專利名稱：培養(yǎng)的水母雪蓮細(xì)胞及其提取物在制備治療Ⅱ型糖尿病及預(yù)防其并發(fā)癥的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及培養(yǎng)的水母雪蓮細(xì)胞及其提取物在制備治療II型糖尿病及預(yù)防其并發(fā)癥的藥物中的用途，屬于生物工程和中藥現(xiàn)代化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病是一組病因和發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明的內(nèi)分泌代謝疾病，以高血糖為其共同標(biāo)志。因胰島素絕對或相對分泌不足所造成的糖、蛋白質(zhì)、脂肪和繼發(fā)的水、電解質(zhì)代謝紊亂。它可以涉及全身各個系統(tǒng)，甚至誘發(fā)許多致命性并發(fā)癥，如感染合并癥、視網(wǎng)膜病變、高血壓、腎臟病變、冠心病、下肢血管病變和腦血管病變等，嚴(yán)重影響人的勞動能力，并威脅人的生命安全。糖尿病有幾種類型1)胰島素依賴型糖尿病(I型糖尿病IDDM)；2)非胰島素依賴型糖尿病(II型糖尿病NIDDM)；3)營養(yǎng)不良型糖尿?。?)其它類型糖尿病。其中II型糖尿病患者占糖尿病總患病人數(shù)的95％。
隨著世界人口的老齡化，糖尿病已成為一種常見病、多發(fā)病，是成為繼腫瘤和心腦血管疾病之后的第三大嚴(yán)重危害人類健康的疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2005年統(tǒng)計，全世界約有2億糖尿病患者，中國是糖尿病患者最多的三個國家(印度、中國、美國)之一，目前糖尿病患者數(shù)量已經(jīng)超過4,000萬人(《中國糖尿病防治指南》)。此外，尚有數(shù)千萬的糖調(diào)節(jié)功能受損者(IGR)，此類人群成為糖尿病的龐大“后備軍團(tuán)”。防治糖尿病已成為臨床上重要的、緊迫的醫(yī)療保健問題之一，日益為人們所重視。
臨床治療糖尿病的藥物可分為口服降糖藥、胰島素、免疫抑制劑及其他藥物，其中口服降糖藥和胰島素是最主要的類別。目前尚無治愈糖尿病的有效方法，控制患者血糖水平、預(yù)防并發(fā)癥是治療糖尿病的關(guān)鍵。臨床常用的口服降糖藥主要有磺脲類、雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑和膳食調(diào)節(jié)劑五類。其中，磺脲類、雙胍類藥屬于老一代產(chǎn)品，α-葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑屬于中生代產(chǎn)品，膳食調(diào)節(jié)劑為新生代產(chǎn)品。五類西藥的市場趨勢是磺脲類和雙胍類藥物依然是中國現(xiàn)階段臨床處方的一線用藥，拜糖平的成功運作使得整個α-糖苷酶抑制劑市場份額迅速擴(kuò)大，增敏劑和餐時血糖調(diào)節(jié)劑的銷售金額和數(shù)量都呈明顯的上升趨勢，增長幅度也很接近。
直至20世紀(jì)90年代，口服降糖藥只有磺酰脲(SU)類和雙胍(BG)類2類。最近幾年，α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-GI)類，噻唑烷二酮(TZD)類和速效促胰島素分泌藥等新型降血糖藥物相繼開發(fā)上市。加之具有胰島素抵抗改善作用的第三代SU類藥物上市，及對BG類藥物的重心評估，2型糖尿病治療藥物的選擇范圍變得越來越寬。
(1)磺酰脲(SU)類藥物SU類藥物的主要作用為促進(jìn)胰島素分泌。它的發(fā)展經(jīng)歷了三代第一代主要是甲苯磺丁脲(tolbutamide)和氯磺丙脲(ehloromide)；第二代有格列本脲(glibenclamide，優(yōu)降糖)、格列齊特(gliclazide，達(dá)美康)、格列吡嗪(glipizide，美吡達(dá))和格列喹酮(gliquidone，糖適平)等；第三代有格列美脲(glimepiride)等。目前我國臨床上所用的主要是第二代，第一代仍有少量使用，第三代尚未見臨床應(yīng)用報道。
第三代產(chǎn)品格列美脲雖然促進(jìn)胰島β-細(xì)胞胰島素分泌作用比較弱，但是能增強(qiáng)胰島素的敏感性。隨著胰島β-細(xì)胞中SU受體的實際情況被人們所掌握，研發(fā)具有雙重作用的SU類藥物應(yīng)該是一個值得注意的方向。
(2)雙胍(BG)類藥物BG類藥物的主要作用是增加周圍組織對葡萄糖的利用和抑制腸道對葡萄糖的吸收，抑制肝糖異生和肝糖輸出。此類藥物包括苯乙雙胍(phenformin，降糖靈)和二甲雙胍(flumamine，降糖片)等。
苯乙雙胍有嚴(yán)重乳酸酸中毒的毒副作用，在許多國家已被禁止使用，國內(nèi)臨床也在減少用量。而二甲雙胍可完全避免乳酸酸中毒，同時還能降低血脂，延緩糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生，使心機(jī)梗死的發(fā)生率降低39％；與磺脲類相比，二甲雙胍降糖作用相對緩和，低血糖發(fā)生少。因此二甲雙胍已成為臨床應(yīng)用最廣泛的雙胍類藥物，主要用于聯(lián)合用藥，治療肥胖型糖尿病患者。
(3)α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-GI)類藥物 α-GI類藥物的主要作用是通過抑制α-葡萄糖苷酶，減慢水解及產(chǎn)生葡萄糖的速度并延緩葡萄糖的吸收，從而降低餐后血糖。由于這種抑制作用是可逆的，所以向葡萄糖的轉(zhuǎn)化僅僅是推遲，而不是完全阻斷。它還有一定的降血脂作用，能防治糖尿病的慢性并發(fā)癥。代表藥物有阿卡波糖(acarbose)和伏格列波糖(voglibose)。目前此類藥物被推薦為治療2型糖尿病的二線藥物，國內(nèi)市場大多被進(jìn)口品占據(jù)。主要毒副作用為腸道反應(yīng)，并且價格較貴。
(4)非磺酰脲類胰島素分泌促進(jìn)劑此類藥物和SU類藥物結(jié)構(gòu)雖然不用，但作用機(jī)制卻有相同之處，均為促進(jìn)胰島β-細(xì)胞分泌胰島素，不同之處在于它們與β-細(xì)胞結(jié)合的部位不同。已上市的藥物有瑞格列奈(repaglinide)和那格列奈(nateglinide)。處于III期臨床研究階段的藥物有Kissei公司的mitiglinide。
那格列奈餐后0.78h胰島素水平達(dá)峰值(瑞格列奈為0.92h)，給藥1.5h后胰島素水平與安慰劑相似(瑞格列奈為4h)。由于減少了總的胰島素接觸，減弱餐時葡萄糖的波動，所以誘發(fā)低血糖的危險更小。
(5)胰島素抵抗改善藥物 此類藥物又叫胰島素增敏劑，它能增加周圍組織(肌肉和脂肪組織)對葡萄糖的利用率及降低肝臟對葡萄糖的輸出率。最早發(fā)現(xiàn)有胰島素增敏作用的化合物都具有2，4-噻唑烷二酮(2，4-thiazolidinedione)骨架，因此這類藥物也叫做TZD類藥物。代表藥物有羅格列酮(rosiglitagone)和吡格列酮(pioglitagone)。
臨床研究表明，羅格列酮每日4mg或8mg口服，可使2型糖尿病患者空腹、餐后的血糖及HbAlc均下降，維持降糖效果可達(dá)30個月以上。在糖尿病發(fā)病早期應(yīng)用羅格列酮有利于保護(hù)β-細(xì)胞功能。羅格列酮和他汀類藥物聯(lián)用可以治療糖尿病血脂異常癥，可以使HDL膽固醇上升，甘油三酯保持不變，F(xiàn)FA顯著下降，LDL顯著下降。羅格列酮還可以減少偏位二甲基精氨酸(asymdimethylarginene，ADMA)，降低心血管疾病危險性。在對一組64例非糖尿病的志愿者研究中，測定穩(wěn)態(tài)血糖(steady state plasma glucose，SSPG)濃度及血清ADMA，發(fā)現(xiàn)ADMA的升高可減少葡萄糖的利用量，使SSPG上升；接著對其中7例伴IR、血清ADMA升高的高血壓患者給羅格列酮4mg/d，共4周，然后改為8mg/d，共8周，經(jīng)過12周的治療后再次檢查，發(fā)現(xiàn)這些患者在SSPG降低的同時，血清ADMA均有下降。說明即使對具IR的非糖尿病患者，羅格列酮在提高對胰島素敏感性的同時具有對血管內(nèi)皮的保護(hù)作用。
格列美脲、阿卡波糖、羅格列酮、吡格列酮和瑞格列奈進(jìn)入市場較晚，但它們由于具有良好的臨床療效和巨大的市場潛力而被稱為“五朵金花”，其對應(yīng)產(chǎn)品的代表品牌分別是亞莫利、拜糖平、文迪雅、艾汀、諾和龍。第一代磺脲類藥物格列苯脲(優(yōu)降糖)已處于被淘汰的邊緣；格列吡嗪(美吡達(dá)、迪沙、依必達(dá)、瑞易寧)，格列齊特和格列喹酮(糖適平)是第二代磺脲類藥物，盡管目前購藥金額較大，但均呈現(xiàn)緩慢向下的趨勢。格列美脲是第三代磺脲類藥物，上市時間較晚，由德國Hoechst Marion Roussel公司研制開發(fā)，1995年首次由全球第三大制藥公司安萬特生產(chǎn)上市，商品名為Amaryl，它是目前西方發(fā)達(dá)國家首選的治療II型糖尿病的口服化學(xué)藥，也是全球銷售最好的磺硫脲類產(chǎn)品，2005年的年銷售額為6.77億歐元(相當(dāng)于8億美元)?；请孱愃幬镏饕ㄟ^刺激胰島細(xì)胞分泌胰島素，提高體內(nèi)胰島素的水平。
由于糖尿病治療是一個長期的過程，各種西藥長期使用都有一定的局限性和不良反應(yīng)，甚至是很嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如導(dǎo)致低血糖、乳酸性酸中毒等。到目前為止，還沒有一個藥物能治愈糖尿病，西藥也只是控制血糖而已；使用胰島素，不僅價格昂貴，而且需要每天注射給藥，病人不易堅持，并且給藥時間和劑量需要嚴(yán)格掌握，否則易導(dǎo)致夜間低血糖及黎明現(xiàn)象。故應(yīng)用植物中的天然降糖物質(zhì)治療糖尿病，具有易于接受和堅持及毒副作用小的優(yōu)點。
針對糖尿病患者多表現(xiàn)為消渴癥，如口渴多飲、五心煩熱、乏力多汗等，多運用清熱瀉火、益氣生津之法，改善臨床癥狀。代表藥物如消渴丸(實際為中西藥合劑)、參芪消渴顆粒等。但是中藥制劑缺乏療效肯定的、臨床醫(yī)生和患者都樂于接受的降糖藥物，并且在動物實驗和臨床試驗中極少建立藥學(xué)界認(rèn)可的降糖模型和選擇國際公認(rèn)的療效確切的陽性對照藥物，即中藥的科學(xué)性往往被忽視或被人懷疑。西藥一般是以降糖為主，而開發(fā)有良好降糖效果同時又可防治糖尿病并發(fā)癥的新藥是中醫(yī)藥工作者的當(dāng)務(wù)之急。據(jù)統(tǒng)計，糖尿病患者由心腦血管疾病引起的死亡率約占80％，并使其預(yù)期壽命減少1/3。糖尿病患者合并血脂升高者在80％以上，血粘度升高者達(dá)90％。糖尿病并發(fā)癥重在預(yù)防，即尋找既能降血糖，又能防治糖尿病并發(fā)癥的長期使用毒副作用小的藥物是目前最理想的選擇。
水母雪蓮(Saussurea medusa Maxim)系菊科鳳毛菊屬植物，是一種非常名貴的植物藥材，產(chǎn)于我國甘肅、青海、西藏、新疆等地的海拔4800～5100米的高山礫石間。具有散寒除濕、壯陽補(bǔ)血、抗炎鎮(zhèn)痛等作用，民間用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、陽萎、婦女月經(jīng)不調(diào)、胎衣不下、高山不適應(yīng)癥等。最近臨床及藥理研究證明，雪蓮有延緩衰老及治療腦動脈硬化、缺血性中風(fēng)等癥。雪蓮提取物acacetin、jaceosidin、hisidulin和quercetin等黃酮類化合物對治療癌癥、抗病毒、抗衰老(清除自由基)具有明顯的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供培養(yǎng)的水母雪蓮細(xì)胞及其提取物在制備治療II型糖尿病及預(yù)防其并發(fā)癥的藥物中的用途。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案培養(yǎng)的水母雪蓮細(xì)胞在制備治療II型糖尿病及預(yù)防其并發(fā)癥的藥物中的用途。
其中培養(yǎng)的水母雪蓮細(xì)胞是利用生物工程技術(shù)，通過人工誘變使雪蓮的愈傷組織發(fā)生基因突變，獲得的穩(wěn)定高產(chǎn)雪蓮黃酮的雪蓮細(xì)胞系。
所述人工誘變包括60Co-γ射線照射誘變、溫度誘變和紫外誘變。對原始雪蓮細(xì)胞系采用60Co-γ射線照射誘變，以獲得黃酮產(chǎn)量更高的雪蓮細(xì)胞系；對60Co-γ射線照射誘變獲得的雪蓮細(xì)胞系采用溫度誘變即用高溫和低溫培養(yǎng)，使其基因發(fā)生突變，以適應(yīng)較寬溫度范圍生長的需要，并且提高細(xì)胞生物合成次級代謝產(chǎn)物黃酮的能力；對雪蓮細(xì)胞采用紫外光線照射，使其基因發(fā)生突變，以提高細(xì)胞生物合成次級代謝產(chǎn)物黃酮的能力。
本發(fā)明藥效學(xué)試驗使用了中國發(fā)明專利ZL02156868.5和ZL200310124256.5所述的水母雪蓮細(xì)胞系，取得了意想不到的優(yōu)異效果。根據(jù)本發(fā)明的試驗結(jié)果可推知，通過誘變獲得的雪蓮細(xì)胞系均可能具有本發(fā)明所首次揭示的藥效。因此，即使他人使用其他的雪蓮細(xì)胞系用于制備治療II型糖尿病的藥物或者用于制備預(yù)防II型糖尿病并發(fā)癥的藥物，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明優(yōu)選保護(hù)的雪蓮細(xì)胞系為雪蓮細(xì)胞系TUIP-8，其保藏號為CGMCC No.0855和水母雪蓮細(xì)胞系SMXL-615，其保藏號為CGMCC No.1072。這兩株雪蓮細(xì)胞的培養(yǎng)不受自然條件限制，生長溫度范圍較寬，在18～30℃范圍內(nèi)生長良好，生長快，產(chǎn)品質(zhì)量可控性好；該細(xì)胞株黃酮產(chǎn)量大，培養(yǎng)密度高，培養(yǎng)周期短；細(xì)胞遺傳特性穩(wěn)定，在連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中，細(xì)胞合成黃酮的能力不退化；細(xì)胞聚集生長，細(xì)胞團(tuán)質(zhì)地較硬，可以抵抗較高的剪切力，能在較高轉(zhuǎn)速的反應(yīng)器中生長良好，適合大規(guī)模反應(yīng)器培養(yǎng)植物細(xì)胞實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
培養(yǎng)的水母雪蓮細(xì)胞提取物在制備治療II型糖尿病及預(yù)防其并發(fā)癥的藥物中的用途。該提取物為沸水提取物，可以但不限于通過如下方法制備得到取一定質(zhì)量的新鮮的水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物，壓榨并收集得到的汁液，將剩余水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物加入8-12倍量的沸水中，攪拌1-3分鐘，立即過濾，將得到的汁液與壓榨得到的汁液合并即得。
運用中藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法，雪蓮細(xì)胞提取物還可通過其他公知的技術(shù)得到，例如將雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物加入一定量的水中煎煮、榨汁或加入有機(jī)溶劑萃取。但無論通過何種方式得到的具有本發(fā)明首次揭示的藥效的雪蓮細(xì)胞提取物的用途，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明以國際公認(rèn)的II型糖尿病動物模型KK-Ay糖尿病小鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)為實驗對象，以水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物(中國發(fā)明ZL02156868.5，中國發(fā)明200310124256.5)的沸水浸取物(Aqueous Extract of Saussurea Medusa，AESM)為治療藥物，以全球銷量最好的II型糖尿病治療藥物格列美脲(glimepiride)為陽性對照，研究并揭示了AESM在降糖、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)心肌細(xì)胞和肝臟、改善肝功能、防止脂肪肝形成等方面，具有明顯的療效。
本發(fā)明的優(yōu)點(1)與治療II型糖尿病的化學(xué)藥物相比，AESM長期使用毒副作用小，不僅是單純降低血糖濃度，而且能降低膽固醇、甘油三脂和低密度脂蛋白(LDL)，預(yù)防高血脂，能保護(hù)心肌細(xì)胞，能改善肝功能，防止脂肪肝的形成；(2)與胰島素治療相比，AESM能提高胰島素受體敏感性，使血液中胰島素水平降至正常水平，并且服藥方便；(3)由于本發(fā)明是采用現(xiàn)代生物技術(shù)，通過植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法來獲取藥物，保護(hù)了珍稀的雪蓮植物，也解決了稀有藥物植物來源有限的問題，并且能很好地保證產(chǎn)品的均一性。
下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作出的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1-A為口服水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的沸水浸取物(AESM)可降低KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的血糖并改善其糖耐量結(jié)果1連續(xù)口服給藥28d，格列美脲組和AESM組小鼠血糖控制在正常水平，每組各10只小鼠，與模型組(生理鹽水組)相比，有顯著性差異(P＜0.001，以***表示)。
圖1-B為口服水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的沸水浸取物(AESM)可降低KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的血糖并改善其糖耐量結(jié)果2糖耐量實驗表明，在注射葡萄糖后((2g/kg)，格列美脲組和AESM組可迅速將血糖濃度降至正常水平。每組各10只小鼠，與模型組(生理鹽水組)相比，有顯著性差異(***P＜0.001，**P＜0.01)；圖1-C為口服水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的沸水浸取物(AESM)可降低KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的血糖并改善其糖耐量結(jié)果3在連續(xù)給藥28d后，處死小鼠取血測定血清中胰島素水平，格列美脲組和AESM組均維持在正常水平。每組各10只小鼠，與模型組(生理鹽水組)相比，有顯著性差異。(**P＜0.01)。
圖2為口服水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的沸水浸取物(AESM)可有效調(diào)節(jié)KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的血脂結(jié)果圖。
圖3為口服水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的沸水浸取物(AESM)可有效保護(hù)KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的心肌細(xì)胞圖。
圖4-A為口服水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的沸水浸取物(AESM)可有效改善KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝功能并防止脂肪肝形成結(jié)果1治療終點各組KK/Ay小鼠肝臟形態(tài)。
圖4-B為口服水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的沸水浸取物(AESM)可有效改善KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝功能并防止脂肪肝形成結(jié)果2治療終點各組KK/Ay小鼠肝臟組織切片。
圖4-C為口服水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的沸水浸取物(AESM)可有效改善KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝功能并防止脂肪肝形成結(jié)果3治療終點各組KK/Ay小鼠血清天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性。
圖4-D為口服水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的沸水浸取物(AESM)可有效改善KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝功能并防止脂肪肝形成結(jié)果4治療終點各組KK/Ay小鼠肝臟中糖原的濃度。
具體實施例方式
實施例1水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的沸水浸取物(AESM)的制備取50g搖瓶培養(yǎng)的新鮮的水母雪蓮細(xì)胞TUIP-8的培養(yǎng)物(中國發(fā)明專利ZL02156868.5，本室保存)在研缽中研磨擠壓，將研磨出的汁液單獨收集。取500mL去離子水煮沸，將研碎的水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物倒入沸水中，攪拌2分鐘，立即倒在4層300目不銹鋼絲網(wǎng)上，擠壓收集汁液，并與研磨出的汁液混合，即制備出水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的沸水浸取物(AESM)。
將AESM分裝至10mL玻璃試管中，凍存于-20℃。用前解凍并一次性使用完畢。
實施例2AESM用于治療II型糖尿病模型動物KK/Ay小鼠從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心購得II型糖尿病模型動物KK/Ay小鼠，在25℃條件下連續(xù)光照12小時單獨飼養(yǎng)，隨意喂飼高脂肪高熱量食物。經(jīng)測定小鼠血糖篩選出血糖濃度高的KK/Ay小鼠，并隨機(jī)分成3組，每組10只，雌雄各半。(1)模型組(陰性對照組)，每天口服(灌喂)生理鹽水，劑量為2.5ml/100g體重/只小鼠。(2)水母雪蓮(AESM)治療組，每天1次口服(灌喂)1ml水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物的沸水浸取物。(3)格列美脲治療組(陽性對照組)，每天1次灌喂，每次劑量為0.5mg/kg/只。每周取尾靜脈血一次，用GLUCOCARDTM Test(Arkray Inc.Japan)試劑盒測定血糖濃度。連續(xù)治療28天后，處死小鼠，取血樣和組織評價AESM的療效。
實施例3 AESM可控制II型糖尿病模型KK/Ay小鼠的血糖和胰島素水平連續(xù)給藥28天，每周監(jiān)測KK/Ay小鼠的血糖濃度，實驗顯示，口服AESM可很好控制KK/Ay小鼠的血糖水平(圖1-A和表1)，模型組小鼠血糖一直維持在20-28mmol/L的高血糖狀態(tài)，經(jīng)格列美脲治療，該組小鼠的血糖濃度一直維持在12mmol/L左右的較低水平，而水母雪蓮組的小鼠血糖一直保持在8-10mmol/L的水平，這種血糖濃度非常接近于正常水平(7-8mmol/L)，與模型組有顯著性差別(P＜0.001)，其控制血糖的水平也要優(yōu)于格列美脲組。
表1雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物水提物對KK/Ay小鼠血糖的影響

糖耐量實驗(Glucose Tolerance Test)結(jié)果表明AESM能迅速降低血糖水平(圖1-B和表2)。糖耐量實驗的方法實驗前實驗動物禁食16小時，之后靜脈注射葡萄糖(2g/kg)，分別從尾靜脈在0，30，60，和120分鐘取血測定血糖濃度。圖1-B顯示，靜脈注射葡萄糖30分鐘后，血糖濃度達(dá)到最高，之后便下降，模型組在120分鐘時仍大于16mmol/L，而格列美脲和AESM組在120分鐘時，血糖濃度均下降至7-8mmol/L的正常水平。
表2雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物水提物對KK/Ay小鼠口服葡萄糖耐量的影響

28天治療后處死小鼠取血測定血清中胰島素的水平，采用放射免疫試劑盒(radioimmuno-assay kit)測定，測定步驟按廠家說明書進(jìn)行(Linco Research，St.Charles，MI)。結(jié)果表明，格列美脲組和AESM組的胰島素水平顯著低于模型組(圖1-C和表3)，血清中胰島素水平高是II型糖尿病典型特征，即II型糖尿病為非胰島素依賴性，血糖濃度高并非胰島素分泌不足造成，而是由于相關(guān)細(xì)胞對胰島素的敏感性下降引起的，這一結(jié)果也提示格列美脲和AESM具有胰島素增敏作用。
表3雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物水提物對KK/Ay小鼠血液中胰島素濃度和自由脂肪酸的影響

實施例4 AESM具有調(diào)節(jié)II型糖尿病模型KK/Ay小鼠的血脂作用28天治療后處死小鼠取血測定血清中甘油三脂(TG)(TG E-test，Wako)，膽固醇(CHO)，高密度脂蛋白(HDL)，低密度脂蛋白(LDL)和未脂化的自由脂肪酸(NEFA)(NEFA C-test，Wako)的濃度，測定方法均按試劑盒生產(chǎn)廠家提供的方法進(jìn)行。格列美脲組和AESM組均可顯著降低TG、CHO、LDL和NEFA濃度(表3)，提高HDL的濃度，與模型組(生理鹽水組)相比，有顯著性差異(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)，見圖2和表4所示。
高密度脂蛋白(HDL)濃度高，可有效防止動脈硬化的形成，而TG、CHO、LDL和NEFA濃度高，都會促進(jìn)動脈硬化，導(dǎo)致心腦血管疾病。據(jù)統(tǒng)計，II型糖尿病患者一般都是飲食不當(dāng)，攝入過多脂肪和熱量食品引起的，患病初期大多肥胖，而后期會并發(fā)心腦血管疾病、高血脂。實際上II型糖尿病并發(fā)的心腦血管疾病引起的死亡率約占80％，并使其預(yù)期壽命減少1/3；糖尿病患者合并血脂升高者在80％以上，血粘度升高者達(dá)90％。因此，即能控制血糖水平、又能顯著改善血脂代謝使水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物成為一種非常有潛力的治療II型糖尿病和降血脂的中藥。
表4雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物水提物對KK/Ay小鼠血脂的調(diào)節(jié)作用

實施例5 AESM具有保護(hù)II型糖尿病模型KK/Ay小鼠心肌細(xì)胞的作用28天治療后處死小鼠取血測定血清中乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的濃度，測定方法均按試劑盒生產(chǎn)廠家提供的方法進(jìn)行(LDH，CK體外診斷試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司)。格列美脲組和AESM組均可顯著降低血清中LDH和CK的濃度(**P＜0.01，***P＜0.001)，見圖3和表5所示。LDH和CK是表征心肌細(xì)胞功能的重要指標(biāo)。II型糖尿病患者一般都會并發(fā)心腦血管疾病，供血不足可造成心肌細(xì)胞壞死，而心肌細(xì)胞壞死會釋放出大量的LDH和CK，尤其是CK，是確診急性心肌梗死最主要的生化指標(biāo)。AESM可顯著降低CK濃度，反映出AESM對心肌細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用。
表5雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物水提物對KK/Ay小鼠心肌功能的影響

實施例6 AESM可有效改善KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝功能并防止脂肪肝形成28天治療后處死小鼠取血測定血清中天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性，測定方法均按試劑盒生產(chǎn)廠家提供的方法進(jìn)行(AST，ALT體外診斷試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司)。取肝臟，一部分勻漿，測定肝臟中糖原和甘油三脂的含量。另一部分肝組織用10％中性福爾馬林固定，用石蠟包埋，切片，用蘇木精和伊紅(hematoxylinand eosin，H&E)染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)。
在28天治療期間，格列美脲組和AESM組血清中兩種反映肝功能的轉(zhuǎn)氨酶——天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)——的活性均在正常水平(表6)，而模型小鼠的兩種轉(zhuǎn)氨酶的水平都偏高，超出正常值范圍(圖4-C)，表明AESM有改善肝功能的作用。
表6雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物水提物對KK/Ay小鼠肝功能的影響

解剖小鼠顯示，模型組小鼠的肝臟明顯腫大，并且色澤發(fā)白，肉眼可見纖維化和脂肪化。肝組織染色可見，模型組小鼠肝臟有非常明顯的脂滴，表明KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝臟有形成脂肪肝的傾向。格列美脲治療組的肝臟體積和重量小于模型組，但大于AESM組，AESM組的肝臟色澤暗紅，為正常肝組織，肝組織染色也表明，AESM治療組的肝組織正常，沒有脂滴，也沒有脂肪化的現(xiàn)象，其效果明顯優(yōu)于格列美脲治療組(圖4-A、圖4-B)。測定肝臟組織中糖原含量，AESM組含量最高，表明肝臟將多余糖份轉(zhuǎn)化為糖原的能力明顯增強(qiáng)(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)，見圖4-D和表7。因此，AESM具有非常顯著的改善KK/Ay II型糖尿病模型小鼠的肝功能并防止脂肪肝形成的療效。
表7雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物水提物對KK/Ay小鼠肝臟組織中糖原和甘油三脂含量的影響

權(quán)利要求
1.培養(yǎng)的水母雪蓮細(xì)胞在制備治療II型糖尿病及預(yù)防其并發(fā)癥的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述培養(yǎng)的水母雪蓮細(xì)胞是利用生物工程技術(shù)，通過人工誘變使雪蓮的愈傷組織發(fā)生基因突變，獲得的穩(wěn)定高產(chǎn)雪蓮黃酮的雪蓮細(xì)胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述人工誘變包括60Co-γ射線照射誘變、溫度誘變和紫外誘變。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述水母雪蓮細(xì)胞系為雪蓮細(xì)胞系TUIP-8，其保減號為CGMCC No.0855和水母雪蓮細(xì)胞系SMXL-615，其保藏號為CGMCC No.1072。
5.培養(yǎng)的水母雪蓮細(xì)胞提取物在制備治療II型糖尿病及預(yù)防其并發(fā)癥的藥物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述培養(yǎng)的水母雪蓮細(xì)胞是利用生物工程技術(shù)，通過人工誘變使雪蓮的愈傷組織發(fā)生基因突變，獲得的穩(wěn)定高產(chǎn)雪蓮黃酮的雪蓮細(xì)胞系。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述人工誘變包括60Co-γ射線照射誘變、溫度誘變和紫外誘變。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述水母雪蓮細(xì)胞系為雪蓮細(xì)胞系TUIP-8，其保減號為CGMCC No.0855和水母雪蓮細(xì)胞系SMXL-615，其保藏號為CGMCC No.1072。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述培養(yǎng)的水母雪蓮細(xì)胞提取物通過如下方法制得取一定質(zhì)量的新鮮的水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物，壓榨并收集得到的汁液，將剩余水母雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物加入8-12倍量的沸水中，攪拌1-3分鐘，立即過濾，將得到的汁液與壓榨得到的汁液合并即得。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項所述的用途，其特征在于所述治療II型糖尿病及預(yù)防其并發(fā)癥是指降血糖、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)心肌細(xì)胞和肝臟、改善肝功能和防止脂肪肝形成。
全文摘要
本發(fā)明公開了培養(yǎng)的水母雪蓮細(xì)胞及其提取物在制備治療II型糖尿病及預(yù)防其并發(fā)癥的藥物中的用途。本發(fā)明的優(yōu)點(1)與治療II型糖尿病的化學(xué)藥物相比，長期使用本發(fā)明毒副作用小，不僅是單純降低血糖濃度，而且能降低膽固醇、甘油三脂和低密度脂蛋白(LDL)，預(yù)防高血脂，能保護(hù)心肌細(xì)胞，能改善肝功能，防止脂肪肝的形成；(2)與胰島素治療相比，本發(fā)明能提高胰島素受體敏感性，使血液中胰島素水平降至正常水平，并且服藥方便；(3)由于本發(fā)明是采用現(xiàn)代生物技術(shù)，通過植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法來獲取藥物，保護(hù)了珍稀的雪蓮植物，也解決了稀有藥物植物來源有限的問題，并且能很好地保證產(chǎn)品的均一性。
文檔編號A61P3/10GK1919225SQ20061011317
公開日2007年2月28日 申請日期2006年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月18日
發(fā)明者胡顯文, 段海峰, 高麗華, 陳惠鵬, 陳金龍, 郗永又 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所