專利名稱：抑制形成腳臭的微生物的制作方法
專利說明抑制形成腳臭的微生物 本發(fā)明涉及微生物，其可以預(yù)防皮膚微生物產(chǎn)生腳臭。本發(fā)明還涉及包含此類微生物的組合物，例如化妝品或藥物組合物，及此類微生物在化妝品、預(yù)防或治療應(yīng)用中的用途。
本領(lǐng)域所熟知的是源自汗腺或皮膚成分的有機(jī)物分解成短鏈脂肪酸會(huì)產(chǎn)生令人不快的體臭(Kanda等人.，Br.J.Dermat.122(1990)，771-776)。具體來說，當(dāng)腳包裹在鞋襪里并出汗時(shí)會(huì)形成腳臭。腳具有比身體其他部位更多數(shù)目的汗腺，因此它們過量排汗，并且由于腳被包裹在鞋襪中而致使產(chǎn)生的汗液無法蒸發(fā)出去。在腳部皮膚表面以共生體生存并且可對汗液組分或皮膚成分進(jìn)行新陳代謝的微生物引起惡臭。本領(lǐng)域公認(rèn)的事實(shí)是臭腳的主要增味劑是異戊酸。例如，Kanda等人.(Br.J.Dermat.122(1990)，771-776)發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重腳臭的人比無明顯腳臭的人產(chǎn)生更多數(shù)量的短鏈脂肪酸，尤其是異戊酸。異戊酸存在于所有具有腳臭的受試者中而在那些不具有腳臭的受試者中檢測不到，并且其在短襪和鞋中積累，導(dǎo)致腳部織物眾所周知的氣味。
異戊酸主要通過酶促轉(zhuǎn)化分支氨基酸亮氨酸產(chǎn)生?？杀容^的酶方法已從瑞士干酪的生產(chǎn)中獲知，其中特意用微生物來產(chǎn)生作為主要香味成分的異戊酸(Thierry等人，Appl.Env.Microbiol.68(2)(2002)，608-615)。乳酪丙酸菌構(gòu)成在瑞士型干酪熟成過程中生長的主要菌群之一并與所述特征性香味的形成密切相關(guān)。Thierry等人(Appl.Env.Microbiol.68(2)(2002)，608-615)表明費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)可以降解分支氨基酸并通過該細(xì)菌對亮氨酸進(jìn)行氨基交換產(chǎn)生α-酮異己酸，其隨后被酶促轉(zhuǎn)化為異戊酸。在現(xiàn)有技術(shù)中還沒有描述過與異戊酸生物合成密切相關(guān)的特異性的腳部微生物。
大部分當(dāng)前市場上可購買到的用于減少或去除令人不快體臭的產(chǎn)品或含有濃厚香氣以掩蓋體臭，或含有鋁鹽以抑制排汗，或依賴于非特異性降低腳部微生物的生物活性，即根除引起所述氣味的細(xì)菌。事實(shí)上，化妝品除臭劑通常含有抑制皮膚微生物菌群生長的抗菌化合物，像例如，2，4，4’-三氯-2’羥基-二苯基醚(三氯生)。然而，盡管該成分可有效抑制氣味的形成，但它導(dǎo)致保護(hù)皮膚的天然聚居微生物皮膚菌群受到嚴(yán)重破壞，例如導(dǎo)致潛在病原微生物建群于皮膚上(Bisno等人，Am.J.Med.76(5A)(1984)，172-179)。
因此，需要在不引起嚴(yán)重副作用或者不破壞人類腳部微生物皮膚菌群的情況下允許抑制腳臭形成的手段和方法。
本發(fā)明提出這種需要并提供了微生物和方法，其導(dǎo)致防止皮膚微生物引起腳臭。尤其是，提供了權(quán)利要求書中所述實(shí)施方案。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及微生物，其可預(yù)防皮膚微生物產(chǎn)生腳臭。
發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過向皮膚施用上述微生物或其滅活形式可有效預(yù)防腳臭的發(fā)生。發(fā)明人第一次鑒定了相應(yīng)的微生物并提供了對它們進(jìn)行鑒定的方法。這些微生物可以抑制皮膚上產(chǎn)生氣味的微生物形成異戊酸或抑制產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物的生長。由此抑制典型腳臭的產(chǎn)生。
術(shù)語“腳臭”涉及通常被描述為干酪樣的典型腳臭。所述“腳臭”通常由寄生在腳部皮膚區(qū)域的皮膚微生物產(chǎn)生。該術(shù)語優(yōu)選指可被檢測到的典型腳臭。更優(yōu)選地，該術(shù)語指用鼻子(優(yōu)選技術(shù)人員的鼻子)通過嗅聞來驗(yàn)證該典型腳臭的檢測。為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選使用不同等級的腳臭強(qiáng)度?？蓛?yōu)選定義這些等級為0(檢測不到氣味)，1(可檢測到的輕度氣味)，2(可檢測到的氣味)和3(可檢測到的強(qiáng)烈氣味)。與腳臭產(chǎn)生相關(guān)的術(shù)語“預(yù)防”是指當(dāng)皮膚與本發(fā)明的微生物接觸時(shí)，該典型干酪樣腳臭的釋放會(huì)停止或減少。優(yōu)選地，該術(shù)語涉及上述任何腳臭強(qiáng)度的等級從任一較高值降低到任一較低值。“釋放停止”指當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的微生物和皮膚接觸時(shí)檢測不到干酪樣腳臭。優(yōu)選地，該術(shù)語指當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的微生物和皮膚接觸時(shí)所述腳臭等級為0(檢測不到氣味)?！搬尫艤p少”指當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的微生物和皮膚接觸時(shí)所述干酪樣腳臭減少。與典型干酪樣腳臭的釋放相關(guān)的術(shù)語“減少”表示如果不與根據(jù)本發(fā)明的微生物接觸，皮膚的氣味強(qiáng)度為3(可檢測到的強(qiáng)烈氣味)，與根據(jù)本發(fā)明的微生物接觸的皮膚的氣味強(qiáng)度為2(可檢測到的氣味)，優(yōu)選為1(可檢測到的輕度氣味)，更優(yōu)選為0(檢測不到氣味)；或表示如果不與根據(jù)本發(fā)明的微生物接觸，皮膚的氣味強(qiáng)度為2(可檢測到的氣味)，與根據(jù)本發(fā)明的微生物接觸，皮膚的氣味強(qiáng)度為1(可檢測到的輕度氣味)并優(yōu)選為0(檢測不到氣味)；或表示如果不與根據(jù)本發(fā)明的微生物接觸，皮膚的氣味強(qiáng)度為1(可檢測到的輕度氣味)，與根據(jù)本發(fā)明的微生物接觸的皮膚的氣味強(qiáng)度為0(檢測不到氣味)。
通過“鼻子嗅聞”進(jìn)行的檢測涉及典型腳臭的檢測，該檢測通過一個(gè)或更多經(jīng)過利用鼻子進(jìn)行氣味檢測訓(xùn)練的人或者沒有經(jīng)過該訓(xùn)練的的人來進(jìn)行。所述檢測可以以任何合適的形式或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的技術(shù)來進(jìn)行。優(yōu)選地，所述檢測可由已經(jīng)過使用鼻子檢測腳臭訓(xùn)練合格的一組人員來進(jìn)行，更優(yōu)選地，它可通過組成合格小組的三人來進(jìn)行。為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選使用不同等級的腳臭強(qiáng)度?？蓛?yōu)選定義這些等級為0(檢測不到氣味)，1(可檢測到的輕度氣味)，2(可檢測到的氣味)和3(可檢測到的強(qiáng)烈氣味)。組成合格小組的個(gè)人或多人可獨(dú)立評估有氣味樣品的氣味強(qiáng)度?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法計(jì)算屬于該合格小組的人們的氣味感受值。優(yōu)選地，可計(jì)算該合格小組里所有人的氣味感受平均值?；谶@些數(shù)據(jù)，隨后可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法對氣味強(qiáng)度進(jìn)行定量。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，可通過一組人員來檢測腳臭，如Kanda等人在(Br.J.Dermat.122(1990)，771-776)中描述。此外，所述嗅聞測定可根據(jù)本文描述來進(jìn)行。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，能夠預(yù)防皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的微生物能夠抑制皮膚微生物的異戊酸生物合成。
術(shù)語“異戊酸的生物合成”涉及將例如已降解成氨基酸后的前體轉(zhuǎn)化成異戊酸，該前體通常可在腳部汗液分泌物中發(fā)現(xiàn)或由死皮細(xì)胞或(死)皮膚成分產(chǎn)生。
具體來說，術(shù)語“前體”涉及在導(dǎo)致產(chǎn)生異戊酸的反應(yīng)中可被化學(xué)轉(zhuǎn)化或酶轉(zhuǎn)化的化合物。優(yōu)選地，術(shù)語“前體”涉及支鏈氨基酸(BCAA)或其衍生物。更優(yōu)選地，所述術(shù)語涉及亮氨酸或氨基接納體，例如α-酮戊二酸或酮戊二酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，亮氨酸和α-酮戊二酸或酮戊二酸同時(shí)以底物或共底物形式來使用。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的微生物抑制至少一種其他有氣味的化合物的生物合成，在具有與典型腳臭相似的氣味的意義上講，該化合物是有氣味的。此類化合物的實(shí)例為3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁酸(異戊酸)乙酯，尤其是還有結(jié)構(gòu)上與異戊酸相關(guān)并可視為其衍生物的化合物。
術(shù)語“氣味”、“有氣味的”或“有氣味”表示可檢測到的典型腳臭。優(yōu)選地，所述術(shù)語表示典型腳臭的檢測通過鼻子，優(yōu)選技術(shù)人員的鼻子嗅聞來驗(yàn)證。更優(yōu)選地，所述術(shù)語指可通過GC/MS分析檢測到的異戊酸或其衍生物的量。術(shù)語“無臭味的”表示不能通過鼻子，優(yōu)選技術(shù)人員的鼻子嗅聞檢測到典型的腳臭。更優(yōu)選地，所述術(shù)語表示不能通過GC/MS分析檢測到異戊酸。通過“鼻子嗅聞”進(jìn)行的驗(yàn)證涉及一個(gè)或多個(gè)經(jīng)過利用鼻子進(jìn)行氣味檢測訓(xùn)練的人或沒有經(jīng)過該訓(xùn)練的人進(jìn)行的典型腳臭的檢測。更優(yōu)選地，所述術(shù)語涉及一個(gè)或多個(gè)經(jīng)過利用鼻子進(jìn)行氣味檢測訓(xùn)練的人或沒有經(jīng)過該訓(xùn)練的人進(jìn)行的異戊酸的檢測。所述檢測可以以任何合適的形式或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的技術(shù)來進(jìn)行。優(yōu)選地，所述檢測可通過已接受使用鼻子檢測腳臭訓(xùn)練的合格小組人員來進(jìn)行，更優(yōu)選地，它可通過形成合格小組的三個(gè)人來進(jìn)行。為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選使用不同等級的腳臭強(qiáng)度0(檢測不到氣味)，1(可檢測到的輕度氣味)，2(可檢測到的氣味)和3(可檢測到的強(qiáng)烈氣味)。組成合格小組的個(gè)人或人們可獨(dú)立評估有氣味的微生物樣品的氣味強(qiáng)度?？蓛?yōu)選評估體外產(chǎn)生的樣品的氣味，該樣品由能從異戊酸的前體形式產(chǎn)生異戊酸的微生物、前體和能抑制異戊酸生物合成的微生物組成，或可優(yōu)選評估對應(yīng)的對照樣品的氣味，該對照樣品不含本發(fā)明中定義的微生物?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法計(jì)算屬于該合格小組的人員的氣味感受值。優(yōu)選地，可計(jì)算該合格小組里所有人的氣味感受平均值。基于這些數(shù)據(jù)，隨后可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法對氣味強(qiáng)度進(jìn)行定量。
術(shù)語“皮膚”涉及身體外層覆蓋物，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知。所述術(shù)語優(yōu)選地涉及三層表皮、真皮和皮下脂肪組織。表皮是皮膚的最外一層。它通常在皮膚表面形成防水的保護(hù)性外皮并由復(fù)層扁平上皮和下面的基膜構(gòu)成。它通常不含血管，而由真皮滲濾為其提供營養(yǎng)。構(gòu)成表皮的主要細(xì)胞類型是角質(zhì)形成細(xì)胞，也存在黑素細(xì)胞和朗氏細(xì)胞。表皮被分成若干層，其中在最內(nèi)層通過有絲分裂形成細(xì)胞。它們在分化時(shí)改變形狀和組成向上層移動(dòng)并充滿角蛋白。它們最終到達(dá)最上層(稱為角質(zhì)層)并開始脫落或脫皮。表皮的最外層由25到30層死細(xì)胞組成。通常，表皮被分成5亞層或?qū)?從表到里)角質(zhì)層、透明層、顆粒層、棘層和生發(fā)層或基底層。通常，表皮和真皮之間的界面是不規(guī)則的并由一系列乳頭或指狀突出物組成，其在皮膚薄的地方最短而在掌部和足底皮膚中最長。通常，掌部和足底的乳頭與表皮的隆起相關(guān)，其產(chǎn)生嵴。皮下脂肪組織是皮膚的最內(nèi)層。該層的特征在于它由結(jié)締組織、血管和脂肪細(xì)胞組成。通常，這層將皮膚和下層結(jié)構(gòu)結(jié)合，使身體與冷隔絕并以脂肪形式儲(chǔ)存能量。所述皮膚通常形成保護(hù)屏障抵御物理、化學(xué)及細(xì)菌物質(zhì)對更內(nèi)層組織的作用。這表示屬于例如口腔或陰道部位或粘膜的組織不屬于皮膚。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語“皮膚”涉及身體覆蓋物的最外層，即表皮。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語“皮膚”涉及所述表皮的角質(zhì)層。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語“皮膚”涉及表皮最外層的25到30層死細(xì)胞。更優(yōu)選地，術(shù)語“皮膚”涉及表皮最外層的10層死細(xì)胞。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語“皮膚”涉及腳部皮膚。術(shù)語“腳部皮膚”涉及足部的皮膚區(qū)域，優(yōu)選足底皮膚區(qū)域。腳部皮膚通常為例如微生物提供獨(dú)特的棲息地。腳部皮膚表面在若干方面通常不同于身體其他區(qū)域。通常，足底的角質(zhì)層中角質(zhì)化的角質(zhì)層比身體任何其他地方厚例如約0.5mm。因此，腳部皮膚，優(yōu)選足底皮膚區(qū)域通?？梢跃S持高含水量。這表示它對營養(yǎng)物和流體的流入和流出的滲透性比其他皮膚表面都小。通常，腳部皮膚表面的結(jié)構(gòu)在類型和分布上都不同于身體其他地方。一般而言，腳底或腳面沒有皮脂腺。通常，在腳部沒有頂漿腺并且在足底或趾骨末端沒有毛囊。如通常所知，腳部皮膚具有大量排泄汗腺，其響應(yīng)熱刺激和精神刺激，不同于其余身體表面的排泄汗腺。一般而言，腳部皮膚表面形成保護(hù)屏障抵御物理、化學(xué)和細(xì)菌物質(zhì)對更深層組織的作用。通常，腳部皮膚區(qū)域的pH值比其他皮膚區(qū)域稍高。優(yōu)選地，腳底皮膚的pH稍高于其他皮膚區(qū)域的pH。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，腳部皮膚區(qū)域的pH值高于5.0，更優(yōu)選地高于5.5，甚至更優(yōu)選地高于6.0，最優(yōu)選地高于6.5。
與異戊酸或其他有氣味的化合物生物合成相關(guān)的術(shù)語“抑制”指當(dāng)與根據(jù)本發(fā)明的微生物接觸時(shí)，停止或減少皮膚微生物生成異戊酸或其他化合物。“停止形成”指在含有能產(chǎn)生異戊酸或其他化合物的微生物和根據(jù)本發(fā)明的微生物、存在異戊酸前體或其他化合物前體的混合物中檢測不到異戊酸或其他化合物?！皽p少形成”指在含有能產(chǎn)生異戊酸或其他化合物的微生物和根據(jù)本發(fā)明的微生物、存在異戊酸前體或其他化合物前體的混合物中異戊酸或其他化合物的量與不存在根據(jù)本發(fā)明的微生物的混合物中的量相比減少。與異戊酸或其他化合物生物合成相關(guān)的術(shù)語“減少”指在存在異戊酸前體或其他化合物前體、含有能夠產(chǎn)生異戊酸或其他化合物的微生物和根據(jù)本發(fā)明的微生物的混合物中異戊酸或其他化合物的量與不存在根據(jù)本發(fā)明的微生物的混合物中異戊酸或其他化合物的量相比低于95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、更優(yōu)選低于3％且最優(yōu)選地低于2％。
可以在下述測定中確定根據(jù)本發(fā)明的微生物抑制異戊酸生物合成的能力。
簡言之，這種測定包括以下步驟 -將應(yīng)檢測其抑制異戊酸生物合成能力的微生物與能產(chǎn)生異戊酸的微生物及異戊酸前體混合， -在允許產(chǎn)生異戊酸的條件下溫育所述混合物； -從該混合物的上清液中提取短鏈脂肪酸；并 -通過異戊酸的出現(xiàn)檢測氣味的釋放。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的比例并在任何合適的緩沖液中對所述組分進(jìn)行混合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在技術(shù)人員已知的合適的條件下對能夠產(chǎn)生異戊酸的微生物進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選地，在BHI培養(yǎng)液中，于37℃下對其進(jìn)行需氧培養(yǎng)。所述培養(yǎng)可進(jìn)行例如10至40小時(shí)，優(yōu)選20至35小時(shí)且甚至更優(yōu)選24小時(shí)。該培養(yǎng)可在技術(shù)人員已知的任何合適的容器中進(jìn)行。優(yōu)選地，該培養(yǎng)在搖動(dòng)的玻璃燒瓶中進(jìn)行。作為需氧培養(yǎng)所需的體積，可使用任何合適的體積，優(yōu)選1至50ml的體積，更優(yōu)選5至40ml，甚至更優(yōu)選10至30ml，且最優(yōu)選使用20ml。作為進(jìn)一步的步驟，可使用技術(shù)人員已知合適的量或體積用作進(jìn)一步培養(yǎng)的接種物。作為需氧培養(yǎng)的體積，可以使用任何合適的體積，優(yōu)選1到50μl，更優(yōu)選5到40μl，甚至更優(yōu)選10到30μl，且最優(yōu)選使用15μl首次培養(yǎng)物作為進(jìn)一步培養(yǎng)的接種物。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用15ul 24小時(shí)預(yù)培養(yǎng)物(20ml體積)作為進(jìn)一步培養(yǎng)的接種物。作為進(jìn)一步的步驟，可在技術(shù)人員已知的合適的條件下對能夠產(chǎn)生異戊酸的微生物進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選地，在BHI培養(yǎng)液中，于37℃下對其進(jìn)行需氧培養(yǎng)。該培養(yǎng)可進(jìn)行例如10到40小時(shí)，優(yōu)選20到35小時(shí)且甚至更優(yōu)選24小時(shí)。作為需氧培養(yǎng)所需的體積，可以使用任何合適的體積，優(yōu)選1到50ml，更優(yōu)選5到40ml，甚至更優(yōu)選10到30ml，且最優(yōu)選使用20ml?？稍诩夹g(shù)人員已知的任何合適的容器中進(jìn)行該培養(yǎng)。優(yōu)選地，該培養(yǎng)可在搖動(dòng)下進(jìn)行，更優(yōu)選地，該培養(yǎng)在劇烈搖動(dòng)下進(jìn)行，例如在往復(fù)式搖床上160轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)。隨后可以使用任何合適的方法從培養(yǎng)基中分離能夠產(chǎn)生異戊酸的微生物，例如可以將該微生物的培養(yǎng)物在4000xg下離心5分鐘。作為進(jìn)一步的步驟，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法洗滌所獲得的微生物，優(yōu)選在緩沖液，例如PBS緩沖液(pH 8.0)中洗滌獲得的細(xì)胞沉淀物一次到幾次。作為進(jìn)一步的步驟，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的緩沖液，優(yōu)選例如在20ml(如60mM)磷酸鹽緩沖液中，如PBS緩沖液(pH 8.0)中重懸所獲得的細(xì)胞。在技術(shù)人員已知的合適條件下培養(yǎng)該微生物，將檢測其抑制異戊酸生物合成的能力。優(yōu)選地，可在缺氧條件，例如在MRS培養(yǎng)液中，于37℃下對其進(jìn)行培養(yǎng)。更優(yōu)選地，可在封閉的Eppendorf管中對其進(jìn)行培養(yǎng)。所述培養(yǎng)可進(jìn)行任何合適的時(shí)間，例如1到3天，優(yōu)選30到60小時(shí)，更優(yōu)選40到50小時(shí)且甚至更優(yōu)選48小時(shí)。所述培養(yǎng)可用技術(shù)人員已知的任何合適形式的細(xì)菌開始。優(yōu)選地，該培養(yǎng)可用-80℃冰凍培養(yǎng)物開始。作為所述缺氧培養(yǎng)的體積，可使用任何合適的體積，優(yōu)選1到1000μl，更優(yōu)選10到500μl，甚至更優(yōu)選100到300μl，且最優(yōu)選使用150μl。隨后可用任何合適的方法從培養(yǎng)基中分離該微生物(將檢測其抑制異戊酸生物合成的能力)，例如可將該微生物的培養(yǎng)物，如在4000xg下離心15分鐘。作為進(jìn)一步的步驟，可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何合適的方法洗滌所獲得的微生物，優(yōu)選在緩沖液中洗滌獲得的細(xì)胞沉淀一到若干次，所述緩沖液優(yōu)選為磷酸緩沖液，更優(yōu)選為60mM的磷酸緩沖液，例如PBS緩沖液，pH 8.0。作為進(jìn)一步的步驟，可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何合適的緩沖液重懸所獲得的細(xì)胞，優(yōu)選例如在200μl(如60mM)磷酸鹽緩沖液如PBS緩沖液(pH 8.0)中重懸獲得的細(xì)胞沉淀。
對于所述測定，以本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何合適的比例將能產(chǎn)生異戊酸的微生物細(xì)胞，優(yōu)選洗滌過的細(xì)胞與異戊酸前體混合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用1到500μl細(xì)胞，更優(yōu)選5到200μl，甚至更優(yōu)選10到100μl且最優(yōu)選15μl。所述混合可在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的緩沖液中進(jìn)行，例如磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選地，該混合在60mM的磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中進(jìn)行?？梢允褂眉夹g(shù)人員已知的任何合適的量或濃度的異戊酸前體，例如其濃度為1mM到100mM，優(yōu)選2mM到50mM，更優(yōu)選5mM到20mM且最優(yōu)選10mM。作為異戊酸前體，優(yōu)選使用支鏈氨基酸。更優(yōu)選使用亮氨酸或α-酮戊二酸。甚至更優(yōu)選使用5mM的L-亮氨酸和10mM的α-酮戊二酸?？蓪?yīng)檢測其抑制異戊酸生物合成能力的微生物培養(yǎng)物細(xì)胞以技術(shù)人員已知的合適的量加入到此混合物中。優(yōu)選地，加入1μl至1000μl，更優(yōu)選5至500μl，甚至更優(yōu)選10至250μl，最優(yōu)選加入100μl。作為對照，可將任何合適的緩沖液或培養(yǎng)基，例如PBS緩沖液或MRS培養(yǎng)基以合適的相應(yīng)量加入上文表征的混合物中。在允許產(chǎn)生異戊酸的條件下溫育所述樣品。這種條件為技術(shù)人員已知?！霸试S產(chǎn)生異戊酸的條件”表示本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的允許微生物產(chǎn)生異戊酸的條件，例如可以在對照中得到證實(shí)，該對照中存在能夠產(chǎn)生異戊酸的微生物而不存在能夠抑制異戊酸生物合成的微生物。更優(yōu)選地，在需氧條件30℃下溫育樣品，例如溫育5至40小時(shí)，甚至更優(yōu)選溫育7至35小時(shí)，10至30小時(shí)并且最優(yōu)選溫育24小時(shí)。優(yōu)選地，所述溫育可以在搖動(dòng)下進(jìn)行，更優(yōu)選地，該溫育在劇烈搖動(dòng)下進(jìn)行，例如在往復(fù)式搖床上160rpm下進(jìn)行。然后可在例如4000xg下將所述細(xì)胞離心5分鐘，并將上清液例如用6MHCl酸化。隨后可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法提取短鏈脂肪酸，優(yōu)選使用3x150μl CHCl3?？梢岳缭诘逻M(jìn)一步濃縮所述提取物至例如10μl的體積。
或者可以用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法檢測異戊酸的存在。優(yōu)選地，異戊酸存在的檢測由GC/MS分析確定，例如使用裝配有分流式/非分流式注射器和FFAP柱的Hewlett-Packard GC 5980系列II/MSD 5971系統(tǒng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可將小體積，例如1μl有氣味的溶液或上述提取物注射進(jìn)GC/MSD，其裝配有例如非分流式FFAP柱(該柱為例如30m，0.5mm ID，膜厚度為0.53μm)。選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的注射器溫度和檢測器溫度。優(yōu)選地，選擇150℃至220℃注射器溫度和檢測器溫度。為合理分離短鏈脂肪酸，選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的溫度條件。優(yōu)選地，合理分離短鏈脂肪酸的溫度條件可以為150℃下維持2分鐘，然后以15℃/min的速度勻變至最終溫度220℃。所述溫度可維持1至100分鐘，優(yōu)選5至50分鐘并且最優(yōu)選3分鐘。可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件設(shè)置柱流量。優(yōu)選地，柱流量可以設(shè)定為30cm/s。作為載體氣體，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的氣體。優(yōu)選使用氦氣。異戊酸的鑒定可通過比較未知譜和純的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行。作為附加鑒定參數(shù)，例如可使用相對色譜滯留時(shí)間。如果在至少存在一種微生物的此類氣味釋放測定中檢測到的異戊酸的量不超過不存在根據(jù)本發(fā)明的微生物的混合物中檢測到的異戊酸的量的95％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％，優(yōu)選不超過5％，更優(yōu)選地不超過3％并且最優(yōu)選地不超過2％，認(rèn)為該微生物能夠抑制異戊酸的生物合成。
所述測定也可用于鑒定能夠抑制異戊酸生物合成的微生物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，能夠預(yù)防皮膚微生物產(chǎn)生腳臭或能夠抑制異戊酸生物合成的微生物能抑制產(chǎn)生臭味的皮膚微生物的生長。與產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物的生長相關(guān)的術(shù)語“抑制”表示當(dāng)與根據(jù)本發(fā)明的微生物接觸時(shí)，一種或多種此類微生物的生長減少。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物抑制至少一種產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物的生長，優(yōu)選抑制產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物的主要代表，即微球菌(Micrococcus spec)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物特異地抑制此類微生物、優(yōu)選微球菌的生長?！疤禺惖亍眱?yōu)選表示抑制此類微生物、優(yōu)選微球菌的生長，但并不顯著抑制或在微小程度上抑制其他微生物的生長，尤其是那些屬于定居的腳部皮膚微生物區(qū)系的微生物。術(shù)語“定居的腳部皮膚微生物區(qū)系”涉及需氧微生物區(qū)系，其可在腳部皮膚、優(yōu)選人類腳部皮膚上發(fā)現(xiàn)。通常，所述腳部皮膚微生物區(qū)系與在其他皮膚位置上看到的微生物區(qū)系相似。通常，細(xì)菌是最豐富的，最主要的細(xì)菌是例如微球菌科(Micrococcaceae)，最常見的是表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(凝固酶陰性)及例如棒狀桿菌細(xì)菌類白喉菌(diphteroids)(Tachibana DK.Microbiology of the foot.Annu Rev Microbiol.1976；30351-375.Marshall J，Leeming JP，Holland KT.The cutaneousmicrobiology of normal human feet.J Appl Bacteriol.1987Feb；62(2)139-146)。通常，需氧細(xì)菌的范圍為例如每cm2 102至106菌落形成單位。通常，在腳部，細(xì)菌只存在于皮膚表面。如通常所知，沒有證據(jù)證明細(xì)菌存在于正常未損傷的皮膚表皮層下面。
更優(yōu)選地，術(shù)語“特異地”表示對產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物、優(yōu)選微球菌的抑制程度遠(yuǎn)高于對另一微生物，尤其是腳部定居皮膚微生物區(qū)系的微生物的抑制程度。特別優(yōu)選地，術(shù)語“特異地”表示在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的生長測定中，存在本發(fā)明的微生物時(shí)產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物、優(yōu)選微球菌的增殖至多是存在本發(fā)明的微生物時(shí)另一微生物、尤其腳部定居皮膚微生物區(qū)系的另一微生物增殖的50％。優(yōu)選地，存在本發(fā)明的微生物時(shí)，產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物、優(yōu)選微球菌的增殖為另一微生物、尤其腳部定居皮膚微生物區(qū)系的40％，30％，20％，10％，更優(yōu)選為5％并且最優(yōu)選為0％。對微球菌的特異性抑制顯示于實(shí)施例4和實(shí)施例5中，為了闡明，其表明微球菌被抑制，然而在體外液體測定中表皮葡萄球菌卻不被本發(fā)明的微生物抑制。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物抑制微球菌的生長，卻不抑制表皮葡萄球菌的生長。
降低的生長優(yōu)選指增殖即時(shí)間單位的細(xì)胞分裂減少?；蛘?，術(shù)語“抑制”也指個(gè)體細(xì)胞大小減小?？捎萌玖蟂YBR Green I(分子探針，美國)將細(xì)菌細(xì)胞染色后，通過流式細(xì)胞術(shù)評估其大小(例如Becton-DickinsonFACSort流式細(xì)胞儀，San José，CA)。細(xì)菌細(xì)胞大小以Side-Angle LightScatter(SSC)式評估。生長降低從而指時(shí)間單位上生物量產(chǎn)量的減少。
可優(yōu)選在體外觀察產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物生長的降低，更優(yōu)選在測定中觀察，在該測定中根據(jù)本發(fā)明的微生物與一種或更多種產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物接觸，并且測定產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物的生長?？稍跍赜煌瑫r(shí)間間隔后對細(xì)胞/菌落數(shù)計(jì)數(shù)而確定所述生長，并可與不含有根據(jù)本發(fā)明微生物的對照比較，從而確定生長是否降低。確定生長抑制的體外測定在實(shí)施例中描述，并包括所稱作的“體外孔板測定”。簡言之，這種測定包括以下步驟 -培養(yǎng)至少一種產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物并將其均勻地涂布在準(zhǔn)備好的含有合適瓊脂培養(yǎng)基的瓊脂平板上用于生長，并且優(yōu)選用于檢測各自微生物； -在接種瓊脂平板上準(zhǔn)備孔； -用本發(fā)明微生物的預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞填滿所述孔； -在允許產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物生長的條件下將該瓊脂平板溫育適當(dāng)時(shí)間；并 -確定含有本發(fā)明微生物的孔周圍產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物區(qū)系的微生物的生長并與不含根據(jù)本發(fā)明微生物的孔周圍的微生物生長比較。
在最后步驟中，所述生長的確定可以通過用于測定細(xì)胞和/或菌落數(shù)目的工具和方法實(shí)現(xiàn)，例如通過使用適當(dāng)染料染色和/或光學(xué)方法如光密度測定法和在顯微鏡下對細(xì)胞/菌落計(jì)數(shù)。
所述測定也可用于鑒定微生物，其能抑制產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物的生長。
更優(yōu)選地，對產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物生長進(jìn)行的抑制可在“體外液體測定”中測定。這種測定在實(shí)施例中描述，并簡單地包括以下步驟 -在液體培養(yǎng)物中培養(yǎng)至少一種產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物； -將本發(fā)明的微生物液體培養(yǎng)物的等分試樣和產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物液體培養(yǎng)物的等分試樣應(yīng)用于允許瞬時(shí)致病的皮膚微生物區(qū)系微生物生長的培養(yǎng)基中； -將根據(jù)本發(fā)明的微生物與產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物在液體培養(yǎng)物中共培養(yǎng)； -將共培養(yǎng)液體培養(yǎng)物的等分試樣轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)生長培養(yǎng)基的瓊脂平板上； -在允許產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物生長的條件下將該瓊脂平板溫育一段時(shí)間； -通過對菌落形成單位進(jìn)行定量來確定產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物的生長并將其與對照中微生物的生長相比，其中對照中在未應(yīng)用本發(fā)明的微生物。
甚至更優(yōu)選地，也可在“原位皮膚測定”中觀察產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物區(qū)系的生長。這種測定包括以下步驟 -培養(yǎng)至少一種產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物并將它/它們均勻地涂布于測試個(gè)體的皮膚區(qū)； -將根據(jù)本發(fā)明的微生物的等分試樣應(yīng)用到涂布有產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物的區(qū)域內(nèi)的準(zhǔn)確區(qū)域； -將該皮膚溫育足夠的時(shí)間以允許產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物生長； -將皮膚上層(包括其中含有的微生物)轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)生長培養(yǎng)基的瓊脂平板上； -在允許產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物生長的條件下將所述瓊脂平板溫育一段時(shí)間； -確定在已應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的微生物的區(qū)域周圍產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物的生長并將其與在未應(yīng)用本發(fā)明微生物的對照中微生物的生長相比。
用于這種測定的皮膚區(qū)域可為個(gè)體任何合適的皮膚區(qū)域，優(yōu)選人類個(gè)體皮膚區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，其為人類個(gè)體腳部皮膚區(qū)。所述區(qū)域的大小是不確定的，優(yōu)選為約1至40cm2，更優(yōu)選為5至20cm2，甚至更優(yōu)選為5至10cm2，例如約5，6，7，8，9或10cm2。
產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物均勻分布于所述區(qū)域，優(yōu)選密度為約102cfu/cm2-103cfu/cm2。涂布于該皮膚上的微生物被風(fēng)干并將本發(fā)明的微生物的等分試樣以準(zhǔn)確的方式應(yīng)用到該區(qū)域內(nèi)。這可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法實(shí)現(xiàn)。例如，將根據(jù)本發(fā)明的微生物離心(15min，4000xg)。用K/Na緩沖液洗滌所述細(xì)胞沉淀兩次(每次1ml)。在200μl K/Na緩沖液中重懸細(xì)胞并用微型移液器將10μl準(zhǔn)備好的微生物準(zhǔn)確應(yīng)用到預(yù)接種的皮膚區(qū)域。
在室溫下溫育所述皮膚例如2小時(shí)。上層皮膚(包括其中含有的微生物)的轉(zhuǎn)移例如可在膠帶條的幫助下完成。將其上轉(zhuǎn)移有上層皮膚的瓊脂平板在允許待檢測的產(chǎn)生惡臭的皮膚微生物生長的溫度下溫育，并且該平板含有支持這種(這些)微生物生長的已知的生長培養(yǎng)基。所述溫育通常進(jìn)行約24小時(shí)。
微生物的生長可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過已知的方法檢測。優(yōu)選地，其由光密度測定法或?qū)σ褢?yīng)用本發(fā)明的微生物的等分試樣的點(diǎn)周圍形成的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)確定?？蓪⒓?xì)菌細(xì)胞用SYBR Green I(分子探針，美國)染色，然后由流式細(xì)胞術(shù)評估該細(xì)菌細(xì)胞的大小(例如Becton-DickinsonFACSort流式細(xì)胞儀，San José，CA)。細(xì)菌細(xì)胞大小以Side-Angle LightScatter(SSC)模式評估。
在體外孔板測定中，如果與未加微生物的對照相比，該微生物導(dǎo)致至少一種產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物生長下降至少5％，優(yōu)選至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，更優(yōu)選至少95％，甚至更優(yōu)選至少99％并且最優(yōu)選100％，它就被認(rèn)為可抑制一種或更多種產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物的生長。
更優(yōu)選地，在體外液體測定中，如果與未加微生物的對照相比，該微生物導(dǎo)致至少一種產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物生長下降至少5％，優(yōu)選至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，更優(yōu)選至少95％，甚至更優(yōu)選至少99％并且最優(yōu)選100％，它就被認(rèn)為可抑制一種或更多種產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物的生長。
甚至更優(yōu)選地，在原位皮膚測定中，如果該微生物導(dǎo)致至少一種產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物生長下降至少5％，優(yōu)選至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、更優(yōu)選至少95％，甚至更優(yōu)選至少99％并且最優(yōu)選100％，該微生物就被認(rèn)為可抑制一種或更多種產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物的生長。用于確定微生物能否抑制產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物例如微球菌生長的檢測優(yōu)選為上述體外和/或原位檢測，更優(yōu)選實(shí)施例中描述的檢測。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將用于上述測定中的能夠產(chǎn)生異戊酸的產(chǎn)生氣味的微生物屬于微球菌或丙酸桿菌屬(Propionibacterium)。更優(yōu)選地，產(chǎn)生氣味的微生物是微球菌或費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)。最優(yōu)選地，在上述測定中所用的產(chǎn)生氣味的微生物為費(fèi)氏丙酸桿菌shermanii亞種TL34(ATCC 9614)。
可如實(shí)施例描述并根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法分離微生物，其產(chǎn)生導(dǎo)致腳臭的典型氣味的化合物。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物為屬于乳酸細(xì)區(qū)系的微生物。術(shù)語“屬于乳酸細(xì)區(qū)系的微生物”包括屬于細(xì)菌的微生物，尤其屬于革蘭氏陽性發(fā)酵真細(xì)菌，更尤其屬于包括乳酸細(xì)菌的乳桿菌科。根據(jù)分類學(xué)觀點(diǎn)可將乳酸細(xì)菌細(xì)分為鏈球菌屬(Streptococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)。本發(fā)明的微生物優(yōu)選為乳桿菌種或乳球菌種或明串珠菌種。所述乳酸細(xì)區(qū)系的成員通常缺乏吡啉和細(xì)胞色素，不能進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移磷酸化作用，因此只能通過底物水平磷酸化獲得能量，即在乳酸細(xì)菌中ATP是通過碳水化合物的發(fā)酵作用合成的。所有的乳酸細(xì)菌都厭氧生長，然而，不象多數(shù)厭氧菌，大部分乳酸細(xì)菌對氧并不敏感，因此其在氧存在及不存在下都能生長。因此，本發(fā)明的細(xì)菌優(yōu)選為耐氧性厭氧乳酸細(xì)菌，優(yōu)選屬于乳桿菌屬、乳球菌屬或明串珠菌屬。
本發(fā)明的乳酸細(xì)菌優(yōu)選為棒狀或球狀(在長細(xì)與短的彎曲棒狀間變化)，此外優(yōu)選為固定的和/或不產(chǎn)生孢子的細(xì)菌，并產(chǎn)生作為發(fā)酵代謝作用主要或唯一產(chǎn)物的乳酸。本發(fā)明的微生物所屬的乳桿菌屬在優(yōu)選的實(shí)施方案中根據(jù)以下特征分成三個(gè)主要亞群，其中可設(shè)想本發(fā)明的乳桿菌屬可屬于這三個(gè)主要亞群的任何一個(gè)。
(a)同型發(fā)酵乳桿菌 (i)從葡萄糖出發(fā)經(jīng)過糖降解途徑(Embden-Meyerhof)產(chǎn)生至少85％量的乳酸，優(yōu)選乳酸的L-，D-或DL-同分異構(gòu)體； (ii)在45℃溫度下生長，但不能在15℃溫度下生長； (iii)為長棒狀；并且 (iv)細(xì)胞壁具有甘油磷壁酸； (b)同型發(fā)酵乳桿菌 (i)經(jīng)過糖降解途徑(Embden-Meyerhof)產(chǎn)生乳酸，優(yōu)選為乳酸的L-或DL-同分異構(gòu)體； (ii)在15℃溫度下生長，45℃溫度下呈現(xiàn)可變異的生長； (iii)為短棒狀或棒狀；并且 (iv)它們的細(xì)胞壁具有核糖醇和/或甘油磷壁酸； (c)異型發(fā)酵乳桿菌 (i)從葡萄糖出發(fā)經(jīng)過戊糖磷酸途徑以至少50％的量產(chǎn)生乳酸，優(yōu)選乳酸的DL-同分異構(gòu)體； (ii)產(chǎn)生二氧化碳和乙醇； (iii)在15℃或45℃溫度呈現(xiàn)可變異生長； (iv)為長棒狀或短棒狀；并且 (v)它們的細(xì)胞壁具有甘油磷壁酸。
基于上述特征，本發(fā)明的微生物可歸類于乳酸細(xì)菌種群，尤其歸類于乳桿菌屬。通過經(jīng)典系統(tǒng)分類學(xué)，例如通過參考″Bergey′s Manual ofSystematic Bacteriology″(Williams & Wilkins Co.，1984)中的恰當(dāng)描述，可以確定本發(fā)明的微生物屬于乳桿菌屬。或者，通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法可將本發(fā)明的微生物歸類于乳桿菌屬，例如通過它們的代謝圖譜，即對本發(fā)明的微生物使糖發(fā)生代謝的能力的同等概述，或通過例如Schleifer等人在System.Appl.Microb.，18(1995)，461-467或Ludwig等人在System.Appl.Microb.，15(1992)，487-501中描述的其他方法。本發(fā)明的微生物能代謝糖源，所述糖源是屬于乳桿菌屬的微生物典型的并為本領(lǐng)域已知。
本發(fā)明的微生物與乳桿菌屬的關(guān)系也可通過使用本領(lǐng)域已知的其他方法來表征，例如使用待測定種的總蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并將它們與已知的并已表征的乳桿菌屬菌株相比較。上述制備總蛋白質(zhì)譜的技術(shù)及這種譜的數(shù)值分析為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。然而，所述結(jié)果只在該方法每一階段都足夠標(biāo)準(zhǔn)的范圍內(nèi)才可靠。確定微生物對乳桿菌屬的附屬關(guān)系時(shí)，面對準(zhǔn)確度的需要，標(biāo)準(zhǔn)方法通常由它們的作者制定并對公眾開放，例如Pot等人在歐洲聯(lián)盟1994年12月12至16日在比利時(shí)Ghent大學(xué)組織的研討會(huì)(workshop)期間給出的方法(Fingerprinting techniquesfor classification and identification of bacteria，SDS-PAGE of whole cellprotein)。在分析SDS-PAGE電泳凝膠的技術(shù)中使用的軟件具有至關(guān)緊要的重要性，因?yàn)槲锓N間的相關(guān)程度依賴于該軟件使用的參數(shù)和算法。不探究理論細(xì)節(jié)，通過光密度計(jì)測量并經(jīng)電腦標(biāo)準(zhǔn)化后的條帶的定量比較優(yōu)選用泊松(Pearson)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行。由此獲得的相似矩陣可在UPGMA(unweighted pair group method using average linkage)算法的幫助下組織起來，該算法不僅可將最相似的譜聚到一起，也可構(gòu)造系統(tǒng)樹(見Kersters，Numerical methods in the classification and identification ofbacteria by electrophoresis，in Computer-assisted Bacterial Systematics，337-368，M.Goodfellow，A.G.O′Donnell Ed.，John Wiley and Sons Ltd，1985) 或者，本發(fā)明的微生物與乳桿菌屬的關(guān)系可用所稱作的Riboprinter.RTM關(guān)于核糖體RNA來表征。更優(yōu)選地，本發(fā)明新鑒定的種與乳桿菌屬的關(guān)系通過比較本發(fā)明細(xì)菌的16S核糖體RNA核苷酸序列或它們編碼16S核糖體RNA的基因組DNA的核苷酸序列與迄今為止已知的乳酸細(xì)菌的其他屬和種的核苷酸序列來闡明。另一確定本發(fā)明新鑒定的種與乳桿菌屬的關(guān)系的優(yōu)選方案為使用種特異性PCR引物，其靶定16S-23S rRNA間隔區(qū)。另一優(yōu)選方案為RAPD-PCR(Nigatu等人在Antonie van Leeuwenhoek(79)，1-6，2001中)，通過其可生成菌株特異DNA帶型來允許確定本發(fā)明中鑒定的微生物與乳桿菌屬的關(guān)系?？捎糜诖_定本發(fā)明的微生物與乳桿菌屬的關(guān)系的其他技術(shù)為限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)(Giraffa等人，Int.J.Food Microbiol.82(2003)，163-172)、重復(fù)元件的指紋(Gevers等人，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.205(2001)31-36)或細(xì)菌細(xì)胞脂肪酸甲酯(FAME)模式分析(Heyrman等人，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.181(1991)，55-62)?；蛘撸闂U菌可通過凝集素分類(Annuk等人，J.Med.Microbiol.50(2001)，1069-1074)或通過對它們的細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的分析(Gatti等人，Lett.Appl.Microbiol.25(1997)，345-348)來確定。
在本申請的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述微生物為益生微生物。在本發(fā)明背景中，術(shù)語“益生的”表示如果該微生物局部應(yīng)用于皮膚會(huì)對健康有益。優(yōu)選地，“益生的”微生物為活微生物，當(dāng)其局部應(yīng)用于皮膚，例如腳部皮膚時(shí)，它對該組織的健康有益。最優(yōu)選地，這表示該微生物對皮膚區(qū)系具有積極影響。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物屬于植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)種、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)種、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrückii)(優(yōu)選德氏乳桿菌德氏亞種(Lactobacillusdelbrückii delbrückii))、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)種、短乳球菌(Lactococcus brevis)種、乳乳球菌(Lactococcus lactis)種或腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)種。然而，本發(fā)明的乳酸細(xì)菌并不局限于此。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物選自由BASFFuture Business GmbH，4.Gartenweg-Z25，67063 Ludwigshafen，德國在德意志微生物保藏中心(DSMZ)保藏的短乳桿菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、德氏乳桿菌德氏亞種或腸膜明串珠菌，其保藏號為DSM 17599(短乳桿菌，LB-FG-0001)、DSM 17600(植物乳桿菌，LB-FG-0002)、DSM 17601(彎曲乳桿菌，LB-FG-0003)、DSM 17602(腸膜明串珠菌，LB-FG-0004)，DSM 17603(植物乳桿菌，LB-FG-0005)、DSM 17604(德氏乳桿菌德氏亞種，LB-FG-0006)、DSM 17605(德氏乳桿菌德氏亞種，LB-FG-0007)、DSM17606(植物乳桿菌，LB-FG-0008)和DSM 17607(短乳桿菌，LB-FG-0009)。
本發(fā)明也涉及上述保藏的乳酸細(xì)菌菌株的突變體或衍生物，其中該突變體或衍生物已保留皮膚微生物抑制腳臭產(chǎn)生的能力，更優(yōu)選保留抑制異戊酸生物合成的能力和/或抑制產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物生長的能力。
術(shù)語“保藏于DSMZ的短乳桿菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、德氏乳桿菌德氏亞種或腸膜明串珠菌”涉及由BASF Future Business GmbH，4.Gartenweg-Z25，67063 Ludwigshafen，德國于2005年9月22日在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen)(DSMZ)保藏的短乳桿菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、德氏乳桿菌德氏亞種或腸膜明串珠菌的微生物細(xì)胞，并具有以下保藏號DSM17599(短乳桿菌，LB-FG-0001)、DSM 17600(植物乳桿菌，LB-FG-0002)、DSM 17601(彎曲乳桿菌，LB-FG-0003)、DSM 17602(腸膜明串珠菌，LB-FG-0004)，DSM 17603(植物乳桿菌，LB-FG-0005)、DSM 17604(德氏乳桿菌德氏亞種，LB-FG-0006)、DSM 17605(德氏乳桿菌德氏亞種，LB-FG-0007)、DSM 17606(植物乳桿菌，LB-FG-0008)和DSM 17607(短乳桿菌，LB-FG-0009)。DSMZ坐落于德國布勞恩斯切魏格D-38124的馬斯切爾奧德爾韋格1b。根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約進(jìn)行上述保藏。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物為“分離的”或“純化的”。術(shù)語“分離的”指所述材料從其最初環(huán)境中移走，例如如果它是天然存在的，就從自然環(huán)境中移走或如果它為培養(yǎng)的，就從培養(yǎng)基中移走。例如，分離天然存在的微生物，優(yōu)選乳酸細(xì)菌，其與天然系統(tǒng)中一些或所有共存物質(zhì)分離。這樣的微生物可以是組合物的部分，但仍然視作是分離的，因?yàn)樵摻M合物并不是自然環(huán)境的一部分。
術(shù)語“純化的”并不需要絕對純度；相反，其旨在為相對定義。已經(jīng)將從庫中獲得的個(gè)別微生物純化至微生物同質(zhì)性，即當(dāng)使用本領(lǐng)域已知的方法將其劃線到瓊脂平板上時(shí)可以以單菌落生長。優(yōu)選地，用于此目的的瓊脂平板用于選擇乳酸細(xì)菌，優(yōu)選乳桿菌物種。此選擇性瓊脂平板為本領(lǐng)域已知。
本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的微生物的滅活形式，例如其為熱滅活或凍干的，但保留抑制異戊酸生物合成能力的性質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“本發(fā)明的微生物的滅活形式”包括本發(fā)明的微生物的死細(xì)胞或滅活細(xì)胞，優(yōu)選此處公開的乳酸細(xì)菌，該乳酸細(xì)菌在屬于乳酸細(xì)菌的微生物特異的平板上不再能形成單菌落。所述死細(xì)胞或滅活細(xì)胞可以具有完整的細(xì)胞膜也可以具有破碎的細(xì)胞膜。殺死或滅活本發(fā)明的微生物的方法為本領(lǐng)域所公知。El-Nezami等人在J.Food Prot.61(1998)，466-468中描述通過紫外線照射來滅活乳桿菌的方法。優(yōu)選熱滅活或凍干本發(fā)明的微生物細(xì)胞。凍干本發(fā)明的細(xì)胞具有易于保存及操作并可保留預(yù)防皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的性質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。
此外，在本領(lǐng)域公知的條件下將凍干的細(xì)胞應(yīng)用到合適的液體或固體培養(yǎng)基中時(shí)，其可再次生長。由本領(lǐng)域公知的方法完成凍干。優(yōu)選地，其在室溫即在16℃和25℃間的任何溫度下進(jìn)行至少2小時(shí)。此外，為了仍然保留上述性質(zhì)，本發(fā)明的凍干微生物細(xì)胞在4℃下至少穩(wěn)定4周。熱滅活可通過將本發(fā)明的微生物細(xì)胞在170℃的溫度下溫育至少2小時(shí)來完成。然而，熱滅活優(yōu)選通過將所述細(xì)胞在飽和蒸汽中2巴大氣壓、121℃溫度下高壓滅菌至少20分鐘來完成?；蛘?，本發(fā)明微生物細(xì)胞的熱滅活通過將該細(xì)胞在-20℃冰凍至少4周、3周、2周、1周、12小時(shí)、6小時(shí)、2小時(shí)或1小時(shí)來完成。優(yōu)選至少70％、75％或80％、更優(yōu)選至少85％、90％或95％、特別優(yōu)選至少97％、98％、99％、并且更特別優(yōu)選至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或至少99.9％，最優(yōu)選100％的本發(fā)明的微生物滅活形式的細(xì)胞為死細(xì)胞或滅活細(xì)胞，然而，它們?nèi)匀槐Ａ舴乐蛊つw微生物產(chǎn)生腳臭的能力?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的方法，例如通過檢測其生活力來檢測本發(fā)明的微生物的滅活形式是實(shí)際上死亡的還是滅活的。
術(shù)語“本發(fā)明的微生物的滅活形式”也包括本發(fā)明的微生物、優(yōu)選此處公開的乳酸細(xì)菌的裂解物或級分，其中所述裂解物或級分優(yōu)選防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭。這種抑制可如此處描述的來檢測，尤其是通過附加的實(shí)施例中描述的來檢測。如果本發(fā)明的微生物的裂解物或級分可防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭，那么技術(shù)人員就可以例如通過本領(lǐng)域公知的方法(在下文中示例)進(jìn)一步純化該裂解物或級分以去除可防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的物質(zhì)。這表示如果本發(fā)明的微生物裂解物或級分不能防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭，技術(shù)人員可例如通過本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)一步純化所述裂解物或級分以去除阻礙防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的物質(zhì)。然后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可再次檢測裂解物或級分是否防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“裂解物”指破碎的本發(fā)明微生物細(xì)胞的水性介質(zhì)溶液或懸浮液。然而，所述術(shù)語不應(yīng)以任何限制性方式來解釋。所述細(xì)胞裂解物包含例如大分子，如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、脂等等和/或小分子，如氨基酸、糖、脂質(zhì)酸等等或其級分。此外，所述裂解物包含平滑的或顆粒狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞碎片。制備微生物細(xì)胞裂解物的方法為本領(lǐng)域公知，例如通過使用弗氏壓碎器、使用玻璃珠或鐵珠研磨細(xì)胞或酶促細(xì)胞裂解等等。另外，裂解細(xì)胞涉及本領(lǐng)域公知的用于打開/破碎細(xì)胞的多種方法。裂解細(xì)胞的方法并不重要，任何能實(shí)現(xiàn)裂解本發(fā)明的微生物細(xì)胞的方法都可使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇一種合適的方法，例如可通過酶學(xué)、化學(xué)或物理方法打開/破碎細(xì)胞。酶和酶混合液的非限定性實(shí)例是蛋白酶如蛋白酶K、脂酶或糖苷酶；化學(xué)品的非限定性實(shí)例是離子載體、去污劑，如十二烷基硫酸鈉、酸或堿；物理方法的非限定性實(shí)例是高壓如弗氏壓碎、滲透性、溫度如熱或冷。此外，也可使用除了蛋白水解酶之外的酶、酸、堿等等的適當(dāng)組合的方法。例如，通過冷凍和解凍來裂解本發(fā)明的微生物細(xì)胞，更優(yōu)選在溫度低于-70℃下冷凍并在溫度高于30℃解凍，特別優(yōu)選在溫度低于-75℃冷凍并在溫度高于35℃解凍，最優(yōu)選冷凍的溫度低于-80℃并且解凍的溫度高于37℃。也優(yōu)選重復(fù)所述冷凍/解凍至少1次，更優(yōu)選至少2次，甚至更優(yōu)選至少3次，特別優(yōu)選至少4次，最優(yōu)選至少5次。
因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考以上概述并適當(dāng)修飾或改變那些方法(如需要的話)來制備期望的裂解物。優(yōu)選地，用于所描述的裂解物的水性介質(zhì)為水、生理鹽水或緩沖溶液。細(xì)菌細(xì)胞裂解物的優(yōu)點(diǎn)是其因需要較少的技術(shù)設(shè)備而易于生產(chǎn)并可經(jīng)濟(jì)地保存。
優(yōu)選地，術(shù)語“提取物”指本發(fā)明的微生物亞細(xì)胞組分，例如大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、脂類等等，和/或小分子如氨基酸、糖、脂質(zhì)酸等等，或任何其它有機(jī)化合物或分子，或其級分，其中所述提取物防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭。更優(yōu)選地，術(shù)語“提取物”涉及無細(xì)胞培養(yǎng)基中的任一種上述亞細(xì)胞組分。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，可使用本領(lǐng)域公知的打開/破碎細(xì)胞的多種方法來裂解細(xì)胞從而獲得提取物，如上文中描述的和/或作為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)囊后w、培養(yǎng)基或緩沖液中本發(fā)明的微生物培養(yǎng)物或這種培養(yǎng)物的裂解物或任何其他合適的細(xì)胞懸浮液在經(jīng)離心程序后的上清液。更優(yōu)選地，所述提取物可以是純化的裂解物或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液或其任何級分或子部分，其中所述純化的裂解物或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液或其任何級分或子部分防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭。純化提取物的合適方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并包括例如親和層析、離子交換層析、大小排阻層析、反相層析和層析柱中用其他層析材料的層析，或分批法，其他分級分離方法，例如過濾法，例如超濾、透析、透析和離心根據(jù)大小排阻濃縮、密度梯度離心或分布基質(zhì)離心，沉淀作用例如親和沉淀、鹽溶或鹽析法(硫酸銨沉淀)、醇沉淀或其他蛋白質(zhì)化學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)或物理學(xué)方法。
根據(jù)本發(fā)明，裂解物也是來自上述裂解物中的分子級分制備物。這些級分可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得，例如層析，包括例如親和層析、離子交換層析、大小排阻層析、反相層析和層析柱中用其他層析材料的層析，或分批法，其他分級分離方法例如過濾法，例如超濾、透析、透析和離心根據(jù)大小排阻濃縮、密度梯度離心或分布基質(zhì)離心，沉淀作用例如親和沉淀、鹽溶或鹽析法(硫酸銨沉淀)、醇沉淀或其他蛋白質(zhì)化學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)或物理學(xué)方法來分離該裂解物的上述組分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選那些比其他級分更具免疫性的級分。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇合適的方法，并且通過參考以上概述和此處實(shí)施例中的特定解釋及適當(dāng)修飾或改變那些方法(如需要的話)來確定其免疫原潛力。
因此，術(shù)語“本發(fā)明的微生物的滅活形式”也包括本發(fā)明的微生物、優(yōu)選此處公開的乳酸細(xì)菌的濾液，其中所述濾液優(yōu)選防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭。這種抑制可如此處描述的來檢測，尤其如附加的實(shí)施例中描述的來檢測。如果本發(fā)明的微生物濾液不能防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭，那么技術(shù)人員就可以例如通過本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)一步純化該濾液(其在下文中有例證)以去除可能阻礙防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的物質(zhì)。然后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可再次檢測所述濾液是否防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭。
術(shù)語“濾液”指本發(fā)明的微生物的無細(xì)胞溶液或懸浮液，其已由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)囊后w、培養(yǎng)基或緩沖液中的本發(fā)明的微生物培養(yǎng)物經(jīng)離心程序作為上清液而獲得。然而，所述術(shù)語不應(yīng)該以任何限制性方式來解釋。所述濾液包括例如大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、脂類等等，和/或小分子如氨基酸、糖、脂質(zhì)酸等等，或其級分。制備微生物濾液的方法為本領(lǐng)域所公知。另外，“過濾”涉及本領(lǐng)域公知的多種方法。提取方法并不重要，任何能完成過濾本發(fā)明的微生物細(xì)胞的方法都可以使用。
術(shù)語“本發(fā)明的微生物的滅活形式”包括本發(fā)明的微生物細(xì)胞的任何部分。優(yōu)選地，所述滅活形式是由膜制劑得到的膜級分。屬于乳酸細(xì)菌的微生物的膜制劑可通過本領(lǐng)域公知的方法得到，例如，通過使用Rollan等人在Int.J.Food Microbiol.70(2001)，303-307中，Matsuguchi等人在Clin.Diagn.Lab.Immunol.10(2003)，259-266中或Stentz等人在Appl.Environ.Microbiol.66(2000)，4272-4278中或Varmanen等人在J.Bacteriology 182(2000)，146-154中描述的方法?；蛘?，也可設(shè)想為全細(xì)胞制劑。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的微生物或上述微生物的突變體、衍生物或滅活形式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含的上述微生物的量為102至1012個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選103至108個(gè)細(xì)胞/mg固體形式的組合物。對于液體形式組合物的情況，該微生物的量為每毫升102至1013個(gè)細(xì)胞。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物為乳液形式，例如水包油或油包水乳液、軟膏或微膠囊形式。如果為乳液、軟膏或微膠囊，所述組合物包含的此處描述的微生物的量為每毫升102至1013個(gè)細(xì)胞。然而，如此處描述，對具體的組合物而言，所述微生物的量可以不同。
術(shù)語“組合物”也包括如下進(jìn)一步描述的織物組合物。
另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的組合物的方法，該方法包括步驟將根據(jù)本發(fā)明的微生物或上述微生物的突變體、衍生物或滅活形式與化妝品或藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑配制到一起。
根據(jù)本發(fā)明所用的術(shù)語“組合物”涉及一種或多種組合物，其包含至少一種本發(fā)明的微生物或如上述的所述微生物的突變體、衍生物或滅活形式。設(shè)想下文中描述的本發(fā)明的組合物包含前面提及成分的任一組合。任選地，它可以包含至少一種其他適合于防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的成分。因此，它可任選地包含下述其他成分的任一組合。術(shù)語“適合于防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的成分”包括化合物或組合物和/或其組合，其導(dǎo)致pH值改變，例如pH值升高或降低。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該術(shù)語包括化合物或組合物和/或其組合，其導(dǎo)致pH值升高。
所述組合物可以為固體、液體或氣體形式，而且尤其為粉劑、溶液劑、氣溶膠、混懸劑、乳劑、液體、酏劑、提取物、酊劑或液體提取物形式，或者為特別適合于局部給藥的形式。適合局部應(yīng)用的形式包括例如除臭劑、糊劑、軟膏、泵式噴霧劑、洗劑、凝膠劑、霜?jiǎng)?、例如作為氣霧劑噴霧分布在泵式分配器瓶子中的霜?jiǎng)┗蛄黧w凝膠，或作為滾涂劑(roll-on)分布在管中或格子中的稠霜?jiǎng)┬问?、棒狀形式或透皮粘劑形式?br> 優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物為化妝品組合物，其還包含化妝品可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的化妝品組合物包含本發(fā)明的微生物、與本發(fā)明的組合物相關(guān)的上述微生物的突變體、衍生物或滅活形式和其他化妝品可接受的載體。本發(fā)明的化妝品組合物優(yōu)選用于局部應(yīng)用。
此處所用的術(shù)語“化妝品可接受的載體”是指合適的媒介物，其可用于將本發(fā)明的組合物以安全有效的方式應(yīng)用到皮膚上。此類媒介物可包括材料如乳液，例如水包油型或油包水型乳液、軟膏或微膠囊。此處所用的術(shù)語“安全有效的方式”是指抑制異戊酸生物合成的足夠數(shù)量。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及藥物組合物，該藥物組合物包含本發(fā)明的微生物或上述微生物的衍生物或突變體或滅活形式，還包含藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。所述藥物組合物優(yōu)選為適合局部給藥的形式。
另外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的微生物或上述微生物的衍生物或突變體或滅活形式在制備防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的組合物，優(yōu)選藥物或化妝品組合物中的用途。
藥物組合物包含治療有效量的本發(fā)明的微生物或如上面描述的本發(fā)明的微生物的衍生物或突變體或滅活形式，該藥物組合物可配制成多種形式，例如固體、液體、粉末、水性、凍干形式。
如此處描述，所述藥物組合物可用藥學(xué)上可接受的載體向患者施用。在具體的實(shí)施方案中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指由管理機(jī)構(gòu)或其他公認(rèn)藥典認(rèn)可的用于動(dòng)物，具體而言用于人類。
術(shù)語“載體”涉及稀釋劑、輔劑、賦形劑、或媒介物，通過其施用治療劑。此類載體是藥學(xué)上可接受的，即在使用的劑量和濃度上對接受者無毒。其優(yōu)選為等滲的、低滲的或弱高滲的并含有相對低的離子強(qiáng)度，如由蔗糖溶液提供。此類藥物載體可為無菌液體，例如水和油，包含那些石油、動(dòng)物、植物或合成來源的油，例如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等等。鹽水溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液體載體。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂質(zhì)酸鈉、單硬脂酰甘油酯、滑石、鈉離子、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。若需要，所述組合物中也可包含少量濕潤劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可以以例如溶液劑、混懸劑、乳劑、粉劑、緩釋制劑等等形式存在。E.W.Martin在″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中描述了合適藥物載體的實(shí)例。可作為藥物載體的物質(zhì)的一些其他實(shí)例有糖，如葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；硬脂質(zhì)酸；硬脂質(zhì)酸鎂；硫酸鈣；碳酸鈣；植物油如花生油、棉子油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；瓊脂；藻酸；無致熱原水；等滲鹽水；酸果蔓提取物和磷酸鹽緩沖液；脫脂奶粉；以及藥物制劑中使用的其他無毒相容物質(zhì)，如維生素C、雌激素和紫錐花。也可存在濕潤劑和潤滑劑如十二烷基硫酸鈉，以及著色劑、調(diào)味劑、潤滑劑、賦形劑、壓片劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑和防腐劑?；钚猿煞忠园z形式施用也是有利的，例如作為纖維素包膠、用明膠、用聚酰胺、囊泡(niosomes)、蠟?zāi)?、環(huán)糊精，或脂質(zhì)體包膠。
通常，所述成分為單獨(dú)提供或以混合后單位劑量形式提供，例如以密封容器中凍干粉或無水濃縮如的形式，該密封容器如安瓿或小藥囊，指示活性劑的量。
本發(fā)明的藥物組合物可按中性形式或鹽形式配制。藥學(xué)上可接受的鹽類包括由陰離子形成的鹽類，如那些來自于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的鹽類，和由陽離子形成的鹽類，如那些來自于鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的鹽類。
體外測定，如實(shí)施例中描述的一種體外測定，可任選地用于幫助鑒定最佳劑量范圍。制劑中使用的準(zhǔn)確劑量也依賴于給藥途徑和疾病及病癥的嚴(yán)重程度，并應(yīng)該根據(jù)醫(yī)生的判斷及每位患者的情況來決定。優(yōu)選局部給藥途徑。有效劑量可由來自體外或(動(dòng)物)模型試驗(yàn)系統(tǒng)的劑量-反應(yīng)曲線外推得到。優(yōu)選地，該藥物組合物直接施用或與輔劑組合施用。輔劑可選自氯喹和質(zhì)子極性化合物，如丙二醇、聚乙二醇、甘油、乙醇、1-甲基L-2-吡咯烷酮或其衍生物，或選自無質(zhì)子極性化合物，如二甲亞砜(DMSO)、二乙亞砜、二正丙基亞砜、二甲砜、環(huán)丁砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四甲基脲、乙腈或其衍生物。在鑒于pH值限制的條件下加入這些化合物。可向脊椎動(dòng)物施用本發(fā)明的組合物。此處所用的“脊椎動(dòng)物”旨在具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同意思。尤其是，“脊椎動(dòng)物”包括哺乳動(dòng)物，并更具體而言包括人類。
術(shù)語“給藥”指施用治療有效劑量的前述組合物?！爸委熡行Я俊敝府a(chǎn)生效應(yīng)的施用劑量，這種效應(yīng)優(yōu)選為防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭。所述準(zhǔn)確劑量依賴于治療的目的，并將通過本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知的技術(shù)來確定。如本領(lǐng)域公知及如上所述，對系統(tǒng)與局部遞送、年齡、體重、一般健康、性別、飲食、給藥時(shí)間、藥物相互作用和疾病的嚴(yán)重程度進(jìn)行調(diào)整可能是必須的，并將由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過例行實(shí)驗(yàn)來確定。
所述方法適用于人類治療。此處描述的具有期望治療活性的化合物可用生理學(xué)可接受的載體向患者施用，如此處描述。根據(jù)給藥的方式，所述化合物可用下述多種方法來配制。制劑中藥學(xué)活性化合物的濃度可在約0.01wt％至100wt％之間變化。該活性劑可單獨(dú)施用或與其他治療組合施用。
所述藥物組合物的給藥可通過多種途徑進(jìn)行。優(yōu)選局部給藥途徑。
主治醫(yī)師和臨床因素將決定劑量方案。如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所熟知，任何一個(gè)患者需要的劑量依賴于許多因素，包括患者的大小、體表面積、年齡、施用的具體化合物、性別、給藥時(shí)間和途徑、一般健康和其他同時(shí)施用的藥物。典型劑量可為例如從0.001至1000μg；然而，特別是考慮到上面提到的因素時(shí)，低于或高于此典型范圍的劑量是可考慮的。
劑量的給予優(yōu)選為一周一次，更優(yōu)選為一周2次、3次、4次、5次或6次，最優(yōu)選為每日一次甚至更優(yōu)選為每日兩次或更多次。然而，治療過程中該劑量可在更長時(shí)間間隔上給予并在必要時(shí)可在更短的時(shí)間間隔上給予，例如每日若干次。在優(yōu)選情況中，通過此處描述的方法和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法來監(jiān)測免疫應(yīng)答并在例如時(shí)間、用量和/或組合物上優(yōu)化劑量。通過定期評估監(jiān)測進(jìn)程。也可設(shè)想在共治療方法中使用該藥物組合物，即與其他藥劑或藥物，例如防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的其他藥物共同給藥。
當(dāng)預(yù)期治療涉及局部給藥易接近的區(qū)域或器官時(shí)，本發(fā)明的化妝品或藥物組合物的局部給藥是有用的。為了局部應(yīng)用于皮膚，藥物組合物優(yōu)選配制為以下形式除臭劑或噴霧劑(泵式噴霧劑或氣溶膠)或糊劑、軟膏、洗劑、霜?jiǎng)?、凝膠劑或透皮貼劑。根據(jù)使用領(lǐng)域，化妝品或藥物制劑也可為以下形式泡沫劑、凝膠噴霧劑、摩絲、混懸劑或粉劑。
化妝品或藥物組合物也可以噴霧劑(泵式噴霧劑或氣溶膠)的形式配制。適合于本發(fā)明的氣溶膠的推進(jìn)劑為慣用推進(jìn)劑，例如丙烷、丁烷、戊烷和其他。
或者所述化妝品或藥物組合物也可用合適的糊劑來配制，該糊劑包含懸浮于載體中的活性成分。此類載體包括但不局限于石油、軟白石蠟、黃色礦脂和甘油。
所述化妝品或藥物組合物也可用合適的軟膏來配制，該軟膏包含懸浮或溶解于載體中的活性組分。此種載體包括但不局限于一種或更多種甘油、礦物油、液體油、液體石油、白石油、黃色礦脂、丙二醇、醇、甘油三酯、脂肪酸酯如鯨蠟酯、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、蠟如白蠟和黃色蜂蠟、脂肪酸醇如鯨蠟醇、十八烷醇和十六/十八烷基醇、脂肪酸如硬脂酸、硬脂酸鯨蠟酯、羊毛脂、氫氧化鎂、高嶺土和水。
或者，所述化妝品或藥物組合物也可用合適的洗劑或霜?jiǎng)﹣砼渲?，該洗劑或霜?jiǎng)┌瑧腋』蛉芙庥谳d體中的活性組分。此類載體包括但不局限于一種或更多種礦物油如石蠟、植物油如蓖麻油、蓖麻子油和氫化蓖麻油、失水山梨糖醇一硬脂酸酯、聚山梨酯、脂肪酸酯如鯨蠟酯、蠟、脂肪酸醇如鯨蠟醇、十八烷醇、2-辛基十二醇、苯甲醇、醇、甘油三酯和水。
或者，所述化妝品或藥物組合物也可用合適的凝膠來配制，該凝膠包含懸浮或溶解于載體中的活性組分。此類載體包括但不局限于一種或多種水、甘油、丙二醇、液體石蠟、聚乙烯、脂肪油、纖維素衍生物、膨潤土和膠態(tài)二氧化硅。
根據(jù)本發(fā)明的制劑通?？砂渌鷦?，如習(xí)慣用于此種制劑的助劑，例如防腐劑、香料、消泡劑、染料、色素、增稠劑、表面活性物質(zhì)、乳化劑、軟化劑、修飾劑、脂肪、油、蠟，或其他化妝品或皮膚病學(xué)制劑的慣用成分，如醇、多元醇、聚合物、泡沫穩(wěn)定劑、增溶劑、電解質(zhì)、有機(jī)酸、有機(jī)溶劑或硅氧烷衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的化妝品或藥物組合物可包含軟化劑。軟化劑以有效預(yù)防或緩解干燥的量來使用。有益的軟化劑包括但不局限于烴油和蠟；硅油；甘油三酯類；乙酰甘油酯類；乙氧基化甘油酯；烷基酯類；烯基酯類；脂肪酸；脂肪醇；脂肪醇醚；醚酯；羊毛脂和衍生物；多元醇(多元醇)和聚醚衍生物；多元醇(多元醇)酯類；蠟酯；蜂蠟衍生物；植物蠟；磷脂；固醇和酰胺。
因此，例如，典型的軟化劑包括礦物油，尤其是具有50至500SUS范圍粘度的礦物油、羊毛脂油、貂油、椰子油、可可油、橄欖油、杏仁油、澳洲堅(jiān)果油、蘆薈提取物、加州希蒙得木油、紅花油、玉米油、液體羊毛脂、棉子油、花生油、purcellin油、全氫化角鯊烯(角鯊烯)、蓖麻油、聚丁烯、無臭礦物精、甜杏仁油、鱷梨油、胡桐油、蓖麻油、乙酸維生素E、橄欖油、礦物精、十六/十八烷基醇(主要由鯨蠟醇和十八烷醇組成的脂肪醇的混合物)、亞麻醇、油醇、辛基十二醇、谷物胚油如小麥胚辛酸十六/十八烷基醇酯(十六/十八烷基醇和2-乙基己酸形成的酯)、棕櫚酸十六酯、己二酸二異丙酯、棕櫚酸異丙酯、棕櫚酸辛酯、肉豆蔻酸異丙酯、肉豆蔻酸丁酯、硬脂酸甘油酯、硬脂酸十六烷基酯、硬脂酸異十六烷基酯、硬脂酸辛酯、羥基硬脂酸辛酯、硬脂酸丙二醇酯、硬脂酸丁酯、油酸癸酯、油酸甘油酯、乙酰甘油酯、(C12-C15)醇的辛酸酯和苯甲酸酯、醇和多元醇如乙二醇和甘油的辛酸酯和癸酸酯、醇和多元醇的蓖麻醇酸酯，如己二酸異丙酯、月桂酸己酯、十二酸辛酯、聚二甲基硅氧烷共聚醇、聚二甲基硅氧烷醇、羊毛脂、羊毛脂醇、羊毛脂蠟、氫化羊毛脂、羥基化羊毛脂、乙?；蛎?、礦脂、羊毛脂酸異丙酯、肉豆蔻酸十六烷基酯、肉豆蔻酸甘油酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、乳酸肉豆蔻酯、鯨蠟醇、異十八烷醇、十八烷醇和羊毛脂酸異十六烷酯等等的蓖麻醇酸酯。
此外，根據(jù)本發(fā)明的化妝品或藥物組合物也包含乳化劑。乳化劑(即乳化劑)優(yōu)選以有效提供組合物成分的均勻混合的量來使用。有用的乳化劑包括(i)陰離子乳化劑，如脂肪酸皂，例如硬脂酸鉀、硬脂酸鈉、硬脂酸銨和硬脂酸三乙醇胺；含有脂肪酸皂的多元醇脂肪酸單酯，例如含有鉀鹽或鈉鹽的單硬脂酸甘油酯；硫酸酯(鈉鹽)，例如十二烷基5硫酸鈉和十六烷基硫酸鈉；和含有硫酸酯的多元醇脂肪酸單酯，例如含有十二烷基硫酸鈉的單硬脂酸甘油酯；(ii)陽離子氯化物乳化劑如N(硬脂酰膽胺甲酰甲基)吡啶；N-豆-N-乙基乙硫酸嗎啉鎓；烷基二甲基芐基氯化銨；二異丙基苯氧基乙氧基乙基二甲氧基芐基氯化銨和十六烷基氯化吡啶；和(iii)非離子乳化劑如聚氧乙烯脂肪醇醚，例如單硬脂酸酯；聚氧乙烯十二烷醇；聚氧丙烯脂肪醇醚，例如丙氧基油醇；聚氧乙烯脂肪酸酯，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，例如，聚氧乙烯失水山梨糖醇單硬脂酸酯；失水山梨糖醇脂肪酸酯，例如失水山梨糖醇；聚氧乙二醇脂肪酸酯，例如聚氧乙二醇單硬脂酸酯；和多元醇脂肪酸酯，例如單硬脂酸甘油酯和單硬脂酸丙二醇酯；和乙氧基化羊毛脂衍生物，例如乙氧基化羊毛脂、乙氧基化羊毛脂醇和乙氧基化膽固醇。乳化劑的選擇如Schrader，Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika，Hüthig Buch Verlag，Heidelberg，第二版，1989，第三部分中示例性描述。
根據(jù)本發(fā)明的化妝品或藥物組合物也可包括表面活性劑。合適的表面活性劑可包括例如那些通常歸為清潔劑、乳化劑、泡沫促進(jìn)劑、水溶助長劑、增溶劑、懸浮劑和非表面活性劑(促進(jìn)液體中固體的分散)的表面活性劑。
所述表面活性劑通常分為兩性表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑。兩性表面活性劑包括?；被岷脱苌锖蚇-烷基氨基酸。陰離子表面活性劑包括?；被岷望}，如酰基谷氨酸鹽、酰基肽、酰肌氨酸鹽和?；；撬猁}；羧酸和鹽，如鏈烷酸、酯羧酸和醚羧酸；磺酸和鹽，如?；u乙磺酸鹽、烷基芳基磺酸鹽、烷基磺酸鹽和磺基丁二酸鹽；硫酸酯，如烷基醚硫酸酯和烷基硫酸酯。陽離子表面活性劑包括烷基胺，烷基咪唑啉、乙氧化胺和季胺類(如烷基苯甲基二甲基銨鹽、烷基甜菜堿、雜環(huán)銨鹽和四烷基銨鹽)。非離子表面活性劑包括醇類，如含有8至18個(gè)碳原子的伯醇；鏈烷醇酰胺類如鏈烷醇胺衍生酰胺類和乙氧基化酰胺類；氧化胺；酯類，如乙氧基化羧酸、乙氧基化甘油酯、乙二醇酯和衍生物、單酸甘油酯、聚甘油酯、多元醇酯和醚、失水山梨糖醇/山梨糖醇酯和磷酸三酯；醚類如乙氧基化醇、乙氧基化羊毛脂、乙氧基化聚硅氧烷和丙氧基化聚氧乙烯醚。
此外，根據(jù)本發(fā)明的化妝品或藥物組合物也可包含成膜劑。根據(jù)本發(fā)明使用的合適的成膜劑保持組合物光滑平坦，且包括但不局限于丙烯酰胺/丙烯酸鈉共聚物；丙烯酸銨共聚物；秘魯香脂；羧甲基纖維素鈉；乙烯/馬來酐共聚物；羥乙基纖維素；羥丙基纖維素；聚丙烯酰胺；聚乙烯；聚乙烯醇；pvm/MA共聚物(聚乙烯基·甲基醚/馬來酐)；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)；馬來酐共聚物，如可從Gulf Science and Technology得到的PA-18；PVP/十六碳烯共聚物，如從GAF公司獲得的Ganex V-216；丙烯酸丙烯酸(acryliclacrylate)共聚物等等。
通常，成膜劑以總組合物重量的約0.1％至約10％的量來使用，優(yōu)選約1％至約8％，最優(yōu)選約0.1DEG/O至約5％。也可以使用有效量的濕潤劑，包括果糖；葡萄糖；谷氨酸；甘油；蜂蜜；麥芽糖醇；甲基葡糖聚醚-10；甲基葡糖聚醚-20；丙二醇；乳酸鈉；蔗糖等等。
當(dāng)然，本發(fā)明的化妝品或藥物組合物也可包含防腐劑。根據(jù)本發(fā)明特定組合物的防腐劑包括但不局限于對羥基苯甲酸丁酯；對羥基苯甲酸乙酯；咪唑烷基脲；對羥基苯甲酸甲酯；鄰苯基苯酚；對羥基苯甲酸丙酯；十二烷基乙基芐基二甲基氯化銨；氯代烯丙基氯化六亞甲基四胺鎓；去氫醋酸鈉；2-巰基吡啶氧化鋅等等。
所述防腐劑以有效預(yù)防或延緩微生物生長的量來使用。通常，使用的防腐劑的量以總組合物的重量計(jì)為約0.1％至約1％，優(yōu)選約0.1％至約0.8％，最優(yōu)選約0.1％至約0.5％。
根據(jù)本發(fā)明的化妝品或藥物組合物也可包含香料。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的香料(芳香組分)和色料(著色劑)以能對本發(fā)明的組合物賦予預(yù)期香味和顏色的量來使用。
而且，本發(fā)明的化妝品或藥物組合物也可包含蠟。本發(fā)明中有用的合適的蠟包括動(dòng)物蠟，如蜂蠟、鯨蠟或羊毛蠟(羊毛脂)；植物蠟，如巴西棕櫚蠟或小燭樹蠟；石蠟，如褐煤蠟或地蠟；還有石油蠟，如石蠟和微晶蠟(高分子量石油蠟)。動(dòng)物、植物和一石地蠟主要是由高分子量脂肪醇和高分子量脂肪酸形成的酯。例如，三十烷醇十六酸酯通常報(bào)道為蜂蠟的主要成分。本發(fā)明的其他合適的蠟包括合成蠟，該蠟包括聚乙烯聚氧乙烯及由一氧化碳和氫衍生而來的烴蠟。
具有代表性的蠟也包括石蠟；十六酯；氫化加州希蒙得木油；氫化加州希蒙得木蠟；氫化米糠蠟；日本蠟；加州希蒙得木脂；加州希蒙得木油；加州希蒙得木蠟；munk蠟；褐煤酸蠟；小冠椰子蠟；米糠蠟；蟲膠蠟；硫化加州希蒙得木油；合成蜂蠟；合成加州希蒙得木油；三羥基硬脂精；鯨蠟醇；十八烷醇；可可脂；羊毛脂脂肪酸；在25℃下為固體的甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯，例如三二十二烷酸甘油酯(二十二烷酸和甘油形成的三酯)和從Croda，Inc.，New York，N.Y.得到的商標(biāo)名分別為Syncrowax HRC和Syncrowax HGL-C的C1g-C36酸甘油三酯(C1g-C36羧酸和甘油的三酯混合物)；在25℃下為固體的脂肪酯；硅氧烷蠟，如甲基十八烷氧基聚硅氧烷和聚(二甲基甲硅烷氧基)硬脂氧基硅氧烷；十八烷酰單和二乙醇酰胺；松脂和其衍生物如乙二醇和甘油的松香酸酯；25℃下為固體的氫化油；和甘油蔗糖酯。可以在水系統(tǒng)中以有效的量使用的增稠劑(粘度控制劑)包括藻膠；卡波姆如卡波姆934、934P、940和941；羧甲基纖維素鈉、十六/十八烷基醇；椰油酰基乙醇胺；糊精；明膠；羥乙基纖維素；羥丙乙基纖維素；羥丙基甲基纖維素；硅酸鎂鋁；肉豆蔻醇；燕麥粉；油酰基乙醇胺；油醇；PEG-7M；PEG-14M；PEG-9OM；硬脂酰胺DEA；硬脂酰胺MEA；十八烷醇；黃蓍膠；小麥淀粉；黃原膠及上面列表中的其他增稠劑，DEA為二乙醇胺，MEA為單乙醇胺?？梢栽诜撬到y(tǒng)中以有效的量使用的增稠劑(粘度控制劑)包括硬脂酸鋁；蜂蠟；小燭樹蠟；巴西棕櫚蠟；石蠟；十六/十八烷基醇；鯨蠟醇；膽固醇；水合二氧化硅；氫化蓖麻油；氫化棉子油；氫化大豆油；氫化牛油甘油酯；氫化植物油；羥丙基纖維素；羊毛酯醇；肉豆蔻醇；硬脂酰硫酸辛基十二醇酯；油醇；地蠟；微晶蠟；石蠟；四辛酸季戊四醇酯；聚丙烯酰胺；聚丁烯；聚乙烯；二辛酸丙二醇酯；二壬酸丙二醇酯；stearalkonium hectorite；十八烷醇；硬脂酰硬脂酸酯；合成蜂蠟；三羥基硬脂精；三亞油精；三硬脂精及硬脂酸鋅等等。
制劑中慣用的天然增稠劑和合成增稠劑或凝膠成形劑為交聯(lián)聚丙烯酸和其衍生物、多糖如黃原膠或藻酸鹽、羧甲基纖維素或羥基羧甲基纖維素、水膠體如阿拉伯膠或蒙脫石礦石，如膨潤土或脂肪醇、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。
其他成分可以以有效于其預(yù)期用途的量加入或用于根據(jù)本發(fā)明的化妝品或藥物組合物中，所述成分包括用來提高性能或消費(fèi)者吸引力的生物添加劑如氨基酸、蛋白質(zhì)、香草、蘆薈提取物、生物類黃酮等等；緩沖劑；乳化穩(wěn)定劑；pH調(diào)節(jié)劑；遮光劑；推進(jìn)劑如丁烷、二氧化碳、乙烷、氫氯氟碳化合物22和142b、氫氟碳化合物152a、異丁烷、異戊烷、氮?dú)狻⒁谎趸?、戊烷、丙烷等等?br> 而且，本發(fā)明的制劑也可包含化合物，該化合物具有抗氧化、清除自由基、皮膚增濕或保持潮濕、抗紅斑、抗炎或抗過敏的作用，以補(bǔ)充或增強(qiáng)它們的作用。具體來說，這些化合物可選自維生素、植物提取物、α-和β-羥基酸、神經(jīng)酰胺、抗炎、抗微生物或紫外線過濾物質(zhì)及其衍生物和其混合物。有利地，本發(fā)明的制劑也可包含能吸收紫外線B和/或紫外線A區(qū)域間紫外線輻射的物質(zhì)。所述脂相可有利地選自礦物油、石蠟、分支和/或不分支的烴和烴蠟、飽和和/或不飽和的、分支和/或不分支的C8-C24-鏈烷羧酸的甘油三酯；它們可選自合成、半合成或天然油，如橄欖油、棕櫚油、杏仁油或混合物；油、脂肪或蠟、飽和和/或不飽和、分支和/或不分支的C3-C30-鏈烷羧酸和飽和和/或不飽和、分支和/或不分支的C3-C30-醇的酯，來自芳香族羧酸和飽和和/或不飽和、分支和/或不分支的C3-C30-醇的酯，例如肉豆蔻酸異丙酯、硬脂酸異丙酯、硬脂酸己基癸酯、油酸油酯；以及此類酯的合成、半合成和天然混合物，如加州希蒙得木油、苯甲酸烷基酯或硅油如環(huán)甲基硅酮、二甲基聚硅氧烷、二乙基聚硅氧烷、八甲基環(huán)四硅氧烷和其混合物或二烷基醚。
根據(jù)本發(fā)明的活性成分例如可用于清潔皮膚的化妝品組合物以清潔皮膚，如條皂、香皂、家用皂粒皂、透明皂、奢侈品香皂、脫臭皂、乳油皂、小兒皂、皮膚防護(hù)皂、擦洗皂、合成洗滌劑、液體皂、糊狀皂、軟肥皂、洗滌膏、液體洗滌劑、淋浴和沐浴制劑，例如洗劑、淋浴制劑、淋浴凝膠、泡沫浴制劑、乳油泡沫浴制劑、油浴制劑、浴用提取物、擦洗洗滌制劑、原位產(chǎn)品、剃須泡沫劑、剃須洗劑、剃須膏。此外，它們適合于皮膚化妝品制劑，如油包水型或水包油型膚體霜、日用霜和夜用霜、防曬組合物、曬后產(chǎn)品、復(fù)合型乳液、gelees、微乳劑、脂質(zhì)體制劑、囊泡制劑、脂凝膠、體育用凝膠、增濕霜、漂白霜、維他命維生素霜、皮膚洗劑、護(hù)理洗劑、安瓿劑、剃須前用霜?jiǎng)?、濕潤劑洗劑、cellulite creams霜?jiǎng)?、脫色素組合物、按摩制劑、底粉、除臭劑、止汗劑、防護(hù)劑拒斥劑及其他。術(shù)語“活性成分”涉及例如上述的本發(fā)明的微生物、其突變體、衍生物、滅活形式、裂解物、級分或其提取物。優(yōu)選地，在下文組合物中使用的術(shù)語“活性成分”是例如上述微生物、其突變體、衍生物、滅活形式、裂解物、級分或其提取物的取代替代。除非另有說明，在下述組合物中使用的術(shù)語“活性成分”指例如上述的本發(fā)明的微生物、其突變體、衍生物、滅活形式、裂解物、級分或提取物在所述組合物中的百分率。優(yōu)選地，術(shù)語“活性成分”指濃度為例如每毫升102-1013個(gè)細(xì)胞的上文中定義的根據(jù)本發(fā)明的微生物，例如乳桿菌(Lactobacillus spec.)或明串珠菌(Leuconostoc spec.)。更優(yōu)選地，術(shù)語“活性成分”指溶液，例如水溶液或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他任何合適的溶液，其包含高達(dá)0.001％至高達(dá)99.999％的本發(fā)明的微生物，例如上文中定義的乳桿菌或明串珠菌，其濃度為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的濃度，例如每毫升102-1013個(gè)細(xì)胞。甚至更優(yōu)選地，所述術(shù)語指溶液，該溶液包含高達(dá)0.001％、0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％、99.99％或99.999％，最優(yōu)選包含高達(dá)0.001至高達(dá)5％的本發(fā)明的微生物，例如上文中定義的乳桿菌或明串珠菌，其濃度為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的濃度，例如每毫升102-1013個(gè)細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物含有日間護(hù)理水包油型制劑，其可包含例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％)活性成分1％ A 1.7 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 0.7 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 2.0 二乙基氨基羥基苯甲酰己基苯甲酸酯 2.0 PEG-14 二甲基硅氧烷 3.6 十六/十八醇 6.0 甲氧基肉桂酸乙基己酯 2.0 己二酸二丁酯 B 5.0 甘油 0.2 EDTA 二鈉 1.0 泛醇 適量 防腐劑 68.4 aqua dem. C 4.0 辛酸/癸酸甘油三酯，丙烯酸鈉共聚物 D 0.2 抗壞血酸磷酸鈉 1.0 生育酚乙酸酯 0.2 紅沒藥醇 1.0 辛酸/癸酸甘油三酯，抗壞血酸鈉，生育酚，視黃醇 1.0 活性成分 E 適量 氫氧化鈉 活性成分5％ A 1.7 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 0.7 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 2.0 二乙氨基羥基苯甲酰己基苯甲酸酯 2.0 PEG-14 二甲基硅氧烷 3.6 十六/十八醇 6.0 甲氧基肉桂酸乙基己酯 2.0 己二酸二丁酯 B 5.0 甘油 0.2 EDTA 二鈉 1.0 泛醇 適量 防腐劑 64.4 aqua dem. C 4.0 辛酸/癸酸甘油三酯，丙烯酸鈉共聚物 D 0.2 抗壞血酸磷酸鈉 1.0 生育酚乙酸酯 0.2 紅沒藥醇 1.0 辛酸/癸酸甘油三酯，抗壞血酸鈉，生育酚，視黃醇 5.0 活性成分 E 適量 氫氧化鈉 分別加熱A相和B相至約80℃。隨后將B相攪拌到A相中并對其進(jìn)行均化。將C相攪拌到A相和B相的組合中并對其進(jìn)行均化。在攪拌下將所述混合物冷卻至約40℃；然后加入D相并用E相將其pH值調(diào)整至約6.5。隨后對所述溶液進(jìn)行均化并冷卻至室溫。
在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含防護(hù)日霜水包油型制劑(protecting day cream O/W formulation)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 1.7 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 0.7 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 2.0 二乙氨基羥基苯甲酰己基苯甲酸酯 2.0 PEG-14 二甲基硅氧烷 3.6 十六/十八醇 6.0 甲氧基肉桂酸乙基己酯 2.0 己二酸二丁酯 B 5.0 甘油 0.2 EDTA 二鈉 1.0 泛醇 適量 防腐劑 68.6 aqua dem. C 4.0 辛酸/癸酸甘油三酯，丙烯酸鈉共聚物 D 1.0 抗壞血酸磷酸鈉 1.0 生育酚乙酸酯 0.2 紅沒藥醇 1.0 活性成分 E 適量 氫氧化鈉 活性成分5％ A 1.7 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 0.7 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 2.0 二乙氨基羥基苯甲酰己基苯甲酸酯 2.0 PEG-14 二甲基硅氧烷 3.6 十六/十八醇 6.0 甲氧基肉桂酸乙基己酯 2.0 己二酸二丁酯 B 5.0 甘油 0.2 EDTA 二鈉 1.0 泛醇 適量 防腐劑 64.6 aqua dem. C 4.0 辛酸/癸酸甘油三酯，丙烯酸鈉共聚物 D 1.0 抗壞血酸磷酸鈉 1.0 生育酚乙酸酯 0.2 紅沒藥醇 5.0 活性成分 E 適量 氫氧化鈉 分別加熱A相和B相至約80℃。隨后將B相攪拌到A相中并對其進(jìn)行均化。將C相放進(jìn)A相和B相的組合中并對其進(jìn)行均化。在攪拌下將所述混合物冷卻至約40℃；然后加入D相并用E相將其pH值調(diào)整至約6.5。隨后對所述溶液進(jìn)行均化并冷卻至室溫。
在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含水包油型皮膚清潔制劑(skin cleanser O/W formulation)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 10.0 乙基己酸十六/十八酯 10.0 三(辛酸/癸酸)甘油酯 1.5 環(huán)五硅氧烷，環(huán)六硅氧烷 2.0 PEG-40 氫化蓖麻油 B 3.5 三(辛酸/癸酸)甘油酯，丙烯酸鈉共聚物 C 1.0 生育酚乙酸酯 0.2 紅沒藥醇 適量 防腐劑 適量 芳香油 D 3.0 聚季銨鹽-44 0.5 椰油基三甲基甲硫酸銨(cocotrimonium methosulfate) 0.5 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 2.0 泛醇，丙二醇 4.0 丙二醇 0.1 EDTA 二鈉 1.0 活性成分 60.7 aqua dem. 活性成分5％ A 10.0 乙基己酸十六/十八酯 10.0 三(辛酸/癸酸)甘油酯 1.5 環(huán)五硅氧烷，環(huán)六硅氧烷 2.0 PEG-40 氫化蓖麻油 B 3.5 三(辛酸/癸酸)甘油酯，丙烯酸鈉共聚物 C 1.0 生育酚乙酸酯 0.2 紅沒藥醇 適量 防腐劑 適量 芳香油 D 3.0 聚季銨鹽-44 0.5 椰油基三甲基甲硫酸銨(cocotrimonium methosulfate) 0.5 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 2.0 泛醇，丙二醇 4.0 丙二醇 0.1 EDTA 二鈉 5.0 活性成分 56.7 aqua dem. 首先，將A相溶解并隨后將B相攪拌進(jìn)A相中。隨后，將C相放進(jìn)A相和B相的組合中。下一步，將D相溶解并攪拌進(jìn)組合的A相、B相和C相中。對所述混合物進(jìn)行均化并攪拌15分鐘。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含日間護(hù)理身體噴霧制劑(daily care body spray formulation)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 3.0 甲氧基肉桂酸乙基己酯 2.0 二乙氨基羥基苯甲酰己基苯甲酸酯 1.0 聚季銨鹽-44 3.0 丙二醇 2.0 泛醇，丙二醇 1.0 環(huán)五硅氧烷，環(huán)六硅氧烷 10.0 辛基十二烷醇 0.5 PVP 10.0 三(辛酸/癸酸)甘油酯 3.0 苯甲酸C12-15烷基酯 3.0 甘油 1.0 生育酚乙酸酯 0.3 紅沒藥醇 1.0 活性成分 59.2 乙醇 活性成分5％ A 3.0 甲氧基肉桂酸乙基己酯 2.0 二乙氨基羥基苯甲酰己基苯甲酸酯 1.0 聚季銨鹽-44 3.0 丙二醇 2.0 泛醇，丙二醇 1.0 環(huán)五硅氧烷，環(huán)己硅氧烷 10.0 辛基十二烷醇 0.5 PVP 10.0 三(辛酸/癸酸)甘油酯 3.0 苯甲酸C12-15烷基酯 3.0 甘油 1.0 生育酚乙酸酯 0.3 紅沒藥醇 5.0 活性成分 55.2 乙醇 稱量A相的組分并將其溶解直至溶液變澄清。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含潤膚凝膠(skin gel)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ 3.6 PEG-40 氫化蓖麻油 15.0 乙醇 0.1 紅沒藥醇 0.5 生育酚乙酸酯 適量 芳香油 B 3.0 泛醇 0.6 卡波姆 1.0 活性成分 75.4 aqua dem. C 0.8 三乙醇胺 活性成分5％ 3.6 PEG-40 氫化蓖麻油 15.0 乙醇 0.1 紅沒藥醇 0.5 生育酚乙酸酯 適量 芳香油 B 3.0 泛醇 0.6 卡波姆 5.0 活性成分 71.4 aqua dem. C 0.8 三乙醇胺 首先，將A相溶解直至溶液變澄清。浸軟B相并隨后用C相將其中和。下一步，將A相攪拌到均化后的B相中并對所述混合物進(jìn)行均化。
在更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含剃須后洗劑(aftershave lotion)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 10.0 乙基己酸十六/十八酯 5.0 生育酚乙酸酯 1.0 紅沒藥醇 0.1 芳香油 0.3 丙烯酸酯/丙烯酸c10-30烷基酯交聚物 B 15.0 乙醇 1.0 泛醇 3.0 甘油 1.0 活性成分 0.1 三乙醇胺 63.5 aqua dem. 活性成分5％ A 10.0 乙基己酸十六/十八酯 5.0 生育酚乙酸酯 1.0 紅沒藥醇 0.1 芳香油 0.3 丙烯酸酯/丙烯酸c10-30烷基酯交聚物 B 15.0 乙醇 1.0 泛醇 3.0 甘油 5.0 活性成分 0.1 三乙醇胺 59.5 aqua dem. 混合A相的組分。下一步，溶解B相并將其引入A相中，隨后對其進(jìn)行均化。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含保濕滾球劑(roll-on)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 0.40 羥乙基纖維素 50.0 aqua dem. B 25.0 乙醇 0.1 紅沒藥醇 0.3 法呢醇 2.0 PEG-40 氫化蓖麻油 適量 芳香油 C 3.0 雙丙二醇 3.0 PEG-14 demethicone 3.0 聚季銨鹽-16 8.2 aqua dem. D 1.0 活性成分 活性成分5％ A 0.40 羥乙基纖維素 46.0 aqua dem. B 25.0 乙醇 0.1 紅沒藥醇 0.3 法呢醇 2.0 PEG-40 氫化蓖麻油 適量 芳香油 C 3.0 雙丙二醇 3.0 PEG-14 demethicone 3.0 聚季銨鹽-16 8.2 aqua dem. D 5.0 活性成分 溶脹A相，獨(dú)立地溶解B相和C相。隨后，將B相和A相攪拌進(jìn)C相。最后，加入D相。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含透明香體膏(transparent deo stick)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 3.0 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 3.0 PEG-40 氫化蓖麻油 0.2 外消旋紅沒藥醇 1.0 生育酚乙酸酯 3.0 芳香油 5.0 硬脂酸鈉 15.0 甘油87％ 60.0 丙二醇 9.3 aqua dem. B 1.0 活性成分 活性成分5％ A 3.0 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 3.0 PEG-40 氫化蓖麻油 0.2 外消旋紅沒藥醇 1.0 生育酚乙酸酯 3.0 芳香油 5.0 硬脂酸鈉 15.0 甘油87％ 60.0 丙二醇 5.3 aqua dem. B 5.0 活性成分 稱量A相的組分并將其熔解。隨后，加入B相。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含保濕噴霧劑(antitranspiration spray)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 3.0 PEG-40 氫化蓖麻油 0.2 植烷三醇(phytantriol) 0.5 芳香油 40.0 乙醇 B 53.49 aqua dem. 2.0 丙二醇 0.5 泛醇 0.01 BHT C 1.0 活性成分 活性成分5％ A 3.0 PEG-40 氫化蓖麻油 0.2 植烷三醇 0.5 芳香油 40.0 乙醇 B 49.49 aqua dem. 2.0 丙二醇 0.5 泛醇 0.01 BHT C 5.0 活性成分 溶解A相。下一步接著加入B相的組分。最后，加入C相。
在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含除臭膏(deo-stick)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％)活性成分1％ A 26.0 十八烷醇 60.0 環(huán)五硅氧烷，環(huán)六硅氧烷 5.0 PEG-40 氫化蓖麻油 2.5 棕櫚酸異丙酯 B 1.44 芳香油 0.05 BHT C 1.0 活性成分 活性成分5％ A 26.0 十八烷醇 56.0 環(huán)五硅氧烷，環(huán)六硅氧烷 5.0 PEG-40 氫化蓖麻油 2.5 棕櫚酸異丙酯 B 1.44 芳香油 0.05 BHT C 5.0 活性成分 稱量A相的組分并將其熔化。隨后在攪拌下將A相冷卻至約50℃。對B相和C相的組分進(jìn)行均化并接著將其連續(xù)加入。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含透明除臭滾球劑(deo-roll on)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 0.40 羥乙基纖維素 50.0 aqua dem. B 2.0 PEG-40 氫化蓖麻油 0.1 紅沒藥醇 0.3 法呢醇 0.5 芳香油 7.6 aqua dem. 25.0 乙醇 C 3.0 丙二醇 3.0 PEG-14 demethicone 3.0 聚季銨鹽-16 0.1 尿囊素 D 1.0 活性成分 活性成分5％ A 0.40 羥乙基纖維素 46.0 aqua dem. B 2.0 PEG-40 氫化蓖麻油 0.1 紅沒藥醇 0.3 法呢醇 0.5 芳香油 7.6 aqua dem. 25.0 乙醇 C 3.0 丙二醇 3.0 PEG-14 demethicone 3.0 聚季銨鹽-16 0.1 尿囊素 D 5.0 活性成分 溶脹A相，溶解B相。隨后，加入C相并攪拌。最后，將B相、C相和D相攪拌進(jìn)A相中。
在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含乳液，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 1.5 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 5.0 PEG-40 氫化蓖麻油 1.5 硬脂酸甘油酯 1.0 十六/十八醇 0.5 Eucerinum anhydricum 0.2 植烷三醇 1.0 棕櫚酸十六醇 5.0 二辛醚 0.3 法呢醇 B 適量 防腐劑 72.0 aqua dem. C 適量 芳香油 D 1.0 活性成分 活性成分5％ A 1.5 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 5.0 PEG-40 氫化蓖麻油 1.5 硬脂酸甘油酯 1.0 十六/十八醇 0.5 Eucerinum anhydricum 0.2 植烷三醇 1.0 棕櫚酸十六醇 5.0 二辛醚 0.3 法呢醇 B 適量 防腐劑 68.0 aqua dem. C 適量 芳香油 D 5.0 活性成分 分別加熱A相和B相至約80℃。將B相攪拌進(jìn)A相中并均化3分鐘。隨后，冷卻所述混合物至40℃，再加入C相和D相。最后，攪拌所述混合物并將其冷卻至室溫。
在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含除臭泵(deo-pump)噴霧劑，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 5.0 PEG-40 氫化蓖麻油 0.3 PEG-7 氫化蓖麻油 1.0 硬脂酸甘油酯 1.0 十六/十八醇 5.0 環(huán)五硅氧烷 0.5 Eucerinum anhydricum 0.2 植烷三醇 5.0 二辛醚 0.3 法呢醇 B 適量 防腐劑 76.7 aqua dem. C 適量 芳香油 D 1.0 活性成分 活性成分5％ A 5.0 PEG-40 氫化蓖麻油 0.3 PEG-7 氫化蓖麻油 1.0 硬脂酸甘油酯 1.0 十六/十八醇 6.0 環(huán)五硅氧烷 0.5 Eucerinum anhydricum 0.2 植烷三醇 5.0 二辛醚 0.3 法呢醇 B 適量 防腐劑 72.7 aqua dem. C 適量 芳香油 D 5.0 活性成分 分別加熱A相和B相至約80℃。將B相均化并攪拌進(jìn)A相和C相中。隨后，冷卻所述混合物至40℃并加入D相。最后，攪拌所述混合物并將其冷卻至室溫。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含除臭洗劑(deo-lotion)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 1.5 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 1.5 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 2.0 PEG-40 氫化蓖麻油 2.0 硬脂酸甘油酯 2.0 十六/十八醇 2.0 鯨蠟醇 2.0 氫化椰油單、雙、三甘油酯 8.0 油酸癸酯 0.5 PEG-14 demehicone 0.3 法呢醇 B 適量 防腐劑 75.2 aqua dem. C 適量 芳香油 D 1.0 活性成分 活性成分5％ A 1.5 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 1.5 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 2.0 PEG-40 氫化蓖麻油 2.0 硬脂酸甘油酯 2.0 十六/十八醇 2.0 鯨蠟醇 2.0 氫化椰油單、雙、三甘油酯 8.0 油酸癸酯 0.5 PEG-14 demehicone 0.3 法呢醇 B 適量 防腐劑 71.2 aqua dem. C 適量 芳香油 D 5.0 活性成分 分別加熱A相和B相至約80℃。將B相均化并攪拌進(jìn)A相中。隨后，冷卻所述混合物至40℃并加入C相和D相。最后，攪拌所述混合物并將其冷卻至室溫。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含水包油型除臭洗劑，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 4.0 乙基己酸十六/十八酯 2.0 十六/十八醇 2.0 氫化椰油單、雙、三甘油酯 1.0 硬脂酸甘油酯 1.0 礦物油 0.5 聚二甲基硅氧烷 0.2 紅沒藥醇 B 2.0 泛醇，丙二醇 2.0 丙二醇 適量 防腐劑 78.9 aqua dem. C 1.2 三(辛酸/癸酸)甘油酯，丙烯酸鈉共聚物 D 0.2 生育酚 適量 芳香油 E 1.0 活性成分 活性成分5％ A 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 4.0 乙基己酸十六/十八酯 2.0 十六/十八醇 2.0 氫化椰油單、雙、三甘油酯 1.0 硬脂酸甘油酯 1.0 礦物油 0.5 聚二甲基硅氧烷 0.2 紅沒藥醇 B 2.0 泛醇，丙二醇 2.0 丙二醇 適量 防腐劑 74.9 aqua dem. C 1.2 三(辛酸/癸酸)甘油酯，丙烯酸鈉共聚物 D 0.2 生育酚 適量 芳香油 E 5.0 活性成分 在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含足香膏(foot balsam)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 5.0 乙基己酸十六/十八酯 4.0 鯨蠟醇 4.0 硬脂酸甘油酯 5.0 礦物油 0.2 薄荷醇 0.5 樟腦 B 69.3 aqua dem. 適量 防腐劑 C 1.0 紅沒藥醇 1.0 生育酚乙酸酯 D 1.0 活性成分 5.0 金縷梅提取物 活性成分5％ A 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 5.0 乙基己酸十六/十八酯 4.0 鯨蠟醇 4.0 硬脂酸甘油酯 5.0 礦物油 0.2 薄荷醇 0.5 樟腦 B 65.3 aqua dem. 適量 防腐劑 C 1.0 紅沒藥醇 1.0 生育酚乙酸酯 D 5.0 活性成分 5.0 金縷梅提取物 分別加熱A相和B相至約80℃。隨后將B相攪拌進(jìn)A相中并對其進(jìn)行均化。在攪拌下將所述混合物冷卻至約40℃；然后加入C相和D相。隨后，對所述混合物進(jìn)行均化并在攪拌下將其冷卻至室溫。
在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含具紅沒藥醇的油包水乳劑，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 6.0 PEG-7 氫化蓖麻油 8.0 乙基己酸十六/十八酯 5.0 肉豆蔻酸異丙酯 15.0 礦物油 0.3 硬脂酸鎂 0.3 硬脂酸鋁 2.0 PEG-45/十二烷基乙二醇共聚物 B 5.0 甘油 0.7 硫酸鎂 55.6 aqua dem. C 1.0 活性成分 0.5 生育酚乙酸酯 0.6 紅沒藥醇 活性成分5％ A 6.0 PEG-7 氫化蓖麻油 8.0 乙基己酸十六/十八酯 5.0 肉豆蔻酸異丙酯 15.0 礦物油 0.3 硬脂酸鎂 0.3 硬脂酸鋁 2.0 PEG-45/十二烷基乙二醇共聚物 B 5.0 甘油 0.7 硫酸鎂 51.6 aqua dem. C 5.0 活性成分 0.5 生育酚乙酸酯 0.6 紅沒藥醇 分別加熱A相和B相至約85℃。隨后將B相攪拌進(jìn)A相并對其進(jìn)行均化。在攪拌下冷卻所述混合物至約40℃；然后加熱C相。隨后，對所述混合物進(jìn)行短暫均化并在攪拌下冷卻至室溫。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含淋浴凝膠劑，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 40.0 月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉 5.0 癸基葡萄糖苷 5.0 椰油酰胺基丙基甜菜堿 1.0 活性成分 1.0 泛醇 適量 芳香油 適量 防腐劑 2.0 氯化鈉 46.0 aqua dem. B 適量 檸檬酸 活性成分5％ A 40.0 月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉 5.0 癸基葡萄糖苷 5.0 椰油酰胺基丙基甜菜堿 5.0 活性成分 1.0 泛醇 適量 芳香油 適量 防腐劑 2.0 氯化鈉 42.0 aqua dem. B 適量 檸檬酸 混合并溶解A相的組分。用B相，即檸檬酸調(diào)整pH值到6-7。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含潤體護(hù)理霜(moistening body care crème)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 3.0 乙基己酸十六/十八酯 1.0 聚二甲基硅氧烷 4.0 十六/十八醇 3.0 硬脂酸甘油酯 SE 5.0 礦物油 4.0 加州希蒙得木(Simmondsia chinensis)種子油 3.0 礦物油，羊毛酯醇 B 5.0 丙二醇 1.0 活性成分 1.0 泛醇 0.5 硅酸鎂鋁 q.s 防腐劑 65.5 aqua dem. C 適量 芳香油 D 適量 檸檬酸 活性成分5％ A 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(25)醚 2.0 十六/十八醇聚氧乙烯(6)醚，十八烷醇 3.0 乙基己酸十六/十八酯 1.0 聚二甲基硅氧烷 4.0 十六/十八醇 3.0 硬脂酸甘油酯 se 5.0 礦物油 4.0 加州希蒙得木(Simmondsia chinensis)種子油 3.0 礦物油，羊毛酯醇 B 5.0 丙二醇 5.0 活性成分 1.0 泛醇 0.5 硅酸鎂鋁 q.s 防腐劑 61.5 aqua dem. C 適量 芳香油 D 適量 檸檬酸 分別加熱A相和B相至約80℃。對B相進(jìn)行短暫預(yù)均化。隨后將B相攪拌進(jìn)A相并進(jìn)行均化。冷卻所述混合物至約40℃；然后加入C相。隨后，對所述混合物進(jìn)行充分均化。用D相，即檸檬酸調(diào)整其pH值到6-7。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含潤體護(hù)理霜(moistening body care crème)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 活性成分1％ A 6.0 PEG-7 氫化蓖麻油 10.0 乙基己酸十六/十八酯 5.0 肉豆蔻酸異丙酯 7.0 礦物油 0.5 牛油樹脂(牛油樹) 0.5 硬脂酸鋁 0.5 硬脂酸鎂 0.2 紅沒藥醇 0.7 聚季銨鹽-18-鋰蒙脫石 B 5.0 雙丙二醇 0.7 硫酸鎂 適量 防腐劑 62.9 aqua dem. C 適量 芳香油 1.0 活性成分 活性成分5％ A 6.0 PEG-7 氫化蓖麻油 10.0 乙基己酸十六/十八酯 5.0 肉豆蔻酸異丙酯 7.0 礦物油 0.5 牛油樹脂(牛油樹) 0.5 硬脂酸鋁 0.5 硬脂酸鎂 0.2 紅沒藥醇 0.7 聚季銨鹽-18-鋰蒙脫石 B 5.0 雙丙二醇 0.7 硫酸鎂 適量 防腐劑 58.9 aqua dem. C 適量 芳香油 5.0 活性成分 分別加熱A相和B相至約80℃。將B相攪拌進(jìn)A相并對其進(jìn)行均化。在攪拌下冷卻所述混合物至約40℃；然后加入C相。隨后，對所述混合物進(jìn)行均化。在攪拌下冷卻所述混合物至室溫。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含泡沫水包油型乳劑(foam O/W emulsion)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％)
在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含凝膠霜?jiǎng)?gel crème)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％)
在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含hydrodispersion，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％)

在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含棒狀劑，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％)
在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含PIT乳劑，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％)
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含凝膠霜?jiǎng)?gel crème)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％)
在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含曬后hydrodispersion，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％)
在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含油包水型乳劑，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％)
在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含pickering乳劑(pickering emulsion)，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，化妝品組合物包含棒狀劑，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％)
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，化妝品組合物包含油性凝膠，其含有例如根據(jù)化妝品成分國際命名法(INCI)命名的以下成分(％) 分別加熱A相和B相至約80℃。隨后，將C相攪拌到A相和B相中并對其進(jìn)行均化。最后，冷卻所述混合物至40℃并加入D相和E相。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的微生物或如上文所述的其衍生物、突變體或滅活形式在制備用于預(yù)防、抑制或治療腳臭、腳多汗或香港腳的藥物組合物中的用途。
另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的微生物或如上文所述的其衍生物、突變體或滅活形式在織物或織物基質(zhì)背景中的用途。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的微生物或如上文所描述的其衍生物、突變體或滅活形式在調(diào)節(jié)或浸漬織物或織物基質(zhì)中的用途。更優(yōu)選地，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或如下文所例證的任何合適的方法，可將本發(fā)明的微生物或如上文所描述的其衍生物、突變體或滅活形式應(yīng)用于或應(yīng)用到織物或織物基質(zhì)中。因此本發(fā)明也涉及在織物或織物基質(zhì)范圍內(nèi)上述任何用途、組合物或者方法。
因此，本發(fā)明涉及制備用于防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的織物和織物基質(zhì)的方法，該方法包括配制本發(fā)明的微生物或上述微生物的突變體、衍生物或滅活形式與織物和織物基質(zhì)的步驟。優(yōu)選地，所述織物和織物基質(zhì)可包含如上文所描述的化妝品或藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，或包含一種或更多種如上文描述的化妝品或藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明所用的術(shù)語“防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的織物和織物基質(zhì)”涉及織物組合物，其包含至少一種本發(fā)明的微生物或上述微生物的突變體、衍生物或滅活形式?？梢栽O(shè)想本發(fā)明的織物組合物包含以任一組合形式存在的上述成分。任選地，它可以包含至少一種其他成分，其適用于防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭(也可見Ullmann，Vol.A 26 S.227 ff，1995，此處引用作為參考)。
根據(jù)本發(fā)明，織物和織物基質(zhì)是織物纖維、半成品織物、成品織物和由此生產(chǎn)的成品，該成品除了包含制衣業(yè)用織物外也包含例如地毯、其他家用織物和用于工業(yè)目的的織物結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)也包括不定型結(jié)構(gòu)如短纖維，線形結(jié)構(gòu)如線、纖維、紗、亞麻線、索、繩、合股線和固體結(jié)構(gòu)如氈、機(jī)織物、襪類、針織物、無紡織布和絮。所述織物可由天然材料制成，例如棉絨、羊毛或亞麻，或由合成材料制成，如聚酰胺、聚酯、改性聚酯、聚酯混紡織物、聚酰胺混紡織物、聚丙烯腈、三乙酸酯、乙酸酯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酯微纖或玻璃纖維織物。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，制備預(yù)防本發(fā)明的皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的織物和織物基質(zhì)的方法可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用來涂飾織物的任何機(jī)器或裝備來進(jìn)行，例如標(biāo)準(zhǔn)機(jī)器如軋染機(jī)。所述軋染機(jī)優(yōu)選為具有例如垂直給料的軋染機(jī)，其含有例如作為基本元件的兩個(gè)緊壓在一起的滾筒，其可以引導(dǎo)所述織物通過。在滾筒上面可以填充水性制劑，其用于濕潤所述織物。通常，該壓力quetches所述織物并保證持續(xù)應(yīng)用。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在軋染機(jī)中例如首先可以引導(dǎo)所述織物通過浸浴并隨后向上通過兩個(gè)緊壓在一起的滾筒，例如在裝有從下面垂直織物給料的軋染機(jī)中。用于織物涂飾的機(jī)器或裝置，尤其是軋染機(jī)，例如Hans-Karl Rouette在“Handbuch der Textilveredlung”，Deutscher Fachverlag 2003，p.618至620中描述了，此處引用作為參考。
在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，制備預(yù)防本發(fā)明的皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的織物和織物基質(zhì)的方法可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的詳盡方法來進(jìn)行，例如噴霧法、浸軋法、輥舐法(kiss-roll)或印染法。優(yōu)選地，制備預(yù)防本發(fā)明的皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的織物和織物基質(zhì)的方法可通過利用液體吸收的耗干法來進(jìn)行，例如液體吸收在1至50％，優(yōu)選20至40％的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，所述織物可隨后由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法進(jìn)行熱處理，例如在30至100℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行干燥或在至少100，優(yōu)選至少101℃高至150℃，優(yōu)選高至135℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行熱固定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述處理可持續(xù)加熱10秒種高至30分鐘，優(yōu)選30秒鐘高至10分鐘。在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，在不同的溫度下進(jìn)行兩個(gè)熱處理步驟，例如，在第一個(gè)步驟中，干燥發(fā)生在例如10秒鐘至20分鐘的時(shí)間范圍內(nèi)的例如30至100℃的溫度范圍內(nèi)，固定發(fā)生在例如30秒鐘至3分鐘的時(shí)間范圍內(nèi)的例如101至135℃的溫度范圍內(nèi)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，適于預(yù)防本發(fā)明的皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的根據(jù)本發(fā)明的織物和織物基質(zhì)中所包含的其他成分可以是DE 40 35 378或DE 10101294.2中描述的環(huán)糊精或是EP-A1-1522626中描述的含直鏈淀粉的物質(zhì)。
通常，環(huán)糊精是由淀粉酶解形成的環(huán)狀寡糖。優(yōu)選地，在本發(fā)明織物或織物基質(zhì)中所用的糊精是α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精，其分別由例如六個(gè)、七個(gè)或八個(gè)α-1，4連接葡萄糖單位組成。所述環(huán)糊精分子的特性是它們具有大量恒定大小的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。通常，α-環(huán)糊精的內(nèi)徑約為570pm，β-環(huán)糊精的內(nèi)徑約為780pm且γ-環(huán)糊精的內(nèi)徑約為950pm。由于它們的結(jié)構(gòu)，環(huán)糊精處于可結(jié)合客體分子的位置。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些客體分子含有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的揮發(fā)性香味。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含直鏈淀粉的物質(zhì)在修飾本發(fā)明中織物或織物基質(zhì)氣味性質(zhì)中的用途。優(yōu)選地，所述直鏈淀粉的含量以該物質(zhì)總重量計(jì)至少為30％(重量)。本發(fā)明也提供修飾織物氣味性質(zhì)的方法，其特征在于該織物是由直鏈淀粉或含直鏈淀粉的物質(zhì)涂飾，其中直鏈淀粉含量以重量計(jì)優(yōu)選為至少30％。術(shù)語“直鏈淀粉或含直鏈淀粉的物質(zhì)”指任何含直鏈淀粉的淀粉，例如天然淀粉、改性淀粉和淀粉衍生物，其直鏈淀粉含量以重量計(jì)優(yōu)選為至少30％。所述淀粉可為天然淀粉，例如玉米淀粉、小麥淀粉、馬鈴薯淀粉、高粱淀粉、稻淀粉或竹芋淀粉，此淀粉也可由天然淀粉部分消化得到或被化學(xué)修飾。純直鏈淀粉也適用，例如通過酶作用得到的直鏈淀粉，如從蔗糖獲得的直鏈淀粉。直鏈淀粉和淀粉的混合物也適用，優(yōu)選地，如果以所述混合物總重量計(jì)直鏈淀粉的總含量至少占30％。對直鏈淀粉和淀粉的混合物而言，涉及直鏈淀粉或含直鏈淀粉的物質(zhì)時(shí)，以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)的所有數(shù)據(jù)通常是基于直鏈淀粉+淀粉的總重量，除非另作明確說明。
根據(jù)本發(fā)明特別適用的是含直鏈淀粉物質(zhì)，尤其是直鏈淀粉和含直鏈淀粉的淀粉，和直鏈淀粉/淀粉混合物，該混合物中直鏈淀粉含量以物質(zhì)總重量計(jì)至少占40％并且尤其至少占45％。通常，所述直鏈淀粉含量以重量計(jì)不會(huì)超過90％并且尤其不會(huì)超過80％。此類物質(zhì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并可通過商業(yè)途徑獲得。
為實(shí)現(xiàn)氣味修飾效應(yīng)，本發(fā)明的織物通常由含直鏈淀粉的物質(zhì)以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的量涂飾，在基于織物重量的每一種情況下，該物質(zhì)的量以重量計(jì)優(yōu)選至少為0.5％，更優(yōu)選至少1％，尤其至少為2％。通常，所述含直鏈淀粉的物質(zhì)以織物重量計(jì)以不高于25％，通常不高于20％并且尤其不高于15％的量來使用，以防止不利地影響該織物的手感。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，為改善所述氣味的性質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明的織物材料可通過含直鏈淀粉的物質(zhì)涂飾。然而，為了獲得織物長久的香氣或香味，也可以一起使用含直鏈淀粉的物質(zhì)及香料。優(yōu)選地，該方法涉及用含直鏈淀粉的物質(zhì)處理本發(fā)明的織物，或同時(shí)使用本發(fā)明的微生物和含直鏈淀粉的物質(zhì)處理所述織物。以這種方法涂飾的織物將用香料進(jìn)行處理。結(jié)果，含直鏈淀粉的物質(zhì)就具有香味。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的織物或織物基質(zhì)可利用香料涂飾，所述織物或織物基質(zhì)由根據(jù)本發(fā)明的微生物或上述該微生物的突變體、衍生物或滅活形式配制。
優(yōu)選地，任何上述實(shí)施方案中使用的香料可以以滿足預(yù)期香味效應(yīng)的量使用，其為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。上限由使用的含直鏈淀粉的物質(zhì)中直鏈淀粉單位的最大吸收能力決定，并且基于所述物質(zhì)的直鏈淀粉含量，以重量計(jì)通常不會(huì)超過20％，經(jīng)常不會(huì)超過10％。如果需要，所述香料通常以從0.1至10％并且特別是從0.5至5％(以重量計(jì))的量來使用。
合適的香料原則上均為易揮發(fā)的有機(jī)化合物及作為香料的有機(jī)化合物的混合物。在Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry第五版(CDRom)，F(xiàn)lavours and Fragrances第二章，尤其是在章節(jié)2.1至2.4中給出了關(guān)于香料的綜述。對本發(fā)明特別適用的為脂肪族香料和脂環(huán)族性質(zhì)的香料。這些包括脂肪族C4-C12醇，例如3-辛醇、順式-3-己烯-1-醇、反式-3-己烯-1-醇、1-辛烯-3-醇、2，6-二甲基庚-2-醇、1-辛烯-3-醇、9-癸烯-1-醇、10-十一碳烯-1-醇、2-反式-6-順式-壬二烯-1-醇，脂肪族C6-C13醛，例如，己醛、辛醛、壬醛、癸醛、十一醛、二-甲基癸醛、2-甲基十一醛、月桂醛和十三醛、順式-4-庚醛和10-十一醛、脂族C1-C6羧酸與脂族、任選單不飽和C1-C8醇的酯，如甲酸乙酯、甲酸順式-3-己烯酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸3，5，5-三甲基己酯、乙酸反式-2-己烯酯、乙酸順式-3-己烯酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯、丁酸異戊酯、丁酸己酯、異丁酸順式-3-己烯酯、異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、己酸2-丙烯酯、庚酸乙酯、庚酸2-丙烯酯和辛酸乙酯，無環(huán)萜烴和烴醇如橙花醇、香葉醇、四氫香葉醇、芳樟醇、四氫芳樟醇、香茅醇、熏衣草醇、月桂烯醇、法呢醇、橙花叔醇以及這些醇的甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯和異丁酸酯，上述醇相對應(yīng)的醛如橙花醛、香茅醛、羥基二氫香茅醛、甲氧基二氫香茅醛以及這些醛的二甲基乙縮醛和二乙基乙縮醛如二乙基橙花醛、甲氧基二氫香茅醛-二甲基乙縮醛，也包括環(huán)萜烴、烴醇和醛。這些也包括自然來源的香料，如玫瑰油、檸檬油、熏衣草油及丁香油的香料。
因此，本發(fā)明也涉及織物或織物基質(zhì)，其包含根據(jù)本發(fā)明的微生物或如上文描述的其衍生物、突變體或滅活形式?！鞍笨芍?，例如結(jié)合或摻入根據(jù)本發(fā)明的微生物或如上文描述的其衍生物、突變體或滅活形式，尤其是以上述方法之一得到的形式。
在另一方面，本發(fā)明涉及制備組合物的方法，該方法包括配制根據(jù)本發(fā)明的微生物或如上文描述的其衍生物、突變體或滅活形式與化妝品和/或藥物載體或賦形劑的步驟。
此外本發(fā)明涉及預(yù)防、抑制或治療腳臭的方法，該方法包括對需要預(yù)防、抑制或治療腳臭的患者施用預(yù)防或治療有效量的本發(fā)明的組合物的步驟。
應(yīng)理解本發(fā)明不局限于此處描述的特定的方法、方案、細(xì)菌、載體和試劑等等，因?yàn)樗鼈兪强勺兊?。也?yīng)理解此處所用術(shù)語僅為描述特定實(shí)施方案的目的，并不旨在限制本發(fā)明的范圍，該范圍僅被附加的權(quán)利要求所限。除非另行定義，此處所用的所有科技術(shù)語與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含意相同。
優(yōu)選地，此處所用術(shù)語定義為如Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.and

eds.(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland在“A multilingual glossary of biotechnological terms(IUPACRecommendations)”中描述。在本說明書及隨后的權(quán)利要求書內(nèi)，除非文中另行要求，術(shù)語“包含”及其變體如“含有”應(yīng)理解為指代包括所陳述的整數(shù)或步驟，或整數(shù)或步驟的集合，但不排除任何其他整數(shù)或步驟，或整數(shù)或步驟的集合。
在本說明書全文中引用了若干文件。此處引用的每個(gè)文件(包括所有專利、專利申請、科學(xué)出版物、制造商說明書、使用說明書等等)，無論在上文中還是在下文中以其整體引入作為參考。不能將此處任何內(nèi)容理解為承認(rèn)由于先前發(fā)明，本發(fā)明沒有資格早于此類公開。
必須注意此處所用以及在所附權(quán)利要求書中的單數(shù)形式“一個(gè)”、“這個(gè)”和“一種”包括復(fù)數(shù)指代物，除非文中另作清楚說明。因此，例如，對“一種試劑”的引用包括一種或更多種此類不同的試劑，對“這個(gè)方法”的引用包括參考等同的步驟和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法，所述方法可修改或替代此處所描述的方法。



圖1 顯示在體外孔平板測定中產(chǎn)生腳臭的微生物受抑制的情況(實(shí)施例3)。所示為瓊脂平板，其具有產(chǎn)生腳臭的指示菌株微球菌和乳酸細(xì)菌短乳桿菌LB-FG-0009(DSM 17607)?？字車谏h(huán)的形成表明所述指示菌株微球菌的生長受到抑制。
圖2 顯示在體外液體測定中產(chǎn)生腳臭的微生物微球菌的生長受抑制的情況(實(shí)施例4)。使用短乳桿菌LB-FG-0009(DSM 17607)。所示為通過對所述指示菌株菌落形成單位計(jì)數(shù)，與沒有乳酸細(xì)菌的對照相比而定量后得出的抑制程度。
圖3 顯示在體外液體測定中表皮葡萄球菌(DSM20044)的生長抑制缺乏(實(shí)施例5)。使用短乳桿菌LB-FG-0009(DSM 17607)。所示為通過對指示菌株菌落形成單位計(jì)數(shù)，與沒有乳酸細(xì)菌的對照相比而定量后得出的抑制程度。
可通過以下實(shí)施例更好的理解本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)，這些實(shí)施例只用于說明性目的而不旨于以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 鑒定產(chǎn)生臭味的微生物/臭味測定 與微生物產(chǎn)生異戊酸相關(guān)的生物合成途徑是已知的(Thierry等人，Appl.Env.Microbiol.68(2)(2002)，608-615)，但是能產(chǎn)生該物質(zhì)對應(yīng)的腳部微生物是未知的。發(fā)明人已經(jīng)鑒定與腳臭產(chǎn)生相關(guān)的特定微生物。為鑒定與腳臭產(chǎn)生(因?yàn)楹铣闪擞谐粑兜奈镔|(zhì)異戊酸)相關(guān)的腳部微生物，從有腳臭的受試者上分離得到了微生物。分離腳部微生物 通過在腳底部規(guī)定的區(qū)域(2cmx2cm)上摩擦無菌Q-tip而從該皮膚分離腳部微生物。將該Q-tip轉(zhuǎn)移至無菌緩沖溶液(PBS，pH 7.0)中并將稀釋液涂布到用于革蘭氏陽性細(xì)菌的選擇性培養(yǎng)瓊脂平板(例如BHI，Difco Inc.)或革蘭氏陰性細(xì)菌的選擇性培養(yǎng)瓊脂平板(例如MacConkeyagar，Difco Inc.)上或用于酵母和真菌的選擇性培養(yǎng)基瓊脂平板上(例如Plate Count Agar，Difco Inc.)。然后將已從皮膚上轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓊脂平板上的微生物在30℃和37℃，有氧和厭氧培養(yǎng)約24小時(shí)。菌落形成單位通過用于定性分析的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方法和用于定量的計(jì)數(shù)來測定。確定相對組成及總細(xì)胞數(shù)目。
鑒定產(chǎn)生臭味的微生物/臭味測定 個(gè)別微生物由于異戊酸的生物合成而產(chǎn)生典型的腳臭。這些微生物由于代謝活動(dòng)而能夠產(chǎn)生異戊酸。進(jìn)行下面的測定以鑒定能合成異戊酸的微生物。
在20ml相應(yīng)的培養(yǎng)液中(針對革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母或真菌(Difco Inc.))將分離得到的微生物在30℃/37℃，有氧或厭氧培養(yǎng)24小時(shí)。將細(xì)胞離心(4000xg)并用60mM磷酸鹽緩沖液(ph 8.0)洗滌兩次。對于臭味產(chǎn)生測定，將細(xì)胞懸浮于含有5mM L-亮氨酸和10mMα-酮戊二酸的60mM磷酸鹽緩沖液(ph 8.0)中，并在160rpm旋轉(zhuǎn)搖床上劇烈搖動(dòng)進(jìn)行有氧培養(yǎng)24小時(shí)。然后，通過離心(4000xg，5分鐘)沉淀細(xì)胞并將所述上清液轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中用于氣相色譜分析。異戊酸的產(chǎn)生通過GC分析觀測，其在有毛細(xì)管柱(30m×0.5mm×0.53μm[薄膜厚度]；Agilent HP-FFAP)的Hewlett-Packard 5890系列II氣相色譜儀上進(jìn)行。溫度程序?yàn)?50℃至220℃。所述溫度最初為150℃，2分鐘；然后以15℃/min的速度升高至最終溫度220℃，并在該溫度下保持3分鐘。恒定流速為30cm/s，使用氦氣作為載體氣體，并以非分流模式進(jìn)行注射。通過氣相色譜/質(zhì)譜分析及與純的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)滯留時(shí)間的比較來鑒定異戊酸。
典型干酪樣氣味的產(chǎn)生可通過將樣品用HCl再酸化后嗅聞來驗(yàn)證。詳細(xì)來說，溫育之后向樣品滴加6M HCl溶液將等分試樣再酸化。由于酸化作用，異戊酸蒸發(fā)并通過鼻子以劑量依賴性方式來識別。能夠產(chǎn)生異戊酸與相應(yīng)的典型干酪樣氣味的那些微生物可歸類為能產(chǎn)生臭味的腳部微生物。
實(shí)施例2 鑒定防止微生物產(chǎn)生異戊酸的微生物 個(gè)別微生物由于異戊酸生物合成而產(chǎn)生典型的腳臭。這些微生物由于代謝活動(dòng)而能產(chǎn)生異戊酸。已經(jīng)鑒定了微生物，尤其是乳酸細(xì)菌特異性抑制異戊酸生物合成，所述微生物能夠抑制產(chǎn)生臭味的腳部微生物的異戊酸生物合成。為檢測這種效應(yīng)，已進(jìn)行下面的測定。
培養(yǎng)并制備乳桿菌 在Eppendorf管中1ml MRS培養(yǎng)液中培養(yǎng)從-80℃冰凍培養(yǎng)物培養(yǎng)得到乳酸細(xì)菌。封閉試管并在37℃下培養(yǎng)2天。將5μl這種預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中由0.5ml MRS培養(yǎng)液組成的主培養(yǎng)物中。將所述培養(yǎng)物溫育兩天。在培養(yǎng)之后通過離心(4000xg，15分鐘)收集細(xì)胞。用60mM磷酸鹽緩沖液(pH 0.8)洗滌細(xì)胞沉淀兩次。在200μl 60mM磷酸鹽緩沖液(pH 0.8)中重懸細(xì)胞。
培養(yǎng)并制備指示菌株 一種典型指示菌株為微球菌。為了培養(yǎng)，將15μl 24小時(shí)預(yù)培養(yǎng)物(20ml)接種至含20ml BHI培養(yǎng)液的搖動(dòng)玻璃燒瓶中。所述指示菌株在37℃下劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)(往復(fù)式搖床上160rpm)。通過離心(4000xg，15分鐘)收集細(xì)胞并在PBS緩沖液(pH 0.8)中洗滌兩次。為了下面的臭味抑制測定，在60mM磷酸鹽緩沖液(pH 0.8)中重懸細(xì)胞。 臭味抑制測定 為了所述臭味抑制測定，在100μl乳桿菌培養(yǎng)物、60mM磷酸鹽緩沖液(pH 0.8)、5mM L-亮氨酸和10mM α-酮戊二酸存在下將15μl制備的指示菌株于30℃劇烈搖動(dòng)下有氧培養(yǎng)24小時(shí)。然后通過離心(4000xg，15分鐘)沉淀細(xì)胞并將上清液轉(zhuǎn)移至玻璃瓶用于氣相色譜分析。相應(yīng)的對照樣品在沒有乳桿菌存在下進(jìn)行溫育。異戊酸產(chǎn)生的抑制作用通過GC分析來觀測，其在具有毛細(xì)管柱(30m×0.5mm×0.53μm[薄膜厚度]；AgilentHP-FFAP)的Hewlett-Packard 5890系列II氣相色譜儀上進(jìn)行。溫度程序?yàn)?50℃至220℃。所述溫度最初為150℃，2分鐘；然后以每分鐘15℃的速度升高至最終溫度220℃，并在該溫度下保持3分鐘。恒定流速為30cm/s，使用氦氣作為載體氣體，并以非分流模式進(jìn)行注射。通過氣相色譜/質(zhì)譜分析及與純的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)滯留時(shí)間的比較來鑒定異戊酸。
典型干酪樣氣味的產(chǎn)生的防止可通過將樣品用HCl再酸化后嗅聞來驗(yàn)證。詳細(xì)來說，溫育之后向樣品滴加6M HCl溶液將等分試樣再酸化。由于酸化作用，異戊酸蒸發(fā)并通過鼻子以劑量依賴性方式來確認(rèn)。
實(shí)施例3 產(chǎn)生臭味的腳部微生物的抑制 個(gè)別微生物由于異戊酸生物合成而導(dǎo)致產(chǎn)生典型的腳臭。在不干擾整個(gè)腳部微生物皮膚區(qū)系情況下，通過局部應(yīng)用微生物對這些微生物進(jìn)行特異性抑制是減少腳臭產(chǎn)生的有效途徑，而在此情況下保護(hù)皮膚的皮膚區(qū)系仍可存在。在體外孔板測定中，已鑒定出特定的乳酸細(xì)菌，其可抑制產(chǎn)生臭味的腳部微生物在瓊脂平板上的生長。為測試該效應(yīng)，將預(yù)培養(yǎng)的乳酸細(xì)菌裝入預(yù)切割的孔中并觀察指示菌株的生長抑制。抑制定義為在移入乳酸細(xì)菌的孔周圍形成透明環(huán)。觀察到若干種菌株抑制腳部微生物的生長。短乳桿菌LB-FG-0009(DSM 17607)和指示菌株微球菌的數(shù)據(jù)如圖1所示。
培養(yǎng)和制備乳桿菌 在Eppendorf管的1ml MRS培養(yǎng)液中從-80℃冰凍培養(yǎng)物培養(yǎng)乳酸細(xì)菌。封閉試管并在37℃下培養(yǎng)2天。將10μl這種預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至Falcon管中由7ml MRS培養(yǎng)液組成的主培養(yǎng)物中。將所述培養(yǎng)物溫育一天。在培養(yǎng)之后通過離心(15min，4000xg)收獲細(xì)胞。用K/Na緩沖液洗滌所述細(xì)胞沉淀兩次(每次1ml)。在200μl K/Na緩沖液中重懸細(xì)胞。
培養(yǎng)并制備指示菌株 所述指示菌株為微球菌。將15μl 24h預(yù)培養(yǎng)物接種于含20ml BHI培養(yǎng)液的搖動(dòng)玻璃燒瓶中。該指示菌株在37℃下培養(yǎng)24h。將等分試樣在BHI培養(yǎng)液中稀釋至光密度OD595nm為0.025-0.05并將其800μl涂布于指示平板上(BHI瓊脂)。用木塞打孔器來壓印瓊脂?？字谐錆M預(yù)培養(yǎng)的乳酸細(xì)菌。
培養(yǎng)基和緩沖液 BHI-瓊脂 Difco 瓊脂1.8％；每塊平板20ml BHI-培養(yǎng)基Difco MRS-培養(yǎng)液Difco，150μl/孔 K/Na-緩沖液 根據(jù)Küster Thiel，ph 7.0，高壓滅菌 -0.066M Na2HPO4x2H2O 61.2ml -0.066M KH2PO438.8ml 實(shí)施例4 體外液體測定中產(chǎn)生腳臭的微生物的生長抑制 所選短乳桿菌(LB-FG-0009)能夠在體外液體測定中阻止產(chǎn)生腳臭的腳部微生物的生長。
為驗(yàn)證該效應(yīng)，預(yù)培養(yǎng)的乳酸細(xì)菌已與指示菌株在液體培養(yǎng)基中共溫育。抑制程度通過對指示菌株菌落形成單位進(jìn)行計(jì)數(shù)并與沒有乳酸細(xì)菌的對照相比而定量。數(shù)據(jù)如圖2所示。
培養(yǎng)并制備乳桿菌 在Eppendorf管的1ml MRS培養(yǎng)液中從-80℃冰凍培養(yǎng)物培養(yǎng)乳酸細(xì)菌。封閉試管并在37℃下培養(yǎng)2天。將10μl這種預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至Falcon管中由7ml MRS培養(yǎng)液組成的主培養(yǎng)物。將所述培養(yǎng)物溫育兩天。在培養(yǎng)之后通過離心(15min，4000xg)收獲細(xì)胞。用K/Na緩沖液洗滌所述細(xì)胞沉淀兩次(每次1ml)。在200μl K/Na緩沖液中重懸細(xì)胞。
培養(yǎng)并制備指示菌株 所述指示菌株為微球菌。將15μl冰凍培養(yǎng)物接種于含20ml BHI培養(yǎng)液的搖動(dòng)玻璃燒瓶中用于24小時(shí)預(yù)培養(yǎng)。 液體抑制測定 在液體測定中，5μl新鮮制備的乳酸細(xì)菌(來自于200μl)和10μl預(yù)培養(yǎng)的指示菌株接種于10ml BHI培養(yǎng)液中用于共培養(yǎng)。將所述培養(yǎng)物溫育7小時(shí)。然后將1∶1000稀釋度的100μl涂布于BHI瓊脂平板上用于菌落形成單位的定量。將所述平板培養(yǎng)24小時(shí)并對菌落形成單位進(jìn)行計(jì)數(shù)。培養(yǎng)基和緩沖液 BHI-瓊脂 Difco 瓊脂1.8％；每塊平板20ml BHI-培養(yǎng)基 Difco MRS-培養(yǎng)液 Difco K/Na-緩沖液根據(jù)Küster Thiel，ph 7.0，高壓滅菌 -0.066M Na2HPO4x2H2O 61.2ml -0.066M KH2PO438.8ml 實(shí)施例5 表皮葡萄球菌(DSM20044)在體外液體測定中無生長抑制 所選的短乳桿菌(LB-FG-0009)能預(yù)防腳部微生物產(chǎn)生腳臭，但在體外液體測定中不能抑制腳部皮膚共生微生物區(qū)系中重要成員表皮葡萄球菌(DSM20044)。
為檢測該效應(yīng)，預(yù)培養(yǎng)的乳酸細(xì)菌已與指示菌株在液體培養(yǎng)物中共同溫育。抑制程度通過對指示菌株菌落形成單位進(jìn)行計(jì)數(shù)并與沒有乳酸細(xì)菌的對照相比而定量。數(shù)據(jù)如圖3所示。
培養(yǎng)并制備乳桿菌 在Eppendorf管的1ml MRS培養(yǎng)液中從-80℃冰凍培養(yǎng)物培養(yǎng)乳酸細(xì)菌。封閉試管并在37℃下培養(yǎng)2天。將10μl這種預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至Falcon管中由7ml MRS培養(yǎng)液組成的主培養(yǎng)物。將所述培養(yǎng)物溫育2天。在培養(yǎng)之后通過離心(15min，4000xg)收獲細(xì)胞。用K/Na緩沖液洗滌所述細(xì)胞沉淀兩次(每次1ml)。在200μl K/Na緩沖液中重懸細(xì)胞。
培養(yǎng)并制備指示菌株 所述指示菌株為表皮葡萄球菌(DSM20044)。將15μl冰凍培養(yǎng)物接種于含20ml BHI培養(yǎng)液的搖動(dòng)玻璃燒瓶中用于24h預(yù)培養(yǎng)。 液體抑制測定 在液體測定中，將5μl新鮮制備的乳酸細(xì)菌(來自于200μl)和10μl預(yù)培養(yǎng)的指示菌株表皮葡萄球菌(DSM20044)接種于10ml BHI培養(yǎng)液中共培養(yǎng)。將所述培養(yǎng)物溫育7小時(shí)。然后將1∶1000稀釋度的100μl涂布于BHI瓊脂平板上用于菌落形成單位的定量。將所述平板培養(yǎng)24小時(shí)并對菌落形成單位進(jìn)行計(jì)數(shù)。
培養(yǎng)基和緩沖液 BHI-瓊脂 Difco 瓊脂1.8％；每塊平板20ml BHI-培養(yǎng)基 Difco MRS-培養(yǎng)液 Difco K/Na-緩沖液根據(jù)Küster Thiel，ph 7.0，高壓滅菌 -0.066M Na2HPO4x2H2O 61.2ml -0.066M KH2PO438.8ml
申請人或代理人卷號 國際申請?zhí)?br> L2545 PCT S3
與保藏的微生物或其它生物材料有關(guān)的聲明
(PCT細(xì)則第13條之2)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印)
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與保藏的微生物或其它生物材料有關(guān)的聲明
(PCT細(xì)則第13條之2)
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與保藏的微生物或其它生物材料有關(guān)的聲明
(PCT細(xì)則第13條之2)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印)
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與保藏的微生物或其它生物材料有關(guān)的聲明
(PCT細(xì)則第13條之2)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印)
申請人或代理人卷號國際申請?zhí)?br> L2545 PCT S3
與保藏的微生物或其它生物材料有關(guān)的聲明
(PCT細(xì)則第13條之2)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印)
權(quán)利要求
1.微生物，其能夠防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭。
2.權(quán)利要求1的微生物，其在利用鼻子的嗅聞測定中表現(xiàn)出防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的能力。
3.權(quán)利要求1或2的微生物，其能夠抑制皮膚微生物的異戊酸生物合成。
4.權(quán)利要求3的微生物，其在測定中表現(xiàn)出抑制皮膚微生物的異戊酸生物合成的能力，該測定包括以下步驟
(i)將所述微生物與能產(chǎn)生異戊酸的微生物和異戊酸前體混合；
(ii)在允許產(chǎn)生異戊酸的條件下溫育所述混合物；
(iii)從所述混合物的上清液中提取短鏈脂肪酸；并
(iv)通過異戊酸的出現(xiàn)檢測腳臭的產(chǎn)生。
5.權(quán)利要求1至4任何一項(xiàng)的微生物，其能抑制產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物的生長。
6.權(quán)利要求5的微生物，其在抑制測定中表現(xiàn)出抑制產(chǎn)生腳臭的皮膚微生物生長的能力。
7.權(quán)利要求3至6任何一項(xiàng)的微生物，其中異戊酸由屬于微球菌屬或丙酸桿菌屬的細(xì)菌產(chǎn)生。
8.權(quán)利要求7的微生物，其中屬于微球菌屬的所述細(xì)菌為微球菌。
9.權(quán)利要求7的微生物，其中屬于丙酸桿菌屬的所述細(xì)菌為費(fèi)氏丙酸桿菌。
10.權(quán)利要求1至9任何一項(xiàng)的微生物，其為屬于乳桿菌屬、乳球菌屬或明串珠菌屬的微生物。
11.權(quán)利要求10的微生物，其中所述乳桿菌屬為短乳桿菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌或德氏乳桿菌德氏亞種。
12.權(quán)利要求10的微生物，其中所述明串珠菌屬為腸膜明串珠菌。
13.權(quán)利要求11或12的微生物，其選自短乳桿菌LB-FG-0001(DSM17599)、植物乳桿菌LB-FG-0002(DSM 17600)、彎曲乳桿菌LB-FG-0003(DSM 17601)、腸膜明串珠菌LB-FG-0004(DSM 17602)、植物乳桿菌LB-FG-0005(DSM 17603)、德氏乳桿菌德氏亞種LB-FG-0006(DSM17604)、德氏乳桿菌德氏亞種LB-FG-0007(DSM 17605)、植物乳桿菌LB-FG-0008(DSM 17606)和短乳桿菌LB-FG-0009(DSM 17607)或其突變體或衍生物，其中所述突變體或衍生物保留防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭的能力。
14.權(quán)利要求1至13任何一項(xiàng)的微生物的滅活形式，其可防止皮膚微生物產(chǎn)生腳臭。
15.權(quán)利要求14的滅活形式，其被熱滅活或凍干。
16.組合物，其包含權(quán)利要求1至13任何一項(xiàng)的微生物或權(quán)利要求14或15的滅活形式。
17.權(quán)利要求16的組合物，其為化妝品組合物，任選地包含化妝品可接受的載體或賦形劑。
18.權(quán)利要求16的組合物，其為藥物組合物，任選地包含藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
19.權(quán)利要求1至13任何一項(xiàng)的微生物或權(quán)利要求14或15的滅活形式在制備用于抑制腳臭的化妝品或藥物組合物中的用途。
20.制備化妝品組合物的方法，其包括用化妝品可接受的載體或賦形劑配制權(quán)利要求1至13任何一項(xiàng)的微生物或權(quán)利要求14或15的滅活形式的步驟。
21.制備藥物組合物的方法，其包括用藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑配制權(quán)利要求1至13任何一項(xiàng)的微生物或權(quán)利要求14或15的滅活形式的步驟。
全文摘要
描述了能夠抑制皮膚微生物形成腳臭的微生物。也描述了含有此類微生物的組合物及此類微生物在化妝品、預(yù)防或治療應(yīng)用中的用途。
文檔編號A61K35/66GK101283086SQ200680034058
公開日2008年10月8日 申請日期2006年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月19日
發(fā)明者E·布德, A·賴因德, R·克內(nèi)爾, C·朗, M·維恩, M·波特納 申請人:巴斯夫歐洲公司