專利名稱：以i型皰疹病毒作為載體的獸用狂犬病重組疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一系列以多片段間同源重組的方式構(gòu)建的表達(dá)狂犬病病毒保護(hù)性抗原 的重組I型皰疹病毒，尤其是公開了一種以I型皰疹病毒作為載體的獸用狂犬病重組疫 苗，可以用于犬和貓等動(dòng)物狂犬病的免疫接種，屬于動(dòng)物用疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
狂犬病是一種重要的人獸共患傳染病，96% 98%的人狂犬病由犬咬傷引起， 一旦發(fā) 病，死亡率100%。預(yù)防人狂犬病發(fā)生的根本措施在于有效的預(yù)防犬的狂犬病。預(yù)防犬狂 犬病最有效的途徑，是采用適當(dāng)?shù)目袢∫呙鐚θM(jìn)行有效的免疫接種。目前，常用的 狂犬病疫苗分為滅活疫苗和弱毒活疫苗，滅活疫苗由于價(jià)格昂貴，影響其推廣使用；而 弱毒活疫苗由于含有活的病毒顆粒，存在毒力返祖的潛在危險(xiǎn)，無論對免疫犬還是對接 觸犬的人，都是一種威脅。在發(fā)達(dá)國家，弱毒疫苗在家養(yǎng)動(dòng)物中早已停止使用。為了研 制適合在我國和其他發(fā)展中國家使用的狂犬病疫苗，已有以犬腺病毒為載體的狂犬病重 組疫苗研制成功，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)和安全評價(jià)，證明該疫苗不僅安全、有效，而且適于 口服，免疫期也較長，但是由于犬腺病毒在犬科動(dòng)物中自然感染率較高，免疫時(shí)受已存 在抗體影響較為明顯，因此，研制以自然感染率低、可誘導(dǎo)較高免疫水平的病毒為載體 的狂犬病重組疫苗，可以克服犬腺病毒抗體的影響是本發(fā)明的目的。 發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明公開一種以I型皰疹病毒作為載體的獸用狂犬病重組口服疫苗，可以用于犬 和貓等動(dòng)物狂犬病的口服免疫接種，具有自然感染率低、可誘導(dǎo)較高免疫水平特點(diǎn)。 本發(fā)明還提供了上述疫苗的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是以I型皰疹病毒為載體，在病毒復(fù)制非必需區(qū)插入狂犬病病 毒保護(hù)性抗原表達(dá)盒，通過基因組片段間同源重組，獲得重組疫苗。將I型皰疹病毒基因組分成若干段，使相鄰片段間含有一定長度的同源序列，將每條片段分別克隆到pPoiyii，得到重組pP:ioyii。然后，根據(jù)i型皰疹病毒復(fù)制非必需基因所在的位置，將狂犬病病毒保護(hù)性抗原基因插入到重組pPloyII中，最后，將所有 重組pPloyII在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染I型皰疹病毒敏感細(xì)胞系，通過多片段間的同源重 組獲得重組病毒。上述的I型皰疹病毒分別選自豬I型皰疹病毒、貓I型皰疹病毒和犬I型皰疹病毒 中的一種。I型皰疹病毒活載體——狂犬病重組疫苗的具體制備方法1. 重組疫苗的構(gòu)建利用pPloyII載體，在多克隆酶切位點(diǎn)處插入人工合成的Linker BE(依次含有BamH I、 EcoRI、 Sacl、 Xbal、 Smal、 Bgl II、 Xho I和EcoR V酶切位點(diǎn))，形成pPloyII-BE 載體。將I型皰疹病毒基因組分成若干段，根據(jù)每一片段的首尾兩端分別設(shè)計(jì)兩對特異 引物，擴(kuò)增片段大小在l.lkb左右，分別將首尾兩端的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pPloy11-BE載 體的多克隆酶切位點(diǎn)處，與I型皰疹病毒基因組共轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，根據(jù)細(xì) 菌內(nèi)同源重組的機(jī)制，獲得5個(gè)中間轉(zhuǎn)移載體。根據(jù)豬I型皰疹病毒基因組中復(fù)制非必 需區(qū)所在的位置，將目的基因插入相應(yīng)的中間轉(zhuǎn)移載體，再與其它中間轉(zhuǎn)移載體在脂質(zhì) 體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染敏感細(xì)胞，隔天傳代，直至出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，獲得重組疫苗。2. 重組疫苗的免疫效力檢測2.1利用敏感細(xì)胞大量制備重組疫苗，并測定疫苗的TCID5 。取無狂犬病免疫史的 家犬或貓為試驗(yàn)動(dòng)物，分別兩側(cè)股內(nèi)側(cè)肌肉注射和口服接種。2.2免疫時(shí)，每只犬或貓肌肉注射或口服重組疫苗，免疫一次，免疫前及免疫后每 周采血并分離血清。2.3采用熒光抗體狂犬病病毒中和試驗(yàn)(FAVN)法，檢測免疫犬或貓血清中和抗體 效價(jià)；采用Reed-Muench法檢測免疫后血清中抗I型皰疹病毒的中和抗體。在狂犬病病毒中，糖蛋白是唯一一種可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的保護(hù)性抗 原成分。而豬I型皰疹病毒是一種極具開發(fā)潛力的疫苗載體，基因背景清楚，遺傳穩(wěn) 定性好，含有許多病毒復(fù)制的非必需基因(TK， gl, gC， gE， gG， PK， gM， gN)，外源 基因容量大(30kb);具有廣泛的宿主范圍，可以感染豬、犬、牛、羊等多種家畜和野 生動(dòng)物，但不感染人。豬I型皰疹病毒疫苗株目前已在國內(nèi)普遍銷售，用于豬偽狂犬病的預(yù)防，經(jīng)過數(shù)年 的臨床應(yīng)用證明對環(huán)境中的其他動(dòng)物不具致病性和其他副作用，通過在犬和貓的試驗(yàn)發(fā) 現(xiàn)，該疫苗株可以通過口服的方式使犬獲得免疫。因此，利用該疫苗作為狂犬病的重組 疫苗載體，研制相應(yīng)的狂犬病口服疫苗具有良好的前景。犬和貓I型皰疹病毒也是皰疹病毒科的主要成員，宿主范圍有限，只對本動(dòng)物易感， 其自然弱毒株的TK、 gl和gE是病毒的復(fù)制非必需區(qū)，可以插入外源基因表達(dá)盒，適合 開發(fā)成相應(yīng)的犬和貓用狂犬病口服重組疫苗。本發(fā)明的積極效果在于疫苗使用安全、有效、方便，而且適于口服，免疫期持久， 自然感染率低、可誘導(dǎo)較高免疫水平。具體實(shí)施方案下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)-一步描述。其作用被理解為是對本發(fā)明的闡釋而非 對本發(fā)明的任何形式的限制。 實(shí)施例1豬I型皰疹病毒活載體——狂犬病重組疫苗 1.重組疫苗的構(gòu)建 1.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)豬I型皰疹病毒基因組序列，對每段片段的首尾兩端設(shè)計(jì)兩對引物。引物序列 如下-引物Fl: 5- gaatccGAGGATCAGCTCTCATATGAGC-3, 引物Rl: 5- tctagaCCATCGTTCGCACATCAAC-3 ， 引物Fl， 5-tctagaCACGAGATCATGCCCACTAG-3， 引物RJ， 5- agatctCATCGTCGACGTGTAGCTCG-3, 引物F2: 5- gaatccCACGAGATCATGCCCACTAG-3 ， 引物R2: 5- tctagaCATCGTCGACGTGTAGCTCG-3 ， 引物F2， 5- tctagaCCCCGCTTTATACCGTTCGTCA-3 ， 弓l物R2， 5-agatctGACCCGCTGTTCACCTCCATCA-3， 引物F3: 5- gaatccCCCCGCTTTATACCGTTCGTCA-3, 引物R3: 5- tctagaGACCCGCTGTTCACCTCCATCA-3, 引物F3， 5- tetagaGCAGGAGACGGTGACGAACA丁G-3, 弓I物R3 ， 5- agatctGGGCGTG A AG A ACTTG A AGCAG-3 ， 引物F4: 5- gaatccGCAGGAGACGGTGACGAACATG-3, 引物R4: 5- tctagaGGGCGTGAAGAACTTGAAGCAG-3， 引物F4': 5- tctagaGGGGTCTTTCTGCCTGAGCG-3, 引物R4， 5陽agatotATCCAAGGCGTGGCTGTCC-3 ， 引物F5: 5- gaatccGGGGTCTTTCTGCCTGAGCG-3 ， 引物R5: 5- tctagaATCCAAGGCGTGGCTGTCC-3 ， 引物F5': 5- tctagaAGGGAACTGCCGTTGCAACCAT-3, 弓I物R5， 5- agatctGAAAAAAGGGGGCGGGGCTTAA-3 。在TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶作用下，95。C預(yù)變性5min， 94。C變性45s, 59。C退火 45s， 72。C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，獲得擴(kuò)增片段。將引物擴(kuò)增的片段連入pMD18-T Vector中，測序正確后，利用引物中設(shè)計(jì)的酶切 位點(diǎn)將片段1與1' ， 2與2' ， 3與3' ， 4與4' ， 5與5'分別克隆入pPloyll-BE 中，得到5個(gè)重組質(zhì)粒，每個(gè)重組質(zhì)粒分別與豬I型皰疹病毒基因組共轉(zhuǎn)化到DH5a感 受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過鑒定，獲得陽性同源重組質(zhì)粒，命名為pPloyll-1、 pPloyll-II、 pPloyll-III、 pPloyIHV和pPloyll-V。將含有狂犬病病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)盒插入含有該復(fù)制非必需基因片段的陽性同 源重組質(zhì)粒。使該質(zhì)粒與其它同源重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，隔天傳代，直至出現(xiàn)典 型的細(xì)胞病變，獲得重組疫苗命名為PHV-RVG。1. 2重組疫苗基因組鑒定PCR鑒定取50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)已呈典型病變的單層PK-15細(xì)胞，傾棄培養(yǎng)基，以PBS洗滌2次，加入800y 1新鮮配制的細(xì)胞裂解液(0.6%SDS， 10mM EDTA， 100ug/ml蛋白酶K), 37。C溫育lh，加入200y 1 5M NaCl，輕輕混勻后，冰水浴lh。將全部混合物移入離心管，于4r， 12000rpffl離心40niin，上清移入加一離心管，以等體積酚氯仿抽提2次，加入終濃度O. 25M醋酸鈉和2倍體積無水乙醇，12000rpm離心10min， DNA沉淀以70%乙醇洗滌1次，無菌風(fēng)干后，溶于50tU去離子水。以基因組為模板設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增外源基因，測序鑒定。鑒定用PCR引物序列如下 TKF: 5'- ATGCGCATCCTCCGGATCTA-3'; TKR: 5'-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3'。 PKF: 5'- ATGTTGGCGATGTGGAGATG-3'; PKR: 5'-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3'。 gEF: 5,-ATGCGGCCCTTTCTGCTGCG-3'; gER: 5，-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3，。 gIF: 5'-ATGATGATGGTGGCGCGCGA-3'; gIR: 5'-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3'。 gGF: 5，- ATGAAGTGGGCAACGTGGAT-3'; gGR: 5，-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3，。 gCF: 5，- ATGGCATCACTAGCTCGTGC-3，； gCR: 5'-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3，。 gMF: 5，- TTATTCAAAGCCGAGGTTCT-3， gMR: 5'-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3'。 gNF: 5'-AGAGCTCGAAGACGTAGTCC-3'; gNR: 5'-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3'。PCR反應(yīng)條件同上。Southern blotting鑒定根據(jù)狂犬病病毒cDNA序列設(shè)計(jì)一對引物(F: 5， -GTTGTGGAGGATGAAGGA-3， ； R: 5， -GGTGTMTCGTGGTTAGTTG-3 ，)，反應(yīng)條件為94°C 5min， 94°C 45s， 48°C 40s， 72°C 30s, 30循環(huán)，72°C 10min，擴(kuò)增片段長度為444bp。6將PCR產(chǎn)物用用酚、氯仿抽提后，用乙醇沉淀，溶于去離子水中進(jìn)行探針的標(biāo)記。按上 述重組疫苗基因組提取方法提取重組病毒基因組，轉(zhuǎn)移到NC膜上，用標(biāo)記好的探針雜 交液與NC膜反應(yīng)顯色以確定目的基因的存在。 1.3 TCIDs。的測定將1X107PK-15細(xì)胞傳入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔內(nèi)細(xì)胞約1X1015，補(bǔ)加培養(yǎng)基至 100ul。次日，接入待測病毒樣品。在1 11孔內(nèi)，進(jìn)行10—' 10-"稀釋，A H列為同 濃度重復(fù)。7天后，以KSrber法計(jì)算待測重組疫苗的TCID5 。 1.4毒力鑒定取4 5月齡狂犬病病毒抗體陰性犬20條，按接種量不同分為2組，每組10條，分 別用含10^0105 和10711:105。的重組疫苗細(xì)胞培養(yǎng)液各肌肉注射10條犬。注射后，觀察 注射犬的飲食、精神狀態(tài)等表現(xiàn)，測量體溫、計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)量和其它臨床表現(xiàn)等，并在 4周后解剖注射犬，觀察犬體病理變化，并進(jìn)行肝等主要臟器的組織切片觀察。 1. 5穩(wěn)定性鑒定1X106PK-15細(xì)胞傳入25crf細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，細(xì)胞長成單層后，按培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基體 積的0.5%接入重組疫苗，接種后3 4天收毒，對各種重組疫苗分別連續(xù)傳代40次，標(biāo) 記并保存每次的培養(yǎng)液，同時(shí)每隔5代提取重組病毒基因組，通過PCR和DNA測序鑒定 外源基因的大小、方向和位置。 1.6免疫原性鑒定(Western blotting)取含狂犬病病毒CVS-1]株的細(xì)胞裂解液50 u丄，加等量2XSDS-PAGE上樣緩沖液， 沸水浴10min，冷卻至室溫，短暫離心后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完畢，將膠上蛋白樣 品電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別與犬抗重組疫苗的多抗及陽性和陰性對照多抗、HRP 標(biāo)記兔抗犬二抗反應(yīng)，最后以DAB/H^顯色，根據(jù)顯色帶出現(xiàn)與否及其位置判定重組疫 苗是否表達(dá)狂犬病病毒保護(hù)性抗原。 1.7結(jié)果(1) 重組疫苗基因組內(nèi)均正確插入了狂犬病病毒保護(hù)性抗原，轉(zhuǎn)錄方向與病毒基因 組轉(zhuǎn)錄方向一致；(2) 0. hil重組疫苗的TCID;',與載體病毒無明顯差別，為106 5 107;(3) 重組疫苗表達(dá)了狂犬病病毒保護(hù)性抗原，抗體可以與狂犬病病毒糖蛋白特異性 5口 pj ;(4) 毒力檢測結(jié)果顯示，注射犬未出現(xiàn)飲食和精神表現(xiàn)異常，體溫在正常范圍內(nèi) (37.5 38. 5'C)。體內(nèi)白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，白細(xì)胞總數(shù)(7. 5 16.0X107L)分類計(jì)數(shù)均在正常范圍內(nèi)，注射犬未出現(xiàn)藍(lán)眼或厭食等臨床表現(xiàn)。解剖未見主要組織器官出現(xiàn)異常 變化，重組疫苗注射犬肺、肝和腎等組織切片與健康犬的組織切片無明顯區(qū)別。(5) 穩(wěn)定性鑒定結(jié)果表明，重組疫苗經(jīng)過40代傳代，基因組(包括外源基因的大小、方向和位置)保持不變，外源基因序列未發(fā)生改變。 2.重組疫苗效力檢測 2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物狂犬病病毒抗體陰性的4 5月齡犬20條，3 6月齡貓20只，均隨機(jī)分為2組， 每組10只。 2. 2動(dòng)物免疫分別以TCID5。為l(f 5的重組疫苗PHV-RVG對4組動(dòng)物進(jìn)行免疫，其中肌肉注射10 條犬和10只貓，lml/條；口服10條犬和10只貓，2ml/條。 2. 3免疫檢測免疫前及免疫后每周分別采集少量靜脈血，分離血清，以FAVN檢測受試犬狂犬病病 毒中和抗體水平。2. 4攻毒試驗(yàn)免疫6周后，每組隨機(jī)抽取5只動(dòng)物，以100 0)5 狂犬病標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株(^3-24接種。 隔離觀察至接種后40天，詳細(xì)記錄各組動(dòng)物的發(fā)病及死亡情況。 2.5結(jié)果(1) 所有受試動(dòng)物的免疫前血清內(nèi)檢不出抗狂犬病病毒的特異性抗體；(2) 所有犬和貓免疫后2 3周，其血清中均可檢出抗I型皰疹病毒抗體，至6周時(shí)， 抗體仍維持在較高水平；(3) 所有受試犬和貓免疫后3 4周時(shí)，其血清中均可檢出狂犬病中和抗體，抗體消 長規(guī)律與I型皰疹病毒抗體一致；(4) 受試犬和貓能抵抗狂犬病強(qiáng)毒的攻擊，存活率為95%。3. 結(jié)論口服和肌肉注射重組疫苗PHV-RVG均可誘導(dǎo)犬和貓產(chǎn)生針對I型皰疹病毒和狂犬病 病毒的特異性中和抗體，對I型皰疹病毒和狂犬病病毒感染具有保護(hù)作用。 實(shí)施例2貓I型皰疹病毒活載體——狂犬病重組疫苗 1.重組疫苗的構(gòu)建 1.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)貓I型皰疹病毒基因組序列，對每段片段的首尾兩端設(shè)計(jì)兩對引物。引物序列 如下引物Fl: 5-gaatccAACGTCCACCCGGGGTGGGT-3; 引物Rl: 5- tctagaCACGTCACCAGTGGAGATAG-3; 引物F，5- tctagaTAACCCGGTT]TGAGGGTTA-3: 引物Rl， 5- agatctAGTCAACATCCTCGATACAA-3:引物F2:5-gaatccGAATTCCCAGGCGACCCGAC -3;引物R2:5-tctagaA AAC ATATTAGTCGCACGAC-3;引物F2':-tctagaCCCCGCTTTATACCGTT'CGTCA-3;引物R2':-agatctAATCTTTTATCTGG AACTAC-3;引物F3:5-gaatccGAGCTCCCGGAGGAGG ATAT-3;引物R3:tctagaGATCCATCGCCTGGGGA ATT-3:引物F3':&-tctagaTCGAAGAGTTATAACCATCG-3;引物R3':-agatctCGACATATTAAGTATTATGC-3;引物F4:5-gaatccGTGGAATCTACGCACTGCGG-3;引物R4:5-tctagaGGCGAGTAAACCGTGTCATT-3;引物F4':5..tctagaCTTTTAGTCGATGGGG AT'GG-3;引物R4':隱agatotTACATCTGGATGTCCAATCG-3;引物F5:5-gaatccCCGGATCTGGGTACAGTGTA-3;引物R5:5-tctagaTAAGCA ATTATCATCTGTGG-3;引物F5':5-■ tctagaTATTACACCA ACTATATGGT-3;引物R5':5.-agatctGAAAAAAGGGAGTGGAACGAC-3。在TaKaRa Ex T叫DNA聚合酶作用下，95。C預(yù)變性5min， 94。C變性45s， 59。C退火 45s， 72。C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，獲得擴(kuò)增片段。將引物擴(kuò)增的片段連入pMD18-T Vector中，測序正確后，利用引物中的設(shè)計(jì)的酶 切位點(diǎn)將片段l與l， ， 2與2' ， 3與3' ， 4與4' ， 5與5，分別克隆入pPloylI-BE 中，得到5個(gè)重組質(zhì)粒，每個(gè)重組質(zhì)粒分別與貓I型皰疹病毒基因組共轉(zhuǎn)化到DH5ci感 受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過鑒定，獲得陽性同源重組質(zhì)粒，命名為pPloyII-I， 、 pPloyl1-II，、 pPloyII-m， 、 pPloyII.-IV'和pPloyl1-V'。將含有狂犬病病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)盒插入含有該復(fù)制非必需基因片段的中間轉(zhuǎn) 移載體中。使該中間轉(zhuǎn)移載體與其它中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染FK-81細(xì)胞，隔天傳代，直至 出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，獲得重組疫苗命名為FHV-RVG。 1.2重組疫苗基因組鑒定PCR鑒定取50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)已呈典型病變的單層FK-81細(xì)胞，傾棄培養(yǎng)基，以PBS 洗滌2次，加入800y 1新鮮配制的細(xì)胞裂解液(0.6%SDS， 10mM EDTA， 100ng/ml蛋 白酶K)， 37。C溫育lh,加入200y 1 5M NaCl，輕輕混勻后，冰水浴lh。將全部混合物 移入離心管，于4。C， 12000rpra離心40min，上清移入加一離心管，以等體積酚氯仿抽 提2次，加入終濃度0. 25M醋酸鈉和2倍體積無水乙醇，12000rpm離心10min， DNA沉淀以70%乙醇洗滌1次，無菌風(fēng)干后，溶于50"1去離子水。以基因組為模板設(shè)計(jì)引物， 擴(kuò)增外源基因，測序鑒定。鑒定用PCR引物序列如下 TKF: 5'- TACATACACAA丁CAGGTCGG-3'; TKR: 5'-TCGGTAAACCAGTCAACATC-3'。 gEF: 5'- ATgggACTgCTTgTTACCAT -3，； gER: 5'-CTACGCGACTGTAATCTGG-3'。 gIF: 5，- ATGTCGTCGATAGCCTTCAT -3'; gIR: 5'- AATCACGGTTAACTGACTTC -3，。PCR反應(yīng)條件同上。Southern blotting鑒定根據(jù)狂犬病病毒cDNA序列設(shè)計(jì)一對引物(F: 5' -GTTGTGGAGGATGAAGGA-3' : R: 5' --GGTGTAATCGTGGTTAGTTG-3，)，反應(yīng)條件為94°C 5tnin, 94°C 45s， 48°C 40s， 72°C 30s, 30循環(huán)，72°C 10min，擴(kuò)增片段長度為444bp。 將PCR產(chǎn)物用用酚、氯仿抽提后，用乙醇沉淀，溶于去離子水中進(jìn)行探針的標(biāo)記。按上 述重組疫苗基因組提取方法提取重組疫苗的基因組，將其轉(zhuǎn)移到NC膜上，用標(biāo)記好的 探針雜交液與NC膜反應(yīng)顯色以確定目的基因的存在。 1.3 TCID5。的測定將1X107FK-81細(xì)胞傳入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔內(nèi)細(xì)胞約lXl(f，補(bǔ)加培養(yǎng)基至 衡l。次n,接入待測病毒樣品。在J U孔內(nèi)，進(jìn)行10—' 10—"稀釋，A H列為同 濃度重復(fù)。7天后，以Kirber法計(jì)算待測S組疫苗的TCID5。。 1.4毒力鑒定取3 5月齡貓I型皰疹病毒和狂犬病病毒抗體陰性貓20只，按接種量不同分為2 組，每組10只，分別用含108TC'ID5。和1()"TC瓜5。的重組疫苗細(xì)胞培養(yǎng)液各肌肉注射10 只貓。注射后，觀察注射犬的飲食、精神狀態(tài)等表現(xiàn)，測量體溫、計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)量和其 它臨床表現(xiàn)等，并在4周后解剖注射貓，觀察貓?bào)w病理變化，并進(jìn)行肝等主要臟器的組 織切片觀察。 1.5穩(wěn)定性鑒定1X106FK-81細(xì)胞傳入25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，細(xì)胞長成單層后，按培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基體 積的0.5%接入重組疫苗，接種后3 4天收毒，對各種重組疫苗分別連續(xù)傳代40次，標(biāo) 記并保存每次的培養(yǎng)液，同時(shí)每隔5代提取感染細(xì)胞中的重組病毒基因組，通過PCR和 DNA測序鑒定外源基因的大小、方向和位置。 1.6免疫原性鑒定(Western blotting)取含狂犬病病毒CVS-11株的細(xì)胞裂解液50 "1,加等量2XSDS-PAGE上樣緩沖液， 沸水浴10rain，冷卻至室溫，短暫離心后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完畢，將膠上蛋白樣 品電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別與貓抗重組疫苗的多抗及陽性和陰性對照多抗、服P 標(biāo)記兔抗貓二抗反應(yīng)，最后以DAB/HA顯色，根據(jù)顯色帶出現(xiàn)與否及其位置判定重組疫苗是否表達(dá)狂犬病病毒保護(hù)性抗原。 1.7結(jié)果(1) 重組疫苗基因組內(nèi)正確插入了狂犬病病毒保護(hù)性抗原，轉(zhuǎn)錄方向與病毒基因組轉(zhuǎn)錄方向一致；(2) 0. lml重組疫苗的TCID.a,與載體病毒無明顯差別，為10" 107;(3) 重組疫苗均表達(dá)了狂犬病病毒保護(hù)性抗原，抗體可以與狂犬病病毒糖蛋白特異 性結(jié)合；(4) 毒力檢測結(jié)果顯示，注射貓未出現(xiàn)飲食和精神表現(xiàn)異常，體溫在正常范圍內(nèi) (37.2 38.化)。體內(nèi)白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，白細(xì)胞總數(shù)(7. 5 16. 0X107L)分類計(jì)數(shù)均在正常范圍內(nèi)，注射貓未出現(xiàn)厭食等臨床表現(xiàn)。解剖未見主要組織器官出現(xiàn)異常變化， 重組疫苗注射貓肺、肝和腎等組織切片與健康貓的組織切片無明顯區(qū)別。(5) 穩(wěn)定性鑒定結(jié)果表明，重組疫苗經(jīng)過40代傳代，基因組(包括外源基因的大 小、方向和位置)保持不變，外源基因序列未發(fā)生改變。2.重組疫苗效力檢測 2. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物狂犬病病毒抗體陰性的3 5月齡貓2()只，隨機(jī)分為2組，每組10只。 2. 2動(dòng)物免疫分別以TCIDs。為106鄰重組疫苗FHV-對2組貓進(jìn)行免疫，其中肌肉注射10只， 0.5ml/條；口服10只，lml/條。2. 3免疫檢測免疫前及免疫后每周分別采集少量靜脈血，分離血清，以FAVN檢測受試犬狂犬病病 毒中和抗體水平。 2.4攻毒試驗(yàn)免疫6周后，每組隨機(jī)抽取5只貓，以100LD5u狂犬病標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株CVS-24接種。隔 離觀察各貓至接種后40天，詳細(xì)記錄各組貓的發(fā)病及死亡情況。 2.5結(jié)果(1) 所有受試貓的免疫前血清內(nèi)檢不出抗及狂犬病病毒的特異性抗體；(2) 所有貓免疫后2 3周，其血清中均可檢出抗I型皰疹病毒抗體，至6周時(shí)，抗 體仍維持在較高水平；(3) 所有受試貓免疫后3 4周時(shí)，其血清中均可檢出狂犬病中和抗體，抗體消長規(guī) 律與I型皰疹病毒抗體---致；(4) 受試貓能抵抗狂犬病強(qiáng)毒的攻擊，存活率為95%。3. 結(jié)論重組疫苗FHV-RVG可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對I型皰疹病毒和狂犬病病毒的特異性中和抗體，對I型皰疹病毒和狂犬病病毒感染具有保護(hù)作用。 實(shí)施例3犬I型皰疹病毒活載體一-~S犬病重組疫苗 1.重組疫苗的構(gòu)建 1.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)犬I型皰疹病毒基因組序列，對每段片段的首尾兩端設(shè)計(jì)兩對引物。引物序列如下引物Fl: 5- gaatccGAATTCACATTTATCAAAAAC -3; 引物Rl: 5- tctagaATATCATCACCATTTATAGG-3; 引物F，5- tctagaGTTCTAAATTAATAGTAC八T -3; 引物R1， 5- agatctTAAATAGATTTCTATAGTAG-3; 引物F2: 5- gaatccATTATTTATACTTTA ATA AT -3; 引物R2: 5- tctagaTCTCCTGA A AG A ATATGAGT-3; 引物F2， 5- tctagaACGTTTGAAAAATGTAAATG -3; 引物R2， 5-agatctTTGGATGTAGATGCTGAAGT-3; 引物F3: 5- gaatccTATGAATGAAATCTATGAAT -3; 引物R3: 5- tctagaTTGCATGGGGTGAAACCTAT-3; 引物F3': 5- tctagaAAATGAATTTC'CATCTGATT -3; 引物R3 ， 5- agatctTTATTCCATAGCTCAGTATT-3; 引物F4: 5- gaatccTACTGAGTTTTCCCCACATG -3 -, 引物R4: 5- tctagaGGGCGTGAAGAACTTGAAGCAG-3; 引物F4， 5- tctagaACGATTATTTTCAAGGCGCG -3; 弓I物R4': 5- agatctG AAA A A AGGGAGTGGA ACG AC-3 。在TaKaRa Ex T叫DNA聚合酶作用下，95。C預(yù)變性5ndn， 94。C變性45s， 59'C退火 45s， 72。C延伸lmin,共30個(gè)循環(huán)，獲得擴(kuò)增片段。將引物擴(kuò)增的片段連入pMD18-T Vector中，測序正確后，利用引物中的設(shè)計(jì)的酶 切位點(diǎn)將片段l與l' ， 2與2' ， 3與3' ， 4與4'分別克隆入pPloyII-BE中，得到 4個(gè)重組質(zhì)粒，每個(gè)重組質(zhì)粒分別與犬I型皰疹病毒基因組共轉(zhuǎn)化到DH5 a感受態(tài)細(xì)胞 中，經(jīng)過鑒定，獲得陽性同源重組質(zhì)粒，命名為pPloyll-1' ' 、 pPloylI-n''、 pPloyll-III''和pPloyII-IV，'。將含有狂犬病病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)盒插入含有該復(fù)制非必需基因片段的中間轉(zhuǎn) 移載體中。使該中間轉(zhuǎn)移載體與其它中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，隔天傳代，直至出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，獲得重組疫苗命名為CHV-RVG。1.2重組疫苗基因組鑒定PCR鑒定取50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)已呈典型病變的單層MDCK細(xì)胞，傾棄培養(yǎng)基，以PBS洗滌2次，加入800y 1新鮮配制的細(xì)胞裂解液(0.6% SDS， lOmM EDTA， 100ug/ml蛋白酶K)， 37。C溫育lh，加入200u 1 5M NaCt,輕輕混勻后，冰水浴lh。將全部混合物移入離心管，于4'C， r2000rpm離心40min,上清移入加一離心管，以等體積酚氯仿抽提2次，加入終濃度0. 25M醋酸鈉和2倍體積無水乙醇，12000rpm離心10min, DNA沉淀以70%乙醇洗滌1次，無菌風(fēng)千后，溶于5()nl去離子水。以基因組為模板設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增外源基因，測序鑒定。鑒定用PCR引物序列如下 TKF: 5，- GTTCTAAATTAATAGTACAT-3'; TKR: 5'-TAAAAACCTTTTCGATGTTG-3，。 gEF: 5'- TTTACGATGTTTCGTTTATT -3'; gER: 5' -CATTCTGGATTGATTTTAAG-3'。 gIF: 5，網(wǎng)ATTCATGTACCTACAACTTT-3'; gIR: 5'-GTTTCAAGAGATGTCTCCCT-3'。PCR反應(yīng)條件同上。Southern blotting鑒定根據(jù)狂犬病病毒cDNA序列設(shè)計(jì)一對引物(F: 5' -GTTGTGGAGGATGAAGGA-3' ; R: 5， -GGTGTAATCGTGGTTAGTTG-3，)，反應(yīng)條件為94°C 5min， 94°C 45s， 48。C 40s， 72°C 30s， 30循環(huán),72°C 10min，擴(kuò)增片段長度為444bp。 將PCR產(chǎn)物用用酚、氯仿抽提后，用乙醇沉淀，溶于去離子水中進(jìn)行探針的標(biāo)記。按上 述重組疫苗基因組提取方法提取重組疫苗的基因組，將其轉(zhuǎn)移到NC膜上，用標(biāo)記好的 探針雜交液與NC膜反應(yīng)顯色以確定目的基因的存在。 1.3TCIDs。的測定將1X107MDCK細(xì)胞傳入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔內(nèi)細(xì)胞約1X106，補(bǔ)加培養(yǎng)基至 100yl。次日，接入待測病毒樣品。在1 11孔內(nèi)，進(jìn)行10—' 1(T稀釋，A H列為同 濃度重復(fù)。7天后，以KS.rber法計(jì)算待測重組疫苗的TCID別。 1.4毒力鑒定取4 5月齡狂犬病病毒抗體陰性犬2()條，按接種量不同分為2組，每組10條，分 別用含10"TCIDs。和1()7TCIQ3。的重組疫苗細(xì)胞培養(yǎng)液各肌肉注射IO條犬。注射后，觀察 注射犬的飲食、精神狀態(tài)等表現(xiàn)，測量體溫、計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)量和其它臨床表現(xiàn)等，并在 4周后解剖注射犬，觀察犬體病理變化，并進(jìn)行肝等主要臟器的組織切片觀察。 1.5穩(wěn)定性鑒定lXl(fMDCK細(xì)胞傳入25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，細(xì)胞長成單層后，按培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基體 積的0.5%接入重組疫苗，接種后3 4天收毒，對各種重組疫苗分別連續(xù)傳代40次，標(biāo) 記并保存每次的培養(yǎng)液，同時(shí)每隔5代提取感染細(xì)胞中的重組病毒基因組，通過PCR和DNA測序鑒定外源基因的大小、方向和位置。 1.6免疫原性鑒定(Western blotting)取含狂犬病病毒CVS-11株的細(xì)胞裂解液50 u 1，加等量2XSDS-PAGE上樣緩沖液， 沸水浴10min，冷卻至室溫，短暫離心后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完畢，將膠上蛋白樣 品電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別與犬抗重組疫苗的多抗及陽性和陰性對照多抗、HRP 標(biāo)記兔抗犬二抗反應(yīng)，最后以DAB/H必,顯色，根據(jù)顯色帶出現(xiàn)與否及其位置判定重組疫 苗是否表達(dá)狂犬病病毒保護(hù)性抗原。 1.7結(jié)果(1) 重組疫苗基因組內(nèi)正確插入了狂犬病病毒保護(hù)性抗原，轉(zhuǎn)錄方向與病毒基因組 轉(zhuǎn)錄方向一致；(2) 0.1ml重組疫苗的TCID5。載體病毒無明顯差別，為106 5 107;(3) 重組疫苗表達(dá)了狂犬病病毒保護(hù)性抗原，抗體可以與狂犬病病毒糖蛋白特異性^b人5口 口 ；(4) 毒力檢測結(jié)果顯示，注射犬未出現(xiàn)飲食和精神表現(xiàn)異常，體溫在正常范圍內(nèi) (37. 5 38. 5°C)。體內(nèi)白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，白細(xì)胞總數(shù)(7. 5 16. 0X107L)分類計(jì)數(shù)均在正常范圍內(nèi)，注射犬未出現(xiàn)藍(lán)眼或厭食等臨床表現(xiàn)。解剖未見主要組織器官出現(xiàn)異常 變化，重組疫苗注射犬肺、肝和腎等組織切片與健康犬的組織切片無明顯區(qū)別。(5) 穩(wěn)定性鑒定結(jié)果表明，重組疫苗經(jīng)過40代傳代，基因組(包括外源基因的大 小、方向和位置)保持不變，外源基因序列未發(fā)生改變。2.重組疫苗效力檢測 2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物狂犬病病毒抗體陰性的4 5月齡犬20條，隨機(jī)分為2組，每組10條。 2. 2動(dòng)物免疫分別以TCIDs。為1(fs的重組疫苗CHV-RVG對2組犬進(jìn)行免疫，其中肌肉注射10條， lml/條;口服10條,2ml/條。 2. 3免疫檢測免疫前及免疫后每周分別采集少量靜脈血，分離血清，以FAVN檢測受試犬狂犬病病 毒中和抗體水平。 2. 4攻毒試驗(yàn)免疫6周后，每組隨機(jī)抽取5條犬，以100U)5?？袢?biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株CVS-24接種。隔 離觀察各犬至接種后40天，詳細(xì)記錄各組犬的發(fā)病及死亡情況。 2.5結(jié)果(1) 所有受試犬的免疫前血清內(nèi)檢不出抗狂犬病病毒的特異性抗體；(2) 所有犬免疫后2 3周，其血清中均可檢出抗I型皰疹病毒抗體，至6周時(shí)，抗體仍維持在較高水平；(3) 所有受試犬免疫后3 4周時(shí)，其血清中均可檢出狂犬病中和抗體，抗體消長規(guī) 律與皰疹病毒抗體一致；(4) 受試犬能抵抗狂犬病強(qiáng)毒的攻擊，存活率為95%。 3.結(jié)論重組疫苗CHV-RVG可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對:[型皰疹病毒和狂犬病病毒的特異性中和抗體，對皰疹病毒和狂犬病病毒感染具有保護(hù)作用。實(shí)施例4I型皰疹病毒活載體——狂犬病重組疫苗聯(lián)合免疫效果檢測 1.重組疫苗效力檢測 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物狂犬病病毒抗體陰性的4 5月齡犬2()條，3 6月齡貓20只，均隨機(jī)分為2組， 每組10條。1. 2動(dòng)物免疫分別以TC.IDs。為l(f 5的重組疫苗〖)HV-RV(;對4組動(dòng)物進(jìn)行免疫，其中肌肉注射10 條犬和10只貓，1ml/條;口服10條犬和10只貓，2ml/條。免疫4周后，以TCIDs。為 10"的重組疫苗FHV-RVG對2組貓進(jìn)行加強(qiáng)免疫,其中肌肉注射10只貓，0. 5ml/條； 口服10只貓，lml/條；再以TCID^為10"的重組疫苗CHV-RVG對2組犬進(jìn)行加強(qiáng)免疫， 其中肌肉注射10條犬，lml/條；口服10條犬，2ral/條。 1.3免疫檢測免疫前及免疫后每周分別采集少量靜脈血，分離血清，以FAVN檢測受試犬狂犬病病 毒中和抗體水平。 1.4攻毒試驗(yàn)免疫6周后，每組隨機(jī)抽取5只動(dòng)物，以IOO LD5。狂犬病標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株CVS-24接種。 隔離觀察至接種后40天，詳細(xì)記錄各組動(dòng)物的發(fā)病及死亡情況。 1.5結(jié)果(1) 所有受試動(dòng)物的免疫前血清內(nèi)檢不出抗狂犬病病毒的特異性抗體；(2) 所有犬和貓免疫后2 3周，其血清中均可檢出抗豬I型皰疹病毒抗體；(3) 所有受試犬和貓免疫后3 4周時(shí)，其血清中均可檢出狂犬病中和抗體，抗體消 長規(guī)律與豬I型皰疹病毒抗體一致；(4) 所有受試犬和貓分別免疫FHV-RV(;和CHV-RVG 2周后，其血清中和抗體水平明 顯升高，加強(qiáng)免疫效果好于1次免疫。(5) 受試犬和貓均能抵抗狂犬病強(qiáng)毒的攻擊，存活率為100%。2. 結(jié)論重組疫苗PRV-RVG可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對I型皰疹病毒和狂犬病病毒的特異性中和抗 體，以FHV-RVG或CHV-RVG加強(qiáng)免疫后，狂犬病病毒的特異性中和抗體水平明顯升高， 對狂犬病病毒感染具有]00%保護(hù)作用。實(shí)施例5將實(shí)施例1 3所得獲得重組疫苗，經(jīng)常規(guī)工藝(如中華人民共和國2000年藥典相 應(yīng)藥物制劑項(xiàng)下規(guī)定)將重組病毒凍干后，制備成注射或口服疫苗制劑，該類疫苗可經(jīng) 不同免疫途徑尤其是口服途徑對犬和貓進(jìn)行狂犬病免疫，使犬和貓等獲得對狂犬病的免 疫保護(hù)。
權(quán)利要求
1、一種以I型皰疹病毒作為載體的獸用狂犬病重組疫苗，其特征在于以I型皰疹病毒為載體，在病毒復(fù)制非必需區(qū)插入狂犬病病毒保護(hù)性抗原表達(dá)盒，通過基因組片段間同源重組，獲得重組疫苗。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組疫苗，其特征在于所述的I型皰疹病 毒分別選自豬I型皰疹病毒、貓I型皰疹病毒和犬I型皰疹病毒中的一種。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述重組疫苗的制備方法，包括以下步驟-利用pPloyII載體，在多克隆酶切位點(diǎn)處插入人工合成的Linker BE， 依次含有BamHI、 EcoRI、 Sac I、 Xbal、 Sma I、 Bgl II、 XhoI和EcoRV酶切位點(diǎn)，形成pPloyII-RE載體；將I型皰疹病毒基因組分成若干段，根據(jù)每一片段的首尾兩端分別設(shè)計(jì) 兩對特異引物，擴(kuò)增片段大小在l.lkb左右，分別將首尾兩端的擴(kuò)增產(chǎn)物克 隆入pPloyII-BE載體的多克隆酶切位點(diǎn)處，與I型皰疹病毒基因組共轉(zhuǎn)化 到DH5(x感受態(tài)細(xì)胞中，根據(jù)細(xì)菌內(nèi)同源重組的機(jī)制，獲得5個(gè)中間轉(zhuǎn)移 載體；根據(jù)I型皰疹病毒基因組中復(fù)制非必需區(qū)所在的位置，將目的基因插入 相應(yīng)的中間轉(zhuǎn)移載體，再與其它中間轉(zhuǎn)移載體在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染敏感 細(xì)胞，隔天傳代，直至出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，獲得重組疫苗。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組疫苗，其特征在于為注射和口服兩種方 式對犬進(jìn)行免疫接種，重組貓I型皰疹病毒可以注射和口服兩種方式對貓進(jìn) 行免疫接種。
全文摘要
本發(fā)明公開一種以I型皰疹病毒作為載體的獸用狂犬病重組疫苗及制備方法，將I型皰疹病毒全基因組分為若干片段，各片段分別克隆入載體pPolyII中，得到相應(yīng)若干個(gè)重組pPolyII，將重組pPolyII共轉(zhuǎn)染病毒的敏感細(xì)胞系時(shí)，能夠通過多片段間同源重組的方式獲得感染性I型皰疹病毒全基因組；本發(fā)明利用這一技術(shù)路線，在重組pPolyII中的I型皰疹病毒復(fù)制非必需區(qū)內(nèi)插入狂犬病病毒保護(hù)性抗原表達(dá)盒，然后以同源重組的方式構(gòu)建了多種重組I型皰疹病毒；經(jīng)常規(guī)工藝將重組病毒凍干后，制備成疫苗制劑，該類疫苗可經(jīng)不同免疫途徑尤其是口服途徑對犬和貓進(jìn)行狂犬病免疫，使犬和貓等獲得對狂犬病的免疫保護(hù)。
文檔編號A61P31/14GK101259268SQ200710056128
公開日2008年9月10日 申請日期2007年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月30日
發(fā)明者曄 劉, 菲 張, 張守峰, 扈榮良, 袁子國 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所