專利名稱：和厚樸酚在制備治療急性白血病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬天然化合物的用途，涉及從植物提取的和厚樸酚的新用途，尤其是在制備治療急性白血病藥物中的用途。
背景技術(shù)：
和厚樸酚是從植物厚樸中提取的一種天然化合物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下 和厚樸酚在對其抗血栓、抗焦慮等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時，證明能被胃腸道吸收，并具有體內(nèi)滯留時間較長、沒有明顯毒副作用等特點(diǎn)(Teng CM，Chen CC，Ko FN，et al.Thromb Res.1988；50757-765，Watanabe K，Watanabe H，Goto Y，etal.Planta Med.1983；49103-108)1946年6月國外第1例化療藥物治療白血病獲得緩解，開辟了白血病治療的新紀(jì)元。70年代后聯(lián)合化療、維持、鞏固治療等策略逐漸完善，近年來隨著新的抗白血病藥物的應(yīng)用，白血病的治療療效有了長足的進(jìn)步。但是困擾著白血病化療效果的是①白血病細(xì)胞完全耐藥，表現(xiàn)為化療后骨髓增生抑制但白血病細(xì)胞不減少；②白血病細(xì)胞部分耐藥，表現(xiàn)為化療后白血病細(xì)胞部分減少，但不理想而隨之白血病細(xì)胞又再增生。
近年來，就白血病細(xì)胞的抗藥性的關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)抑制調(diào)亡與耐藥的形成存在一定的關(guān)系。細(xì)胞凋亡過程受到許多癌基因調(diào)控，如p53基因及Bcl-2家族(包括抑制凋亡基因Bcl-2，Bcl-xL，Mcl-1，Al及Bag，促進(jìn)凋亡的基因如Bax，Bcl-xs，Bad和Bak等)。抑制凋亡基因中Bcl-2蛋白過度表達(dá)時，可引起細(xì)胞不死亡或病死率下降的抗凋亡作用，從而對抗藥物的治療作用，使化療藥物失去效果。即Bcl-2導(dǎo)致耐藥主要是通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑而完成。Bcl-2家族中Bcl-x轉(zhuǎn)錄形成的mRNA經(jīng)剪切、加工形成兩種拼接形式，其中一種稱為Bcl-xL，另一種為Bcl-xs。有研究表明Bcl-xL的過度表達(dá)可顯著降低順鉑、足葉乙甙、長春新堿等藥物的細(xì)胞毒作用并抑制細(xì)胞凋亡，從而形成多藥耐藥。促凋亡基因中Bax功能與Bcl-2相反，當(dāng)Bax增加時自身可形成同源二聚體，致使細(xì)胞凋亡加速，腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性增強(qiáng)。當(dāng)Bcl-2表達(dá)增加，Bax同源二聚體解離，形成Bcl-2Bax異源二聚體，抑制了Bax-Bax同源二聚體的細(xì)胞凋亡作用，從而腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。因而可見，凋亡相關(guān)基因與細(xì)胞耐藥間關(guān)系密切，在產(chǎn)生多藥耐藥的過程中存在著精密的調(diào)控系統(tǒng)，其中的調(diào)控機(jī)理尚不得而知，有待進(jìn)一步深入探討。
細(xì)胞死亡一般分兩類，調(diào)亡和壞死。細(xì)胞凋亡是最早被研究的程序性死亡現(xiàn)象，并且在過去很長一段時間內(nèi)，程序性死亡等同于細(xì)胞凋亡。這種細(xì)胞的有序死亡在形態(tài)學(xué)上被描述為細(xì)胞質(zhì)和和細(xì)胞核的皺縮、染色質(zhì)向核外周集中、DNA的片斷化、細(xì)胞分裂成小的凋亡小體，并通過吞噬作用被除去。凋亡主要通過兩種信號通路引導(dǎo)，即由從線粒體的釋放細(xì)胞色素c介導(dǎo)的內(nèi)源途徑和通過死亡受體與配體結(jié)合并被激活來介導(dǎo)的外源途徑。但隨著研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在凋亡以外，還存在著多種細(xì)胞的程序性死亡方式，由不同的信號通路調(diào)控。自噬是除凋亡外研究最多的程序性死亡，經(jīng)歷這種死亡方式的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器被多個具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡隔離，并被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w或自噬泡降解。在一定的脅迫條件如饑餓、損傷條件下都可引發(fā)細(xì)胞的自噬行為，但過度的自噬行為將導(dǎo)致非凋亡性的細(xì)胞死亡。此外，細(xì)胞還存在著若干種其它程序性死亡方式，如Paraptosis，表現(xiàn)為線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的不斷腫脹和細(xì)胞質(zhì)的泡化。又如Mitotic catastrophe，這種死亡是由有絲分裂的失敗引起，伴隨著線粒體膜的通透化和caspases的激活，但它并不同于凋亡，因?yàn)閷aspases的抑制和Bcl-2的過表達(dá)都不能抑制這種死亡方式的進(jìn)行。
既然化療遭遇耐藥，毒性巨大等種種問題，那么用一種非凋亡的程序性死亡的方式作為對抗腫瘤的辦法就成為目前研究的一個新的熱點(diǎn)。
各種非凋亡類程序性死亡的研究已成為細(xì)胞生物學(xué)的一大熱點(diǎn)。這些研究，一方面豐富了我們對細(xì)胞內(nèi)部調(diào)控機(jī)制的理解，另一方面也為生物體發(fā)育控制，疾病治療等提供了更多的分子靶點(diǎn)和作用機(jī)理，具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供和厚樸酚在制備治療急性白血病藥物中的用途，和厚樸酚英文名為honokiol，CAS number35354-74-6，分子量266.33，化學(xué)命名為3，5’-diallyl-4，2’-dihydroxybiphenyl，分子式為C18H18O2，對人體毒性小。
本發(fā)明的另一個目的是提供和厚樸酚在制備治療急性髓性和急性淋系白血病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所采用和厚樸酚根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)從植物提取或化學(xué)合成，制備的藥物可含有其他的抗腫瘤藥物，及藥物賦形劑或載體。本發(fā)明所述的和厚樸酚與制劑允許的藥物賦形劑或載體按本制劑領(lǐng)域已知方法制成腸道或非腸道組合藥的劑型。制成的制劑形式主要包括液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、滴丸劑或注射劑。口服制劑包括緩釋劑。
制劑的給藥形式主要包括口服給藥或注射給藥。
和厚樸酚殺死白血病細(xì)胞的機(jī)理是誘導(dǎo)非凋亡程序性死亡，其死亡機(jī)制與線粒體PT孔開放緊密相關(guān)。
本發(fā)明的有益效果有(1)提出了和厚樸酚的新用途；(2)和厚樸酚毒性低，對于人體正常細(xì)胞幾乎無毒，是一種潛在的高效低毒的化療藥物。因此，和后樸酚具有很好的臨床腫瘤化療、尤其是抗急性髓性白血病的應(yīng)用前景。


圖1和厚樸酚引起人原代急性髓性白血病(AML)細(xì)胞膜破裂，該死亡可被環(huán)孢菌素A(CsA)所抑制。
圖2和厚樸酚對健康人外周血單個核細(xì)胞的毒性作用。
圖3Caspase總抑制劑(z-VAD-fmk)不能抑制和厚樸酚對AML細(xì)胞的濃度依賴性的殺傷效果，但是CsA可以抑制。
圖4和厚樸酚影響線粒體與壞死密切相關(guān)的PT孔蛋白Cyclophilin D含量。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一和厚樸酚可殺死白血病細(xì)胞，該效用可被CsA抑制住實(shí)驗(yàn)材料原代AML和ALL(急性淋系白血病)單個核細(xì)胞均來源于急性期AML和ALL病人骨髓血，幼稚細(xì)胞比例經(jīng)髓片Giemsa染色鑒定均大于85％。和厚樸酚購自中國藥品與生物制品鑒定所。碘化丙啶(PI)，Caspase總抑制劑(z-VAD-fmk)，環(huán)孢菌素A(CsA)，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液購自Sigma。
實(shí)驗(yàn)方法1.(1)用Ficoll分離液將病人的骨髓血分離出單個核細(xì)胞，臺盼蘭檢查活力。(2)用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基37℃下恢復(fù)單個核細(xì)胞一小時。(3)1×106/ml細(xì)胞種板，將所有細(xì)胞分為兩組，一組預(yù)先加入5μM的CsA處理兩個小時。用10，20，30，40，50，60，80μg/ml的和厚樸酚處理單個核細(xì)胞8或24小時。(4)處理后，收集細(xì)胞，PBS洗滌后，30μg/ml PI室溫下染色10分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜通透性。PI本身不能透過細(xì)胞膜，但是當(dāng)細(xì)胞膜破損以后，可以進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞核著色，所以，PI+細(xì)胞代表細(xì)胞膜破損，PI-細(xì)胞代表細(xì)胞膜完整。將死亡率數(shù)據(jù)輸入origin軟件分析，統(tǒng)計(jì)分析后獲得和厚樸酚對該原代細(xì)胞的LC50，以及在CsA干預(yù)下的和厚樸酚對原代細(xì)胞的LC50。
2.(1)用Ficoll分離液將病人的骨髓血分離出單個核細(xì)胞，臺盼蘭檢查活力。(2)用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基37℃下恢復(fù)單個核細(xì)胞一小時。(3)1×106/ml細(xì)胞種板，用20，30，40，50μg/ml的和厚樸酚處理單個核細(xì)胞8，24，48小時。(4)處理后，收集細(xì)胞，PBS洗滌后，30μg/ml PI室溫下染色10分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜通透性。PI本身不能透過細(xì)胞膜，但是當(dāng)細(xì)胞膜破損以后，可以進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞核著色，所以，PI+細(xì)胞代表細(xì)胞膜破損，PI-細(xì)胞代表細(xì)胞膜完整。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果和厚樸酚可以引起AML單個核細(xì)胞膜破損，這種細(xì)胞毒性呈濃度與時間依賴，而且這種毒性作用可被線粒體PT孔抑制劑CsA所抑制，參見圖1，其中A用10，20，30，40，50，60，80μg/ml的和厚樸酚處理細(xì)胞8小時，提前用CsA處理組該死亡可以被抑制；B用10，20，30，40，50，60，80μg/ml的和厚樸酚處理細(xì)胞24小時，提前用CsA處理組該死亡可以被抑制；C用20，30，40，50μg/ml的和厚樸酚處理細(xì)胞不同時間；用CsA干預(yù)的都是用了5μM，提前處理細(xì)胞2小時。表1中和厚樸酚對多例急性白血病細(xì)胞的LC50在30μg/ml左右。
表1.和厚樸酚對多例急性白血病細(xì)胞的LC50(μg/ml)

實(shí)施例二和厚樸酚對健康人外周血單個核細(xì)胞的毒殺作用實(shí)驗(yàn)材料健康人單個核細(xì)胞均來源于健康志愿者外周血，幼稚細(xì)胞比例經(jīng)髓片Giemsa染色鑒定均大于85％。和厚樸酚購自中國藥品與生物制品鑒定所。碘化丙啶(PI)，環(huán)孢菌素A(CsA)，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液購自Sigma。
實(shí)驗(yàn)方法(1)用Ficoll分離液將病人的骨髓血分離出單個核細(xì)胞，臺盼蘭檢查活力。(2)用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基37℃下恢復(fù)單個核細(xì)胞一小時。(3)1×106/ml細(xì)胞種板，用10，20，30，40，50，60，80μg/ml的和厚樸酚處理單個核細(xì)胞48小時。(4)處理后，收集細(xì)胞，PBS洗滌后，30μg/ml PI室溫下染色10分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜通透性。PI本身不能透過細(xì)胞膜，但是當(dāng)細(xì)胞膜破損以后，可以進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞核著色，所以，PI+細(xì)胞代表細(xì)胞膜破損，PI-細(xì)胞代表細(xì)胞膜完整。將死亡率數(shù)據(jù)輸入origin軟件分析，統(tǒng)計(jì)分析后獲得和厚樸酚對該原代細(xì)胞的LC50。參見圖2，用10，20，30，40，50，60，80μg/ml的和厚樸酚處理細(xì)胞48小時。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果和厚樸酚對健康人外周血單個核細(xì)胞的48小時的LC50大于50μg/ml，其毒性明顯低于對AML病人單個核細(xì)胞的效用。
實(shí)施例三和厚樸酚是通過非經(jīng)典凋亡的死亡方式殺死急性白血病細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)材料健康人單個核細(xì)胞均來源于健康志愿者外周血，幼稚細(xì)胞比例經(jīng)髓片Giemsa染色鑒定均大于85％。和厚樸酚購自中國藥品與生物制品鑒定所。碘化丙啶(PI)，Caspase總抑制劑(z-VAD-FMK)，環(huán)孢菌素A(CsA)，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液購自Sigma。
實(shí)驗(yàn)方法(1)用Ficoll分離液將病人的骨髓血分離出單個核細(xì)胞，臺盼蘭檢查活力。(2)用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基37℃下恢復(fù)單個核細(xì)胞一小時。(3)1×106/ml細(xì)胞種板，用30，40，50μg/ml的和厚樸酚處理單個核細(xì)胞24小時處理，其中設(shè)VP-16 100μg/ml組為凋亡陽性對照，其中z-VAD-FMK 50μM以及CsA 5μM預(yù)先處理相關(guān)組2小時。(4)處理后，收集細(xì)胞，PBS洗滌后，用AnnexinV-FITC染細(xì)胞10min，再用PI染色10min，之后用流式細(xì)胞儀檢測。AnnexinV單陽性細(xì)胞表征凋亡細(xì)胞，PI陽性細(xì)胞表征壞死細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果多個濃度的和厚樸酚引起的細(xì)胞死亡缺乏凋亡標(biāo)志物PS外翻。40μg/ml的HNK引起的細(xì)胞死亡，caspase凋亡總抑制劑無法抑制該組細(xì)胞死亡，但是線粒體PT孔抑制劑CsA可以抑制該死亡。說明和厚樸酚可以通過非經(jīng)典凋亡方式殺死AML單個核細(xì)胞。參見圖3，100μg/ml足葉乙甙(VP16)處理AML細(xì)胞24小時作為調(diào)亡陽性對照，z-VAD-FMK能夠抑制VP16的凋亡誘導(dǎo)作用。30，40，50μg/ml的和厚樸酚處理細(xì)胞。CsA干預(yù)40μg/ml的和厚樸酚處理細(xì)胞組，z-VAD-FMK不能干預(yù)40μg/ml的和厚樸酚處理細(xì)胞組。用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測凋亡。
實(shí)施例四和厚樸酚通過非經(jīng)典凋亡的死亡方式殺死急性白血病細(xì)胞的前期，影響了線粒體與壞死密切相關(guān)的PT孔蛋白Cyclophilin D含量實(shí)驗(yàn)材料健康人單個核細(xì)胞均來源于健康志愿者外周血，幼稚細(xì)胞比例經(jīng)髓片Giemsa染色鑒定均大于85％。和厚樸酚購自中國藥品與生物制品鑒定所。碘化丙啶(PI)，Caspase總抑制劑(z-VAD-FMK)，環(huán)孢菌素A(CsA)，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液購自Sigma。，聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜(Bio-Rad公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠抗體(KPL，美國)，鼠抗人cyclophilinD單抗(Calbiochem)，化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)ECL反應(yīng)液(Santa Cruz公司)，蛋白質(zhì)測定試劑盒(DC Protein Assay Kit，Bio-Rad公司)實(shí)驗(yàn)方法(1)用Ficoll分離液將病人的骨髓血分離出單個核細(xì)胞，臺盼蘭檢查活力。(2)用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基37℃下恢復(fù)單個核細(xì)胞一小時。(3)1×106/ml細(xì)胞種板，用不同濃度的和厚樸酚處理單個核細(xì)胞不同時間梯度病例2用30，40μg/ml的和厚樸酚分別處理樣本6，10，16小時。病例5用20，30，40μg/ml的和厚樸酚處理樣本6，12小時。(4)Western blot收集培養(yǎng)細(xì)胞，用生理鹽水洗兩次，細(xì)胞沉淀加入1×蛋白提取緩沖液(RIPAbuffer，Pierce公司，美國)，吹散，沸水中煮15min，13000轉(zhuǎn)速(rpm)離心20分鐘，取上清測定蛋白質(zhì)濃度(按DC Protein Assay Kit說明書進(jìn)行)。取蛋白提取物50μg，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍(lán)染料到達(dá)凝膠最前沿，停止電泳。
轉(zhuǎn)膜電泳結(jié)束后揭膠，并將凝膠浸于適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液(Transfer buffer，三羥甲基氨基甲烷(Tris)3.03g，甘氨酸，14.36g，甲醇，150ml，用去離子水溶解后用鹽酸調(diào)pH至8.3，定容至1000ml，以下同)中，平衡30分鐘。同時截取適當(dāng)大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一同浸于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，平衡10～15分鐘，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉(zhuǎn)膜過夜。
封閉將轉(zhuǎn)有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的緩沖液(TBST)中封閉1hr。雜交取出已封閉的膜，然后浸于1∶1000稀釋的鼠抗人cyclophilin D(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH 7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH 7.4配制)中，TBST漂洗5分鐘×5次。
壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECL A液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5分鐘后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內(nèi)，壓片，洗片。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖4，從多個病例上的結(jié)果顯示和厚樸酚可以誘導(dǎo)濃度依賴，時間依賴性的線粒體PT孔道蛋白CyclophilinD的水平上升，這與細(xì)胞死亡密切相關(guān)。圖4中，病例2，20μg/ml，30μg/ml和厚樸酚處理細(xì)胞6，10，16小時；病例5，20μg/ml，30μg/ml，40μg/ml的和厚樸酚處理細(xì)胞6，12小時。
以上實(shí)施例說明和厚樸酚可以引起原代AML細(xì)胞死亡的主要方式是一種非經(jīng)典凋亡的壞死，由于其殺腫瘤細(xì)胞主要為一種非調(diào)亡的方式，所以它有可能可以避開普通的困擾白血病治療的調(diào)亡耐藥。
和厚樸酚對小鼠直至120mg/kg劑量是耐受的，實(shí)際為無毒性組分。臨床應(yīng)用上具有廣闊的前景。
權(quán)利要求
1.和厚樸酚在制備治療急性白血病藥物中的用途，所述的和厚樸酚的分子量為266.33，化學(xué)命名為3，5’-diallyl-4，2’-dihydroxybiphenyl，分子式為C18H18O2，其特征是所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的和厚樸酚在制備治療急性白血病藥物中的用途，其特征是在制備治療急性髓系白血病藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的和厚樸酚在制備治療急性白血病藥物中的用途，其特征是在制備治療急性淋系白血病藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的和厚樸酚在制備治療急性白血病藥物中的用途，其特征是所制備的藥物為抗腫瘤化療藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的和厚樸酚在制備治療急性白血病藥物中的用途，其特征是所制備的藥物還含有其他抗腫瘤藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的和厚樸酚在制備治療急性白血病藥物中的用途，其特征是所述藥物的制劑形式包括液體制劑、顆粒劑、緩釋劑、沖劑、片劑或膠丸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的和厚樸酚在制備治療急性白血病藥物中的用途，其特征是所述藥物的給藥方式包括口服給藥或注射給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供和厚樸酚在制備治療白血病藥物中的用途，所述和厚樸酚的分子量266.33，化學(xué)命名為3，5’－diallyl－4，2’－dihydroxybiphenyl，分子式為C
文檔編號A61P35/00GK101057836SQ20071006721
公開日2007年10月24日 申請日期2007年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月8日
發(fā)明者胡汛, 李凌 申請人:浙江大學(xué)