專(zhuān)利名稱(chēng)：穩(wěn)定化的glp-1類(lèi)似物的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2005年9月8日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)序列第60/715,322號(hào)的優(yōu)先權(quán)權(quán)益；該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用被并入。
背景技術(shù)：
多肽和肽治療劑被廣泛用于醫(yī)療實(shí)踐中。它們的易于生產(chǎn)，通過(guò)重組DNA技術(shù)或肽合成儀，確保它們?cè)诮酉聛?lái)的若干年中將持續(xù)用于各種情況。因此，多肽治療劑，例如激素、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，代表著重要的一類(lèi)治療劑。然而，某些天然多肽，通過(guò)蛋白水解或異構(gòu)化在體內(nèi)可被迅速滅活。這類(lèi)滅活在其中期望在一段時(shí)期內(nèi)維持一致的或持續(xù)的治療劑血水平的情況下可能是不便的，因?yàn)槠浜笾貜?fù)給藥將是必要的。在某些情況下，該多肽的一種或多種蛋白水解產(chǎn)物可能拮抗完整多肽的活性。在這些情況下，單獨(dú)施用額外的治療劑可能不足以克服水解產(chǎn)物的拮抗效應(yīng)。
為進(jìn)一步闡述，在血液中延長(zhǎng)的存在時(shí)間可能是有益的一種肽激素包括胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)。GLP-1是在葡萄糖代謝和胃腸分泌和代謝中起調(diào)節(jié)功能的重要多肽激素。當(dāng)前的成果表明，GLP-1是胰腺中β細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，并可能參與胰腺外的其它器官中的細(xì)胞分化。
GLP-1被認(rèn)為是由絲氨酸蛋白酶的后脯氨酸切割類(lèi)(post-proline cleaving class)的成員加以降解，例如二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV，DPP IV)。DPP IV是膜結(jié)合的絲氨酸肽酶，其從肽鏈切割N末端二肽，所述肽鏈在倒數(shù)第二(P1)位含有——優(yōu)選地——脯氨酸殘基或者丙氨酸殘基，如果N末端殘基(P2)是組氨酸或大的芳族氨基酸例如酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸。GLP-1的氨基末端序列是His-Ala-Glu。因此，DPP IV已被暗示涉及體內(nèi)GLP-1的活性調(diào)節(jié)。
DPP IV介導(dǎo)的、從生物活性肽激素例如GLP-1的N-末端進(jìn)行的Xaa-Ala或Xaa-Pro二肽的切除——其中Xaa是氨基酸殘基，使得它們失活或者甚至是拮抗的。因此，肽激素通過(guò)絲氨酸蛋白酶如DPP IV的切割和失活是一個(gè)例子，其說(shuō)明了應(yīng)用治療劑多肽的局限性；即，它們?cè)隗w內(nèi)短的作用持續(xù)時(shí)間。由于這個(gè)原因，在本領(lǐng)域中存在對(duì)于具有GLP-1樣活性的作用時(shí)間更長(zhǎng)的肽的需求。
發(fā)明概述
本發(fā)明一般地提供GLP-1類(lèi)似物，其在體內(nèi)具有增加的GLP-1樣活性持續(xù)時(shí)間。本發(fā)明還提供了GLP-1類(lèi)似物，其對(duì)GLP-1受體具有增加的親和性。
一方面，本發(fā)明是多肽類(lèi)似物，其包括 a)與GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ ID NOS1-4)之一至少80％相同的基礎(chǔ)氨基酸序列；和 b)一至十五個(gè)(天然或非天然存在的)氨基酸殘基，其連接于所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端， 其中與天然GLP-1相比，所述類(lèi)似物具有在人類(lèi)中更長(zhǎng)體內(nèi)持續(xù)時(shí)間的GLP-1樣活性。
另一方面，本發(fā)明是多肽類(lèi)似物，其包括 a)與GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ ID NOS1-4)之一至少80％相同的基礎(chǔ)氨基酸序列；和 b)連接于所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的一至十五個(gè)氨基酸殘基， 其中GLP-1受體對(duì)所述類(lèi)似物具有比天然GLP-1更高的親和性。這種類(lèi)似物還有利地具有GLP-1樣活性，所述活性在人類(lèi)中具有比天然GLP-1更長(zhǎng)的體內(nèi)持續(xù)時(shí)間。
在又另一方面，本發(fā)明是多肽類(lèi)似物，其包括 a)與GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ ID NOS1-4)之一至少50％相同的基礎(chǔ)氨基酸序列，其中在所述基礎(chǔ)氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于GLP-1的P’1殘基的氨基酸殘基是具有四取代Cβ碳的氨基酸類(lèi)似物；和 b)連接于所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的一至十五個(gè)氨基酸殘基， 其中所述類(lèi)似物具有GLP-1樣活性，所述活性在人類(lèi)中具有比天然GLP-1更長(zhǎng)的體內(nèi)持續(xù)時(shí)間。
在又一方面，本發(fā)明是多肽類(lèi)似物，其包括 a)與GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ ID NOS1-4)之一至少50％相同的基礎(chǔ)氨基酸序列，其中在所述基礎(chǔ)氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于GLP-1的P’1殘基的氨基酸殘基是具有四取代Cβ碳的氨基酸類(lèi)似物；和 b)連接于所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的一至十五個(gè)氨基酸殘基， 其中GLP-1受體對(duì)所述類(lèi)似物具有比天然GLP-1更高的親和性。這類(lèi)類(lèi)似物還有利地具有GLP-1樣活性，所述活性在人類(lèi)中具有比天然GLP-1更長(zhǎng)的體內(nèi)持續(xù)時(shí)間。
本發(fā)明還提供了包括一種或更多種題述類(lèi)似物的藥物組合物。示例性的藥物組合物包括一種或多種與藥學(xué)上可接受載體或賦形劑一起配制的類(lèi)似物。
本發(fā)明的另一方面是治療受試者(subject)中的疾病的方法，其包括施用治療有效量的一種或多種所述類(lèi)似物。題述類(lèi)似物可以被單獨(dú)施用，或可作為治療方案的一部分加以施用，所述治療方案包括適于具體疾病適應(yīng)癥的其它治療。作為例子，用于治療糖尿病的類(lèi)似物的施用可被單獨(dú)應(yīng)用，或者可與飲食調(diào)節(jié)和鍛煉和/或胰島素施用聯(lián)合應(yīng)用。進(jìn)一步的示例性聯(lián)合治療方法包括施用類(lèi)似物和施用切割天然GLP-1多肽的特定的一種或多種酶的抑制劑。這類(lèi)抑制劑對(duì)于特定酶可以是特異的(例如，DPP IV特異性抑制劑)，或者對(duì)于酶類(lèi)可以是更一般性的(例如，絲氨酸蛋白酶抑制劑)。
本發(fā)明的另一方面是為了診斷目的應(yīng)用題述類(lèi)似物。
本發(fā)明的另一方面是題述類(lèi)似物在生產(chǎn)用于治療本文所公開(kāi)的疾病或狀況的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一方面是增加與GLP-1至少80％相同的肽在人類(lèi)中的體內(nèi)半衰期的方法，其包括將一至十五個(gè)氨基酸殘基連接至所述肽的羧基端。
本發(fā)明的又一方面是進(jìn)行商業(yè)行為的方法，包括對(duì)本發(fā)明的類(lèi)似物、其藥物組合物和/或包含所述類(lèi)似物的試劑盒進(jìn)行鑒別、生產(chǎn)、市場(chǎng)開(kāi)發(fā)、分配、和/或許可。
附圖簡(jiǎn)述
圖1示出了(A)在pH 8.0的50mM HEPES、0.14M NaCl中于37℃與大鼠DPP IV溫育的Ala-Pro-Leu-Ser-Trp-Ser-NH2(□)、Ala-Pro-Ile-Ser-Trp-Ser-NH2(△)和Ala-Pro-Tle-Ser-Trp-Ser-NH2(
)的消化；和(B)在pH 8.0的50mM HEPES、0.14M NaCl中于30℃與人DPP IV溫育的GLP-1(7-36酰胺)(■)、TPA 1B4(◆)和P1732(▲)的消化。在所示出的時(shí)刻取出等分試樣，通過(guò)添加HCl至pH為2來(lái)停止反應(yīng)，并通過(guò)LCMS分析樣品。肽濃度為0.1mM。通過(guò)對(duì)MS色譜圖中的底物峰和產(chǎn)物峰進(jìn)行積分確定切割百分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)被擬合至單相指數(shù)方程。
圖2示出了在表達(dá)人GLP-1受體的COS-7細(xì)胞中GLP-1(■)、Exendin-4(▲)、TPA144(○)、TPA1B4(◆)和P1732(
)與125I毒蜥外泌肽(exendin)(9-39)結(jié)合(binding)的競(jìng)爭(zhēng)。IC50值對(duì)于GLP-1為1.5nM，對(duì)于TPA 144為36.3nM，對(duì)于TPA 1B4為7.6nM，對(duì)于P 1732為2.5nM，以及對(duì)于Exendin-40為0.4nM。數(shù)據(jù)表示獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并被標(biāo)準(zhǔn)化為競(jìng)爭(zhēng)劑不存在下的125I Exendin(9-39)結(jié)合。
圖3示出了GLP-1受體的活化，如cAMP產(chǎn)生所測(cè)量的。以300nM的濃度測(cè)試肽的激動(dòng)劑活性。數(shù)據(jù)表示平均值+SEM，其中n＝4。
圖4表示在與各種濃度的GLP-1(■)、P1732(
)和Exendin-4(▲)溫育之后在表達(dá)人GLP-1受體的COS-7細(xì)胞中的cAMP產(chǎn)生情況。數(shù)據(jù)值
SEM被繪制并擬合為S形劑量-應(yīng)答曲線。從該擬合曲線得到的EC50值對(duì)于GLP-1、P1732和Exendin-4分別為0.5nM、0.6nM和0.2nM。
圖5示出了葡萄糖降低效應(yīng)的時(shí)程，其中血糖測(cè)量在注射鹽水(●)或8μg GLP-1(■)、TPA1B4(◆)、P1732(
)、DGS65(□)或Exendin-4(▲)之前和在注射鹽水(●)或8μg GLP-1(■)、TPA1B4(◆)、P1732(
)、DGS65(□)或Exendin-4(▲)后所示時(shí)間進(jìn)行。具有P3β-二甲基Asp的TPA1B4被比較于GLP-1(A)，而具有P3和羧基末端修飾的肽類(lèi)似物被比較于exendin-4(B)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定10只小鼠的血糖變化百分比，并對(duì)平均變化±SEM進(jìn)行繪圖。
圖6示出了糖尿病小鼠中由實(shí)施例1的肽表現(xiàn)出的劑量應(yīng)答。血糖測(cè)量在注射各種劑量的TPA1B4(◆)、P1732(
)和Exendin-4(▲)之前進(jìn)行，并在注射后60分鐘時(shí)再次進(jìn)行。在每一個(gè)劑量下，測(cè)定10只小鼠的血糖變化百分比，并對(duì)平均變化±SEM進(jìn)行繪圖。數(shù)據(jù)被擬合成S形劑量應(yīng)答曲線。來(lái)自這些擬合的EC50值(和95％的置信區(qū)間)對(duì)于TPA 1B4為0.4μg(0.1-1.92μg)，對(duì)于P1732為0.5μg(0.4-3.5μg)，以及對(duì)于exendin-4為0.5μg(0.2-1.2μg)。
圖7示出了葡萄糖降低效應(yīng)的時(shí)程，其中血糖測(cè)量注射鹽水(■)或8μg TPA1B4(
)、DGS69(
)或Exendin-4(▲)之前或在注射鹽水(●)或8μg TPA 1B4(
)、DGS69(
)或Exendin-4(▲)后所示時(shí)間進(jìn)行。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定10只小鼠的血糖變化百分比，并對(duì)平均變化±SEM進(jìn)行繪圖。
發(fā)明詳述 I.綜述
本發(fā)明一般地涉及GLP-1類(lèi)似物，其具有增加的體內(nèi)半衰期——例如源自降低的蛋白水解酶切割易感性(susceptibility)和/或增加的GLP-1受體親和性，但仍保留想要的GLP-1活性。具體而言，本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)具有GLP-1樣活性的所述肽的體內(nèi)半衰期可以通過(guò)將一至十五個(gè)(天然或非天然存在的)氨基酸殘基連接到所述肽的羧基末端而被延長(zhǎng)。
本發(fā)明的GLP-1類(lèi)似物具有連接至基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的一至十五個(gè)氨基酸殘基。基礎(chǔ)氨基酸序列是指在用一至十五個(gè)額外的氨基酸殘基修飾之前的氨基酸序列。典型地，基礎(chǔ)氨基酸序列與GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ IDNOS1-4)之一的序列至少50％相同，特別是至少80％相同，至少90％相同，至少95％相同，或甚至100％相同。典型地，序列相同性(identity)在相關(guān)序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)量。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，基礎(chǔ)氨基酸序列是GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ ID NOS1-4)之一，或與GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ ID NOS1-4)之一的區(qū)別在于僅一個(gè)氨基酸殘基。GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ ID NOS1-4)的序列如下 GLP-1-(7-34)HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(SEQ ID NO1) GLP-1-(7-35)HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG(SEQ ID NO2) GLP-1-(7-36)HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO3) GLP-1-(7-37)HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO；4)
添加的氨基酸殘基通常為α-氨基酸殘基。
在某些實(shí)施方式中，所添加的氨基酸殘基的一個(gè)或更多個(gè)(甚至全部)是非天然存在的。如此處所使用，非天然存在的氨基酸是在人DNA中編碼的20個(gè)氨基酸之外的氨基酸?！胺翘烊淮嬖诘摹辈灰鈭D排除在有機(jī)體(例如，人類(lèi)和其它哺乳動(dòng)物)中發(fā)現(xiàn)的所有氨基酸，除非特別指出。
適于在本發(fā)明中使用的示例性非天然存在的氨基酸是具有含芳基側(cè)鏈的那些氨基酸。在某些實(shí)施方式中，含芳基側(cè)鏈具有雙環(huán)或多環(huán)芳基基團(tuán)。在某些實(shí)施方式中，含芳基側(cè)鏈具有兩個(gè)或更多個(gè)芳基，例如聯(lián)苯基(4-苯基-苯基)。具有非天然存在的側(cè)鏈的氨基酸包括聯(lián)苯基甘氨酸、聯(lián)苯基丙氨酸和萘基甘氨酸，其結(jié)構(gòu)如下
在某些實(shí)施方式中，所添加的氨基酸殘基全部是天然存在的。當(dāng)所有的添加的氨基酸都是天然存在的，殘基有利地選自exendin-4的羧基末端(殘基31-39)殘基的一個(gè)或更多個(gè)。Exendin-4是從赫拉毒蜥(Heloderma suspectum)(希拉毒蜥，Gila monster)的唾液分離的肽激素，其在哺乳動(dòng)物中具有葡萄糖降低活性。exendin-4的殘基31-39為 Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO5)。
優(yōu)選地，殘基31-39的至少三個(gè)連續(xù)殘基——例如Pro-Ser-Ser或全部九個(gè)殘基序列，被添加到基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，僅Pro被連接到羧基末端。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，針對(duì)后脯氨酸切割蛋白酶，基礎(chǔ)氨基酸序列在P’1位置(酰胺切割位點(diǎn)的羧基末端側(cè)的殘基)被修飾。該修飾產(chǎn)生相對(duì)于天然GLP-1具有大大降低的對(duì)酶介導(dǎo)切割的易感性的GLP-1類(lèi)似物，該類(lèi)似物仍保持天然GLP-1的生物活性。
典型地，GLP-1類(lèi)似物在(切割位點(diǎn)的)P’1殘基的修飾包括具有四取代的Cβ碳的氨基酸類(lèi)似物的取代。這類(lèi)氨基酸類(lèi)似物顯著增加了所得到的類(lèi)似物的體內(nèi)半衰期，例如，其相對(duì)于野生型多肽可具有更長(zhǎng)的生物作用持續(xù)時(shí)間和/或降低的清除率(例如，更長(zhǎng)的血清半衰期)。
盡管用另一天然存在的氨基酸置換P’1殘基被考慮在內(nèi)，但在優(yōu)選的實(shí)施方式中，P’1殘基被用非天然存在的氨基酸類(lèi)似物置換，甚至更優(yōu)選地，用結(jié)構(gòu)類(lèi)似物置換，所述結(jié)構(gòu)類(lèi)似物例如保持位阻和/或電子性質(zhì)方面的相似特性。為了舉例說(shuō)明，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了修飾的多肽，其被賦予更低的對(duì)后脯氨酸切割蛋白酶如二肽基肽酶IV(DPP-IV)的蛋白水解作用的易感性，其中所述多肽在P’1位置用具有式I的氨基酸或氨基酸類(lèi)似物修飾
其中 R1和R2各自獨(dú)立地表示低碳烷基(lower alkyl)、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、烷氧基、酰胺、羰基、鹵素、羥基、胺或氰基，或者R1和R2一起形成4-7個(gè)原子的環(huán)； R3表示低碳烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、氨基、烷氧基、鹵素、酰胺、羰基、氰基、巰基、硫烷基(thioalkyl)、酰氨基(acylamino)、酰胺基(amido)、氰基、硝基、疊氮基、硫酸酯(sulfate)、磺酸酯、亞磺酰氨基、-(CH2)m-R4、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-O-低碳烷基、-(CH2)m-O-低碳鏈烯基、-(CH2)n-O-(CH2)m-R4、-(CH2)m-S-低碳烷基、-(CH2)m-S-低碳鏈烯基、-(CH2)n-S-(CH2)m-R4、-(CH2)m-N-C(＝NH)NH2、-(CH2)m-C(＝O)NH2或-(CH2)m-NH2； 對(duì)于每一次出現(xiàn)，R4獨(dú)立地表示芳基、芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或雜環(huán)； m＝0、1或2；和 n＝0、1或2。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，R1和R2各自獨(dú)立地表示小疏水基團(tuán)，例如低碳烷基(優(yōu)選甲基、乙基或丙基，以及甚至更優(yōu)選甲基)、鹵素或鹵化低碳烷基。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，R3表示低碳烷基，更優(yōu)選甲基、乙基或丙基，以及甚至更優(yōu)選甲基。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，R3表示芳基，例如苯基或羥苯基(優(yōu)選對(duì)羥基)。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，R3表示羥基。在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，R3表示-(CH2)m-COOH，其中m優(yōu)選是0或1。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，n＝0。
在這類(lèi)底物類(lèi)似物的某些優(yōu)選實(shí)施方式中，P’1是具有四取代的Cβ碳的氨基酸類(lèi)似物，例如式II所表示
其中 R1和R2各自獨(dú)立地表示低碳烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、烷氧基、羰基、酰胺、鹵素、羥基、胺或氰基，或者R1和R2一起形成4-7個(gè)原于的環(huán)； R3表示低碳烷基、雜烷基、氨基、烷氧基、鹵素、酰胺、羰基、氰基、巰基、硫烷基、酰氨基、硝基、疊氮基、硫酸酯、磺酸酯、亞磺酰氨基、-(CH2)m-R4、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-O-低碳烷基、-(CH2)m-O-低碳鏈烯基、-(CH2)n-O-(CH2)m-R4、-(CH2)m-S-低碳烷基、-(CH2)m-S-低碳鏈烯基、-(CH2)n-S-(CH2)m-R4、-(CH2)m-N-C(＝NH)NH2、-(CH2)m-C(＝O)NH2或-(CH2)m-NH2； 對(duì)于每一次出現(xiàn)，R4獨(dú)立地表示芳基、芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或非芳香雜環(huán)基；和 m＝0、1或2。
在某些實(shí)施方式中，R1和R2各自獨(dú)立地表示低碳烷基或鹵素；R3表示低碳烷基、芳基、羥基、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-NH2、-(CH2)m-N-C(＝NH)NH2、-(CH2)m-C(＝O)NH2、-SH或-(CH2)m-S-CH3；以及m＝0、1或2。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，R1和R2各自獨(dú)立地表示甲基、乙基或丙基，以及甚至更優(yōu)選甲基。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，R3表示低碳烷基，更優(yōu)選甲基、乙基或丙基，以及甚至更優(yōu)選甲基。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，R3表示芳基，例如苯基或羥苯基(優(yōu)選對(duì)羥基)、吲哚或咪唑。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，R3表示羥基。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，R3表示-COOH或CH2-COOH。在另一些優(yōu)選實(shí)施方式中，R3表示-CH2-CH2-N-C(＝NH)NH2、-CH2-C(＝O)NH2、-CH2-CH2-C(＝O)NH2、-SH、或-CH2-S-CH3。
具有修飾的P’1殘基的示例性基礎(chǔ)氨基酸序列示于表1中，其中X表示修飾的P’1殘基的位置 表1 天然序列 示例性類(lèi)似物 更具體而言，本發(fā)明特別考慮了具有下列氨基酸序列的GLP-1類(lèi)似物的產(chǎn)生 Xaa-Ala-Yaa-R或Xaa-Pro-Yaa-R’ 其中Xaa和Yaa表示氨基酸殘基，而R和R’每一次出現(xiàn)獨(dú)立地表示具有GLP-1樣活性并包含1至約100個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，其中類(lèi)似物序列Yaa被由式I或式II表示的氨基酸殘基置換。本發(fā)明考慮了序列不同于GLP-1的變體多肽的修飾，以便產(chǎn)生變體P’1類(lèi)似物。這類(lèi)變體與GLP-1-(7-36)至少80％、85％、90％、95％、97％、99％或99％以上相同。
在某些實(shí)施方式中，R是這樣的多肽，其具有選自下列的氨基酸序列 GTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO10)，和 GTFTSDVSSYLEGQAAKKEFIAWLVKGR-NH2(SEQ ID NO11)， 或者5個(gè)或更少的氨基酸殘基與上述序列不同的序列，甚至更優(yōu)選不超過(guò)4、3或甚至2個(gè)氨基酸殘基不同。
優(yōu)選的基礎(chǔ)氨基酸序列是 His-Ala-Xaa-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val- Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys- Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (SEQ ID NO12)， 其中Xaa是β-二甲基天冬氨酸或叔亮氨酸，特別是β-二甲基天冬氨酸。有利地連接于該基礎(chǔ)氨基酸序列的氨基酸包括聯(lián)苯基亮氨酸、Pro-Ser-Ser和Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO5)。
II.定義
肽底物的結(jié)合位點(diǎn)由沿著酶表面的一系列“特異性亞位點(diǎn)(specificity subsites)”組成。術(shù)語(yǔ)“特異性亞位點(diǎn)”是指酶上能夠與酶底物的一部分相互作用的口袋或其它位點(diǎn)。
在討論肽和蛋白質(zhì)底物與蛋白酶如絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶等之間的相互作用時(shí)，本發(fā)明采用了Schechter和Berger[(1967)Biochem.Biophys.Res.Commun.27157-162)]的命名法。底物或抑制劑的各個(gè)氨基酸殘基從氨基末端到羧基末端被稱(chēng)為-P2-P1-P’1-P’2-等等，而酶的相應(yīng)亞位點(diǎn)被稱(chēng)為S2，、S1、S’1、S’2等等。底物的分離鍵(scissilebond)是連接P1和P’1殘基的酰胺鍵。
“P’1殘基”是指底物多肽的氨基酸殘基，其成為由底物多肽的酰胺骨架的蛋白酶介導(dǎo)切割得到的產(chǎn)物多肽的新氨基末端。為進(jìn)一步舉例說(shuō)明，底物多肽包括酰胺骨架鍵，其經(jīng)受下列一般方案所表示的蛋白水解反應(yīng)
術(shù)語(yǔ)“氨基酸殘基”意指氨基酸，通常是α-氨基酸。一般而言，本文用于命名天然存在的氨基酸的縮寫(xiě)基于IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)的建議(參見(jiàn)Biochemistry(1972)111726-1732)。例如，Met、Ile、Leu、Ala和Gly分別表示甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸和甘氨酸的殘基。殘基意指通過(guò)消去羧基的OH部分和α-氨基的H部分衍生自相應(yīng)的α-氨基酸的基團(tuán)(radical)。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸側(cè)鏈”是氨基酸殘基除了骨架之外的那部分，如K.D.Kopple，“Peptides and Amino Acids”，W.A.Benjamin Inc.，NewYork and Amsterdam，1966，第2和33頁(yè)所定義；常見(jiàn)氨基酸的這類(lèi)側(cè)鏈的例子是-CH2CH2SCH3(甲硫氨酸的側(cè)鏈)、-CH2(CH3)-CH2CH3(異亮氨酸的側(cè)鏈)、-CH2CH(CH3)2(亮氨酸的側(cè)鏈)或-H(甘氨酸的側(cè)鏈)。這些側(cè)鏈連接于骨架Cα碳(pendant from the backbone Cαcarbon)。
術(shù)語(yǔ)“四取代Cβ碳”是指這樣的碳原子，其(i)直接連接于氨基酸骨架的Cα碳，和(ii)帶有四個(gè)取代基(包括Cα碳)，其中沒(méi)有一個(gè)是氫。
如此處所使用，“蛋白質(zhì)”是基本上由20個(gè)氨基酸的任意個(gè)的組合組成的多聚體。盡管“多肽”通常在提及相對(duì)大的蛋白質(zhì)時(shí)被使用，而“肽”通常在提及小蛋白時(shí)被使用，但在本領(lǐng)域中這些術(shù)語(yǔ)的使用有所重疊并變化。除非通過(guò)上下文是清楚的，術(shù)語(yǔ)“肽”、“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可互換使用。
對(duì)于肽鍵水解酶的亞型(亞類(lèi)E.C 3.4.)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)國(guó)際聯(lián)合會(huì)(The International Union of Biochemistry and MolecularBiology)(1984)已經(jīng)建議使用術(shù)語(yǔ)“肽酶”。廣泛使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白酶”與“肽酶”同義，并且它們?cè)诒疚闹斜换Q使用。肽酶包括兩組酶內(nèi)肽酶和外肽酶。內(nèi)肽酶切割蛋白質(zhì)內(nèi)位點(diǎn)處的肽鍵，而外肽酶從氨基末端或羧基末端順序除去氨基酸。
術(shù)語(yǔ)“蛋白酶”也用作內(nèi)肽酶的同義詞。蛋白酶根據(jù)它們的催化機(jī)理進(jìn)行分類(lèi)。四種機(jī)理類(lèi)別已經(jīng)被生物化學(xué)和分子生物學(xué)國(guó)際聯(lián)合會(huì)承認(rèn)絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。
術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”，如此處所使用，意指保持保持感興趣的天然底物(例如，GLP-1)的生物活性以便當(dāng)施用于動(dòng)物時(shí)產(chǎn)生類(lèi)似的生物學(xué)效應(yīng)的類(lèi)似物。
術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”是指一種類(lèi)似物，其不保持感興趣的天然底物(例如，GLP-1)的生物活性或至少相對(duì)于天然底物處于降低的活性水平，并抑制天然底物的生物作用。
術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”是指在功能上基本上類(lèi)似于天然肽或蛋白或其片段的分子。
如本文所使用，“說(shuō)明書(shū)”意指描述與試劑盒或包裝藥物的使用有關(guān)的相關(guān)材料或方法的產(chǎn)品標(biāo)簽和/或文件。這些材料科包括如下的任何組合背景信息、成分列表、建議劑量、關(guān)于可能的副作用的警告、施用藥物的說(shuō)明、技術(shù)支持以及任何其它相關(guān)文件。
對(duì)于在治療中使用，化合物例如本發(fā)明的類(lèi)似物的“有效量”是指類(lèi)似物在制劑中的量，當(dāng)其作為期望的劑量方案的一部分被施用(給哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類(lèi))時(shí)，根據(jù)待治療的疾病或病癥或美容目的的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，例如以適于任何醫(yī)學(xué)治療的合理效益/風(fēng)險(xiǎn)比，減輕癥狀、改善病癥或減緩疾病狀況的起始。
術(shù)語(yǔ)“烷基”是指完全飽和的支化或未支化碳鏈基團(tuán)，其具有指定的碳原子數(shù)，或者如果未進(jìn)行說(shuō)明則最多可達(dá)30個(gè)碳原子。例如，“低碳烷基”是指具有1至10個(gè)碳原子的烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、和辛基，以及這些烷基的位置異構(gòu)體。具有10至30個(gè)碳原子的烷基包括癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基和二十四烷基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，直鏈或支鏈烷基在其骨架中具有30個(gè)或更少的碳原子(例如，對(duì)于直鏈為C1-C30，對(duì)于支鏈為C3-C30)，并且更優(yōu)選20個(gè)或更少。同樣，優(yōu)選的環(huán)烷基在它們的環(huán)結(jié)構(gòu)中具有3-10個(gè)碳原子，并且更優(yōu)選在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有5、6或7個(gè)碳。
而且，如在整個(gè)說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例和權(quán)利要求書(shū)中所使用的，術(shù)語(yǔ)“烷基”(或“低碳烷基”)意圖包括未取代的和取代的烷基鏈，后者是指具有取代基的烷基部分，該取代基取代烴骨架的一個(gè)或更多個(gè)碳上的氫。這類(lèi)取代基可包括例如鹵素、羥基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或?；?、硫代羰基(例如硫代酸酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次磷酸酯、氨基、酰氨基、脒、氰基、硝基、巰基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺?；?、亞磺酰氨基、磺?；㈦s環(huán)基、芳烷基、或者芳族部分或雜芳族部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，如果適當(dāng)，在烴鏈上被取代的部分它們本身可以被取代。例如，取代的烷基的取代基可包括取代形式和未取代形式的氨基、疊氮基、亞氨基、酰氨基、磷酰基(包括膦酸酯和次磷酸酯)、磺酰基(包括硫酸酯、亞磺酰氨基、氨磺酰和磺酸酯)和甲硅烷基，以及醚、烷硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸酯和酯)、-CF3、-CN等等。示例性的取代烷基在下面進(jìn)行了描述。環(huán)烷基可用烷基、鏈烯基、烷氧基、烷硫基、氨基烷基、羰基-取代的烷基、-CF3、-CN等等進(jìn)一步取代。
除非碳原子數(shù)另外說(shuō)明，“低碳烷基”，如此處所使用，意指如上所定義的烷基，但在其骨架結(jié)構(gòu)中具有一至十個(gè)碳，更優(yōu)選一至六個(gè)碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。同樣，“低碳鏈烯基”和“低碳炔基”具有類(lèi)似的鏈長(zhǎng)。在整個(gè)申請(qǐng)中，優(yōu)選的烷基是低碳烷基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文稱(chēng)為烷基的取代基是低碳烷基。
“雜烷基基團(tuán)”是一種烷基基團(tuán)，其中一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)部(即，非末端)碳原子被雜原子如氮、氧、硫、磷、硒或硅取代。典型地，雜原子是氮、氧或硫?！半s環(huán)烷基基團(tuán)”是類(lèi)似的環(huán)烷基基團(tuán)，其中碳原子被雜原子取代。
術(shù)語(yǔ)“碳環(huán)”，如此處所使用，是指其中環(huán)的每個(gè)原子都是碳的芳環(huán)或非芳環(huán)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“芳基”包括5-、6-和7-元單環(huán)芳香基團(tuán)，其可包括零至四個(gè)雜原子，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等。這些在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有雜原子的芳基也可被稱(chēng)為“芳基雜環(huán)”或“雜芳族化合物”。芳環(huán)可在一個(gè)或更多個(gè)環(huán)位置用上述的這類(lèi)取代基取代，所述取代基例如鹵素、疊氮基、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、烷氧基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、酰氨基、膦酸酯、次磷酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺?；喕酋０被?、酮、醛、酯、雜環(huán)基、芳族部分或雜芳族部分、-CF3、-CN等等。術(shù)語(yǔ)“芳基”還包括具有兩個(gè)或更多個(gè)環(huán)的多環(huán)體系，其中兩個(gè)或更多個(gè)碳由兩個(gè)相鄰環(huán)共用(環(huán)是“稠合環(huán)”)，其中至少一個(gè)環(huán)是芳香性的，例如，另一些環(huán)可以是環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基。
“鏈烯基”是指任何支化的或未支化的不飽和碳鏈基團(tuán)，其具有指定的碳原子數(shù)，或者如果未說(shuō)明對(duì)碳原子數(shù)的限制可達(dá)26個(gè)碳原子；并在基團(tuán)中具有1個(gè)或多個(gè)雙鍵。具有6至26個(gè)碳原子的鏈烯基由下列示例各種形式的己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基和二十四碳烯基，其中不飽和鍵(一個(gè)或多個(gè))可位于基團(tuán)內(nèi)任意位置且對(duì)于雙鍵(一個(gè)或多個(gè))可具有(Z)或(E)構(gòu)型。
術(shù)語(yǔ)“炔基”是指鏈烯基的范圍的烴基團(tuán)(radical)，但在基團(tuán)內(nèi)具有1個(gè)或多個(gè)三鍵。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“烷氧基(alkoxyl或alkoxy)”是指烷基基團(tuán)，如下所定義，其具有連接于其上的氧基。代表性的烷氧基基團(tuán)包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等?！懊选笔怯裳豕矁r(jià)連接的兩個(gè)烴。因此，烷基的取代基——其使得該烷基成為醚——是烷氧基或類(lèi)似烷氧基，例如可由-O-烷基、-O-鏈烯基、-O-炔基、-O-(CH2)m-R1所表示，其中m和R1在下面加以描述。
術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基(heterocyclyl或heterocyclic group)”是指3-至10-元環(huán)結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選3-至7-元環(huán)，其環(huán)結(jié)構(gòu)包括一至四個(gè)雜原子。雜環(huán)還可以是多環(huán)。雜環(huán)基包括例如噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、異苯并呋喃、色烯、呫噸、吩噻(phenoxathiin)、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、中氮茚(indolizine)、異吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、喹啉、2，3-二氮雜萘、1，5-二氮雜萘、喹喔啉，喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩噁嗪、吡咯烷、四氫呋喃(oxolane)、四氫噻吩、噁唑、哌啶、哌嗪、嗎啉、內(nèi)酯、內(nèi)酰胺如β-丙內(nèi)酰胺和吡咯烷酮、磺內(nèi)酰胺、磺內(nèi)酯等等。雜環(huán)可在一個(gè)或多個(gè)環(huán)位置用上述的這類(lèi)取代基取代，所述取代基例如鹵素、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、酰氨基、磷酸酯、膦酸酯、次磷酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、氨磺酰、亞磺酰、醚、烷硫基、磺?；⑼?、醛、酯、雜環(huán)基、芳族部分或雜芳族部分、-CF3、-CN等等。
術(shù)語(yǔ)“烷硫基”是指烷基基團(tuán)，如上所定義，具有連接于其上的硫基。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，“烷硫基”部分由-(S)-烷基、-(S)-鏈烯基、-(S)-炔基和-(S)-(CH2)m-R1之一所代表，其中m和R1在下面加以定義。代表性的烷硫基基團(tuán)包括甲硫基、乙硫基等。
如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“硝基”意指-NO2；術(shù)語(yǔ)“鹵素”表示-F、-Cl、-Br或-I；術(shù)語(yǔ)“巰基”(“sulfhydryl”或“thiol”)意指-SH；術(shù)語(yǔ)“羥基”意指-OH；以及術(shù)語(yǔ)“磺?；币庵?SO2-。
術(shù)語(yǔ)“胺”和“氨基”是領(lǐng)域公知的，是指未取代和取代的胺，例如可由下列通式表示的部分
其中R3、R5和R6各自獨(dú)立表示氫、烷基、鏈烯基、-(CH2)m-R1，或者R3和R5與它們連接在其上的N原子一起完成在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有4至8個(gè)原子的雜環(huán)；R1表示鏈烯基、芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基或多環(huán)基；以及m是零或1至8的范圍中的整數(shù)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，僅R3或R5之一可以是羰基，例如R3、R5和氮一起不形成二酰亞胺。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，R3和R5(以及任選地，R6)各自獨(dú)立表示氫、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R1。因此，如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“烷基胺”意指胺基團(tuán)，如上所定義，具有連接于其上的取代或未取代烷基，即，R3和R5的至少一個(gè)是烷基基團(tuán)。在某些實(shí)施方式中，氨基或烷基胺是堿性的，意味著它具有pKa≥7.00。這些官能團(tuán)的質(zhì)子化形式具有相對(duì)于水在7.00以上的pKa。
術(shù)語(yǔ)“羰基”是領(lǐng)域公知的，并包括如下列通式所表示的這類(lèi)部分
其中X是鍵或者表示氧或硫，而R7表示氫、烷基、鏈烯基、-(CH2)m-R1或藥學(xué)上可接受的鹽，R8表示氫、烷基、鏈烯基、-(CH2)m-R1，其中m和R1如上所定義。在X是氧且R7或R8不是氫的情況下，該式子表示“酯”。在X是氧且R7如上所定義的情況下，該部分在本文被稱(chēng)為羧基，以及尤其當(dāng)R7是氫時(shí)，該式子表示“羧酸”。在X是氧且R8是氫的情況下，該式子表示“甲酸酯”。一般而言，在上式的氧原子被硫取代的情況下，該式子表示“硫代羰基”基團(tuán)。在X是硫且R7或R8不是氫的情況下，該式子表示“硫代酸酯”基團(tuán)。在X是硫且R7是氫的情況下，該式子表示“硫代羧酸”基團(tuán)。在X是硫且R8是氫的情況下，該式子表示“硫代甲酸酯”基團(tuán)。另一方面，在X是鍵且R7不是氫的情況下，上式表示“?；被鶊F(tuán)。在X是鍵且R7是氫的情況下，上式表示“醛”基團(tuán)。
如此處所使用，術(shù)語(yǔ)“取代的”考慮包括有機(jī)化合物的所有容許的取代基。在寬的方面，容許的取代基包括有機(jī)化合物的無(wú)環(huán)的和環(huán)狀的、支化的和未支化的、碳環(huán)的和雜環(huán)的、芳族的和非芳族取代基。說(shuō)明性取代基包括例如本文中上面描述的那些取代基。對(duì)于合適的有機(jī)化合物，容許的取代基可以是一個(gè)或多個(gè)并且可相同或不同。為了本發(fā)明的目的，雜原子例如氮可具有氫取代基和/或任何本文描述的有機(jī)化合物容許取代基，其滿(mǎn)足雜原子的化合價(jià)。本發(fā)明不意圖以任何方式受限于有機(jī)化合物的容許取代基。應(yīng)當(dāng)理解，“取代”或“用......取代”包括暗含的條件這類(lèi)取代與被取代的原子和取代基所允許的化合價(jià)一致，并且取代產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物，例如，其不會(huì)自發(fā)地經(jīng)歷轉(zhuǎn)變，例如通過(guò)重排、環(huán)化、消去等進(jìn)行的轉(zhuǎn)變。
術(shù)語(yǔ)“氨磺?！笔穷I(lǐng)域公知的(art-recognized)并包括可由下列通式表示的部分
其中R3和R5如上所定義。
術(shù)語(yǔ)“硫酸酯”是領(lǐng)域公知的并包括可由下列通式表示的部分
其中R7如上所定義。
術(shù)語(yǔ)“亞磺酰氨基”是領(lǐng)域公知的并包括可由下列通式表示的部分
其中R2和R4如上所定義。
術(shù)語(yǔ)“磺酸酯”是領(lǐng)域公知的并包括可由下列通式表示的部分
其中R7是電子對(duì)、氫、烷基、環(huán)烷基或芳基。
術(shù)語(yǔ)“亞砜基”或“亞磺?！保绱颂幩褂?，是指可由下列通式表示的部分
其中R12選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳烷基或芳基。
類(lèi)似的取代可對(duì)鏈烯基和炔基基團(tuán)進(jìn)行，以產(chǎn)生例如氨基鏈烯基、氨基炔基、酰胺鏈烯基、酰胺炔基、亞氨基鏈烯基、亞氨基炔基、硫代鏈烯基、硫代炔基、羰基取代的鏈烯基或炔基。
如此處所使用，每一表達(dá)方式，例如烷基、m、n等，的定義，當(dāng)該表達(dá)方式在任何結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一次以上時(shí)，意圖獨(dú)立于其在該同一結(jié)構(gòu)中其它位置的定義。
為了本發(fā)明的目的，化學(xué)元素根據(jù)CAS版本，Handbook ofChemistry and Physics，67th Ed.，1986-87的內(nèi)封面的元素周期表加以鑒定。同樣為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“烴”考慮包括具有至少一個(gè)氫和一個(gè)碳原子的所有容許的化合物。在寬的方面，容許的烴包括無(wú)環(huán)和環(huán)狀的、支化和未支化的、碳環(huán)和雜環(huán)的、芳族和非芳族的有機(jī)化合物，其可以是取代或未取代的。
III.示例性實(shí)施方式 (a)類(lèi)似物的特性
在許多實(shí)施方式中，類(lèi)似物將被選擇，以保持天然底物的體外或體內(nèi)活性的一種或更多種。體外和體內(nèi)活性可采用適于特定類(lèi)似物的、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可利用的任何方案加以測(cè)量?？杀粶y(cè)量以確定類(lèi)似物是否保持相同或相似功能活性的示例性功能活性包括類(lèi)似物在基于細(xì)胞的測(cè)定或無(wú)細(xì)胞測(cè)定中結(jié)合其受體(一種或多種)的能力、類(lèi)似物誘導(dǎo)應(yīng)答于GLP-1的細(xì)胞變化(例如，增殖、分化、存活、生長(zhǎng)、遷移等等)、類(lèi)似物調(diào)節(jié)在細(xì)胞中應(yīng)答于GLP-1的一個(gè)或更多個(gè)其它基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)的能力。
在某些實(shí)施方式中，類(lèi)似物具有與天然GLP-1或其片段基本上相似的活性(例如，活性為天然GLP-1的大約80％、90％、100％、110％或120％)。在一些實(shí)施方式中，類(lèi)似物活性較天然GLP-1低(例如，活性為該天然多肽的大約50％、60％、70％或75％)。我們注意到，如果活性降低仍提供在足夠的時(shí)間期間內(nèi)提供足夠的類(lèi)似物局部濃度的能力，活性稍微低一些的類(lèi)似物可能是有用的，例如在體內(nèi)或在細(xì)胞培養(yǎng)物中。因此，例如通過(guò)蛋白酶抗性得到的半衰期增加可補(bǔ)償類(lèi)似物的構(gòu)建所導(dǎo)致的活性降低。在另外的實(shí)施方式中，類(lèi)似物比天然GLP-1活性更強(qiáng)(例如，活性為天然GLP-1的大約130％、150％、175％、200％、300％、500％、800％或甚至1000％)。在前述的任一種中，“活性”意指天然GLP-1的一種或多種功能。例如，類(lèi)似物的活性(例如，生物功能)可以是受體結(jié)合、作為轉(zhuǎn)錄激活子或抑制子起作用的能力、參與特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的能力、或影響細(xì)胞行為(例如，增殖、分化、存活或遷移)的能力。
這類(lèi)活性可被例如表示為相對(duì)結(jié)合常數(shù)(例如用于受體結(jié)合)、有效濃度(EC50)和/或有效劑量(ED50)。
示例性的類(lèi)似物相比于天然GLP-1具有增加的半衰期(或作用持續(xù)時(shí)間)(體外和/或體內(nèi))。然而，一般應(yīng)當(dāng)理解，各種類(lèi)似物將具有不同的半衰期(以及不同的、相對(duì)于天然GLP-1的半衰期變化)。體外和/或體內(nèi)半衰期(或作用持續(xù)時(shí)間)可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法例如葡萄糖降低效應(yīng)的時(shí)程由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員方便地加以測(cè)量。在某些實(shí)施方式中，類(lèi)似物具有這樣的體外或體內(nèi)半衰期(作用持續(xù)時(shí)間)，其在相似的半衰期測(cè)量分析條件下是天然多肽的體外和/或體內(nèi)半衰期的大約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.3、1.5、2、3、5、10、25、30、50、75、100或甚至高于100的倍數(shù)。
(b)肽激素類(lèi)似物的合成
本發(fā)明的類(lèi)似物可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)固相合成法加以制備；參見(jiàn)，例如Stewart，J.M.，et al.，Solid Phase Synthesis(Pierce Chemical Co.，2ded.1984)。如通常所知，具有必要長(zhǎng)度的肽可采用商業(yè)可得的設(shè)備和試劑加以制備，遵照生產(chǎn)商的說(shuō)明，以阻斷干擾基團(tuán)、保護(hù)待反應(yīng)的氨基酸、偶聯(lián)、去保護(hù)和帽化未反應(yīng)的殘基。合適的設(shè)備可從例如FosterCity，Calif的Applied BioSystems或San Raphael，Calif.的BiosearchCorporation獲得。
在優(yōu)選的方法中，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)固相合成法合成類(lèi)似物，該自動(dòng)固相合成法利用具有合適的側(cè)鏈保護(hù)的叔丁氧基羰基-α-氨基酸。完成的類(lèi)似物從固相載體除去，同時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的氟化氫法進(jìn)行側(cè)鏈去保護(hù)。使用在0.1％三氟乙酸(TFA)中的乙腈梯度，通過(guò)半制備反相-HPLC(Vydac C18)進(jìn)一步純化粗制類(lèi)似物。類(lèi)似物被真空干燥以除去乙腈，并從0.1％TFA水溶液冷凍干燥出來(lái)。通過(guò)分析性RP-HPLC確認(rèn)純度。肽被凍干，然后按重量計(jì)以1-2mg/mL的濃度溶解在水或0.01M乙酸中。
如果非編碼氨基酸或D型氨基酸存在于類(lèi)似物中，則前述合成方法的使用是需要的。然而，對(duì)于可以被基因編碼的類(lèi)似物，也可求助于重組技術(shù)，其在商業(yè)可得的表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用容易合成的DNA序列。
(c)功能測(cè)定
評(píng)價(jià)候選類(lèi)似物是否抗蛋白水解的各種方法是本領(lǐng)域中可得的。例如，特定蛋白酶切割類(lèi)似物的能力可在體外無(wú)細(xì)胞體系中加以測(cè)定。在無(wú)細(xì)胞測(cè)定體系的一個(gè)這樣的實(shí)施方式中，候選底物(例如，類(lèi)似物和/或天然多肽)用可檢測(cè)的標(biāo)記如放射性進(jìn)行末端標(biāo)記。標(biāo)記的底物在蛋白酶存在下進(jìn)行溫育。隨著時(shí)間的過(guò)去，反應(yīng)混合物的樣品可被停止，并進(jìn)行跑膠。放射性條帶的大小變化表明多肽被蛋白酶切割，且該變化發(fā)生的速率指示多肽被蛋白酶切割的速率。該速率可與用天然多肽觀察到的速率相比。
為進(jìn)一步舉例說(shuō)明，測(cè)試特定類(lèi)似物的示例性實(shí)驗(yàn)包括下列內(nèi)容。天然多肽(GLP-1)和推定類(lèi)似物各自被放射性標(biāo)記(注意為了標(biāo)記的目的，全部的必要條件是多肽的切割產(chǎn)生其大小不同于全長(zhǎng)的標(biāo)記多肽的放射性片段)。標(biāo)記的天然多肽和類(lèi)似物與特定的蛋白酶一起溫育。在溫育之后，天然多肽和類(lèi)似物都通過(guò)凝膠電泳加以分離，并檢測(cè)標(biāo)記物質(zhì)的遷移。由于已知該特定蛋白酶切割所述天然多肽，所以期望將觀察到標(biāo)記的天然多肽片段的大小變化(在與酶溫育前后)，其中較小的片段相應(yīng)于切割產(chǎn)物。然而，如果類(lèi)似物抗蛋白水解，那么與蛋白酶溫育后遷移率的變化將或者不發(fā)生，或者將發(fā)生得比天然蛋白質(zhì)的蛋白水解慢得多。
相比于切割天然多肽，蛋白酶切割類(lèi)似物的相對(duì)能力也可在基于細(xì)胞的體外系統(tǒng)中進(jìn)行評(píng)價(jià)。在一個(gè)這類(lèi)基于細(xì)胞的測(cè)定中，表達(dá)給定蛋白酶的細(xì)胞與天然多肽或類(lèi)似物接觸，使得天然多肽和類(lèi)似物存在于細(xì)胞中。與在上述的無(wú)細(xì)胞測(cè)定中類(lèi)似，天然多肽和類(lèi)似物被可檢測(cè)地標(biāo)記。天然多肽和類(lèi)似物的切割可通過(guò)從細(xì)胞提取蛋白質(zhì)并測(cè)量標(biāo)記蛋白質(zhì)的遷移加以測(cè)量和比較。
在基于細(xì)胞的測(cè)定的進(jìn)一步的例子中，不表達(dá)給定蛋白酶的細(xì)胞與可檢測(cè)地標(biāo)記的天然多肽或類(lèi)似物接觸，使得天然多肽或類(lèi)似物在所述細(xì)胞中表達(dá)。所述細(xì)胞與特定蛋白酶進(jìn)一步接觸，使得所述蛋白酶在所述細(xì)胞中表達(dá)。天然多肽和類(lèi)似物的切割可通過(guò)從細(xì)胞提取蛋白質(zhì)并測(cè)量標(biāo)記蛋白質(zhì)的遷移加以測(cè)量和比較。
在前述基于細(xì)胞的測(cè)定中的任何一種中，本發(fā)明考慮使用許多原代細(xì)胞或細(xì)胞系的任何一種。在一些情況下，選擇特定的細(xì)胞或細(xì)胞系來(lái)在其中進(jìn)行體外分析可能是有利的。例如，在一些情況下，選擇這樣的細(xì)胞系可能是有利的，該細(xì)胞系與最終希望在其中應(yīng)用類(lèi)似物的細(xì)胞類(lèi)型更緊密相關(guān)。然而，在其它情況下，可能最有用的是在主要根據(jù)方便性而選擇的、可能不相關(guān)的細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞系中進(jìn)行候選類(lèi)似物的初步篩選和測(cè)試，然后根據(jù)需要在更特定的細(xì)胞系中或在動(dòng)物模型中進(jìn)行安全性和有效性測(cè)試。
除了無(wú)細(xì)胞測(cè)定和基于細(xì)胞的測(cè)定，特定類(lèi)似物的蛋白酶抗性可利用許多動(dòng)物模型的任何一種進(jìn)行體內(nèi)測(cè)量。給定類(lèi)似物的初步蛋白水解測(cè)試可在野生型動(dòng)物中進(jìn)行評(píng)價(jià)。在這類(lèi)初步測(cè)試期間，類(lèi)似物的潛在正效應(yīng)或負(fù)效應(yīng)并不是問(wèn)題，而問(wèn)題是特定的類(lèi)似物是否抗蛋白水解。使用上述的無(wú)細(xì)胞測(cè)定、基于細(xì)胞的測(cè)定或體內(nèi)測(cè)定的任何一種，一旦特定類(lèi)似物顯示出抗蛋白水解，則可進(jìn)行類(lèi)似物的進(jìn)一步體外和體內(nèi)測(cè)試，以確定類(lèi)似物的治療有效性。
其它測(cè)定可用于評(píng)價(jià)類(lèi)似物的具體功能活性。這類(lèi)測(cè)定可基于特定類(lèi)似物進(jìn)行選擇。對(duì)于本GLP-1類(lèi)似物，類(lèi)似物的功能活性可通過(guò)測(cè)量類(lèi)似物在無(wú)細(xì)胞測(cè)定或基于細(xì)胞的測(cè)定中結(jié)合其受體的能力并將其與天然肽激素的能力比較來(lái)加以評(píng)價(jià)。在這些例子的任何一個(gè)中，功能活性還可以在動(dòng)物模型中進(jìn)行測(cè)量，例如測(cè)定血糖或胰島素水平的那些。
下列例證性例子提供了類(lèi)似物功能活性的可能的評(píng)估方法。
I.促胰島活性測(cè)定
活性GLP-1肽7-34、7-35、7-36和7-37具有促胰島活性，本發(fā)明提供制備這些活性GLP-1肽的肽類(lèi)似物的方法。GLP-1肽類(lèi)似物對(duì)蛋白質(zhì)水解的抗性可被容易地測(cè)定。另外，GLP-1肽類(lèi)似物的功能活性可通過(guò)檢測(cè)該肽激素類(lèi)似物的促胰島素性能加以證明。促胰島素活性可被測(cè)定，例如通過(guò)將給定肽類(lèi)似物提供至動(dòng)物細(xì)胞或者將該類(lèi)似物注射到動(dòng)物中，并分別監(jiān)測(cè)免疫反應(yīng)性胰島素(IRI)向培養(yǎng)基或動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)的釋放。IRI的存在可通過(guò)利用可特異性檢測(cè)胰島素的放射免疫測(cè)定加以檢測(cè)。
db/db小鼠是遺傳性肥胖和糖尿病株小鼠。該db/db小鼠伴隨其肥胖的發(fā)展而發(fā)展高血糖癥和高胰島素血癥，從而用作肥胖2型糖尿病(NIDDM)的模型。例如，db/db小鼠可從The Jackson Laboratories(Bar Harbor，Me.)購(gòu)買(mǎi)。在示例性的實(shí)施方式中，為用包括肽激素類(lèi)似物或?qū)φ盏姆桨钢委熜∈?，?duì)每只動(dòng)物在給藥之前和在給藥之后一定時(shí)間(如，60分鐘)采集眼窩竇(sub-orbital sinus)血樣。血糖測(cè)量可通過(guò)幾種常規(guī)技術(shù)的任一種來(lái)進(jìn)行，例如使用葡萄糖儀。比較對(duì)照和肽激素類(lèi)似物給藥的動(dòng)物的血糖水平。
外源GLP-1類(lèi)似物的代謝命運(yùn)也可在非糖尿病或II型糖尿病受試者中進(jìn)行追蹤，且測(cè)定候選類(lèi)似物的效果。例如，可使用高壓液相色譜(HPLC)、特異性放射免疫測(cè)定(RIAs)和酶聯(lián)免役吸附測(cè)定(ELISA)的組合，由此完整的生物活性GLP-1和其代謝物可被檢測(cè)。參見(jiàn)，例如Deacon等.(1995)Diabetes 441126-1131。為舉例說(shuō)明，在GLP-1類(lèi)似物施用后，完整肽可使用NH2-末端定向的(NH2-terminallydirected)RIA或ELISA進(jìn)行測(cè)量，盡管在這些實(shí)驗(yàn)之間的濃度差異和COOH末端特異性RIA允許測(cè)定NH2-末端截短的代謝物。在沒(méi)有類(lèi)似物的情況下，皮下GLP-1以時(shí)間依賴(lài)方式迅速降解，形成在HPLC上與GLP-1-(9-36)酰胺共洗脫并具有相同免疫反應(yīng)性特征的代謝物。例如，在向糖尿病患者(n＝8)皮下施用GLP-1后三十分鐘，代謝物占由COOH-末端RIA測(cè)定的血漿免疫反應(yīng)性增加的88.5+1.9％，這高于在健康受試者中測(cè)量的水平(78.4+3.2％；n＝8；P＜0.05)。參見(jiàn)Deacon等，如前述。靜脈內(nèi)輸注的GLP-I也被廣泛降解。
測(cè)量GLP-1類(lèi)似物的促胰島素活性的其它方法被公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利5,545,618中。
(d)藥物制劑
為了治療用途，所選擇的類(lèi)似物與載體一起配制，所述載體是藥學(xué)上可接受的并適于使用所選施用途徑所適用的劑量來(lái)向受試者施用治療有效量的所述類(lèi)似物以便將肽輸送到所需組織，所述施用途徑即經(jīng)口、靜脈內(nèi)或腸胃外。在某些實(shí)施方式中，類(lèi)似物是非熱原性的，即不引發(fā)高于臨床可接受量的患者體溫升高。合適的藥學(xué)上可接受載體是傳統(tǒng)上與肽類(lèi)藥物一起使用的那些，例如稀釋劑、賦形劑等。對(duì)于藥物制劑方面的一般性指導(dǎo)，可參考″Remington′sPharmaceutical Sciences″，17th Ed.，Mack Publ ishing Company，Easton，Pa.，1985。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，化合物被配制，用于通過(guò)輸注施用，例如，當(dāng)用作完全腸胃外營(yíng)養(yǎng)療法中患者的液體營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑時(shí)，或者通過(guò)注射施用，例如皮下、肌肉內(nèi)成靜脈內(nèi)注射時(shí)，并因此被用作無(wú)菌和無(wú)熱原形式的水溶液，且可選地緩沖至生理上可耐受的pH，例如稍微酸性pH或生理pH。因此，所述化合物可以在載體例如蒸餾水中被施用，或者更期望地，在鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水或5％的葡萄糖溶液中被施用。如需要，類(lèi)似物的水溶性可通過(guò)摻入例如乙酸或氫氧化鈉等助溶劑而增強(qiáng)。
本發(fā)明的類(lèi)似物可用藥學(xué)上可接受的鹽的形式來(lái)提供。這類(lèi)鹽的例子包括但不限于用有機(jī)酸(例如，乙酸、乳酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、甲磺酸或甲苯磺酸)、無(wú)機(jī)酸(例如，鹽酸、硫酸或磷酸)和高分子酸(例如，丹寧酸、羧甲基纖維素、聚乳酸、聚羥基乙酸或聚乳酸-羥基乙酸的共聚物)形成的那些鹽。
治療有效量的本發(fā)明類(lèi)似物和藥學(xué)上可接受載體物質(zhì)(例如碳酸鎂、乳糖、或與該治療類(lèi)似物可形成膠束的磷脂)一起形成治療組合物(例如，丸劑、片劑、膠囊或液體)，用于施用(例如，經(jīng)口、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、肺部、陰道、皮下、經(jīng)鼻、用離子透入(iontophoretically)、氣管內(nèi)、顱內(nèi)、心肌內(nèi)、心包內(nèi)、肌肉內(nèi))給受試者。經(jīng)口施用的丸劑、片劑或膠囊可用物質(zhì)進(jìn)行包衣，用于在一段足以使活性組合物未經(jīng)消化地進(jìn)入小腸的時(shí)間內(nèi)保護(hù)所述活性組合物在胃中免受胃酸或腸酶破壞。治療組合物還可以是生物可降解的或非生物可降解的緩釋制劑的形式，用于皮下或肌肉內(nèi)施用。參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利3,773,919和4,767,628以及PCT公開(kāi)號(hào)WO 94/15587。使用可植入的泵或外部泵(例如，INFUSAIDTM泵)，也可實(shí)現(xiàn)持續(xù)施用。施用也可被間歇地進(jìn)行——例如每日一次注射，或以低劑量連續(xù)進(jìn)行，例如緩釋制劑。
本發(fā)明的治療或診斷組合物以足以治療或診斷疾病的量被施用至個(gè)體。用于治療上述疾病或紊亂的本發(fā)明的肽的有效量根據(jù)給藥方式、受試者的年齡和體重、待治療受試者的狀況而變化，并最終由主治醫(yī)生或獸醫(yī)決定。
還被考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是上述通式所覆蓋的肽，其用于治療與異常葡萄糖代謝、脂代謝或進(jìn)食障礙相關(guān)的疾病或紊亂。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)通過(guò)詳細(xì)的描述和權(quán)利要求書(shū)將變得明顯。
(e)使用方法 1.診斷應(yīng)用
本發(fā)明的類(lèi)似物可以被放射標(biāo)記的或未標(biāo)記的形式用于診斷或治療多種疾病狀態(tài)，包括但不限于與葡萄糖代謝、脂類(lèi)代謝和食物攝取相關(guān)的那些。
優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物的放射標(biāo)記復(fù)合物被用于這類(lèi)診斷和治療中。本發(fā)明化合物的放射標(biāo)記的實(shí)施方式可用在放射性同位素指導(dǎo)的手術(shù)(radioisotope guided surgery)中，如在WO 93/18797和Woltering，et al.(1994)Surgery 116，1139-1147中所述。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，例如99Tc等的γ-發(fā)射放射性核素和本發(fā)明的化合物的復(fù)合物被用于診斷SSTR-表達(dá)腫瘤，隨后，例如188Re或186Re等的β-發(fā)射放射性核素與所述化合物的復(fù)合物被用于治療腫瘤。
為了診斷目的，診斷有效量的本發(fā)明的診斷劑或放射診斷劑被施用，優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。診斷有效量被定義為利用常規(guī)方法例如磁共振、計(jì)算機(jī)化斷層X(jué)線攝影法、γ閃爍法、SPECT、PET等實(shí)現(xiàn)體內(nèi)標(biāo)記的定位和檢測(cè)所必需的診斷劑或放射診斷劑的量。
為了使用閃爍成像進(jìn)行診斷，優(yōu)選地，本發(fā)明的99Tc標(biāo)記化合物以單個(gè)單位可注射劑量給藥。本發(fā)明提供的99Tc標(biāo)記化合物可在用于靜脈內(nèi)注射的任何常規(guī)介質(zhì)如鹽水介質(zhì)中或在血漿介質(zhì)中被靜脈內(nèi)施用。一般而言，待施用的單位劑量具有約0.01mCi至約100mCi的放射活性，優(yōu)選1mCi至50mCi。以單位劑量注射的溶液為約0.01mL至約10mL。在靜脈內(nèi)施用之后，體內(nèi)成像可在大概數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生。然而，如果需要，成像可在放射性標(biāo)記化合物被注射入患者后數(shù)小時(shí)或甚至更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)發(fā)生。在大多數(shù)情況下，所施用劑量的足夠量將在大約0.1小時(shí)內(nèi)在待成像區(qū)內(nèi)積累，允許進(jìn)行閃爍照相。用于診斷目的的任何常規(guī)閃爍成像方法都可根據(jù)本發(fā)明被采用。
2.治療方法
本發(fā)明的類(lèi)似物提供了治療任何可用給出的治療組合物治療的疾病或狀況的改進(jìn)方法，其中“母體”多肽通常被蛋白酶體內(nèi)切割。假設(shè)蛋白水解降低或消除了治療劑的可獲得性(availability)，并且在一些情況下導(dǎo)致功能上拮抗產(chǎn)物的產(chǎn)生，則許多可用于治療特定疾病和狀況的多肽治療劑的安全性和功效大大受損。因此，本發(fā)明的方法和類(lèi)似物的組合物提供了治療許多不同疾病和狀況的改進(jìn)方法。
本發(fā)明的類(lèi)似物在一些實(shí)施方式中具有降低血糖水平的能力，以緩解肥胖、減輕受損的葡萄糖耐受、抑制肝葡萄糖再生和降低血脂水平(例如，游離脂肪酸)以及抑制醛糖還原酶。本發(fā)明的類(lèi)似物，在一些實(shí)施方式中，還能夠增加胰島增殖和再生、增加葡萄糖依賴(lài)性胰島素分泌、增加胰島素生物合成、降低胰高血糖素分泌、延遲胃排空、降低食物攝取和/或食欲、增加心臟功能(例如，左心室射血分?jǐn)?shù))、增加心率、增加收縮血壓、降低血管阻力(舒張血壓)、增加外周血流、增加高鈉血癥患者的鈉排泄(例如，降低Na依賴(lài)性高血壓)、降低局部缺血/再灌注損傷(例如，在心肌梗塞之后降低梗塞尺寸)、降低神經(jīng)毒生(例如，與谷氨酸鹽或紅藻氨酸鹽興奮性中毒相關(guān)的神經(jīng)毒性)、降低凋亡(例如，在神經(jīng)元中)、降低β-淀粉狀蛋白的流行性和增加空間和/或聯(lián)想學(xué)習(xí)。因此，尤其是，它們可用于預(yù)防和/或治療高血糖、肥胖、血脂過(guò)多、糖尿病并發(fā)癥(包括視網(wǎng)膜病、腎病、神經(jīng)病、白內(nèi)障、冠狀動(dòng)脈疾病和動(dòng)脈硬化)、心臟病、心肌梗塞、循環(huán)障礙、神經(jīng)退行性疾病(例如，阿爾茨海默病、杭廷頓氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化)以及用于預(yù)防和/或治療肥胖相關(guān)的高血壓和骨質(zhì)疏松癥。因此，本發(fā)明的一方面是治療患者或受試者的疾病的方法，包括施用治療有效量的本文公開(kāi)的一種或多種GLP-1類(lèi)似物。
當(dāng)施用給患有糖尿病包括I型和II型糖尿病但尤其是II型的患者時(shí)，GLP-1肽的類(lèi)似物特別有用。糖尿病是一種疾病，其特征在于由相對(duì)或絕對(duì)降低的胰島素分泌、降低的胰島素敏感性或胰島素抗性而發(fā)生的高血糖。該疾病的發(fā)病率和死亡率是由血管、腎臟和神經(jīng)的并發(fā)癥所致?？诜咸烟悄褪茉囼?yàn)是用于診斷糖尿病的臨床試驗(yàn)。在口服葡萄糖耐量試驗(yàn)中，患者對(duì)葡萄糖荷載或激發(fā)(challenge)的生理應(yīng)答被評(píng)價(jià)。在攝入葡萄糖后，患者對(duì)葡萄糖激發(fā)的生理應(yīng)答被評(píng)價(jià)。通常，這通過(guò)在幾個(gè)預(yù)定時(shí)間點(diǎn)測(cè)定患者血糖水平(患者血漿、血清或全血中的葡萄糖濃度)來(lái)完成。
因此，在一方面，本發(fā)明涉及治療劑和蛋白水解抗性的GLP-1類(lèi)似物在治療高血糖、肥胖、血脂過(guò)多、糖尿病并發(fā)癥(包括視網(wǎng)膜病、腎病、神經(jīng)病、白內(nèi)障、冠狀動(dòng)脈疾病和動(dòng)脈硬化)以及用于肥胖相關(guān)的高血壓和骨質(zhì)疏松癥中的相關(guān)用途。
本發(fā)明考慮了類(lèi)似物在所述類(lèi)似物單獨(dú)組成治療方案的治療方法中的用途，以及在采用施用作為更復(fù)雜的多因子治療方案的一部分的一種或多種類(lèi)似物的治療方法中的用途。例如，在糖尿病和/或糖尿病并發(fā)癥的治療方法的情況下，本發(fā)明考慮了通過(guò)施用GLP-1類(lèi)似物治療糖尿病的方法。本發(fā)明進(jìn)一步考慮在一些情況下，施用一種以上的類(lèi)似物可能是優(yōu)選的。例如，治療方法可包括施用兩種或更多種類(lèi)似物。而且，本發(fā)明考慮一種或多種類(lèi)似物的施用可被用作復(fù)雜治療方案的一部分。在糖尿病或糖類(lèi)病并發(fā)癥的治療方法的情況下，示例性的治療方案可以包括施用一種或多種類(lèi)似物、施用胰島素、飲食調(diào)節(jié)和鍛煉調(diào)節(jié)。
在多面性治療方案的進(jìn)一步的例子中，本發(fā)明考慮了施用一種或多種類(lèi)似物和一種或多種抑制內(nèi)源性切割天然蛋白質(zhì)的特定酶的酶活的藥劑。在GLP-1的情況下，示例性方法將包括施用一種或多種類(lèi)似物和一種或多種DPP IV抑制劑。特定酶的抑制劑可以是特異性的(例如，僅調(diào)節(jié)DPP IV的活性的抑制劑)或者抑制劑可以是更混雜的(例如，調(diào)節(jié)多種絲氨酸蛋白酶活性的抑制劑)。此外，本發(fā)明考慮了施用一種或多種類(lèi)似物和降解內(nèi)源性切割天然蛋白質(zhì)的特定酶的一種或多種酶。在GLP-1的情況下，示例性的方法將包括施用一種或多種類(lèi)似物和一種或多種降解DPP IV的酶。這類(lèi)酶可以是特異性的(例如僅降解DPP IV的酶)或所述酶可降解多種其它蛋白質(zhì)(例如，降解幾種絲氨酸蛋白酶的酶)。
(f)商業(yè)方法
本發(fā)明的其它方面提供了進(jìn)行商業(yè)行為的某些方法。具體而言，實(shí)踐本發(fā)明的方法可鑒別某些GLP-1類(lèi)似物。該技術(shù)步驟，當(dāng)與一個(gè)或多個(gè)其它步驟相結(jié)合時(shí)，提供了進(jìn)行制藥上、農(nóng)用化學(xué)品上、生物技術(shù)上或優(yōu)選地生命科學(xué)上的商業(yè)行為的新方法。例如，根據(jù)本發(fā)明的類(lèi)似物可被檢測(cè)作為各種疾病模型中的治療劑的功效，然后該潛在治療組合物可在所得到的疾病治療制劑的配制、包裝和隨后的市場(chǎng)化之前被檢測(cè)其毒性和其它安全特性?；蛘?，開(kāi)發(fā)和銷(xiāo)售這類(lèi)制劑或進(jìn)行這類(lèi)步驟的權(quán)利可被許可給第三方進(jìn)行考量。在本發(fā)明的某些其它方面，由此鑒定的類(lèi)似物能夠以可提供給第三方考量的信息的形式而具有實(shí)用性，從而獲得對(duì)所述類(lèi)似物在生物或治療背景中的功能或副作用的增強(qiáng)理解。
在某些實(shí)施方式中，初步鑒定的類(lèi)似物可經(jīng)歷進(jìn)一步的優(yōu)化，例如，以進(jìn)一步精修前導(dǎo)類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)。這類(lèi)優(yōu)化可導(dǎo)致這樣的類(lèi)似物的開(kāi)發(fā)，所述類(lèi)似物結(jié)合了最長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間和其它期望的藥理學(xué)特征，包括溶解性、滲透性、生物利用度、毒性、致突變性和藥代動(dòng)力學(xué)。
通常對(duì)前導(dǎo)類(lèi)似物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以解決關(guān)于上述參數(shù)的問(wèn)題。然而，這些修飾必須考慮對(duì)類(lèi)似物的效能和活性的可能影響。例如，如果在動(dòng)物模型中測(cè)試時(shí)前導(dǎo)藥物的毒性高，則對(duì)所述類(lèi)似物進(jìn)行修飾，以努力降低毒性同時(shí)保持期望的特性。
候選類(lèi)似物(所述類(lèi)似物是否被修飾以改變或改善體內(nèi)特性)或其組合必須在動(dòng)物模型中測(cè)試其功效和毒性。這類(lèi)治療劑測(cè)驗(yàn)(therapeutic profiling)通常在制藥領(lǐng)域中被采用。在人中測(cè)試實(shí)驗(yàn)治療劑之前，大量的治療劑測(cè)驗(yàn)(臨床前試驗(yàn))必須被完成，以建立安全性和功效的初步參數(shù)。臨床前試驗(yàn)通過(guò)體外(即，在試管、燒杯、培養(yǎng)皿等中)和在動(dòng)物中進(jìn)行的研究，建立了治療劑的作用機(jī)制、其生物利用度、吸收、分布、代謝和清除。動(dòng)物研究被用于評(píng)價(jià)治療劑是否將提供期望的結(jié)果。不同劑量的實(shí)驗(yàn)治療劑被施用，以測(cè)試治療劑的功效、鑒定可能發(fā)生的有害副作用以及評(píng)價(jià)毒性。
簡(jiǎn)言之，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，候選類(lèi)似物的鑒定是開(kāi)發(fā)可用于施用的藥物制劑的第一步。施用對(duì)治療病癥或疾病有效的一定量的包含所述類(lèi)似物的藥物制劑必須是安全且有效的。本領(lǐng)域常規(guī)使用的早期藥物試驗(yàn)有助于解決對(duì)潛在藥物的安全性和功效的疑慮。在類(lèi)似物的具體情況下，藥物制劑的功效可首先在細(xì)胞培養(yǎng)物中接著在小鼠或大鼠模型中容易地進(jìn)行評(píng)價(jià)。適于給定類(lèi)似物將被應(yīng)用的具體疾病適應(yīng)癥的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和動(dòng)物模型可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地進(jìn)行選擇。簡(jiǎn)言之，小鼠或大鼠可在不同的時(shí)間方案內(nèi)被施用變化劑量的所述藥物制劑?；谒巹┑木唧w特性和所述類(lèi)似物期望輸送的細(xì)胞類(lèi)型，施用途徑可被合適地選擇。對(duì)照小鼠可被施用安慰劑(例如，單獨(dú)的載體或賦形劑)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，治療劑測(cè)驗(yàn)的步驟包括類(lèi)似物在細(xì)胞培養(yǎng)物中和在動(dòng)物中的毒性試驗(yàn)；候選類(lèi)似物的藥代動(dòng)力學(xué)和代謝的分析；和在疾病動(dòng)物模型中的藥效測(cè)定。在某些情況下，所述方法可包括分析結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系并基于功效、安全性和藥代動(dòng)力學(xué)特征優(yōu)化前體類(lèi)似物。這類(lèi)步驟的目標(biāo)是選擇類(lèi)似物候選物，用于臨床前試驗(yàn)，以便在人臨床試驗(yàn)之前向FDA提交Investigational New Drug申請(qǐng)(″IND″)。
在前導(dǎo)優(yōu)化和治療劑測(cè)驗(yàn)之間，一個(gè)目標(biāo)是開(kāi)發(fā)具有相對(duì)于天然GLP-1和其片段作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)并可在具有最小副作用的情況下施用的類(lèi)似物。在體外應(yīng)用的類(lèi)似物的情況下，示例性的類(lèi)似物對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞不應(yīng)當(dāng)是異常毒性的，且對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞不應(yīng)當(dāng)是致突變的。在體內(nèi)應(yīng)用的類(lèi)似物的情況下，示例性的類(lèi)似物不應(yīng)當(dāng)是異常毒性的(例如，當(dāng)施用給患者時(shí)應(yīng)當(dāng)僅具有可耐受的副作用)，不應(yīng)當(dāng)是致突變性的，且不應(yīng)當(dāng)是致癌的。
毒性測(cè)驗(yàn)意指對(duì)當(dāng)施用有效量的藥物制劑時(shí)可能發(fā)生的潛在有害副作用的評(píng)價(jià)。副作用可以是有害的或可以不是有害的，而確定與藥物制劑相關(guān)的副作用是否是可接受的副作用由Food and DrugAdministration在管理批準(zhǔn)過(guò)程期間進(jìn)行。該確定并不按照硬性和快速的規(guī)定，什么是可接受的副作用基于下列因素而變化(a)正治療的病癥的嚴(yán)重程度，和(b)其它治療的可利用性和與這類(lèi)可利用的治療當(dāng)前相關(guān)的副作用。例如，術(shù)語(yǔ)癌癥包括與失控的細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化相關(guān)的疾病狀態(tài)的復(fù)雜家族。許多形式的癌癥是導(dǎo)致嚴(yán)重疼痛、受影響組織的功能缺失以及死亡的極具破壞性的疾病?；焺┦窃S多形式的癌癥的標(biāo)準(zhǔn)療法的重要組成部分。盡管化療劑本身可具有許多副作用，包括脫發(fā)、嚴(yán)重的惡心、體重下降和不育，考慮到它們要治療的疾病的嚴(yán)重性，這類(lèi)副作用被認(rèn)為是可接受的。在本發(fā)明的背景中，副作用是否被認(rèn)為是顯著的將取決于待治療的病癥和其它治療該病癥的其他方法的可利用性(availability)。
毒性試驗(yàn)可與功效試驗(yàn)一前一后進(jìn)行，施用有效劑量的藥物制劑的小鼠可被監(jiān)測(cè)其對(duì)所述制劑的不利反應(yīng)。
一種或多種類(lèi)似物，其在動(dòng)物研究中被證明是安全和有效的，可被配制成藥物制劑。然后，這類(lèi)藥物制劑可被上市、分配和銷(xiāo)售。示例性的類(lèi)似物和這類(lèi)類(lèi)似物的藥物制劑可被單獨(dú)上市和銷(xiāo)售，或可作為藥物包裝和/或試劑盒進(jìn)行銷(xiāo)售。而且，在任何前述的方面，基于一種或多種類(lèi)似物的設(shè)計(jì)進(jìn)行商業(yè)行為的方法可任選地包括向患者和/或患者的保險(xiǎn)提供商收費(fèi)的系統(tǒng)，以及從患者和/或患者的保險(xiǎn)提供商收集適當(dāng)付款的系統(tǒng)。
實(shí)施例
下列的實(shí)施例以舉例說(shuō)明的方式而不是限制的方式被示出。
實(shí)施例1 GLP-1類(lèi)似物的作用持續(xù)時(shí)間
DPP-IV從在倒數(shù)第二位置(P2)處具有Pro或Ala的肽上切割N端二肽。非天然氨基酸叔亮氨酸(Tle)—其具有叔側(cè)鏈β-碳——的插入大大降低了切割速率。這在使用三種同源肽Ala-Pro-Leu-Ser-Trp-Ser-NH2、Ala-Pro-Ile-Ser-Trp-Ser-NH2和Ala-Pro-Tle-Ser-Trp-Ser-NH2——它們僅在P3殘基的側(cè)鏈原子的排列上有所不同——的圖1A中得到證明。在含Leu和Ile的肽的切割速率之間幾乎沒(méi)有區(qū)別(半衰期分別為49分鐘和41分鐘)。對(duì)于含Tle肽在30分鐘的消化期間未觀察到反應(yīng)。
已知DPP IV切割在P2位置具有Ala且在P3位置具有Glu的GLP-1。其中Tle取代P3Glu殘基的GLP-1類(lèi)似物對(duì)于DPP IV的降解是穩(wěn)定的(圖1B)。已知Glu殘基對(duì)于GLP-1受體結(jié)合和激活是重要的。因此，我們合成了在P3具有β-二甲基Asp(DMA)的另一類(lèi)似物。該修飾維持在天然序列中發(fā)現(xiàn)的酸性基團(tuán)，但引入叔β-碳。如在圖1B中所示，Tle-取代的和β-DMA-取代的GLP-1類(lèi)似物對(duì)于DPP IV的降解是抗性的，所述GLP-1類(lèi)似物的半衰期在1000分鐘以上，與其相比，天然Glp-1的半衰期為96分鐘。
盡管GLP-1的P3殘基的修飾穩(wěn)定了該肽，但是該修飾也降低了受體親和性。然而，將exendin-4的氨基酸殘基連接到該肽的羧基末端提高了該修飾肽對(duì)于GLP-1受體的親和性并在很大程度上補(bǔ)償了P3修飾所導(dǎo)致的損失(圖2)。將GLP-1的P3處的Glu殘基變成Tle以產(chǎn)生被稱(chēng)為T(mén)PA 144的肽，導(dǎo)致對(duì)GLP-1受體的親和性相比于GLP-1降低20倍。IC50從GLP-1的1.5nM增加到TPA 144的36.3nM。當(dāng)P3殘基是β-二甲基Asp以形成TPA1B4時(shí)，親和性?xún)H降低大約5倍。TPA 1B4具有7.6nM的IC50。向TPA 1B4序列的末端添加exendin-4的羧基末端9個(gè)殘基，以形成P1732，補(bǔ)償了P3DMA殘基的親和性損失。P1732的親和性顯著不同于GLP-1的親和性(P1732的IC50為2.5nM，GLP-1的IC50為1.5nM)。exendin-4與GLP-1受體的結(jié)合被測(cè)量，用于比較。相比于GLP-1，該肽的結(jié)合具有小但顯著的親和性增加，因?yàn)閑xendin-4結(jié)合GLP-1受體的IC50值為0.4nM。
GLP-1的修飾不影響肽功效(圖3)。在高肽濃度下，GLP-1受體激活的量，如cAMP產(chǎn)生所測(cè)量，對(duì)于GLP-1、TPA 144、TPA 1B4和P1732是相同的。因此，具有P3修飾的P3GLP-1類(lèi)似物作為GLP-1受體的完全激動(dòng)劑起作用。羧基末端延伸的進(jìn)一步延伸不減少該激動(dòng)劑活性。通過(guò)測(cè)量受體激活的EC50值，P1732的體外效能被測(cè)量，并與GLP-1和exendin-4比較(圖4)。具有組合的氨基和羧基末端修飾的GLP-1類(lèi)似物維持正常效能，具有0.4-1.1nM的EC50，與其相比，GLP-1具有0.3-0.8nM的EC50。Exendin-4具有稍微低于GLP-1的EC50(0.1-0.5nM)。
相比于GLP-1，DPP IV抗性的GLP-1類(lèi)似物已延長(zhǎng)了作用持續(xù)時(shí)間(圖5A)。在注射后30分鐘，GLP-1降低了db小鼠的血糖，但在60分鐘時(shí)，該效應(yīng)大部分消失。相比之下，DPP IV抗性類(lèi)似物TPA1B4在30分鐘時(shí)顯示了相似的效應(yīng)，但注射后血糖持續(xù)降低達(dá)60分鐘。在60分鐘時(shí)的血糖值在正常小鼠所觀察到的范圍之內(nèi)。該效應(yīng)持續(xù)達(dá)至少90分鐘。4小時(shí)后，血糖值回復(fù)到對(duì)照動(dòng)物中觀察到的高血糖值。
Exendin-4比GLP-1或DPP IV抗性類(lèi)似物TPA1B4具有顯著更長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間。注射后，db小鼠血糖值被降低達(dá)至少4小時(shí)(圖5B)。通過(guò)添加9殘基C-末端延伸以形成P1732，對(duì)血糖的效應(yīng)等價(jià)于exendin-4的效應(yīng)。為測(cè)試整個(gè)9殘基延伸對(duì)于作用持續(xù)時(shí)間的這種效應(yīng)而言是否是必需的，用P3β-DMA和相應(yīng)于exendin-4的殘基31-33(Pro-Ser-Ser)的3殘基羧基末端延伸制備GLP-1類(lèi)似物DGS65。就像exendin-4和P1732一樣，該肽將db小鼠血糖降至正常值達(dá)至少4小時(shí)，并在8小時(shí)后回復(fù)至高血糖水平。
Exendin-4與DPP IV抗性的GLP-1類(lèi)似物P1732和TPA1B4被施用給db小鼠，劑量在0.008μg至80μg的范圍內(nèi)，以確定葡萄糖降低效應(yīng)的劑量依賴(lài)性。在注射后60分鐘測(cè)量血糖，其對(duì)應(yīng)于8μg劑量下的最大效應(yīng)的時(shí)間。所有三種肽都表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性(圖6)，并具有相似的EC50值exendin-4為0.5μg，P1732為1.1μg，以及TPA1B4為0.4μg。
實(shí)施例1的結(jié)果被概述在表2中。
表2 實(shí)施例2 具有羧基末端的非天然發(fā)生的氨基酸殘基的GLP-1類(lèi)似物的作用持續(xù)時(shí)間
肽DGS69同源于DPP IV抗性的GLP-1類(lèi)似物TPA1B4。這兩種肽在位置3都含有β-二甲基Asp，這使得它們都抵抗DPP IV的降解。DGS69和TPA1B4的不同之處在于不常見(jiàn)氨基酸聯(lián)苯基丙氨酸(Bip)被添加到羧基末端。該單個(gè)殘基的添加顯著增加了糖尿病小鼠中的血糖降低效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間。該作用時(shí)程與TPA1B4和Exendin-4作用時(shí)程在圖7中進(jìn)行了比較。肽的結(jié)構(gòu)如下 GLP-1 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2(SEQ ID NO3) Exendin-4 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-[NH2] (SEQ ID NO8) TPA1B4 HAXGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2(SEQ ID NO12) DGS69 HAXGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRZ-NH2(SEQ ID NO13) X＝β-二甲基Asp(DMA) Z＝聯(lián)苯基丙氨酸(Bip)
總之，向DPP IV抗性的GLP-1類(lèi)似物的羧基末端添加單個(gè)非天然氨基酸賦予了長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間，基本上等于Exendin-4的作用持續(xù)時(shí)間。
所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用以這樣的程度被全部并入本文好比每個(gè)單獨(dú)出版物、專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)被具體和單獨(dú)地指出其通過(guò)引用被全部并入。
等價(jià)物
只是使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或能夠確定本文所描述的化合物和其使用方法的許多等價(jià)物。這類(lèi)等價(jià)物被認(rèn)為落在本發(fā)明的范圍內(nèi)并被下面的權(quán)利要求書(shū)所覆蓋。
權(quán)利要求
1.一種多肽類(lèi)似物，包括
a)與GLP-1-(7-34)、G LP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ ID NOS1-4)之一至少80％相同的基礎(chǔ)氨基酸序列；和
b)連接到所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的一至十五個(gè)氨基酸殘基，
其中，相較于天然GLP-1，所述類(lèi)似物在人類(lèi)體內(nèi)具有更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間的GLP-1樣活性。
2.一種多肽類(lèi)似物，包括
a)與GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ ID NOS1-4)之一至少80％相同的基礎(chǔ)氨基酸序列；和
b)連接到所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的一至十五個(gè)氨基酸殘基，
其中GLP-1受體對(duì)所述類(lèi)似物比對(duì)天然GLP-1具有更大親和性。
3.一種多肽類(lèi)似物，包括
a)與GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ ID NOS1-4)之一至少50％相同的基礎(chǔ)氨基酸序列，其中在所述基礎(chǔ)氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于GLP-1的P’1殘基的氨基酸殘基是具有四取代Cβ碳的氨基酸類(lèi)似物；和
b)連接到所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的一至十五個(gè)氨基酸殘基，
其中，相較于天然GLP-1，所述類(lèi)似物在人類(lèi)體內(nèi)具有更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間的GLP-1樣活性。
4.一種多肽類(lèi)似物，包括
a)與GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ ID NOS1-4)之一至少50％相同的基礎(chǔ)氨基酸序列，其中在所述基礎(chǔ)氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于GLP-1的P’1殘基的氨基酸殘基是具有四取代Cβ碳的氨基酸類(lèi)似物；和
b)連接到所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的一至十五個(gè)氨基酸殘基，
其中GLP-1受體對(duì)所述類(lèi)似物比對(duì)天然GLP-1具有更大親和性。
5.如權(quán)利要求3或4所述的類(lèi)似物，其中相對(duì)于GLP-1，與所述P’1殘基相對(duì)應(yīng)的所述殘基降低了所述類(lèi)似物對(duì)于蛋白酶切割的易感性。
6.如權(quán)利要求5所述的蛋白酶抗性類(lèi)似物，其中與所述P’1殘基相對(duì)應(yīng)的所述殘基由下式表示
其中
R1和R2各自獨(dú)立地表示低碳烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、烷氧基、羰基、酰胺、鹵素、羥基、胺或氰基，或者R1和R2一起形成4-7個(gè)原子的環(huán)；
R3表示低碳烷基、雜烷基、氨基、烷氧基、鹵素、酰胺、羰基、氰基、巰基、硫烷基、酰氨基、硝基、疊氮基、硫酸酯、磺酸酯、亞磺酰氨基、-(CH2)m-R4、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-O-低碳烷基、-(CH2)m-O-低碳鏈烯基、-(CH2)n-O-(CH2)m-R4、-(CH2)m-S-低碳烷基、-(CH2)m-S-低碳鏈烯基、-(CH2)n-S-(CH2)m-R4、-(CH2)m-N-C(＝NH)NH2、-(CH2)m-C(＝O)NH2或-(CH2)m-NH2；
對(duì)于每一次出現(xiàn)，R4獨(dú)立地表示芳基、芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或非芳香族的雜環(huán)基；并且
m＝0、1或2。
7.如權(quán)利要求6所述的類(lèi)似物，其中R1和R2各自獨(dú)立地表示低碳烷基或鹵素；且R3表示低碳烷基、芳基、羥基、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-NH2、-(CH2)m-N-C(＝NH)NH2、-(CH2)m-C(＝O)NH2、-SH或-(CH2)m-S-CH3。
8.如權(quán)利要求7所述的類(lèi)似物，其中R1和R2各自獨(dú)立地表示甲基、乙基或丙基。
9.如權(quán)利要求8所述的類(lèi)似物，其中R1和R2各自表示甲基。
1O.如權(quán)利要求8所述的類(lèi)似物，其中R3表示低碳烷基、苯基、羥基苯基、吲哚、咪唑、羥基、-COOH、-CH2-COOH、-CH2-CH2-N-C(＝NH)NH2、-CH2-C(＝O)NH2、-CH2-CH2-C(＝O)NH2、-SH或-CH2-S-CH3。
11.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的類(lèi)似物，其中所述類(lèi)似物保持GLP-1的生物活性的至少50％。
12.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的類(lèi)似物，其中一個(gè)或多個(gè)非天然存在的氨基酸殘基被連接到所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端。
13.如權(quán)利要求12所述的類(lèi)似物，其中所述非天然存在的氨基酸殘基具有含芳基的側(cè)鏈。
14.如權(quán)利要求13所述的類(lèi)似物，其中所述非天然存在的氨基酸是聯(lián)苯基丙氨酸。
15.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的類(lèi)似物，其中連接于所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的所述氨基酸殘基選自exendin-4的氨基酸殘基31-39。
16.如權(quán)利要求15所述的類(lèi)似物，其中連接到所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的氨基酸殘基是選自exendin-4的氨基酸殘基31-39的三個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。
17.如權(quán)利要求16所述的類(lèi)似物，其中連接到所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的所述氨基酸殘基是Pro-Ser-Ser。
18.如權(quán)利要求16所述的類(lèi)似物，其中連接到所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的氨基酸殘基是Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO5)。
19.如權(quán)利要求3或4所述的類(lèi)似物，其中所述類(lèi)似物具有與GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ IDNOS1-4)之一至少80％相同的基礎(chǔ)氨基酸序列。
20.如權(quán)利要求19所述的類(lèi)似物，其中所述類(lèi)似物具有與GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ IDNOS1-4)之一至少90％相同的基礎(chǔ)氨基酸序列。
21.如權(quán)利要求20所述的類(lèi)似物，其中所述類(lèi)似物具有與GLP-1-(7-34)、GLP-1-(7-35)、GLP-1-(7-36)和GLP-1-(7-37)(SEQ IDNOS1-4)之一至少95％相同的基礎(chǔ)氨基酸序列。
22.如權(quán)利要求21所述的類(lèi)似物，其中所述類(lèi)似物具有下列基礎(chǔ)氨基酸序列
His-Ala-Xaa-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg(SEQ ID NO12)，
其中Xaa是β-二甲基天冬氨酸或叔亮氨酸。
23.如權(quán)利要求1或2所述的類(lèi)似物，其中所述類(lèi)似物具有的基礎(chǔ)氨基酸序列與GLP-1-(7-36)序列(SEQ ID NO3)相差不超過(guò)一個(gè)殘基。
24.如權(quán)利要求24所述的類(lèi)似物，其中所述類(lèi)似物具有與GLP-1-(7-36)(SEQ ID NO3)相同的基礎(chǔ)氨基酸序列。
25.藥物組合物，其包括如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的類(lèi)似物，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
26.包裝的藥物制劑，其包括如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的類(lèi)似物，和藥學(xué)上可接受的載體；以及用于對(duì)患者施用的標(biāo)簽、說(shuō)明書(shū)或標(biāo)簽和說(shuō)明書(shū)。
27.包裝的獸用制劑，其包括如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的類(lèi)似物，和藥學(xué)上可接受的載體；以及用于對(duì)動(dòng)物施用的標(biāo)簽、說(shuō)明書(shū)或標(biāo)簽和說(shuō)明書(shū)。
28.在需要治療的患者中治療胰島素抗性、葡萄糖不耐受、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、血脂過(guò)多和糖尿病并發(fā)癥的一種或多種的方法，包括施用治療有效量的如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的類(lèi)似物。
29.增加與GLP-1至少80％相同的肽在人體內(nèi)的半衰期的方法，包括將一至十五個(gè)氨基酸殘基連接到所述肽的羧基末端。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述氨基酸殘基是非天然存在的。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中至少所述非天然存在的氨基酸殘基具有含芳基的側(cè)鏈。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中至少所述非天然存在的氨基酸殘基是聯(lián)苯基丙氨酸。
33.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述氨基酸殘基選自exendin-4的氨基酸殘基31-39。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述氨基酸殘基是選自exendin-4的氨基酸殘基31-39的三個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述氨基酸殘基是Pro-Ser-Ser。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述氨基酸殘基是Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO5)。
37.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述肽與GLP-1-(7-36)序列(SEQ ID NO3)相差不超過(guò)一個(gè)氨基酸殘基。
全文摘要
本發(fā)明的多肽類(lèi)似物，包括a)與GLP-1片段之一至少80％相同的基礎(chǔ)氨基酸序列；和b)連接到所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的氨基酸殘基，其中所述類(lèi)似物具有比天然GLP-1更長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的GLP-1樣活性，和/或GLP-1受體對(duì)所述類(lèi)似物比對(duì)天然GLP-1具有更大親和性。本發(fā)明的其它多肽類(lèi)似物包括a)與GLP-1片段至少50％相同的基礎(chǔ)氨基酸序列，其中在所述基礎(chǔ)氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于GLP-1的P＇1殘基的氨基酸殘基是具有四取代Cβ碳的氨基酸類(lèi)似物；和b)連接到所述基礎(chǔ)氨基酸序列的羧基末端的氨基酸殘基，其中所述類(lèi)似物具有上述的性質(zhì)。本發(fā)明還包括施用這些類(lèi)似物的治療方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101262874SQ200680033105
公開(kāi)日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2006年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月8日
發(fā)明者W·W·巴喬夫欽, D·G·桑福德 申請(qǐng)人:塔夫茨大學(xué)信托人