專利名稱：Akt活性抑制劑的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及是一種或者多種絲氨酸/蘇氨酸激酶同工酶Akt(亦稱PKB；以下稱為“Akt”)活性的抑制劑的化合物。本發(fā)明還涉及含有所述化合物的藥物組合物以及在癌癥治療中使用本發(fā)明化合物的方法。
細(xì)胞凋亡(細(xì)胞程序死亡)在胚胎發(fā)育和在多種疾病(比如退化神經(jīng)元疾病、心血管疾病和癌癥等)的發(fā)病機(jī)理中都起著至關(guān)重要的作用。近期的研究已經(jīng)使得參與程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)或執(zhí)行的多種促凋亡基因產(chǎn)物和抗凋亡基因產(chǎn)物得到了確認(rèn)。抗凋亡基因的表達(dá)，例如Bc12或Bc1-xL的表達(dá)，抑制多種刺激誘導(dǎo)的凋亡性細(xì)胞死亡。另一方面，促凋亡基因的表達(dá)，例如Bax或Bad的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡(Aams等人，Science，2811322-1326(1998))。程序性細(xì)胞死亡的執(zhí)行是由與胱天蛋白酶(caspase)-1相關(guān)蛋白酶介導(dǎo)的，包括胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-9等(Thornberry等人，Science，2811312-1316(1998))。
磷脂酰肌醇3′-OH激酶(PI3K)/Akt途徑對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞存活/細(xì)胞死亡顯得很重要(Kulik等人，Mol.Cell.Biol.171595-1606(1997)；Franke等人，Cell，88435-437(1997)；Kauffmann-Zeh等人，Nature 385544-548(1997)；Hemmings Science，275628-630(1997)；Dudek等人，Science，275661-665(1997))。存活因子，例如血小板衍生生長因子(PDGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，通過誘導(dǎo)PI3K的活性，促進(jìn)細(xì)胞在各種條件下的存活(Kulik等人，1997，Hemmings 1997)?；罨疨I3K導(dǎo)致磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸(PtdIns(3，4，5)-P3)產(chǎn)生，磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸繼而與含有血小板白細(xì)胞C激酶底物同源(PH)結(jié)構(gòu)域的絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt結(jié)合，并促進(jìn)其活化(Franke等人，Cell，81727-736(1995)；HemmingsScience，277534(1997)；Downward，Curr.Opin.Cell Biol.10262-267(1998)；Alessi等，EMBO J.156541-6551(1996))。PI3K特異性抑制劑或顯性失活A(yù)kt突變體破壞了這些生長因子或細(xì)胞因子促進(jìn)存活的活性。先前已經(jīng)公開，PI3K抑制劑(LY294002或渥曼青霉素)通過上游激酶阻斷Akt的活化。另外，在細(xì)胞正常經(jīng)歷凋亡性細(xì)胞死亡的條件下，結(jié)構(gòu)活性PI3K或Akt突變體的導(dǎo)入促進(jìn)細(xì)胞存活(Kulik等人，1997，Dudek等人，1997)。
第二信使調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt亞家族的3個(gè)成員已經(jīng)得到了鑒定，并分別稱之為Akt1/PKα、Akt2/PKBβ和Akt3/PKBγ(在下文分別稱為“Akt1”、“Akt2”和“Akt3”)。同工酶是同源的，特別是在編碼催化結(jié)構(gòu)域的區(qū)域是同源的。通過響應(yīng)PI3K信號(hào)發(fā)生的磷酸化作用，Akt得到激活。PI3K使膜肌醇磷脂磷酸化，產(chǎn)生已經(jīng)表明會(huì)結(jié)合到Akt的PH域上的第二信使磷脂酰-肌醇3，4，5-三磷酸和磷脂酰肌醇3，4-二磷酸。Akt激活的當(dāng)前模型提出，通過3′-磷酸化磷酸肌醇將酶補(bǔ)充到膜上，并在膜上通過上游激酶，產(chǎn)生Akt調(diào)節(jié)位點(diǎn)的磷酸化作用(B.A.Hemmings，Science 275628-630(1997)；B.A.Hemmings，Science 276534(1997)；J.Downward，Science 279673-674(1998))。
Akt1磷酸化發(fā)生在兩個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn)，催化結(jié)構(gòu)域活化環(huán)上的Thr308和靠近羧基端的Ser473(D.R.Alessi等人，EMBO J.156541-6551(1996)和R.Meier等人，J.Biol.Chem.27230491-30497(1997))。在Akt2和Akt3中存在同等的調(diào)節(jié)磷酸化位點(diǎn)。在活化環(huán)位點(diǎn)使Akt磷酸化的上游激酶被克隆，稱為3′-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)。PDK1不僅使Akt磷酸化，而且可使p70核糖體S6激酶、p90RSK、血清及糖皮質(zhì)素調(diào)節(jié)激酶(SGK)和蛋白激酶C磷酸化。對(duì)近羧基端的Akt調(diào)節(jié)位點(diǎn)磷酸化的上游激酶尚未得到鑒定，但近期的報(bào)告提示該酶對(duì)于整聯(lián)蛋白偶聯(lián)性激酶(ILK-1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶或自身磷酸化的作用。
對(duì)人類腫瘤中Akt水平的分析表明，在為數(shù)眾多的卵巢癌(J.Q.Cheng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.899267-9271(1992))和胰腺癌(J.Q.Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.933636-3641(1996))中，Akt2都過量表達(dá)。類似地，還發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞系和前列腺癌細(xì)胞系中，Akt3過量表達(dá)(Nakatani等人，J.Biol.Chem.27421528-21532(1999))。
腫瘤抑制劑PTEN，一種特異性去除PtdIns(3，4，5)-P3中3′磷酸的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)磷酸酶，是PI3K/Akt途徑的負(fù)調(diào)節(jié)劑(Li等人，Science2751943-1947(1997)，Stambolic等人，Cell 9529-39(1998)，Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.966199-6204(1999))。PTEN的種系突變是造成人類癌癥綜合征的原因，例如Cowden病(Liaw等人，NatureGenetics 1664-67(1997))。很大比例的人類腫瘤中的PTEN缺失，且無功能性PTEN的腫瘤細(xì)胞系顯示活化Akt的水平升高(Li等人，出處同上，Guldberg等人，Cancer Research 573660-3663(1997)，Risinger等人，Cancer Research 574736-4738(1997))。
這些觀察結(jié)果表明，在腫瘤發(fā)生中，PI3K/Akt途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活或細(xì)胞凋亡中起著重要作用。
通過使用例如LY294002和渥曼青霉素等抑制劑抑制PI3K，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Akt活化和Akt活性的抑制。但是，PI3K抑制可能不加區(qū)別地影響不僅所有3個(gè)Akt同工酶，而且影響依賴于PdtIns(3，4，5)-P3的含有PH結(jié)構(gòu)域的其它信號(hào)分子，例如酪氨酸激酶的Tec家族。另外，已經(jīng)公開，Akt可被與PI3K無關(guān)的生長信號(hào)激活。
另外，可通過阻斷上游激酶PDK1的活性抑制Akt活性。尚無特異性PDK1抑制劑的報(bào)道。再者，抑制PDK1可能導(dǎo)致抑制其活性依賴于PDK1的許多蛋白激酶，例如，非典型PKC同工酶、SGK和S6激酶(Williams等，Curr.Biol.10439-448(2000))。
本發(fā)明的目標(biāo)是提供新穎的Akt抑制劑化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供包含新穎的Akt抑制劑化合物的藥物組合物。
本發(fā)明的目標(biāo)還在于提供治療癌癥的方法，包括給藥所述Akt活性抑制劑。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供抑制Akt活性的化合物。特別是，本發(fā)明公開的化合物選擇性地抑制一種或者兩種Akt同工酶。本發(fā)明還提供了包含所述抑制性化合物的組合物和通過將所述化合物給藥至需要治療癌癥的患者而抑制Akt活性的方法。
發(fā)明詳述 本發(fā)明化合物可以用于抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt的活性。在本發(fā)明第一實(shí)施方案中，Akt活性抑制劑表示為式A
其中 a為0或者1；b為0或者1；m為0、1或者2；n為0、1、2、3或者4；p為0、1、2、3、4或者5；和t為2、3、4、5或者6； u、v、w和x獨(dú)立地選自CH和N； y和z獨(dú)立地選自CH和N，條件是y和z中至少一個(gè)是N； 環(huán)K選自(C3-C8)環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，條件是環(huán)K不是苯基； R1獨(dú)立地選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、(C＝O)aOb-芳基、(C＝O)aOb(C2-C10)烯基、(C＝O)aOb(C2-C10)炔基、CO2H、鹵素、OH、Ob(C1-C6)全氟烷基、(C＝O)aNR7R8、CN、(C＝O)aOb(C3-C8)環(huán)烷基、S(O)2NR7R8、S(O)2-(C1-C10)烷基和(C＝O)aOb-雜環(huán)基，所述烷基、芳基、烯基、炔基、環(huán)烷基和雜環(huán)基任選被一個(gè)或者多個(gè)選自R6的取代基取代； R2獨(dú)立地選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、(C＝O)aOb-芳基、(C＝O)aOb(C2-C10)烯基、(C＝O)aOb(C2-C10)炔基、CO2H、鹵素、OH、Ob(C1-C6)全氟烷基、(C＝O)aNR7R8、CN、(C＝O)aOb(C3-C8)環(huán)烷基、S(O)2NR7R8、S(O)2-(C1-C10)烷基和(C＝O)aOb-雜環(huán)基，所述烷基、芳基、烯基、炔基、環(huán)烷基和雜環(huán)基任選被一個(gè)或者多個(gè)選自R6的取代基取代； R3和R4獨(dú)立地選自H、(C1-C6)烷基和(C1-C6)全氟烷基，或者R3和R4可以合起來形成-(CH2)t-其中一個(gè)碳原子任選被選自O(shè)、S(O)m、-N(Rb)C(O)-和-N(CORa)-的部分替換； R5選自NR7R8； R6為(C＝O)aObC1-C10烷基、(C＝O)aOb芳基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、(C＝O)aOb雜環(huán)基、CO2H、鹵素、CN、OH、ObC1-C6全氟烷基、Oa(C＝O)bNR7R8、氧代、CHO、(N＝O)R7R8、S(O)2NR7R8、S(O)2-(C1-C10)烷基或者(C＝O)aObC3-C8環(huán)烷基，所述烷基、芳基、烯基、炔基、雜環(huán)基和環(huán)烷基任選被一個(gè)或者多個(gè)選自R6a的取代基取代； R6a選自(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、Oa(C1-C3)全氟烷基、(C0-C6)亞烷基-S(O)mRa、氧代、OH、鹵素、CN、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C6)環(huán)烷基、(C0-C6)亞烷基-芳基、(C0-C6)亞烷基-雜環(huán)基、(C0-C6)亞烷基-N(Rb)2、C(O)Ra、(C0-C6)亞烷基-CO2Ra、C(O)H和(C0-C6)亞烷基-CO2H，所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基和雜環(huán)基任選被最高達(dá)三個(gè)選自R6a的取代基取代； R6b選自(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、Oa(C1-C3)全氟烷基、(C0-C6)亞烷基-S(O)mRa、氧代、OH、鹵素、CN、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C6)環(huán)烷基、(C0-C6)亞烷基-芳基、(C0-C6)亞烷基-雜環(huán)基、(C0-C6)亞烷基-N(Rb)2、C(O)Ra、(C0-C6)亞烷基-CO2Ra、C(O)H和(C0-C6)亞烷基-CO2H，所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基和雜環(huán)基任選被最高達(dá)三個(gè)選自Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、鹵素、CO2H、CN、Oa(C＝O)b(C1-C6)烷基、氧代和N(Rb)2的取代基取代； R7和R8獨(dú)立地選自H、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、(C＝O)aOb(C3-C8)環(huán)烷基、(C＝O)aOb-芳基、(C＝O)aOb-雜環(huán)基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、SO2Ra和(C＝O)aNRb2，所述烷基、環(huán)烷基、芳基、雜環(huán)基、烯基和炔基任選被一個(gè)或多個(gè)選自R6a的取代基取代，或者R7和R8可以與它們連接的氮原子合起來形成在各個(gè)環(huán)中具有3-7個(gè)環(huán)原子和除了氮之外任選另外含有一個(gè)或者兩個(gè)選自N、O和S的雜原子的單環(huán)或者二環(huán)雜環(huán)，所述單環(huán)或者二環(huán)雜環(huán)任選被一個(gè)或者多個(gè)選自R6a的取代基取代； Ra為(C1-C6)烷基、(C3-C6)環(huán)烷基、芳基或者雜環(huán)基；和 Rb為H、(C1-C6)烷基、芳基、雜環(huán)基、(C3-C6)環(huán)烷基、(C＝O)aOb(C1-C6)烷基或者S(O)2Ra； 或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
在本發(fā)明第二實(shí)施方案中，Akt活性抑制劑表示為式B
其中 q為0、1、2、3或者4； Q獨(dú)立地選自雜環(huán)基，所述雜環(huán)基任選被1～3個(gè)選自R6a的取代基取代； 和所有其它取代基和變量如第一實(shí)施方案中所定義； 或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
在第三實(shí)施方案中，本發(fā)明的抑制劑表示為式C
其中 所有其它取代基和變量如第二實(shí)施方案中所定義； 或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
在第四實(shí)施方案中，本發(fā)明的抑制劑表示為式D
其中 所有其它取代基和變量如第二實(shí)施方案中所定義； 或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
在第五實(shí)施方案中，本發(fā)明的抑制劑表示為式E
其中 所有其它取代基和變量如第二實(shí)施方案中所定義； 或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
在第六實(shí)施方案中，本發(fā)明的抑制劑表示為式F
其中 所有其它取代基和變量如第一實(shí)施方案中所定義； 或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
在第七實(shí)施方案中，本發(fā)明的抑制劑表示為式G
其中 R3和R4獨(dú)立地為H和(C1-C6)烷基，其中所述烷基任選被最高達(dá)三個(gè)選自以下的取代基取代OH和鹵素；和其中R3和R4可以連接在一起形成(C3-C7)環(huán)烷基；和 所有其它取代基和變量如第一實(shí)施方案中所定義； 或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
在第八實(shí)施方案中，本發(fā)明的抑制劑表示為式G 其中 R3和R4獨(dú)立地為H和(C1-C6)烷基；和 所有其它取代基和變量如第一實(shí)施方案中所定義； 或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
本發(fā)明的具體化合物包括 5-甲氧基-2-(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘(1-7)； 2-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑-3-基)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-5(6H)-酮(1-8)； 1-{4-[4-(3-嘧啶-5-基喹喔啉-2-基)芐基]環(huán)己基}-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮(1-9)； 3-[3-(4-{[4-2-氧代-2，3-二氫-1H-苯并咪唑-1-基)環(huán)己基]甲基}苯基)喹喔啉-2-基]噻吩-2-甲醛(1-10)； 1-4-{4-[3-(1H-吡唑-5-基)喹喔啉-2-基]芐基}環(huán)己基)-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮(1-11)；和 2-[4-(1-氨基-1-甲基乙基)苯基]-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-5(6H)-酮(2-7)； 或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
本發(fā)明化合物的實(shí)例包括以下化合物的TFA鹽 5-甲氧基-2(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘(1-7)； 2-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑-3-基)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-5(6H)-酮(1-8)； 1-{4-[4-(3-嘧啶-5-基喹喔啉-2-基)芐基]環(huán)己基}-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮(1-9)； 3-[3-(4-{[4-2-氧代-2，3-二氫-1H-苯并咪唑-1-基)環(huán)己基]甲基}苯基)喹喔啉-2-基]噻吩-2-甲醛(1-10)；和 1-(4-{4-[3-(1H-吡唑-5-基)喹喔啉-2-基]芐基}環(huán)己基)-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮(1-11)； 或者其立體異構(gòu)體。
本發(fā)明化合物可以具有不對(duì)稱中心、手性軸和手性面(如E.L.Eliel和S.H.Wilen，Stereochemistry of Carbon Compounds，John Wiley&Sons，New York，1994，pages 1119-1190中所述)，并且可以存在為外消旋物、外消旋混合物和作為單一非對(duì)映異構(gòu)體，與所有可能的異構(gòu)體及其混合物，包括旋光異構(gòu)體，所有這些立體異構(gòu)體都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
此外，在此公開的化合物可以作為互變異構(gòu)體存在，并且其兩種互變異構(gòu)形式都意圖包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，即便僅僅對(duì)一種互變結(jié)構(gòu)進(jìn)行了說明。例如，以下任何涉及化合物A的權(quán)利要求都應(yīng)當(dāng)理解為包括互變結(jié)構(gòu)B，反之亦然，及其混合物。苯并咪唑酮基部分的兩種互變異構(gòu)形式同樣包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。

四唑作為1H/2H互變異構(gòu)體的混合物存在。四唑部分的互變異構(gòu)形式同樣包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。

當(dāng)任何變量(例如R1、R2、R6b等等)在任何結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)多于一次時(shí)，它在各次出現(xiàn)時(shí)的定義獨(dú)立于下一次出現(xiàn)時(shí)的定義。并且，只有當(dāng)組合能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物時(shí)，取代基和變量的組合才是允許的。從取代基畫入環(huán)系統(tǒng)中的線表示所示鍵可以連接在任何可取代環(huán)原子上。如果所述環(huán)系統(tǒng)為二環(huán)系統(tǒng)，那么該鍵意圖連接在二環(huán)部分的任一環(huán)的任何適宜原子上。
應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明化合物上的取代基和取代方式進(jìn)行選擇，從而提供化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定并且可以由可以輕易獲得的原料通過本領(lǐng)域已知工藝以及以下所述方法輕易合成的化合物。如果取代基自身被多于一個(gè)基團(tuán)取代，那么應(yīng)當(dāng)理解，所述多個(gè)基團(tuán)可以在相同碳原子或者不同碳原子上，只要得到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)即可。短語“任選被一個(gè)或者多個(gè)取代基取代”應(yīng)當(dāng)理解為等價(jià)于短語“任選被至少一個(gè)取代基取代”，并且在這種情形下，優(yōu)選實(shí)施方案將具有0～4個(gè)取代基，并且更優(yōu)選的實(shí)施方案將具有0～3個(gè)取代基。
在此使用的“烷基”意指包括具有指定碳原子數(shù)目的支鏈和直鏈的飽和脂族烴基。例如，C1-C10，如在“C1-C10烷基”中定義，為包括在直鏈或者支鏈結(jié)構(gòu)中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10個(gè)碳原子的基團(tuán)。例如，“(C1-C10)烷基”具體包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基等等。
術(shù)語“環(huán)烷基”是指具有指定數(shù)目碳原子的單環(huán)飽和脂族烴基。例如，“環(huán)烷基”包括環(huán)丙基、甲基-環(huán)丙基、2，2-二甲基-環(huán)丁基、2-乙基-環(huán)戊基和環(huán)己基等等。
“烷氧基”表示通過氧橋連接的具有所述碳原子數(shù)目的環(huán)狀或者非環(huán)狀烷基。由此，“烷氧基”包含以上烷基和環(huán)烷基的定義。
如果碳原子數(shù)目沒有明確說明，那么術(shù)語“烯基”是指含有2～10個(gè)碳原子和至少一個(gè)碳碳雙鍵的直鏈、支鏈或者環(huán)狀非芳香烴基。優(yōu)選存在一個(gè)碳碳雙鍵，并且可以存在最高達(dá)四個(gè)非芳香碳碳雙鍵。由此，“(C2-C10)烯基”是指具有2～10個(gè)碳原子的烯基。烯基包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、2-甲基丁烯基和環(huán)己烯基。烯基的直鏈、支鏈或者環(huán)部分可以含有雙鍵，并且如果表明為取代烯基，那么可以被取代。
術(shù)語“炔基”是指含有2～10個(gè)碳原子和至少一個(gè)碳碳三鍵的直鏈、支鏈或者環(huán)狀烴基。其中可以存在最高達(dá)三個(gè)碳碳三鍵。由此，“(C2-C10)炔基”是指具有2～10個(gè)碳原子的炔基。所述炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基和3-甲基丁炔基等等。炔基的直鏈、支鏈或者環(huán)部分可以含有三鍵，并且如果表明為取代炔基，那么其可以被取代。
在某些情況下，取代基可以用包括0的碳原子范圍來限定，比如(C0-C6)亞烷基-芳基。如果芳基取值為苯基，那么該定義將包括苯基自身以及-CH2Ph、-CH2CH2Ph和-CH(CH3)CH2CH(CH3)Ph等等。
在此使用的“芳基”是指任何穩(wěn)定的在各環(huán)中有最高達(dá)7個(gè)原子的單環(huán)或者雙環(huán)碳環(huán)，其中至少一個(gè)環(huán)是芳香環(huán)。所述芳基的實(shí)例包括苯基、萘基、四氫萘基、茚滿基和聯(lián)苯基。可以理解，在芳基取代基是二環(huán)取代基以及一個(gè)環(huán)是非芳香環(huán)的情況中，連接是通過芳環(huán)進(jìn)行的。
在此使用的術(shù)語“雜芳基”表示各環(huán)中有最高達(dá)7個(gè)原子的穩(wěn)定單環(huán)或者二環(huán)，其中至少一個(gè)環(huán)是芳香環(huán)并且含有1～4個(gè)選自O(shè)、N、和S的雜原子。在此定義范圍內(nèi)的雜芳基包括但不限于吖啶基、咔唑基、噌啉基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、異喹啉基、唑基、異唑基、吲哚基、吡嗪基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、四氫喹啉。正如以下雜環(huán)的定義一樣，“雜芳基”還應(yīng)當(dāng)理解為包括任何含氮雜芳基的N-氧化物衍生物。在其中雜芳基取代基是二環(huán)取代基并且一個(gè)環(huán)是非芳香環(huán)或者不包含雜原子的情況下，可以理解，連接分別通過芳環(huán)或者通過包含雜原子的環(huán)進(jìn)行。取代基Q的所述雜芳基部分包括但不限于2-苯并咪唑基、2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、1-異喹啉基、3-異喹啉基和4-異喹啉基。
在此使用的術(shù)語“雜環(huán)”或者“雜環(huán)基”表示含有1～4個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子的3～10元芳香或者非芳香雜環(huán)，并且包括二環(huán)基團(tuán)。因此，“雜環(huán)基”包括上述雜芳基以及其二氫或者四氫類似物?！半s環(huán)基”的其它實(shí)例包括但不限于以下苯并咪唑基、苯并咪唑酮基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氫吲哚基、吲哚基、indolazinyl、吲唑基、異苯并呋喃基、異氮雜茚基、異喹啉基、異噻唑基、異唑基、萘吡啶基、二唑基、唑基、唑啉、異唑啉、氧雜環(huán)丁基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、噠嗪基、吡啶并吡啶基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氫吡喃基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮雜環(huán)丁烷基、1，4-二氧雜環(huán)己基、六氫氮雜基、哌嗪基、哌啶基、吡啶-2-酮基、吡咯烷基、嗎啉基、硫代嗎啉基、二氫苯并咪唑基、二氫苯并呋喃基、二氫苯并噻吩基、二氫苯并唑基、二氫呋喃基、二氫咪唑基、二氫吲哚基、二氫異唑基、二氫異噻唑基、二氫二唑基、二氫唑基、二氫吡嗪基、二氫吡唑基、二氫吡啶基、二氫嘧啶基、二氫吡咯基、二氫喹啉基、二氫四唑基、二氫噻二唑基、二氫噻唑基、二氫噻吩基、二氫三唑基、二氫氮雜環(huán)丁烷基、亞甲基二氧基苯甲?；?、四氫呋喃基和四氫噻吩基及其N-氧化物。雜環(huán)基取代基可以經(jīng)碳原子或者雜原子進(jìn)行連接。
如熟練的技術(shù)人員所理解，本文中使用的“鹵”或者“鹵素”意指包括氯(Cl)、氟(F)、溴(Br)和碘(I)。
在一種實(shí)施方案中，下式表示的部分
包括以下結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)僅僅是例證性而非限制性結(jié)構(gòu)；此外，所述二環(huán)結(jié)構(gòu)中所含的任何適宜的碳和/或氮原子可以任選被1、2或者3個(gè)選自R1的取代基取代
和
在另一實(shí)施方案中，下式表示的部分
選自


和
其中在所述二環(huán)結(jié)構(gòu)中，任何適宜的碳和/或氮原子可以任選被1～3個(gè)選自R1的取代基取代。
在另一實(shí)施方案中，下式表示的部分
選自
其中在所述二環(huán)結(jié)構(gòu)中，任何適宜的碳和/或氮原子可以任選被1～3個(gè)選自R1的取代基取代。
在一種實(shí)施方案中，環(huán)K選自雜環(huán)基。
在一種實(shí)施方案中，環(huán)K選自
在一種實(shí)施方案中，n為0、1、2或者3。
在進(jìn)一步實(shí)施方案中，n為0、1或者2。
在另一實(shí)施方案中，n為1。
在一種實(shí)施方案中，p為0、1、2或者3。
在進(jìn)一步實(shí)施方案中，p為0、1或者2。
在另一實(shí)施方案中，p為1。
在一種實(shí)施方案中，y和z為N。
在另一實(shí)施方案中，y為N和z為CH。
在另一實(shí)施方案中，y為CH和z為N。
在一種實(shí)施方案中，Q選自苯并咪唑基、苯并咪唑酮基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氫吲哚基、吲哚基、indolazinyl、吲唑基、異苯并呋喃基、異氮雜茚基、異喹啉基、異噻唑基、異唑基、萘吡啶基、二唑基、唑基、唑啉、異唑啉、氧雜環(huán)丁基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、噠嗪基、吡啶并吡啶基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氫吡喃基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮雜環(huán)丁烷基、1，4-二氧雜環(huán)己基、六氫氮雜?；⑦哙夯?、哌啶基、吡啶-2-酮基、吡咯烷基、嗎啉基、硫代嗎啉基、二氫苯并咪唑基、二氫苯并呋喃基、二氫苯并噻吩基、二氫苯并唑基、二氫呋喃基、二氫咪唑基、二氫吲哚基、二氫異唑基、二氫異噻唑基、二氫二唑基、二氫唑基、二氫吡嗪基、二氫吡唑基、二氫吡啶基、二氫嘧啶基、二氫吡咯基、二氫喹啉基、二氫四唑基、二氫噻二唑基、二氫噻唑基、二氫噻吩基、二氫三唑基、二氫氮雜環(huán)丁烷基、亞甲基二氧基苯甲?；⑺臍溥秽退臍溧绶曰捌銷-氧化物，其任選被1～3個(gè)選自R6b的取代基取代。雜環(huán)基取代基可以經(jīng)碳原子或者雜原子進(jìn)行連接。
在進(jìn)一步施方案中，Q選自2-azepinone、苯并咪唑基、苯并咪唑酮基、2-diazapinone、咪唑基、2-咪唑烷酮、吲哚基、異喹啉基、嗎啉基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、吡咯烷基、2-哌啶酮、2-嘧啶酮、2-吡咯烷酮、喹啉基、四唑基、四氫呋喃基、四氫異喹啉基和噻吩基，其任選被1～3個(gè)選自R6b的取代基取代。雜環(huán)基取代基可以經(jīng)碳原子或者雜原子進(jìn)行連接。
在再進(jìn)一步實(shí)施方案中，當(dāng)Q為雜環(huán)基時(shí)，Q選自
其任選被1～3個(gè)選自R6b的取代基取代。
在還進(jìn)一步實(shí)施方案中，當(dāng)Q為雜環(huán)基時(shí)，Q選自

和

其任選被一個(gè)選自R6b的取代基取代。
在一種實(shí)施方案中，R1選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、(C＝O)aOb-芳基、(C＝O)aOb(C2-C10)烯基、(C＝O)aOb(C2-C10)炔基、CO2H、鹵素、OH、Ob(C1-C6)全氟烷基、(C＝O)aNR7R8、CN、(C＝O)aOb(C3-C8)環(huán)烷基、S(O)2NR7R8、S(O)2-(C1-C10)烷基和(C＝O)aOb-雜環(huán)基，所述烷基、芳基、烯基、炔基、環(huán)烷基和雜環(huán)基任選被Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、鹵素、CO2H、CN、O(C＝O)(C1-C6)烷基、氧代和N(Rb)2取代。
在另一實(shí)施方案中，R1選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、CO2H、鹵素、OH、CN、(C1-C6)烷氧基、O(C＝O)(C1-C6)烷基和N(Rb)2。
在另一實(shí)施方案中，R1選自氧代和O(C1-C6)烷基。
在一種實(shí)施方案中，R2選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、(C＝O)aOb-芳基、(C＝O)aOb(C2-C10)烯基、(C＝O)aOb(C2-C10)炔基、CO2H、鹵素、OH、Ob(C1-C6)全氟烷基、(C＝O)aNR7R8、CN、(C＝O)aOb(C3-C8)環(huán)烷基、S(O)2NR7R8、S(O)2-(C1-C10)烷基和(C＝O)aOb-雜環(huán)基，所述烷基、芳基、烯基、炔基、環(huán)烷基和雜環(huán)基任選被Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、鹵素、CO2H、CN、O(C＝O)(C1-C6)烷基、氧代和N(Rb)2取代。
在另一實(shí)施方案中，R2選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、CO2H、鹵素、OH、CN、(C1-C6)烷氧基、O(C＝O)(C1-C6)烷基、(C2-C10)烯基和N(Rb)2，所述烯基任選被氧代取代。
在一種實(shí)施方案中，R3和R4選自H和(C1-C6)烷基。
在另一實(shí)施方案中，R3和R4為H。
在一種實(shí)施方案中，當(dāng)Q被R6b取代時(shí)，所述R6b為任選被最高達(dá)三個(gè)選自以下的取代基取代的雜環(huán)基Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、鹵素、CO2H、CN、Oa(C＝O)b(C1-C6)烷基、氧代和N(Rb)2。
在另一實(shí)施方案中，當(dāng)Q被R6b取代時(shí)，所述R6b選自任選被1～3個(gè)選自氧代、OH、N(Rb)2、鹵素和Oa(C1-C6)烷基的取代基取代的
在一種實(shí)施方案中，Rb獨(dú)立地選自H和(C1-C6)烷基。
在式A的一種實(shí)施方案中，環(huán)K為雜環(huán)基；R1選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、CO2H、 鹵素、OH、CN、(C1-C6)烷氧基、O(C＝O)(C1-C6)烷基和N(Rb)2；R2選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、CO2H、鹵素、OH、CN、(C1-C6)烷氧基、O(C＝O)(C1-C6)烷基、(C2-C10)烯基和N(Rb)2，所述烯基任選被氧代取代；R3和R4為H；Q獨(dú)立地選自雜環(huán)基，所述雜環(huán)基任選被1～3個(gè)選自R6b的取代基取代；R6b為任選被最高達(dá)三個(gè)選自Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、鹵素、CO2H、CN、Oa(C＝O)b(C1-C6)烷基、氧代，和N(Rb)2的取代基取代的雜環(huán)基；Rb獨(dú)立地選自H和(C1-C6)烷基；所有其它取代基和變量如上式A中所定義。
在式D的一種實(shí)施方案中，環(huán)K為雜環(huán)基；R1選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、CO2H、鹵素、OH、CN、(C1-C6)烷氧基、O(C＝O)(C1-C6)烷基和N(Rb)2；R2選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、CO2H、鹵素、OH、CN、(C1-C6)烷氧基、O(C＝O)(C1-C6)烷基、(C2-C10)烯基和N(Rb)2，所述烯基任選被氧代取代；R3和R4為H；Q獨(dú)立地選自雜環(huán)基，所述雜環(huán)基任選被1～3個(gè)選自R6b的取代基取代；R6b為任選被最高達(dá)三個(gè)選自Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、鹵素、CO2H、CN、Oa(C＝O)b(C1-C6)烷基、氧代和N(Rb)2的取代基取代的雜環(huán)基；Rb獨(dú)立地選自H和(C1-C6)烷基；所有其它取代基和變量如上式D中所定義。
在式E的一種實(shí)施方案中，環(huán)K為雜環(huán)基；R1選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、CO2H、鹵素、OH、CN、(C1-C6)烷氧基、O(C＝O)(C1-C6)烷基和N(Rb)2；R2選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、CO2H、鹵素、OH、CN、(C1-C6)烷氧基、O(C＝O)(C1-C6)烷基、(C2-C10)烯基和N(Rb)2，所述烯基任選被氧代取代；R3和R4為H；Q獨(dú)立地選自雜環(huán)基，所述雜環(huán)基任選被1～3個(gè)選自R6b的取代基取代；R6b為任選被最高達(dá)三個(gè)選自Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、鹵素、CO2H、CN、Oa(C＝O)b(C1-C6)烷基、氧代和N(Rb)2的取代基取代的雜環(huán)基；Rb獨(dú)立地選自H和(C1-C6)烷基；所有其它取代基和變量如上式E中所定義。
在式G的一種實(shí)施方案中，環(huán)K選自雜環(huán)基。
在式G的一種實(shí)施方案中，p為0和環(huán)K選自
在式G的一種實(shí)施方案中，p為0和環(huán)K為
本發(fā)明包括式A化合物的游離形式以及其藥學(xué)上可接受的鹽和立體異構(gòu)體。在此例證說明的一些分離的具體化合物為胺化合物的質(zhì)子化鹽。術(shù)語“游離形式”是指為非鹽形式的胺化合物。本發(fā)明所包含的藥學(xué)上可接受的鹽不僅包括對(duì)于在此所述具體化合物而例證說明的分離鹽，而且包括游離形式的式A化合物的所有一般藥學(xué)上可接受的鹽。所述化合物具體鹽的游離形式可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的工藝進(jìn)行分離。例如，上述游離形式可以通過用適宜的稀堿水溶液處理所述鹽重新得到，所述稀堿水溶液比如稀NaOH、碳酸鉀、氨水和碳酸氫鈉水溶液。所述游離形式在某些物理性能上可以與其相應(yīng)的鹽形式存在某些不同，比如在極性溶劑中的溶解度，但是基于本發(fā)明目的，其酸和堿鹽是其它與其相應(yīng)的游離形式藥學(xué)上等同的鹽。
本發(fā)明化合物藥學(xué)上可接受的鹽，可以由含有堿性或者酸性部分的本發(fā)明化合物利用常規(guī)化學(xué)方法進(jìn)行合成。通常，堿性化合物的鹽通過離子交換色譜法進(jìn)行制備，或者通過在適當(dāng)溶劑或者溶劑的多種組合中，使游離堿與化學(xué)計(jì)量或者與過量的形成期望鹽的無機(jī)酸或有機(jī)酸反應(yīng)進(jìn)行制備。類似地，酸性化合物的鹽通過與適當(dāng)?shù)臒o機(jī)或者有機(jī)堿反應(yīng)而得到形成。
由此，本發(fā)明化合物藥學(xué)上可接受的鹽包括通過使本發(fā)明堿性化合物與無機(jī)或者有機(jī)酸反應(yīng)而形成的本發(fā)明化合物的常規(guī)無毒鹽。例如，常規(guī)的無毒鹽包括由無機(jī)酸得到的鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、胺磺酸鹽、磷酸鹽和硝酸鹽等等，以及由有機(jī)酸制備的鹽，例如醋酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、乙醇酸鹽、硬脂酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、撲酸鹽、馬來酸鹽、羥基馬來酸鹽、苯基馬來酸鹽、谷氨酸鹽、安息香酸鹽、水楊酸鹽、磺胺酸鹽、2-乙酰氧基-安息香酸鹽、富馬酸鹽、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、乙基二磺酸鹽、草酸鹽、羥乙磺酸鹽和三氟乙酸鹽(TFA)等等。
當(dāng)本發(fā)明化合物為酸性化合物時(shí)，適宜的“藥學(xué)上可接受的鹽”是指由藥學(xué)上可接受的無毒堿(包括無機(jī)堿和有機(jī)堿)制備得到的鹽。由無機(jī)堿衍生得到的鹽包括鋁鹽、銨鹽、鈣鹽、銅鹽、三價(jià)鐵鹽、二價(jià)鐵鹽、鋰鹽、鎂鹽、錳鹽、亞錳鹽、鉀鹽、鈉鹽和鋅鹽等等。特別優(yōu)選銨、鈣、鎂、鉀和鈉鹽。由藥學(xué)上可接受的有機(jī)無毒堿衍生得到的鹽包括伯胺鹽、仲胺鹽、叔胺鹽、取代胺鹽(包括天然存在的取代胺鹽)、環(huán)胺鹽和陽離子離子交換樹脂鹽，比如精氨酸、甜菜堿咖啡因、膽堿、N，N1-二芐基乙二胺、二乙基胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、葡糖胺、組氨酸、哈胺、異丙胺、賴氨酸、甲基葡萄糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、聚胺樹脂、普魯卡因、嘌呤、可可堿、三乙胺、三甲胺、三丙胺和氨基丁三醇等等。
如上所述藥學(xué)上可接受的鹽以及其它一般藥學(xué)上可接受的鹽的制備由Berg等人，″Pharmaceutical Salts″，J.Pharm.Sci.，1977，661-19進(jìn)行了更全面的描述。
還應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明化合物潛在地是內(nèi)鹽或者兩性離子化合物，因?yàn)樵谏項(xiàng)l件下，化合物中的去質(zhì)子酸性部分(比如羧基)可以成為陰離子，隨后此電荷可以與質(zhì)子化或者烷基化堿性部分(比如季氮原子)的陽離子電荷得到內(nèi)部平衡。
應(yīng)用 本發(fā)明化合物是Akt活性抑制劑，因此可以用于治療癌癥，特別是與Akt活性異常及Akt下游細(xì)胞靶相關(guān)的癌癥。所述癌癥包括但不限于卵巢癌、胰腺癌、乳癌和前列腺癌，以及腫瘤抑制劑PTEN在其中發(fā)生突變的癌癥(包括惡性膠質(zhì)瘤)(Cheng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)899267-9271；Cheng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)933636-3641；Bellacosa等人，Int.J.Cancer(1995)64280-285；Nakatani等人，J.Biol.Chem.(1999)27421528-21532；Graff，Expert.Opin.Ther.Targets(2002)6(1)103-113；和Yamada和Araki，J.Cell Science.(2001)1142375-2382；Mischel和Cloughesy，Brain Pathol.(2003)13(1)52-61)。
認(rèn)為在此提供的化合物、組合物和方法特別可以用于治療癌癥。可以通過本發(fā)明化合物、組合物和方法治療的癌癥包括但不限于心臟(血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肉瘤)、粘液瘤、橫紋肌瘤、纖維瘤、脂肪瘤和畸態(tài)瘤； 肺支氣管癌(鱗狀上皮細(xì)胞、未異化小細(xì)胞、未異化大細(xì)胞、惡性腺瘤)、肺泡(bronchiolar)癌、支氣管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、軟骨瘤錯(cuò)構(gòu)瘤、間皮瘤；胃腸食道(鱗狀細(xì)胞癌、惡性腺瘤、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺胰腺(ductal ductal ductal惡性腺瘤、胰島瘤、胰升血糖素瘤、胃泌素瘤、類癌瘤、vipoma)、小腸(惡性腺瘤、淋巴瘤、類癌瘤、Karposi′s sarcoma、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤纖維神經(jīng)瘤、纖維瘤)、大腸(惡性腺瘤、管腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯(cuò)構(gòu)瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖道腎(惡性腺瘤、韋母氏瘤[腎母細(xì)胞瘤]、淋巴瘤、血癌)、膀胱和尿道(鱗狀細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移細(xì)胞癌、惡性腺瘤)、前列腺(惡性腺瘤、肉瘤)、睪丸(精原細(xì)胞瘤、畸態(tài)瘤、胚胎性癌、畸胎癌、絨毛膜癌、肉瘤、間質(zhì)細(xì)胞癌、纖維瘤、纖維腺瘤、腺瘤樣瘤、脂肪瘤)；肝肝癌(肝細(xì)胞癌)、膽管細(xì)胞癌、肝胚細(xì)胞瘤、血管肉瘤、肝細(xì)胞腺瘤、血管瘤；骨骼骨原性肉瘤(骨肉瘤)、纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、軟骨肉瘤、尤因氏肉瘤、惡性淋巴瘤(網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤)、多發(fā)性骨髓瘤、惡性巨細(xì)胞瘤、脊索癌、osteochronfroma(骨軟骨性外生骨疣)、良性軟骨瘤、成軟骨細(xì)胞瘤、chondromyxofibroma、骨樣骨瘤和巨細(xì)胞瘤；神經(jīng)系統(tǒng)頭骨(骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黃瘤、佩吉特氏病)、腦膜(腦膜瘤、meningiosarcoma、神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、大腦(星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、胚組織瘤[松果狀瘤]、惡性膠質(zhì)瘤多型、少枝膠質(zhì)瘤、神經(jīng)鞘瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、先天性腫瘤)、脊髓纖維神經(jīng)瘤、腦膜瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤)；婦科子宮(子宮內(nèi)膜癌)、宮頸(宮頸癌、預(yù)腫瘤子宮頸非典型增生)、卵巢(卵巢癌[漿液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、一般性癌癥]、肉芽瘤-膜細(xì)胞腫瘤、卵巢塞-萊二氏細(xì)胞瘤、無性細(xì)胞瘤、卵巢未成熟畸胎瘤)、外陰(鱗狀細(xì)胞癌、上皮內(nèi)癌、惡性腺瘤、纖維肉瘤、黑素瘤)、陰道(明細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、葡萄樣肉瘤(胚胎性橫紋肌肉瘤))、輸卵管(癌)；血液血液(骨髓性白血病[急性和慢性]、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、骨髓及外骨髓增殖病、多發(fā)性骨髓瘤、脊髓發(fā)育不良綜合征)淋巴肉芽腫病、非何杰金氏淋巴瘤[惡性淋巴瘤]；皮膚惡性黑色素瘤、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、Karposi′s sarcoma、moles dysplastic nevi、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤、瘢痕瘤、牛皮癬；和腎上腺成神經(jīng)細(xì)胞瘤。由此，如上所給出的術(shù)語“癌細(xì)胞”包括受任何上述等同癥狀折磨的細(xì)胞。
可以通過本發(fā)明化合物、組合物和方法進(jìn)行治療的癌癥包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、腦癌、睪丸癌、胃癌、pancrease、皮膚癌、小腸癌、大腸癌、喉癌、頭部和頸癌、口腔癌、骨癌、肝癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌和血癌。
Akt信號(hào)調(diào)節(jié)血管形成中的多個(gè)關(guān)鍵步驟。Shiojima和Walsh，Circ.Res.(2002)901243-1250。血管形成抑制劑在癌癥治療中的應(yīng)用在文獻(xiàn)中已知，例如，參見J.Rak等人，Cancer Research，554575-4580，1995和Dredge等人，Expert Opin.Biol.Ther.(2002)2(8)953-966。血管形成在癌癥中的作用在多種癌腫和組織中得到了表明乳腺癌(G.Gasparini和A.L.Harris，J.Clin.Oncol.，1995，13765-782；M.Toi等人，Japan.J.Cancer Res.，1994，851045-1049)；膀胱癌(A.J.Dickinson等人，Br.J.Urol.，1994，74762-766)；結(jié)腸癌(L.M.Ellis等人，Surgery，1996，120(5)871-878)；和口腔腫瘤(J.K.Williams等人，Am.J.Surg.，1994，168373-380)。其它癌癥包括晚期腫瘤、毛細(xì)胞白血病、黑素瘤、晚期頭頸部癌、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌、非霍奇金淋巴瘤、轉(zhuǎn)移性乳癌、乳腺癌，晚期黑素瘤、胰腺癌、胃癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、各種實(shí)體瘤、多發(fā)性骨髓瘤、轉(zhuǎn)移性前列腺癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎癌、淋巴瘤、頑固性轉(zhuǎn)移性疾病、頑固性多發(fā)性骨髓瘤、宮頸癌、卡波西肉瘤、復(fù)發(fā)性間變神經(jīng)膠質(zhì)瘤和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌(Dredge等，Expert Opin.Biol.Ther.(2002)2(8)953-966)。由此，本申請(qǐng)所公開的Akt抑制劑也可以用于治療這些血管生成相關(guān)的癌癥。
已經(jīng)歷新血管形成的腫瘤顯示升高的轉(zhuǎn)移可能性。事實(shí)上，血管生成對(duì)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移是至關(guān)重要的(S.P Cunningham等人，Can.Research，613206-3211(2001))。因此，在本申請(qǐng)中公開的Akt抑制劑也可以用于預(yù)防或降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
還包含在本發(fā)明范圍的是治療或預(yù)防涉及血管生成的疾病的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物給藥治療有效量的本發(fā)明化合物。眼部新血管形成病是其中大部分組織損害可以歸咎于眼內(nèi)血管的異常浸潤的癥狀的一個(gè)實(shí)例(參見WO 00/30651，2000年6月2日公布)。不期望的浸潤可以由局部缺血性視網(wǎng)膜病(比如由糖尿病性視網(wǎng)膜病、早熟兒視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈閉塞等)或變性疾病(比如在老齡化相關(guān)性黃斑變性中觀察到的脈胳膜新血管形成)引起。因此，通過給予本發(fā)明化合物對(duì)血管生長的抑制作用可以預(yù)防血管浸潤，和可以預(yù)防或治療涉及血管生成的疾病，例如視網(wǎng)膜血管化、糖尿病性視網(wǎng)膜病、老年黃斑變性等。
還包含在本發(fā)明范圍的是治療或預(yù)防涉及血管生成的非惡性疾病的方法，所述疾病包括但不限于眼疾(例如視網(wǎng)膜血管化、糖尿病性視網(wǎng)膜病和老齡化相關(guān)性黃斑變性)、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、肥胖癥和阿爾茨海默病(Dredge等人，Expert Opin.Biol.Ther.(2002)2(8)953-966)。在另一實(shí)施方案中，治療或預(yù)防涉及血管生成的疾病的方法包括眼疾(例如視網(wǎng)膜血管化、糖尿病性視網(wǎng)膜病和老齡化相關(guān)性黃斑變性)、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎和牛皮癬。
還包含在本發(fā)明范圍的是治療過度增殖性病癥的方法，例如再狹窄、炎癥、自身免疫病和變態(tài)反應(yīng)/哮喘。
還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是本發(fā)明化合物涂覆支架(stent)的用途，以及由此本發(fā)明化合物在涂覆支架上用于治療和/或預(yù)防再狹窄的用途(WO03/032809)。
還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是本發(fā)明化合物用于治療和/或預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎的用途(WO03/035048)。
還包含在本發(fā)明范圍的是治療高胰島素血癥的方法。
本發(fā)明化合物還可以用于制備用于治療上述疾病(特別是癌癥)的藥物。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物為選擇性抑制劑，其抑制效力取決于PH結(jié)構(gòu)域。在該實(shí)施方案中，所述化合物對(duì)缺乏PH結(jié)構(gòu)域的截短Akt蛋白表現(xiàn)為體外抑制活性降低或無體外抑制活性。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物選自Akt1選擇性抑制劑、Akt2選擇性抑制劑及Akt1和Akt2二者的選擇性抑制劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物選自Akt1選擇性抑制劑、Akt2選擇性抑制劑、Akt3選擇性抑制劑及上述三種Akt同工酶中兩種Akt的選擇性抑制劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物為所有三種Akt同工酶的選擇性抑制劑，但不是經(jīng)改造而刪除PH結(jié)構(gòu)域、刪除鉸鏈區(qū)或刪除PH結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)二者后的1種、2種或所有這些Akt同工酶的抑制劑。
本發(fā)明還涉及抑制Akt活性的方法，包括給藥需要其的哺乳動(dòng)物藥用有效量的本發(fā)明化合物。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐，本發(fā)明化合物可以單獨(dú)或者以藥物組合物的形式聯(lián)用藥學(xué)上可接受載體、賦形劑或稀釋劑一起給藥至哺乳動(dòng)物，包括人類。所述化合物可以口服給藥或胃腸外給藥，包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、直腸內(nèi)和局部等給藥途徑。
含有活性成分的藥物組合物可為適于口服應(yīng)用的形式，例如，片劑、糖錠劑、錠劑、水性混懸劑或油性混懸劑、分散粉劑或顆粒劑、乳劑、硬質(zhì)膠囊劑或軟質(zhì)膠囊劑、糖漿劑或酏劑。用于口服的組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何制備藥物組合物的方法進(jìn)行制備，并且為了提供美觀適口的藥物制劑，所述組合物可以包含一種或多種選自甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑的成分。片劑包含與適用于片劑制備的無毒可藥用賦形劑混合的活性成分。所述賦形劑可以是，例如惰性稀釋劑，比如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；制粒劑和崩解劑，例如微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、玉米淀粉或藻酸；粘合劑，例如淀粉、明膠、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯樹膠；以及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉?？梢圆粚?duì)片劑進(jìn)行包衣，或者可以用已知技術(shù)對(duì)其進(jìn)行包衣以掩蓋藥物的不適味道，或延遲其在胃腸道中的崩解和吸收，從而在較長時(shí)間內(nèi)提供持續(xù)作用。例如，可以使用水溶性味道掩蔽材料，例如羥丙基甲基纖維素或羥丙基纖維素，或者，可以使用延時(shí)材料例如乙基纖維素、醋酸丁酸纖維素。
用于口服應(yīng)用的制劑還可為硬明膠膠囊劑，其中活性成分與碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土等惰性固體稀釋劑進(jìn)行混合；或者為軟明膠膠囊劑，其中活性成分與聚乙二醇等水可溶性載體進(jìn)行混合，或與花生油、液體石蠟或橄欖油等油性介質(zhì)進(jìn)行混合。
水性混懸劑含有與適于制備水性混懸劑的賦形劑混合的活性材料。所述賦形劑為懸浮劑、分散劑或濕潤劑，懸浮劑例如羧甲基纖維素納、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃芪樹膠和阿拉伯樹膠；分散劑或濕潤劑可為天然磷脂，例如卵磷脂，或烯化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，例如十七碳乙烯氧基十六醇，或環(huán)氧乙烷與脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯。水性混懸劑還可以包含一種或多種防腐劑(例如對(duì)羥基苯甲酸乙酯或?qū)αu基苯甲酸正丙酯)、一種或多種著色劑、一種或多種矯味劑及一種或多種甜味劑(例如蔗糖、糖精或天冬甜素)。
油性混懸劑可以通過將活性成分懸浮在植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或礦物油(例如液體石蠟)中得到制備。所述油性混懸劑可包含增稠劑，例如蜂蠟、固體石蠟或鯨蠟醇。還可以向其中加入比如如上所述的甜味劑和矯味劑以提供適口的口服制劑。這些組合物可通過加入抗氧化劑(例如丁羥茴醚或α-生育酚)予以保存。
通過向適于制備水性混懸劑的分散粉劑和顆粒劑中加入水，提供活性成分與分散劑或濕潤劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑的混合物。適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑如上述例證說明。其中還可存在另外的賦形劑，例如甜味劑、矯味劑和著色劑。這些組合物可通過加入抗氧化劑(例如抗壞血酸)予以保存。
本發(fā)明的藥物組合物還可以是水包油乳劑的形式。所述油相可以為植物油(例如橄欖油或花生油)、礦物油(例如液體石蠟)或其混合物。合適的乳化劑可為天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂，也可為從脂肪酸和己糖醇酐衍生的酯或偏酯，例如脫水山梨糖醇單油酸酯，和所述偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯。所述乳劑還可包含甜味劑、矯味劑、防腐劑和抗氧化劑。
糖漿劑和酏劑可以利用甜味劑進(jìn)行制備，例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖。所述制劑還可包含緩和劑、防腐劑、矯味劑和著色劑，以及抗氧化劑。
所述藥物組合物可以是無菌注射水溶液劑的形式?？梢允褂玫目山邮艿妮d體和溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。
所述無菌注射制劑還可是無菌注射水包油微乳劑，其中活性成分溶解在油相中。例如，可以首先將活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后，將油性溶液摻入水和甘油的混合物中，從而制備形成微乳劑。
所述注射液或注射微乳劑可以通過局部快速濃注引入到患者血管中。另外，還可以有利地以保持本發(fā)明化合物處于恒定的循環(huán)濃度的方式給藥所述溶液劑或微乳劑。為了保持這種恒定濃度，可以使用恒定靜脈遞藥裝置。所述裝置的實(shí)例為Deltec CADD-PLUSTM 5400型靜脈泵。
所述藥物組合物可以是用于肌內(nèi)和皮下給藥的無菌注射水性混懸劑或油性混懸劑。所述混懸劑可以根據(jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)，使用上述適宜的分散劑或濕潤劑及懸浮劑進(jìn)行配制。所述無菌注射制劑還可以是無菌注射溶液劑或混懸劑，其中含有無毒胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑，例如1，3-丁二醇的溶液劑。另外，通常將無菌固定油用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此目的，可使用任何品牌的固定油，包括合成甘油單酯或合成甘油二酯。另外，在注射劑制備中還可以使用脂肪酸(比如油酸)。
式A化合物還可以用于直腸內(nèi)給藥的栓劑形式進(jìn)行給藥。這些組合物可以通過將藥物與合適的無刺激賦形劑混合得到制備，其中所述賦形劑在常溫下為固體，但在直腸溫度下為液體，因此可在直腸中熔化釋放藥物。這類材料包括可可脂、甘油化明膠、氫化植物油、多種分子量的聚乙二醇混合物和聚乙二醇脂肪酸酯。
對(duì)于局部使用，可以使用含有式A化合物的乳膏劑、軟膏劑、凝膠劑、溶液劑或混懸劑等(對(duì)于本申請(qǐng)，局部使用應(yīng)當(dāng)包括漱口水和含漱劑)。
本發(fā)明化合物可以通過局部應(yīng)用合適的鼻內(nèi)載體和遞藥裝置以鼻內(nèi)形式給藥，或可以通過應(yīng)用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的經(jīng)皮皮膚貼劑形式經(jīng)皮途徑進(jìn)行給藥。在以經(jīng)皮遞藥系統(tǒng)的形式給藥時(shí)，劑量給藥在整個(gè)給藥方案中當(dāng)然將是連續(xù)的而不是間歇性的。本發(fā)明化合物還可以栓劑給藥，所述栓劑使用比如脂、甘油化明膠、氫化植物油、各種分子量的聚乙二醇的混合物和聚乙二醇脂肪酸酯的基料。
當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明的組合物給藥至人類對(duì)象時(shí)，其日劑量通常將由處方醫(yī)師進(jìn)行確定，并且所述劑量通常將隨著年齡、體重和具個(gè)體患者的反應(yīng)以及患者癥狀的嚴(yán)重程度而變化。
在一種實(shí)施方案中，將適宜量的Akt抑制劑給藥至正在接受癌癥治療的哺乳動(dòng)物。抑制劑給藥量的范圍每目約0.1mg/kg體重～約60mg/kg體重，或每日約0.5mg/kg體重～約40mg/kg體重。另一個(gè)含有本發(fā)明組合物的治療方案含有約0.01mg～約1000mg的Akt抑制劑。在另一實(shí)施方案中，所述劑量含有約1mg～約1000mg的Akt抑制劑。
本發(fā)明化合物也可以與已知的治療藥物和抗癌藥聯(lián)合使用。例如，本發(fā)明化合物可以與已知的抗癌藥聯(lián)合使用。因此本發(fā)明公開的化合物與其它抗癌藥或化療藥物的聯(lián)合使用也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述試劑的實(shí)例可參見Cancer Principles and Practice of Oncology，V.T.Devita和S.Hellman編著，第6版(2001年2月15日)，Lippincott Williams&WilkinsPublishers。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠理解，試劑的聯(lián)用應(yīng)當(dāng)基于藥物的特定性質(zhì)和所涉及癌癥的具體性質(zhì)進(jìn)行。所述抗癌藥包括雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雄激素受體調(diào)節(jié)劑、類視黃醇受體調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞毒劑/細(xì)胞抑制劑、抗增殖藥、異戊烯基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑和其它血管生成抑制劑、細(xì)胞增殖和存活信號(hào)抑制劑以及干擾細(xì)胞周期關(guān)卡的藥劑。當(dāng)進(jìn)行放射治療的同時(shí)給藥時(shí)，本發(fā)明化合物尤為有益。
“雌激素受體調(diào)節(jié)劑”是指干擾或抑制雌激素與受體結(jié)合的化合物，與機(jī)制無關(guān)。雌激素受體調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括但不限于，他莫昔芬、雷洛昔芬、艾多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟維司群、2，2-二甲基丙酸4-[7-(2，2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯酯、4，4’-二羥基二苯甲酮-2，4-二硝基苯腙和SH646。
“雄激素受體調(diào)節(jié)劑”是指干擾或抑制雄激素與受體結(jié)合的化合物，與機(jī)制無關(guān)。雄激素受體調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括非那雄胺和其它5α-還原酶抑制劑、尼魯米特、氟他胺、比卡魯胺、利阿唑和醋酸阿比特龍。
“類視黃醇受體調(diào)節(jié)劑”是指干擾或抑制類視黃醇與受體結(jié)合的化合物，與機(jī)制無關(guān)。這些類視黃醇受體調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括貝沙羅汀、維A酸、13-順-視黃酸、9-順-視黃酸、α-二氟甲基鳥氨酸、ILX23-7553、反-N-(4’-羥基苯基)視黃酰胺和N-4-羧基苯基視黃酰胺。
“細(xì)胞毒劑/細(xì)胞抑制劑”是指主要通過直接干擾細(xì)胞功能引起細(xì)胞死亡或抑制細(xì)胞增殖、或者抑制或干擾細(xì)胞減數(shù)分裂的化合物，包括烷基化試劑、腫瘤壞死因子、嵌入劑、低氧可激活化合物、微管抑制劑/微管穩(wěn)定劑、有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白抑制劑、參與有絲分裂進(jìn)程的激酶抑制劑、參與生長因子和細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激酶抑制劑、抗代謝藥、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、激素/抗激素治療藥物、造血生長因子、單克隆抗體定向治療藥、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、蛋白體抑制劑、泛肽接合酶抑制劑和遍在蛋白連接酶(aurora kinase)抑制劑。
細(xì)胞毒劑/細(xì)胞抑制劑的實(shí)例包括但不限于sertenef、惡液質(zhì)素(cachectin)、異環(huán)磷酰胺、他索納明、氯尼達(dá)明、卡鉑、六甲蜜胺、潑尼莫司汀、二溴衛(wèi)矛醇、雷莫司汀、福莫司汀、奈達(dá)鉑、奧沙利鉑、替莫唑胺、庚鉑、雌莫司汀、托西酸英丙舒凡、曲磷胺、尼莫司汀、二溴螺氯銨、嘌嘧替派、洛鉑、沙鉑、泊非霉素(profiromycin)、順鉑、依羅夫文、右異環(huán)磷酰胺、順-胺二氯(2-甲基-吡啶)合鉑、芐基鳥嘌呤、葡磷酰胺、GPX100、四氯化(反式，反式，反式)-雙-μ-(己烷-1，6-二胺)-μ-[二胺-鉑(II)]雙[二胺(氯)鉑(II)]、二吖丙啶基精氨、三氧化二砷、1-(11-十二烷基氨基-10-羥基十一烷基)-3，7-二甲基黃嘌呤、佐柔比星、伊達(dá)比星、柔紅霉素、比生群、米托蒽醌、吡柔比星、吡萘非特、戊柔比星、氨柔比星、抗瘤酮、3’-脫氨基-3’-嗎啉代-13-脫氧代-10-羥基洋紅霉素、脂質(zhì)體蒽環(huán)霉素(annamycin)、加柔比星、依利奈法德、MEN10755、4-脫甲氧基-3-脫氨基-3-吖丙啶基-4-甲基磺酰基-柔紅霉素(參見WO00/50032)、Raf激酶抑制劑(例如Bay43-9006)和mTOR抑制劑(例如Wyeth公司的CCI-779)。
可低氧激活化合物的一個(gè)實(shí)例為替拉扎明。
蛋白體抑制劑的實(shí)例包括但不限于乳胞素和MLN-341(Velcade)。
微管抑制劑/微管穩(wěn)定劑的實(shí)例包括紫杉醇、硫酸長春地辛、3’，4’-二脫氫-4’-脫氧-8’-去甲長春堿、多西他賽、根霉素、多拉司他汀、依西酸米伏布林、auristatin、西馬多丁、RPR109881、BMS184476、長春氟寧、縮酚酸肽類抗腫瘤藥(cryptophycin)、2，3，4，5，6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺酰胺、脫水長春堿、N，N-二甲基-L-纈氨酰-L-纈氨酰-N-甲基-L-纈氨酰-L-脯氨酰-L-脯氨酸-叔丁酰胺、TDX258、埃博霉素(參見例如美國專利號(hào)6,284,781和6,288,237)和BMS188797。在一個(gè)實(shí)施方案中，微管抑制劑/微管穩(wěn)定劑不包括大環(huán)內(nèi)酯類抗腫瘤藥。
拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的一些實(shí)例為托泊替康、hycaptamine、伊立替康、盧比替康、6-乙氧基丙?；?3’，4’-O-外-亞芐基-教酒菌素、9-甲氧基-N，N-二甲基-5-硝基吡唑并[3，4，5-kl]吖啶-2-(6H)丙酰胺、1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]呋喃并[3’，4’b，7]-吲嗪并[1，2b]喹啉-10，13(9H，15H)二酮、勒托替康、7-[2-(N-異丙氨基)乙基]-(20S)喜樹堿、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、索布佐生、2’-二甲氨基-2’-脫氧-依托泊苷、GL331、N-[2-(二甲氨基)乙基]-9-羥基-5，6-二甲基-6H-吡啶并[4，3-b]咔唑-1-甲酰胺、asulacrine、(5a，5aB，8aa，9b)-9-[2-[N-[2-(二甲氨基)乙基]-N-甲氨基]乙基]-5-[4-羥基-3，5-二甲氧基苯基]-5，5a，6，8，8a，9-六氫呋喃并(3’，4’6，7)萘并(2，3-d)-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-6-酮、2，3-(亞甲二氧基)-5-甲基-7-羥基-8-甲氧基苯并[c]-菲啶、6，9-雙[(2-氨乙基)氨基]苯并[g]異喹啉-5，10-二酮、5-(3-氨基丙氨基)-7，10-二羥基-2-(2-羥乙基氨甲基)-6H-吡唑并[4，5，1-de]吖啶-6-酮、N-[1-[2(二乙氨基)乙氨基]-7-甲氧基-9-氧代-9H-噻噸-4-基甲基]甲酰胺、N-(2-(二甲氨基)乙基)吖啶-4-甲酰胺、6-[[2-(二甲氨基)乙基]氨基]-3-羥基-7H-茚并[2，1-c]喹啉-7-酮和地美司鈉。
有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白抑制劑的實(shí)例，特別是人類有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白KSP的實(shí)例描述于以下PCT公布文本中WO 01/30768，WO 01/98278，WO 03/049527，WO 03/049679，WO 03/050064，WO 03/050122，WO 03/049678和WO 03/039460。在一種實(shí)施方案中，有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白的抑制劑包括但不限于KSP抑制劑、MKLP1抑制劑、CENP-E抑制劑、MCAK抑制劑和Rab6-KIFL抑制劑。
“組蛋白脫乙?；敢种苿钡膶?shí)例包括但不限于SAHA、TSA、oxamflatin、PXDlOl、MG98和scriptaid。進(jìn)一步涉及的其它組蛋白脫乙酰基酶抑制劑可以發(fā)現(xiàn)于以下文獻(xiàn)中Miller，T.A.等人J.Med.Chem.46(24)5097-5116(2003)。
“參與有絲分裂進(jìn)程的激酶抑制劑”包括但不限于aurora激酶抑制劑、Polo樣激酶抑制劑(PLK；特別是PLK-1抑制劑)、bub-1抑制劑和bub-R1抑制劑。
“抗增殖藥”包括反義RNA寡核苷酸和反義DNA寡核苷酸，比如G3139、ODN698、RVASKRAS、GEM231和INX3001，還包括抗代謝藥，比如依諾他濱、卡莫氟、替加氟、噴司他丁、去氧氟尿苷、三甲曲沙、氟達(dá)拉濱、卡培他濱、加洛他濱、阿糖胞苷ocfosfate、fosteabine鈉水合物、雷替曲塞、paltitrexid、乙嘧替氟、噻唑呋啉、地西他濱、諾拉曲塞、培美曲塞、nelzarabine、2’-脫氧-2’-亞甲基胞苷、2’-氟亞甲基-2’-脫氧胞苷、N-[5-(2，3-二氫-苯并呋喃基)磺?；鵠-N’-(3，4-二氯苯基)脲、N6-[4-脫氧-4-[N2-[2(E)，4(E)-十四烷二烯酰]甘氨酰氨基]-L-甘油基-B-L-甘露糖基-吡喃庚糖基]腺嘌呤、aplidine、海鞘素(ecteinascidin)、曲沙他濱、4-[2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-b][1，4]噻嗪-6-基-(S)-乙基]-2，5-噻吩甲酰基-L-谷氨酸、氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿拉諾新、乙酸11-乙?；?8-(氨甲?；趸谆?-4-甲酰基-6-甲氧基-1 4-氧雜-1，11-二氮雜四環(huán)(7.4.1.0.0)-十四烷-2，4，6-三烯-9-基酯、八氫吲嗪三醇、洛美曲索、右雷佐生、甲硫氨酸酶(methioninase)、2’-氰基-2’-脫氧-N4-棕櫚酰-1-B-D-阿糖呋喃糖基胞嘧啶、3-氨基吡啶-2-甲醛縮氨基硫脲和曲妥單抗。
單克隆抗體靶向治療藥物的實(shí)例包括那些具有連接癌細(xì)胞特異性單克隆抗體或靶細(xì)胞特異性單克隆抗體的細(xì)胞毒劑或放射性同位素的治療藥物。其實(shí)例包括托西莫單抗(Bexxar)。
“HMG-CoA還原酶抑制劑”是指3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑。可以使用的HMG-CoA還原酶抑制劑的實(shí)例包括但不限于洛伐他汀(MEVACOR，參見美國專利號(hào)4,231,938、4,294,926和4,319,039)、辛伐他汀(ZOCOR，參見美國專利號(hào)4,444,784、4,820,850和4,916,239)、普伐他汀(PRAVACHOL，參見美國專利號(hào)4,346,227、4,537,859、4,410,629、5,030,447和5,180,589)、氟伐他汀(LESCOL，參見美國專利號(hào)5,354,772、4,911,165、4,929,437、5,189,164、5,118,853、5,290,946和5,356,896)、阿托伐他汀(LIPITOR，參見美國專利號(hào)5,273,995、4,681,893、5,489,691和5,342,952)以及西立伐他汀(亦稱雷伐它汀和BAYCHOL，參見美國專利號(hào)5,177,080)。M.Yalpani，”Cholesterol Lowering Drugs”，Chemistry&Industry，第85-89頁(1996年2月5日)中的第87頁，以及美國專利號(hào)4,782,084和4,885,314中描述了這些HMG-CoA還原酶抑制劑和其它可用于本發(fā)明使用方法的HMG-CoA還原酶抑制劑的結(jié)構(gòu)式。本文所用的術(shù)語HMG-CoA還原酶抑制劑包括所有可藥用內(nèi)酯和開鏈酸(即其內(nèi)酯環(huán)打開形成游離酸)的形式，還包括具有HMG-CoA還原酶抑制活性的化合物的鹽和酯的形式，因而此類鹽、酯、開鏈酸和內(nèi)酯形式的用途都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
“異戊烯基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑”是指抑制異戊烯基蛋白轉(zhuǎn)移酶中任何一種或任何組合的化合物，包括法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶(FPTase)、香葉基香葉基蛋白轉(zhuǎn)移酶I型(GGPTase-I)和香葉基香葉基蛋白轉(zhuǎn)移酶II型(GGPTaseII，亦稱Rab GGPTase)。
異戊烯基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑的實(shí)例可發(fā)現(xiàn)于以下公開文本和專利中WO 96/30343、WO 97/18813、WO 97/21701、WO 97/23478、WO97/38665、WO 98/28980、WO 98/29119、WO 95/32987、美國專利號(hào)5,420,245、美國專利號(hào)5,523,430、美國專利號(hào)5,532,359、美國專利號(hào)5,510,510、美國專利號(hào)5,589,485、美國專利號(hào)5,602,098、歐洲專利公布號(hào)0618221、歐洲專利公布號(hào)0 675 112、歐洲專利公布號(hào)0 604 181、歐洲專利公布號(hào)0 696 593、WO 94/19357、WO 95/08542、WO 95/11917、WO 95/12612、WO 95/12572、WO 95/10514、美國專利號(hào)5,661,152、WO 95/10515、WO 95/10516、WO 95/24612、WO 95/34535、WO95/25086、WO 96/05529、WO 96/06138、WO 96/06193、WO 96/16443、WO 96/21701、WO 96/21456、WO 96/22278、WO 96/24611、WO96/24612、WO 96/05168、WO 96/05169、WO 96/00736、美國專利號(hào)5,571,792、WO 96/17861、WO 96/33159、WO 96/34850、WO 96/34851、WO 96/30017、WO 96/30018、WO 96/30362、WO 96/30363、WO96/31111、WO 96/31477、WO 96/31478、WO 96/31501、WO 97/00252、WO 97/03047、WO 97/03050、WO 97/04785、WO 97/02920、WO97/17070、WO 97/23478、WO 97/26246、WO 97/30053、WO 97/443 50、WO 98/02436和美國專利號(hào)5,532,359。異戊烯基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑對(duì)血管生成的作用的實(shí)例參見European J.of Caner，第35卷，第9期，第1394-1401頁(1999年)。
“血管生成抑制劑”是指抑制新血管形成的化合物，與機(jī)制無關(guān)。血管生成抑制劑的實(shí)例包括但不限于酪氨酸激酶抑制劑(例如酪氨酸激酶受體Flt-1(VEGFR1)和Flk-1/KDR(VEGFR2)抑制劑)、表皮衍生生長因子抑制劑、成纖維細(xì)胞衍生生長因子抑制劑或血小板衍生生長因子抑制劑、MMP(基質(zhì)金屬蛋白酶)抑制劑、整聯(lián)蛋白阻滯劑、干擾素-α、白介素-12、聚硫酸戊聚糖、環(huán)加氧酶抑制劑(包括非甾族抗炎劑(NSAIDs)，比如阿斯匹林和布洛芬，以及選擇性環(huán)氧加酶-2抑制劑，比如西利考昔和羅非考昔)(PNAS，第89卷，第7384頁(1992年)；JNCI，第69卷，第475頁(1982年)；Arch.Opthalmol.，第108卷，第573頁(1990年)；Anat.Rec.，第238卷，第68頁(1994年)；FEBS Letters，第372卷，第83頁(1995年)；Clin，Orthop.第313卷，第76頁(1995年)；J.Mol.Endocrinol.，第16卷，第107頁(1996年)；Jpn.J.Pharmacol.，第75卷，第105頁(1997年)；Cancer Res.，第57卷，第1625頁(1997年)；Cell，第93卷，第705頁(1998年)；Intl.J.Mol.Med.，第2卷，第715頁(1998頁)；J.Biol..Chem.，第274，第9116頁(1999年))、甾族抗炎藥(例如皮質(zhì)甾類、鹽皮質(zhì)甾類固醇、地塞米松、潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、培他米松)、羧基酰胺基三唑、考布他汀A-4、角鯊胺、6-O-氯乙酰-羰基-煙曲霉醇、沙利度胺、血管生長抑素、肌原蛋白-1、血管緊張素II拮抗劑(參見Fernandez等人，J.Lab.Clin.Med.105141-145(1985))和抗VEGF抗體(參見Nature Biotechnology，第17卷，第963-968頁(1999年10月)；Kim等，Nature，362，841-844(1993)；WO 00/44777和WO 00/61186)。
其它調(diào)節(jié)或抑制血管生成的并且可以與本發(fā)明化合物聯(lián)合使用的治療劑，包括調(diào)節(jié)或抑制凝固系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng)的試劑(參見Clin.Chem.La.Med.38679-692(2000)中的綜述)。所述調(diào)節(jié)或抑制凝固途徑和纖維蛋白溶解途徑的試劑的實(shí)例包括但不限于肝素(參見Thromb.Haemost.8010-23(1998))、低分子量肝素和羧肽酶U抑制劑(亦稱活性凝血酶激活的纖維蛋白溶解抑制劑[TAFIa]抑制劑)(參見Thrombosis Res.101329-354(2001))。TAFIa抑制劑已經(jīng)在WO 03/13526中進(jìn)行了描述。
“干擾細(xì)胞周期關(guān)卡的藥物”是指抑制轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞周期關(guān)卡信號(hào)的蛋白激酶，因而致敏癌細(xì)胞成為DNA損傷劑的化合物。所述試劑包括ATR抑制劑、ATM抑制劑、Chk1和Chk2激酶抑制劑、及cdk和cdc激酶抑制劑，其中的具體實(shí)例為7-羥基星孢素、黃酮類抗腫瘤藥(flavopiridol)、CYC202(Cyclacel)和BMS-387032。
“細(xì)胞增殖和生存信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑”是指抑制細(xì)胞表面受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)下游的化合物。此類抑制劑包括絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑(包括但不限于例如在WO 02/083064、WO 02/083139、WO 02/083140和WO 02/083138中描述的Akt抑制劑)、Raf激酶抑制劑(例如BAY-43-9006)、MEK抑制劑(例如CI-1040和PD-098059)、mTOR抑制劑(例如Wyeth CCI-779)和PI3K抑制劑(例如LY294002)。
如上所述，與NSAID的組合涉及為有效的COX-2抑制劑的NSAID的應(yīng)用。對(duì)于本說明書，如果通過細(xì)胞或微粒體測定，測得NSAID對(duì)COX-2抑制的IC50為1μM或更低，則是有效的。
本發(fā)明還包括與是選擇性COX-2抑制劑的NSAID的組合。對(duì)于本說明書，當(dāng)NSAID具有抑制COX-2比抑制COX-1超過至少100倍的特異性時(shí)，該NSAID被定義為選擇性COX-2抑制劑，該特異性可通過細(xì)胞或微粒體測定，測出COX-2的IC50與COX-1的IC50之比來評(píng)價(jià)。此類化合物包括但不限于以下文獻(xiàn)所公開的化合物美國專利5,474,995、美國專利5,861,419、美國專利6,001,843、美國專利6,020,343、美國專利5,409,944、美國專利5,436,265、美國專利5,536,752、美國專利5,550,142、美國專利5,604,260、美國專利5,698,584、美國專利5,710,140、WO 94/15932、美國專利5,344,991、美國專利5,134,142、美國專利5,380,738、美國專利5,393,790、美國專利5,466,823、美國專利5,633,272和美國專利5,932,598,它們都在此引入作為參考。
具體可用于本發(fā)明治療方法中的COX-2抑制劑為3-苯基-4-(4-(甲磺?；?苯基)-2-(5H)-呋喃酮；和5-氯-3-(4-甲磺酰)苯基-2-(2-甲基-5-吡啶基)吡啶；或者其藥學(xué)上可接受的鹽。
被描述為COX-2特異性抑制劑并因而用于本發(fā)明中的化合物包括但不限于帕瑞考昔、BEXTRA和CELEBREX或者其藥學(xué)上可接受的鹽。
血管生成抑制劑的其它實(shí)例包括但不限于內(nèi)皮生長抑素、ukrain、豹蛙酶、IM862、(氯乙?；?氨基甲酸5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)環(huán)氧乙烷基]-1-氧雜螺[2，5]辛-6-基酯、acetyldinanaline、5-氨基-1-[[3，5-二氯-4-(4-氯苯甲?；?苯基]甲基]-1H-1，2，3-三唑-4-甲酰胺、CM101、角鯊胺、考布他汀、RPI4610、NX31838、硫酸化磷酸甘露戊糖、7，7-(羰基-二[亞氨基-N-甲基-4，2-吡咯并羰基亞氨基[N-甲基-4，2-吡咯]-羰基亞氨基]-雙-(1，3-萘二磺酸酯)和3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亞甲基]-2-二氫吲哚酮(SU5416)。
以上所應(yīng)用的“整聯(lián)蛋白抑制劑”是指選擇性拮抗、抑制或?qū)股砼潴w與ανβ3整聯(lián)蛋白結(jié)合的化合物；選擇性拮抗、抑制或?qū)股砼潴w與ανβ5整聯(lián)蛋白結(jié)合的化合物；拮抗、抑制或?qū)股砼潴w與ανβ3整聯(lián)蛋白和ανβ5整聯(lián)蛋白兩者結(jié)合的化合物；以及拮抗、抑制或?qū)姑?xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的特殊整聯(lián)蛋白活性的化合物。該術(shù)語還指ανβ6、ανβ8、α1β1、α2β1、α5β1、α6β1和α6β4整聯(lián)蛋白的拮抗劑。該術(shù)語還指ανβ3、ανβ5、ανβ6、ανβ8、α1β1、α2β1、α5β1、α6β1和α6β4整聯(lián)蛋白中任何組合的拮抗劑。
酪氨酸激酶抑制劑的一些具體實(shí)例包括N-(三氟甲基苯基)-5-甲基異唑-4-甲酰胺、3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)甲基茚基]二氫吲哚-2-酮、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧格爾德霉素、4-(3-氯-4-氟苯氨基)-7-甲氧-6-[3-(4-嗎啉基)丙氧基]喹唑啉、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-雙(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺、BIBX1382、2，3，9，10，11，12-六氫-10-(羥甲基)-10-羥基-9-甲基-9，12-環(huán)氧-1H-二吲哚并[1，2，3-fg3’，2’，1’-kl]吡咯并[3，4-i][1，6]苯并二吖辛因-1-酮、SH268、金雀異黃素、STI571、CEP2563、4-(3-氯苯基氨基)-5，6-二甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶基甲磺酸酯、4-(3-溴-4-羥苯基)氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉、4-(4’-羥苯基)氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉、SU6668、STI571A、N-4-氯苯基-4-(4-吡啶基甲基)-1-二氮雜萘胺和EMD121974。
與除抗癌化合物外的其它化合物的組合也包括在本發(fā)明的方法內(nèi)。例如，本申請(qǐng)要求保護(hù)的化合物與PPAR-γ激動(dòng)劑和PPAR-δ激動(dòng)劑的組合可用于治療某些惡性腫瘤。PPAR-γ和PPAR-δ是核過氧化物酶體增殖物激活受體γ和核過氧化物酶體增殖物激活受體δ。PPAR-γ在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)及其參與血管生成已經(jīng)在文獻(xiàn)中得到了報(bào)道(參見J.Cardiovasc.Pharmacol.1998；31909-913；J.Biol.Chem.1999；2749116-9121；Invest.Ophthalmol Vis.Sci.2000；412309-2317)。最近，有報(bào)告說明PPAR-γ激動(dòng)劑在體外抑制血管生成對(duì)VEGF的反應(yīng)；在小鼠中，馬來酸曲格列酮和馬來酸羅西格列酮兩者都抑制視網(wǎng)膜新血管形成的發(fā)育(Arch.Ophthamol.2001；119709-717)。PPAR-γ激動(dòng)劑和PPAR-γ/α激動(dòng)劑的實(shí)例包括但不限于噻唑烷二酮(例如DRF2725、CS-011、曲格列酮、羅西格列酮和吡格列酮)、非諾貝特、吉非貝劑、氯貝丁酯、GW2570、SB219994、AR-H039242、JTT-501、MCC-555、GW2331、GW409544、NN2344、KRP297、NP0110、DRF4158、NN622、GI262570、PNU182716、DRF552926、2-[(5，7-二丙基-3-三氟甲基-1，2-苯基異唑-6-基)氧基]-2-甲基丙酸(公開于WO 01/60807中)和2(R)-7-(3-(2-氯-4-(4-氟苯氧基)苯氧基)丙氧基)-2-乙基苯并二氫吡喃-2-甲酸(公開于WO 02/026729中)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案為目前公開的化合物與用于治療癌癥的基因治療的聯(lián)合應(yīng)用。有關(guān)治療癌癥的基因策略的概況參見Hall等人(Am.J.Hum.Genet.61785-789，1997)和Kufe等人(Cancer Medicine，第五版，第876-889頁，BC Decker，Hamilton 2000)。基因治療可用于傳遞任何腫瘤抑制基因。此類基因的實(shí)例包括但不限于p53，p53可通過重組病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)行傳遞(參見，例如美國專利號(hào)6,069,134)、uPA/uPAR拮抗劑(“Adenovirus-Mediated Delivery of a uPA/uPARAntagonist Suppresses Angiogenesis-Dependent Tumor Growth andDissemination in Mice”，Gene Therapy，1998年8月5(8)1105-13)和干擾素γ(J.Immunol.2000；164217-222)。
本發(fā)明化合物還可以與固有多藥耐藥性(MDR)抑制劑，特別是與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高水平表達(dá)有關(guān)的MDR抑制劑聯(lián)合用藥。此類MDR抑制劑包括p-糖蛋白(P-gp)的抑制劑，例如LY335979、XR9576、OC144-093、R101922、VX853和PSC833(伐司樸達(dá))。
本發(fā)明化合物可與止吐藥聯(lián)合使用從而治療惡心或嘔吐，包括急性嘔吐、延遲嘔吐、晚期嘔吐和先期嘔吐，所述惡心或者嘔吐可能是因單獨(dú)使用本發(fā)明化合物或與放療一起使用而引起。為了預(yù)防或治療嘔吐，本發(fā)明化合物可與其它止吐藥聯(lián)合使用，特別是與下述止吐藥聯(lián)合使用神經(jīng)激肽-1受體拮抗劑；5HT3受體拮抗劑，例如昂丹司瓊、格拉司瓊、托烷司瓊和zatisetron；GABAB受體激動(dòng)劑，例如巴氯芬；皮質(zhì)甾類，例如地塞米松(Decadron)、Kenalog、曲安西龍(Aristocort)、鼻松(Nasalide)、布地奈德(Preferid)、Benecorten或其它公開于美國專利號(hào)2,789,118、2,990,401、3,048,581、3,126,375、3,929,768、3,996,359、3,928,326和3,749,712中的皮質(zhì)甾類，例如吩噻嗪(如丙氯拉嗪、氟奮乃靜、硫利達(dá)嗪和美索達(dá)嗪)、甲氧氯普胺或屈大麻酚等抗多巴胺能藥。在另一實(shí)施方案中，與選自神經(jīng)激肽-1受體拮抗劑、5HT3受體拮抗劑和皮質(zhì)甾類等止吐藥的聯(lián)合療法得到了公開，其用于治療或預(yù)防由于給予本發(fā)明化合物而引起的嘔吐。
與本發(fā)明化合物聯(lián)用的神經(jīng)激肽-1受體拮抗劑的用途在以下專利得到了全面描述，例如，美國專利號(hào)5,162,339、5,232,929、5,242,930、5,373,003、5,387,595、5,459,270、5,494,926、5,496,833、5,637,699、5,719,147；歐洲專利公布號(hào)EP 0 360 390、0 394 989、0 428 434、0 429366、0 430 771、0 436 334、0 443 132、0 482 539、0 498 069、0 499 313、0 512 901、0 512 902、0 514 273、0 514 274、0 514 275、0 514 276、0 515681、0 517 589、0 520 555、0 522 808、0 528 495、0 532 456、0 533 280、0 536 817、0 545 478、0 558 156、0 577 394、0 585 913、0 590 152、0 59953 8、0 610 793、0 634 402、0 686 629、0 693 489、0 694 535、0 699 655、0 699 674、0 707 006、0 708 101、0 709 375、0 709 376、0 714 891、0 723959、0 733 632和0 776 893；PCT國際專利公布號(hào)WO 90/05525、90/05729、91/09844、91/18899、92/01688、92/06079、92/12151、92/155 85、92/17449、92/20661、92/20676、92/21677、92/22569、93/00330、93/00331、93/01159、93/01165、93/01169、93/01170、93/06099、93/09116、93/10073、93/14084、93/14113、93/18023、93/19064、93/21155、93/21181、93/23380、93/24465、94/00440、94/01402、94/02461、94/02595、94/03429、94/03445、94/04494、94/04496、94/05625、94/07843、94/08997、94/10165、94/10167、94/10168、94/10170、94/11368、94/13639、94/13663、94/14767、94/15903、94/19320、94/19323、94/20500、94/26735、94/26740、94/29309、95/02595、95/04040、95/04042、95/06645、95/07886、95/07908、95/08549、95/11880、95/14017、95/15311、95/16679、95/17382、95/18124、95/18129、95/19344、95/20575、95/21819、95/22525、95/23798、95/26338、95/28418、95/30674、95/30687、95/33744、96/05181、96/05193、96/05203、96/06094、96/07649、96/10562、96/16939、96/18643、96/20197、96/21661、96/29304、96/29317、96/29326、96/29328、96/31214、96/32385、96/37489、97/01553、97/01554、97/03066、97/08144、97/14671、97/17362、97/18206、97/19084、97/19942和97/21702；以及英國專利公布號(hào)2 266 529、2 268 931、2 269 170、2 269590、2 271 774、2 292 144、2 293 168、2 293 169和2 302 689。所述化合物的制備完全描述在上述專利和公布說明書中，它們都在此引入作為參考。
在一種實(shí)施方案中，用于與本發(fā)明化合物聯(lián)用的神經(jīng)激肽-1受體拮抗劑選自2-(R)-(1-(R)-(3，5-雙(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(S)-(4-氟苯基)-4-(3-(5-氧代-1H，4H-1，2，4-三唑并)甲基)嗎啉，或者其藥學(xué)上可接受的鹽，有關(guān)內(nèi)容描述于美國專利號(hào)5,719,147中。
本發(fā)明化合物也可與用于治療貧血的試劑一起給藥。所述貧血治療劑為，例如，連續(xù)紅血球生成受體激活劑(例如阿法依泊汀)。
本發(fā)明化合物還可與用于治療中性粒細(xì)胞減少癥的試劑一起給藥。所述中性粒細(xì)胞減少癥的治療劑為，例如，調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞的形成和功能的造血生長因子(比如，人類粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF))。G-CSF的實(shí)例包括非格司亭。
本發(fā)明化合物還可與例如左旋咪唑、異丙肌苷和日達(dá)仙(Zadaxin)的免疫增強(qiáng)藥一起給藥。
本發(fā)明的化合物還可以與雙膦酸鹽(理解為包括雙膦酸鹽、二膦酸鹽、雙膦酸和二膦酸)聯(lián)合用于治療或預(yù)防癌癥，包括骨癌。雙膦酸鹽的實(shí)例包括但不限于依替膦酸鈉(Didronel)、氨羥二膦酸二鈉(Aredia)、阿倫膦酸鈉(Fosamax)、利塞膦酸鈉(Actonel)、唑來磷酸(Zometa)、伊本膦酸鈉(Boniva)、因卡瞵酸二鈉或英卡膦酸鈉、氯屈膦酸二鈉、EB-1053、米諾膦酸二鈉、奈立膦酸鈉、piridronate和替魯膦酸鈉，包括其所有藥學(xué)上可接受的鹽、衍生物、水合物及其混合物。
由此，本發(fā)明的范圍包括本申請(qǐng)要求保護(hù)的化合物與選自以下的第二化合物的聯(lián)合應(yīng)用雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雄激素受體調(diào)節(jié)劑、類視黃醇受體調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞毒劑/細(xì)胞抑制劑、抗增殖藥、異戊烯基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、HIV蛋白酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、血管生成抑制劑、PPAR-γ激動(dòng)劑、PPAR-δ激動(dòng)劑、固有多藥耐藥性抑制劑、止吐藥、用于治療貧血的藥物、用于治療中性粒細(xì)胞減少癥的藥物、免疫增強(qiáng)藥、細(xì)胞增殖和存活信號(hào)抑制劑、雙膦酸鹽和干擾細(xì)胞周期關(guān)卡的試劑 與本發(fā)明化合物相關(guān)的術(shù)語“給藥”及其變形(例如，“給藥”一種化合物)，意指將化合物或者化合物的前體藥物引入到需要治療的動(dòng)物系統(tǒng)中。當(dāng)本發(fā)明化合物或者其前藥與一種或多種其它活性劑(例如細(xì)胞毒素劑等等)組合提供時(shí)，應(yīng)當(dāng)將“給藥”及其變形理解為包含所述化合物或者其前藥和其它試劑同時(shí)和順序引入。
在本文中使用的術(shù)語“組合物”意圖包括含有指定量的指定成分的產(chǎn)品，以及任何由指定量的指定成分的組合物直接或者間接得到的產(chǎn)品。
在此使用的術(shù)語“治療有效量”是指能夠在組織、系統(tǒng)、動(dòng)物或者人類中引起生物反應(yīng)或者藥物反應(yīng)的活性物質(zhì)或者藥物制劑的量，該量由研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)療醫(yī)生或者其他臨床醫(yī)生進(jìn)行探索。
術(shù)語“治療癌癥”或者“癌癥的治療”是指給藥遭受癌癥癥狀折磨的哺乳動(dòng)物和指通過殺死癌細(xì)胞從而減輕癌癥癥狀的效果，并且指導(dǎo)致癌癥生長和/或轉(zhuǎn)移受到抑制的效果。
在一種實(shí)施方案中，意欲用作第二化合物的血管形成抑制劑選自酪氨酸激酶抑制劑、表皮源生長因子抑制劑、成纖維細(xì)胞源生長因子抑制劑、血小板源生長因子抑制劑、MMP(基體金屬蛋白酶)抑制劑、整聯(lián)蛋白阻斷劑、干擾素-α、白細(xì)胞間介素-12、戊聚糖多硫酸鹽、環(huán)加氧酶抑制劑、羧酰胺基三唑、考布他汀A-4、角鯊胺、6-O-氯乙?；?羰基-煙曲霉醇、沙立度胺、血管生長抑素、肌鈣蛋白-1或者VEGF抗體。在一種實(shí)施方案中，雌激素受體調(diào)節(jié)劑為他莫昔芬或者雷洛昔芬。
權(quán)利要求的范圍還包括治療癌癥的方法，該方法包括聯(lián)合放射治療和/或第二化合物給藥治療有效量的式A化合物，所述第二化合物選自雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雄激素受體調(diào)節(jié)劑、類視黃醇受體調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞毒劑/細(xì)胞抑制劑、抗增殖藥、異戊烯基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、HIV蛋白酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、血管生成抑制劑、PPAR-γ激動(dòng)劑、PPAR-δ激動(dòng)劑、固有多藥耐藥性抑制劑、止吐藥、用于治療貧血的藥物、用于治療中性粒細(xì)胞減少癥的藥物、免疫增強(qiáng)藥、細(xì)胞增殖和存活信號(hào)抑制劑、雙膦酸酯和干擾細(xì)胞周期關(guān)卡的藥物。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是治療癌癥的方法，包括給藥與紫杉醇或曲妥珠單抗聯(lián)用的治療有效量的式A化合物。
本發(fā)明還包括治療或者預(yù)防癌癥的方法，包括協(xié)同COX-2抑制劑給藥治療有效量的式A化合物。
本發(fā)明還包括用于治療或者預(yù)防癌癥的藥物組合物，其中包含治療有效量的式A化合物和選自以下的第二化合物雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雄激素受體調(diào)節(jié)劑、類視黃醇受體調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞毒素/細(xì)胞生長抑制劑、抗增殖劑、異戊二烯基-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、HIV蛋白酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、血管形成抑制劑、PPAR-γ激動(dòng)劑、PPAR-δ激動(dòng)劑、細(xì)胞增殖和存活信號(hào)抑制劑、雙膦酸酯和干擾細(xì)胞檢驗(yàn)點(diǎn)的試劑。
所有標(biāo)出的專利、出版物和未決專利申請(qǐng)都在此引入作為參考。
在以下化學(xué)過程說明和實(shí)施例中使用的縮略語如下AEBSF(對(duì)氨基乙基苯磺酰氟)；Atm(大氣壓)；BSA(牛血清蛋白)；Boc(叔丁氧羰基)；BuLi(正丁基鋰)；CDCl3(氯仿-d)；CuI(碘化亞銅)；CuSO4(硫酸銅)；DCE(二氯乙烷)；DCM(二氯甲烷)；DEAD(偶氮二羧酸二乙酯)；DMF(N，N-二甲基甲酰胺)；DMSO(二甲亞砜)；DTT(二硫蘇糖醇)；EDTA(乙二胺四乙酸)；EGTA(乙二醇-四乙酸)；EtOAc(乙酸乙酯)；EtOH(乙醇)；HOAc(乙酸)；HPLC(高效液相色譜)；HRMS(高分辨率質(zhì)譜)；LCMS(液相色譜儀-質(zhì)譜儀)；LHMDS(雙(三甲基甲硅烷)氨基鋰)；LRMS(低分辨率質(zhì)譜)；Me(甲基)；MeOH(甲醇)；MP-B(CN)H3(大孔氰基硼氫化物)；NaHCO3(碳酸氫鈉)；Na2SO4(硫酸鈉)；Na(OAc)3BH(三乙酰氧基硼氫化鈉)；NH4OAc(乙酸銨)；NBS(N-溴丁二酰胺)；NMR(核磁共振)；PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)；PCR(聚合酶鏈反應(yīng))；Pd(dppf)([1，1′-二(二苯膦基)二茂鐵]鈀)；Pd(Ph3)4(鈀(0)四-三苯基膦)；POCl3(三氯氧磷)；PS-DIEA(聚苯乙烯二異丙基乙胺)；PS-PPh3(聚苯乙烯-三苯膦)；TBAF(四丁基氟化銨)；THF(四氫呋喃)；TFA(三氟乙酸)；和TMSCH2N2(三甲基甲硅烷基重氮甲烷)。
除了其它文獻(xiàn)中已知或者在試驗(yàn)方法中例證說明的標(biāo)準(zhǔn)操作之外，本發(fā)明化合物還可以通過利用以下方案中所示反應(yīng)進(jìn)行制備。由此，以下例證性反應(yīng)方案并不受所列舉化合物或者任何基于例證說明目的而使用的具體取代基的限制。如反應(yīng)方案所示的取代基編號(hào)并不必然與權(quán)利要求中所用編號(hào)相關(guān)，通常為了清楚起見，在上文式A定義中允許有多個(gè)取代基的化合物上顯示連接一個(gè)取代基。
除了其它可以在文獻(xiàn)中已知或者例證說明于試驗(yàn)方法中的標(biāo)準(zhǔn)操作，比如酯水解、保護(hù)基裂解等等之外，可以用于形成本發(fā)明化合物的反應(yīng)通過應(yīng)用如反應(yīng)方案I-X所示的反應(yīng)進(jìn)行制備。
這些反應(yīng)可以以線性順序使用，從而提供本發(fā)明化合物，或者它們可以用于合成片斷，隨后通過反應(yīng)方案中所述的烷基化反應(yīng)進(jìn)行連接。
反應(yīng)方案概要 以下反應(yīng)方案，反應(yīng)方案I-VII提供了制備本發(fā)明化合物二環(huán)部分的有用細(xì)節(jié)。按照反應(yīng)方案VIII-IX，芳基可以被雜環(huán)基部分取代。
反應(yīng)必需的中間體在一些情形中可以市場購買到或者可以根據(jù)文獻(xiàn)方法進(jìn)行制備。如反應(yīng)方案1中所示，適當(dāng)取代的苯基乙炔化合物可以與碘化亞銅反應(yīng)，從而形成相應(yīng)的乙炔銅I-1(參見，例如，Sonogashira，K.；Toda，Y.；Hagihara，N.Tetrahedron Lett.1975，4467)。然后，中間體I可以與適當(dāng)取代的親電部分反應(yīng)，從而提供不對(duì)稱取代的I-2。與NBS反應(yīng)之后進(jìn)行水解，得到I-3(參見，例如，Yusybov，M.S.；Filimonov，VD.；Synthesis 1991，2，131)。多種取代或者未取代的芳基和雜環(huán)基同樣可以市場購買到。
反應(yīng)方案II圖解說明了由適當(dāng)取代的II-1開始進(jìn)行的化合物的制備。該中間體可以與適當(dāng)取代的胺反應(yīng)，從而提供中間體II-2，該化合物可以與適宜的芳基或者雜芳基二胺反應(yīng)，從而提供本發(fā)明化合物的區(qū)域異構(gòu)體混合物，通?？梢詫?duì)該混合物進(jìn)行色譜分離。
反應(yīng)方案III圖解說明了其中“y”為CH和“z”為N的化合物的合成。
反應(yīng)方案IV圖解說明了由適當(dāng)取代的4-氨基-3-硝基苯甲腈IV-I開始進(jìn)行的化合物的制備。然后，使該中間體進(jìn)行微波促進(jìn)的[3+2]環(huán)化加成反應(yīng)，從而得到四唑IV-II。用親電試劑(比如碘代甲烷)對(duì)該酸性四唑進(jìn)行烷基化，得到烷基化四唑的2-甲基(IV-III)/1-甲基(IV-IV)混合物，該混合物可以通過柱色譜進(jìn)行分離。對(duì)IV-III進(jìn)行Ra-Ni氫化，得到二胺IV-V。進(jìn)一步的合成如以上反應(yīng)方案所述。
反應(yīng)方案V是本發(fā)明化合物的合成的例證說明。用適當(dāng)取代的酮與適當(dāng)取代的芳基或者雜芳基氨基醛進(jìn)行Friedlander環(huán)化縮合，從而得到式V-1中間體。將羧酸官能團(tuán)轉(zhuǎn)化為醛官能團(tuán)，得到中間體V-2，該過程可以通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行。用適當(dāng)取代的胺進(jìn)行還原性烷基化作用，從而得到式V-3化合物。
反應(yīng)方案VI圖解說明了中間體V-2的另一種合成方法。
反應(yīng)方案VII圖解說明了由酮VII-1開始的化合物的合成，其中酮VII-1根據(jù)文獻(xiàn)方法進(jìn)行制備(Renault，O.；Dallemagne，P；和Rault，S.，Org.Prep.Proced.Int.，1999，31，324)。使VII-1與N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛縮合，得到酮基-烯胺VII-2，其與2-氰基乙酰胺發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，從而得到吡啶酮VII-3。用三氯氧磷處理VII-3，得到氯代吡啶VII-4。進(jìn)行自由基溴化之后，用適當(dāng)取代的胺進(jìn)行取代，從而得到胺VII-5。隨后使氯代煙酰腈VII-5與多種雙親核化合物反應(yīng)，得到環(huán)化結(jié)構(gòu)VII-6。
反應(yīng)方案I
反應(yīng)方案II
反應(yīng)方案III
反應(yīng)方案IV
反應(yīng)方案V
反應(yīng)方案VI
反應(yīng)方案VII
除了其它可以在文獻(xiàn)中已知或者例證說明于試驗(yàn)方法中的標(biāo)準(zhǔn)操作，比如酯水解、保護(hù)基裂解等等之外，用于形成本發(fā)明化合物的反應(yīng)通過應(yīng)用如反應(yīng)方案VIII和IX所示的反應(yīng)進(jìn)行制備。
進(jìn)一步的反應(yīng)方案概要 反應(yīng)方案VIII圖解說明了1，6-二氮雜萘-6(5H)-酮化合物的制備。所述合成從市售羧酸(VIII-1)開始，將其轉(zhuǎn)化為Weinreb酰胺(VIII-2)。使該酰胺與芳基鋰試劑(通過芳基溴與正丁基鋰進(jìn)行鋰-鹵素交換反應(yīng)得到)反應(yīng)，得到酮(VIII-3)。在堿(例如氫氧化鈉或者甲醇鈉)存在下，使上述取代酮與4-氨基煙堿醛進(jìn)行縮合，得到1，6-二氮雜萘(VIII-4)。苯基上的R取代基可以是比如(甲硅烷基)保護(hù)的羥甲基、掩蔽的醛(即縮醛)或者羧酸的官能團(tuán)。該物質(zhì)可以轉(zhuǎn)化成必需的醛VIII-4。當(dāng)R基團(tuán)為羥甲基時(shí)，用比如活化二氧化錳的試劑對(duì)其進(jìn)行氧化，得到醛VIII-4。當(dāng)R為縮醛時(shí)，進(jìn)行弱酸水解即可得到醛。通過用硼氫化物還原混合酸酐對(duì)羧基進(jìn)行還原，同樣得到醛VIII-4。然后，用不同系列的胺(例如，4-取代哌啶)和硼氫化物對(duì)該醛進(jìn)行還原氨基化，得到1，6-二氮雜萘-5(H)-酮(VIII-5)。在150℃時(shí)用吡啶鹽酸鹽處理(VIII-5)，得到最終產(chǎn)品(VIII-6)。
反應(yīng)方案IX圖解說明了在C3-位置上引入雜環(huán)的另一策略。從市售二氯苯并吡嗪開始，在鈀催化劑存在下使其與芳基硼酸偶聯(lián)(Suzuki反應(yīng))。然后，在相同的反應(yīng)條件下，與另一雜環(huán)硼酸重復(fù)上述反應(yīng)，從而得到最終產(chǎn)品。
反應(yīng)方案X圖解說明了1，6-二氮雜萘-5(6H)-酮化合物的另一種制備方法。在該方案中，使Weinreb酰胺VIII-2與由芳基溴X-1得到的芳基鋰試劑反應(yīng)，其中R為保護(hù)或者掩蔽的氨基甲基衍生物(比如1-(1-疊氮基-1-甲基乙基))，從而得到酮X-2。在甲醇鈉存在下，使該酮與(2-氯-3-甲?；拎?4-基)氨基甲酸叔丁酯進(jìn)行縮合，從而得到1，6-二氮雜萘X-3。在這種情形中，通過用氫氣進(jìn)行鈀催化還原對(duì)胺進(jìn)行去保護(hù)或者去屏蔽，得到胺X-4。用鹽酸處理X-4，得到1，6-二氮雜萘-5(6H)-酮X-5。
反應(yīng)方案VIII
反應(yīng)方案IX
反應(yīng)方案X
實(shí)施例 以下提供的實(shí)施例和方案用于輔助對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步了解。使用的具體物質(zhì)、種類和條件確定為是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，并不是對(duì)其合理范圍的限制。
方案1
5-甲氧基-2(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘(1-7)和2-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑-3-基)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-5(6H)-酮(1-8) N-甲氧基-N-甲基-2-(2-噻吩基)乙酰胺(1-1) 向具有攪拌棒的25mL RB(圓底)燒瓶中加入2-噻吩乙酸(2.84g，2mmol)，隨后向其中加入無水DMF(10mL)。將1，1’-羰基二咪唑(3.24g，2mmol)一次加入其中，產(chǎn)生顯著的氣體逸出。將上述混合物的溫度升高至40℃。30分鐘之后，將N，O-二甲基羥胺鹽酸鹽(2.14g，2.2mmol)一次加入其中。在23℃下將上述混合物攪拌30分鐘，之后用飽和氯化銨溶液(100mL)進(jìn)行稀釋并且用1∶1乙酸乙酯/己烷(100mL)進(jìn)行提取兩次。在硅膠上(0-25％乙酸乙酯/己烷)通過柱色譜法對(duì)所得粗混合物進(jìn)行純化，從而得到N-甲氧基-N-甲基-2-(2-噻吩基)乙酰胺(1-1)。1H NMR(CDCl3，ppm)δ7.20(m，1H)，6.96(m，2H)，3.91(s，2H)，3.70(s，3H)，3.25(s，3H). 1-[4-(1，3-二氧戊環(huán)-2-基)苯基]-2-(2-噻吩基)乙酮(1-2) 向具有攪拌棒的25ml RB燒瓶中加入1-溴-4-1，3-二氧戊環(huán)-2-基)苯(243mg，1.0mmol)，隨后向其中加入無水THF(5mL)。將上述混合物冷卻至-78℃，并且在2分鐘時(shí)間內(nèi)將正丁基鋰(687μ L1.6M己烷溶液)滴加加入其中。在-78℃下攪拌15分鐘之后，將N-甲氧基-N-甲基-2-(2-噻吩基)乙酰胺(1-1)(185mg，1mmol)一次加入其中。在-78℃下再攪拌30分鐘之后，用飽和氯化銨(20mL)將上述混合物猝滅，并且用乙酸乙酯(10mL)提取兩次。合并的有機(jī)提取物用硫酸鈉干燥、進(jìn)行濃縮并且經(jīng)柱色譜在硅膠上(0-50％乙酸乙酯/己烷)進(jìn)行純化，從而得到1-[4-(1，3-二氧戊環(huán)-2-基)苯基]-2-(2-噻吩基)乙酮(1-2)。1HNMR(CDCl3，ppm)δ7.98(d，J＝8.25Hz，2H)，7.45(d，J＝8.25Hz，2H)，7.15(d，J＝5.15Hz，1H)，6.86(m，1H)，6.83(m，1H)，5.77(s，1H)，4.38(s，2H)，4.01(m，4H). (2-氯-3-甲?；拎?4-基)氨基甲酸叔丁酯(1-3) 向4-氨基-2-氯吡啶(30.0g，243mmol)的CH2Cl2(500mL)溶液中加入三乙胺(38mL)、二碳酸二叔丁酯(58.0g)和DMAP(10.0g)。將上述反應(yīng)混合物攪拌過夜，在真空中對(duì)其進(jìn)行濃縮，并且在硅膠上對(duì)其進(jìn)行色譜分離，用1∶1己烷/EtOAc洗脫。將所得固體與CH2Cl2/EtOAc(1∶1)一起進(jìn)行研磨，從而得到N-BOC-4-氨基-2-氯吡啶。1HNMR(500MHz，CDCl3)δ8.19(d，1H)，7.53(d，1H)，7.25(br s，1H)，7.20(dd，1H)，5.80(s，1H)，1.52(s，9H). 在10分鐘時(shí)間內(nèi)，向-78℃的N-Boc-4-氨基-2-氯吡啶(14.4g，63mmol)的THF(200mL)中滴加加入1.7M叔丁基鋰溶液(100mL)，并且將所得溶液攪拌2小時(shí)。然后將DMF(15mL)加入其中，并且使該反應(yīng)升溫至環(huán)境溫度3小時(shí)。用飽和NH4Cl小心地將該反應(yīng)猝滅，用EtOAc進(jìn)行提取，所得有機(jī)層用H2O和鹽水洗滌、用MgSO4干燥、過濾、在真空中進(jìn)行濃縮和通過硅膠色譜法(10-25％EtOAc/己烷)進(jìn)行純化，從而得到為白色固體的(2-氯-3-甲酰基吡啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(1-3)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ10.98(br s，1H)，10.49(s，1H)，8.35(d，1H)，8.28(d，1H)，1.52(s，9H). 4-[5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-2-基]苯甲醛(1-5) 向具有攪拌棒的25ml RB燒瓶中加入1-[4-(1，3-二氧戊環(huán)-2-基)苯基]-2-(2-噻吩基)乙酮(1-2)(80mg，0.29mmol)、(2-氯-3-甲酰基吡啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(1-3)(90mg，0.35mmol)和無水甲醇(2mL)。然后將甲醇鈉(25％w/w甲醇溶液)一次加入其中，并且在65℃下將上述混合物加熱4小時(shí)，從而產(chǎn)生暗橙色懸浮液。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶劑除去，所得混合物用1M鹽酸(10mL)進(jìn)行酸化并且用乙酸乙酯(10mL)提取兩次。在硅膠上(0-50％乙酸乙酯/己烷)通過柱色譜對(duì)所得粗混合物進(jìn)行純化，從而得到2-[4-(1，3-二氧戊環(huán)-2-基)苯基]-5-甲氧基-3-苯基-1，6-二氮雜萘(1-4)。
將2-[4-(1，3-二氧戊環(huán)-2-基)苯基]-5-甲氧基-3-苯基-1，6-二氮雜萘(1-4)溶于THF(4mL)和1M HCl(4mL)溶液的混合物中，并且在23℃下將其攪拌2小時(shí)，直至通過TLC確定沒有原料存在為止。上述反應(yīng)混合物用飽和碳酸氫鈉溶液(10mL)進(jìn)行稀釋并且用乙酸乙酯(10mL)提取兩次。對(duì)合并的有機(jī)提取物進(jìn)行濃縮，從而得到4-[5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-2-基]苯甲醛(1-5)。1H NMR(CDCl3，ppm)δ9.93(s，1H)，8.54(s，1H)，8.12(d，J＝6.0Hz，1H)，7.75(d，J＝8.2Hz，2H)，7.40(d，J＝8.2Hz，2H)，7.19(d，J＝5.0Hz，1H)，7.03(d，J＝3.5Hz，1H)，6.82(d，J＝3.6Hz，1H)，6.69(s，1H)，4.13(s，3H). 5-甲氧基-2(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)- 3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘(1-7) 向具有攪拌棒的25ml RB燒瓶中加入4-[5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-2-基]苯甲醛(1-5)(62mg，0.18mmol)，隨后向其中加入2-(3-哌啶-4-基-1H-1，2，4-三唑-5-基)吡啶二鹽酸鹽(1-6)(82mg，0.36mmol)、無水DMF(1.0mL)、三乙胺(72mg，0.716mmol)和乙酸(107mg，1.79mmol)。然后將三乙酰氧基硼氫化鈉(76g，0.36mmol)一次加入其中，并且在23℃下將所得淺黃色溶液攪拌過夜。上述反應(yīng)混合物用飽和氯化銨溶液(10mL)進(jìn)行稀釋并且用乙酸乙酯(10mL)提取兩次。在硅膠上(0-30％甲醇/二氯甲烷)通過柱色譜對(duì)所得粗混合物進(jìn)行純化，從而得到5-甲氧基-2-(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘(1-7)。1H NMR(CDCl3，ppm)δ8.54(bs，1H)，8.51(s，1H)，8.10(d，J＝6.0Hz，1H)，8.01(d，J＝7.8Hz，1H)，7.68(t，J＝7.7Hz，1H)，7.42(d，J＝8.0Hz，2H)，7.37(d，J＝6.9Hz，1H)，7.29(d，J＝8.0Hz，2H)，7.25(t，J＝3.4Hz，1H)，7.19(d，J＝5.1Hz，1H)，7.15(s，1H)，6.81(t，J＝3.6Hz，1H)，6.68(d，J＝3.1Hz，1H)，4.05(s，3H)，3.98(s，2H)，3.35(s，1H)，3.25(bs，2H)，3.02(bs，2H)，2.75(bs，2H)，2.19(bs，2H). 2-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-4H-1 2 4-三唑-3-基)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3- (2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-5(6H)-酮(1-8) 向具有攪拌棒的10ml RB燒瓶中加入5-甲氧基-2-(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘(1-7)(40mg，0.7mmol)和吡啶鹽酸鹽(738mg，6.4mmol)。在150℃下將上述混合物加熱10分鐘，直至混合物熔化為黃色溶液為止。通過冷卻上述混合物再次固化，用飽和碳酸氫鈉溶液(10mL)進(jìn)行中和并且用乙酸乙酯(10mL)提取兩次。對(duì)合并的有機(jī)提取物進(jìn)行濃縮并且在硅膠上(0-30％甲醇/二氯甲烷)通過柱色譜對(duì)其進(jìn)行純化，從而得到2-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑-3-基)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-5(6H)-酮(1-8)。1H NMR(CDCl3，ppm)δ8.69(s，1H)，8.51(s，1H)，8.40(d，J＝6.0Hz，1H)，8.03(d，J＝7.8Hz，1H)，7.76(t，J＝7.7Hz，1H)，7.39(d，J＝8.0Hz，2H)，7.27(m，4H)，7.22(d，J＝4.4Hz，1H)，6.78(d，J＝5.1Hz，2H)，3.55(s，2H)，2.95(d，J＝11.6Hz，2H)，2.83(bs，1H)，2.14(m，2H)，1.97(m，2H)，1.87(m，2H). 以下表1中的化合物按照類似于方案1所示和反應(yīng)方案中所示的方式進(jìn)行制備 表1
方案2
2-[4-(1-氨基-1-甲基乙基)苯基]-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-5(6H)-酮(2-7) 2-(4-溴苯基)丙-2-醇(2-2) 在-30℃下，將甲基溴化鎂溶液(1.4M 7525甲苯THF溶液，20mL，28mmol)緩緩加入到4-溴苯甲酸乙酯(2-1，2.52g，11.0mmol)的THF(10mL)溶液中。2小時(shí)之后，用氯化銨將上述混合物猝滅并且用醚進(jìn)行提取。所得有機(jī)層用1∶1鹽水∶水洗滌、用硫酸鎂干燥、進(jìn)行過濾并且對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而得到為淺黃色油的標(biāo)題化合物(J.Am.Chem.Soc.1971，93，6877)。
1-(1-疊氮基-1-甲基乙基)-4-溴苯(2-3) 將TFA(4.4mL，45.0mmol)的氯仿(10mL)溶液緩緩加入到冷卻至-5℃的2-(4-溴苯基)丙-2-醇(2-2，2.33g，10.8mmol)和疊氮化鈉(1.42g，21.8mmol)的氯仿(10mL)混合物中，保持溫度低于0℃。將冷卻浴除去并且在室溫下將上述混合物攪拌過夜。將濃氨水加入其中，直至溶液成為堿性(濕潤的pH試紙)。所得有機(jī)層用1∶1鹽水∶水洗滌、用硫酸鎂干燥、進(jìn)行過濾并且對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而得到為淺黃色油的標(biāo)題化合物(2.51g)。
LRMS m/z(M-N2)計(jì)算值197.0，發(fā)現(xiàn)值197.1 1-[4-(1-疊氮基-1-甲基乙基)苯基]-2-(2-噻吩基)乙酮(2-4) 在-78℃下，將nBuLi(1.6M己烷溶液，2.88mL，4.60mmol)滴加加入至1-(1-疊氮基-1-甲基乙基)-4-溴苯(2-3，1.03g，4.28mmol)的THF(20mL)溶液中。15分鐘之后，將N-甲氧基-N-甲基-2-噻吩-2-基乙酰胺(1-1，0.78g，4.18mmol)的THF(1mL)溶液加入其中。在-78℃下再保持30分鐘之后，用飽和氯化銨溶液將反應(yīng)猝滅，用乙酸乙酯提取、用硫酸鎂干燥、進(jìn)行過濾并且對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而得到油。在硅膠上(在30分鐘時(shí)間內(nèi)，5％CH2Cl2，0-10％EtOAc/己烷)經(jīng)自動(dòng)快速柱色譜法對(duì)所得粗產(chǎn)品進(jìn)行純化，從而得到為黃色油的標(biāo)題化合物。
LRMS m/z(M+1)計(jì)算值286.1，發(fā)現(xiàn)值286.2 2-[4-(1-疊氮基-1-甲基乙基)苯基]-5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮 雜萘(2-5) 將甲醇鈉(在甲醇中為25重量％，0.23mL)加入到攪拌的1-[4-(1-疊氮基-1-甲基乙基)苯基]-2-(2-噻吩基)乙酮(2-4，95mg，0.33mmol)和(2-氯-3-甲?；拎?4-基)氨基甲酸叔丁酯(1-3，100mg，0.39mmol)的甲醇(2mL)混合物中，然后在65℃下將其加熱2小時(shí)。將上述混合物冷卻至室溫、用EtOAc稀釋并且用1N HCl進(jìn)行酸化。用乙酸乙酯對(duì)所得水相進(jìn)行提取，合并的有機(jī)物用1∶1鹽水∶水洗滌、用硫酸鎂干燥、進(jìn)行過濾和濃縮，從而得到黑色半固體。在硅膠上(在30分鐘時(shí)間內(nèi)，0-45％EtOAc的己烷溶液，含有5％CH2Cl2)經(jīng)自動(dòng)快速柱色譜法對(duì)所得粗產(chǎn)品進(jìn)行純化，從而得到為琥珀油的標(biāo)題化合物。LRMS m/z(M+1)計(jì)算值402.2，發(fā)現(xiàn)值402.2 2-{4-[5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-2-基]苯基}丙-2-胺(2-6) 在1atm氫氣下，在EtOH(5mL)中，將2-[4-(1-疊氮基-1-甲基乙基)苯基]-5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘(2-5，78mg，0.194mmol)和10％Pd/C(9mg)攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物濾過硅藻土并且對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而得到為透明油的標(biāo)題化合物。LRMS m/z(M+1)計(jì)算值376.1，發(fā)現(xiàn)值376.2 2-[4-(1-氨基-1-甲基乙基)苯基]-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-5(6H)-酮(2-7) 向2-{4-[5-甲氧基-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-2-基]苯基}丙-2-胺(2-6，66mg，0.176mmol)的THF(10mL)溶液中加入濃HCl(1mL)，并且在室溫下將其攪拌5小時(shí)。在真空中將揮發(fā)物蒸發(fā)，并且將所得殘余物分配在飽和碳酸氫鈉溶液和乙酸乙酯之間。所得有機(jī)層用硫酸鎂干燥、進(jìn)行過濾并且對(duì)其進(jìn)行濃縮，從而得到為灰白色固體的標(biāo)題化合物。LRMS m/z(M+1)計(jì)算值362.1，發(fā)現(xiàn)值362.2 實(shí)施例1 人Akt同工酶和ΔPH-Akt1的克隆 pS2neo載體(于2001年4月3日保藏于ATCC，保藏號(hào)為ATCCPTA-3253)按下述方法制備用BglII切割pRmHA3載體(按照Nucl.Acid Res.161043-1061(1988)中所述的方法制備)，分離出2734bp片段。還用BglII切割pUChsneo載體(按照EMBO J.4167-171(1985)中所述的方法制備)，分離出4029bp片段。將這兩個(gè)分離出的片段連接在一起從而形成載體，被稱為pS2neo-1。該質(zhì)粒在金屬硫蛋白啟動(dòng)子和醇脫氫酶聚腺苷酸(poly A)添加位點(diǎn)間含有多接頭。它還有一個(gè)受熱激啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的neo抗性基因。用Psp5II和BsiWI切割pS2neo-1載體。合成兩個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸，然后退火(CTGCGGCCGC(SEQ.ID.NO.1)和GTACGCGGCCGCAG(SEQ.ID.NO.2))。將經(jīng)切割的pS2neo-1與經(jīng)退火的寡核苷酸連接起來從而形成第二載體，即pS2neo。這一基因轉(zhuǎn)變加入了NotI位點(diǎn)，有助于在轉(zhuǎn)染到S2細(xì)胞前線性化。
用以下引物將人脾cDNA(Clontech)通過PCR(Clontech)擴(kuò)增人Akt1基因5’引物5’CGCGAATTCAGATCTACCATGAGCGACGTGGCTATTGTG3’(SEQ.ID.NO.3)和3’引物5’CGCTCTAGAGGATCCTCAGGCCGTGCTGCTGGC3’(SEQ.ID.NO.4)。5’引物包括EcoRI和BglII位點(diǎn)。3’引物包括用于克隆目的的XbaI和BamHI位點(diǎn)。所得的PCR產(chǎn)物作為EcoRI/XbaI片段亞克隆到pGEM3Z(Promega)中。為了表達(dá)/純化目的，用PCR引物5’GTACGATGCTGAACGATATCTTCG 3’(SEQ.ID.NO.5)，在全長Akt1基因的5’末端加上中間T標(biāo)記。所得的PCR產(chǎn)物包含5’KpnI位點(diǎn)和3’BamHI位點(diǎn)，用于與含有昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體pS2neo的生物素標(biāo)記一起符合讀框地亞克隆所述片段。
為了表達(dá)Akt1的血小板白細(xì)胞C激酶底物同源結(jié)構(gòu)域(PH)缺失模型(Δaa 4-129，其中包括Akt1鉸鏈區(qū)部分的缺失)，用pS2neo載體中的全長Akt1基因作為模板，進(jìn)行PCR缺失誘變。用重疊內(nèi)部引物(5’GAATACATGCCGATGGAAAGCGACGGGGCTGAAGAGATGGAGGTG3’(SEQ.ID.NO.6)，和5’CCCCTCCATCTCTTCAGCCCCGTCGCTTTCCATCGGCATGTATTC 3’(SEQ.ID.NO.7))分兩步進(jìn)行PCR，該重疊內(nèi)部引物包含缺失和5’側(cè)翼引物和3’側(cè)翼引物，該5’側(cè)翼引物和3’側(cè)翼引物在5’端具有KpnI位點(diǎn)和中間T標(biāo)記。最終的PCR產(chǎn)物用KpnI和SmaI消化，并連接成為pS2neo全長Akt1 KpnI/SmaI切割載體，用缺失形式有效地替換克隆的5’端。
用氨基端寡聚引物5’GAATTCAGATCTACCATGAGCGATGTTACCATTGTG 3’(SEQ.ID.NO.8)和羧基端寡聚引物5’TCTAGATCTTATTCTCGTCCACTTGCAGAG3’(SEQ.ID.NO.9)，通過成體腦cDNA(Clontech)的PCR，擴(kuò)增人Akt3基因。這些引物包括用于克隆目的的5’EcoRI/BglII位點(diǎn)和3’XbaI/BglII位點(diǎn)。將所得的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM4Z(Promega)的EcoRI和XbaI位點(diǎn)。為了表達(dá)/純化目的，用PCR引物將中間T標(biāo)記加到全長Akt3克隆的5’端，該P(yáng)CR引物為5’GGTACCATGGAATACATGCCGATGGAAAGCGATGTTACCATTGTGAAG 3’(SEQ.ID.NO.10)。所得的PCR產(chǎn)物包含5’KpnI位點(diǎn)，允許用含有昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體pS2neo的生物素標(biāo)記進(jìn)行符合讀框地克隆。
用以下引物，通過從人胸腺cDNA(Clontech)的PCR擴(kuò)增人Akt2基因氨基端寡聚引物 5’AAGCTTAGATCTACCATGAATGAGGTGTCTGTC 3’(SE Q.ID.NO.11)和羧基端寡聚引物5’GAATTCGGATCCTCACTCGCGGATGCTGGC 3’(SEQ.ID.NO.12)。這些引物包括用于克隆目的的5’HindIII/BglII位點(diǎn)和3’EcoRI/BamHI位點(diǎn)。所得的PCR產(chǎn)物可亞克隆到pGem3Z(Promega)的HindIII/EcoRI位點(diǎn)。為了表達(dá)/純化目的，用PCR引物5’GGTACCATGGAATACATGCCGATGGAAAATGAGGTGTCTGTCATCAAAG 3’(SEQ.ID.NO.13)將中間T標(biāo)記加到全長Akt2的5’端。所得的PCR產(chǎn)物亞克隆到上述的pS2neo載體內(nèi)。
實(shí)施例2 人Akt同工酶和ΔPH-Akt1的表達(dá) 用磷酸鈣方法，將pS2neo表達(dá)載體中含有經(jīng)克隆的Akt1、Akt2、Akt3和ΔPH-Akt1基因的DNA純化，并用于轉(zhuǎn)染果蠅(Drosophila)S2細(xì)胞(ATCC)。選出抗生素(G418，500μg/ml)抗性細(xì)胞集合體。將細(xì)胞稀釋至1.0L體積(～7.0×106/ml)，加入生物素和CuSO4，使之終濃度分別為50μM和50mM。細(xì)胞在27℃下生長72小時(shí)，通過離心收獲。細(xì)胞沉淀物置于-70℃冷藏待用。
實(shí)施例3 人Akt同工酶和ΔPH-Akt1的純化 將實(shí)施例2中描述的由1L S2細(xì)胞中得到的細(xì)胞沉淀物，在50ml 1％CHAPS的緩沖液A(50mM Tris pH7.4、1mM EDTA、1mM EGTA、0.2mMAEBSF、10μg/ml苯甲脒、亮抑酶肽、抑蛋白酶肽和抑胃酶肽各5μg/ml、10％甘油和1mM DTT)中，用超聲處理進(jìn)行裂解?？扇苄圆糠钟醚b有9mg/ml抗中間T單克隆抗體的G蛋白瓊脂糖凝膠(Sepharose)快流(Pharmacia)柱純化，用75μM EYMPME(SEQ.ID.NO.14)肽的含25％甘油的緩沖液A洗脫。合并含有Akt/PKB的流分，通過SDS-PAGE對(duì)蛋白質(zhì)純度進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用標(biāo)準(zhǔn)Bradford方案定量測定純化蛋白質(zhì)。用液氮快速冷凍純化蛋白質(zhì)，并貯藏于-70℃。
從S2細(xì)胞中純化的Akt和Akt血小板白細(xì)胞C激酶底物同源結(jié)構(gòu)域缺失需要進(jìn)行活化。在含有下述成分的反應(yīng)物中對(duì)Akt和Akt血小板白細(xì)胞C激酶底物同源結(jié)構(gòu)域缺失進(jìn)行激活(Alessi等，Current Biology7261-269)10nM PDK1(Upstate Biotechnology，Inc.)、脂囊泡(10μM磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(Metreya，Inc.)、100μM磷脂酰膽堿和100μM磷脂酰絲氨酸(Avanti Polar lipids，Inc.))以及激活緩沖液(50mM Tris pH7.4、1.0mM DTT、0.1mM EGTA、1.0μM微囊藻素-LR、0.1mM ATP、10mMMgCl2、333μg/ml BSA和0.1mM EDTA)。反應(yīng)物在22℃下孵育4小時(shí)。在液氮中對(duì)等分試樣進(jìn)行快速冷凍。
實(shí)旋例4 Akt激酶測定 利用GSK衍生生物素化肽底物，對(duì)活化Akt同工酶和血小板白細(xì)胞C激酶底物同源結(jié)構(gòu)域缺失構(gòu)建體進(jìn)行測定。使用對(duì)磷酸肽特異性的鑭螯合物(Lance)偶聯(lián)的單克隆抗體，以及可在肽上與生物素部分結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白連接的別藻藍(lán)蛋白(SA-APC)熒光團(tuán)，通過均相時(shí)間分辨熒光(HTRF)測定肽磷酸化的程度。當(dāng)鑭螯合物和APC接近時(shí)(即與同一磷酸肽分子結(jié)合)，從鑭螯合物到APC產(chǎn)生無輻射能量轉(zhuǎn)移，隨后在665nm從APC發(fā)出發(fā)射光。
測定所需的材料 A.活化Akt同工酶或血小板白細(xì)胞C激酶底物同源結(jié)構(gòu)域缺失構(gòu)建體； B.Akt肽底物GSK3α(S21)肽No.3928生物素- GGRARTSSFAEPG(SEQ.ID.NO.15)，MacromolecularResources； C.鑭螯合物標(biāo)記的抗磷酸GSK3α單克隆抗體(Cell SignalingTechnology，克隆#27)； D.SA-APC(Prozyme目錄號(hào)PJ25S批號(hào)896067)； E.MicrofluorB U形底微量滴定板(Dynex Technologies，目錄號(hào)7205)； F.DiscoveryHTRF微型板分析儀，Packard InstrumentCompany； G.100X蛋白酶抑制劑混合物(PIC)1mg/ml苯甲脒，0.5mg/ml抑胃酶肽，0.5mg/ml亮抑酶肽，0.5mg/ml抑蛋白酶肽； H.10X測定緩沖液500mM HEPES，pH7.5，1％PEG，mM EDTA，1mM EGTA，1％BSA，20mMθ-磷酸甘油； I.猝滅緩沖液50mM HEPES pH7.3，16.6mM EDTA，0.1％BSA，0.1％Triton X-100，0.17nM鑭螯合物標(biāo)記的單克隆抗體克隆#27，0.006mg/ml SA-APC； J.ATP/MgCl2工作液1X測定緩沖液，1mM DTT，1X PIC，125mMKCl，5％甘油，25mM MgCl2，375 TM ATP； K.酶工作液1X測定緩沖液，1mM DTT，1X PIC，5％甘油，活性Akt。選擇最終的酶濃度，使得測定在線性反應(yīng)范圍內(nèi)； L.肽工作液1X測定緩沖液，1mM DTT，1X PIC，5％甘油，2TMGSK3生物素化肽#3928。
通過在96孔微量滴定板適當(dāng)?shù)目字屑尤?6TL ATP/MgCl2使用液，反應(yīng)開始。將抑制劑或載體(1.0Tl)加入其中，隨后將10Tl肽使用液加入其中。通過加入13Tl酶使用液并混合，反應(yīng)開始。使反應(yīng)進(jìn)行50分鐘，然后加入60Tl HTRF猝滅緩沖液終止反應(yīng)。在室溫下，將終止的反應(yīng)至少孵育30分鐘，然后在Discovery儀器上讀數(shù)。
抗生物素蛋白鏈菌素閃現(xiàn)板測定的方法 步驟1 將1μl測試化合物的100％DMSO溶液加入到20μ1 2X基質(zhì)溶液(20uM GSK3肽，300μ MATP，20mM MgCl2，20μ Ci/ml[γ33P]ATP，IX測定緩沖液，5％甘油，1mMDTT，IX PIC，0.1％BSA和100mMKCl)中。通過加入19μl 2X酶溶液(6.4nM活性Akt/PKB，IX測定緩沖液，5％甘油，1mM DTT，IX PIC和0.1％BSA)，磷酸化反應(yīng)得到引發(fā)。然后，在室溫下將上述反應(yīng)孵化45分鐘。
步驟2 通過加入170μl125mM EDTA，反應(yīng)得到終止。將200μl終止的反應(yīng)轉(zhuǎn)移入抗生物素蛋白鏈菌素FlashplatePLUS(NEN LifeSciences，目錄號(hào)SMP103)中。在平板振蕩器上，在室溫下將上述反應(yīng)孵化≥10分鐘。將孔中物質(zhì)從各孔中吸出，并且用200μl TBS/孔清洗各孔兩次。然后，用200μl TBS/孔將各孔洗滌5分鐘，洗滌三次，在洗滌步驟的同時(shí)，在平臺(tái)振蕩器上在室溫下對(duì)板進(jìn)行孵化。
用密封帶蓋上板并且利用適當(dāng)設(shè)定的Packard TopCount對(duì)Flashplates中的[33P]進(jìn)行計(jì)數(shù)。
抗生物素蛋白鏈菌素濾板測定的方法 步驟1 如以上步驟1中所述的抗生物素蛋白鏈菌素閃現(xiàn)板測定進(jìn)行酶促反應(yīng)。
步驟2 通過加入20μl 7.5M的鹽酸胍終止反應(yīng)。將50μl終止的反應(yīng)轉(zhuǎn)移入抗生物素蛋白鏈菌素濾板(SAM2TM Biotin Capture Plate，Promega，目錄號(hào)V7542)中，并且在施加真空之前，在過濾器上將反應(yīng)孵化1～2分鐘。
然后，利用如下所述的真空歧管對(duì)板進(jìn)行洗滌1)4×200μl/孔的2M NaCl；2)6×200μl/孔的2M NaCl與1％H3PO4；3)2×200μl/孔的雙蒸水；和4)2×100μl/孔的95％乙醇。然后，在加入閃爍體之前，使得膜得到完全風(fēng)干。
用白色帶基將板的底部密封，將30μl/孔的Microscint 20(PackardInstruments，目錄號(hào)6013621)加入其中。用透明密封帶密封板的頂部，然后利用[33P]與液體閃爍體適當(dāng)設(shè)定的Packard TopCount對(duì)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。
磷酸纖維素濾板測定的方法 步驟1 如步驟1(以上)的抗生物素蛋白鏈菌素閃現(xiàn)板測定進(jìn)行酶促反應(yīng)，使用KKGGRARTSSFAEPG(SEQ.ID.NO.16)作為基質(zhì)代替生物素-GGRARTSSFAEPG。
步驟2 通過加入20μl 0.75％H3PO4終止反應(yīng)。將50μl終止的反應(yīng)轉(zhuǎn)移入濾板(UNMLTERTM，Whatman P81強(qiáng)陽離子交換劑，白色聚苯乙烯96孔板，Polyfiltronics，目錄號(hào)7700-3312)中，并且在施加真空之前，在過濾器上將反應(yīng)孵化1～2分鐘。
然后，利用如下所述的真空歧管對(duì)板進(jìn)行洗滌1)9×200μl/孔的0.75％H3PO4；2)2×200μl/孔的雙蒸水。用白色帶基將板的底部密封，將30μl/孔的Microscint 20加入其中。用透明密封帶密封板的頂部，然后利用[33P]與液體閃爍體適當(dāng)設(shè)定的Packard TopCount對(duì)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。
PKA測定 每個(gè)單獨(dú)的PKA測定由下列成分組成 A.5X PKA測定緩沖液(200mM Tris pH7.5，100mM MgCl2，5mMθ-巰基乙醇，0.5mM EDTA)； B.50μM用水稀釋的肯普肽(Kemptide)(Sigma)貯液； C.通過將1.0μl33P-ATP[10mCi/ml]稀釋成200Tl 50μM未標(biāo)記ATP貯液制備的33P-ATP； D.10μl稀釋至0.5mg/ml BSA的70nM PKA催化亞基(UBI目錄#14-114)貯液； E.PKA/肯普肽使用液等體積的5X PKA測定緩沖液，肯普肽溶液和PKA催化亞基。
在96深孔測定板中進(jìn)行反應(yīng)。向10Tl33P-ATP溶液中加入抑制劑或載體(10Tl)。向各孔中加入30Tl PKA/肯普肽使用液，反應(yīng)即開始。反應(yīng)物經(jīng)混合，在室溫下孵育20分鐘。加入50Tl 100mM EDTA和100mM焦磷酸鈉，混合，終止反應(yīng)。
用p81磷酸纖維素96孔濾板(Millipore)收集酶反應(yīng)產(chǎn)物(磷酸化肯普肽)。向p81濾板各孔中加入75mM磷酸以制板。通過板底抽真空，經(jīng)過濾，排空各孔。向各孔中加入磷酸(75mM，170μl)。在含磷酸濾板的相應(yīng)孔中，加入30μl等分的各已停止反應(yīng)的PKA反應(yīng)物。抽真空后，肽被截留在濾板上，用75mM磷酸洗滌濾板5次。最后一次洗滌后，將濾板風(fēng)干。向各孔中加入閃爍液(30μl)，在TopCount(Packard)上對(duì)濾板進(jìn)行計(jì)數(shù)。
PKC測定 每個(gè)PKC測定都由下列成分組成 A.10X PKC輔激活緩沖液2.5mM EGTA、4mM CaCl2； B.5X PKC激活緩沖液1.6mg/ml磷脂酰絲氨酸，0.16mg/ml二酰甘油，100mM Tris pH7.5，50mM MgCl2，5mMθ-巰基乙醇； C.在將1.0μl 33P-ATP[10mCi/ml]稀釋成100μl 100μM未標(biāo)記的ATP貯液制備的33P-ATP； D.用水稀釋的髓鞘堿性蛋白(350μg/ml，UBI)； E.稀釋至0.5mg/ml BSA的PKC(50ng/ml，UBI目錄#14-115)； F.PKC/髓鞘堿性蛋白使用液將各5倍體積的PKC輔激活緩沖液和髓鞘堿性蛋白與各10倍體積的PKC激活緩沖液和PKC混合而制得。
在96深孔測定板中進(jìn)行測定。在5.0μl 33P-ATP中加入抑制劑或載體(10Tl)。加入PKC/髓鞘堿性蛋白使用液，混合，即開始反應(yīng)。反應(yīng)物在30℃下孵育20分鐘。加入50Tl 100mM EDTA和100mM焦磷酸鈉，混合后，停止反應(yīng)。在96孔濾板的PVDF膜上收集磷酸化髓鞘堿性蛋白，用閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行定量測定。
用上述測定法，對(duì)上述方案1和表1中所述的本發(fā)明化合物進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)所述化合物對(duì)一種或多種Akt1、Akt2和Akt3的IC50≤50μM。
實(shí)施例5 基于細(xì)胞的測定確定Akt/PKB的抑制 將細(xì)胞(例如具活化Akt的LnCaP或PTEN(-/-)腫瘤細(xì)胞系)接種到100mM培養(yǎng)皿中。當(dāng)細(xì)胞生長至約70-80％匯合時(shí)，再補(bǔ)加5ml新培養(yǎng)基和試驗(yàn)化合物溶液并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)照包括未處理細(xì)胞、經(jīng)載體處理的細(xì)胞和分別用20μM或者200nM LY294002(Sigma)或渥曼青霉素(Sigma)處理的細(xì)胞。細(xì)胞孵育2、4或6小時(shí)，棄培養(yǎng)基。細(xì)胞用PBS洗滌，刮出，并轉(zhuǎn)移到離心管中。使細(xì)胞沉淀，再次用PBS洗滌。最后，將細(xì)胞沉淀物重懸于裂解緩沖液(20mM Tris pH8、140mM NaCl、2mMEDTA、1％Triton、1mM焦磷酸鈉、10mMθ-磷酸甘油、10mM NaF、0.5mM NaVO4、1μM Microsystine和1x蛋白酶抑制劑混合物)中，在冰上放置15分鐘，溫和渦旋使細(xì)胞裂解。將裂解液放入Beckman臺(tái)式超速離心機(jī)中，在4℃以100,000×g離心20分鐘。通過標(biāo)準(zhǔn)Bradford方案(BioRad)對(duì)上清液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，貯藏于-70℃待用。
按下述方法，對(duì)澄清裂解液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫沉淀(IP)對(duì)于Akt1，將裂解液與NETN(100mM NaCl、20mM Tris pH8.0、1mM EDTA、0.5％NP-40)中的Santa Cruz sc-7126(D-17)混合，加入A/G蛋白瓊脂糖凝膠(Santa Cruz sc-2003)。對(duì)于Akt2，將裂解液與NETN中的抗Akt-2瓊脂糖(Upstate Biotechnology#16-174)混合，至于Akt3，將裂解液與NETN中的抗Akt3瓊脂糖(Upstate Biotechnology#16-175)混合。免疫沉淀物(IP)在4℃下孵育過夜，洗滌，用SDS-PAGE進(jìn)行分離。
使用蛋白質(zhì)印跡分析總Akt、pThr308 Akt1、pSer473 Akt1以及Akt2和Akt3上相應(yīng)的磷酸化位點(diǎn)，并用特異性抗體(Cell Signaling Technology)分析Akt下游目標(biāo)抗總Akt(目錄號(hào)9272)、抗磷酸Akt絲氨酸473(目錄號(hào)9271)和抗磷酸Akt蘇氨酸308(目錄號(hào)9275)。在4℃下，與用PBS+0.5％脫脂奶粉(NFDM)稀釋的合適第一抗體孵育過夜后，洗滌印跡，在室溫下，與PBS+0.5％NFDM中的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的第二抗體孵育1小時(shí)。用ECL試劑(Amersham/Pharmacia Biotech RPN2134)檢測蛋白質(zhì)。
實(shí)施例6 調(diào)蛋白刺激的Akt活化 將MCF7細(xì)胞(為PTEN+/+的一種人乳癌系)以1×106細(xì)胞/100mM板接種到培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞為70-80％匯合時(shí)，再補(bǔ)加5ml無血清培養(yǎng)基并孵育過夜。次日上午，加入化合物，孵育細(xì)胞1-2小時(shí)，然后加入調(diào)蛋白(誘導(dǎo)Akt的活化)30分鐘，用上述方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。
實(shí)施例7 腫瘤生長的抑制 癌細(xì)胞生長抑制劑的體內(nèi)功效，可通過幾種本領(lǐng)域眾所周知的方案加以確定。
第0天，在6-10周齡的雌性無胸腺小鼠(Harlan)左脅處，皮下注射人腫瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有PI3K途徑(例如LnCaP、PC3、C33a、OVCAR-3、MDA-MB-468等)失調(diào)。隨機(jī)將小鼠分為載體組、化合物組或聯(lián)合治療組。從第一天起，每天經(jīng)皮下給藥，并在實(shí)驗(yàn)過程中連續(xù)給藥?；蛘?，可選用連續(xù)輸注泵，給予抑制劑試驗(yàn)化合物?；衔?、化合物聯(lián)合藥物或載體以總體積為0.2ml給藥。通常注射細(xì)胞后4-5.5周，當(dāng)所有載體治療的動(dòng)物的損害直徑為0.5-1.0cm時(shí)，切除腫瘤并稱重。計(jì)算每一治療組每一細(xì)胞系腫瘤的平均重量。
序列表
<110>默克公司&Co.，Inc.
N.D.P.科斯福德
M.E.萊頓
J.梁
C.W.林茲利
P.E.桑德森
Z.趙
<120>AKT活性抑制劑
<130>MS0064Y
<150>60/652,737
<151>2005-02-14
<160>16
<170>FastSEQ，Windows文本4.0
<210>1
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>全合成DNA序列
<400>1
ctgcggccgc10
<210>2
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>全合成DNA序列
<400>2
gtacgcggcc gcag 14
<210>3
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>全合成DNA序列
<400>3
cgcgaattca gatctaccat gagcgacgtg gctattgtg39
<210>4
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>全合成DNA序列
<400>4
cgctctagag gatcctcagg ccgtgctgct ggc 33
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>5
gtacgatgct gaacgatatc ttcg24
<210>6
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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gaatacatgc cgatggaaag cgacggggct gaagagatgg aggtg 45
<210>7
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>全合成DNA序列
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cccctccatc tcttcagccc cgtcgctttc catcggcatg tattc 45
<210>8
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<212>DNA
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gaattcagat ctaccatgag cgatgttacc attgtg 36
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tctagatctt attctcgtcc acttgcagag 30
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ggtaccatgg aatacatgcc gatggaaagc gatgttacca ttgtgaag 48
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aagcttagat ctaccatgaa tgaggtgtct gtc 33
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>全合成DNA序列
<400>12
gaattcggat cctcactcgc ggatgctggc 30
<210>13
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>全合成DNA序列
<400>13
ggtaccatgg aatacatgcc gatggaaaat gaggtgtctg tcatcaaag 49
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>全合成氨基酸序列
<400>14
Glu Tyr Met Pro Met Glu
15
<210>15
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>全合成氨基酸序列
<400>15
Gly Gly Arg Ala Arg Thr Ser Ser Phe Ala Glu Pro Gly
1 5 10
<210>16
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>全合成氨基酸序列
<400>16
Lys Lys Gly Gly Arg Ala Arg Thr Ser Ser Phe Ala Glu Pro Gly
15 10 1權(quán)利要求
1.式A化合物
其中
a為0或者1；b為0或者1；m為0、1或者2；n為0、1、2、3或者4；p為0、1、2、3、4或者5；和t為2、3、4、5或者6；
u、v、w和x獨(dú)立地選自CH和N；
y和z獨(dú)立地選自CH和N，條件是y和z中至少一個(gè)是N；
環(huán)K選自(C3-C8)環(huán)烷基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，條件是環(huán)K不是苯基；
R1獨(dú)立地選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、(C＝O)aOb-芳基、(C＝O)aOb(C2-C10)烯基、(C＝O)aOb(C2-C10)炔基、CO2H、鹵素、OH、Ob(C1-C6)全氟烷基、(C＝O)aNR7R8、CN、(C＝O)aOb(C3-C8)環(huán)烷基、S(O)2NR7R8、S(O)2-(C1-C10)烷基和(C＝O)aOb-雜環(huán)基，所述烷基、芳基、烯基、炔基、環(huán)烷基和雜環(huán)基任選被一個(gè)或者多個(gè)選自R6的取代基取代；
R2獨(dú)立地選自氧代、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、(C＝O)aOb-芳基、(C＝O)aOb(C2-C10)烯基、(C＝O)aOb(C2-C10)炔基、CO2H、鹵素、OH、Ob(C1-C6)全氟烷基、(C＝O)aNR7R8、CN、(C＝O)aOb(C3-C8)環(huán)烷基、S(O)2NR7R8、S(O)2-(C1-C10)烷基和(C＝O)aOb-雜環(huán)基，所述烷基、芳基、烯基、炔基、環(huán)烷基和雜環(huán)基任選被一個(gè)或者多個(gè)選自R6的取代基取代；
R3和R4獨(dú)立地選自H、(C1-C6)烷基和(C1-C6)全氟烷基，或者R3和R4合起來形成-(CH2)t-，其中一個(gè)碳原子任選被選自O(shè)、S(O)m、-N(Rb)C(O)-和-N(CORa)-的部分替換；
R5選自NR7R8；
R6為(C＝O)aObC1-C10烷基、(C＝O)aOb芳基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、(C＝O)aOb雜環(huán)基、CO2H、鹵素、CN、OH、ObC1-C6全氟烷基、Oa(C＝O)bNR7R8、氧代、CHO、(N＝O)R7R8、S(O)2NR7R8、S(O)2-(C1-C10)烷基或者(C＝O)aObC3-C8環(huán)烷基，所述烷基、芳基、烯基、炔基、雜環(huán)基和環(huán)烷基任選被一個(gè)或者多個(gè)選自R6a的取代基取代；
R6a選自(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、Oa(C1-C3)全氟烷基、(C0-C6)亞烷基-S(O)mRa、氧代、OH、鹵素、CN、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C6)環(huán)烷基、(C0-C6)亞烷基-芳基、(C0-C6)亞烷基-雜環(huán)基、(C0-C6)亞烷基-N(Rb)2、C(O)Ra、(C0-C6)亞烷基-CO2Ra、C(O)H和(C0-C6)亞烷基-CO2H，所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基和雜環(huán)基任選被最高達(dá)三個(gè)選自R6b的取代基取代；
R6b選自(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、Oa(C1-C3)全氟烷基、(C0-C6)亞烷基-S(O)mRa、氧代、OH、鹵素、CN、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、(C3-C6)環(huán)烷基、(C0-C6)亞烷基-芳基、(C0-C6)亞烷基-雜環(huán)基、(C0-C6)亞烷基-N(Rb)2、C(O)Ra、(C0-C6)亞烷基-CO2Ra、C(O)H和(C0-C6)亞烷基-CO2H，所述烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基和雜環(huán)基任選被最高達(dá)三個(gè)選自Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、鹵素、CO2H、CN、Oa(C＝O)b(C1-C6)烷基、氧代和N(Rb)2的取代基取代；
R7和R8獨(dú)立地選自H、(C＝O)aOb(C1-C10)烷基、(C＝O)aOb(C3-C8)環(huán)烷基、(C＝O)aOb-芳基、(C＝O)aOb-雜環(huán)基、(C2-C10)烯基、(C2-C10)炔基、SO2Ra和(C＝O)aNRb2，所述烷基、環(huán)烷基、芳基、雜環(huán)基、烯基和炔基任選被一個(gè)或多個(gè)選自R6a的取代基取代，或者R7和R8可以與它們連接的氮原子合起來形成在各個(gè)環(huán)中具有3-7個(gè)環(huán)原子和除了氮之外任選另外含有一個(gè)或者兩個(gè)選自N、O和S的雜原子的單環(huán)或者二環(huán)雜環(huán)，所述單環(huán)或者二環(huán)雜環(huán)任選被一個(gè)或者多個(gè)選自R6a的取代基取代；
Ra為(C1-C6)烷基、(C3-C6)環(huán)烷基、芳基、或者雜環(huán)基；和
Rb為H、(C1-C6)烷基、芳基、雜環(huán)基、(C3-C6)環(huán)烷基、(C＝O)aOb(C1-C6)烷基或者S(O)2Ra；
或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的式B所示化合物
其中
q為0、1、2、3或者4；
Q獨(dú)立地選自雜環(huán)基，所述雜環(huán)基任選被1～3個(gè)選自R6b的取代基取代；
和所有其它取代基和變量如權(quán)利要求1中所定義；
或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的式C所示化合物
其中
所有其它取代基和變量如權(quán)利要求2中所定義；
或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的式D所示化合物
其中
所有其它取代基和變量如權(quán)利要求2中所定義；
或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的式E所示化合物
其中
所有其它取代基和變量如權(quán)利要求2中所定義；
或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的式F所示化合物
其中
所有其它取代基和變量如權(quán)利要求1中所定義；
或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的式G所示化合物
其中
R3和R4獨(dú)立地為H和(C0-C6)烷基，其中所述烷基任選被最高達(dá)三個(gè)選自以下的取代基取代OH和鹵素；和其中R3和R4可以連接在一起形成(C3-C7)環(huán)烷基；和
所有其它取代基和變量如權(quán)利要求1中所定義；
或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，選自
5-甲氧基-2(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘；
2-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑-3-基)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-5(6H)-酮；
1-{4-[4-(3-嘧啶-5-基喹喔啉-2-基)芐基]環(huán)己基}-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮；
3-[3-(4-{[4-2-氧代-2，3-二氫-1H-苯并咪唑-1-基)環(huán)己基]甲基}苯基)喹喔啉-2-基]噻吩-2-甲醛；
1-(4-{4-[3-(1H-吡唑-5-基)喹喔啉-2-基]芐基}環(huán)己基)-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮；和
2-[4-(1-氨基-1-甲基乙基)苯基]-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-5(6H)-酮；或者其藥學(xué)上可接受的鹽或者立體異構(gòu)體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物的TFA鹽，所述化合物選自
5-甲氧基-2(4-{[4-5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘；
2-(4-{[4-(5-吡啶-2-基-4H-1，2，4-三唑-3-基)哌啶-1-基]甲基}苯基)-3-(2-噻吩基)-1，6-二氮雜萘-5(6H)-酮；
1-{4-[4-(3-嘧啶-5-基喹喔啉-2-基)芐基]環(huán)己基}-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮；
3-[3-(4-{[4-2-氧代-2，3-二氫-1H-苯并咪唑-1-基)環(huán)己基]甲基}苯基)喹喔啉-2-基]噻吩-2-甲醛；和
1-(4-{4-[3-(1H-吡唑-5-基)喹喔啉-2-基]芐基}環(huán)己基)-1，3-二氫-2H-苯并咪唑-2-酮；
或者其立體異構(gòu)體。
10.一種藥物組合物，含有藥物載體和分散于其中的治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物的用途，用于制備在需要所述治療的哺乳動(dòng)物中治療或者預(yù)防癌癥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供抑制Akt活性的化合物。特別是，本發(fā)明公開的化合物選擇性地抑制一種或者兩種Akt同工酶。本發(fā)明還提供了包含所述抑制性化合物的組合物和通過將所述化合物給藥至需要治療癌癥的患者而抑制Akt活性的方法。
文檔編號(hào)A61K31/395GK101115479SQ200680004464
公開日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2006年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月14日
發(fā)明者N·D·P·科斯福德, M·E·萊頓, J·梁, C·W·林茲利, P·E·桑德森, Z·趙 申請(qǐng)人:默克公司