專利名稱：用于治療和/或預防腦梗塞的含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組人胰激肽原酶藥物組合物、其制備方法及在制藥中的 用途。更具體地說，本發(fā)明涉及利用分子生物學技術結合大規(guī)模細胞培養(yǎng)方法 制備重組人胰激肽原酶，本發(fā)明還涉及含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物。 本發(fā)明進一步涉及重組人胰激肽原酶在制備治療和預防腦梗塞的藥物中的用 途。(二) 背景技術人胰激肽原酶能作用于激肽原底物，使之釋放出具有血管活性的激肽，激肽 與耙器官上特定受體結合能產(chǎn)生一系列生物效應，如擴張血管增加血流量、改善 血液循環(huán)的作用，并且還有增加紅細胞的變形性和抑制血小板聚集、延長再鈣化 時間改善血液粘稠的作用。目前已上市的人尿來源的激肽原酶產(chǎn)品，即人尿激肽原酶，是從人尿中提取 的糖蛋白。其氨基酸組成與人胰激肽原酶的氨基酸序列相同，但是，從人尿中 提取的激肽原酶蛋白的162位點上存在Glu/Lys兩種氨基酸，這種氨基酸的多 態(tài)性對酶活性的影響未知。臨床上使用人尿激肽原酶發(fā)現(xiàn)靜脈滴注過快會導致 患者血壓急劇下降等不良副作用，給病人帶來了一定風險。另外，人尿收集困 難，人尿蛋白資源十分有限。其來源范圍越廣，成分越復雜，可能含有病毒等 成分。同時歐美等高端市場普遍不接受人尿來源產(chǎn)品。分子生物學技術的發(fā)展使得利用宿主細胞表達并大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白成為 可能，目前利用基因表達方法生產(chǎn)重組蛋白已代替了傳統(tǒng)的從自然資源中提取天 然蛋白方法。對于糖蛋白， 一般是將編碼糖蛋白的基因轉入哺乳動物細胞，特別 是中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞，以生產(chǎn)與天然蛋白 接近并具有生物活性的重組蛋白。KLKl基因位于染色體19q13.4 ，其大小為6. 55 kb，編碼區(qū)為874bp。 KLK1 全長基因編碼262個氨基酸組成的激肽酶原(即前體蛋白)，包括17個氨基酸信號 蛋白，7個氨基酸酶原片段和238個氨基酸成熟蛋白。激肽酶原在體內(nèi)進一步被蛋 白酶切割和加工成為具有生物活性的成熟人胰激肽原酶。KLK1基因在胰腺、腎臟 和唾液腺表達最高。人胰激肽原酶是一種糖蛋白，分子中含有14.4%的糖，其結構中包括三個 N糖基化位點，分別位于Asn78 ， Asn84及Asnl41 。研究表明，人胰激肽原酶 在CHO細胞中表達時，CHO大規(guī)模培養(yǎng)條件影響其糖基化程度，進而也影響到 其體內(nèi)的活性。因此，選擇適當?shù)腃HO培養(yǎng)條件，制備活性相似、副作用小的 重組人胰激肽原酶成為科研者的最新攻克難題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過分子生物學技術克隆KLK1基因，將該基因轉入宿主細胞進行表 達，并用細胞培養(yǎng)或發(fā)酵方法大量生產(chǎn)含有重組蛋白的細胞，從細胞或胞外分 泌液中提取重組人胰激肽原酶。優(yōu)選，利用大規(guī)模培養(yǎng)CHO細胞制備重組人胰 激肽原酶。進而制備由這種重組人胰激肽原酶為活性成分的藥物組合物。該重 組人胰激肽原酶在臨床上有多種用途，與人尿來源的激肽原酶相比活性相似、 副作用小，尤其是對血壓下降影響更小的特點。本發(fā)明制備的含有重組人胰激 肽原酶的藥物組合物可有效用于治療和/或預防腦梗塞。本發(fā)明是通過細胞培養(yǎng)或發(fā)酵方法獲得一種重組人胰激肽原酶。具體說， 本發(fā)明是利用分子生物學技術克隆KLK1基因并獲得表達重組人胰激肽原酶的 宿主細胞；利用大規(guī)模細胞培養(yǎng)或發(fā)酵方法進行表達重組人胰激肽原酶的宿主 細胞的大量生產(chǎn)，采用親和層析方法純化獲得重組人胰激肽原酶。優(yōu)選，表達重組人胰激肽原酶的宿主細胞是哺乳動物細胞，特別是CHO細 胞，該宿主細胞的大規(guī)模培養(yǎng)采用灌注反應器進行灌注培養(yǎng)。通過優(yōu)化培養(yǎng)條 件提高了細胞生長密度和表達產(chǎn)物的糖基化程度。本發(fā)明的目的是提供一種含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物。 本發(fā)明的另一目的是含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物用于制備治療和
/或預防腦梗塞的藥物的用途。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)一種含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性 成分的重組人胰激肽原酶和可藥用輔料，活性成分與藥用輔料重量比例為1:1 1:15000。其中所述重組人胰激肽原酶是由238個氨基酸殘基組成一條單鏈，N—末端和C一末端氨基酸殘基分別為異亮氨酸和絲氨酸，分子中含有5對S—S鍵，通過SDS-PAGE電泳測定，其分子量為35.0_44.0KDa，其一級結構為 11 e-Val -Gl y一Gl y-Trp-Gl u-(jy s-Gl u—Gl n-Hi s—Ser-Gln-Pr o-Trp-Gl n_Al a-Ala-Leu—Tyr-Hi s_30 40 Phe-Ser-Thr-Phe-Gln-Cp-Gly-Gly-Ile-Leu-Val-His-Arg-Gln-Trp-Val-Leu-Thr-Ala-Ala-50 60 His-Cys-Ile_Ser_Asp-AsrrTyr_Gln-Leu-Trp-Leu_Gly-Arg-His_Asn-Leu_Phe-Asp-Asp_Glu-70 CHO 80Asn-Thr-Ala-Gln-Phe-Val-His-Val-Ser-Glu-Ser-Phe-Pro-His-Pro-Gly-Phe-Asn-Met-Ser-CHO 90 100Leu-Leu-Glu-Asn-His-Thr-Arg-Gln-AlerAsp-Glu-Asp-Tyr-Ser-His-Asp-Leu-Met-Leu-Leu-110 120 Arg-Leu-Thr-Glu-Pro-Ala-Asp-Thr-Ile-Thr-Asp-Ala-Val-Lys-Val-Val-Glu-Leu-Pro-Thr-130 140 Gln-Glu-Pro—Glu-Val-Gly-Ser—Thr-Cys-Leu—Ala-Ser-Gly—Trp—Gly—Ser—lie—Glu-Pro -Glu-CH0 150 160Asn-Phe-Ser-Phe-Pro-Asp-Asp-Leu-Gln-Cys-Val-Asp-Leu-Lys-Ile-Leu-Pro-Asn-Asp-Glu-170 180 Cys-Glu-Lys-Ala-His-Val-Gln-Lys-Val-Thr-Asp-Phe-Met-Leu-Cys-Val-Gly-His-Leu-Glu-190 200 Gly-Gly-Lys-Asp-Thr-Cp-Val-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-PrcrLeu-Met-Cys-Asp-Gly-Val-Leu-210 220 Gln-Gly-Val-Thr-Ser-Trp-Gly—Tyr-Val-Pro—Cys-Gly-Thr-Pro-Asn-Lys—Pro-Ser-Val-Ala-230Val-Arg-Val-Leu-Ser-Tyr-Val-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser 所述重組人胰激肽原酶分子中含有5對S — S鍵，分別為Cys7 — Cys150， Cys26—Cys42， Cys29—Cys196， Cysl61—Cys175以及Cysl86—Cys211，等電點約為4.0，分子中含有14.4%的糖，結合位點分別位于Asn78 、 Asn84及Asnl41。
該重組人胰激肽原酶是一種糖蛋白，糖基化結合位點分別位于Asn78 、 Asn84及Asn141。該重組人胰激肽原酶一級結構中的粗體字母(Glu)表示162位點上的氨基酸。本發(fā)明的重組人胰激肽原酶的糖基化程度主要取決于糖鏈中唾液酸的水 平。通過SDS-PAGE電泳測定，現(xiàn)有的人尿激肽原酶分子量為39.0—43.0KDa， 本發(fā)明的重組人胰激肽原酶為35.0_44.0KDa，重組人胰激肽原酶的電泳帶區(qū) 域比現(xiàn)有的人尿激肽原酶寬，說明重組人胰激肽原酶由于其糖基化程度的不同， 尤其是唾液酸化程度的不同，即重組人胰激肽原酶比現(xiàn)有的人尿激肽原酶具有 更復雜的糖基化組成。另外，本發(fā)明制備的重組人胰激肽原酶是由單一肽鏈組 成的蛋白，其162位點上只表達Glu—種氨基酸；而現(xiàn)有的人尿激肽原酶蛋白 是由兩條肽鏈組成的蛋白混合物，其162位點上存在Glu/Lys兩種氨基酸，這 種氨基酸的多態(tài)性對酶活性的影響尚在研究中。本發(fā)明的重組人胰激肽原酶制備包括利用基因重組技術克隆KLK1 DNA、 構建含有編碼該基因DNA序列的表達質(zhì)粒、大規(guī)模細胞培養(yǎng)或發(fā)酵方法生產(chǎn) 表達重組蛋白的宿主細胞和重組蛋白的純化。本發(fā)明重組人胰激肽原酶的制備方法如下1. 根據(jù)KLK1的DNA序列設計引物，采用RT-PCR方法從人胰腺擴增KLK1 DNA 序列，該DNA序列包括cDNA (序列表中序列1， GenBank NM—002257)、 基因組DNA (序列表中序列2)和人工合成的DNA。2. 將KLK1 DNA克隆到表達載體，構建含有KLK1 DNA的表達質(zhì)粒。表達載體包 括原核表達載體(如pET-32a)、酵母表達載體(如pPIC9)或真核表達載體(如pcDNA3. 1)。對于真核表達載體的情況，為了提高重組人胰激肽原酶的 穩(wěn)定性和延長其半衰期，在真核表達載體插入了人IgGlFc片段，構建含有 KLK1和Fc片段的真核表達質(zhì)粒。3. 將含有KLK1 DNA表達質(zhì)粒轉入宿主細胞，宿主細胞包括原核細胞(如大腸 桿菌)、酵母(如畢赤酵母)或哺乳細胞(如CHO， NSO細胞)。優(yōu)選，將真 核表達質(zhì)粒轉染CHO細胞,篩選穩(wěn)定轉染的細胞株。4. 用發(fā)酵方法或大規(guī)模細胞培養(yǎng)方法大量生產(chǎn)表達重組人胰激肽原酶的宿主 細胞；優(yōu)選，通過生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)表達重組人胰激肽原酶的CH0細胞,其步驟如下a) 將含有表達重組蛋白的細胞株用含有5-10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 (pH7.20)進行培養(yǎng)，然后在無血清培養(yǎng)基中采用常規(guī)的方法進行傳代適 應后，小規(guī)模懸浮批次培養(yǎng)，置溫度37'C、 5XC02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育生長。 接種于細胞培養(yǎng)罐中進行細胞連續(xù)培養(yǎng)，接種密度為1.0X105/ml-5.0X 105/ml,優(yōu)選，3.0 X 105/ml。培養(yǎng)溫度37°C、 pH7.2、轉速50-120 rpm/min， 優(yōu)選90rpm/min，溶解氧50%空氣飽和度和通氣量O.lLpm。b) 在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-72小時后，優(yōu)選，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 小時后，將無血清培養(yǎng)基灌注進入生物反應器進行灌注培養(yǎng)。灌注速度 需根據(jù)培養(yǎng)基中的殘?zhí)橇窟M行調(diào)節(jié)。保持殘?zhí)橇吭?.8-1.2 g/L;抽取罐 內(nèi)少量培養(yǎng)液，檢測和跟蹤其體外活性.。培養(yǎng)時間為28天，從第6天 起開始收液，最高細胞密度可達0.8X107/ml—2X107/ml，優(yōu)選，IX 107/ml。c) 收集含有表達重組人胰激肽原酶的培養(yǎng)基，過濾去除細胞碎片。上清液 用于重組蛋白的純化。5.從大量培養(yǎng)的表達重組人胰激肽原酶的細胞中純化重組蛋白。優(yōu)選，從CHO 細胞表達重組人胰激肽原酶，該蛋白的純化包括以下步驟a) 將含有重組人胰激肽原酶的培養(yǎng)基超濾濃縮后，上擴張床強陰離子交 換柱(Streamline Q XL， GE Healthcare公司)，沖洗柱子至OD28o<0.2;用 含0.3M NaCl及0.02mol/L Tris緩沖洗脫柱子。b) 在上述洗脫收集液加入(NH4)2S04，用HCl調(diào)整pH 7.0±0.1上苯基交 聯(lián)瓊脂糖快速流凝膠(phenyl S印harose 6 Fast Flow, GE Healthcare 公司)。洗脫液用10000MWCO膜超濾至3L。加入90g檸檬酸鈉，用 HC1調(diào)pH值至7.0±0.2，然后6(TC恒溫加熱10小時。加熱后將溶液 調(diào)pH8.0土0.1，上苯扎嘧啶交聯(lián)瓊脂糖凝膠柱(Benzamidine Sepharose 6B)，沖洗，洗脫。c) 調(diào)節(jié)上述洗脫收集液pH4.0士0.1，上SP瓊脂糖凝膠FF柱(Sp SepharoseTM Fast Flow ，GE Healthcare公司)，沖洗至流出液 0D280O.15,洗脫，收集0D28O0.1的洗脫流出液。將洗脫收集液 調(diào)pH7.0，用IOOOOMWCO膜進行超濾濃縮，得到純化的重組人胰激 肽原酶蛋白。用酯酶法測定純化蛋白的酶活性。 用上述方法進行大規(guī)模培養(yǎng)細胞并結合基于親和層析技術制備的重組人胰 激肽原酶具有下列特征通過SDS-PAGE電泳方法測定，重組人胰激肽原酶的 電泳帶區(qū)域比現(xiàn)有人尿激肽原酶寬(重組人胰激肽原酶為38.0—43.0KDa，人 尿激肽原酶分子量為40.0—43.0KDa);說明重組人胰激肽原酶由于其糖基化程 度的不同，比現(xiàn)有人尿激肽原酶具有更復雜的組成。通過酯酶法測定酶活性的 結果表明重組人胰激肽原酶和現(xiàn)有人尿激肽原酶活性相近。本發(fā)明由于采用了特定的大規(guī)模培養(yǎng)條件和發(fā)酵方法，從而使得到的重組 人胰激肽原酶的糖基化程度與現(xiàn)有的人尿激肽原酶有所不同，在臨床應用上副 作用明顯減小，尤其是對體內(nèi)血壓下降較為緩和。雖然導致重組人胰激肽原酶 副作用小的機理并不很清楚，但我們推斷可能是由于糖鏈結構有所不同，導致 在體內(nèi)的發(fā)揮了更優(yōu)異的效能。本發(fā)明的重組人胰激肽原酶一般以藥物組合物的形式使用，這種組合物含 有治療有效量的作為活性成分的重組人胰激肽原酶和可藥用輔料，活性成分與 藥用輔料重量比例為1:1 1:15000,其中優(yōu)選比例為1:1 1:2500。這種藥物組 合物優(yōu)選以靜脈注射途徑給藥，主要劑型包括凍干粉針劑和注射液劑。經(jīng)靜脈注射給藥的重組人胰激肽原酶組合物， 一般是固體的滅菌組合物形 式，即凍干粉針劑。這些組合物還可以含有藥用輔料，特別是甘露醇、右旋糖 苷、水解明膠、檸檬酸鈉、甘氨酸或聚乙二醇等中的一種或其任意混合物，在 使用時可以溶解于滅菌注射用水或各種其它注射用滅菌介質(zhì)中。經(jīng)靜脈注射給藥的重組人胰激肽原酶組合物也可以是水溶液形式，即注射 液劑、輸液劑。組合物還可以含有藥用輔料，特別是甘露醇、氯化鈉、葡萄糖 或聚乙二醇等中的一種或其任意混合物。重組人胰激肽原酶凍干粉針的制備方法取過濾滅菌的重組人胰激肽原酶 150PNA單位，加15克甘露醇、2克右旋糖酐40和5克檸檬酸鈉(枸櫞酸鈉)
溶解，調(diào)節(jié)PH至中性，加注射用水至500毫升，無菌過濾，分裝1000個安瓿 中，無菌條件下冷凍干燥，即得。重組人胰激肽原酶注射液的制備方法取過濾滅菌重組人胰激肽原酶水溶 150 PNA單位，調(diào)節(jié)ra至中性，加注射用水至500毫升，加氯化鈉調(diào)節(jié)等滲， 無菌過濾，分裝1000個安瓿中，即得。應用重組人胰激肽原酶組合物治療腦梗塞的劑量根據(jù)病情的嚴重程度、治 療時間而定， 一般靜脈注射給藥量是每天給藥1_3次，每次0.005 — 2.5 PNA 單位。優(yōu)選，藥物的給藥量是每天l次，每次0.1—0.2PNA單位。PNA的定義為在37°C、 pH8.0條件下，1分鐘水解底物Val-Leu-Arg-PNA 釋放lumol游離PNA，即為1PNA單位。對本發(fā)明所進行的試驗研究表明，含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物對 腦梗塞患者的療效顯著，副作用極小。


圖1本發(fā)明的重組人胰激肽原酶和現(xiàn)有人尿激肽原酶的SDS — PAGE電泳 圖。1，重組人胰激肽原酶；2，人尿激肽原酶；3，蛋白標準分子量對照。 圖2各組大鼠腦血栓24h后腦梗塞面積的變化1為對照組，2為重組人胰激肽原酶17.5X 10-3 PNA / kg組，3為重組人胰 激肽原酶3.50X 10-3 PNA / kg組，4為人尿激肽原酶17.5X 10-3 PNA / kg組， 5為人尿激肽原酶3.50X10-3PNA/kg組。***表示與對照組比較，p<0.001。圖3各組大鼠腦血栓24h后神經(jīng)癥狀評分結果1為對照組，2為重組人胰激肽原酶17.5 X 10-3 PNA / kg組，3為重組人胰 激肽原酶3.50X 10-3 PNA / kg組，4為人尿激肽原酶17.5X 10-3 PNA / kg組， 5為人尿激肽原酶3.50X10-3PNA/kg組。***和*分別表示與對照組比較， p<0.001禾口 p<0.05。
具體實施方式
實施例l:人胰激肽原酶基因(KLK1基因)的克隆
材料和方法以人腎總RNA為模板，先通過反轉錄試劑盒(美國Iiwitrogen 公司)獲得KLK的全長cDNA。然后以該cDNA為模板，首先分別擴增KLK 的1-496 bp (以ATG為l)和476-789 bp兩個片段，然后用5，和3，端引物通過 重疊延伸PCR技術將兩個片段拼接成完整的KLK基因。擴增KLK片段的PCR 反應條件94°C 3min變性；94。C 30s; 62°C 30s; 72°C 30s ;擴增34個循環(huán); 72°C延伸5min后結束反應。 擴增KLK的1-496所用引物為上游引物5' GCCTCGCCCTGTCCCTGGGGGGGACTGGTGCTGCGCCCCCGATTCAGTCCCGGATTGTGG3' 下游引物5， AATTCTCTGGTTCGATGCTGC 3' PCR擴增476-789 bp片段所用引物為上游引物5，GCAGCATCGAACCAGAGAATTTCTCATTTCCAGATGATCTC3' 下游引物5' GACACCATAGCGGAGAACTCCTGA3' PCR拼接兩個片段所用引物上游引物5， GCCTCGCCCTGTCCCTGGGGGGGACTGGTCCTGCGCCCCCGATTCAGTCCCGGATTGTGG3' 下游引物5， GACACCATAGCGGAGAACTCCTGA3' 結果經(jīng)過上述方法克隆到的KLK1基因全長序列見序列表中序列1，序列1中 標有下劃線一的堿基為兩個多態(tài)性位點，GenBank中相應位置分別是T和G。與 GenBank發(fā)表的人KLK1基因對比，克隆的KLK1基因在第405和433位處存 在兩個突變，這兩處突變是文獻中已報道的多態(tài)性位點。根據(jù)基因組序列設計對應的引物，用RT-PCR方法獲得了KLK1的基因組 DNA ，見序列表中序列2，大寫字母部分代表基因組DNA序列外顯子部分， 小寫字母部分代表基因組DNA序列非編碼區(qū)及內(nèi)含子部分。實施例2:含有重組KLK1基因表達質(zhì)粒的構建將全長KLK1基因插入含有CMV強啟動子的載體pcDNA3.1/myc-His (-) A 的Xho I和EcoR I位點，構建了 pcDNA3.1-KLKl真核表達質(zhì)粒。
構建pcDNA3.1-KLKl所用引物上游引物5，GTGACTCGAGACCATGGGGTTCCTGGTTCTGTGC 3,(下劃線為Xho I 酶切位點)下游引物5' ATCTGAATTCTCAGGAGTTCTCCGCTATGGTGTC 3，(下劃線為EcoR I 酶切位點)。另外，為了構建含有人胰激肽原酶和human IgGl Fc片段以便表達在體內(nèi) 更為穩(wěn)定的融合蛋白，在pcDNA3.1-KLKl的EcoRI和BamHI位點處插入了 human IgGl Fc片段，構建了 pcDNA3.1-KLKl-Fc真核表達質(zhì)粒。Fc片段位于 KLK1基因的C端，通過EcoRI限制性酶切位點連接。實施例3:重組人胰激肽原酶在真核細胞中的表達及其制備 方法1. KLK1基因在CHO細胞中的表達CHO細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于5%C02、 37 。C孵育。用陽離子脂質(zhì)體(LipofectAMINE2000， Invitrogen公司)將上述實施 例2制備的pcDNA3.1-KLK真核表達質(zhì)粒轉染CHO細胞，以G418篩選轉染細 胞；進而通過酶活性測定和Western Blot鑒定G418篩選后的單克隆穩(wěn)定細胞 株。2. 大規(guī)模培養(yǎng)表達重組人胰激肽原酶的宿主細胞a) 將含有表達重組蛋白的細胞株用含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 (pH7.20)進行培養(yǎng)，在無血清培養(yǎng)基中采用常規(guī)的方法進行傳代適應后， 小規(guī)模懸浮批次培養(yǎng)，置溫度37'C、 5XC02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育生長。接種 于5L細胞培養(yǎng)罐(New Brunswick Scientific Co. USA)中進行細胞連續(xù)培 養(yǎng)，接種密度為3.0X105/ml。培養(yǎng)溫度37。C、 pH7.2、轉速90rpm/min， 溶解氧50%空氣飽和度和通氣量0.1Lpm。b) 在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后，將無血清灌注培養(yǎng)基以0.6V/V/day 的灌注速率灌注進入生物反應器進行灌注培養(yǎng)。隨著新鮮培養(yǎng)基的連續(xù) 灌注，細胞數(shù)目逐漸增加，灌注速度需根據(jù)培養(yǎng)基中的殘?zhí)橇窟M行調(diào)節(jié)。 當每天灌注25L時，保持殘?zhí)橇吭?.8-1.2 g/L;抽取罐內(nèi)少量培養(yǎng)液， 檢測和跟蹤其體外活性.。培養(yǎng)時間為28天，從第6天起開始收液，最
高細胞密度可達1.1X107/ml。C)收集含有表達重組人胰激肽原酶的培養(yǎng)基，過濾去除細胞碎片。上清液 用于重組蛋白的純化。3. 重組蛋白的純化包括以下步驟a) 收集10L含有重組人胰激肽原酶的無血清培養(yǎng)基，超濾濃縮后，上擴張 床強陰離子交換(Streamline Q XL， GE Healthcare公司)離子交換柱， 用含0.15M NaCl及O.02mol/L Tris緩沖沖洗柱子至0D280O.2;用含 0.3M NaCl及0.02mol/L Tris緩沖洗脫柱子。b) 在上述20L洗脫收集液加入1800g(NH4)2SO4，用HCl調(diào)整pH7.0土0.1， 上苯基交聯(lián)瓊脂糖快速流凝膠(phenyl Sepharose 6 Fast Flow, GE Healthcare公司)。用0.7M(NH4)2S04緩沖液沖洗柱子。用0.4M (NH4)2S04緩沖液進行洗脫柱子，洗脫液用10000膜超濾至3L。加入 90g檸檬酸鈉，用HC1調(diào)pH值至7.0±0.2，然后6(TC恒溫加熱10小時。 加熱后將溶液調(diào)pH8.0土0.1，上苯扎嘧啶交聯(lián)瓊脂糖凝膠柱(Benzamidine Sepharose 6B, GE Healthcare公司)，用含O.lMNaCl及 0.02mol/L Tris緩沖進行沖洗，用含0.4M NaCl及0.02mol/L Tris緩沖進 行洗脫。c) 調(diào)節(jié)上述洗脫收集液pH4.0土0.1，上SP瓊脂糖凝膠FF柱 (Sp SepharoseTM Fast Flow, GE Healthcare公司)，用0.1M NaAc-HAc緩 沖液進行沖洗至流出液OD280<0.15，用含0.1M NaCl及0.1M NaAc-HAc 緩沖溶液進行洗脫，收集0D28O0.1的洗脫流出液。將洗脫收集液調(diào) pH7.0，用1萬超濾膜進行超濾濃縮。4. 活性測定方法分別配置含有等量活性的人尿激肽原酶和重組人胰激肽原酶的樣品溶液， 在樣品溶液中加入底物S-2266 (H-D-Val-Leu-Arg-PNA 2HC1)，置37±0.5°C 水浴中準確反應15分鐘，在405mn波長處測定測定各樣品的吸收值A， A值 控制在0.1 0.2之間。將A值代入下式計算活性單位 PNA單位/ml-173.6X AXT/1000
注式中173.6為反應常數(shù)；T為稀釋倍數(shù)；1000為單位/L與單位/ml的單位換算值活性單位定義為在37'C pH8.0的條件下，1分鐘水解1 y mol Val-Leu-Arg-PNA的酶量稱為1PNA單位。 結果在CMV強啟動子調(diào)控下將KLK1基因轉染到CHO細胞，通過酶活性測定 和Western Blot分析篩選酶活性高的單克隆穩(wěn)定細胞株，通過生物反應器灌注 法進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)，收集含有重組人胰激肽原酶的無血清培養(yǎng)基，進行純 化，獲得純化的重組人胰激肽原酶。通過酯酶法測定酶活性的結果表明重組人 胰激肽原酶和人尿激肽原酶活性相近，分別為7.1和6.8PNA/mg蛋白。灌注培養(yǎng)一方面連續(xù)向反應器中注入新鮮的培養(yǎng)基，同時又連續(xù)不斷地取出 等量的培養(yǎng)液，但是過程中不取出細胞，細胞仍留在反應器內(nèi)，使細胞處于一 種營養(yǎng)不斷的狀態(tài)。優(yōu)化培養(yǎng)條件后細胞密度達到107/ml，高密度培養(yǎng)動物細 胞時，必須確保補充給細胞以足夠的營養(yǎng)以及除去有素毒的代謝物。灌注培養(yǎng) 時用新鮮的培養(yǎng)液進行灌注，可以確保上述目的的實現(xiàn)。通過調(diào)節(jié)灌注速度， 可以把培養(yǎng)過程保持在穩(wěn)定的、廢代謝物低于抑制水平的狀態(tài)下。采用灌注培 養(yǎng)的優(yōu)越性在于大大提高了細胞生長密度，同時有助于產(chǎn)物的表達和純化。已有報導表明蛋白質(zhì)糖基化的程度受多種因素的影響，如大規(guī)模培養(yǎng)條件和 發(fā)酵方法等。純化的重組人胰激肽原酶和現(xiàn)有的人尿激肽原酶分子量通過 SDS-PAGE電泳測定，結果如附圖1所示。從附圖1中可以看出，現(xiàn)有的人尿 激肽原酶分子量為39.0 — 43.0KDa，本發(fā)明的重組人胰激肽原酶為35.0 — 44.0KDa，重組人胰激肽原酶的電泳帶區(qū)域比人尿激肽原酶寬，說明重組人胰 激肽原酶由于其糖基化程度的不同，尤其是唾液酸化程度的不同，即重組人胰 激肽原酶比人尿激肽原酶具有更復雜的糖基化組成。實施例4制備重組人胰激肽原酶干粉針取實施例3制備的過濾滅菌的重組人胰激肽原酶150PNA單位，加15克甘 露醇、2克右旋糖酐40和5克檸檬酸鈉(枸櫞酸鈉)溶解，調(diào)節(jié)PH至中性， 加注射用水至500毫升，無菌過濾，分裝IOOO個安瓿中，無菌條件下冷凍干燥， 即得。實施例5制備重組人胰激肽原酶注射液取實施例3制備的過濾滅菌重組人胰激肽原酶水溶150 PNA單位，調(diào)節(jié)PH 至中性，加注射用水至500毫升，加氯化鈉調(diào)節(jié)等滲，無菌過濾，分裝1000個 安瓿中，即得。實施例6重組人胰激肽原酶對大鼠腦梗塞的實驗研究 動物和分組Wistar雄性大鼠，體重280 320 g，分別采用重組人胰激肽原 酶和人尿激肽原酶為治療劑，并將動物隨機分為3組，每組12只① 對照組腦梗塞后僅用生理鹽水處理；② 重組人胰激肽原酶組腦梗塞后30min經(jīng)舌下靜脈注射重組人組織激肽原 酶(分為17. 5X10—3、 3. 50X10—3pNA/kg兩個劑量組，每組6只)；③ 人尿激肽原酶組腦梗塞后30min經(jīng)舌下靜脈注射人尿激肽原酶(分為17. 5 X10—3、 3. 50X10—3pNA/kg兩個劑量組，每組6只)。動物模型的制作腹腔注射水合三氯乙醛350mg/kg麻醉，右側位固定。手 術暴露顴弓，用咬骨鉗咬去顴弓，剪斷筋膜，暴露聶前窩，用小牽張器將磷狀 骨和下頷骨間距撐開，于顱骨底開一2cmX2cm顱窗，撕開硬腦膜，暴露大腦中 動脈，用高頻電刀燒斷，以阻斷血流，造成局部腦缺血，逐層縫合切口。 30分 鐘后進行舌下靜脈給藥，回籠飼養(yǎng)。室溫嚴格控制在24 25'C。治療組在手術 30rain后由舌下靜脈給藥(用藥量lml/kg),對照組僅注射同等體積的生理鹽水。檢測指標和方法腦梗塞面積測定將剝離完整的大腦放入4'C冰箱內(nèi)盛有生理鹽水的小杯 中，IO分鐘后去嗅球、小腦及低位腦干，沿冠狀面切為五片，立即放入紅四氮 唑(TTC)染色液中，避光在37'C水浴中溫孵30分鐘。取出腦片放入10%福爾 馬林中固定。正常組織為玫瑰紅色；缺血組織呈白色。用重量求積法測量缺血 面積，計算缺血區(qū)域占全腦面積的百分比。神經(jīng)癥狀評分判斷方法和標準(l)提起鼠尾，正常鼠兩前肢向前伸直并且對稱。手術鼠，缺血腦半球對側
的前肢肩內(nèi)旋和內(nèi)收，觀察其程度不同評為0 4分。(2) 牽拉兩肢，正常大鼠肌力對稱，手術后腦缺血半球的對側前肢肌無力， 觀察其程度不同評為0 3分。(3) 推兩肩，正常大鼠雙側肩阻力對稱，手術后腦缺血半球的對側肩阻力下 降；觀察其程度不同評為0 3分。按以上標準，滿分為10分。分數(shù)越高，說明腦功能障礙越嚴重。結果各組大鼠腦梗塞面積和神經(jīng)癥狀評分的檢測結果見附圖2和附圖3:從圖2可以看出，重組人胰激肽原酶組和人尿激肽原酶組可劑量依賴地縮小 大鼠腦栓塞24h后的腦梗塞面積。與對照組相比，大劑量(17.5X10—3 PNA/kg) 重組人胰激肽原酶組和人尿激肽原酶組的腦梗面積明顯縮小(P〈0. 001)，但劑量 減至3. 50X 10—3PNA / kg時兩組都無明顯作用。相同劑量下重組人胰激肽原酶組和 人尿激肽原酶組之間作用比較無顯著差異(P〉0. 05)。各組大鼠神經(jīng)癥狀評分結果表明，對照組大鼠麻醉清醒后即有偏癱樣癥狀出 現(xiàn)，主要表現(xiàn)為手術對側前肢內(nèi)收、肩內(nèi)旋、前肢肌張力下降，向手術對側推動 時抵抗阻力下降。從圖3可以看出，重組人胰激肽原酶和人尿激肽原酶均可劑量 依賴地改善神經(jīng)癥狀，兩組與對照組相比有顯著性差異,但兩組之間相比無顯著 性差異(P〉0.05)。本實驗結果表明，腦梗塞大鼠在腦血栓30min靜脈注射重組人胰激肽原 酶，能明顯縮小腦梗塞24h后的腦梗塞范圍、改善行為障礙，并有劑量依賴關 系。說明重組人胰激肽原酶可抑制腦血栓的形成，對腦梗塞大鼠具有很好的治 療作用。
序列表序列l(wèi):克隆到的KLK1基因全長序列GTCTTATGTGAAGTGGATCGAGGACACCATAGCGGAGAACTCCTGA序列2: KLK1基因組序列agatctctgggactttggaggacaggacgttgagcacccataactgggagcaagaagtgggaggctcattgagaccccagcattgtttgggagggacactggattttgtaatgctaaagaacttaccctgggagacccctgaaacttcacattcctggatctggaggcactaggaatgtggtgatgtgtaccccaaaattttattatgaaaggaacagtagctttggggacctaggtcctgggtctgggagtgcaagaaccagggcattctgaaggccaaggcttatatttcagggggaactggcagctgagatgctagtatcttggctccgagtggtgcagggaatcagagccctaactgctggtgtttgagggcaccaggtctgggggtgcagggccttaattgagactgaggtatatggggctttgtaccaggggtcactgattcctccgtcttectgtttctgctteccctcagtccccccttgcctcactggctgctccccagagcaaagccccagagccacaggccctgccccacctggcttcaaccccaggaatgcgtccagcgtgatccagggcctgcagaacaggtgctggttctccctccccgtctacagctctggggatcggaggcgggggggcaattgtccagcccccaggcaacaggggaagggccttggcaacatctgggtgccagcagggcaggggtggggctctgaggggataagggcttttaaaagcctccccagggaggttccccAGTTCCTCCACCTGCTGGCCCCTGGGGGGGACTGgtgagacagtggggggatgtgggagggggaacgggccctgattctcttgctggcctcacatccccccccgataagaccttcccctccaacaccccaccctcatccctctggcccacagtctatcctagtccggggtgccccggctcttatctatcttgcgcggccccaccctaaacttccacccccgctcctccatgttgtcatagtgctcactcccacacC3gattcctgctcctcccagg肌gcctc3gtectttctcctcttccctagccaacgccctgtccc3ccgctttaccaa3ggggcagattctgggccatctctgtctctctctggaggaccccaaccctcccatgggcttcccccaccccacaggactotgatcatcccctcctgccccctagttccctgcggccacctatttggctcctgagtctacaaatcccaccacactccagtgactttttccatecagctgtccgctctcaactgtgtectccagaccctgacatctggtctccccagtecttccagggtcccccaaattteaccagaaaaccctgcttcccaaactggcatgtgggatcccccatctggtatgggggggggtctgcaaatgtcccttcccacccagcacccccagctctcccaggaaaaacaccacaccctcccaccacatgctcctttccttggggaagttccatcccgccccaggccccagcccttctctgcctgaattgttcctacacagctctggttttctggaaccccacgccaaggatcctgaatgccttctcagccagcgcttctgccctggctcccccaagtcagtatgtgattctacaacctcacatcaagtgggtcctgcattgcattcccacagctgcttggcgcctgttctcaccacttctccaatcctcttcctaggattgcctccaagaggaccccatatccttccagtaccctcagaccatgaaccccatccccatgagaaacgaagatcccatccttcaccctgtccgagaaggactgccactcacgcctccctcctoctgagccccgtcccagtcctgaccgcaactgtgttctcagggccccaacctcccctcatattgccattcctggttcacaggaaggaccccaaaacctctcggaagcccacctctagccttaaccatagccctttcttttaccctttaaccaggaagccctgaaatctaactgtccagccaagctggccccttccaaccccaatgtagggaccccaagtcacccccaaactcttcagtcgagatgctcttctttacctctcagacctggttccctaaagctgcatcctttcctgaacctcaaaagcccaacccaggtcctgtttccctagcctaggagccccttagccctccagattcttcctcagtgagcctctgatcctgtcccacccttggcgccttg3tccctggtttccagtccctttccactcccctaacccaccacctcccatcccccagccccag3ccccatgacctgacgcccagatgcagtgtctgctccagacactgtctcctgtctcctaccctgatccctggaggctgctctectgtcagagcacaaaatctccccaccaggtccagccaccactccaaaagcccagggaacagtccagagtcccaccccttcccaacaccccttgcccatgtcccccctccagccctggtcctctacccgctgtccctte3g3cccacagccc3gctccctctcctagccttgtccctggcctctcctgccccctgcccttcctgacccagcaccgcctctgcagGTGCTGCGCCCCCGAGGTGCACCGCCAGTGGGTGCTCACAGCTGCTCATTGCATCAGCGAgtgagtaggggcctggggtctgggaggagggcatctatgctgccacaggattgacaggccagtggcattccccttggataacctcaggcaagactggggggctgagccagagaggaaggctctggcgcaggtcgcctggcagggcagagctgggctggacacccctetecaaggctgcctgggtctcttgggatctggttctgcttgtgtctctgtgtgactgtgttctggtctctgtcttcctctctctcctetgtctccttgtctctgcatctcccctgtctctgtctgtctctgagtctetotgcggcatctctgtcactgtgtctcaccctecatctctctacccatctctctctctctgggtctetecctcaccgctccctcatccctactaaacacac3ccc3gatggaccteagggaggccccagagtaaaggaagggctttatccccaacttgtgtgcctgggagggggcgcctctccctctgtccagctccccgccccacaggatatccctccactctggagagacacagggaagggctggttteagcgggagctgggtggggcaactgagggaggaggaaggaggaggcggggcgagaaacgcgcgggagggtgctgggaaccgaagggggcctcgaccttggacttcaggccccacctgcccctggggagcccgcaccacagccccagctgcagctgagccgctctcaggcctcccctcctccctacctgcccccaccctccccacctgcccccaccctccccc3gggcctccctcccttttctctcccacactcggtcactcctgcttectetctgcctctgtttctogttotcactctgacgtcccgcgtcctttttcatttgtctgcttctcgctcccttecgtgttctgttccctcttcctccctcttccctggggcctgtttctcgctgtccctgtcttttatccttctcatctgcctcttttttgctc3ccctgtttetcactgccctcccctccgcctttcteacccctctgtccttttg3gctcttttttgctctgtctettcatttgccttttgc3CtctcaaactctttC3tcttcccattcgctgtctgtatttctccat幼ctatatctttcttcctctgtctccgcccacccacatttttctctttccctttctetetttggggacccteccccatgcteccctgccccatccccttttccccttcccgtcttctcatccctccattcccatctttccccagCAATTACCAGCTCTGGCTGGGTCGCCACAACTTGTTTGACGAtatgtgggggcagactgtgtagcccaaggcggggatggggactcctgcgtccaagggagaaagggccagggaagca 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權利要求
1.一種含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的重組人胰激肽原酶和可藥用輔料，活性成分與藥用輔料重量比例為1∶1～1∶15000，其中所述重組人胰激肽原酶是由238個氨基酸殘基組成一條單鏈，N-末端和C-末端氨基酸殘基分別為異亮氨酸和絲氨酸，分子中含有5對S-S鍵，通過SDS-PAGE電泳測定，其分子量為35.0-44.0KDa，其一級結構為
2.根據(jù)權利要求l所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物，所述的重組人 胰激肽原酶分子中含有5對S—S鍵，分別為Cys7—Cys150， Cys26—Cys42， Cys29 —Cysl96， Cysl61—Cysl75以及Cysl86—Cys211，等電點約為4. 0，分子中含有 14. 4%的糖，結合位點分別位于Asn78 、 Asn84及Asn141 。
3.根據(jù)權利要求2所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物，其中所述的重 組人胰激肽原酶是由以下步驟制備得到-1) 根據(jù)KLK1的DNA序列設計引物，采用RT-PCR方法從人胰腺擴增KLK1 DNA 序列；2) 將KLK1 DNA克隆到表達載體，構建含有KLK1 DNA的表達質(zhì)粒；3) 將含有KLK1 DNA表達質(zhì)粒轉入宿主細胞；4) 用發(fā)酵方法或大規(guī)模細胞培養(yǎng)方法大量生產(chǎn)表達重組人胰激肽原酶的宿主 細胞，其步驟如下a) 將含有表達重組蛋白的細胞株用含有5-10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 進行培養(yǎng)，然后在無血清培養(yǎng)基中采用常規(guī)的方法進行傳代適應后，小 規(guī)模懸浮批次培養(yǎng)，置溫度37'C、 5XC02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育生長，接種于 細胞培養(yǎng)罐中進行細胞連續(xù)培養(yǎng)，接種密度為1.0X105/ml-5.0X105/ml, 培養(yǎng)溫度37。C、 pH7.2、轉速50-120 rpm/min，溶解氧50%空氣飽和度 和通氣量0.1Lpm;b) 在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-72小時后，將無血清培養(yǎng)基灌注進入生物反 應器進行灌注培養(yǎng)，保持殘?zhí)橇吭?.8-1.2 g/L;c) 收集含有表達重組人胰激肽原酶的培養(yǎng)基，過濾去除細胞碎片，上清液 用于重組蛋白的純化；5) 從大量培養(yǎng)的表達重組人胰激肽原酶的細胞中純化重組蛋白，該蛋白的純化 包括以下步驟a) 將含有重組人胰激肽原酶的培養(yǎng)基超濾濃縮后，上擴張床強陰離子交 換柱，沖洗柱子至OD28Q<0.2;用含0.3MNaCl及0.02mol/LTris緩沖洗 脫柱子；b) 在上述洗脫收集液加入(NH4)2S04，用HCl調(diào)整pH7.0土0.1上苯基交聯(lián) 瓊脂糖快速流凝膠，洗脫液用10000MWCO膜超濾至3L，加入90g檸 檬酸鈉，用HC1調(diào)pH值至7.0±0.2，然后60'C恒溫加熱10小時，加 熱后將溶液調(diào)pH8.0士0.1，上苯扎嘧啶交聯(lián)瓊脂糖凝膠柱，沖洗，洗脫。 c)調(diào)節(jié)上述洗脫收集液pH4.0士0.1，上SP瓊脂糖凝膠FF柱，沖洗至流 出液OD2800.15，洗脫，收集OD2800.1的洗脫流出液，將洗脫收集 液調(diào)pH7.0，用10000MWCO膜進行超濾濃縮，得到純化的重組人胰激 肽原酶蛋白。
4. 根據(jù)權利要求3所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物，其中重組人胰 激肽原酶和可藥用輔料的重量比例為l: 1 1:2500。
5. 根據(jù)權利要求4所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物，其為凍干粉針 劑，可藥用輔料為甘露醇、右旋糖苷、水解明膠、檸檬酸鈉、甘氨酸或聚乙二 醇等中的一種或其任意混合物。
6. 根據(jù)權利要求4所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物，其為注射液劑， 可藥用輔料為甘露醇、氯化鈉、葡萄糖或聚乙二醇中的一種或其任意混合物。
7. 根據(jù)權利要求5—6任意一項權利要求所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物 組合物，所述藥物的規(guī)格為0. 1 0. 2PNA單位/支或瓶。
8. 根據(jù)權利要求7所述的含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物，其是由重組人 胰激肽原酶150PNA單位，加15克甘露醇、2克右旋糖酐40和5克檸檬酸鈉(枸 櫞酸鈉)溶解，調(diào)節(jié)PH至中性，加注射用水至500毫升，無菌過濾，分裝1000 個安瓿中，無菌條件下冷凍干燥，即得。
9. 權利要求1的含有重組人胰激肽原酶的藥物組合物用于制備預防和/或治療腦 梗塞的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組人胰激肽原酶組合物在制備治療和/或預防腦梗塞的藥物中的用途。本發(fā)明的重組人胰激肽原酶利用分子生物學技術結合表達該重組蛋白的宿主細胞生產(chǎn)制備，對腦梗塞有明顯的治療和/或預防作用。本發(fā)明的重組人胰激肽原酶通常以藥物組合物如凍干粉針劑或注射液劑的形式使用。
文檔編號A61K38/43GK101134105SQ200710123538
公開日2008年3月5日 申請日期2007年7月2日 優(yōu)先權日2007年7月2日
發(fā)明者侯永敏, 傅和亮, 吳蓉蓉, 王曉巖 申請人:廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司