專利名稱：中華絨鰲蟹抗脂多糖因子基因及其編碼蛋白和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學中華絨鰲蟹抗脂多糖因子基因克隆及體外重組表達技術(shù)，具體地說是從中華絨鰲蟹cDNA文庫中克隆出中華絨鰲蟹抗脂 多糖因子基因的cDNA全序列并對該序列進行了原核重組表達，還涉及到 該基因及其表達產(chǎn)物在藥物生產(chǎn)、詞料添加劑以及防腐劑和保鮮劑及人類 敗血病治療生產(chǎn)中的應用。
技術(shù)背景細菌內(nèi)毒素引發(fā)敗血癥休克的防治長期以來難獲重要突破，其發(fā)病率 和死亡率仍呈上升趨勢。目前已發(fā)現(xiàn)多種具有中和內(nèi)毒素作用的蛋白質(zhì)， 如多粘菌素B(PMB)、殺菌滲透性增強蛋白(BPI)等，然而這些中和蛋白多 需預先或在LPS攻擊同時給予才有效?？怪嗵且蜃?anti-lipopolysaccharide factor, ALF)是一種通過特異性識別R型革蘭氏陰性菌LPS亞單位脂質(zhì)A 而結(jié)合并中和內(nèi)毒素的蛋白質(zhì)。動物實驗研究表明，在內(nèi)毒素血癥發(fā)生時、 甚至在內(nèi)毒素血癥的晚期給予ALF，都對實驗動物具有良好的保護作用， 其保護作用可能與ALF降低脂多糖(LPS)誘導的炎癥因子NO的產(chǎn)生并增加 抗炎因子IL-10的分泌有關(guān)。同時，ALF顯示了對某些菌株的生長抑制活 性，還可抑制LPS對家兔的致熱反應。因此，ALF逐漸成為臨床中防治內(nèi) 毒素血癥^一條重要途徑。但對于該基因的研究卻與其重要的應用前景不 相符。目前僅在丄/mw/ws / o/yp/7em附 (Tanaka et al, 1982) 、 Zito/ e"aews va朋ame/ (Gross et al, 2001)， T^c/^/ /ews ^r/cfewto加(Wang et al， 2001)， 附o朋fifow (Supimgul et al, 2002; Supungul et al, 2004)， Fe朋era/ e朋ews c/n'wews/s (Liu et al, 2004)禾口 Manswpewaews _/apow/cws (Nagoshi et al, 2006)中獲得該基因的同源分子。中華絨鰲蟹(五Woc/2e/w/wera/s)又名河蟹，因其營養(yǎng)豐富、味道鮮美而 深受人們喜愛，是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。自20世紀80年代以來， 中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，到2000年全國養(yǎng)殖產(chǎn)量已超過100， 000噸， 年產(chǎn)值達120-150億元，已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)之一(崔朝霞等，2003)。 但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，各種疾病日趨嚴重，給中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè) 造成了巨大損失。養(yǎng)殖中華絨鰲蟹病害的不斷爆發(fā)及病因的多樣性迫切要 求從河蟹自身的免疫防御因子入手，研究其抗病機制和制定新的疾病防治 措施?？紤]到當前分離到甲殼類的病原菌多為革蘭氏陰性菌，抗脂多糖因 子作為一種重要的結(jié)合LPS的抗菌肽勢必會在其免疫防御中發(fā)揮著非常重 要的作用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是從中華絨鰲蟹中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列， 并對其實現(xiàn)原核表達及重組產(chǎn)物的活性鑒定，為進一步研究中華絨鰲蟹防 御機制提供基礎(chǔ)，并為中華絨鰲蟹的病害防治、基因輔助選育及進一步開 發(fā)為醫(yī)藥產(chǎn)品和飼料添加劑奠定基礎(chǔ)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種中華絨鰲蟹抗脂多糖因子基因，具有序列表SEQ ID No:l中堿基 序列。其是從從中華絨鰲蟹中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列，該序列 全長700bp，包括363bp的開放閱讀框，編碼120個氨基酸，5'非編碼區(qū)長 20bp， 3'非編碼區(qū)長317bp，有多聚腺苷酸加尾信號和多聚腺苷酸尾巴，該 基因在中華絨鰲蟹免疫防御方面發(fā)揮著重要作用。利用pET32a表達載體在 大腸桿菌BL21(DE3)plysS中重組表達了該蛋白，表達產(chǎn)物對藤黃微球菌 M/cracoccws /她ws和齒弧菌a"爐7an/m和大腸桿菌TOP10F均具有明顯的殺菌活性。其中對于藤黃微球菌的殺菌活性為100%;而對于革蘭氏陰性細菌鰻弧菌和大腸桿菌TOP10F的殺菌活性分別是80%和26.42%.其編碼蛋白具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，分子量為13273.42 Da，等電點為8.59，其中編碼序列的1一25位為信號肽序列，成熟肽分子 量為10588.14 Da，等電點為8.79，有11個凈正電荷，并且具有典型的抗脂 多糖因子W(T)CPG(S)WT模體結(jié)構(gòu)。分析該成熟肽序列發(fā)現(xiàn)其N-端具有明 顯的疏水性，呈現(xiàn)(3-折疊結(jié)構(gòu)，而C-端親水性較強，具有典型的a-螺旋結(jié) 構(gòu)。中華絨鰲蟹抗脂多糖因子基因的重組表達產(chǎn)物可作為動物飼料添加 劑、食品防腐劑、食品保鮮劑或用于制備治療人類敗血病的藥物。本發(fā)明利用表達序列標簽(EST)技術(shù)、cDNA末端快速擴增(RACE) 技術(shù)從中華絨鰲蟹中克隆到抗脂多糖因子基因cDNA全長序列，通過PCR 技術(shù)，擴增編碼抗脂多糖因子成熟肽的基因片斷并將其克隆到pET32a表達 載體中，在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中實現(xiàn)了原核體外重組表達。重組產(chǎn) 物經(jīng)HiTrap chelating柱純化和透析復性后，對藤黃微球菌和鰻弧菌均表現(xiàn) 出明顯的殺傷活性。其中對于藤黃微球菌的殺菌活性為100%;而對于革蘭 氏陰性細菌鰻弧菌和大腸桿菌TOP10F的殺菌活性分別是80%和26.42%。 本發(fā)明可為進一步研究中華絨鰲蟹免疫防御機制提供基礎(chǔ)，并為中華絨鰲 蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑奠定基礎(chǔ)，同時為進一步開發(fā) 治療人類敗血病醫(yī)藥產(chǎn)品提供了更多的選擇。本發(fā)明利用構(gòu)建的中華絨鰲蟹cDNA文庫，采用RACE技術(shù)及體外重 組表達技術(shù)，對中華絨鰲蟹抗脂多糖因子進行了研究，首次從中華絨鰲蟹 中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列，該基因具有序列表中所示的序列， 并利用原核重組技術(shù)表達了具有較強殺菌活性的重組蛋白。


圖1為本發(fā)明重組抗脂多糖因子和融合標簽殺菌活性圖譜。
具體實施方式
下面的實施例中將對本發(fā)明作進一步的闡述，但本發(fā)明不限于此( 實施例1.一種克隆得到的中華絨鰲蟹抗脂多糖因子，具有以下序列序列表(1) SEQIDNOl的信息 序列特征 長度700堿基對鏈型雙鏈 拓撲結(jié)構(gòu)線形 分子類型DNA特性名稱CDS (21—383)來源中華絨鰲蟹(En'oc/ie/r !^)序列描述GAATTCGTCAAACCACCAGTATGGCACGCCTGTCGCTGTTCCTTCTCGTTGTGGCTGTTGCCGTGTTTACTCCAAACATTCCACAGTGTGAAGCTGGCTGGCTGGACCGGATTATTGGTACAGCAGTTGATTCTGTTGCTGAATTCGGAACCACTAATATAGTGGACCAAATCTGCAACACCCGTGTGATGCCCACCATAAAGAAGTTTGAACTGTACTTCAGGGGGAGAGTGTGGTGCCCAGGCTGGACAACAATCCAGGGGGAGTCTCTGACTCGCAGCAGGACCAGGGTGGTGAACAAAGCTGTGGAAGACTTCGCCAGGAAGGCTGTCGCTGCAGGCCTCATGACGCAGGAGGATGCTAACCCTTTGCTGAATGCCTGATCATGGAGCAGGACGCCACACCTCTGGGGCACATGGCTATCCTGATGTAGAGCAGGATTTCTTAACCTTTTCTAGCATCTGAACCCTTGTACTAAAAAGAAATAAAAAAAAAAAAAAAAAA (2) SEQIDN0 2的信息序列特征 長度120 個氨基酸鏈型單鏈 拓撲結(jié)構(gòu)線形特性編碼蛋白分子量為13273.42Da，等電點為8.59，其中編碼序列 的l一25位為信號肽序列，成熟肽分子量為10588.14 Da，等電點為8.79， 有11個凈正電荷，并且具有典型的抗脂多糖因子W(T)CPG(S)WT模體結(jié) 構(gòu)。分析該成熟肽序列發(fā)現(xiàn)其N-端具有明顯的疏水性，呈現(xiàn)卩-折疊結(jié)構(gòu)， 而C-端親水性較強，具有典型的a-螺旋結(jié)構(gòu)。來源中華絨鰲蟹(2Hoc/ie/r s/"eraz》序列描述MARLSLFLLWAVAVFTPNIPQCEAGWLDRIIGTAVDSVAEFGTTNIVDQI KAVAAGLMTQEDANPLLNA本發(fā)明的中華絨鰲蟹抗脂多糖因子cDNA序列克隆及其體外重組表 達，包括下列步驟a) 中華絨鰲蟹總RNA的提取及mRNA的純化；b) 中華絨鰲蟹cDNA文庫構(gòu)建；c) 中華絨鰲蟹cDNA文庫EST序列的大規(guī)模測定；d) 中華絨鰲蟹EST序列的同源性分析及抗脂多糖因子基因片段的篩選；e) 用基因特異性引物GSF1: GACGCAGGAGGATGCTAAC和GSF2:TGATGGCAGATGAAGGACAC 進行3'和5'RACE克隆到中華絨鰲蟹抗脂多糖因子cDNA全長序列；f) 中華絨鰲蟹抗脂多糖因子的體外重組表達及其活性分析。具體操作如下1 )中華絨鰲蟹總RNA的提取及mRNA的純化:將中華絨鰲蟹注射50pl OD6Q()=0.4的鰻弧菌暫養(yǎng)12小時后，利用Invitrogen公司的Trizol試劑提取 中華絨鰲蟹血淋巴中總RNA，利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化 試劑盒純化mRNA。2) 中華絨鰲蟹cDNA文庫構(gòu)建利用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit 和ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene)進行cDNA的合成，分別按照試 劑盒的說明進行雙鏈cDNA末端補平、￡CORI接頭連接、五coRI末端磷酸 化、I內(nèi)切酶酶切，后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit對大于lOObp的酶切片段進行回收，與Invitrogen公司 Uni-ZAP XR vector載體金接，利用Stratagene公司的ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit試劑盒進行文庫包裝，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株從Uni-ZAP XR Vector上體外切割pBluescript成為 質(zhì)粒文庫。3) 中華絨鰲蟹cDNA文庫EST序列的大規(guī)模測定文庫中篩選陽性克 隆，使用載體通用引物T3 ( AATTAACCCTCACTAAAGGG )在 MegaBACE1000測序儀上進行序列測定，將得到的原始峰圖文件(*.abi， *.abd文件)數(shù)據(jù)經(jīng)Phred程序處理轉(zhuǎn)化為序列文件(氣s叫)和質(zhì)量文件(氣s叫.qual)，依據(jù)質(zhì)量文件提供的數(shù)值確定獲得序列的誤差概率，去除 低質(zhì)量的堿基，用cross-mach程序屏蔽數(shù)據(jù)中的載體序列，從得到的數(shù)據(jù) 中選取連續(xù)堿基質(zhì)量大于Q13 (準確率大于95%)且長度大于lOObp的序 列作為EST數(shù)據(jù)，具體的操作參照《基因表達序列標簽(EST)數(shù)據(jù)分析手冊》6(胡松年著，浙江大學出版社，2005年)。4) 中華絨鰲蟹EST序列的同源性分析及抗脂多糖因子基因片段的篩選 將獲得的全部有效的EST數(shù)據(jù)進行聚類拼接，生成Contigs和Singletons, 分別將所獲的Contigs與Singletons在數(shù)據(jù)庫中進行BLASTn和BLASTx分 析，具體的操作參照《基因表達序列標簽(EST)數(shù)據(jù)分析手冊》(胡松年著， 浙江大學出版社，2005年)。根據(jù)相似性分析結(jié)果尋找出與抗脂多糖因子 基因同源的EST序列。5) 中華絨鰲蟹抗脂多糖因子基因cDNA全長序列的克隆根據(jù)與抗脂 多糖因子基因同源的EST序列設(shè)計基因特異性引物GSF1 : GACGCAGGAGGATGCTAAC和GSF2: TGATGGCAGATGAAGGACAC， 分別利用載體通用引物T3 (AATTAACCCTCACTAAAGGG) 、 T7(GTAATACGACTCACTATAGGGC)進行3，和5'末端的擴增，PCR產(chǎn)物 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用膠回收試劑盒(上海中科開瑞生物芯 片公司)進行PCR產(chǎn)物的回收和純化，再與pMD-18T載體(大連寶生物 工程有限公司)連接，參照《分子克隆第三版》(黃培堂譯，科學出版社， 2002年)的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-blue，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，用載體 弓i物 M13-47 ( CGCCAGGGTT TTCCCAGTCACGAC ) 、 RV陽M (GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)進行PCR檢測，確認插入片段 大小后進行序列測定，測得的序列經(jīng)CLUSTER分析拼接后得到全長序列。 3'RACE擴增所用體系以及反應條件 25^11反應體系2.5^1 10 xPCR buffer1.0(ilMgCl2 (2.5 mM)2.0 pi dNTP (2.5 mM)1 引物GSFl(10pmol4d)1 pl引物T7(10pmol4U)16.3 jil of PCR-grade water0.2 |il (1 U) Taq polymerase (Promega)1 iilcDNA文諫模板。反應在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler (MJ Research)中進行，反應條件為首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列 循環(huán)94"C變性25秒，57'C退火30秒，72"C延伸60秒，共進行35個循 環(huán)，最后72"C延伸10分鐘。5'RACE擴增所用體系以及反應條件 25^1反應體系2.5 pi 10 x PCR buffer C12 (2.5 mM)2.0nldNB>(2.5mM)1 pi引物GSF2(10pmol/nl)1 ^引物T3(10pmo1/[！1)16.3 (jl of PCR-grade water0.2 fol (1 U) Taq polymerase (Promega)1 plcDNA模板。反應在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler (MJ Research)中進行，反應條件為首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列 循環(huán)94-C變性30秒，59T:退火30秒,72'C延伸50秒，共進行34個循 環(huán)，最后72。C延伸10分鐘。PCR篩選陽性克隆的反應條件 25^1反應體系2.5 pl 10 x PCR buffer1.0plMgCl2 (2.5 mM)2.0pldNTP(2.5 mM)1 pi引物Ml3-47 (10 pmol/)al)1 pi引物RV-M(10pmolV)16.3 pi of PCR-grade water0.2(1 U) Taq polymerase (Promega)1 ^菌液模板。反應在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler (MJ Research)中進行，反應條件為首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列 循環(huán)94"C變性25秒，6(TC退火30秒，72"C延伸60秒，共進行30個循 環(huán)，最后72"C延伸10分鐘。 一將3'RACE和5'RACE的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢 測，用膠回收試劑盒(上海中科開瑞生物芯片公司)進行PCR產(chǎn)物的回收 和純化，再與pMD-18T載體(大連寶生物工程有限公司)連接，參照《分 子克隆第三版》(黃培堂譯，科學出版社，2002年)的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 XLl-blue，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，送上海鼎安生物科技有限公司測序，測 得的序列經(jīng)CLUSTER分析拼接后得到全長序列。6)中華絨鰲蟹抗脂多糖因子基因的體外重組表達通過PCR技術(shù)， 禾U用 Rl ( GAATTCGGCTGGCTGGACCGGATTATT ) 和 R2 (GCGGCCGCTCAGGCATTCAGCAAAGGGTTAG)擴增編碼抗脂多糖因 子成熟肽的基因片斷，反應在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler (MJResearch)中進行，反應條件為首先94°C預變性5分鐘，然后 進入下列循環(huán)94'C變性25秒，65 °C退火30秒，72。C延伸60秒，共進 行30個循環(huán)，最后72C延伸10分鐘。按照《分子克隆第三版》的方法將 其克隆到pET32a表達載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS，測序確認 表達框的正確性。接種陽性克隆到含有1%葡萄糖的SOB液體培養(yǎng)基中， 37。C振蕩培養(yǎng)至OD6(W0.4-0.6，加入lmM的IPTG誘導過夜，離心保存菌體 沉淀。菌體以lmg/mL雞蛋清溶菌酶處理30min后超聲破碎200W，超聲60次，每次2秒，間隔14秒。離心收集上清和沉淀，沉淀以8M的尿素溶 解后，利用Amersham公司的HiTrap chelating柱純化重組產(chǎn)物，純化產(chǎn)物 經(jīng)2mM的還原谷胱甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽、lmM EDTA、 50mM Tris-HCl、 50mMNaCl、 10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素溶液透析復 性，尿素濃度從起始的6M逐漸替換到5M、 4M、 3M、 2M、 1M，最后一 次透析至無尿素的透析液時不添加甘油。復性后的重組產(chǎn)物采用經(jīng)典的殺 菌活性檢測方法(Wang D., Liu C., Liu J., He Z.， Zhang W.， Wu X. 2001. The native gene of anti-LPS factor from 7bc/^/ /ews加Vfewto加cloning, expression and its bacteriostatic activity in vz'組Protein Pept Lett. 8, 273-280)，以藤黃微 球菌、鰻弧菌和大腸桿菌TOP10F作為受試菌株檢驗表達產(chǎn)物的殺菌活性。 表達產(chǎn)物與指數(shù)生長期的供試菌株共孵育1 hr后，將適度稀釋的樣品涂步 于SOB固體平板，發(fā)現(xiàn)藤黃微球菌沒有生長，表明重組產(chǎn)物對于該菌株的 殺菌活性為100%;而對于革蘭氏陰性細菌鰻弧菌和大腸桿菌TOP10F的殺 菌活性分別是80%和26.42%。實施例2中華絨鰲蟹抗脂多糖因子基因的重組表達產(chǎn)物可作為動物飼料添加劑、食 品防腐劑、食品保鮮劑或用于制備治療人類敗血病的藥物。S柳皿E LISTING 《H0>中W科學院海洋研究所 2G》中華絨紫蟹抗脂多糖W了'埃W及K編碼級D鄰應用 <則> 2<370> Patent In version 3,1<220><221> CDS<222> (21). .(383)<223><纖1g幼ttcgtca腿ccacc稱t atg gca egc ctg teg etg ttc ctt etc gtt gtg 53 Met Ala if g Leu S枕Leu怖e Leu Leu Val i 5 10get gtt柳gtg ttt act cca aac att cca卿tgt gaa get ggc tgg 101 Ala Val Ala %i Phe Thr Pro Asn lie Pro Gin Cys Glu Ala Gly Trp 15 幼 25ctg gac egg att att ggt aca gca gtt gat tct gtt get g幼ttc gga i鄉(xiāng) Leu Asp Arg lie lie Gly Thr Ala Val Asp Ser Val Ala Glu Phe Gly 30 35 40aee act aat ata gtg gac c幼ate tgc aac acc cgt gtg atg cec acc 19 Thr Tte Asii lie Vai Asp Gin lie Cys Asn Hir Arg Val Met Pro Hir 45 50 55ata卿aag ttt gaa ctg t加tte鄉(xiāng)鵬鄉(xiāng)gtg tgg tgc cca ggc 245 lie Lys Lys Phe Glu Leu Tyr Phe Arg Gly Arg Yal Trp C^s Pro Gly 節(jié) 肪 70 75tgg aca aca ate c鄉(xiāng)鵬gag tct ctg act cgc age鄉(xiāng)acc鄉(xiāng)gtg 293 T， Thr Thr lie Gin Gly Ser Leu Thr Arg Ser Arg Tte" Arg Val 柳 肪 卯gtg aac aaa get gtg g幼g枉c ttc gcc agg aag get gtc gel gca ggc 341 Vai Asn Lys Ala Val Glu Asp Phe Ala Arg Lys Ala Val Ala Ala Gly 站 100 105etc aig aeg cag gag gat get aac cct ttg ctg aat gee t辟 383 Leu Mel Th^ Wn Glu Asp Ala Asn Pro Leu L抑Asn Ala 110 US l加tcatggagca g辟cgecaca cctct鵬gc acatggctat cctgacccat gtg，ccltca 443mgcralca ctc助cc化t ccctcag卿acattgt, gcaggatttc* tt朋ccttu 鄉(xiāng)ft卿 "'tg腿ra:ttgt8 ctstatt卿gtatatc卿cegccctra ccectlc卿 563t抑歐川a gtsgttcagc" scsccT'gatg 8ttttgttaa抑gactacct ttuctacatr 鄉(xiāng)a!ra,gfwgt aaaag朋gtl g"tggccag tactttgttg at"cataat朋mi卿ata 鄉(xiāng)rffu鵬f""副朋鵬則 7001700 DNA中華絨鸛蟹(Briocheir sinensis)!20P盯 ，屮,級科軀(Eriork、ir sineiisi s》> > > 。2222> > 二 > <formula>formula see original document page 11</formula>
權(quán)利要求
1. 一種中華絨鰲蟹抗脂多糖因子基因，其特征在于具有序列表SEQID No1中堿基序列。
2. —種權(quán)利要求l所述中華絨鰲蟹抗脂多糖因子基因編碼蛋白，其特 征在于具有序列表SEQIDNo:2中氨基酸序列。
3. —種權(quán)利要求2所述中華絨鰲蟹抗脂多糖因子基因的應用，其特征 在于中華絨鰲蟹抗脂多糖因子基因的重組表達產(chǎn)物可作為動物詞料添加 劑、食品防腐劑、食品保鮮劑或用于制備治療人類敗血病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學中華絨鰲蟹抗脂多糖因子基因克隆及體外重組表達技術(shù)，中華絨鰲蟹抗脂多糖因子基因，具有序列表SEQ ID No1中堿基序列。本發(fā)明利用構(gòu)建的中華絨鰲蟹cDNA文庫，采用RACE技術(shù)及體外重組表達技術(shù)，對中華絨鰲蟹抗脂多糖因子進行了研究，首次從中華絨鰲蟹中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列，該基因具有序列表中所示的序列，并利用原核重組技術(shù)表達了具有較強殺菌活性的重組蛋白。
文檔編號A61K38/17GK101245344SQ20071001373
公開日2008年8月20日 申請日期2007年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月17日
發(fā)明者宋林生, 李成華, 趙建民, 邱麗梅 申請人:中國科學院海洋研究所