專利名稱：畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿在制備治療老年性癡呆藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿的應用，尤其涉及畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿在制備治療老年性癡呆，減少APPmRNA和APP蛋白表達的藥物中的應用。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年期癡呆的主要病因。在AD的發(fā)病機制中，淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積是各種病因的共同通路。實驗證實Aβ來源于淀粉樣前體蛋白(APP)，如果抑制APP過量表達，能減少Aβ在腦內(nèi)生成和沉積，因此成為治療AD的重要靶點。
海風藤(caulis piperis kadsurae)是胡椒科胡椒屬植物風藤[Piperkadsura(choisy)Ohwi]的干燥藤莖。中醫(yī)臨床主要用于哮喘、風濕病和關節(jié)痛等疾病的治療，但少見有用于老年性癡呆治療的報道。
近年，申請人采用Northern blot方法證實了海風藤能選擇性抑制APP基因表達，同時采用RT-PCR和免疫組化的方法首次發(fā)現(xiàn)了畢撥明寧堿(piperlonguminine)和二氫畢撥明寧堿(dihydropiperlonguminine)能夠抑制SK-N-SH細胞淀粉樣前體蛋白(APP)mRNA和APP蛋白的表達。這一研究經(jīng)檢索查新，目前國內(nèi)外尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術對不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿在制備治療老年性癡呆，減少APPmRNA和APP蛋白表達的藥物中的應用。
本發(fā)明的主要技術路線是1.由福建海風藤提取與分離畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿。
2.自上海中科院細胞所購買人神經(jīng)母細胞瘤細胞系(SK-N-SH)，建立穩(wěn)定的傳代細胞系。
3.海風藤抑制淀粉樣前體蛋白(APP)基因表達實驗(APP mRNA)建立細胞RNA提取和RT-PCR反應體系。
4.海風藤抑制淀粉樣前體蛋白(APP)實驗建立細胞總蛋白提取和Western blot反應體系。
本發(fā)明所述畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿在制備治療老年性癡呆藥物中的應用。
其中所述畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿能夠從細胞水平抑制APPmRNA和APP蛋白的表達。
其中所述畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿由福建海風藤分離、提取，畢撥明寧堿與二氫畢撥明寧堿的質量比例為1∶0.8。
上述畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿具體由下述方法制得1.海風藤有效成分的萃取1)福建產(chǎn)海風藤購自安徽省亳州中藥材市場，經(jīng)山東大學藥學院生藥學教研所鑒定為瓦氏胡椒(Piper wallichii)。
2)海風藤藥材(18kg)用水提取后，提取液濃縮得到浸膏1788.06g。浸膏加水溶解后，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取相4.577g，乙酸乙酯萃取相37.95g和正丁醇萃取相198.25g。
2.萃取相細胞毒性測定將萃取相的作用濃度均換算成相當生藥濃度，以便各萃取相與生藥間具有可比性。
使各萃取相的溶液作用濃度在50g/l(相當于生藥)以下時，以人神經(jīng)母細胞瘤細胞系(SK-N-SH)進行MTT法檢測。
結果顯示無明顯細胞毒作用。
3.萃取相活性部位的確定1)利用RNA提取和RT-PCR反應體系，分別運用海風藤的三個萃取相合適的濃度(低于50g/l)作用于細胞，觀察其抑制作用。
通過實驗，最終將海風藤抑制APP基因表達的活性部位確定在乙酸乙酯萃取相。
2)應用蛋白質提取和Western blot的反應體系，再次證實了活性部位為乙酸乙酯萃取相。
4.海風藤的有效成分的確定(1)單體成分的分離與鑒定1)乙酸乙酯萃取相(37.95g)用95％乙醇溶解后，加硅膠拌樣，經(jīng)硅膠(100-200目，1.52kg，10cm×1m)柱色譜，氯仿-丙酮梯度洗脫，收集洗脫流份，500ml/流份，共收集流份151份。其中氯仿-丙酮(9∶1)洗脫流份Fr.31用石油醚-丙酮反復結晶后，得到化合物1(命名為HFT-1)20mg。
2)HFT-1分析根據(jù)氫譜、碳譜的數(shù)據(jù)，并與文獻對照，確定HFT-1結晶由化合物A畢撥明寧堿(piperlonguminine，A)和B二氫畢撥明寧堿(dihydropiperlonguminine，B)組成，由其氫譜積分確定在此結晶中A與B的質量比例為1∶0.8。
化合物A、B分子式如下A畢撥明寧堿(piperlonguminine，A) B二氫畢撥明寧堿(dihydropiperlonguminine，B) 為了更好地理解本發(fā)明的實質及本發(fā)明所述化合物的作用效果，下面結合畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿的藥理實驗及結果，來進一步闡述其在制備治療老年性癡呆藥物中的應用。
1.單體成分的溶解及施藥濃度將海風藤單體成分HFT-1用DMSO溶解使其終濃度為105mg/ml。
加藥前用DMSO倍比稀釋成1∶16(6.56mg/ml)，1∶32(3.28mg/ml)。
按1ulDMSO藥液加入1ml培養(yǎng)基的比例加藥，使DMSO濃度為1‰，HFT-1的最終濃度分別為6.56ug/ml和3.28ug/ml。
2.單體成分細胞毒性測定以人神經(jīng)母細胞瘤細胞系(SK-N-SH)進行MTT法檢測，結果顯示HFT-1兩個試驗濃度均無明顯細胞毒作用(MTT法)。
3.單體成分活性測定1)利用已建立的人神經(jīng)母細胞瘤細胞系(SK-N-SH)，RNA提取和RT-PCR的反應體系試驗，結果顯示HFT-1能選擇性的抑制APP基因表達(mRNA)。(見圖1)2)用Western blot的方法從蛋白質水平證實HFT-1能明顯的抑制淀粉樣前體蛋白(APP)的表達。(見圖2)通過上述實驗及其結果，可以得出如下結論海風藤抑制APP表達的活性部位是海風藤成分經(jīng)化學分離的乙酸乙酯萃取相，海風藤的有效成份是畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿，通過RT-PCR和Western Blot證實畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿是海風藤抑制APP表達的有效成分，其較佳的藥物濃度為3.28ug/ml～6.56ug/ml，預示畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿在制備治療老年性癡呆的新藥開發(fā)和應用中，有較為誘人的發(fā)展前景。


圖1HFT-1選擇性的抑制APP基因表達其中左圖為APP；右圖為18s(參照基因)。
1.正常對照。2.DMSO對照(1‰)。3.HFT-1(3.28ug/ml)。
圖中所示，HFT-1(即畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿)在濃度為3.28ug/ml能夠抑制SK-N-SH細胞APP mRNA的表達。
圖2HFT-1抑制淀粉樣前體蛋白(APP)的表達其中上圖為APP；下圖為β-Actin(參照蛋白)。
1.正常對照。2.陽性對照(生藥濃度35g/l)。3.DMSO對照(1‰)。4.HFT-1(3.28ug/ml)。5.HFT-1(6.56ug/ml)。
圖中所示，濃度為6.56ug/ml的HFT-1(即畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿)能夠抑制SK-N-SH細胞APP蛋白的表達。
具體實施例方式
實施例1 海風藤的有效成分的化學分離提取。
海風藤藥材(18kg)用水提取后，提取液濃縮得到浸膏1788.06g。浸膏加水溶解后，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取相4.577g，乙酸乙酯萃取相37.95g和正丁醇萃取相198.25g。乙酸乙酯萃取相(37.95g)用95％乙醇溶解后，加硅膠拌樣，經(jīng)硅膠(100-200目，1.52kg，10cm×1m)柱色譜，氯仿-丙酮梯度洗脫，收集洗脫流份，500ml/流份，共收集流份151份。其中氯仿-丙酮(9∶1)洗脫流份Fr.31用石油醚-丙酮反復結晶后，得到化合物1(命名為HFT-1)20mg。
HFT-1根據(jù)氫譜、碳譜的數(shù)據(jù)，確定該結晶由化合物畢撥明寧堿(piperlonguminine，A)和二氫畢撥明寧堿(dihydropiperlonguminine，B)組成，在此結晶中A與B的質量比例為1∶0.8。
實施例2 畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿對SK-N-SH細胞APPmRNA和APP蛋白表達的影響。
將海風藤單體成分HFT-1(畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿)用少量DMSO溶解(終濃度為105mg/ml)。
加藥前用DMSO倍比稀釋成1∶16(6.56mg/ml)。
按1ulDMSO藥液加入1mlMEM培養(yǎng)基的比例加藥，使DMSO濃度為1‰，HFT-1的最終濃度分別為6.56ug/ml。
加入SK-N-SH細胞培養(yǎng)24-48小時，常規(guī)提取RNA和進行RT-PCR反應，發(fā)現(xiàn)HFT-1能抑制APP mRNA的表達。(見圖1)提取SK-N-SH細胞蛋白質，用Western blot方法發(fā)現(xiàn)了HFT-1能抑制淀粉樣前體蛋白的表達。(見圖2)
權利要求
1.畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿在制備治療老年性癡呆藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征是所述畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿能夠從細胞水平抑制APPmRNA和APP蛋白的表達。
3.如權利要求1或2所述的應用，其特征是所述畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿由海風藤分離、提取，畢撥明寧堿與二氫畢撥明寧堿的質量比例為1∶0.8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿在制備治療老年性癡呆藥物中的應用，其中所述畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿由福建海風藤分離、提取，畢撥明寧堿與二氫畢撥明寧堿的質量比例為1∶0.8。本發(fā)明通過RT－PCR和Western Blot證實畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿是海風藤抑制APP表達的有效成分，其較佳的藥物濃度為3.28ug/ml～6.56ug/ml，預示畢撥明寧堿和二氫畢撥明寧堿在制備治療老年性癡呆的新藥開發(fā)和應用中，有較為誘人的發(fā)展前景。
文檔編號A61P25/00GK101036639SQ20071001433
公開日2007年9月19日 申請日期2007年4月18日 優(yōu)先權日2007年4月18日
發(fā)明者韓恩吉 申請人:山東大學齊魯醫(yī)院