專利名稱：：原花青素類化合物用于制備防治幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的藥物和保健食品的制作方法原花青素類化合物用于制備防治幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的藥物和保健食品絲鄉(xiāng)本發(fā)明涉及原花青素類化合物的醫(yī)藥用途，尤其涉及用于制備防治幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的藥物和保健食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：1983年Warren和Marshall發(fā)現(xiàn)了幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)，并因此獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)。現(xiàn)已證實(shí)，Hp是引起慢性胃炎和消化性拷、瘍的主要病因，與胃癌的發(fā)生也密切相關(guān)。世界衛(wèi)生組織已于上世紀(jì)九十年代將Hp列為I級致癌原。我國Hp感染率高達(dá)60。/。，屬世界上高感染地區(qū)。研究證明，Hp相關(guān)性胃炎治療的關(guān)鍵在于根除胃內(nèi)Hp。目前臨床上常用的Hp根除方法主要是藥物治療，由制酸劑加兩種抗菌藥物組成。作用機(jī)制是利用抗菌藥物的殺菌作用，通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成等機(jī).制將細(xì)菌殺滅。這些藥物治療雖可獲得一定的療效，但不能預(yù)防Hp感染及其引起的胃炎，而且治療上也存在很大的弊端，如藥物副作用較大、患者依從性差、特別是耐藥菌株出現(xiàn)及治療后復(fù)發(fā)等。尤其值得說明的是，隨著抗菌藥物的普遍使用甚至是濫用，原發(fā)或繼發(fā)耐藥性Hp菌株的發(fā)生率正逐年上升，例如上海市Hp對甲硝唑的耐藥率由1995年的30%上升至1999年的70%。目前耐藥菌株的出現(xiàn)是臨床根除Hp失敗最主要的原因之一。原花青素(Proanthocyanidins，PACs)是植物王國中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱，起初統(tǒng)歸于縮合鞣質(zhì)或黃烷醇類，隨著分離鑒定技術(shù)的提高和對此類物質(zhì)的深入研究，現(xiàn)已成為獨(dú)樹一幟的一大類物質(zhì)，并稱之為原花青素。原花青素(PACs)是以黃烷-3-醇類化合物(flavan-3-ols)或黃垸-3，4-二醇類化合物為單體通過C-C鍵和C-0酯鍵連接成的寡聚體或多聚體，也稱縮合鞣質(zhì)。其中，最常見的單體如兒茶素、表兒茶素、沒食子酰兒茶素、沒食子酰表兒茶素和阿福豆素等。聚合度可為二聚體、三聚體、直至十聚體以上。黃烷醇單體之間主要通過B型鍵合(B-typelinkage)[C4-C8(式I)，和C4-C6(式II)]，和A型鍵合(A-typelinkage)[C4-C8禾QC2-0-C7(式III)]的方式連接聚合。原花青素(PACs)己被證實(shí)具有多種生物學(xué)功能，如抗黏附性、抗氧化性、抗腫瘤性等，具有廣闊的應(yīng)用前景。但尚未有報(bào)道將原花青素類化合物用于防治幽門螺桿菌引起的胃炎。原花青素類化合物廣泛存在于天然植物中，如葡萄、沙棘、松樹皮、黑加侖、可可豆、草莓、銀杏、花生、山楂及越橘類植物(如蔓越莓、藍(lán)莓、紅豆越橘等)中。目前已有文獻(xiàn)和專利報(bào)道從天然植物中分離提取原花青素的多種方法，其中主要針對我國產(chǎn)量較高的植物，如葡萄、松樹皮和越橘類植物等(如呂麗爽，葡萄籽中低聚原花青素工藝初探，食品工藝科技，2002，(23):17;張馳，徐曉云，潘思軼，沙棘果原花青素的分離純化研究，食品科學(xué)，2005，(26):183-185;于文利，趙亞平，從松樹皮中提取低聚原花青素的方法，發(fā)明專利公開號CN1613854A;HowellAB，ReedJD，KruegerCGetal.Phytochemistry，2005(66):2281)。隨著對原花青素類化合物研究的深入，這類化合物也可由化學(xué)合成法和生物合成法合成(如AkikoSaito，etal.Tetrahedron,2002(58):7829;HelenA，etal.Phytochemistry，1985(24):333)?！度赵码S本發(fā)明的目的是公開原花青素類化合物的一種新用途，即在制備防治幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的藥物和保健食品中的新應(yīng)用。本發(fā)明中，所述的原花青素類化合物(Proanthocyanidins,PACs)，也稱縮合鞣質(zhì)，是以黃烷-3-醇類化合物(flavan-3-ols)或黃烷-3，4-二醇類化合物為單體通過C-C鍵和C-O酯鍵連接成的寡聚體或多聚體。其中，最常見的單體如兒茶素、表兒茶素、沒食子酰兒茶素、沒食子酰表兒茶素和阿福豆素等。聚合度可為二聚體、三聚體、直至十聚體以上。黃垸醇單體之間主要通過B型鍵合(B誦typelinkage)[C4-C8(式I)，和C4-C6(式II)]，和A型鍵合(A-typelinkage)[C4-C8和C2-0-C7(式III)]的方式連接聚合。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式II式III本發(fā)明中，所述的原花青素類化合物可從天然植物中分離提取，如葡萄、沙棘、松樹皮、黑加侖、可可豆、草莓、銀杏、花生、山楂及越橘類植物(如蔓越莓、藍(lán)莓、紅豆越橘等)。具體提取方法可參見己有文獻(xiàn)和專利報(bào)道(如呂麗爽，葡萄籽中低聚原花青素工藝初探，食品工藝科技，2002，(23):17;張馳，徐曉云，潘思軼，沙棘果原花青素的分離純化研究，食品科學(xué)，2005，(26):183-185;于文利，趙亞平，從松樹皮中提取低聚原花青素的方法，發(fā)明專利公開號CN1613854A)。本發(fā)明中，所述的原花青素類化合物也可由化學(xué)合成法和生物合成法合成，具體合成方法參見現(xiàn)有文獻(xiàn)，如AkikoSaito,etal.Tetrahedron,2002(58):7829;HelenA，etal.Phytochemistry，1985(24):333等等。本發(fā)明中，所述的原花青素類化合物尤其優(yōu)選越橘類植物中所含的原花青素類化合物，其中更優(yōu)選蔓越莓果中所含的原花青素類化合物。該類原花青素類化合物主要為如式IV所示的黃烷醇的寡聚體和多聚體，聚合方式主要為前述的B型鍵合(B-typelinkage)[C4-C8(式I)，和C4-C6(式II)]，和A型鍵合(A-typelinkage)[C4-C8和C2-0-C7(式III)]，聚合度主要為包含2~10個(gè)單體。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式IV其中，R產(chǎn)OH，R2=H，R3=H，R4=OH(兒茶素)；或R尸OH，R2=H，R3=OH，Rt=H(表兒茶素)；或R產(chǎn)OH，R2=OH，R3=H，R4=OH(沒食子酰兒茶素)；或R,-OH，R2=OH，R3=OH，RrH(沒食子酰表兒茶素)。從蔓越莓果中分離提取該類原花青素類化合物的具體方法，可參見文獻(xiàn)HowellAB,ReedJD，Kruegeretal.Phytochemistry,2005(66):2281。由其他方法，如化學(xué)合成法和生物合成法，制得的該類原花青素類化合物，或有效成分為該類原花青素類化合物的其他提取物，同樣具有顯著的防治幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的藥理效果。本發(fā)明中，所述的原花青素類化合物還較佳的選自葡萄中所含的原花青素類化合物，其主要為由兒茶素和/或表兒茶素單體之間通過B型鍵合方式聚合而成的二聚體、三聚體、四聚體、五聚體和六聚體等。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，原花青素類化合物具有有效防治幽門螺桿菌感染引起的急、慢性胃炎，保護(hù)胃黏膜、改善胃炎癥狀的藥理效果，且其制得的藥物或保健食品不會產(chǎn)生耐藥性、副作用小。其中，以越橘類植物(如蔓越莓)中所含的原花青素類化合物藥理效果最為突出(參見實(shí)施例)。本發(fā)明中，所述的原花青素類化合物可用于制備藥劑學(xué)和食品學(xué)上任何劑型的藥物及保健食品，如口服液、片劑、膠囊劑、沖劑、顆粒劑、丸劑、散劑、袋泡茶、飲料類等口服形式的劑型和注射劑型。在制備過程中，可向產(chǎn)品中加入必要的輔料、賦形劑和添加劑等。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于本發(fā)明為原花青素類化合物發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明了原花青素類化合物制成的藥物具有顯著的治療和預(yù)防幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的藥理效果。原花青素類化合物原料來源豐富，價(jià)廉，制備工藝簡單，可制成藥劑學(xué)和食品學(xué)上任何劑型的藥物及保健食品，易于規(guī)?；a(chǎn)，具有廣大的市場前景。圖1為經(jīng)蔓越莓原花青素0.4mg治療后4周的胃黏膜(H&E染色)400倍放大的病理組織圖。圖2為感染對照組未經(jīng)治療的胃黏膜(Giemsa染色)400倍放大的病理組織圖，與圖1相比，該圖中胃黏膜明顯變薄。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。實(shí)施例l堇越莓中提取原花青素及藥物制備1.原料處理將200克蔓越莓果在50ml溶劑中4°C研磨5分鐘(溶劑為:體積百分比70%丙酮，體積百分比30%甲醇，0.1g/100ml檸檬酸)，離心后取上清液，將果肉除去，再將溶劑蒸干，將提取物溶于水，制得蔓越莓提取液。2.溶劑脫脂在蔓越莓提取液中加等體積石油醚進(jìn)行脫脂處理，重復(fù)一次，每次3小時(shí)。將脫脂后的蔓越莓提取液減壓蒸發(fā)干燥，得蔓越莓提取物。3.SephadexLH-20凝膠柱層析分離提純將LH-20柱(購自Pharmacia公司)用50%乙醇水溶液平衡過夜；將蔓越莓提取物溶于50%乙醇水溶液，旋渦震蕩后立即上樣(10克LH-20凝膠，柱體積為40ml);用50%乙醇水溶液洗柱，流速為2.5ml/min,直到流出的洗滌液變無色，棄洗漆液；然后用8倍柱體積的70%的丙酮水溶液洗脫，收集洗脫液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀35°C蒸干溶劑，凍干得到棕紅色粉末。其中原花青素含量達(dá)80%。200克原果分離得到約95mg原花青素。經(jīng)MALDI-TOFMS(基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)和DI/ESIMS(電噴霧電離質(zhì)譜)分析，該產(chǎn)物為聚合度2-10的聚合物混合物，單體為兒茶素、表兒茶素、沒食子酰兒茶素和沒食子酰表兒茶素，聚合方式包括B型和A型鍵合。4.藥物制備取原花青素PACsO.lmg、0.2mg和0.4mg分別溶解于0.5ml的雙蒸水中，制得濃度為0.1mg/0.5ml、0.2mg/0.5ml和0.4mg/0.5ml的原花青素口服液，備用。實(shí)施例2小鼠幽門嫁桿菌感染相關(guān)性胃炎治療和預(yù)防實(shí)驗(yàn)一.材料和方法1.菌株和培養(yǎng)本發(fā)明所用的Hp菌株為悉尼株(SydneyStrain,SS1)。經(jīng)液體培養(yǎng)擴(kuò)增，5000rpm，10min離心收集細(xì)菌。將菌體懸于改良布氏肉湯中，利用分光光度計(jì)測定菌液濃度，當(dāng)OD66(Hl時(shí)，細(xì)菌濃度為108/ml。將菌液濃度調(diào)至2xl0Vml，用于接種小鼠。2.動物實(shí)驗(yàn)動物為無特殊病原菌(S.P.F)級C57BL/6小鼠，6~8周齡，1820g，委托中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)。3.治療實(shí)驗(yàn)將小鼠分為6組，經(jīng)口灌胃lxl08CFUHp，隔日1次，共3次。最后l次灌胃后2周從各組中分別隨機(jī)處死1只小鼠，觀察Hp感染情況。然后，除第l組作感染對照組外，其它2~6組依次分別按下列方法治療經(jīng)口灌胃給予0.1mg/0,5ml、0.2mg/0.5ml和0.4mg/0.5ml的原花青素口服液，1日1次，共30天；體積百分比17%蔓越莓汁(上海華珠生物科技有限公司制)0.5ml，1日1次，共30天；三聯(lián)療法(阿莫西林50mg/kg，甲硝唑22.5mg/kg和枸櫞酸鉍6.15mg/kg)，1日1次，共14天。各種處理后的24h和4周后分別處死小鼠，觀察Hp感染情況。4.預(yù)防實(shí)驗(yàn)將小鼠分為6組，除第l組作感染對照組外，其它2~6組依次分別按下列方法作預(yù)防經(jīng)口灌胃分別給予0.1mg/0.5ml、0.2mg/0.5ml和0.4mg/0.5ml的原花青素口服液，一日一次，共46天；體積百分比17%蔓越莓汁(上海華珠生物科技有限公司制)0.5ml，一日一次，共46天；三聯(lián)療法(阿莫西林50mg/kg，甲硝挫22.5mg/kg和枸櫞酸鉍6.15mg/kg)，1日1次，共14天(第32-46天)。第42、44和46天給予Hp攻擊。細(xì)菌攻擊后2周(第61天)處死小鼠鑒定Hp感染情況。5.Hp感染的檢測將實(shí)驗(yàn)鼠胃沿大彎縱向切開，縱向切成同樣大小的3份，1份直接行半定量尿素酶試驗(yàn)，l份放入無菌生理鹽水中，用于細(xì)菌培養(yǎng)，1份置于10%福爾馬林中固定，用于病理組織學(xué)(Giemsa和H&E染色)檢測。半定量尿素酶試驗(yàn)將其中1份胃黏膜放入50(^1尿素酶檢測試劑(50g尿素，0.3g酚藍(lán)，加0.1%磷酸二氫鉀溶液1000ml，pH值5.0)中，室溫放置5小時(shí)后，在630nm波長處檢測其吸光度(OD)值。該值與Hp感染量成正相關(guān)，因此此結(jié)果可定量反映出胃黏膜Hp的感染量。在Hp未被完全清除的情況下也可顯示出防治效果。培養(yǎng)將1份胃黏膜黏膜面朝下，均勻涂布于血瓊脂平板上，37'C微氧環(huán)境中培養(yǎng)5-7天，經(jīng)涂片革蘭氏染色、尿素酶、觸酶、氧化酶試驗(yàn)確定是否為Hp。6.判斷標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)下列3點(diǎn)全符合為Hp陰性。(l)尿素酶試驗(yàn)OD630nnK未感染小鼠OD630nm的均數(shù)(mean)+2倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD);(2)培養(yǎng)陰性；(3)組織學(xué)檢查未見細(xì)菌。對Hp的治療效果以清除率(即治療后24hHp陰性的百分比)、根除率(即治療后4周Hp陰性的百分比)及半定量尿素酶試驗(yàn)結(jié)果(OD630nm)來綜合評價(jià)。預(yù)防效果以預(yù)防率和半定量尿素酶試驗(yàn)結(jié)果(OD630nm)來綜合評價(jià)。胃體和胃竇黏膜炎癥根據(jù)炎癥細(xì)胞數(shù)量與浸潤程度分為輕、中、重度，同時(shí)測量胃竇黏膜厚度，綜合評判炎癥程度。二.結(jié)果1.治療24h后小鼠Hp感染情況如表1所示。表1治療后24h小鼠感染情況<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注ap<0.05(雙尾Fisher's精確概率檢驗(yàn))bp<0.01((雙尾Fisher's精確概率檢驗(yàn))*p<0.05(方差分析)p<0.01(方差分析)2.治療4周后小鼠Hp感染與胃炎情況如表2所示。表2治療后4周小鼠感染情況<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注ap<0.05(雙尾Fisher's精確概率檢驗(yàn))bp<0.01(雙尾Fisher's精確概率檢驗(yàn))*p<0.05(方差分析)**p<0.01(方差分析)3.預(yù)防實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。表3.預(yù)防小鼠感染情況<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注ap<0.05(雙尾Fisher's精確概率檢驗(yàn))bp<0.01(雙尾Fisher's精確概率檢驗(yàn))*p〈0.05(方差分析)**pO.Ol(方差分析)4.小鼠胃黏膜炎癥情況。1)所有小鼠的胃黏膜炎癥程度都不重，為輕一中度炎癥，總體來說，治療組和預(yù)防組小鼠的炎癥程度較感染對照組輕。2)胃黏膜炎癥主要發(fā)生在胃竇部或腺胃起始部或竇體交界處。胃黏膜固有層(黏膜深層較明顯)和黏膜下層見程度不等的單核細(xì)胞浸潤，部分小鼠胃黏膜見中性粒細(xì)胞浸潤。3)胃竇黏膜未見明顯萎縮(腺體排列緊密，間質(zhì)未見纖維組織增生)，正常小鼠胃竇黏膜相比，感染對照組小鼠胃竇黏膜厚度明顯變薄(見圖1);治療后4周第5組小鼠胃竇點(diǎn)膜則接近正常黏膜(見表2，圖2)，其余治療組厚薄不均。預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療后24小時(shí)的小鼠由于感染時(shí)間較短，炎癥程度較輕，與相同感染時(shí)間的對照小鼠相比，胃竇黏膜厚度無顯著差異。4)所有小鼠黏膜均未見腸化發(fā)生。由以上結(jié)果表明，原花青素，和以原花青素為有效成分的蔓越莓汁對幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的治療和預(yù)防都有顯著效果。隨著原花青素劑量的增加，根除幽門螺桿菌和抗炎作用也增加，具有劑量依賴效應(yīng)。從上述結(jié)果中可以看出，原花青素(0.4mg/日)治療一個(gè)月后可獲得90%的清除率和80%的根除率，治療后4周黏膜炎癥程度也顯著減輕，與三聯(lián)療法相似。但是，三聯(lián)療法僅有治療效果，而無預(yù)防的作用。本專利中的動物模型感染的幽門螺桿菌是抗菌藥物敏感菌株，因此用三聯(lián)療法可以獲得顯著療效，而實(shí)際在人群中幽門螺桿菌對抗菌藥物的耐藥率很高，且呈逐年上升的趨勢，因此臨床治療中并不能取得這么好的效果(M6graudF，H.pyloriantibioticresistance:prevalence,importance,andadvancesintesting.Gut.2004;53;1374-1384)。原花青素為天然植物提取物，無毒副作用。而且不會產(chǎn)生耐藥性。因此，與目前藥物治療相比，具有顯著優(yōu)勢。實(shí)施例3膠襄制劑蔓越莓果lkg，按照前述方法提取原花青素，將分離提取得到的原花青素冷凍干燥，粉碎成細(xì)粉，加入適量輔料(如淀粉、糊精)，混勻，裝入45-50個(gè)膠囊中制成。實(shí)施例4顆粒制劑蔓越莓果lkg，按照前述方法提取原花青素，將分離提取得到的原花青素冷凍干燥，粉碎成細(xì)粉，加入適量輔料(如淀粉、糊精)，經(jīng)充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，加入適量乙醇潤濕后制粒，經(jīng)60。C以下烘箱內(nèi)干燥，將顆粒分袋包裝。實(shí)施例5片劑蔓越莓果lkg，按照前述方法提取原花青素，將分離提取得到的原花青素冷凍干燥，粉碎成細(xì)粉，加入適量輔料(如淀粉、糊精)，經(jīng)充分?jǐn)嚢杌靹蚝螅尤脒m量乙醇潤濕后制粒，經(jīng)60。C以下烘箱內(nèi)干燥，壓制成不同大小規(guī)格的片劑。實(shí)施例6口服液制劑直接將蔓越莓濃縮汁(50或65Brix，購于美國OceanSpray)加適量水和蔗糖，配制成不同濃度，裝入瓶中，制成口服液制劑。權(quán)利要求1.原花青素類化合物在制備防治幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的藥物和保健食品中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述的原花青素類化合物為越橘類植物中所含的原花青素類化合物。3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的越橘類植物為蔓越莓。4.如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述的原花青素類化合物為葡萄中所含的原花青素類化合物。全文摘要本發(fā)明涉及原花青素類化合物在制備防治幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的藥物和保健食品中的應(yīng)用。本發(fā)明的應(yīng)用為原花青素類化合物開拓了新的應(yīng)用領(lǐng)域，同時(shí)也為制備有效防治幽門螺桿菌感染引起的急、慢性胃炎，保護(hù)胃黏膜、改善胃炎癥狀，且不會產(chǎn)生耐藥性、副作用小的藥物和保健食品提供了新方向。文檔編號A61P1/04GK101239058SQ200710037280公開日2008年8月13日申請日期2007年2月7日優(yōu)先權(quán)日2007年2月7日發(fā)明者彤史,飛高申請人:上海華珠生物科技有限公司