quán)利要求1中的方法，其中在含有多種醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物和至少一種酰肼活化蛋白的組合物中，實(shí)現(xiàn)了所述多種醛活化的免疫原性不同的多糖與至少一種酰肼活化蛋白的同時(shí)反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1中的方法，其中多種醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物與至少一種酰肼活化蛋白的接觸和C＝N雙鍵的還原包括在硼氫化鈉的存在下提供多種由醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物與至少一種酰肼活化蛋白形成的組合物。
5.權(quán)利要求2中的方法，其中至少一種蛋白與肼、碳酰肼、鹽酸肼、二酰肼或其混合物在(i)碳二亞胺以及(ii)至少一種氨基酸、至少一種肽、或至少一種氨基酸與至少一種肽的混合物存在下進(jìn)行反應(yīng)。
6.權(quán)利要求5中的方法，其中氨基酸選自賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的至少一種。
7.權(quán)利要求1中的方法，其中至少一種蛋白與肼、碳酰肼、琥珀酰二酰肼、己二酸二酰肼或其混合物在碳二亞胺鹽酸鹽存在下在pH大約6到大約7下反應(yīng)以獲得酰肼活化的蛋白的溶液，并且還包括對酰肼活化蛋白的溶液進(jìn)行緩沖液交換，使pH達(dá)到大約10.0到大約11.0。
8.權(quán)利要求1中的方法，其中至少一種蛋白與肼、碳酰肼、琥珀酰二酰肼、己二酸二酰肼或其混合物在碳二亞胺鹽酸鹽存在下在pH大約5.5到大約6.5下反應(yīng)以獲得酰肼活化的蛋白的溶液，并且還包括對酰肼活化的蛋白的溶液進(jìn)行緩沖液交換，使pH達(dá)到大約10.0到大約11.0。
9.權(quán)利要求1中的方法，其中2-28種醛活化的免疫原性不同的多糖同時(shí)與至少一種酰肼活化的蛋白反應(yīng)。
10.權(quán)利要求9中的方法，其中免疫原性不同的多糖選自腦膜炎球菌(Meningococcal)多糖、肺炎球菌(Pneumococcal)多糖、b型流感嗜血桿菌(Hemophilus influenzae type b)多糖、傷寒沙門氏菌(Salmonnella typhi)Vi多糖和B類鏈球菌(group B Streptococcus)多糖。
11.權(quán)利要求1中的方法，其中免疫原性不同的多糖選自A群腦膜炎球菌、C群腦膜炎球菌、W135群腦膜炎球菌和Y群腦膜炎球菌。
12.權(quán)利要求1中的方法，其中醛活化的免疫原性不同的多糖與單個(gè)的酰肼活化的蛋白反應(yīng)。
13.權(quán)利要求1中的方法，其中醛活化的免疫原性不同的多糖與多種不同的酰肼活化的蛋白反應(yīng)。
14.權(quán)利要求5中的方法，其中碳二亞胺是1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
15.權(quán)利要求7中的方法，其中碳二亞胺是1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
16.權(quán)利要求1中的方法，其中免疫原性不同的多糖的混合物與氧化劑反應(yīng)。
17.權(quán)利要求1中的方法，其中每種免疫原性不同的多糖最初與氧化劑反應(yīng)，然后將獲得的個(gè)體醛活化的免疫原性不同的多糖混合在一起，形成醛活化的免疫原性不同的多糖的混合物。
18.制造復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物的方法，包括
將多種免疫原性不同的多糖與氰基化試劑進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生多種氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物；
將至少一種蛋白與肼、碳酰肼、鹽酸肼、二酰肼或其混合物在足以產(chǎn)生至少一種肼活化的蛋白的溶液條件下進(jìn)行反應(yīng)；以及
將多種氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物與至少一種酰肼活化的蛋白在pH大約6到8大約下相接觸，使得多種氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖同時(shí)與至少一種酰肼活化的蛋白發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物，該結(jié)合物含有在每種結(jié)合的免疫原性不同的多糖和蛋白之間形成的至少一個(gè)C-N鍵。
19.權(quán)利要求18中的方法，其中氰基化試劑選自1-氰基-4-二甲基銨吡啶四氟硼酸鹽、溴化氰或N-氰基-N，N，N-三乙基銨四氟硼酸鹽。
20.權(quán)利要求18中的方法，其中在含有多種氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物和至少一種酰肼活化的蛋白的組合物中，實(shí)現(xiàn)了多種氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖與至少一種酰肼活化的蛋白同時(shí)反應(yīng)。
21.權(quán)利要求18中的方法，其中多種氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物與至少一種酰肼活化的蛋白的接觸包括制備含有多種氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的混合物與至少一種酰肼活化的蛋白的反應(yīng)組合物。
22.權(quán)利要求18中的方法，還包括將第二多種第二種免疫原性不同的多糖與氰基化試劑進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生多種第二種氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的第二混合物；以及
將多種氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖的第二混合物與復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物相接觸，從而在每種第二種氰酸酯活化的免疫原性不同的多糖和蛋白之間形成至少一個(gè)C-N鍵。
23.權(quán)利要求22中的方法，其中第二種免疫原性不同的多糖與氰基化試劑的反應(yīng)性比第一種免疫原性不同的多糖與氰基化試劑的反應(yīng)性高。
24.權(quán)利要求23中的方法，其中第一種免疫原性不同的多糖選自A群腦膜炎球菌或C群腦膜炎球菌的至少一種。
25.權(quán)利要求23中的方法，其中第二種免疫原性不同的多糖選自W135群腦膜炎球菌或Y群腦膜炎球菌的至少一種。
26.制造復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物的方法，包括
將蛋白與1-氨基-2，3-丙二醇(ADPO)在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽存在下在pH大約5.5到大約7下進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生ADPO修飾的蛋白的溶液；
將ADPO修飾的蛋白與氧化劑進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生醛活化的蛋白的溶液；
將多種酰肼活化的免疫原性不同的多糖的混合物與醛活化的蛋白在pH大約5到大約8下相接觸，使得多種酰肼活化的免疫原性不同的多糖同時(shí)與至少一種醛活化的蛋白發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生復(fù)合的多價(jià)結(jié)合物，該結(jié)合物含有在每種結(jié)合的免疫原性不同的多糖和蛋白之間形成的至少一個(gè)C＝N雙鍵；以及
將復(fù)合的多價(jià)結(jié)合物中基本上所有的C＝N雙鍵還原成C-N鍵，產(chǎn)生復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合產(chǎn)物。
27.權(quán)利要求26中的方法，其中蛋白與ADPO在pH大約5.5到大約6.5下反應(yīng)。
28.權(quán)利要求26中的方法，其中蛋白與ADPO在pH大約6到大約7下反應(yīng)。
29.制備酰肼活化的蛋白的方法，包括
將蛋白與肼、碳酰肼、鹽酸肼、二酰肼或其混合物在存在下述物質(zhì)下進(jìn)行反應(yīng)(i)碳二亞胺以及(ii)至少一種氨基酸、至少一種肽、或至少一種氨基酸和至少一種肽的混合物。
30.權(quán)利要求29中的方法，其中碳二亞胺是1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
31.權(quán)利要求29中的方法，其中氨基酸選自賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的至少一種。
32.權(quán)利要求29中的方法，其中至少一種酰肼活化的蛋白在中性pH下基本可溶。
33.制造復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物的方法，包括
(a)將至少一種第一種醛活化的免疫原性不同的多糖與至少一種酰肼活化的蛋白在足以形成第一種結(jié)合物中間體的條件下相接觸，使得第一種免疫原性不同的多糖與蛋白之間形成至少一個(gè)C＝N雙鍵；
(b)將至少一種第二種醛活化的免疫原性不同的多糖與第一種結(jié)合物中間體相接觸，使得第二種免疫原性不同的多糖與蛋白之間形成至少一個(gè)C＝N雙鍵；以及
(c)將基本上所有的C＝N雙鍵還原成C-N鍵，產(chǎn)生復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合產(chǎn)物；
其中第一種醛活化的免疫原性不同的多糖與酰肼活化的蛋白的反應(yīng)性比第二種醛活化的免疫原性不同的多糖與酰肼活化的蛋白的反應(yīng)性低。
34.權(quán)利要求33中的方法，其中第一種醛活化的免疫原性不同的多糖選自A群腦膜炎球菌或C群腦膜炎球菌的至少一種。
35.權(quán)利要求33中的方法，其中第二種醛活化的免疫原性不同的多糖選自W135群腦膜炎球菌或Y群腦膜炎球菌的至少一種。
36.權(quán)利要求34中的方法，其中第二種醛活化的免疫原性不同的多糖選自W135群腦膜炎球菌或Y群腦膜炎球菌的至少一種。
37.按照權(quán)利要求1制備的復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物。
38.按照權(quán)利要求18制備的復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物。
39.按照權(quán)利要求26制備的復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物。
40.按照權(quán)利要求33制備的復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物。
41.藥物組合物，包含權(quán)利要求37的復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物和至少一種可藥用的載體。
42.藥物組合物，包含權(quán)利要求38的復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物和至少一種可藥用的載體。
43.藥物組合物，包含權(quán)利要求39的復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物和至少一種可藥用的載體。
44.藥物組合物，包含權(quán)利要求40的復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物和至少一種可藥用的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了制備復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物的方法，包括將多種免疫原性不同的多糖與至少一種蛋白同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，以制備復(fù)合的多價(jià)免疫原性結(jié)合物。該同時(shí)進(jìn)行的反應(yīng)包括一種反應(yīng)物上的酰肼基團(tuán)與另一種反應(yīng)物上的醛或氰酸酯基團(tuán)的反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K39/385GK101405028SQ200780009505
公開日2009年4月8日 申請日期2007年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日
發(fā)明者澈黃·羅伯特·李 申請人:美國政府健康及人類服務(wù)部