專利名稱：東亞鉗蝎提取物及其預(yù)防和/或治療口腔上皮癌藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有預(yù)防和/或治療口腔上皮癌作用的東亞鉗蝎提取物及其預(yù)防和/或治療口腔上皮癌藥物，以及東亞鉗蝎提取物其制備方法和應(yīng)用，所述的制備方法包括從去除毒腺的東亞鉗蝎中提取一種抗口腔上皮癌的部位，并且通過一種有效的方法證明該提取物的作用及其安全性。
背景技術(shù)：
全蝎是傳統(tǒng)中醫(yī)藥學中常用的中藥，主要是指東亞鉗蝎(Buthus martensicKarch)的干燥蟲體，中醫(yī)臨床用干燥全蟲治療驚風抽搐、風濕痹痛等癥。隨著國內(nèi)外生物醫(yī)藥學和生物化學的發(fā)展，全蝎和蝎毒素的應(yīng)用領(lǐng)域正不斷拓寬，已成為治療多種疾病，特別是一些疑難雜癥的主要藥材。
對全蝎及蝎毒的藥理學研究已經(jīng)取得了較大的進展，一般認為蝎毒是全蝎的主要有效成分(吳英良.我國全蝎及其有效成分的藥理毒理研究及臨床應(yīng)用進展[J].中草藥，1995，26(2)97-99.)。現(xiàn)在對東亞鉗蝎蝎毒提取物以及從蝎毒中提取的抗癌多肽的抗癌作用已經(jīng)有很深入的研究，但是全蝎毒素是類似蛇毒神經(jīng)毒素，毒性甚劇。蝎毒能產(chǎn)生宮縮，并導(dǎo)致早期流產(chǎn)；蝎毒可使胎兒骨化中心延遲或消失，造成胎兒骨骼異常，有致畸作用；蝎毒對骨骼肌也有直接作用，可以招致骨骼肌自發(fā)性抽動和強直性痙攣，終致不可逆性麻痹；全蝎毒素還有呼吸抑制作用(孫利文，張鐵光，徐惠爽.中藥全蝎的研究進展[J].特產(chǎn)研究，1999，160-62.)。因此，研究去除尾部蝎毒后剩余部位的藥理藥效學研究將為全蝎的充分利用提供有價值的證據(jù)，另外去除了蝎尾的毒素，蝎子應(yīng)用將更加安全可靠。申請人已經(jīng)從去尾的蝎體中提取出了抗癲癇的有效部位，該部位可能通過促進GABAA受體的作用而發(fā)揮抗癲癇的作用(黃迎春，左萍萍.東亞鉗蝎提取物對致癇小鼠大腦GABAA受體活性的影響.北京聯(lián)合大學學報，2006，166-68)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有預(yù)防和/或治療口腔上皮癌作用的東亞鉗蝎提取物。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種預(yù)防和/或治療口腔上皮癌藥物。
本發(fā)明的再一個目的在于提供一種東亞鉗蝎提取物的制備方法。
本發(fā)明的還一個目的在于提供一種東亞鉗蝎提取物的應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種東亞鉗蝎提取物，為將去除尾部毒腺的東亞鉗活蝎所獲得的無蝎毒提取物。
一種預(yù)防和/或治療口腔上皮癌藥物，該藥物是由所述的東亞鉗蝎提取物和藥劑學上可接受的載體所組成。本發(fā)明的東亞鉗蝎提取物作為有效成分與蒸餾水配合，可以制成口服液；該東亞鉗蝎提取物和藥劑學上可接受的輔料，如常用的糊精、淀粉、或葡萄糖等配合，可以制成各種劑型，如片劑、膠囊、丸劑等。
一種東亞鉗蝎提取物的制備方法，為將去除尾部毒腺的東亞鉗蝎研磨碎，加入蒸餾水或葡萄糖溶液，或?qū)⑷コ膊慷鞠俚臇|亞鉗蝎在蒸餾水或葡萄糖溶液中搗碎，再經(jīng)充分攪拌混勻，靜置沉淀，取上部溶液離心，離心后再取上清液冷凍干燥，得到凍干粉。
本發(fā)明的東亞鉗蝎提取物的制備方法中，所使用的東亞鉗蝎為活蝎。
本發(fā)明的東亞鉗蝎提取物的制備方法中，所述的東亞鉗蝎研磨碎過程，是在液氮中進行的。
本發(fā)明的東亞鉗蝎提取物的制備方法中，所述的冷凍干燥過程，是在冷凍干燥機中且在-38℃～-42℃條件下進行。
本發(fā)明的東亞鉗蝎提取物的制備方法中，所述的離心過程是在3-5℃條件下進行。
本發(fā)明的東亞鉗蝎提取物的制備方法中，所述的葡萄糖溶液為無菌葡萄糖溶液，其濃度為10體積％。
一種東亞鉗蝎提取物的應(yīng)用，東亞鉗蝎提取物作為制備預(yù)防和/或治療口腔上皮癌藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明是采取一種方法去掉東亞鉗蝎的蝎尾，然后從剩余部分提取活性部位，再對其活性部位進行應(yīng)用，該活性部位具有預(yù)防和/或治療口腔上皮癌作用。從去除蝎尾毒腺后東亞鉗蝎中提取具有預(yù)防和/或治療口腔上皮癌作用的有效部位，可以制備預(yù)防和/或治療口腔上皮癌藥物，并可以制成各種劑型，如片劑、膠囊、丸劑、口服液等，有效地預(yù)防和/或治療口腔上皮癌。本發(fā)明的東亞鉗蝎提取物無毒性、具有安全性。
具體實施例方式
在下述實施例中所使用的東亞鉗蝎購自毫州中藥材公司。
東亞鉗蝎提取物(也稱東亞鉗蝎提取物凍干粉，以下也簡稱蝎粉)，為將去除尾部毒腺的活蝎在液氮中研磨碎，然后加入蒸餾水或10體積％的無菌葡萄糖溶液，其中，研磨碎的蝎體與蒸餾水或10體積％的無菌葡萄糖溶液的體積比是0.8～1.2∶0.8～1.2，經(jīng)過充分攪拌混勻，靜置沉淀12-24小時，取上部溶液，該上部溶液很混濁，有大顆粒，將上部溶液于于立式冷凍離心機，低溫(4℃)，離心，取上清液-20℃冷凍后，置真空冷凍干燥機中，-40℃，冷凍干燥，得到凍干粉。其中，上清液在冷凍干燥機中，是先凍成冰，然后靠升華作用，去除水分，得到東亞鉗蝎提取物凍干粉。
實施例1稱取178.7g冷凍的活蝎，去除尾部毒腺，得到172.1g蝎體，在液氮中研磨碎，然后加入等體積的蒸餾水，充分攪拌混勻，靜置沉淀12小時，上部溶液于立式冷凍離心機，4℃，離心，取上清液-20℃冷凍后，置真空冷凍干燥機中，-40℃，冷凍干燥。得到凍干粉9.6g。
實施例2稱取300g冷凍活蝎，去除尾部毒腺，得279.5g蝎體，加入等體積蒸餾水，置組織搗碎機中，20min，上部溶液于立式冷凍離心機，4℃，離心，取上清液-20℃冷凍后，置真空冷凍干燥機中，-40℃，冷凍干燥，得到凍干粉18.6g。
實施例3稱取279g冷凍活蝎，去除尾部毒腺，得255g蝎體，加入等體積的10體積％的無菌葡萄糖溶液，置組織搗碎機中，20min，靜置沉淀，上部溶液于立式冷凍離心機，4℃，離心，上清液-20℃冷凍后，置真空冷凍干燥機中，-40℃，冷凍干燥。得到凍干粉14g。
證明本發(fā)明的東亞鉗蝎提取物具有對口腔上皮癌的預(yù)防和/或治療作用的細胞系的試驗、動物試驗，以及毒性試驗如下抗口腔上皮癌的作用1、細胞系人口腔上皮癌KB細胞(由中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供)培養(yǎng)于含10％(重量百分比)小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(含青霉素100u/ml，鏈霉素100μg/ml)內(nèi)，鼠正常肝WB細胞(右中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供)培養(yǎng)于含10％(重量百分比)小牛血清的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，上述細胞均置于37℃、5％CO2(體積百分比)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25％(重量百分比)胰蛋白酶和0.02％(重量百分比)EDTA液消化傳代。
2、樣品取150mg蝎粉用1mlRPMI1640全培養(yǎng)基溶解，10倍(體積比)稀釋后過濾除菌，然后用RPMI1640全培養(yǎng)基5倍(體積比)稀釋成100ul/ml(300ug/ml)、20ul/ml(60ug/ml)、4ul/ml(12ug/ml)和0.8ul/ml(2.4ug/ml)。
3、陽性對照阿霉素，因其為廣譜抗腫瘤藥物，除對血液系統(tǒng)腫瘤惡性淋巴瘤有效外，對乳腺癌、頭頸部癌、肺癌、睪丸癌等多種實體瘤有效。
實驗方法取對數(shù)生長期的KB、WB細胞，接種于96孔培養(yǎng)板(Coster)內(nèi)，每孔分別含KB細胞3500個，WB細胞3500個。培養(yǎng)24小時后，加入100ul/ml(300ug/ml)、20ul/ml(60ug/ml)、4ul/ml(12ug/ml)和0.8ul/ml(2.4ug/ml)的蝎粉以及阿霉素2ug/ml、0.02ug/ml、0.002ug/ml。繼續(xù)培養(yǎng)72小時，棄去培養(yǎng)液，每孔加入0.5mg/mlMTT100μl，輕微振蕩使沉淀溶解，于酶標儀(Bio-Red 450型)在參考波長450nm，檢測波長570nm處測定吸光度。每個藥物濃度設(shè)4個平行孔，取其平均值。以不做任何處理的細胞為對照組，用下面的公式計算受試樣品對細胞的存活率，并運用中效分析軟件計算IC50。
存活率(％)＝給藥組平均OD值/對照組平均OD值×100試驗結(jié)果表蝎粉對各細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)

由上表可見蝎粉對腫瘤細胞KB抑制作用較強，需要量較少(4.48ug/ml)，對正常肝細胞也有一定的生長抑制作用，需要量為43.06g/ml，雖然同陽性對照藥相比需要的劑量較大，但是，在實際使用的過程中，中藥的用量一直比西藥的用量要大。我們的這一結(jié)果顯示，蝎粉對口腔上皮癌KB腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度幾乎是對正常細胞WB半數(shù)抑制濃度的十分之一，說明東亞鉗蝎提取物的抑制腫瘤細胞的用量要大大的低于抑制正常細胞的用量。
蝎粉對大鼠口腔癌前病變的作用口腔癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，在其發(fā)生前可有一較長時間的癌前病變階段。抑制或阻斷癌前病變的發(fā)展，或?qū)⑵淠孓D(zhuǎn)為正常組織，是防治口腔癌的重要途徑?？谇话装叩劝┣安∽兪桥R床多間的口腔粘膜疾病，據(jù)報道其癌變率可高達36％，因此受到學者們的普遍關(guān)注，對于口腔癌前病變的研究，可采用不同的動物模型。本試驗擬對1％的9，10-二甲基苯丙蒽(DMBA)(重量百分比)的丙酮溶液處理后后及用蝎粉治療后，大鼠口腔粘膜癌變過程進行階段性觀察，以期證明東亞鉗蝎提取物對口腔上皮癌的預(yù)防和/或治療作用。
動物6-8周健康Wistar大鼠130只(購自北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部)，體重200g左右。
致癌劑將9，10二甲基苯丙蒽(DMBA)2g在室溫下溶于200ml的丙酮溶液中，避光保存?zhèn)溆谩?br> 受試物蝎粉溶液，150mg/ml。
癌前病變模型制作大鼠用乙醚麻醉，撐開口腔，牽出舌體，在舌左后緣1/3處，用拔髓針摩擦粘膜至滲血，吹干后涂抹1％DMBA(重量百分比)，自然干燥，禁水2h，每周3次。
隨機將動物分成5組，模型組30只，對照組10只，蝎粉高劑量治療組30只(1000mg/kg)、中劑量治療組30只(500mg/kg)、低劑量治療組30只(250mg/kg)。均采用滴管喂服，每日一次，喂藥后禁水2h。
分別在實驗第4、6、8周處死動物，觀察涂藥后粘膜出現(xiàn)的色、形、質(zhì)的變化。
模型組到試驗第4周，有27只局部出現(xiàn)白色改變，至第8周，有16只出現(xiàn)明顯白斑樣改變，質(zhì)地粗糙，其中4只表面有潰瘍形成，5里出現(xiàn)顆粒狀改變。正常對照組舌體呈粉紅色，質(zhì)地柔軟。高、中劑量組從實驗開始到第4周，涂致癌劑處粘膜充血，淺表糜爛，第6，8周逐漸變成乳白色，質(zhì)地不硬。至第8周后，低劑量治療組有6例形成明顯白斑樣改變，質(zhì)地較粗糙。
試驗結(jié)果顯示，中、高劑量組舌體沒有白斑樣改變，質(zhì)地不硬，說明蝎粉能夠在癌前病變階段抑制癌前病變的發(fā)展，證明東亞鉗蝎提取物具有對口腔上皮癌的預(yù)防和/或治療作用。
按照使用蝎粉的劑量組推測人用劑量一般來說，動物的耐受性要比人大，也就是單位體重的用藥量動物要比人大。一般按下列公式計算，D2＝D1*K2/K1*(W1/W2)1/2。D為藥物劑量，K為常數(shù)，W為動物體重(kg) (1指人，2指動物，K1＝1.6，K2＝9.1)，如一成人的體重為70kg。則可計算出人用劑量為4.7mg/kg～9.4mg/kg。
安全性檢測動物健康昆明系小鼠(一級)，雌雄兼用，體重22.55±0.20g受試物蝎粉濃度為150mg/ml，取7ml原液加蒸餾水稀釋成500ml，每毫升含蝎粉2.1mg/ml供實驗用。
給藥途徑采用灌胃法。
給藥劑量小鼠在實驗前禁食12小時，不禁水。每次投予蝎粉劑量為42.2mg/kg，按每只體重計算，每次灌胃體積在0.4～0.5ml之間。平均0.94mg/只。
最大耐受實驗在受試物毒性較小的情況下，做最大耐受實驗。采用24小時內(nèi)分3次給藥(9:00，14:00，19:00)，每次劑量為42.2mg/kg，平均累加劑量為2.84mg/只，相當于125.3mg/kg。
觀察毒性反應(yīng)行為活動、精神狀態(tài)、皮膚顏色、呼吸、大小便、鼻眼口分泌物及死亡情況等。
觀察時間給藥后立即觀察，當天觀察10次以上并記錄，之后連續(xù)觀察7天每天1次。
①予實驗采用8只小鼠(雌雄各半)，以42.2mg/kg的蝎粉投給小鼠，連續(xù)觀察15分鐘，以后每15分鐘觀察一次，1小時后每隔1小時觀察一次，經(jīng)10小時以上的觀察未發(fā)現(xiàn)任何異常。
②取小鼠20只進行最大耐受實驗。在最后一次投藥后按上述方法觀察，連續(xù)7天。小鼠均活潑健康，未見任何異?，F(xiàn)象及死亡。
③計算小鼠每日最大耐受量并與成人每日用量進行比較，得出耐受倍數(shù)，以判斷其毒性。根據(jù)蝎粉對人口腔上皮癌治療的參考劑量為4.7mg/kg～9.4mg/kg計算。
按照中藥的安全性評價標準，小鼠耐受量超過人用劑量的100倍即可認為是安全的。本次急性毒性實驗在一次投給小鼠33mg/kg蝎蛋白，即人用劑量的21795～43591倍時，未發(fā)現(xiàn)任何異常反應(yīng)。證明其口服安全。
權(quán)利要求
1.一種東亞鉗蝎提取物，其特征在于為將去除尾部毒腺的東亞鉗活蝎所獲得的無蝎毒提取物。
2.一種預(yù)防和/或治療口腔上皮癌藥物，其特征在于該藥物是由權(quán)利要求1所述的東亞鉗蝎提取物和藥劑學上可接受的載體所組成。
3.一種權(quán)利要求1所述的東亞鉗蝎提取物的制備方法，其特征在于為將去除尾部毒腺的東亞鉗蝎研磨碎，加入蒸餾水或葡萄糖溶液，或?qū)⑷コ膊慷鞠俚臇|亞鉗蝎在蒸餾水或葡萄糖溶液中搗碎，再經(jīng)攪拌混勻，靜置沉淀，取上部溶液離心，離心后再取上清液冷凍干燥，得到凍干粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的東亞鉗蝎提取物的制備方法，其特征在于所使用的東亞鉗蝎為活蝎。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的東亞鉗蝎提取物的制備方法，其特征在于所述的東亞鉗蝎研磨碎過程，是在液氮中進行的。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的東亞鉗蝎提取物的制備方法，其特征在于所述的冷凍干燥過程，是在冷凍干燥機中且在-38℃～-42℃條件下進行。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的東亞鉗蝎提取物的制備方法，其特征在于所述的離心過程是在3-5℃條件下進行。
8.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的東亞鉗蝎提取物的制備方法，其特征在于所述的葡萄糖溶液為無菌葡萄糖溶液，其濃度為10體積％。
9.一種權(quán)利要求1所述的東亞鉗蝎提取物的應(yīng)用，其特征在于東亞鉗蝎提取物作為制備預(yù)防和/或治療口腔上皮癌藥物的應(yīng)用。
全文摘要
一種東亞鉗蝎提取物，為將去除尾部毒腺的東亞鉗活蝎所獲得的無蝎毒提取物。預(yù)防和/或治療口腔上皮癌藥物是由東亞鉗蝎提取物和藥劑學上可接受的載體所組成。東亞鉗蝎提取物的制備方法為將去除尾部毒腺的東亞鉗蝎研磨碎，加入蒸餾水或葡萄糖溶液，或?qū)⑷コ膊慷鞠俚臇|亞鉗蝎在蒸餾水或葡萄糖溶液中搗碎，再經(jīng)攪拌混勻，靜置沉淀，取上部溶液離心，離心后再取上清液冷凍干燥，得到凍干粉。本發(fā)明的東亞鉗蝎提取物可以作為制備預(yù)防和/或治療口腔上皮癌藥物的應(yīng)用，可以制備預(yù)防和/或治療口腔上皮癌藥物，并可以制成各種劑型，如片劑、膠囊、丸劑、口服液等，有效地預(yù)防和/或治療口腔上皮癌。本發(fā)明的東亞鉗蝎提取物無毒性、具有安全性。
文檔編號A61P1/00GK101032526SQ20071009857
公開日2007年9月12日 申請日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日
發(fā)明者黃迎春, 左萍萍 申請人:北京聯(lián)合大學生物化學工程學院