專利名稱：：具有高抑菌活性的新抗菌肽設(shè)計與合成的制作方法具有高抑菌活性的新抗菌肽設(shè)計與合成
技術(shù)領(lǐng)域：
'本發(fā)明技術(shù)涉及抗菌肽的設(shè)計合成與抑菌技術(shù)。技術(shù)背景牛乳鐵蛋白15肽(BovineLactoferricin15簡稱LfcinB15)為乳鐵蛋白分子中N端的第17位到第31位氨基酸。LfcinB15的一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列為Phe-Lys-Cys陽Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala。牛乳鐵蛋白15肽具有一定的抗菌活性。
發(fā)明內(nèi)容色氨酸在抑菌活性中的有重要作用，本發(fā)明采用提高色氨酸含量的方法來改善LfcinB15抗菌活性，設(shè)計并合成了新抗菌肽LfcinB15-W4,10，即通過色氨酸分別替代牛乳鐵蛋白15肽的第四位氨基酸殘基Arg和第十位氨基酸殘基Met，其氨基酸序列為Phe-Lys-Cys-Trp-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Trp隱Lys-Lys-Leu-Gly-Ala(FKCWRWQWRWKKLGA)。體外抑菌實驗結(jié)果表明新抗菌肽對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有不同程度的抗菌效果，比較而言，LfcinB15-W4，10對革蘭氏陰性菌抑制活性較差，對革蘭氏陽性細菌的抑制活性較強。其對金黃色葡萄球菌ATCC25923、糞鏈球菌和枯草芽孢桿菌ATCC6633的最小抑菌濃度分別為4^g/ml、8^g/ml和16^g/ml。青霉素、金霉素、鏈霉素、多西環(huán)素4種抗生素總體上要好于抗菌肽LfcinB15-W4,10。但LfcinB15-W4，10本身不含稀有氨基酸和外源化學成分，不產(chǎn)生耐藥性，是一種極具應(yīng)用潛力的健康安全的抗菌替代物。圖1LfcinB15-W4,10對不同微生物的體外抑菌曲線下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步說明圖1LfcinB15-W4,10對不同微生物的體外抑菌曲線為合成新抗菌肽LfcinB15-W4，10對不同革蘭氏陽性細菌(枯草芽孢桿菌ATCC6633、金黃色葡萄球菌ATCC25923;糞鏈球菌)和革蘭氏陰性細菌(大腸桿菌CVCC195(k88)、BL21(DE3)、ER2566)的體外抑菌曲線，如圖1所示，橫坐標為不同濃度的LfcinB15-W4,10稀釋液，縱坐標為在490nm波長下測試孔的吸光值。具體實施方式采用提高色氨酸含量的方法來改善LfcinB15抗菌活性，設(shè)計并化學合成了新抗菌肽LfcinB15-W4,10，即通過用色氨酸分別替代牛乳鐵蛋白15肽的第四位氨基酸殘基Arg和第十位氨基酸殘基Met，.其氨基酸序列為FKCWRWQWRWKKLGA。應(yīng)用由Hancock實驗室改進的微量肉湯稀釋法測定了抗菌肽牛乳鐵蛋白肽衍生肽LfcinB15-W4，10對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有不同程度的體外抗菌曲線(圖1)以及比較了LfcinB15-W4，10和青霉素、金霉素、鏈霉素、多西環(huán)素4種抗生素的體外抗菌活性(表l)。表1抗菌肽LfcinB15-W4,10和抗生素體外抗菌結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>測試菌株包括大腸桿菌CVCC195(K88)、CMCC44102、枯草芽孢桿菌ATCC6633(717)、金黃色葡萄球菌ATCC25923;糞鏈球菌、大腸桿菌BL21(DE3)、ER2566、畢赤酵母GS115。從抑菌試驗結(jié)果不難看出，LfdnB15-W4，10對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有不同程度的抗菌效果，比較而言，LfdnB15-W4，10對革蘭氏陰性菌抑制活性較差，對革蘭氏陽性細菌的抑制活性較強。其對金黃色葡萄球菌ATCC25923、糞鏈球菌和枯草芽孢桿菌ATCC6633的最小抑菌濃度分別為4^g/ml、8^g/ml和16^g/ml。青霉素、金霉素、鏈霉素、多西環(huán)素4種抗生素總體上要好于抗菌肽LfcinB15-W4,10。以金霉素等為代表的常用作飼料添加劑的抗生素確有比較好的抗菌效果。鏈霉素和多西環(huán)素對幾種測試菌的MIC在0.25//g/ml至l.O^g/ml之間，總體抑菌效果要好于青霉素和金霉素；青霉素和金霉素對測試菌的MIC基本在2//g/ml至32//g/ml之間，只對金黃色葡萄球菌和糞鏈球菌的抑菌效果比較突出，MIC在0.125^g/ml至2.0/^g/ml之間。但LfcinB15-W4，10本身不含稀有氨基酸和外源化學成分，不產(chǎn)生耐藥性，是一種極具應(yīng)用潛力的健康安全的抗菌替代物。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所<120>抗菌肽LfcinB15-W4,10<130>07—1<160>1<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>15<212〉PRT<213>人工序列<220><221>將牛乳鐵蛋白15肽(LfcinB15)第四位Arg替換為Trp，增加色氨酸含量，提高抗菌活性<222>(4)..(4)<220><221>將牛乳鐵蛋白15肽(LfcinB15)第十位Met替換為Trp，增加色氨酸含量，提高抗菌活性〈222>(IO)..(IO)<400>1PheLysCysTrpArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAla15101權(quán)利要求1.具有高抑菌活性的新抗菌肽設(shè)計合成，其特征在于采用提高色氨酸含量的方法來改善LfcinB15抗菌活性，設(shè)計并合成了新抗菌肽LfcinB15-W4，10，即通過色氨酸分別替代牛乳鐵蛋白15肽的第四位氨基酸殘基Arg和第十位氨基酸殘基Met。新抗菌肽LfcinB15-W4，10的氨基酸序列為FKCWRWQWRWKKLGA。2.如權(quán)利要求l所述的具有高抑菌活性的新抗菌肽設(shè)計合成，其特征在于體外抑菌實驗結(jié)果表明新抗菌肽對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有不同程度的抗菌效果，比較而言，LfcinB15-W4,10對革蘭氏陰性菌抑制活性較差，對革蘭氏陽性細菌的抑制活性較強。其對金黃色葡萄球菌ATCC25923、糞鏈球菌和枯草芽孢桿菌ATCC6633的最小抑菌濃度分別為4昭/ml、8lag/ml和16iig/ml。3.如權(quán)利要求l所述的具有高抑菌活性的新抗菌肽設(shè)計合成，其特征在于青霉素、金霉素、鏈霉素、多西環(huán)素4種抗生素總體上要好于抗菌肽LfcinB15-W4，10。全文摘要本發(fā)明是具有高抑菌活性的新抗菌肽設(shè)計合成。色氨酸在抑菌活性中有重要作用，本發(fā)明采用提高色氨酸含量的方法來改善LfcinB15抗菌活性，設(shè)計并合成了新抗菌肽LfcinB15-W4，10，即通過色氨酸分別替代牛乳鐵蛋白15肽的第四位氨基酸殘基Arg和第十位氨基酸殘基Met，其氨基酸序列為FKCWRWQWRWKKLGA。體外抑菌實驗結(jié)果表明新抗菌肽對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有不同程度的抗菌效果，比較而言，LfcinB15-W4，10對革蘭氏陰性菌抑制活性較差，對革蘭氏陽性細菌的抑制活性較強。其對金黃色葡萄球菌ATCC25923、糞鏈球菌和枯草芽孢桿菌ATCC6633的最小抑菌濃度分別為4μg/ml、8μg/ml和16μg/ml。青霉素、金霉素、鏈霉素、多西環(huán)素4種抗生素總體上要好于抗菌肽LfcinB15-W4，10。LfcinB15-W4，10本身不含稀有氨基酸和外源化學成分，不產(chǎn)生耐藥性，是一種極具應(yīng)用潛力的健康安全的抗菌替代物。文檔編號A61P31/04GK101319007SQ20071011050公開日2008年12月10日申請日期2007年6月6日優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日發(fā)明者楊雅麟,達滕,王建華,田子罡申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所