專利名稱：介導(dǎo)細(xì)胞吸附和信號(hào)傳遞的細(xì)胞表面分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面分子；組成這些分子的多肽及其片段；包含這些多肽片段和免疫球蛋白片段的融合多肽；編碼這些多肽和片段的基因；帶有這些基因的載體；導(dǎo)入了這些載體的轉(zhuǎn)化體；可與這些多肽或包含這些多肽的細(xì)胞表面分子反應(yīng)的抗體；產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤；包含這些多肽片段或融合多肽的藥用組合物；包含這些抗體的藥用組合物；轉(zhuǎn)基因小鼠；及基因敲出(knockout)小鼠。
背景技術(shù)：
活體哺乳動(dòng)物具有免疫應(yīng)答系統(tǒng)可排除侵入該活體的致病微生物(病毒、細(xì)菌、寄生蟲等)或外源生物體(二者在下文中均稱“抗原”)。這樣的免疫應(yīng)答系統(tǒng)之一稱之為天然免疫應(yīng)答系統(tǒng)，另一為獲得性免疫應(yīng)答系統(tǒng)。前者是排除機(jī)制，包括吞噬細(xì)胞(多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)的吞噬，自然殺傷(NK)細(xì)胞的攻擊，及非特異性識(shí)別如補(bǔ)體對(duì)抗原的調(diào)理。后者，獲得性免疫應(yīng)答系統(tǒng)的排除機(jī)制由獲得抗原特異性的淋巴細(xì)胞(主要是T細(xì)胞和B細(xì)胞)(即活化的淋巴細(xì)胞)完成。已獲抗原特異性的B細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)抗原的特異性抗體攻擊存在于細(xì)胞外的抗原。獲得抗原特異性的T細(xì)胞(稱為活化的T細(xì)胞)被分為輔助T細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞(細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞，CTL)。輔助T細(xì)胞調(diào)節(jié)B細(xì)胞的分化和抗體的產(chǎn)生，并與吞噬細(xì)胞合作破壞抗原。后者，CTL自己攻擊被病毒感染的細(xì)胞及其他(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)增刊，“生物科學(xué)術(shù)語(yǔ)文庫(kù)，免疫”，Yodosha，第14-17頁(yè)(1995))。
T細(xì)胞之獲得抗原特異性(即T細(xì)胞的活化)始于T細(xì)胞識(shí)別由抗原呈遞細(xì)胞(APC)如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、或樹突細(xì)胞呈遞的抗原?？乖蔬f細(xì)胞將加工的抗原納為己有，并使之與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)結(jié)合從而呈遞之。T細(xì)胞識(shí)別通過其細(xì)胞膜表面存在的T細(xì)胞受體(TCR)和CD3抗原的復(fù)合物(TCR/CD3復(fù)合物)而由抗原呈遞細(xì)胞所呈遞的加工后抗原從而接受細(xì)胞活化(或獲得特異性)的初級(jí)信號(hào)。
然而，TCR/CD3復(fù)合物介導(dǎo)的初級(jí)信號(hào)單獨(dú)不足以活化T細(xì)胞，而將導(dǎo)致非應(yīng)答性或克隆無反應(yīng)性，從而使細(xì)胞不能對(duì)隨后收到的任何刺激產(chǎn)生反應(yīng)。白細(xì)胞介素2(IL-2)的自分泌是T細(xì)胞活化，分化為抗原特異性T細(xì)胞克隆，并增殖所必需的。在克隆無反應(yīng)性中，T細(xì)胞由于不產(chǎn)生IL-2和無細(xì)胞分裂而被滅活。即，伴隨產(chǎn)生如IL-2這樣的細(xì)胞因子的T細(xì)胞活化作用在TCR/CD3復(fù)合物傳遞的第一信號(hào)之后需要第二信號(hào)。該第二信號(hào)稱為協(xié)同刺激信號(hào)(costimulatory signal)。
T細(xì)胞接受該第二信號(hào)并將之傳入細(xì)胞，方式是抗原呈遞細(xì)胞上除MHC以外的分子與T細(xì)胞表面除TCR/CD3復(fù)合物的分子相互作用(細(xì)胞粘附)。該第二信號(hào)避免細(xì)胞無反應(yīng)性(克隆無反應(yīng)性)并活化這些細(xì)胞。
盡管抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞這樣的淋巴細(xì)胞之間第二信號(hào)傳遞的機(jī)制中有些部分尚未詳細(xì)闡明，但是到目前為止的研究已揭示第二信號(hào)傳遞中一個(gè)重要的因素是CD28(亦名Tp44，T44或9.3抗原)，主要表達(dá)在T細(xì)胞和胸腺細(xì)胞上的一種細(xì)胞表面分子，與CD80(亦名B7-1，B7，BB1，或B7/BB1)，一種表達(dá)在抗原呈遞細(xì)胞(巨噬細(xì)胞單核細(xì)胞，樹突細(xì)胞，等)上的細(xì)胞表面分子，及與CD86(亦名B7-2或B70)，也是一種抗原呈遞細(xì)胞表面分子，的相互作用(即通過這些分子相互結(jié)合而產(chǎn)生的細(xì)胞粘附)。而且，實(shí)驗(yàn)亦說明細(xì)胞裂解性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)、(其表達(dá)被認(rèn)為是依賴第二信號(hào)而增強(qiáng))與CD80(B7-1)及CD86(B7-2)之間的相互作用(即經(jīng)分子間結(jié)合而產(chǎn)生的細(xì)胞粘附)也是第二信號(hào)調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化時(shí)的重要因素。換而言之，第二信號(hào)傳遞所調(diào)節(jié)的T細(xì)胞活化過程涉及至少CD28與CD80/CD86之間的相互作用，CTLA-4的表達(dá)增強(qiáng)，(這種增強(qiáng)被認(rèn)為取決于上述相互作用)，及CTLA-4與CD80/CD86之間的相互作用。
CD28已知是T細(xì)胞活化和避免無反應(yīng)性所必需的傳遞第二信號(hào)(協(xié)同刺激信號(hào))的協(xié)同刺激分子。通過該分子與抗原呈遞細(xì)胞上的協(xié)同刺激分子，CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的結(jié)合(分子間結(jié)合而致細(xì)胞粘附)所傳遞的第二信號(hào)穩(wěn)定了Th1型細(xì)胞因子的mRNA并隨后促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生大量Th1型細(xì)胞因子如IL-2，IFNγ，TNFα。CTLA-4表達(dá)由TCR/CD3傳遞的初級(jí)信號(hào)誘導(dǎo)，并由CD28與CD80之間的結(jié)合所傳遞的第二信號(hào)增強(qiáng)表達(dá)。已有人揭示CTLA-4接受這些信號(hào)后抑制T細(xì)胞功能這種作用正相反于CD28傳遞的第二信號(hào)引起的T細(xì)胞活化作用。
人CD28和CTLA-4均為I型糖蛋白，分子量分別為44KD和41-43KD。均有免疫球蛋白樣區(qū)，屬于免疫球蛋白超家族，既有細(xì)胞粘附分子的功能又有信號(hào)傳遞分子的功能。
人CD28以二硫鍵形成同型二聚體，而CTLA-4為單體。CD28和CTLA-4的基因均位于人類染色體的“2q33”和小鼠染色體的“1C”，均由4個(gè)外顯子組成。人CD28和CTLA-4分別由220和230個(gè)氨基酸組成，內(nèi)含前導(dǎo)序列，它們之間的氨基酸同源性為20-30％。
CD28和CTLA-4的配體在人和小鼠中為CD80(B7-1)和CD86(B7-2)。CTLA-4與兩種配體的親和力比CD28高約20倍。業(yè)已闡明在各動(dòng)物種之間保守的氨基酸序列結(jié)構(gòu)“MYPPPY(Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr)”對(duì)于CD28和CTLA-4與CD80(B7-1)的結(jié)合很重要。亦有報(bào)道，當(dāng)CD28受刺激時(shí)，PI3激酶(磷酸肌醇3激酶，PI3K)結(jié)合于CD28的一個(gè)部分序列“YMNM(酪氨酸-甲硫氨酸-天冬酰胺-甲硫氨酸)”的磷酸化酪氨酸殘基上，這一CD28在細(xì)胞間經(jīng)這種“YxxM”結(jié)構(gòu)進(jìn)行的信號(hào)傳遞中起重要作用。更進(jìn)一步，有報(bào)道稱CTLA-4在其胞質(zhì)區(qū)也有一個(gè)YxxM的序列，即“YVKM(酪氨酸-纈氨酸-賴氨酸-甲硫氨酸)”，且受到刺激后，SYP與該序列結(jié)合。
CD28特異性表達(dá)于胸腺細(xì)胞和外周血T細(xì)胞，CTLA-4特異性表達(dá)于活化的T細(xì)胞(細(xì)胞工程增刊，“粘附分子手冊(cè)”，Shujunsha，93-102頁(yè)(1994)；同一書中120-136頁(yè)；實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)增刊，“生物科學(xué)術(shù)語(yǔ)文庫(kù)，免疫”，Yodosha，94-98頁(yè)(1995)；實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)增刊，“生物科學(xué)術(shù)語(yǔ)文庫(kù)，細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)”，Yodosha，58-59頁(yè)(1997)；Nihon Rinsho，55卷，6期，215-220頁(yè)(1997))。
在T細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)中(T細(xì)胞功能的活化和抑制中)，復(fù)分子之間，如協(xié)同刺激分子(CD28，CD80(B7-1)，CD86(B7-2)等和CTLA-4這種與上述分子互相作用的分子的相互作用，(換而言之經(jīng)這些分子間結(jié)合而進(jìn)行的細(xì)胞粘附)其重要性已被認(rèn)識(shí)，并使人注意力轉(zhuǎn)移到這些分子與疾病之間的聯(lián)系，及通過調(diào)節(jié)這些分子的功能而治療疾病的方面。
如上述，盡管某一活體活化了其獲得性免疫應(yīng)答系統(tǒng)以對(duì)抗外源生物體的抗原，它仍有免疫耐受以便對(duì)自身成分(自身抗原)不顯示免疫應(yīng)答。如果免疫耐受因某種原因被打破，對(duì)自身抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，自身抗原反應(yīng)性T細(xì)胞將以上述相同的機(jī)制被誘導(dǎo)，而導(dǎo)致免疫異常，引起各種自身免疾病。
換而言之，當(dāng)某活體的免疫系統(tǒng)正常時(shí)，由于正常組織中未受刺激的抗原呈遞細(xì)胞(APC)不表達(dá)協(xié)同刺激分子，即使有與自身抗原起反應(yīng)的自身抗原反應(yīng)性T細(xì)胞存在，也均處于非應(yīng)答狀態(tài)以維持免疫耐受。有人認(rèn)為在免疫異常狀態(tài)下，更多自身抗原反應(yīng)性T細(xì)胞由于非正常過量并持續(xù)表達(dá)協(xié)同刺激分子而活化并因此導(dǎo)致自身免疫病。
近來從這一觀點(diǎn)出發(fā)，提出很多治療各種自身免疫病的嘗試，采取調(diào)節(jié)協(xié)同刺激信號(hào)的傳遞的方法，如上述CD28/CTLA-4與CD80/CD86之間的信號(hào)傳遞。
有人發(fā)現(xiàn)CD80這樣作為CD28和CTLA-4之配體的協(xié)同刺激分子在自身免疫病病灶部位的抗原呈遞細(xì)胞中異常表達(dá)，所述自身免疫病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，自身免疫性甲狀腺炎，過敏性接觸型皮炎，慢性炎癥性皮膚病如扁平苔癬，和牛皮癬。很多人因這一發(fā)現(xiàn)而嘗試通過調(diào)節(jié)CD80的功能來治療各種自身免疫病。
有人提議封閉CD80的功能，方法是用抗CD80的抗體，可相配CD80的CD28可溶性蛋白，可相配CD80的CTLA-4可溶性蛋白。特別是，基于這樣一個(gè)事實(shí)CTLA-4結(jié)合CD80的親和力比CD28高20倍或更多，在動(dòng)物模型和臨床檢驗(yàn)中進(jìn)行了一些治療上的嘗試，所用為“可溶性CTLA-4”，含有“CTLA-4”的胞外區(qū)和人免疫球蛋白IgG1的Fc區(qū)的融合蛋白(CTLA-4-IgFc)(Nihon Rinsho，55卷，6期，215-220頁(yè)(1997))。
如下文1至5所示，已報(bào)道CTLA-4-IgFc在自身免疫病的動(dòng)物模型中的治療效果。
1.在(NZB/NZW)F1小鼠(人系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)模型)中，自身抗體的產(chǎn)生和狼瘡腎炎的發(fā)作均由于發(fā)作前使用了CTLA-4-IgFc而受抑制，即使在發(fā)作后使用該藥也改善了病況(科學(xué)，125卷，1225-1227頁(yè)(1994))。
2.在實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎(EAE)這種多發(fā)性硬化癥(MS)的模型中，由于在免疫接觸種后立即短期使用CTLA-4-IgFc而使發(fā)作被阻止(臨床調(diào)查雜志，95卷，2783-2789頁(yè)(1995))。
3.在NOD(非肥胖型糖尿病)小鼠這種胰島素依賴型糖尿病(IDDM)模型中，由于對(duì)2周齡或3周齡的雌性小鼠持續(xù)兩周施用CTLA-4-IgFc而使發(fā)病率顯著下降(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，181卷，1145-1155頁(yè)(1995))。
4.在由腎小球基底膜免疫所致的大鼠腎炎這種Goodpasture′s腎炎模型中，因施用CTLA-4-IgFc而使癥狀大大改善(歐洲免疫學(xué)雜志，24卷，6期，1249-1254頁(yè)(1994))。
5.在DBA/1小鼠的II型膠原蛋白誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(CIA)這種人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中，因在免疫接種時(shí)施用受試藥物而使關(guān)節(jié)炎的發(fā)作受到抑制，抗膠原蛋白的自身抗體IgG1和IgG2的產(chǎn)生也受抑制(歐洲免疫學(xué)雜志，26卷，2320-2328頁(yè)(1996))。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚未詳細(xì)明確因協(xié)同刺激分子和相關(guān)分子之間的相互作用(即因這些分子間結(jié)合所致細(xì)胞粘附)而使T細(xì)胞活化的機(jī)制。其他未知分子有可能涉及該機(jī)制。
發(fā)明公開如果弄清了上文所述淋巴細(xì)胞如T細(xì)胞活化所必需的第二信號(hào)傳遞過程中所涉及的經(jīng)分子間結(jié)合導(dǎo)致的細(xì)胞粘附而活化淋巴細(xì)胞如T細(xì)胞的機(jī)制，以及弄清淋巴細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)機(jī)制，和能介導(dǎo)該機(jī)制中所涉及的細(xì)胞粘附的已知或未知分子，能傳遞信號(hào)的已知或未知分子均能鑒別和定性。那么用于治療或預(yù)防各種疾病如上述自身免疫病，過敏性疾病，和炎癥性疾病的藥物將會(huì)得到開發(fā)。
本發(fā)明的目的之一是鑒別同時(shí)具有介導(dǎo)該細(xì)胞粘附和信號(hào)傳遞這兩種功能的新型細(xì)胞表面分子，并澄清其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特點(diǎn)。本發(fā)明的另一目的是通過應(yīng)用新型分子或這些分子的抗體而提供可用于治療或預(yù)防各種自身免疫病和炎癥疾病的藥物。
為了鑒別這些有用的分子，本發(fā)明人將注意力集中于以下事實(shí)淋巴細(xì)胞(如T細(xì)胞)在自身免疫病和過敏性疾病中起重要作用；細(xì)胞粘附是第二信號(hào)(協(xié)同刺激信號(hào))從抗原呈遞細(xì)胞向淋巴細(xì)胞傳遞時(shí)所必需的。本發(fā)明人計(jì)劃分離并鑒別特異性地表達(dá)在淋巴細(xì)胞上并介導(dǎo)細(xì)胞粘附的細(xì)胞表面分子。
本發(fā)明人獲得了針對(duì)表達(dá)在淋巴細(xì)胞表面的各種細(xì)胞表面分子的單克隆抗體，其是用上述淋巴細(xì)胞免疫動(dòng)物而得；再用所獲單克隆抗體分離并鑒別所需介導(dǎo)細(xì)胞粘附的表面分子。具體方法詳見下文。
本發(fā)明人首先給小鼠施用大鼠淋巴細(xì)胞系作為抗原，制備各種單克隆抗體(簡(jiǎn)稱單抗)。然后，用所獲單抗與用作抗原的大鼠淋巴細(xì)胞反應(yīng)，檢驗(yàn)單抗對(duì)所給細(xì)胞的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一種單抗可強(qiáng)烈凝集大鼠淋巴細(xì)胞(此單抗命名為“JTT-1抗體”)。而且發(fā)現(xiàn)另一種單抗可強(qiáng)烈抑制由“JTT-1抗體”引起的大鼠淋巴細(xì)胞凝集(此單抗命名為“JTT.2抗體”)。
由于“JTT-1抗體”所致大鼠淋巴細(xì)胞的凝集不受抑制于抗細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的抗體或淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)的抗體，而這兩種抗原分子均是已知最具代表性的細(xì)胞表達(dá)的粘附分子，故本發(fā)明人認(rèn)為這種凝集是由通過未知介導(dǎo)的細(xì)胞粘附的粘附分子的細(xì)胞粘附所致。
由這兩種單抗每一所識(shí)別的細(xì)胞表面分子(命名為“JTT-1抗原”和“JTT.2抗原”)隨后被鑒別。分離并定性。
首先，用“JTT-1抗體”和“JTT-2抗體”以熒光抗體技術(shù)在流式細(xì)胞儀上分析“JTT-1抗原”和“JTT.2抗原”在不同細(xì)胞上的表達(dá)模式。盡管在用刀豆蛋白A(ConA)這種絲裂原刺激胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞活化的活化的淋巴母細(xì)胞(活化的T淋巴母細(xì)胞、活化的B淋巴母細(xì)胞等)中，尤其是在活化的淋巴母細(xì)胞中，強(qiáng)烈表達(dá)“JTT-1抗原”和“JTT.2抗原”，而根本未受刺激的脾細(xì)胞幾乎未見表達(dá)(這些細(xì)胞于本文中有時(shí)稱為“靜息淋巴細(xì)胞”)?！癑TT-1抗體”和“JTT-2抗體”每一所識(shí)別分子的表達(dá)模式幾乎一樣。
將“JTT-1抗體”結(jié)合于吸附劑制備成親和層析柱，由“JTT-1抗體”捕獲的分子，即“JTT-1抗原”將從由上述大鼠淋巴細(xì)胞制備的可溶性細(xì)胞表面分子混合物中純化出來。經(jīng)“JTT-1抗體”和“JTT-2抗體”免疫沉降并經(jīng)SDS-PAGE分析純化的“JTT-1抗原”的分子量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)“JTT-1抗體”和“JTT-2抗體”每一免疫沉降所得分子相同，且每種分子均為有不同糖鏈的同型二聚體。特別是，當(dāng)N連接的糖鏈不經(jīng)消化時(shí)，該分子在非還原狀態(tài)下測(cè)得為分子量約47KD的一種分子，在還原狀態(tài)下測(cè)得分子量分別約24KD和約28KD的兩種分子；當(dāng)N連接的糖鏈?zhǔn)墙?jīng)消化的時(shí)，該分子在非還原狀態(tài)下測(cè)得為約36KD的一種分子，還原狀態(tài)下測(cè)得為約20KD的一種分子。
用包被有純化“JTT-1抗原”的板分析大鼠胸腺細(xì)胞的吸附。結(jié)果，只有“JTT-1抗體”存在時(shí)，胸腺細(xì)胞顯著性吸附于板上(即吸附于“JTT-1抗原”)；并在同時(shí)還有“JTT.2抗體”存在時(shí)，吸附顯著受抑，說明“JTT-1抗原”是介導(dǎo)細(xì)胞粘附的細(xì)胞表面分子。
下一步，本發(fā)明人從大鼠、人和小鼠克隆了編碼“JTT-1抗原”的基因，并分析了它們的結(jié)構(gòu)。
首先，通過利用“JTT-1抗體”的采用淘選法的表達(dá)克隆法從ConA刺激的大鼠脾細(xì)胞衍生的淋巴母細(xì)胞制成的cDNA文庫(kù)中分離編碼全長(zhǎng)“大鼠JTT-1抗原”的cDNA，用雙脫氧法測(cè)定其核苷酸序列而分離并鑒別出一種全新的大鼠基因。編碼全長(zhǎng)“人JTT-1抗原”的基因亦分離自ConA刺激的人外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)，方法是用編碼所獲“大鼠JTT-1抗原”的基因作探針進(jìn)行噬斑雜交，用雙脫氧法測(cè)其核苷酸序列而分離并鑒別出一種全新的人基因。類似地，編碼全長(zhǎng)“小鼠JTT-1抗原”的cDNA分離自ConA刺激的小鼠脾細(xì)胞衍生的淋巴母細(xì)胞cDNA文庫(kù)，用雙脫氧法測(cè)定其核苷酸序列而分離并鑒別出一種全新小鼠基因。更進(jìn)一步，編碼全長(zhǎng)的上述“大鼠JTT-1抗原”之可替換的剪切變異體相似地分離自大鼠胸腺瘤細(xì)胞cDNA文庫(kù)，而用雙脫氧法測(cè)定其核苷酸序列而分離并鑒別出另一種全新大鼠基因。
對(duì)分離的“人JTT-1抗原”cDNA編碼的氨基酸序列進(jìn)行親水性分析發(fā)現(xiàn)“JTT-1抗原”為穿膜蛋白(細(xì)胞表面分子)，由信號(hào)序列，一個(gè)有糖基化位點(diǎn)的胞外區(qū)，一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)胞內(nèi)區(qū)組成，與已知分子的同源性研究發(fā)現(xiàn)大鼠、人和小鼠的“JTT-1抗原”與包括細(xì)胞粘附分子在內(nèi)的任何已知分子均無明顯同源性，說明它們是介導(dǎo)細(xì)胞粘附的新型細(xì)胞表面分子。
對(duì)“人JTT-1抗原”的氨基酸序列進(jìn)行基序查尋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“人JTT-1抗原”與上文所述“CD28”和“CTLA-4”結(jié)構(gòu)相似，而CD28為淋巴細(xì)胞如T細(xì)胞的表面分子，其傳遞的協(xié)同刺激信號(hào)對(duì)于T細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞粘附的活化十分重要，CTLA-4也是淋巴細(xì)胞如T細(xì)胞的表面分子，與信號(hào)一同調(diào)節(jié)活化的淋巴細(xì)胞如活化T細(xì)胞的功能。
結(jié)構(gòu)相似點(diǎn)如下1.20或更多個(gè)包含半脫氨酸殘基在內(nèi)的氨基酸殘基高度保守。
2.作為配體結(jié)合區(qū)必需的脯氨酸重復(fù)序列“Pro-Pro-Pro(PPP)”在胞外區(qū)中為保守的。
3.作為信號(hào)傳遞區(qū)必需的序列“Tyr-Xaa-Xaa-Met(YxxM)”(Xaa和X代表任意氨基酸)在胞漿區(qū)保守。
編碼“小鼠JTT-1抗原”的基因座經(jīng)熒光原位雜交(FISH)法發(fā)現(xiàn)是小鼠染色體上的“IC3”，這相同于小鼠“CD28”和“CTLA-4”的所在位點(diǎn)。
下一步，考查調(diào)整“JTT-1抗原”的功能對(duì)自身免疫病和過敏性疾病的療效，方法是對(duì)實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎(EAE)和腎小球基底膜(GBM)腎炎的模型大鼠施用上述“JTT-2抗體”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種疾病模型動(dòng)物的病理狀況顯著受抑，自身免疫病或過敏性疾病可通過調(diào)節(jié)“JTT-1抗原”的功能而進(jìn)行治療。
還發(fā)現(xiàn)抗“人JTT-1抗原”的單抗顯著增殖人外周血淋巴細(xì)胞，在有抗CD3單抗同時(shí)存在時(shí)此增殖進(jìn)一步增強(qiáng)(CD3為使T細(xì)胞活化必需的T細(xì)胞上接受來自抗原呈遞細(xì)胞的初級(jí)信號(hào)的TCR/CD3復(fù)合物的組成成分)，說明“JTT-1抗原”是涉及向淋巴細(xì)胞傳遞信號(hào)的細(xì)胞表面分子。
更進(jìn)一步，本發(fā)明人成功地生產(chǎn)了含有“人JTT-1抗原”的胞外區(qū)和人免疫球蛋白的Fc區(qū)的融合多肽。該融合多肽可作為藥物通過調(diào)節(jié)“JTT-1抗原”和/或其配體的功能而用于治療自身免疫病，過敏性疾病，和炎癥性疾病。
而且，本發(fā)明人成功地制備了一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其中轉(zhuǎn)入的基因可編碼其它動(dòng)物種的“JTT-1抗原”。該轉(zhuǎn)基因小鼠可用于分析“JTT-1抗原”的具體功能，也可用于開發(fā)藥物以治療自身免疫病，過敏性疾病和炎癥性疾病。發(fā)明人還生成了一種基因敲出小鼠，其中編碼“小鼠JTT-1抗原”的內(nèi)源性基因被滅活。此基因敲出小鼠也適用于上述目的。
本發(fā)明涉及多肽，基因，抗體，載體，轉(zhuǎn)化體，藥用組合物，轉(zhuǎn)基因小鼠，基因敲出小鼠等，均相關(guān)于按上述分離并鑒別所得的新型哺乳動(dòng)物“JTT-1抗原”。特別是，本發(fā)明如以下(1)至(36)所述。
(1)一種組成具有以下特征的細(xì)胞表面分子的多肽(a)該細(xì)胞表面分子至少在胸腺細(xì)胞和絲裂原刺激的淋巴母細(xì)胞上表達(dá)，(b)一種與該細(xì)胞表面分子反應(yīng)的抗體誘導(dǎo)發(fā)生在絲裂原刺激的淋巴母細(xì)胞之間的粘附，(c)一種與該細(xì)胞表面分子反應(yīng)的抗體在有抗CD3抗體存在時(shí)誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞增殖，(d)該細(xì)胞表面分子在其胞外區(qū)氨基酸序列中有一部分為苯丙氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸，且
(e)該細(xì)胞表面分子在其胞質(zhì)區(qū)的氨基酸序列中有一部分是酪氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸。
(2)(1)多肽，包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或包含其中一個(gè)或更多氨基酸被替代、缺失，或加入的SEQ ID NO2的氨基酸序列。
(3)(1)多肽，其由在嚴(yán)格條件下與有SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼。
(4)(1)多肽，包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列有60％或更多同源性的氨基酸序列。
(5)(1)至(4)中任何一個(gè)多肽，其中所說細(xì)胞表面分子來自人類。
(6)編碼(1)至(5)中任何一個(gè)多肽的基因。
(7)(6)基因，其中該基因?yàn)橐欢蝐DNA。
(8)(7)基因，其中該cDNA有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
(9)(7)基因，其中該cDNA含相應(yīng)于SEQ ID NO3的26至625核苷酸殘基，SEQ ID NO4的35至637核苷酸殘基，SEQ ID NO5的1至603核苷酸殘基，或SEQ ID NO6的35至685核苷酸殘基的一段核苷酸序列。
(10)一種載體，包含(6)至(9)中任何一個(gè)基因。
(11)一種轉(zhuǎn)化體，其中導(dǎo)入了(10)的載體。
(12)一種轉(zhuǎn)化體，鑒定為國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-5725。
(13)一種多肽片段，包含(1)至(5)中任一個(gè)多肽的胞外區(qū)。
(14)(13)多肽片段，其中該多肽為有SEQ ID NO2的氨基酸序列的人源多肽。
(15)編碼(13)或(14)的多肽片段的基因。
(16)一種包含兩個(gè)多肽片段的同型二聚體分子，其中每個(gè)片段含有(1)至(5)中任一個(gè)多肽的胞外區(qū)，且此二個(gè)多肽片段彼此以二硫鍵橋聯(lián)。
(17)(16)同型二聚體分子，其中該多肽為具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的人源多肽。
(18)一種藥物組合物，含有(14)多肽片段或含有(17)同型二聚體分子，或二者均含，并包含一個(gè)可藥用載體。
(19)一種融合多肽，含(1)至(5)中任一個(gè)多肽的胞外區(qū)及人免疫球蛋白(Ig)重鏈恒定區(qū)或此恒定區(qū)的一部分。
(20)(19)融合多肽，其中免疫球蛋白為IgG。
(21)(19)融合多肽，其中恒定區(qū)的部分包含IgG的鏈區(qū)，C2區(qū)和C3區(qū)。
(22)(19)至(21)中任一個(gè)融合多肽，其中該多肽為有SEQ ID NO2的一段氨基酸序列的人源多肽。
(23)一種同型二聚體分子，包含(19)至(22)中任意兩個(gè)融合多肽，其中兩個(gè)多肽彼此以二硫鍵橋聯(lián)。
(24)一種同型二聚體分子，包含(22)的兩個(gè)融合多肽，其中兩個(gè)多肽間以二硫鍵橋聯(lián)。
(25)一種藥物組合物，包含(22)融合多肽，或(24)同型二聚體分子，或二者皆有，以及一種可藥用載體。
(26)(25)藥物組合物，其中該藥物組合物用于治療自身免疫病或過敏性疾病，或用于預(yù)防上述疾癥的癥狀。
(27)可與(1)至(5)中任一個(gè)多肽，(13)或(14)多肽片段，或含有該多肽的細(xì)胞表面分子反應(yīng)的一種抗體或其部分。
(28)(27)抗體或其部分，其中該抗體為單抗。
(29)一種可與有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽，或(14)多肽片段，或含該多肽的人源細(xì)胞表面分子反應(yīng)的單抗或其部分。
(30)一種可與(1)至(5)中任一個(gè)多肽，或與含有該多肽的細(xì)胞表面分子反應(yīng)的單抗或其部分，其中該單抗在絲裂原刺激的淋巴母細(xì)胞上的效應(yīng)實(shí)質(zhì)上等同于經(jīng)國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-5707的雜交瘤產(chǎn)生的單抗對(duì)絲裂原刺激的大鼠淋巴母細(xì)胞的效應(yīng)。
(31)一種可與(1)至(5)中任一個(gè)多肽，或與含有該多肽的細(xì)胞表面分子反應(yīng)的單抗或其部分，其中該單抗對(duì)絲裂原刺激的淋巴母細(xì)胞的效應(yīng)實(shí)質(zhì)上等同于國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-5708的雜交瘤所產(chǎn)生的單抗對(duì)絲裂原刺激的大鼠淋巴母細(xì)胞的效應(yīng)。
(32)一種藥物組合物，含有(29)單抗或其部分和可藥用載體。
(33)(32)藥物組合物，其中該藥物組合物用于治療自身免疫病或過敏性疾病，或用于預(yù)防該疾病癥狀。
(34)一種生產(chǎn)(28)至(31)的任一種單抗的雜交瘤。
(35)一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其中整合入其內(nèi)源基因上的編碼(1)多肽的基因是包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的一種人源基因，或是包含相應(yīng)于SEQID NO4的35至637核苷酸殘基的核苷酸序列的大鼠源基因。
(36)一種基因敲出小鼠，其內(nèi)源編碼權(quán)利要求1的小鼠多肽(包含SEQID NO5的基因編碼的氨基酸序列)的基因被滅活，從而不產(chǎn)生該小鼠多肽。
如上所述，本發(fā)明的細(xì)胞表面分子(“JTT-1抗原”)涉及細(xì)胞粘附，向淋巴細(xì)胞(如T細(xì)胞)的信號(hào)傳遞，對(duì)活化的淋巴細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。下文描述了有關(guān)淋巴細(xì)胞，細(xì)胞粘附分子，及它們之間關(guān)系的一般常識(shí)，只是為了對(duì)這些生物學(xué)事件作一般性理解，但以下常識(shí)不是為了限定性解釋本發(fā)明。
淋巴細(xì)胞粗分為兩類，T細(xì)胞和B細(xì)胞。從骨髓的多能干細(xì)胞分化為淋巴樣干細(xì)胞后，其中一些進(jìn)入血流以達(dá)胸腺。淋巴細(xì)胞在胸腺中分化成熟，稱為T細(xì)胞(胸腺衍生T細(xì)胞)，再進(jìn)入血液，循環(huán)于全身。成熟T細(xì)胞在其表面有一稱為CD3的分子。CD3分子的存在是決定該細(xì)胞是否為成熟T細(xì)胞的標(biāo)志。CD3是一個(gè)可信的T細(xì)胞標(biāo)志。此外，T細(xì)胞表達(dá)CD4或CD8。T細(xì)胞分為輔助T細(xì)胞(Th細(xì)胞)，其輔助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體；細(xì)胞毒T細(xì)胞(Tc細(xì)胞，CTL)或殺傷T細(xì)胞，它們可結(jié)合靶細(xì)胞并直接破壞它們；抑制T細(xì)胞，其可抑制B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體；效應(yīng)T細(xì)胞，其分泌效應(yīng)物如淋巴因子引起遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。
B細(xì)胞來自于骨髓中分化和成熟的淋巴樣干細(xì)胞。B細(xì)胞是產(chǎn)生抗體的前體細(xì)胞。因?yàn)樗鼈兪芟鄳?yīng)刺激時(shí)產(chǎn)生抗體。B細(xì)胞在其細(xì)胞表面有免疫球蛋白分子，其產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi)。這些免疫球蛋白是抗原的受體。成熟B細(xì)胞在其表面同時(shí)具有IgM和IgD。若B細(xì)胞受抗原刺激和T細(xì)胞傳來的信號(hào)作用而分化，則IgM的生成增加，且其C端細(xì)胞膜結(jié)合區(qū)發(fā)生改變從而被分泌。只要有足夠刺激，不只是表面免疫球蛋白轉(zhuǎn)換成IgG，IgE和IgA，而且每類免疫球蛋白均有分泌。B細(xì)胞表面的免疫球蛋白有時(shí)表示為sIg(表面Ig的縮寫)，或mIg(膜Ig的縮寫)。同一B細(xì)胞表面所有Ig分子具有相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
有些淋巴細(xì)胞稱為大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)或無表面標(biāo)志細(xì)胞，它們即非T細(xì)胞，亦非B細(xì)胞。這些細(xì)胞不經(jīng)抗原事先刺激就能破壞腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞，這相當(dāng)于細(xì)胞毒T細(xì)胞。故這些細(xì)胞也稱自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)。
上述T細(xì)胞中，CD4陽(yáng)性T細(xì)胞在與抗原呈遞細(xì)胞呈遞的抗原反應(yīng)時(shí)，分泌多種細(xì)胞因子，重新表達(dá)這些細(xì)胞因子的受體。擴(kuò)大自身體積，開始細(xì)胞分裂和增殖。在細(xì)胞水平上的這些反應(yīng)發(fā)生前，抗原呈遞細(xì)胞上的抗原肽與MHC II類分子的復(fù)合物結(jié)合于相應(yīng)的T細(xì)胞抗原受體(TCR)。這導(dǎo)致胞內(nèi)發(fā)生各種生化變化，信號(hào)傳入核內(nèi)，啟動(dòng)特異性DNA的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生相應(yīng)蛋白。結(jié)果細(xì)胞水平的反應(yīng)增強(qiáng)。例如，感染了病毒的細(xì)胞產(chǎn)生病毒蛋白并在胞質(zhì)中由蛋白酶體降解為肽，其中部分經(jīng)TAP進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與剛產(chǎn)生的MHC I類分子形成穩(wěn)定復(fù)合物，再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面。轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面的肽由CD8陽(yáng)性T細(xì)胞特異性識(shí)別，但這些T細(xì)胞在此階段尚不能破壞受感染的細(xì)胞。這些與抗原反應(yīng)的T細(xì)胞表達(dá)IL-2受體(IL-2R)，均在IL-2作用下分化為CTL細(xì)胞毒性然后當(dāng)再次遇到相同抗原肽/MHC I類復(fù)合物時(shí)破壞靶細(xì)胞以殺死它們。分化為CTL所需細(xì)胞因子不只IL-2，還有IFNγ或其它細(xì)胞因子，它們有相似的作用。故T細(xì)胞分泌的淋巴因子是分化為CTL所必需。淋巴因子的產(chǎn)生是CD4陽(yáng)性Th1細(xì)胞(CD4陽(yáng)性分泌IL-2或IFNγ的T細(xì)胞)識(shí)別同一病毒來源的抗原肽和II類分子的結(jié)果。某些例子中，沒有CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的幫助，CD8陽(yáng)性T細(xì)胞也能與抗原反應(yīng)并產(chǎn)生IL-2和其他細(xì)胞因子。當(dāng)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞分化為CTL時(shí)，胞質(zhì)中顆粒增多。這些顆粒包括各種高分子量蛋白質(zhì)，表示為穿孔素。穿孔素類似于由補(bǔ)體的第五至第九成分組成的膜攻擊復(fù)合物(MAC)，可在靶細(xì)胞的細(xì)胞膜上產(chǎn)生孔。此外，顆粒還包括絲氨酸蛋白酶，LT，蛋白多糖等。而且，若分化為CTL的CD8陽(yáng)性細(xì)胞受到抗原刺激，它們也可分泌淋巴因子如IFNγ，LT，TNF或IL-2。而且，當(dāng)T細(xì)胞與血凝素(植物血凝素，PHA)或ConA反應(yīng)時(shí)表現(xiàn)出母細(xì)胞(blast)轉(zhuǎn)化表型。
完全未受刺激的成熟T細(xì)胞稱靜息T細(xì)胞，細(xì)胞體積較小，壽命短，只有幾天。當(dāng)它們接受刺激，細(xì)胞如上所述增大，易于與各種刺激發(fā)生反應(yīng)。這些T細(xì)胞稱活化的T細(xì)胞。一部分活化的T細(xì)胞變成記憶T細(xì)胞，若受到相同抗原刺激可產(chǎn)生再次免疫反應(yīng)。記憶T細(xì)胞被認(rèn)為在身體循環(huán)中保持幾年或幾十年。
完全未受刺激的B細(xì)胞稱靜息B細(xì)胞，就象T細(xì)胞的情況一樣，受多價(jià)抗原或CD40L刺激而增生的B細(xì)胞稱活化的B細(xì)胞。由于靜息B細(xì)胞無協(xié)同刺激分子(通過TCR傳遞信號(hào)刺激T細(xì)胞)如B7-1(CD80)或B7-2(CD86)，因而認(rèn)為呈遞抗原至靜息T細(xì)胞只能刺激TCR，不能表達(dá)CD40配體(CD40L)或產(chǎn)生淋巴因子。故認(rèn)為由其他抗原呈遞細(xì)胞所呈遞抗原刺激活化的輔助T細(xì)胞可與由靜息B細(xì)胞呈遞的抗原反應(yīng)。即，若有抗原入侵，首先，表達(dá)B7分子的樹突細(xì)胞(有極多樹突狀突起的細(xì)胞)或與微生物反應(yīng)而活化的巨噬細(xì)胞呈遞抗原，刺激靜息T細(xì)胞活化以表達(dá)CD40L?；罨妮o助T細(xì)胞隨后結(jié)合于呈遞了相同抗原的靜息B細(xì)胞，刺激其CD40。一旦B細(xì)胞因多價(jià)抗原或CD40L的刺激而活化，它們也表達(dá)B7分子，刺激輔助T細(xì)胞表面的CD28及TCR而使之活化，從而使輔助T細(xì)胞表達(dá)CD40L或產(chǎn)生淋巴因子。受刺激后顯示有諸如細(xì)胞體積增大之類的變化但未顯示抗體分泌的B細(xì)胞稱活化的B細(xì)胞。若成熟至此的B細(xì)胞遇到抗原，又有來自T細(xì)胞的刺激，IgM的產(chǎn)生增加，所產(chǎn)生的MgM從膜結(jié)合型轉(zhuǎn)成分泌型分泌出細(xì)胞。而且，它們?cè)趤碜訲細(xì)胞的體液因子作用下產(chǎn)生除IgM以外的其他同種型抗體。這稱為同種型轉(zhuǎn)換或類別轉(zhuǎn)換。分泌抗體的B細(xì)胞稱抗體分泌型細(xì)胞。其中一部分變?yōu)樾螒B(tài)特征性細(xì)胞并稱為漿細(xì)胞(免疫學(xué)知識(shí)，Ohmsha，(1996))。
偶爾地，在各種免疫系統(tǒng)的反應(yīng)中，白細(xì)胞亞群，即T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，NK，中性粒細(xì)胞等常顯示相互不同的動(dòng)力學(xué)。即使是上述同種淋巴細(xì)胞根據(jù)該細(xì)胞是活化的還是靜息的也顯示相互不同的動(dòng)力學(xué)。這些事實(shí)暗示存在白細(xì)胞亞群特異性的識(shí)別機(jī)制，且識(shí)別機(jī)制特異于細(xì)胞的狀態(tài)，尤其細(xì)胞粘附分子(細(xì)胞粘附蛋白)。
細(xì)胞粘附分子，或細(xì)胞粘附蛋白是通常在個(gè)體發(fā)育分化中或在細(xì)胞遷移至局部位點(diǎn)時(shí)使細(xì)胞間粘附的分子，已知這些分子是活體的機(jī)體和功能接觸所必需的分子。
細(xì)胞粘附分子根據(jù)結(jié)構(gòu)特征粗分為五大家族免疫球蛋白超家族，整聯(lián)蛋白家族，選擇素家族，鈣粘著蛋白家族，和CD44家族。屬免疫球蛋白超家族的粘附分子特征是有以二硫鍵形成的重復(fù)環(huán)狀區(qū)。其例子有細(xì)胞間粘附分子-1“ICAM-1”和血管細(xì)胞粘附分子“VCAM-1”。此外，屬整聯(lián)蛋白家族的粘附分子特征是α/β異二聚體結(jié)構(gòu)。其實(shí)例為極遲相抗原-1至6“VLA-1至6”，淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1“LFA-1”，“Mac-1”，和“P150/90”。屬選擇素家族的分子從N端依次有植物血凝素樣區(qū)，EGF樣區(qū)，和補(bǔ)體區(qū)。其實(shí)例為“E-選擇素”和“P-選擇素”。鈣粘著蛋白家族的實(shí)例為“E-鈣粘著蛋白”，“N-鈣粘著蛋白”和“P-鈣粘著蛋白”，CD44家族的一個(gè)實(shí)例是“CD44”。
已知這些粘附分子的特殊功能是使白細(xì)胞粘附血管內(nèi)皮細(xì)胞或使淋巴細(xì)胞粘附抗原呈遞細(xì)胞。最近各種研究漸漸揭示粘附分子不僅涉及這些功能，也涉及多種疾病。
尤其，已有多項(xiàng)關(guān)于疾病和粘附分子表達(dá)異常的報(bào)道。如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，據(jù)報(bào)道RA滑膜細(xì)胞中“Mac-1”和“P150/95”的表達(dá)均加強(qiáng)(Allen，C.等，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，32卷，947頁(yè)(1989))。另有報(bào)道RA滑膜上各種細(xì)胞表達(dá)“ICAM-1”既強(qiáng)又異位(Hale，L.等，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，32卷，22頁(yè)(1989))。另一項(xiàng)報(bào)道暗示“ELAM-1”亦涉及中性粒細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，這些分子的過量表達(dá)涉及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)(特別是，進(jìn)入滑液)，在RA的滑液中發(fā)現(xiàn)有中性粒細(xì)胞(Laffon，A.等，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，32卷，386頁(yè)(1989))。血管內(nèi)皮細(xì)胞和RA滑膜上A型滑膜細(xì)胞中CD44的強(qiáng)烈表達(dá)也有報(bào)道(Heynes，B.等，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，34卷，1434頁(yè)(1991))。
有些報(bào)道是關(guān)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)與粘附分子表達(dá)異常之間的聯(lián)系。如據(jù)報(bào)道系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人的T淋巴細(xì)胞粘附血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力低于健康志愿者的。SLE病人的外周血淋巴細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)粘附分子“ICAM-1”，“VLA-4”，和“IFA-1”(Haskard，D.O.等，Rheumatol.Int.9卷，33頁(yè)(1989))。
在自身免疫病中，據(jù)報(bào)道當(dāng)甲狀腺濾泡細(xì)胞受干擾素γ，白細(xì)胞介素1，和腫瘤壞死因子刺激時(shí)表達(dá)“ICAM-1”，而濾泡細(xì)胞和單核細(xì)胞的群形成受抗“ICAM-1”抗體的抑制(Weetman，A.P.等，歐洲免疫學(xué)雜志，20卷，271頁(yè)(1990))。
在肝炎中，一般認(rèn)為肝細(xì)胞與炎癥細(xì)胞間的粘附機(jī)率增加，因?yàn)橛小癐CAM-1”和“LFA-3”，“LFA-1”和“CD2”這兩條粘附通道，因而促進(jìn)了抗原的呈遞和炎癥細(xì)胞的活化。尤其，乙肝中，肝細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)“LFA-3”，肝細(xì)胞內(nèi)病毒活躍復(fù)制，而“ICAM-1”與肝炎的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。故暗示“LFA-3”涉及病毒的排除，“ICAM”促進(jìn)T細(xì)胞呈遞抗原及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。在“ICAM-1”陰性而HBC抗原陽(yáng)性肝細(xì)胞中，慢性病毒感染，一種免疫無應(yīng)答，可能由于淋巴細(xì)胞與肝細(xì)胞間無相互作用而發(fā)生，還有報(bào)道說慢性肝病中的血清“ICAM-1”，可能相關(guān)于肝細(xì)胞損壞程度因?yàn)榧毙愿窝撞∪耍曰顒?dòng)性肝炎病人，肝壞死病人的血清“ICAM-1”濃度高于健康志愿者的和慢性遷延性肝炎病人的，在組織學(xué)漸進(jìn)性活動(dòng)肝炎中該濃度是高的(Mod.Phys.，15卷，1期，73-76頁(yè)(1995))。
在動(dòng)脈硬化的動(dòng)物模型中，于發(fā)病的早早期就察到單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的粘附和入侵。故認(rèn)為這些血細(xì)胞與內(nèi)皮的相互作用是動(dòng)脈硬化癥發(fā)病的第一步。各種報(bào)道顯示急性動(dòng)脈硬化病灶中有粘附分子的表達(dá)，包括人動(dòng)脈硬化病灶中有“ICAM-1”表達(dá)(Poston，R.N.等，美國(guó)病理學(xué)雜志，140卷，665頁(yè)(1992))和兔高膽固醇血癥的動(dòng)脈硬化病灶中有“VCAM-1”表達(dá)(Cybulsky，M.I.和Gimbrone，M.A.Jr.，科學(xué)，251卷，788頁(yè)(1991))。一項(xiàng)近期報(bào)道揭示，于人動(dòng)脈硬化灶中觀察到“VCAM-1”的表達(dá)，及尤其是遷移至內(nèi)膜的平滑肌細(xì)胞中和單核/巨噬細(xì)胞中有強(qiáng)表達(dá)。此外，兔和人動(dòng)脈硬化灶中“MCP-1”的表達(dá)增強(qiáng)，說明“MCP-1”通過移動(dòng)單核/巨噬細(xì)胞促進(jìn)動(dòng)脈硬化灶的形成(Curent Therapy，12卷，8期，1485-1488頁(yè)(1994))。
腫瘤轉(zhuǎn)移與粘附分子異常之間的關(guān)系已有報(bào)道。如E-鈣粘著蛋白減少的癌細(xì)胞顯示較強(qiáng)侵襲力，但該癌細(xì)胞中導(dǎo)入E-鈣粘著蛋白的cDNA后侵襲力受抑，再加入E-鈣粘著蛋白抗血清侵襲力又恢復(fù)。這說明E-鈣粘著蛋白表達(dá)的減少與腫瘤細(xì)胞侵襲力之間有緊密聯(lián)系(Frixen，U.H.等，113卷，173頁(yè)(1991))。在實(shí)際臨床病例中，E-鈣粘著蛋白表達(dá)減少與轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系出現(xiàn)在各種癌癥中，如肝癌，鼻咽癌，胃癌，和乳癌。亦有報(bào)道“VLA-4”分子，作為“VCAM-1”的配體，在轉(zhuǎn)移型黑色素瘤，胃癌和乳癌中高度表達(dá)，說明此分子可用于轉(zhuǎn)移病例中對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的植入。此外，用各種腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所得報(bào)道說上皮癌，如胃癌，大腸癌，肺癌，肝癌或胰腺癌，均經(jīng)E-選擇素粘附血管內(nèi)皮細(xì)胞(Takada，A.等，癌癥研究，53卷，354頁(yè)(1993))。
另一方面，已有人采用靶向這些粘附分子的治療方法治病。如，報(bào)道抗大鼠“ICAM-1”抗體在大鼠自身免疫性關(guān)節(jié)炎模型中強(qiáng)烈抑制炎癥反應(yīng)。亦有報(bào)道，在一個(gè)RA動(dòng)物模型中施用抗“ICAM-1”抗體抑制了輔助性滑膜炎中關(guān)節(jié)炎的發(fā)作(Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi，14卷，6期，571-577頁(yè)(1991))。進(jìn)一步有報(bào)道說，若對(duì)膽囊癌小鼠施用大量具有REG序列(為一種胞外基質(zhì)蛋白中由某些整聯(lián)蛋白識(shí)別并結(jié)合的一段氨基酸序列)的肽將顯著抑制所接種腫部的轉(zhuǎn)移形成，而在體外系統(tǒng)中，RGD肽和抗β1亞單位抗體抑制了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和浸潤(rùn)(Yamada，K.M.等，癌癥研究，50卷，4485頁(yè)(1990))。
下文中，本發(fā)明通過澄清了本文所用術(shù)語(yǔ)的意義，及本發(fā)明的多肽，融合多肽，基因，抗體，轉(zhuǎn)基因小鼠，和基因敲出小鼠的一般生產(chǎn)方法而詳述，但不用說術(shù)語(yǔ)的意義不應(yīng)限定在本文所給定義中。
本文所用“絲裂原”也稱促分裂因子，指能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的物質(zhì)。其免疫學(xué)意義為多克隆誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞母細(xì)胞生成(blastogenesis)和誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的物質(zhì)。其實(shí)例為外源凝集素如PHA和PWM，刀豆蛋白A(ConA)，脂多糖，鏈球菌溶血素S，和抗淋巴細(xì)胞抗體。已知刀豆蛋白A和pHA只作用于T淋巴細(xì)胞，脂多糖只作用于B淋巴細(xì)胞，而PWM對(duì)兩種細(xì)胞均有作用。
本文所用“淋巴母細(xì)胞”也稱大淋巴細(xì)胞，淋巴母細(xì)胞，或免疫母細(xì)胞，意指屬于出現(xiàn)在淋巴樣組織(淋巴節(jié)，脾，胸腺，骨髓，淋巴導(dǎo)管，扁桃體等)和血液中的淋巴細(xì)胞中的大淋巴細(xì)胞的淋巴細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“活化的淋巴細(xì)胞”指如上述淋巴細(xì)胞，但不止于此。如該術(shù)語(yǔ)指受某些刺激活化的淋巴細(xì)胞。如上述，淋巴細(xì)胞分T細(xì)胞，B細(xì)胞和NK細(xì)胞。T細(xì)胞分CD4陽(yáng)性細(xì)胞和CD8陽(yáng)性細(xì)胞。故本發(fā)明的“活化的淋巴細(xì)胞”主要包括活化T細(xì)胞，活化B細(xì)胞，活化的NK細(xì)胞，而活化T細(xì)胞又包括活化的CD4陽(yáng)性細(xì)胞和CD8陽(yáng)性細(xì)胞。
基于與抗原呈遞細(xì)胞呈遞的抗原反應(yīng)，CD4陽(yáng)性T細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子，即時(shí)表達(dá)這些細(xì)胞因子的受體，增大其自身體積，開始細(xì)胞分裂，增殖并被活化?；罨腃D4陽(yáng)性T細(xì)胞包括處于該狀態(tài)的那些。
CD8陽(yáng)性T細(xì)胞與抗原反應(yīng)時(shí)表達(dá)IL-2R。當(dāng)IL-2作用于IL-2R，這些細(xì)胞分化為CTL，具有細(xì)胞毒性。當(dāng)CTL遇到相同抗原肽/MHC I類復(fù)合物時(shí)，將破壞其靶細(xì)胞以殺死之。當(dāng)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞分化為CTL時(shí)，胞質(zhì)中顆粒增多。這些顆粒包括各種高分子量蛋白質(zhì)，表示為穿孔素。穿孔素類似于補(bǔ)體第五至第九成分組成的MAC，可在靶細(xì)胞的細(xì)胞膜上穿孔。這些顆粒還含有絲氨酸蛋白酶，LT，和蛋白多糖。若CD8陽(yáng)性細(xì)胞受到抗原刺激并分化為CTL，將分泌淋巴因子如IFNγ，LT，TNF或IL-2?；罨腃D8陽(yáng)性T細(xì)胞包括上述狀態(tài)中的細(xì)胞。
T細(xì)胞與血凝素(植物血凝素，PHA)或刀豆蛋白A(ConA)反應(yīng)時(shí)顯示母細(xì)胞形成現(xiàn)象。活化的T細(xì)胞包括處于此狀態(tài)的細(xì)胞。
B細(xì)胞表達(dá)B7分子，刺激輔助T細(xì)胞表面的CD28及TCR而使之活化，使輔助T細(xì)胞表達(dá)CD40L或產(chǎn)生淋巴因子。當(dāng)細(xì)胞受到刺激。它們轉(zhuǎn)而增大體積或增殖?；罨腂細(xì)胞包括此狀態(tài)中的細(xì)胞。本發(fā)明中，活化的B細(xì)胞包括分泌抗體的細(xì)胞(抗體分泌型細(xì)胞和漿細(xì)胞)。
活化的自然殺傷細(xì)胞指上述對(duì)腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞有細(xì)胞毒作用的細(xì)胞。本發(fā)明中，活化的淋巴細(xì)胞包括ConA刺激的胞腺細(xì)胞。
本文的“活化的淋巴母細(xì)胞”包括上述淋巴母細(xì)胞經(jīng)上述“絲裂原”如ConA刺激生成的活化的“淋巴母細(xì)胞”。
本文的“靜息淋巴細(xì)胞”在一些情況下指未活化的淋巴細(xì)胞，未接受活化細(xì)胞的刺激，是對(duì)比于上述活化的淋巴細(xì)胞。
本發(fā)明的“基因”包括基因組DNA和cDNA。
“人源”物質(zhì)在本發(fā)明包括分離自人體成分(器官，組織，細(xì)胞，體液等)的天然物質(zhì)，及用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的重組產(chǎn)物。若該物質(zhì)為蛋白質(zhì)或多肽，則包括人工蛋白和多肽(其中所含氨基酸序列有一處或更多氨基酸被取代，缺失或補(bǔ)加)。
本發(fā)明的“細(xì)胞表面分子”來自哺乳動(dòng)物，如人，大鼠，小鼠，豚鼠，和兔，較優(yōu)選來自人，大鼠或小鼠，更優(yōu)選來自人。
特別指出，本發(fā)明的“細(xì)胞表面分子”具有至少以下所述特征(a)該細(xì)胞表面分子至少在胸腺細(xì)胞和絲裂原刺激的淋巴母細(xì)胞中表達(dá)；(b)反應(yīng)于該細(xì)胞表面分子的抗體誘導(dǎo)絲裂原刺激的淋巴母細(xì)胞間的相互粘附；(c)反應(yīng)于該細(xì)胞表面分子的抗體在有抗CD3抗體存在時(shí)誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞增殖；(d)該細(xì)胞表面分子在其胞外區(qū)有表示為苯丙氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸的部分氨基酸序列；且(e)該細(xì)胞表面分子在其胞質(zhì)區(qū)有表示為酪氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸的部分氨基酸序列。
較優(yōu)選地，該“細(xì)胞表面分子”包含本發(fā)明的以下“多肽”。
本發(fā)明的“多肽”是組成本發(fā)明的上述“細(xì)胞表面分子”的。其實(shí)例如下(1)在嚴(yán)格條件下與含有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA雜交的DNA所編碼的多肽；(2)其氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列有60％或更多同源的多肽；(3)多肽，具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或與該氨基酸序列實(shí)質(zhì)相同的氨基酸序列(即，組成“人JTT-1抗原”的多肽及其衍生物)；(4)多肽，具有由相應(yīng)于SEQ ID NO3的26至625核苷酸殘基的一段核苷酸序列編碼的氨基酸序列，或?qū)嵸|(zhì)上相同于該氨基酸序列的一段氨基酸序列(即，組成“人JTT-1抗原”的多肽及其衍生物)；(5)多肽，具有由相應(yīng)于SEQ ID NO4的35至637核苷酸殘基的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，或與該氨基酸序列實(shí)質(zhì)上相同氨基酸序列(即，組成“大鼠JTT-1抗原”的多肽及其衍生物)；(6)多肽，具有由相應(yīng)于SEQ ID NO5的1至603核苷酸殘基的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，或與該氨基酸序列實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列(即，組成“小鼠JTT-1抗原”的多肽及其衍生物)；(7)多肽，具有由相應(yīng)于SEQ ID NO6的35至685核苷酸殘基的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，或與此氨基酸序列實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列(即，組成“大鼠JTT-1抗原突變體”的多肽及其衍生物)；以及(8)多肽，具有的氨基酸序列由編碼組成本發(fā)明的細(xì)胞表面分子的多肽的DNA所編碼，其中該DNA導(dǎo)入為國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-5725所定義的轉(zhuǎn)化體，或該多肽具有與上述氨基酸序列實(shí)質(zhì)相同的序列(即，組成“人JTT-1抗原”的多肽及其衍生物)。
“嚴(yán)格條件”的實(shí)例如下當(dāng)用50或更多個(gè)核苷酸的探針，雜交在0.9％NaCl中進(jìn)行時(shí)，50％解離溫度的標(biāo)準(zhǔn)(Tm)用以下公式計(jì)算，雜交溫度亦根據(jù)以下公式而定Tm＝82.3℃+0.41×(G+C)％-500/n-0.61×甲酰胺％(n指探針的核苷酸數(shù))溫度＝Tm-25℃
此外，若用100或更多核苷酸(G+C為40％至50％)作探針，則應(yīng)考慮Tm按下述(1)和(2)變化。
(1)Tm下降為每1％錯(cuò)配約1℃。
(2)Tm下降為每1％甲酰胺降0.6至0.7℃。
相應(yīng)地，完全互補(bǔ)鏈的組合的溫度條件可按如下設(shè)定(A)65至75℃(未加甲酰胺)(B)35至45℃(有50％甲酰胺時(shí))不完全互補(bǔ)鏈的組合的溫度條件可按如下設(shè)定(A)45-55℃(不加甲酰胺)(B)35-42℃(有50％甲酰胺)。
若用23或更少核苷酸的探針，溫度條件可為37℃，或按以下公式計(jì)算溫度＝2℃×(A+T數(shù))+4℃×(C+G數(shù))-5℃在此，“實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列”指包括其氨基酸序列中顯示于序列表中的多個(gè)氨基酸，較優(yōu)選1至10個(gè)，尤其優(yōu)選1至5個(gè)被替代，缺失，和/或修飾的多肽，和其氨基酸序列加入了多個(gè)氨基酸，較優(yōu)選1至10個(gè)，尤其優(yōu)選1至5個(gè)加入到序列表中的氨基酸中的多肽，只要該多肽有著與序列表中所示氨基酸序列的多肽實(shí)質(zhì)上相同的生物學(xué)特點(diǎn)。
氨基酸的這些替代，缺失或插入可按常規(guī)方法進(jìn)行(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)增刊，“遺傳工程手冊(cè)”(1992)；等等)。
其實(shí)例有，合成寡核苷酸定點(diǎn)誘變(缺口雙鏈體法)，經(jīng)亞硝酸鹽或亞硫酸鹽處理而隨意誘導(dǎo)點(diǎn)突變的點(diǎn)突變，用Bal 31酶或類似物制備缺失突變的方法。盒式誘變，連接子掃描法，錯(cuò)誤摻入法，錯(cuò)配引物法。DNA節(jié)段合成法，等等。
合成寡核苷酸定點(diǎn)誘變(缺口雙鏈體法)可如下進(jìn)行。將期望誘變的區(qū)段克隆進(jìn)具有琥珀突變的M13噬菌體中以制備單鏈?zhǔn)删wDNA。經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理使不帶琥珀突變的M13載體的RF I DNA線性化后，DNA與上述單鏈?zhǔn)删wDNA混合，變性，退火從而形成“缺口雙鏈體DNA”。一段導(dǎo)入了突變的合成寡核苷酸與此“缺口雙鏈DNA”雜交，用DNA多聚酶和DNA連接酶制成閉合環(huán)狀雙鏈DNA。大腸桿菌mutS細(xì)胞缺乏錯(cuò)配修補(bǔ)活性，用此DNA轉(zhuǎn)染。大腸桿菌細(xì)胞中無抑制活性的用成熟噬菌體轉(zhuǎn)染，篩選無琥珀突變的噬菌體。
用亞硝酸鹽誘導(dǎo)點(diǎn)突變的方法，其原理舉例如下。DNA若經(jīng)亞硝酸鹽處理，堿基脫氨使腺嘌呤變成次黃嘌呤。胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏ざB嘌呤變成黃嘌呤。如果脫氨的DNA導(dǎo)入細(xì)胞，“A:T”和“G:C”分別被“G:C”和“A:T”代替。因?yàn)樵贒NA復(fù)制中次黃嘌呤，尿嘧啶，和黃嘌呤分別與胞嘧啶，腺嘌呤和胸腺嘧啶形成堿基對(duì)。事實(shí)上，亞硝酸鹽處理過的單鏈DNA片段均與“缺口雙鏈DNA”雜交，隨后突變鏈經(jīng)等同于合成寡核苷酸定點(diǎn)誘變的方法(缺口雙鏈法)而分離。
三聯(lián)體字母或單字母密碼用來表示本說明書中的氨基酸，意義如下(Gly/G)甘氨酸，(Ala/A)丙氨酸，(Val/V)纈氨酸，(Leu/L)亮氨酸，(Ile/I)異亮氨酸，(Ser/S)絲氨酸，(Thr/T)蘇氨酸，(Asp/D)天冬氨酸，(Glu/E)谷氨酸，(Asn/N)天冬酰胺，(Gln/Q)谷氨酰胺，(Lys/K)賴氨酸，(Arg/R)精氨酸，(Cys/C)半胱氨酸，(Met/M)甲硫氨酸，(Phe/F)苯丙氨酸，(Tyr/Y)酪氨酸，(Trp/W)色氨酸，(His/H)組氨酸，(Pro/P)脯氨酸。
組成上述本發(fā)明的“細(xì)胞表面分子”的“多肽”為跨膜蛋白，穿透細(xì)胞膜，而此“細(xì)胞表面分子”由一或兩個(gè)這樣的跨膜多肽組成。
在此，“跨膜蛋白”指通過穿透膜的脂質(zhì)雙層一次或多次的疏水肽段與膜連接的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)就整體而言，由三個(gè)主要區(qū)段組成，它們是胞外區(qū)，跨膜區(qū)，和胞質(zhì)區(qū)，如在許多受體或細(xì)胞表面分子中所見一樣。這樣一個(gè)跨膜蛋白以單體，同型二聚體，異二聚體或與另外的具有相同或不同氨基酸序列的鏈形成的寡聚體形式組成每個(gè)受體或細(xì)胞表面分子。
“多肽片段”在本發(fā)明中是來自本發(fā)明上文規(guī)定的“多肽”的片段，較優(yōu)選多肽的胞外區(qū)。若有需要，可在該區(qū)的N末端和/或C末端加入1至5個(gè)氨基酸。
在此，“胞外區(qū)”指上述跨膜蛋白完整結(jié)構(gòu)中部分結(jié)構(gòu)(部分區(qū)段)的全部或部分，其中該部分結(jié)構(gòu)存在于胞外。換而言之，它指跨膜蛋白中除去插入膜中的區(qū)段(跨膜區(qū))和緊隨跨膜區(qū)存在于胞內(nèi)的區(qū)段(胞質(zhì)區(qū))后的區(qū)段的全部或部分。
“人免疫球蛋白(Ig)重鏈恒定區(qū)或其部分”在本文中指人源免疫球蛋白重鏈(H鏈)的恒定區(qū)或Fc區(qū)，或其一部分。該免疫球蛋白可以是任何類和亞類的任一種免疫球蛋白。特別是，免疫球蛋白的實(shí)例有IgG(IgG1，IgG2，IgG3和IgG4)，IgM，IgA(IgA1和IgA2)，IgD和IgE。優(yōu)選免疫球蛋白是IgG(IgG1，IgG2，IgG3和IgG4)，或IgM。本發(fā)明之特別優(yōu)選免疫球蛋白實(shí)例屬于人源IgG(IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)。
免疫球蛋白有Y形結(jié)構(gòu)單位，其中四條鏈由兩條相同的輕鏈(L鏈)和兩條相同的重鏈(H鏈)經(jīng)二硫鏈(S-S鍵)連接而成。輕鏈由輕鏈可變區(qū)(VL)和輕鏈恒定區(qū)(CL)組成。重鏈由重鏈可變區(qū)(VH)和重鏈恒定區(qū)(CH)組成。
重鏈恒定區(qū)由其氨基酸序列為每類(IgG，IgM，IgA，IgD和IgE)和每亞類(IgG1，IgG2，IgG3和IgG4，IGA1和IgA2)所固有的某些區(qū)域組成。
IgG(IgG1，IgG2，IgG3和IgG4)的重鏈從N末端依次由VH，CH1區(qū)，絞鏈區(qū)，CH2區(qū)，和CH3區(qū)組成。
相似地，IgG1的重鏈從N末端依次由VH，Cγ11區(qū)，絞鏈區(qū)，Cγ12區(qū)，Cγ13區(qū)組成。IgG2重鏈自N末端依次為VH，Cγ21區(qū)，絞鏈區(qū)，Cγ22區(qū)，Cγ23區(qū)。IgG3的重鏈自N末端依次為VH，Cγ31區(qū)，絞鏈區(qū)，Cγ32區(qū)，Cγ33區(qū)。IgG4的重鏈自N末端依次為VH，C41區(qū)，絞鏈區(qū)，C42區(qū)，C43區(qū)。
IgA的重鏈自N末端依次為VH，Cα1區(qū)，絞鏈區(qū)，Cα2區(qū)，Cα3區(qū)。
類似地，IgA1的重鏈自N末端依次為VH，Cα11區(qū)，絞鏈區(qū)，Cα12區(qū)，Cα13區(qū)。IgA2的重鏈自N末端依次為VH，Cα21區(qū)，絞鏈區(qū)，Cα22區(qū)，Cα23區(qū)。
IgD的重鏈自N末端依次為VH，Cδ1區(qū)，絞鏈區(qū)，Cδ2區(qū)，Cδ3區(qū)。
IgM的重鏈自N末端依次為VH，Cμ1區(qū)，Cμ2區(qū)，Cμ3區(qū)，Cμ4區(qū)，而無IgG，IgA和IgD中可見的絞鏈區(qū)。
IgE的重鏈自N末端依次為VH，Cε1區(qū)，Cε2區(qū)，Cε3區(qū)和Cε4區(qū)，而無IgG，IgA和IgD中可見的絞鏈區(qū)。
例如，若用木瓜蛋白酶處理IgG，在較靠N末端位于絞鏈區(qū)中二硫鍵之外的地方被切斷，此時(shí)二硫鏈所連接的兩條重鏈產(chǎn)生兩個(gè)同源的Fab其中由VH和CH1組成的重鏈片段與一條輕鏈經(jīng)二硫鏈連接，和一個(gè)Fc，兩條同源的由絞鏈區(qū)，CH2區(qū)，和CH3區(qū)組成的重鏈片段經(jīng)二硫鍵連接(見“免疫學(xué)圖譜”，原裝第2版，Nankodo.65-75頁(yè)(1992))；“最新醫(yī)學(xué)科學(xué)集萃‘免疫系統(tǒng)的識(shí)別機(jī)制’”，Nankodo，4-7頁(yè)(1991)；等等)。
即，本發(fā)明的“免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的一部分”指具有上述結(jié)構(gòu)特征的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的一部分，且優(yōu)選地是不含C1區(qū)的恒定區(qū)，或Fc區(qū)。特別地，其實(shí)例是由IgG，IgA和IgD之每一種的絞鏈區(qū)，C2區(qū)和C3區(qū)組成的區(qū)域，IgM和IgE中每種的C2區(qū)，C3區(qū)和C4區(qū)組成的區(qū)域。其中一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)例為人源IgG1的Fc區(qū)。
本發(fā)明的“融合多肽”指由組成本發(fā)明的上述“細(xì)胞表面分子”的“多肽”的胞外區(qū)和“人免疫球蛋白(Ig)重鏈恒定區(qū)或其一部分”組成的。優(yōu)選地是由本發(fā)明的多肽的胞外區(qū)和人I gG重鏈恒定區(qū)的一部分組成的融合多肽，特別優(yōu)選地由本發(fā)明的多肽的胞外區(qū)與人IgG重鏈的絞鏈區(qū)，CH2區(qū)，CH3區(qū)組成的區(qū)域(Fc)組成的融合多肽。此外，來自人，小鼠，或大鼠(優(yōu)選人)的多肽較優(yōu)選為本發(fā)明的多肽。
本發(fā)明的融合多肽的優(yōu)點(diǎn)是純化十分簡(jiǎn)便，只需使用利用蛋白A性質(zhì)的親和柱層析，因?yàn)榈鞍譇可特異性結(jié)合免疫球蛋白片段，而本發(fā)明的融合多肽具有一種免疫球蛋白(如上述的IgG)恒定區(qū)的一部分如(Fc)作為融合伙伴。而且，由于可提供抗各種免疫球蛋白Fc的抗體，可簡(jiǎn)便地用這些抗體對(duì)融合多肽進(jìn)行免疫檢測(cè)。
本發(fā)明的多肽，多肽片段，融合多肽不僅可用下文所述重組DNA技術(shù)生產(chǎn)，亦可用本領(lǐng)域熟知的方法如化學(xué)合成法和細(xì)胞培養(yǎng)法，或它們的改進(jìn)方法生產(chǎn)。
本發(fā)明的“基因”含有編碼上述本發(fā)明的多肽或多肽片段的DNA，并包括具有編碼本發(fā)明的多肽或多肽片段的核苷酸序列的任何基因。
基因的實(shí)例有編碼下文所提及多肽或多肽片段的那些基因。
(1)多肽，是由在嚴(yán)格條件下與包括SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA雜交的DNA所編碼；(2)多肽，具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列有60％或更多同源的氨基酸序列；(3)多肽，具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或?qū)嵸|(zhì)上相同于該氨基酸序列的氨基酸序列(即組成“人JTT-1抗原”的多肽及其衍生物)；(4)多肽，具有由對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO3的26至625核苷酸殘基的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，或?qū)嵸|(zhì)上相同于這段氨基酸序列的氨基酸序列(即組成“人JTT-1抗原”的多肽及其衍生物)；(5)多肽，具有由SEQ ID NO4的35至637核苷酸殘基相應(yīng)的核苷酸序列編碼的氨基酸序列或?qū)嵸|(zhì)上相同于它的序列的氨基酸序列(即組成“大鼠JTT-1抗原”的多肽及其衍生物)；(6)多肽，具有由SEQ ID NO5的1至603核苷酸殘基相應(yīng)的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，或與該序列實(shí)質(zhì)相同的氨基酸序列(即組成“小鼠JTT-1抗原”的多肽及其衍生物)；(7)多肽，具有由相應(yīng)于SEQ ID NO6的35至685核苷酸殘基的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，或?qū)嵸|(zhì)上相同于該序列的氨基酸序列(即組成“大鼠JTT-1抗原突變體”的多肽及其衍生物)；以及(8)多肽，具有由編碼組成本發(fā)明的細(xì)胞表面分子的多肽的DNA編碼的氨基酸序列，其中該DNA導(dǎo)入由國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-5725所定義的轉(zhuǎn)化體，或具有實(shí)質(zhì)上相同于該氨基酸序列的氨基酸序列(即組成“人JTT-1抗原”)的多肽及其衍生物)。
此處，“實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列”意義如上文所規(guī)定。
本發(fā)明的基因的具體實(shí)列是下述的DNA或其片段(1)DNA，包含SEQ ID NO1的核苷酸序列，及與該DNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA；(4)DNA，包含相應(yīng)于SEQ ID NO3的26至625核苷酸殘基的核苷酸序列；(5)DNA，含相應(yīng)于SEQ ID NO4的35至637核苷酸殘基的核苷酸序列；(6)DNA，含相應(yīng)于SEQ ID NO5的1至603核苷酸殘基的核苷酸序列；(7)DNA，含相應(yīng)于SEQ ID NO6的35至685核苷酸殘基的核苷酸序列；(8)DNA，編碼組成本發(fā)明的細(xì)胞表面分子的多肽，其中此DNA導(dǎo)入由國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-5725所定義的轉(zhuǎn)化體。
編碼免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的一部分(為本發(fā)明的融合多肽的一部分)的DNA可以是cDNA，或由每個(gè)外顯子間內(nèi)含子組成的基因組DNA(編碼如，CH1區(qū)，絞鏈區(qū)，CH2區(qū)，CH3區(qū)，CH4區(qū)等的DNA)。
本發(fā)明之DNA包括任意密碼子組成的任意DNA，只要這些密碼子編碼的是同樣的氨基酸。
本發(fā)明的DNA可經(jīng)任何方法獲得。如，從mRNA制備互補(bǔ)DNA(cDNA)，從基因組DNA制備，化學(xué)合成，用RNA或DNA作模板經(jīng)PCR擴(kuò)增所得，及將這些方法適當(dāng)組合而構(gòu)建。
編碼本發(fā)明之多肽的DNA可用一般方法獲得，如從編碼本發(fā)明之多肽的mRNA克隆cDNA，分離基因組DNA并切割，化學(xué)合成等等。
(1)cDNA可從編碼本發(fā)明之多肽的mRNA克隆而得，例如通過如下方法首先，編碼本發(fā)明之細(xì)胞表面分子(多肽)的mRNA可從能表達(dá)并生產(chǎn)本發(fā)明之細(xì)胞表面分子(多肽)的組織或細(xì)胞(如經(jīng)ConA刺激的胸腺細(xì)胞或脾衍生的淋巴母細(xì)胞)而制備。mRNA可用已知方法分離總DNA來制備，方法如硫氰酸胍法(Chirgwin，J.M.等，生物化學(xué)，18卷，5294頁(yè)，1979)，熱酚法，或AGPC法，再用Oligo-dT纖維素或poly-U葡聚糖進(jìn)行親和層。
然后，用所得mRNA為模板通過熟知的方法用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，如Okayama等的方法(分子細(xì)胞生物學(xué)，2卷，161頁(yè)(1982)；同一雜志，3卷，280頁(yè)(1983))，或Hoffman等的方法(基因，25卷263頁(yè)(1983))，再反轉(zhuǎn)成雙鏈cDNA。用帶此cDNA的質(zhì)粒載體，噬菌體載體，或Cosmid載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，或在體外包裝后轉(zhuǎn)染大腸桿菌制備出cDNA文庫(kù)。
本發(fā)明所用質(zhì)粒載體不受限制，只要它們可在宿主中復(fù)制并維持。任何可在宿主中復(fù)制的噬菌體載體均可應(yīng)用。常用的克隆載體如pME 18S，λZAPII(1 ZAPII)，pUC 19，λgt 10，λgt 11等。用載體進(jìn)行如下免疫學(xué)篩查。若載體帶有可在宿主體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明之多肽的基因的啟動(dòng)子則較優(yōu)選應(yīng)用。
cDNA可插入質(zhì)粒，方法如Maniatis等的(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，p.1.53，1989)。cDNA可插入噬菌體載體，方法如Hyunh等(DNA克隆，實(shí)用方法，1卷，49頁(yè)(1985))。這些方法可用商品化克隆試劑盒(如Takara Shuzo的產(chǎn)品)簡(jiǎn)便地完成。這樣所得的重組質(zhì)?；蚴删w載體被導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如原核細(xì)胞(如，大腸桿菌XL1BLueMRF′，DH5α，HB101，MC 1061/P3，等)。
將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主的方法舉例如氯化鈣法，氯化鈣/氯化銣法，見分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，p.1.74，(1989))，以及電穿孔法。將噬菌體載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法如將噬菌體DNA體外包裝后等入生長(zhǎng)的宿主。體外包裝可簡(jiǎn)單地用商品試劑盒完成(如Stratagene或Amersham的產(chǎn)品)。
編碼本發(fā)明之多肽的cDNA可從用上述方法制備的cDNA文庫(kù)中用組合總cDNA篩選法分離。
例如，含所需cDNA的克隆可用已知菌落雜交法(Crunstein等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，72卷，3961頁(yè)(1975))篩選，或用蝕斑雜交法(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，p.2.108(1989))以32P標(biāo)記的化學(xué)合成的寡核苷酸(相應(yīng)于本發(fā)明之多肽的氨基的序列)為探針。另外，帶有編碼本發(fā)明之多肽中特殊區(qū)段的DNA片段的克隆可用合成的PCR引物經(jīng)PCR擴(kuò)增該區(qū)段而篩選得到。
應(yīng)用經(jīng)cDNA表達(dá)載體(如λZAPII噬菌體載體)制備的cDNA文庫(kù)時(shí)，所需克隆可用抗原-抗體反應(yīng)來篩選，所用抗體針對(duì)的是本發(fā)明的多肽。當(dāng)有多個(gè)克隆需篩選時(shí)，較優(yōu)選用PCR為篩選方法。
如此所得DNA的核苷酸序列或用Maxam-Gilbert法(Maxam等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，74卷，560頁(yè)(1977))或用M13噬菌體比雙脫氧核苷酸合成鏈終止法(Samger等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，74卷，5463-5467頁(yè)(1997))測(cè)定。編碼本發(fā)明的多肽的基因的全部或部分的方法是用限制性內(nèi)切酶切割上述所獲克隆等而獲得的。
(2)編碼本發(fā)明之多肽的DNA可分離自衍生于表達(dá)上述本發(fā)明多肽的細(xì)胞的基因組DNA，方法如下這些細(xì)胞較優(yōu)選用SDS或蛋白激酶K溶解，經(jīng)反復(fù)苯酚抽提使DNA去蛋白。RNA較優(yōu)選用核糖核酸酶消化。所得DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼缸鞑糠窒肈NA片段用適當(dāng)?shù)氖删w或cosmid質(zhì)粒擴(kuò)增以產(chǎn)生文庫(kù)。然后，檢測(cè)帶所需序列的克隆，如用放射性標(biāo)記的DNA探針，編碼本發(fā)明的多肽的基因的全部或部分可從克隆中經(jīng)限制酶切割等方法獲得。
編碼人源多肽的cDNA獲取方法如下；制備其中導(dǎo)入了人基因組DNA(染色體DNA)的Cosmid文庫(kù)(“實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)人類基因圖譜”，Maruzen出版)，含所需蛋白編碼區(qū)的DNA的陽(yáng)性克隆經(jīng)篩選該Cosmid文庫(kù)可獲得。然后，上述cDNA文庫(kù)用陽(yáng)性克隆經(jīng)切割成的編碼DNA密碼作探針進(jìn)行篩選以制備人cDNA。
(3)基于SEQ ID NO1，3，4，5，或6的核苷酸序列，還可用常規(guī)方法化學(xué)合成本發(fā)明的DNA。
本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明的上述細(xì)胞表面分子(多肽)的DNA的重組載體。該重組載體不受限制，只要它能在各種原核和/或真核宿主中復(fù)制和維持或能自我復(fù)制。本發(fā)明的載體包括質(zhì)粒載體和噬菌體載體。
重組載體的制備可簡(jiǎn)單地將編碼本發(fā)明多肽的DNA與本領(lǐng)域內(nèi)可用于重組的載體(質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA)按常規(guī)方法連接而成。用于重組的載體特別有大腸桿菌質(zhì)粒如pBR322，pBR 325，pUC12，pUC13和pUC19，酵母質(zhì)粒如pSH19和pSH15，枯草桿菌質(zhì)粒如pUB110，pTP5，和pC194。噬菌體的實(shí)例有λ噬菌體，動(dòng)物或昆蟲的病毒(pVL 1393，Invitragen)如逆轉(zhuǎn)錄病毒，痘苗病毒，及核型多角體病毒。
表達(dá)載體有用于表達(dá)DNA所編碼的本發(fā)明的多肽，并產(chǎn)生該多肽。表達(dá)載體不受限，只要它能在各種原核和/或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因所編碼的本發(fā)明的多肽并生產(chǎn)該蛋白。其實(shí)例有pEFneo(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，91卷，158-162頁(yè)(1994))，pEF-BOS(核酸研究，18卷，5322頁(yè)(1990))，pME 18S(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)增刊，“基因工程手冊(cè)”(1992))，pMAL C2，等等。
當(dāng)細(xì)菌，尤其是大腸桿菌被用作宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體通常至少由包括啟動(dòng)子/操縱子區(qū)，起始密碼，編碼本發(fā)明多肽的DNA，終止密碼，終止子區(qū)，及復(fù)制子組成。
當(dāng)用酵母，動(dòng)物細(xì)胞，或昆蟲細(xì)胞作宿主時(shí)，表達(dá)載體的優(yōu)選至少由啟動(dòng)子，起始密碼，編碼本發(fā)明多肽的DNA，終止密碼組成。還可能包含編碼信號(hào)肽的DNA，增強(qiáng)子序列，編碼本發(fā)明多肽的基因的5′-和3′-非翻譯區(qū)，剪切連接，多聚腺嘌呤化位點(diǎn)可選擇標(biāo)記區(qū)，及復(fù)制子。如有必要，該表達(dá)載體還可包含常用的用于基因擴(kuò)增的基因(標(biāo)志)。
細(xì)菌中表達(dá)本發(fā)明的多肽的啟動(dòng)子/操縱子區(qū)包括啟動(dòng)子，操縱子和Shine-Dalgarno(SD)序列(如AAGG)。例如，若宿主為大腸桿菌，則優(yōu)選包括Trp啟動(dòng)子，lac啟動(dòng)子，recA啟動(dòng)子，λPL啟動(dòng)子，Ipp啟動(dòng)子，tac啟動(dòng)子或其他類似啟動(dòng)子。酵母中表達(dá)本發(fā)明之多肽的啟動(dòng)子實(shí)例有PH05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子，GAP啟動(dòng)子，ADH啟動(dòng)子等等。若宿主為芽孢桿菌，其實(shí)例有SL01啟動(dòng)子，SP02啟動(dòng)子，penP啟動(dòng)子等。當(dāng)宿主是諸如哺乳動(dòng)物是真核細(xì)胞時(shí)，其實(shí)例是SV 40衍生的啟動(dòng)子，逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子，熱休克啟動(dòng)子，EF啟動(dòng)子等等，優(yōu)選SV-40，SRα，逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的啟動(dòng)子。當(dāng)然，啟動(dòng)子不限于上述實(shí)例。此外，應(yīng)用增強(qiáng)子將使表達(dá)更有效。
優(yōu)選的啟始密碼如甲硫氨酸密碼(ATG)。
常用的終止密碼(如TAG，TGA，TAA等)均在此用作終止密碼。
常用的天然或合成終止子也用于作終止子區(qū)。
復(fù)制子意指可在宿主細(xì)胞中復(fù)制全長(zhǎng)DNA序列的DNA，包括天然質(zhì)粒，人工修飾質(zhì)粒(從天然質(zhì)粒制備的DNA片段)，合成質(zhì)粒等。優(yōu)選質(zhì)粒的實(shí)例有用于大腸桿菌的pBR322或其人工衍生物(用適當(dāng)限制酶處理所得DNA片段)，用于酵母的酵母2μ質(zhì)粒或酵母染色體DNA，用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的pEFneo，pME18S，pRSVneo ATCC 37198，pSV2dhfr ATCC 37145，pdBPV-MMTneo ATCC 37224，pSV2neo ATCC 37149等。
本領(lǐng)域常用的增強(qiáng)子序列，多聚腺苷酸化位點(diǎn)和剪接連接，如SV 40衍生的那些，均用于此。
可按常規(guī)方法使用可選擇性標(biāo)志物。其實(shí)例有抗生素耐藥基因，如四環(huán)素、新霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、及胸苷激酶基因。
用于基因擴(kuò)增的基因?qū)嵗卸淙~酸還原酶、(DHFR)基因、胸苷激酶基因、新霉素耐藥基因、谷氨酸合成酶基因、腺苷脫氨酶基因、鳥氨酸脫羧酶基因、潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因。
本發(fā)明的表達(dá)載體可通過持續(xù)、循環(huán)地連接至少上述啟動(dòng)子，起始密碼，編碼本發(fā)明之多肽的DNA(基因)，終止密碼，及終止子區(qū)至合適的復(fù)制子上而制備。若有需要，適當(dāng)?shù)腄NA片段(如連接子，其它限制酶位點(diǎn))均可用諸如限制酶消化或以T4 DNA酶連接的常用方法而使用。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可通過向宿主細(xì)胞導(dǎo)入上述表達(dá)載體而制備。
本發(fā)明所用宿主細(xì)胞不限，只要能兼容上述表達(dá)載體并可被轉(zhuǎn)化。其實(shí)例如天然細(xì)胞或人工建成的重組細(xì)胞，均常用于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域(如細(xì)菌(埃希氏菌和芽孢桿菌)，酵母(酵母屬，畢赤酵母屬等)，動(dòng)物細(xì)胞，或昆蟲細(xì)胞)。
優(yōu)選大腸桿菌或動(dòng)物細(xì)胞。具體例子有大腸桿菌(DH5α，XL1Blue MRF′，TB1，HB101等)，小鼠衍生的細(xì)胞(COP，L.C127，Cp210，NS-1，N2H3T3，等)，大鼠源細(xì)胞，倉(cāng)鼠源細(xì)胞(BHK，CH0-K1，CHO等)，猴源細(xì)胞(cos1，cos3，cos7，cv1，Velo，等)，及人源細(xì)胞(HEK 293，Hela，二倍體成纖維細(xì)胞衍生細(xì)胞，黑色素瘤，Namalwa等)。
表達(dá)載體可用已知方法導(dǎo)入(轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)導(dǎo)))宿主細(xì)胞。
若宿主為細(xì)菌(大腸桿菌，枯草桿菌等)時(shí)，轉(zhuǎn)化可按Cohen等的方法(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊69卷2110頁(yè)(1972))，原生質(zhì)體法(分子基因遺傳學(xué)，18卷，111頁(yè)(1979))，或感受態(tài)法(分子生物學(xué)雜志，56卷，209頁(yè)(1971))，若宿主為釀酒酵母，轉(zhuǎn)化可用Hinnen等人的方法(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊75卷，1927頁(yè)(1978))或鋰法(細(xì)菌學(xué)雜志，153卷，163頁(yè)(1983))，若宿主為動(dòng)物細(xì)胞用Graham法(病毒學(xué)，52卷，456頁(yè)(1973))，若宿主為昆蟲細(xì)胞，用Summers等人的方法(分子細(xì)胞生物學(xué)，3卷，2156-2165頁(yè)(1983))。
生產(chǎn)本發(fā)明之多肽的方法可以是在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含上述制備的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體(下文中該術(shù)語(yǔ)包括轉(zhuǎn)導(dǎo)子)。
營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基較優(yōu)選包含宿主細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)生長(zhǎng)所必需的碳源，無機(jī)氮源，或有機(jī)氮源。碳源如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉及蔗糖、無機(jī)或有機(jī)氮源如銨鹽、硝酸鹽、氨基酸、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白、肉浸汁、大豆糕，和馬鈴薯浸出汗。若有需要，還可包含其它營(yíng)養(yǎng)(如，無機(jī)鹽(如氯化鈣，磷酸二氫鹽，氯化鎂))，維生素，抗生素(如四環(huán)素、新霉素、氨芐青霉素、卡那霉素等)。
培養(yǎng)方法本領(lǐng)域熟知。所選培養(yǎng)條件如溫度、培養(yǎng)基的酸堿度、培養(yǎng)時(shí)間使本發(fā)明的多肽超量產(chǎn)生。
下文例舉了根據(jù)不同宿主細(xì)胞所選用的特殊培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，但并非限制。
若宿主為細(xì)菌、放線菌、酵母，絲狀真菌，適于用含上述營(yíng)養(yǎng)源的液體培養(yǎng)基。優(yōu)選用pH5至8的培養(yǎng)基。
若宿主為大腸桿菌，優(yōu)選培養(yǎng)基有LB培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基(Miller等，實(shí)驗(yàn)分子遺傳學(xué)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，431頁(yè)(1972))。用這些培養(yǎng)基，常于14至43℃培養(yǎng)約3至24小時(shí)，若有必要，通氣并攪拌。
若宿主為芽孢桿菌，則根據(jù)需要于30至40℃通氣并攪拌培養(yǎng)約16至96小時(shí)。
若宿主為酵母，培養(yǎng)基可選Burkholder基本培養(yǎng)基(Bostian，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，77卷，4505頁(yè)(1980))。培養(yǎng)基pH值較優(yōu)選5至8。根據(jù)需要于20至35℃通氣并攪拌培養(yǎng)14至144小時(shí)。
若宿主為動(dòng)物細(xì)胞，可選MEM培養(yǎng)基，內(nèi)含5至20％胎牛血清(科學(xué)，122卷，501頁(yè)(1952))，DMEM培養(yǎng)基(病毒學(xué)，8卷，396頁(yè)(1959))，RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)雜志，199卷，519頁(yè)(1967))，199培養(yǎng)基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.173卷，1頁(yè)(1950))。培養(yǎng)基pH值約6至8。根據(jù)需要于約30至40℃通氣攪拌培養(yǎng)約15至72小時(shí)。
若宿主為昆蟲細(xì)胞，可用例如含胎牛血清的Grace′s培養(yǎng)基(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，82卷，8404頁(yè)(1985))。pH優(yōu)選約5至8。根據(jù)需要于約20至40℃通氣攪拌培養(yǎng)15至100小時(shí)。
上述轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)，尤其動(dòng)物細(xì)胞?？沙勘磉_(dá)本發(fā)明之多肽于細(xì)胞表面。
本發(fā)明的多肽可生產(chǎn)成可溶性肽段如胞外區(qū)片段，方法是用上述以編碼胞外區(qū)或各區(qū)的DNA制備轉(zhuǎn)化體，并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體使之將可溶性肽分泌于培養(yǎng)上清中。此外，本發(fā)明的融合多肽可用類似的方法制備。
即，過濾或離心所獲培養(yǎng)物得到培養(yǎng)濾液(上清)，從中純化并分離本發(fā)明的多肽或多肽片段，方法采用常用于純化和分離天然或合成蛋白質(zhì)的常規(guī)方法。
分離及純化法實(shí)例有利用溶解度的方法，如鹽析法和溶劑沉淀法，利用分子量差異的方法如透析，超濾，凝膠過濾，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用電荷的方法如離子交換層析和羥基磷灰石層析，利用特異性親和的方法如親和層析，利用疏水性差異的方法如反相高效液相層析，及利用等電點(diǎn)差異的方法如等電聚焦。
若本發(fā)明之多肽或多肽片段存在于所培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的周質(zhì)或胞質(zhì)，首先，用常規(guī)方法如過濾或離心并懸浮于適當(dāng)緩沖液的方法收獲真菌菌體或細(xì)胞，經(jīng)超聲破碎、溶酶體法、凍融法等方法破壞細(xì)胞壁和/或細(xì)胞膜等之后，含本發(fā)明之多肽的膜部分用諸如離心或過濾的方法獲得。用去污劑如Triton-X100溶解膜部分獲得粗提物。最后，用上文舉例的常規(guī)方法從粗提物中分離及純化多肽或多肽片段。
“轉(zhuǎn)基因小鼠”在本發(fā)明中指這樣一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其中按上述制備的來源于除小鼠以外的動(dòng)物(非自身)編碼本發(fā)明多肽的DNA已整合在該小鼠的內(nèi)源基因位點(diǎn)上。該轉(zhuǎn)基因小鼠在其體內(nèi)表達(dá)并分泌非自身多肽。
轉(zhuǎn)基因小鼠可按常規(guī)方法制備(如見“動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)最新手冊(cè)”，LIC出版，第7章，361-408頁(yè)，(1990))。
具體地，如用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得自正常小鼠胚泡的胚胎干細(xì)胞ES細(xì)胞，該載體基因中可操作性插入有編碼本發(fā)明之人源多肽(即“人JTT-1抗原”)的基因。ES細(xì)胞的內(nèi)源基因中整合了編碼本發(fā)明的人源多肽的基因，用常規(guī)方法篩選。然后，所選ES細(xì)胞微注射入來自另一正常小鼠Pro受精卵胚泡(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，77卷，12期，7380-7384頁(yè)(1980)；美國(guó)專利號(hào)4,873,191)。該胚泡移植入了另一正常小鼠(養(yǎng)母)的子宮。然后，養(yǎng)母小鼠生出建立者(founder)小鼠(子代小鼠)。將建立者(founder)小鼠與正常小鼠交配，獲得異源轉(zhuǎn)基因小鼠。將異源轉(zhuǎn)基因小鼠相互交配，根據(jù)孟德爾定律獲得同源轉(zhuǎn)基因小鼠。
本發(fā)明的“基因敲出小鼠”是其編碼本發(fā)明之小鼠源多肽(即“小鼠源JTT-1抗原”)的內(nèi)源基因已被基因敲出(滅活)?？捎美珀?yáng)性陰性選擇法制備，其中應(yīng)用了同源重組(美國(guó)專利號(hào)5,464,764；5,487,992；5,627,059，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊86卷，8932-8935頁(yè)(1989)；自然，342卷，435-438頁(yè)(1989)；等等)。
“抗體”在本發(fā)明中可以是多克隆抗體(抗血清)或單克隆抗體，優(yōu)選單抗。
特別是可與上述本發(fā)明之多肽或多肽片段反應(yīng)(對(duì)抗，結(jié)合)的抗體。
本發(fā)明的抗體可以是用抗原免疫接種哺乳動(dòng)物而得的天然抗體，其中哺乳動(dòng)物如小鼠、大鼠，倉(cāng)鼠，豚鼠，兔?？乖绫磉_(dá)本發(fā)明之“細(xì)胞表面分子”的細(xì)胞(天然細(xì)胞，細(xì)胞系，腫瘤細(xì)胞等)，于其表面超表達(dá)在該細(xì)胞表面用重組DNA技術(shù)制備的本發(fā)明之多肽或細(xì)胞表面分子的轉(zhuǎn)化體，或本發(fā)明的“多肽片段”或“融合多肽”。本發(fā)明之抗體還包括可用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的嵌合抗體和人化抗體(CDR-移植抗體)，可用產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)的人類抗體。
單抗包括具有IgG，IgM，IgA，IgD，或IgE中任一同種型的那些，優(yōu)選IgG或IgM。
本發(fā)明的多克隆抗體(抗血清)和單克隆抗體可用已知方法制備。即，用如上述某種抗原免疫接種哺乳動(dòng)物，必要時(shí)可加弗氏佐劑。該哺乳動(dòng)物優(yōu)選小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠，豚鼠，兔，貓，狗，豬，山羊，馬或牛，或更優(yōu)選小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠，豚鼠，或兔。
多克隆抗體可從如此免疫接種的動(dòng)物的抗血清中獲得。此外，單抗如下生產(chǎn)。用獲自如此接種動(dòng)物所得產(chǎn)抗體細(xì)胞及不產(chǎn)自身抗體的骨髓瘤細(xì)胞的產(chǎn)抗體細(xì)胞制備雜交瘤?？寺‰s交瘤，篩選對(duì)用于免疫接種哺乳動(dòng)物的抗原有特異親和力的單抗生產(chǎn)克隆。
具體地，該單抗可如下生產(chǎn)。用上述抗原作免疫原，對(duì)非人類哺乳動(dòng)物，特別是小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠，豚鼠或兔，較優(yōu)選小鼠，大鼠或倉(cāng)鼠(包括為生產(chǎn)其它動(dòng)物抗體而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠如下文中產(chǎn)生人類抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠)，經(jīng)皮下，肌肉，靜脈，腳掌或腹膜內(nèi)注射或植入一次或多次，完成免疫接種(如有必要，抗原配合弗氏佐劑)。通常，初次免疫接種后每隔1至14天再接種1至4次。末次接種的約1至5天后可得產(chǎn)抗體細(xì)胞。免疫接種的頻率和時(shí)間間隔可根據(jù)所用免疫原的特點(diǎn)適當(dāng)安排。制備分泌單抗的雜交瘤可用Kohler及Milstein的方法(自然，256卷，495-497頁(yè)(1975))或其修改方法。即，用上述已免疫接種的非人哺乳動(dòng)物的脾。淋巴結(jié)，骨髓或扁桃體(優(yōu)選脾)的產(chǎn)抗體細(xì)胞與無產(chǎn)生自身抗體能力的優(yōu)選地來自哺乳動(dòng)物如小鼠，大鼠，豚鼠，倉(cāng)鼠，兔或人，或更優(yōu)選小鼠，大鼠，或人的骨髓瘤細(xì)胞融合以制備雜交瘤。
例如，小鼠源骨髓瘤P3/X63-AG8.653(653)，P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)，P3/X63＝Ag8.U1(P3U1)，SP2/0-Ag14(Sp2/0，Sp2)，PAI，F(xiàn)0，或BW 5147，大鼠源骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3，或人源骨髓瘤U-266AR1，GM 1500-6TG-A1-2，UC 729-6，CEM-AGR，D1R11，或CEM-T15可用作該細(xì)胞融合中的骨髓瘤。
篩選產(chǎn)單抗的雜交瘤克隆方法可以是培養(yǎng)雜交瘤于如微滴板上，對(duì)發(fā)現(xiàn)有雜交瘤生長(zhǎng)的各孔測(cè)培養(yǎng)上清對(duì)上述免疫接種所用免疫原的反應(yīng)性，所用方法如酶免疫試驗(yàn)(如RIA和ELISA)。
雜交瘤單抗可產(chǎn)生于通過培養(yǎng)雜交瘤于體外或體內(nèi)如小鼠，大鼠，豚鼠，倉(cāng)鼠，兔，較優(yōu)選小鼠或大鼠。更優(yōu)選小鼠的腹水中，從最后的培養(yǎng)上清或哺乳動(dòng)物腹水中分離抗體。
體外培養(yǎng)雜交瘤可根據(jù)要培養(yǎng)細(xì)胞的特點(diǎn)，研究目的及培養(yǎng)法和各種條件，用已知營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或衍生于已知基礎(chǔ)培養(yǎng)基的任何營(yíng)養(yǎng)型培養(yǎng)基培養(yǎng)，維持，并貯存雜交瘤以便在培養(yǎng)上清中產(chǎn)生單抗。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基的例子有低鈣濃度培養(yǎng)基如Ham′F12培養(yǎng)基，MCDB 153培養(yǎng)基，或低鈣濃度MEM培養(yǎng)基，還有高鈣濃度培養(yǎng)基如MCDB 104培養(yǎng)基，MEM培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，1640培養(yǎng)基，ASF 104培養(yǎng)基或RD培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基可根據(jù)目的包含如血清、激素，細(xì)胞因子和/或各種無機(jī)或有機(jī)物。
從上述培養(yǎng)上清或腹水中分離并純化單抗可用飽和硫酸銨沉淀，優(yōu)球蛋白沉淀法，己酸法，辛酸法，離子交換層析(DEAE或DE52)，抗免疫球蛋白柱或蛋白A柱的親和層析。
本發(fā)明之單抗的優(yōu)選實(shí)例如下。
(1)單抗，可針對(duì)有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽，其衍生的多肽片段，或由該多肽構(gòu)成的人源細(xì)胞表面分子起反應(yīng)；(2)單抗，可針對(duì)本發(fā)明的多肽，其衍生的多肽片段，或由該多肽構(gòu)成的細(xì)胞表面分子起反應(yīng)，其中單抗在絲裂原刺激的淋巴母細(xì)胞上的作用實(shí)質(zhì)上等同于由國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-5707所鑒定的雜交瘤所產(chǎn)生的單抗在絲裂原刺激的大鼠淋巴母細(xì)胞上的作用；(3)單抗，可針對(duì)本發(fā)明的多肽，其衍生的多肽片段，或由該多肽組成的細(xì)胞表面分子，其中該單抗對(duì)絲裂原刺激的淋巴母細(xì)胞的作用實(shí)質(zhì)上等同于由國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-5708所鑒定的雜交瘤所產(chǎn)單抗對(duì)絲裂原刺激的大鼠淋巴母細(xì)胞的作用。
此外，本發(fā)明的單抗包括由國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-5707或FERM BP-5708所鑒定的雜交瘤所產(chǎn)單抗。
本發(fā)明的“嵌合單抗”是用遺傳工程制備的單抗，特指嵌合的抗體諸如小鼠/人嵌合單抗，其可變區(qū)衍生自非人哺乳動(dòng)物(小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠等)的免疫球蛋白而其恒定區(qū)來自人免疫球蛋白。
人免疫球蛋白可變區(qū)具有生每種同種型如IgG(IgG1，IgG2，IsG3，IgG4)，IgM、IgA，IgD和IgE所固有的氨基酸序列。本發(fā)明之重組嵌合單抗的恒定區(qū)可以是任何同種型的人免疫球蛋白的。優(yōu)選是人IgG的恒定區(qū)。
本發(fā)明的嵌合單抗可如下生產(chǎn)。無需說，該生產(chǎn)方法并非限制與此。
小鼠/人嵌合單抗可參照實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)；增刊，卷1.6，10期(1988)；已審查公布的日本專利申請(qǐng)(JP-B)號(hào)Hei 3-73280制備。即將活化VH基因下游的CH基因與活化VL基因下游的CL基因可操作插入相同或不同載體表達(dá)，其中CH基因(編碼H鏈恒定區(qū)的C基因)得自編碼人免疫球蛋白的DNA；活化VH基因(重排的編碼H鏈可變區(qū)的VDJ基因)得自編碼小鼠單抗的DNA，該單抗分離自產(chǎn)生該單抗的雜交瘤，CL基因(編碼L鏈恒定區(qū)的C基因)得自編碼人免疫球蛋白的DNA，活化的VL基因(重排的編碼L鏈可變區(qū)的VJ基因)得自小鼠編碼單抗的DNA，該單抗分離自雜交瘤。隨后用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，再培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體。
具體地，DNA首先用常規(guī)方法抽提自小鼠單抗生成的雜交瘤。再用適當(dāng)?shù)南拗泼?如EcoRI和HindIII)消化，電泳(用如0.7％瓊脂糖凝膠)，用Southern印跡分析。電泳膠經(jīng)染色，如溴化乙錠染色并攝相，膠中顯示標(biāo)志物位置，用水洗兩次，在0.25M HCl中浸泡15分鐘。然后，將膠浸于0.4NNaOH溶液溫和攪拌10分鐘。DNA用常規(guī)方法轉(zhuǎn)移4小時(shí)至濾膜上。濾膜重新用2×SSC覆蓋并洗兩次。濾膜充分干燥后，于75℃烘烤3小時(shí)。再用0.1×SSC/1％SDS于65℃將濾膜處理膜30分鐘。然后，浸于3×SSC/0.1％SDS。所得濾膜用預(yù)雜交溶液在塑料袋中于65℃處理3至4小時(shí)。
下一步，向塑料袋中加入32P標(biāo)記的探針DNA和雜交溶液65℃反應(yīng)12小時(shí)，隨后濾膜在適宜鹽濃度，反應(yīng)溫度和時(shí)間(如2×SSC-0.1％SDS，室溫10分鐘)清洗。將濾膜放入有2×SSC的塑料袋中，封袋后進(jìn)行放射自顯影。
用上述Southern印跡法鑒別重排的編碼小鼠單抗H鏈和L鏈的VDJ基因和VJ基因。用蔗糖密度梯度離心分離含有所鑒別DNA片段的區(qū)域，插入噬菌體載體(如charon 4A，charon 28，λEMBL 3，λEMBL 4等)。大腸桿菌(如LE 392，MM 539等)用該噬菌體載體轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生基因組文庫(kù)。用蝕斑雜交篩選該基因組文庫(kù)，方法如Benton-Davis方法(科學(xué)，196卷，180-182頁(yè)(1977))，用適當(dāng)探針(H鏈J基因，L鏈(K)J基因等)以獲得含重排的VDJ基因或VJ基因的陽(yáng)性克隆。制所得克隆的限制酶圖譜并測(cè)定其核苷酸序列，確證所得基因中含有所期望的重排VH(VDJ)基因或VL(VJ)基因。
用于嵌合的人CH基因和人CL基因單獨(dú)分離。如，當(dāng)嵌合抗體用人IgG1產(chǎn)生時(shí)，Cγ1基因作為CH基因被分離，CK基因作為CL基因被分離。這些基因可從人基因文庫(kù)中分離，用分別相應(yīng)于人Cγ1基因和人CK基因的小鼠Cγ1基因和小鼠CK基因作探針，利用小鼠免疫球蛋白基因和人免疫球蛋白基因核苷酸序列的高度同源性。
具體地，包含人CK基因和一個(gè)增強(qiáng)子區(qū)的DNA片段分離自人類λCharon4A Hae III-AluI基因組文庫(kù)(細(xì)胞，15卷，1157-1174頁(yè)(1978))，探針為，如，克隆Ig146的3kb HindIII-BamHI片段(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊75卷，4709-4713頁(yè)(1978))和克隆MEP 10的6.8kb EcoRI片段(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，78卷，474-478頁(yè)(1981))。此外，如人胚肝細(xì)胞DNA用HindIII消化并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，一個(gè)5.9kb的片段被插入λ788，再用上述探針就分離到人Cγ1基因。
用如此獲得的小鼠VH基因，小鼠VL基因，人CH基因和人CL基因，并考慮啟動(dòng)子區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)，就可用常規(guī)方法用合適的限制酶和DNA連接酶將人CH基因插入小鼠VH基因的下游，并將人CL基因插入小鼠VL基因下游，最終進(jìn)入諸如pSV2gpt或pSV2neo之類的表達(dá)載體。在這種情況下，小鼠VH基因/人CH基因的嵌合基因，小鼠VL基因/人CL基基因的嵌合基因可分別插入同一個(gè)或不同的表達(dá)載體。
如此制備的插入了嵌合基因的表達(dá)載體被導(dǎo)入不產(chǎn)生抗體的骨骨瘤如P3X63·Ag8·653細(xì)胞或SP 210細(xì)胞，方法有原生質(zhì)體融合法，DEAE-葡聚糖法，磷酸鈣法或電穿孔法。將轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在與插入表達(dá)載體的耐藥基因相應(yīng)的藥物培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，而獲得產(chǎn)生預(yù)期嵌合單抗的細(xì)胞。
從如此篩選到的抗體生成細(xì)胞的培養(yǎng)上清可獲得預(yù)期嵌合單抗。
本發(fā)明的“人化單抗(CDR-移植抗體)”是經(jīng)遺傳工程所制單抗，并特指人化的單抗，其中超變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)部分或全部來自非人哺乳動(dòng)物(小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠等)單抗的超變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)，可變區(qū)的框架區(qū)來自人免疫球蛋白的可變區(qū)框架區(qū)，恒定區(qū)來自人免疫球蛋白的恒定區(qū)。
超變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)在抗體可變區(qū)的超變區(qū)中，指三個(gè)直接互補(bǔ)結(jié)合抗原的區(qū)域(互補(bǔ)決定殘基，CDR 1，CDR 2和CDR 3)?？勺儏^(qū)的框架區(qū)指位于三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)上游、下游或之間的4個(gè)相當(dāng)保守區(qū)(框架區(qū)FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4)。
換句話說，人化單抗指其完整區(qū)域中除了非人哺乳動(dòng)物源的單抗超變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)部分或全部被其相應(yīng)的源于人免疫球蛋白區(qū)域取代的那些。
源于人免疫球蛋白恒定區(qū)有固有于各個(gè)同種型如IgG(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，IgM，IgA，IgD和IgE中的氨基酸序列。本發(fā)明中人化單抗的恒定區(qū)可是來自屬于任一種同種型的人免疫球蛋白。較優(yōu)選為人IgG的恒定區(qū)。來自人免疫球蛋白的恒定區(qū)的框架區(qū)無特別限制。
本發(fā)明的人化單抗生產(chǎn)方法舉例如下。無需說，生產(chǎn)方法不限于此。
如，經(jīng)遺傳工程制備小鼠單抗衍生的重組人化單抗，參照未審查的日本專利發(fā)表(JP-WA)號(hào)Hei4-506458和未審查的日本專利發(fā)表(JP-A)號(hào)Sho62-296890。即，從產(chǎn)小鼠單抗的雜交瘤分離出至少一個(gè)小鼠H鏈CDR基因及其相應(yīng)的至少一個(gè)小鼠L鏈CDR基因，從人免疫球蛋白基團(tuán)中分離出編碼除對(duì)應(yīng)于上述小鼠H鏈CDR的人H鏈CDR以外的全部區(qū)的人H鏈基因，和編碼除對(duì)應(yīng)于上述小鼠L鏈CDR的人L鏈CDR以外的全部區(qū)的人L鏈基因。
如此分離到的小鼠H鏈CDR基因和人H鏈基因可操作插入適宜載體使它們表達(dá)。相似地，小鼠L鏈CDR基因和人L鏈基因可操作插入另一適宜載體使它們表達(dá)?；蛘撸∈驢鏈CDR基因/人H鏈基因和小鼠L鏈CDR基因/人L鏈基因可操作插入同一表達(dá)載體使它們表達(dá)。用如此制備的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以獲得產(chǎn)生人化單抗的轉(zhuǎn)化體。通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，可從培養(yǎng)上清中獲得預(yù)期的人化單抗。
本發(fā)明的“人單抗”所指免疫球蛋白，其中含組成免疫球蛋白的H鏈可變區(qū)和恒定區(qū)，L鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的完整區(qū)域由編碼人免疫球蛋白的基因產(chǎn)生。
人抗體的產(chǎn)生方法可同于上述多克隆抗體或單抗的產(chǎn)生方法，即用抗原免疫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如該動(dòng)物如小鼠用常規(guī)方法在適當(dāng)位點(diǎn)整合了至少人的免疫球蛋白基因。
例如制備可產(chǎn)人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的方法描述在自然遺傳學(xué)，7卷，13-21頁(yè)(1994)；自然遺傳學(xué)，15卷，146-156頁(yè)(1997)；JP-WA編號(hào)Hei4-504365和Hei 7-509137；Nikkei科學(xué)，6期，40-50頁(yè)(1995)；國(guó)際專利發(fā)表號(hào)WO 94/25585；自然，368卷，856-859頁(yè)(1994)；和JP-WA編號(hào)Hei 6-500233。
此外，可應(yīng)用用于從轉(zhuǎn)基因奶?；蜇i的奶中產(chǎn)生人源蛋白的最新開發(fā)技術(shù)(Nikkei科學(xué)，78-84頁(yè)(1997年4月))。
用于本發(fā)明的“抗體的部分”指上述單抗的部分區(qū)域，并具體指F(ab′)2，F(xiàn)ab′，F(xiàn)ab，F(xiàn)v(抗體可變片段)，sFv，dsFv(二硫鍵所穩(wěn)定的Fv)，或dAb(單區(qū)抗體)(Exp.Opin.Ther.Patents，6卷，5期，441-456頁(yè)(1996))。
“F(ab′)2”和“Fab′”可用如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等處理免疫球蛋白(單抗)產(chǎn)生，意思指消化在兩條H鏈每一個(gè)的絞鏈區(qū)之間二硫鍵附近的免疫球蛋白所產(chǎn)生的抗體片段。如木瓜蛋白酶在兩條H鏈中每一個(gè)的絞鏈區(qū)之間的二硫鍵IgG上游切割，產(chǎn)生兩個(gè)同源的抗體片段，其中L鏈由VL(L鏈可變區(qū))和CL(L鏈恒定區(qū))組成，H鏈片段由VH(H鏈可變區(qū))和CHγ1(H鏈恒定區(qū)的γ1區(qū))組成，L鏈和H鏈在它們的C末端區(qū)通過二硫鍵連接。這樣兩個(gè)同源的抗體片段的每一個(gè)均稱Fab′。胃蛋白酶也在兩個(gè)H鏈的每一個(gè)的絞鏈區(qū)的二硫鍵的IgG下游切割，產(chǎn)生的抗體片段略大于其中兩個(gè)上述Fab′在絞鏈區(qū)連接而成的片段。該抗體片段稱F(ab′)2。
本發(fā)明中“藥學(xué)組合物”包括上文規(guī)定的本發(fā)明的任一個(gè)“多肽”；含該多肽的“同型二聚體分子”，“多肽片段”；“融合多肽”；包括該融合多肽的“同型二聚體分子”，“抗體”，或“抗體的部分”；以及一個(gè)可藥用載體。
“可藥用載體”包括賦形劑，稀釋劑，膨脹劑，分解劑，穩(wěn)定劑，防腐劑，緩沖液，乳化劑，芳香劑，著色劑，加甜劑，增粘劑，生泡劑，增溶劑或其它添加劑。用一種或更多這樣的載體可將藥學(xué)組合物配成片劑，藥丸，藥粉，藥粒，注射液，溶液，膠囊，錠劑，酏劑，懸浮液，乳劑或糖漿。藥學(xué)組合物可口服或不經(jīng)胃腸道服用。非胃腸道給藥的其它形式包括外用溶液，直腸用藥及陰道栓劑，按常規(guī)方法開處方，其中包含一種或更多種有效成分。
劑量根據(jù)年齡，性別，體重，病癥，治療效果，給藥途徑，治療階段，或藥學(xué)組合物中所含有效成分的種類(上述多肽或抗體)而有變化。一般，成人給藥劑量為每次10μg-1000mg(或10μg-500mg)。根據(jù)不同情況，低于上述劑量在某些病例中可能足夠，多于上述劑量在其它病例中可能是必需的。
尤其，注射劑的產(chǎn)生可將抗體溶解于或懸浮于無毒性可藥用載體如生理鹽水或市售注射用蒸餾水，調(diào)成0.1μg抗體/ml載體至10mg抗體/ml載體的濃度。如此產(chǎn)生的注射液可給藥于需要治療的病人，劑量為1μg-100mg/kg體重，較優(yōu)選50μg-50mg/kg體重，一天一次或多次給藥。給藥途徑的實(shí)例均為醫(yī)療上適當(dāng)?shù)慕o藥途徑如靜脈注射，皮下注射，皮內(nèi)注射，肌肉注射，或腹膜內(nèi)注射，較優(yōu)選靜脈注射。
注射劑也可制入非水相稀釋劑(如丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，醇類如乙醇)，懸浮液，或乳液中。
注射劑濾過除菌濾器，或與殺菌劑混合，或輻射可滅菌。注射劑可制成備用形式。即凍干為無菌固相組合物，用之前溶解于注射用無菌蒸餾水或其它溶劑。
本發(fā)明的藥學(xué)組合物可用于治療或預(yù)防由淋巴細(xì)胞如T細(xì)胞的活化和活化淋巴細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)所致的各種自身免疫病，過敏性疾病，或炎癥性炎病。病例有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，自身免疫性甲狀腺炎，過敏性接觸性皮炎，慢性炎癥性皮膚病如扁平癬，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，胰島素依賴型糖尿病和牛皮癬。
本發(fā)明之藥學(xué)組合物對(duì)多種疾病的治療效果可用常規(guī)方法將它給藥于已知疾病的動(dòng)物模型而檢測(cè)。
模型的實(shí)例包括(1)(NZB/NZW)F1小鼠，人系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的模型(科學(xué)，科學(xué)125卷，1225-1227頁(yè)，1994)，(2)實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎(EAE)，多發(fā)性硬化癥(MS)模型(臨床調(diào)研雜志，95卷，2783-2789頁(yè)(1995))。(3)NOD(非肥胖糖尿病)小鼠，胰島素依賴型糖尿病(IDDM)模型(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，181卷，1145-1155頁(yè)(1995))，(4)腎小球基底膜免疫所致大鼠腎炎模型，Goodpasture′s腎炎模型(歐洲免疫學(xué)雜志，24卷，6期，1249-1254頁(yè)(1994))，(5)DBA/1小鼠，人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型(歐洲免疫學(xué)雜志，26卷，2320-2328頁(yè)(1996))。
圖的描述

圖1為顯微攝影，顯示FTL 435細(xì)胞經(jīng)“JTT-1抗體”誘導(dǎo)的凝集狀態(tài)和該細(xì)胞凝集受“JTT-2抗體”抑制的狀態(tài)。
其中(a)示無任何雜交瘤上清時(shí)細(xì)胞狀態(tài)，(b)示“JTT-1抗體”誘導(dǎo)的細(xì)胞凝集狀態(tài)，(c)示有“抗-ICAM-1抗體”及“JTT-1抗體”時(shí)細(xì)胞狀態(tài)，(d)示有“JTT-2抗體”與“JTT-1抗體”共同作用的細(xì)胞凝集狀態(tài)。
圖2是顯微攝影，顯示FTL 435細(xì)胞和大鼠活化的淋巴母細(xì)胞經(jīng)“JTT-1抗體”誘導(dǎo)的細(xì)胞凝集狀態(tài)和“JTT-2抗體”對(duì)細(xì)胞凝集的抑制狀態(tài)。
其中(a)示無任何抗體時(shí)FTL 435細(xì)胞的狀態(tài)，(b)示有PMA時(shí)FTL 435細(xì)胞的狀態(tài)，(c)示有“JTT-1抗體”時(shí)FTL 435細(xì)胞的狀態(tài)，(d)示有抗LFA-1抗體與“JTT-1抗體”時(shí)FTL 435細(xì)胞的狀態(tài)，(e)示有抗CD18抗體與“JTT-1抗體”時(shí)FTL 435細(xì)胞的狀態(tài)，(f)示有抗ICAM-1抗體與“JTT-1抗體”時(shí)FTL 435細(xì)胞的狀態(tài)，(g)示無任何抗體時(shí)活化的淋巴母細(xì)胞的狀態(tài)，(h)示有PMA時(shí)活化淋巴母細(xì)胞的狀態(tài)，(i)示有“JTT-1抗體”時(shí)活化淋母細(xì)胞的狀態(tài)，(j)示有抗LFA-1抗體與“JTT-1抗體”時(shí)活化淋母細(xì)胞的狀態(tài)，(k)示有抗CD18抗體與“JTT-1抗體”時(shí)活化淋母細(xì)胞的狀態(tài)，(l)示有抗ICAM-1抗體與“JTT-1抗體”時(shí)活化淋母細(xì)胞的狀態(tài)。
圖3顯示用流式細(xì)胞儀測(cè)量的“JTT-1抗原”和“JTT-2抗原”在不同細(xì)胞中的表達(dá)狀態(tài)。
圖4顯示用流式細(xì)胞儀測(cè)量的“JTT-1抗原”在不同淋巴細(xì)胞中的表達(dá)狀態(tài)。
圖5為照片，顯示經(jīng)SDS-PAGE分析“JTT-1抗原”的電泳圖譜。
圖6為顯微攝影，顯示大鼠胸腺細(xì)胞對(duì)包被有純化的“JTT-1抗原”的微滴板的粘附狀態(tài)，其粘附在“JTT-1抗體”存在時(shí)受誘導(dǎo)，和“JTT-2抗體”抑制細(xì)胞粘附的狀態(tài)。
其中(a)示細(xì)胞對(duì)未包被“JTT-1抗原”的板的粘附狀態(tài)，(b)示無任何抗體時(shí)細(xì)胞對(duì)包被“JTT-1抗原”的板的粘附狀態(tài)，(c)示在有“JTT-1抗體”的Fab片段時(shí)細(xì)胞對(duì)包被“JTT-1抗原”的板的粘附狀態(tài)，(d)示有“JTT-2抗體”與“JTT-1抗體”Fab片段時(shí)細(xì)胞對(duì)包被“JTT-1抗原”的板的粘附狀態(tài)。
圖7顯示熒光強(qiáng)度測(cè)量所得胸遙細(xì)胞粘附于包被有純化“JTT-1抗原”的板的相對(duì)細(xì)胞數(shù)。
“Ag(-)”示未包被“JTT-1抗原”的板中相對(duì)細(xì)胞數(shù)，“Ag(+)”示無任何抗體時(shí)包被“JTT-1抗原”的板中相對(duì)細(xì)胞數(shù)，“Ag(+)+JTT-1Fab”示有“JTT-1抗體”Fab段時(shí)包被“JTT-1抗原”的板中的相對(duì)細(xì)胞數(shù)，“Ag(+)+JTT-1 Fab+JTT-2”示有“JTT-2抗體”與“JTT-1抗體”Fab段時(shí)包被了“JTT-1抗原”的板中的相對(duì)細(xì)胞數(shù)。
圖8示流式細(xì)胞儀測(cè)得“大鼠“JTT-1抗原”和“大鼠JTT-1抗原”在COS細(xì)胞中的表達(dá)狀態(tài)，該細(xì)胞轉(zhuǎn)化有編碼“大鼠JTT-1抗原”的cDNA。
圖9顯示親水性圖分析所揭示的“JTT-1抗原”氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征。
圖10顯示人，大鼠和小鼠“JTT-1抗原”及“大鼠JTT-1抗原”突變體的氨基酸序列間的同源性。
圖11顯示“人JTT-1抗原”，“人CD28分子”和“人CTLA-4分子”中的基序的氨基酸序列同源性和保守狀態(tài)。
圖12圖示了“人JTT-1抗原”，“人CD28分子”和“人CTLA-4分子”的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和它們之間的相似性。
圖13圖示了編碼“小鼠JTT-1抗原”的基因組DNA的結(jié)構(gòu)。
圖14顯示“大鼠JTT-1抗原”及其另一種剪接實(shí)變體之間氨基酸序列的差別。
圖15顯示用[3H]胸苷摻入法測(cè)得的人外周血淋巴細(xì)胞受抗“人JTT-1抗原”的單抗誘導(dǎo)后的生長(zhǎng)程度。
縱坐標(biāo)示[3H]胸苷摻入細(xì)胞的量(dpm)。
圖16顯示疾病模型大鼠中，抗“JTT-1抗原”的單抗對(duì)實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎(EAE)的療效。
縱坐標(biāo)顯示病癥的得分程度，橫坐標(biāo)示免疫誘導(dǎo)EAE后的天數(shù)。
圖17顯示在疾病模型大鼠中，抗“JTT-1抗原”的單抗對(duì)大鼠腎小球腎炎的療效。
縱坐標(biāo)示蛋白尿排泄量，橫坐標(biāo)示免疫誘導(dǎo)腎小球腎炎后的時(shí)間(周數(shù))。
圖18顯示用蛋白A Sephaobse柱純化融合多肽(“大鼠JTT-1抗原”胞外區(qū)與人IgFc(rJTT-1-IgFc))的直方圖。
圖19為照片，顯示rJTT-1-IgFc經(jīng)SDS-PAGE分析所得電泳圖譜。
圖20顯示用蛋白A Sepharose柱純化融合多肽(“人JTT-1抗原胞外區(qū)和人IgFc(hJTT-1-IgFc))的直方圖。
圖21為照片，顯示hJTT-1-IgFc經(jīng)SDS-PAGE分析所得電泳圖譜。
圖22圖示了用于制備其中導(dǎo)入了編碼“大鼠JTT-1抗原”的cDNA的轉(zhuǎn)基因小鼠的基因轉(zhuǎn)移(靶向)載體的結(jié)構(gòu)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明參照以下實(shí)施例作更詳細(xì)描述，但不能理解成本發(fā)明限定于此。
實(shí)施例1 單抗制備按Kohler等的方法制備產(chǎn)抗體的雜交瘤(Omori等，血液，81卷，101-111頁(yè)(1993))，按Kannagi等的方法制備單抗(實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手則，4卷，117.21-117.21(1986))。
首先，以大鼠胸腺瘤細(xì)胞系FTL 435的細(xì)胞作為免疫抗原對(duì)BALB/C小鼠足掌給藥，107細(xì)胞/小鼠，給藥時(shí)間為0，7，14和28天。只在首次免疫時(shí)將抗原與弗氏完全佐劑混合給藥。末次接種2天后，取出小鼠的淋巴結(jié)，用常規(guī)方法與小鼠骨髓瘤細(xì)胞PAI融合(JCR NO.B0113；Stocker，J.W.等，Res.Disclosure，217卷，155頁(yè)(1982))，以獲得很多產(chǎn)單抗的雜交瘤。
實(shí)施例2 雜交瘤的篩選和單抗的鑒定篩選實(shí)施例1制備的雜交瘤的方法是，分析雜交瘤培養(yǎng)上清中產(chǎn)生的抗體對(duì)FTL 435細(xì)胞(免疫原)的作用。接種FTL 435細(xì)胞(5×106細(xì)胞/ml，0.1ml)至96孔板的每一孔中，在每個(gè)雜交瘤的培養(yǎng)上清存在下(每份10μg/ml)于37℃培養(yǎng)4小時(shí)。所得雜交瘤克隆“JTT-1”和“JTT-2”的結(jié)果示于圖1和圖2。
顯示雜交瘤克隆“JTT-1”產(chǎn)生的單抗(“JTT-1抗體”)強(qiáng)烈凝集FTL435細(xì)胞(圖1(b)和圖2(c))，而加入“JTT-2抗體”強(qiáng)烈抑制FTL 435細(xì)胞受“JTT-1抗體”刺激所致的凝集(圖1(d))。不加任何雜交瘤上清的實(shí)驗(yàn)孔為對(duì)照(圖1(a)和圖2(a))。
為測(cè)定FTL 435細(xì)胞受“JTT-1抗體”刺激引起的凝集是否由于細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)之間的粘附作用所致(因?yàn)樵摷?xì)胞粘附是具有代表性的已知通道)，在有抗大鼠ICAM-1抗體1A29(10μg/ml，IgG1)或抗大鼠LFA-1抗體(10μg/ml，IgG2a)與“JTT-1抗體”同時(shí)存在時(shí)37℃培養(yǎng)FTL 435細(xì)胞，1小時(shí)。
“JTT-1抗體”刺激引起的FTL 435細(xì)胞凝集既不被抗ICAM-1抗體抑制，也不被抗LFA-1抗體(抗ICAM-1抗體圖1(c)和圖2(f)；抗-LFA-1抗體，圖2(d))抑制。
為進(jìn)一步分析“JTT-1抗體”凝集細(xì)胞的能力。用上述相同方法分析該抗體凝集刀豆蛋白A活化的大鼠淋巴母細(xì)胞的能力。結(jié)果示于圖2。
與對(duì)FTL 435細(xì)胞的作用相似，活化的淋巴母細(xì)胞的凝集是受到“JTT-1抗體”的刺激誘導(dǎo)的(圖2(i))?！癑TT-1抗體”刺激所致的活化淋巴母細(xì)胞凝集大部分被抗-LFA-1抗體(圖2(j))和被抗ICAM-1抗體抑制(圖2(1))。(但仍有部分凝集)。
根據(jù)對(duì)未加任何抗體的對(duì)照實(shí)驗(yàn)(圖2(g))的理解，活化的淋巴細(xì)胞如活化的淋巴母細(xì)胞顯示沒有經(jīng)細(xì)胞粘附的凝集，除非它們接受大戟二萜醇肉豆蔻乙酸酯(PMA，活化LFA-1)的刺激(圖2(h))或接受“JTT-1抗體”的刺激(圖2(I))。因此抗LFA-1抗體部分抑制“JTT-1抗體”刺激的細(xì)胞凝集這一事實(shí)說明，活化的淋巴母細(xì)胞中的LFA-1受“JTT-1抗體”刺激而活化，它還說明“JTT-1抗體”識(shí)別的分子涉及某些信號(hào)傳遞。
雜交瘤克隆“JTT-1”和“JTT-2”已被保藏在布達(dá)佩斯條約下的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)，國(guó)家生命科學(xué)及人類技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)(國(guó)際工貿(mào)部，日本(1-1-3，Higashi，Tsukua-Shi，Ibaraki，日本))，保藏日1996年10月11日，國(guó)際保藏號(hào)為分別為FERM BP-5707和FERM BP-5708。
用單抗同種型鑒定試劑盒(Amersham)分析測(cè)得每種雜交瘤產(chǎn)生的單抗(JTT-1抗體和JTT-2抗體)均為IgG1。
實(shí)施例3 “JTT-1抗體”和“JTT-2抗體”對(duì)各種細(xì)胞的反應(yīng)性為分析不同細(xì)胞中“JTT-1抗體”和“JTT-2抗體”識(shí)別的分子的表達(dá)模式，檢測(cè)了這兩種抗體對(duì)不同細(xì)胞的反應(yīng)性?！癑TT-1抗體”或“JTT-2抗體”所識(shí)別的分子分別命名為“JTT-1抗原”或“JTT-2抗原”。
一只5周齡至10周齡Wistar大鼠(150-250g)用二乙醚麻醉處死。用剖腹術(shù)從其胸腔和腹部分別取出胸腺和脾，勻漿以制備細(xì)胞懸液。所得脾細(xì)胞在含2μg/ml刀豆蛋白A和10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)3天以制備活化的淋巴母細(xì)胞。
FTL 435細(xì)胞，胸腺細(xì)胞，脾細(xì)胞，活化淋母細(xì)胞(每種5×105個(gè)細(xì)胞)與“JTT-1抗體”或“JTT-2抗體”反應(yīng)，再與FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG(Cappel)反應(yīng)。被染色細(xì)胞的熒光強(qiáng)度用EPICS-Elite流式細(xì)胞儀測(cè)量。
結(jié)果示于圖3。FTL 435細(xì)胞中，觀察到“JTT-1抗原”和“JTT-2抗原”均強(qiáng)表達(dá)。這些抗原在胸腺細(xì)胞中有表達(dá)，而在脾細(xì)胞中只有很少的表達(dá)。然而用刀豆蛋白A刺激脾細(xì)胞所得活化淋母細(xì)胞中，“JTT-1抗原”和“JTT-2抗原”均強(qiáng)表達(dá)。此外，每種細(xì)胞中，“JTT-1抗原”和“JTT-2抗原”的表達(dá)模式一致。這些結(jié)果說明“JTT-1抗原”和“JTT-2抗原”是相同的分子。
實(shí)施例4 “JTT-1抗體”對(duì)各種淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性為分析各種淋巴細(xì)胞中“JTT-1抗體”所識(shí)別分子(“JTT-1抗原”)的表達(dá)模式，分析了“JTT-1抗體”對(duì)兩種大鼠(Wrstar大鼠和F344大鼠)的淋巴節(jié)，脾T淋母細(xì)胞，脾B淋母細(xì)胞的反應(yīng)性。
二乙醚麻醉處死5周齡至10周齡的Wistar大鼠和F344大鼠(150～250g)。剖腹術(shù)取出每只大鼠的淋巴節(jié)和脾，勻漿制成細(xì)胞懸液。脾細(xì)胞懸液在含2μg/ml刀豆蛋白A(ConA)和10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)3天。1天和3天后獲得每只大鼠的活化T淋母細(xì)胞和活化B淋母細(xì)胞。此外未加淋巴節(jié)細(xì)胞和ConA之前的脾T淋母細(xì)胞和脾B淋母細(xì)胞用作對(duì)照。
每種細(xì)胞(各5×105個(gè)細(xì)胞)與生物素標(biāo)記的抗大鼠T細(xì)胞抗體或生物素標(biāo)記的抗大鼠B細(xì)胞抗體(10μg/ml，Seikagaku公司)反應(yīng)，再與藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白反應(yīng)。再將細(xì)胞與10μg/ml FITC標(biāo)記的“JTT-1抗體”反應(yīng)。染色細(xì)胞的熒光強(qiáng)度用EPICS-Elite流式細(xì)胞儀測(cè)量。
結(jié)果示于圖4。Wistar大鼠和F344大鼠的活化T淋母細(xì)胞和活化B淋母細(xì)胞從ConA刺激活化作用的1天后開始均強(qiáng)表達(dá)“JTT-1抗原”。此外，每種細(xì)胞中“JTT-1抗原”的表達(dá)模式幾乎完全一致。
實(shí)施例5 用免疫沉淀法鑒定“JTT-1抗原”和“JTT-2抗原”通過用FTL 435細(xì)胞的免疫沉淀法鑒定“JTT-1抗原”和“JTT-2抗原”。
(1)制備生物素化可溶性細(xì)胞表面分子FTL 435細(xì)胞用PBS洗，再懸浮于含100μg/ml NHS-生物素和0.1M HEPES的生理鹽水(pH8.0)，調(diào)至1×107個(gè)細(xì)胞/ml，室溫40分鐘。用PBS洗細(xì)胞三次，加裂解液(1％NP-40，10mM Tris-HCl(pH7.4)，0.15M NaCl)調(diào)至5×107細(xì)胞/ml，4℃反應(yīng)30分鐘以裂解細(xì)胞。離心所得的裂解產(chǎn)物，含生物素化可溶性細(xì)胞表面分子的上清貯存于-80℃。
(2)免疫沉淀和SDS-PAGE分析“JTT-1抗體”用常規(guī)方法純化自實(shí)施例1制備的雜交瘤克隆“JTT-1”的培養(yǎng)上清，將該抗體的純化樣品與蛋白G-Sepharose珠混合，調(diào)節(jié)成2mg/ml，4℃反應(yīng)1小時(shí)使抗體結(jié)合于珠上。洗珠后，加500μl生物素化FTL 435細(xì)胞裂解物至10μl珠中，混合物4℃反應(yīng)2小時(shí)。用裂解液洗珠三次后，將50μl葡聚糖酶緩沖液(含0.15％SDS的磷酸鈉緩沖液(pH7.0))加至珠上，煮沸混合液以洗脫被抗體結(jié)合珠捕獲的結(jié)合分子。洗脫樣品級(jí)分中加入1.25％NP-40和20U/ml N-萄聚糖酶，混合液反應(yīng)過夜以降解N連接的糖鏈。
將SDS-PAGE的等體積樣品緩沖液(Enprotech)加入5μl的有或無巰基乙醇的洗脫樣品中，將該混合物煮沸。電泳后將電泳膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。膜用3％BSA-PBS封閉并與過氧化酶標(biāo)記的鏈霉菌抗生物素蛋白反應(yīng)以檢測(cè)由“JTT-1抗體”捕獲的生物素化的可溶性細(xì)胞表面分子，檢測(cè)用ECL系統(tǒng)(Amersham)，方法按手冊(cè)所述。
結(jié)果示于圖5。FTL 435細(xì)胞上被“JTT-1抗體”識(shí)別的分子(“JTT-1抗原”)顯示在非還原條件下分子量約47KD(圖5中“(-)”)，還原條件下為24KD和28KD(圖5中“(+)”)。作為N連接的糖鏈消化結(jié)果(圖5中“+N-gly”)，“JTT-1抗原”在非還原條件下集中在約36KD的一條帶上，還原條件下約20KD。這些結(jié)果暗示“JTT-1抗原”形成了二聚體，其中相同的核心蛋白有不同糖鏈。用“JTT-2抗體”按上述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)獲得完全相同的結(jié)果。將這些結(jié)果與實(shí)施例3及下文實(shí)施例7的結(jié)果綜合考慮，“JTT-1抗原”(“JTT-1抗體”所識(shí)別的分子)和“JTT-2抗原”(“JTT-2抗體所識(shí)別的分子)”被認(rèn)為完全一樣。
實(shí)施例6 大鼠胸腺細(xì)胞對(duì)純化的“JTT-1抗原”的粘附實(shí)驗(yàn)及N末端氨基酸分析進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)是為了分析“JTT-1抗體”識(shí)別的分子(“JTT-1抗原”)是否起粘附分子的功能。還進(jìn)行了N末端氨基酸分析。
(1)“JTT-1抗體”親和柱的制備用常規(guī)方法從實(shí)施例1的“JTT-1”雜交瘤上清純化“JTT-1抗體”，取純化樣品(2mg于2ml)與1ml蛋白G-Sepharose樹脂混合，4℃反應(yīng)1小時(shí)。用200mM三乙醇胺(pH8.2)洗樹脂三次。再將樹脂室溫下于含10mM庚二酰亞氨酸二甲基酯(dimethyl pimelimidate)(DMD)的三乙醇胺(pH8.2)中溫育1小時(shí)使“JTT-1抗體”與樹脂共價(jià)結(jié)合。
(2)“JTT-1抗原”的純化在含10％FCS的RPMI 1640中培養(yǎng)FTL 435細(xì)胞。離心得到沉淀團(tuán)以收獲細(xì)胞，沉淀團(tuán)用PBS洗三次。加入裂解液(1％NP-40，10mM Tris-HCl(pH7.4)，0.15M NaCl)調(diào)至5×107細(xì)胞/ml，4℃反應(yīng)30分鐘使細(xì)胞裂解。裂解產(chǎn)物離心，含可溶性細(xì)胞分子的上清貯存于-80℃。
將裂解物(400ml)裝載“JTT-1抗體”親和柱。柱經(jīng)50ml裂解液和20mlPBS洗滌后，用0.2M甘氨酸緩沖液(pH2.8)洗脫“JTT-1抗原”。向洗脫的抗原中加1M Tris中和。所得“JTT-1抗原”存于-80℃。
(3)N末端氨基酸序列的測(cè)定純化的“JTT-1抗原”進(jìn)行SDS-PAGE后，用常規(guī)方法測(cè)其N端氨基酸序列。結(jié)果顯示“JTT-1抗原”含有氨基酸序列Glu-Leu-Asn-Asp-Leu-Ala-Asn-His-Arg.
(4)粘附實(shí)驗(yàn)二乙醚麻醉殺死5周齡至10周齡Wistar大鼠(150-250g)，剖腹術(shù)取出胸腺勻漿刷成胸腺細(xì)胞懸液。向其中加入10μM 2′，7′-二(羧乙基)羧基熒光素四乙酰氧甲酯(BCECF-AM，分子探針)，37℃溫育30分鐘以熒光標(biāo)記胸腺細(xì)胞。細(xì)胞用PBS洗之后懸浮于含10％FCS的RPMI 1640中，調(diào)至2×107細(xì)胞/ml。
在(2)中所獲得的純化“JTT-1抗原”以濃度10μl/孔包被96孔板過夜。PBS洗板后，板上加200μl/孔3％BSA-PBS封閉2小時(shí)。PBS洗板，(1)只有熒光標(biāo)記的胸腺細(xì)胞(2×107細(xì)胞/ml，0.1ml)，(2)熒光標(biāo)記的胸腺細(xì)胞(濃度同上)及常規(guī)方法制得的“JTT-1抗體”Fab段(5μg/ml)，或(3)熒光標(biāo)記的胸腺細(xì)胞(濃度同上)，“JTT-1抗體”Fab段(濃度同上)，“JTT-2抗體”(10μg/ml)，被加入每孔，37℃培養(yǎng)1小時(shí)。為去除未結(jié)合細(xì)胞，每孔用含10％FCS的RPMI 1640洗一次。每孔均在光學(xué)顯微鏡下觀察。然后，每孔加100μl 0.1％NP-40，吸附于板上的細(xì)胞被裂解。用Fluoroscan II Microplate熒光計(jì)(Flow Laboratories)在538nm(485nm被激發(fā))測(cè)熒光強(qiáng)度計(jì)數(shù)每孔所吸附熒光標(biāo)記胸腺細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞數(shù)。未包被純化“JTT-1抗原”的板為對(duì)照。
光鏡觀察結(jié)果示于圖6。
只有有“JTT-1抗體”Fab片段時(shí)，胸腺細(xì)胞才顯著吸附于純化“JTT-1抗原”(圖6(c))。該吸附顯著受“JTT-2抗體”的抑制(圖6(d))。
圖7顯示熒光強(qiáng)度表示的吸附于包被于每一孔的“JTT-1抗原”胸腺細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞數(shù)。
這些結(jié)果揭示“JTT-1抗原”有粘附分子功能。
實(shí)施例7 編碼大鼠“JTT-1抗原”的cDNA的克隆1.制備cDNA文庫(kù)1-(1)從ConA刺激的大鼠淋母細(xì)胞抽提poly(A)+RNA大鼠脾臟源的ConA刺激的淋巴母細(xì)胞(ConA母細(xì)胞)(約1×106/ml)4℃離心(2000xg)5分鐘。沉淀的細(xì)胞重新懸浮于ISOGEN(Nippon Gene)，用氯仿振蕩抽提以收集上清。加異丙醇以獲上清，混合液室溫靜置10分鐘，12,000xg離心4℃10分鐘以沉淀RNA。用乙醇洗過的RNA溶于TE緩沖液。用“mRNA純化試劑盒”(Pharmacia)從所獲總RNA中純化poly(A)+RNA。
1-(2)cDNA的制備以如上制備的poly(A)+RNA 5μg為模板，用“省時(shí)cDNA合成盒”(Pharmacia)合成cDNA。用帶NotI位點(diǎn)的“Oligo dT引物”(Pharmacia)以增加篩選效率。加入EcoRI連接子，用NotI酶解以獲得單向性的cDNA。隨后用Spun柱(Pharmacia)進(jìn)行大小分級(jí)分離。
1-(3)插入載體所獲有EcoRI末端和Not I末端的cDNA與經(jīng)EcoRI和NotI消化的pME18S連接(Hara，T.和Miyajima，A.EMBO雜志，11卷，1875-1884頁(yè)(1992))。用“DNA連接試劑盒”(Takara Shuzo)連接。用該反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5細(xì)胞(Toyobo)。轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)至O.D。值(在600nm)達(dá)0.6，收獲以回收質(zhì)粒DNA，用QUIAGEN-Tip(QUIAGEN)純化質(zhì)粒DNA。
2.篩選cDNA文庫(kù)用淘選法篩選(Seed B.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，84卷，3365-3369頁(yè)(1987))。
2-(1)基因轉(zhuǎn)移進(jìn)COS細(xì)胞所得文庫(kù)經(jīng)電穿孔導(dǎo)入COST細(xì)胞(Potter H.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，85卷，2288-2292頁(yè))。導(dǎo)入后轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)60小時(shí)，去除上清，沉淀用PBS洗三次。用PBS(含0.5mM EDTA)37℃處理沉淀30分鐘后，用移液管移去細(xì)胞。只有活細(xì)胞再用“Lymphprep”(NYCOMED)收集。
2-(2)經(jīng)淘選濃縮可表達(dá)基因的細(xì)胞所得活細(xì)胞懸于PBS(含5％FCS和0.5mM EDTA)。將該細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至包被有“JTT-1抗體”的培養(yǎng)皿，室溫溫育3小時(shí)。去除未結(jié)合細(xì)胞后，用PBS洗培養(yǎng)皿三次，用Hirt的方法從結(jié)合于皿上的細(xì)胞中收集質(zhì)粒DNA(Hirt，B.分子生物學(xué)雜志，26卷，365-369頁(yè))。用所獲質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(GIBCO BRL)。按上述1-(3)用轉(zhuǎn)化體擴(kuò)增并純化質(zhì)粒。重復(fù)(1)和(2)的程序兩次。
2-(3)分離陽(yáng)性克隆三次淘汰后，將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH10B細(xì)胞培養(yǎng)于含青霉素的LB平板上過夜以獲得菌落。培養(yǎng)出20個(gè)耐藥菌落，用堿性miniprep法收集質(zhì)粒DNA(Maniatirs，下等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)，分析插入的DNA。瓊脂糖凝膠電泳揭示濃縮到有約0.9kb cDNA的克隆(命名為“T132A7”)。
再次用(1)中的方法在COS 7細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)“T132A7”?！癟132A7”誘導(dǎo)的細(xì)胞先與“JTT-1抗體”或“JTT-2抗體”反應(yīng)，再與FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG(Cappel)反應(yīng)，染色細(xì)胞的熒光強(qiáng)度用EPICS-Elite流式細(xì)胞儀(Coulter)測(cè)量。“JTT-1抗體”和“JTT-2抗體”強(qiáng)識(shí)別“T132A7”的基因產(chǎn)物。結(jié)果示于圖8。
3.測(cè)定核苷酸序列和氨基酸序列克隆“T132A7”的核苷酸序列用“自讀測(cè)序試劑盒”(Pharmacia)和“A.L.F.DNA測(cè)序儀”(Pharmacia)經(jīng)雙脫氧法測(cè)得。此外，該核苷酸序列編碼的“大鼠JTT-1抗原”的推測(cè)氨基酸序列用基因分析軟件“GENEWORKS”(IntelliGenetics)分析。核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列示于圖SEQ ID NO4。
從克隆的基因推出的氨基酸序列(由200個(gè)氨基酸殘基組成)包含實(shí)施例6-(3)所測(cè)N末端氨基酸序列?？紤]到克隆“T132A7”導(dǎo)入的細(xì)胞與“JTT-1抗體”強(qiáng)烈反應(yīng)，可得出結(jié)論克隆“T132A7”包含編碼“大鼠JTT-1抗原”的cDNA。
4.計(jì)算機(jī)分析對(duì)“JTT-1抗原”的推測(cè)氨基酸序列的初級(jí)結(jié)構(gòu)的親水性分析按Kite和Doolittle的方法(Kite，J.和Doolittle，R.F.，分子生物學(xué)雜志，157卷，105-132頁(yè)(1982))(圖9)。結(jié)果揭示“JTT-1抗原”為跨膜蛋白，在N端有信號(hào)序列。此外，基序分析結(jié)果揭示“JTT-1抗原”在胞外區(qū)有兩個(gè)Asn連接的糖鏈結(jié)合位點(diǎn)，在胞漿區(qū)有兩個(gè)酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)和一個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。圖9中“CHO”指N連接的糖鏈結(jié)合位點(diǎn)；“P”，磷酸化位點(diǎn)；“CKII”，酪蛋白激酶II；“PKC”，蛋白激酶C。
實(shí)施例8 克隆編碼“人JTT-1抗原”的cDNA1.制備探針編碼“大鼠JTT-1抗原”的cDNA(約0.9kb)的產(chǎn)生是通過用限制性酶EcoRI和NotI消化實(shí)施例7所得的“T132A7”，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離。用“QUIAEX凝膠抽提試劑盒”(QUIAGEN)純化所分離的DNA片段，所得DNA片段用“Ready-To-Go DNA標(biāo)記盒”(Pharmacia)標(biāo)記32P。這些標(biāo)記的DNA作為探針用于蝕斑雜交。
2.制備cDNA文庫(kù)2-(1)抽提poly(A)+RNA從ConA刺激的人外周血源的淋巴母細(xì)胞(ConA母細(xì)胞)抽提poly(A)+RNA，方法同實(shí)施例7-1-(1)。
2-(2)制備cDNA如此制得的poly(A)+RNA取5μl作模板，用“Oligo dT引物”(Pharmacia)和“省時(shí)cDNA合成試劑盒”(Pharmacia)合成cDNA。再加入EcoRI連接子，在Spun柱(Pharmacia)上進(jìn)行大小分級(jí)分離。
2-(3)插入載體并包裝所獲帶有EcoRI末端的cDNA與經(jīng)EcoRI酶切的載體“λZAPII”(Stratagene)連接。用“DNA連接試劑盒”(Takara Shuzo)連接。體外用“GIGA PACK II GOLD”(Stratagene)進(jìn)行連接的DNA的包裝后，用所得噬菌體顆粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1Blue MRF′細(xì)胞(Stratagene)以產(chǎn)生由含重組噬菌體的蝕斑組成的cDNA文庫(kù)。
3.篩選cDNA文庫(kù)用“快速雜交緩沖液”(Amersham)，經(jīng)蝕斑雜交法(Maniatis，T.等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)篩選cDNA文庫(kù)。首先，所得cDNA文庫(kù)(1×104)置于瓊脂平板上，用“Hybond-N尼龍膜”(Amersham)產(chǎn)生復(fù)制子。蝕斑雜交在“快速雜交緩沖液”(Amersham)中用復(fù)制子和32P標(biāo)記的探針(實(shí)施例8-1所制)完成。首次和第二次篩選獲得8個(gè)陽(yáng)性克隆。分離每個(gè)克隆的單蝕斑，用相應(yīng)手冊(cè)方法(stratagene)體內(nèi)切割，收得7個(gè)陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA。
4.測(cè)定核苷酸序列7個(gè)克隆的核苷酸序列用“自讀測(cè)序試劑盒”(Pharmacia)和“A.L.F.DNA測(cè)序儀(Pharmacia)經(jīng)雙脫氧法測(cè)得。7個(gè)克隆含有相同核苷酸序列。發(fā)現(xiàn)克隆“pBSH 41”編碼全長(zhǎng)“人JTT-1抗原”。對(duì)應(yīng)于“人JTT-1抗原”的開放讀碼框(DRF)的DNA序列示于SEQ ID NO1，推測(cè)的全長(zhǎng)“人JTT-1抗原”氨基酸序列示于SEQ ID NO2，含5′和3′序列的核苷酸序列示于SEQ ID NO3(ORF相應(yīng)于核苷酸26-625)。理解到克隆中包含的核苷酸序列編碼全長(zhǎng)“人JTT-1抗原”，因?yàn)楦鶕?jù)該核苷酸序列推測(cè)的氨基酸序列(由199個(gè)氨基酸殘基組成)顯示顯著同源于“大鼠JTT-1抗原”的氨基酸序列(圖10)。如圖10示，二者同源性為60％或更多。
轉(zhuǎn)化有克隆“pBSh 41”的大腸桿菌DH10B(GIBCO BRL)已保藏于布達(dá)佩斯條約下的國(guó)際保藏權(quán)威機(jī)構(gòu)，國(guó)家生命科學(xué)和人類技術(shù)研究所，工業(yè)科技機(jī)構(gòu)，國(guó)際貿(mào)工部，日本(1-1-3，Higashi，Tsukuba-Shi，Ibaraki，日本)，自1996年10月25日起(國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-5725)。
5.“JTT-1抗原”的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能在已知人類蛋白中檢索推測(cè)的“人JTT-1抗原”氨基酸序列的基序的結(jié)果揭示“人JTT-1抗原”結(jié)構(gòu)上類似于“CD28”和“CTLA-4”，屬于免疫球蛋白超家族的人源細(xì)胞膜蛋白，詳見上文所述(圖11和12)。如上述，“CD28”和“CTLA-4”均為十分重要的調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中T細(xì)胞活化和抑制的分子。
結(jié)構(gòu)相似性如下；1.20或更多個(gè)包括半胱氨酸殘基在內(nèi)的氨基酸序列高度保守。
2.在CD28和CTLA-4中是作為配基連接區(qū)必需的脯氨酸重復(fù)序列(Pro-Pro-Pro，PPP)保守。
3.作為CD28和CTLA-4中信號(hào)傳遞區(qū)必需的“Tyr-Xaa-Xaa-Met”(YxxM)(Xaa和x表示任意氨基酸)序列在胞質(zhì)區(qū)是保守的。
根據(jù)這樣的事實(shí)，即結(jié)構(gòu)相同于在T細(xì)胞活化(免疫機(jī)制中的主要因素)調(diào)節(jié)中起重要作用的“CD28”和“CTLA-4”的特異性結(jié)構(gòu)，推斷本發(fā)明的“JTT-1抗原”為像那些分子一樣在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞如T細(xì)胞(免疫應(yīng)答的主要因素)活化的調(diào)節(jié)中起重要作用。
實(shí)施例9 克隆編碼“小鼠JTT-1抗原”的cDNA1.制備探針通過用限制性酶EcoRI和NotI消化實(shí)施例7的克隆“T132A7”，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，獲得編碼“大鼠JTT-1抗原”的cDNA(約0.9kb)。用“QUIAEX凝膠抽提試劑盒”(QUIAGEN)純化所分離得的DNA片段，并用“Recdy-To-Go DNA標(biāo)記試劑盒”(Pharmacia)給DNA片段標(biāo)記32P。這些標(biāo)記DNA作為探針用于蝕斑雜交。
2.制備DNA文庫(kù)2-(1)抽提poly(A)+RNA如實(shí)施例7-1-(1)，從ConA刺激的小鼠脾臟源的淋巴母細(xì)胞(約1×106細(xì)胞/ml)抽提pdy(A)+RNA。
2-(2)制備cDNA文庫(kù)取上述poly(A)+RNA5mg作模板，用obgodT引物(Pharmacia)和“省時(shí)cDNA合成試劑盒”(Pharmacia)合成cDNA。加入EcoRI接頭到該cDNA后，用Spun柱(Pharmacia)進(jìn)行分級(jí)分離。
2-(3)插入cDNA到載體并包裝。
所得的帶EcoRI末端的cDNA連接至EcoRI消化的載體1ZAPII(Stratagene)，用“DNA連接試劑盒”(Takara Shuzo)連接。用GIGAPACK II GOLD(Stratagene)體外包裝連接的DNA后，以所得的噬菌體顆粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1Blue MRF′細(xì)胞(Stratafene)產(chǎn)生由含重組噬菌體的蝕斑組成的cDNA文庫(kù)。
3.篩選cDNA文庫(kù)篩選通過用快速雜交緩沖液(Amersham)蝕斑雜交法(Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)進(jìn)行。
將所得cDNA文庫(kù)(1×104)置于瓊脂平板上，用Hybond-N尼龍膜(Amersham)復(fù)制。蝕斑雜交在“快速雜交緩沖液”(Amerham)中用復(fù)制膜和實(shí)施例9-1的32P標(biāo)記探針完成。進(jìn)行首次和第二次篩選得到5個(gè)陽(yáng)性克隆。分離每一克隆的單蝕斑后，根據(jù)指導(dǎo)手則(Stratagene)進(jìn)行體內(nèi)切割并收集到5個(gè)陽(yáng)性克隆體的質(zhì)粒DNA。
4.測(cè)定核苷酸序列5個(gè)克隆的每一的核苷酸序列用“自讀測(cè)序盒”(Pharmacia)和“A.L.F.DNA測(cè)序儀”(Pharmacia)以雙脫氧法測(cè)得。其中4個(gè)克隆含相同核苷酸序列，編碼全長(zhǎng)“小鼠JTT-1抗原”的cDNA序列和推測(cè)的氨基酸序列示于SEQ ID NO5。
從圖10知，“小鼠JTT-1抗原”由200個(gè)類似“大鼠JTT-1抗原”的氨基酸殘基組成。小鼠，大鼠和人“JTT-1抗原”的氨基酸序列同源性顯著(60％或更多)。
5.分析“小鼠JTT-1抗原”基因的基因座“小鼠JTT-1抗原”的編碼基因的基因座用熒光原位雜交法分析所得編碼“小鼠JTT-1抗原”的cDNA用常規(guī)方法標(biāo)記32P以制備雜交探針。用這些探針篩選129個(gè)SVJ小鼠基因組文庫(kù)(Stratagene)以獲得編碼含“小鼠JTT-1抗原”的外顯子的小鼠基因組DNA克隆。該基因組DNA的結(jié)構(gòu)圖示于圖13。
上述所得基因組DNA克隆經(jīng)缺口翻譯標(biāo)記上洋地黃毒苷duTp以制備探針。該標(biāo)記的探針結(jié)合于切割的小鼠DNA，與小鼠胚成纖維細(xì)胞源的正常細(xì)胞分裂中期染色體雜交，雜交在含50％甲醛，10％硫酸葡聚糖和2×SSC的溶液中進(jìn)行。雜交玻片在熒光標(biāo)記的抗洋地黃毒苷抗體中溫育后，用DAPI染色測(cè)得特異性的雜交信號(hào)。在第一次檢驗(yàn)中，根據(jù)DNA大小和出現(xiàn)的帶判斷，靠近被認(rèn)為是染色體1的最大的染色體的部分被特異性標(biāo)記。根據(jù)該信息，上述基因組DNA克隆共雜交于特別針對(duì)染色體1的著絲粒區(qū)域的探針。結(jié)果，該染色體的著絲粒區(qū)及附近區(qū)被特異性標(biāo)記。分析10份顯示特異性雜交的染色體1樣本，揭示上述基因組DNA克隆的位置在異染色質(zhì)和常染色質(zhì)之間的邊界至染色體1的端粒的這段距離中的33％處，即在小鼠“CD28”和“CTLA-4”基因的基因座的同一帶“IC3”上。分析了80個(gè)中期細(xì)胞，結(jié)果鑒別于79個(gè)細(xì)胞的該位置上有特異性標(biāo)記。
這些結(jié)果以及實(shí)施例8所得的說明“JTT-1抗原”與“CD28”和“CTLA-4”結(jié)構(gòu)相似的結(jié)果提示“JTT-1抗原”象“CD28”和“CTLA-4”一樣，是涉及調(diào)節(jié)協(xié)同刺激信號(hào)的傳遞和/或淋巴細(xì)胞的活化的重要分子。
實(shí)施例10 克隆編碼“大鼠JTT-1抗原”突變體的cDNA被認(rèn)為是編碼實(shí)施例7中“大鼠JTT-1抗原”的另一種剪接變異體的cDNA如下克隆。
1.制備探針用限制性酶EcoRI和NotI消化實(shí)施例7所得的克隆“T132A7”，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離得編碼“大鼠JTT-1抗原”的cDNA(約0.9kb)。用“QUIAEX凝膠抽提試劑盒”(QUIAGEN)純化該分離的cDNA，所得DNA片段用“Ready-To-Go DNA標(biāo)記盒”(Pharmacia)標(biāo)記32P。這些標(biāo)記DNA片段作為探針用于蝕斑雜交。
2.制備cDNA文庫(kù)2-(1)抽提poly(A)+RNA如實(shí)施例7-1-(1)，從大鼠胸腺瘤細(xì)胞系FTL 435(約1×106細(xì)胞/ml)抽提poly(A)+RNA。
2-(2)制備cDNA文庫(kù)取上述制備的5mg poly(A)+RNA作模板，用Oligo dT引物(Pharmacia)和“省時(shí)cDNA合成盒”(Pharmacia)合成cDNA。加上EcoRI接頭該到cDNA后，經(jīng)Spun柱(Pharmacia)進(jìn)行大小的分級(jí)分離。
2-(3)cDNA插入到載體并包裝上述所得帶EcoRI末端的cDNA連接于EcoRI消化的載體1ZAPII(Stratagene)，用“DNA連接盒”(Takara Shuzo)連接。用GIGA PACKIIGOLD(Stratagene)體外包裝連接的DNA后，以所得的噬菌體顆粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1Blue MRF′細(xì)胞(Stratagene)，產(chǎn)生由含重組噬菌體的蝕斑組成的cDNA文庫(kù)。
3.篩選cDNA文庫(kù)篩選通過用快速雜交緩沖液(Amersham)的蝕斑雜交法進(jìn)行(Maniatis等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)。
將所得cDNA文庫(kù)(1×104)置于瓊脂平板上，用Hybond-N尼龍膜(Amersham)復(fù)制。蝕斑雜交在快速雜交緩沖液(Amersham)中用復(fù)制膜和實(shí)施例10-1的32P標(biāo)記探針完成。第一次和第二次篩選得2個(gè)陽(yáng)性克隆，分離每一克隆的單蝕斑后，根據(jù)指導(dǎo)手冊(cè)(Stratagene)體內(nèi)切割，并收集到兩個(gè)陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒載體。
4.測(cè)定核苷酸序列兩個(gè)克隆的核苷酸序列用“自讀測(cè)序試劑盒”(Pharmacia)和“A.L.FDNA測(cè)序儀”(Pharmacia)以雙脫氧法測(cè)得。兩個(gè)克隆含相同核苷酸序列，該編碼全長(zhǎng)的所得的“大鼠JTT-1抗原”的cDNA的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列示于SEQ ID NO6。將該推測(cè)于所得的cDNA序列的氨基酸序列(SEQID NO6)與實(shí)施例7中克隆的編碼“大鼠JTT-1抗原”的cDNA序列的推測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO4)比較(圖14)。如圖14示，此試驗(yàn)克隆的cDNA編碼的氨基酸序列與實(shí)施例7所得的編碼“大鼠JTT-1抗原”的cDNA編碼的完全相同，除了(1)(末端三個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基(Met-Thr-Ser)變成Thr-Ala-Pro，(2)緊隨Thr-Ala-Pro之后，加入了16個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基(Leu-Arg-Ala-Leu-Gly-Arg-Gly-Glu-His-Ser-Ser-Cys-Gln-Asp-Arg-Asn)。這說明此試驗(yàn)克隆的cDNA克隆編碼實(shí)施例7中所得的“大鼠JTT-1抗原”的另一種剪接變異體。
實(shí)施例11 制備重組“人JTT-1抗原”表達(dá)細(xì)胞實(shí)施例8所得的質(zhì)?？寺Bsh 41用限制性酶EcoRI消化并切得含編碼全長(zhǎng)“人JTT-1抗原”的cDNA的DNA片段。將該DNA片段用DNA連接試劑盒(Takarashuzo)插入用同一限制酶EcoRI處理的質(zhì)粒pEFneo(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊91卷，158-162頁(yè)(1994))以制備表達(dá)載體。用該載體經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化CHO-K1細(xì)胞(ATCCCCL-61)。在含0.8mg/ml遺傳霉素(GIBCO BRL)和10％胎牛血清的RPIM 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞約2周，選得抗遺傳霉素轉(zhuǎn)化體。用常規(guī)方法經(jīng)Northern印跡確證重組“人JTT-1抗原”的表達(dá)。
實(shí)施例12 制備抗“人JTT-1抗原”的單抗將實(shí)施例11制備的重組“人JTT-1抗原”的表達(dá)載體勻漿并超速離心(100,000xg)。收集含細(xì)胞膜級(jí)分的沉淀并懸浮于PBS。將該懸浮液配合完全福氏佐劑注射入BALB/C小鼠的腳掌進(jìn)行第一次免疫(0天)。在間隔至7，14和28天時(shí)再次給腳掌注射該細(xì)胞膜級(jí)分抗原。末次免疫2天后，取出淋巴節(jié)細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞PAI(JCR號(hào)B0113；研究揭示，217卷，155頁(yè)(1982))以5∶1的比率混合，用聚乙二醇4000(GIBCO)作融合劑融合以制備產(chǎn)單抗雜交瘤。雜交瘤的篩選過程是將之培養(yǎng)于補(bǔ)加了10％胎牛血清和氨基蝶呤的含HAT的ASF 104培養(yǎng)基(Ajinomoto)。用實(shí)施例11的重組“人JTT-1抗原”表達(dá)轉(zhuǎn)化體與每份雜交瘤上清反應(yīng)，用FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG(Cappel)染色細(xì)胞，熒光強(qiáng)度用EPICS-ELITE流式細(xì)胞儀測(cè)量，以確證每份培養(yǎng)上清產(chǎn)生的單抗對(duì)“人JTT-1抗原”的反應(yīng)性。證實(shí)得到了10種或更多種產(chǎn)可與“人JTT-1抗原”反應(yīng)的單抗的雜交瘤。
這些雜交瘤中的兩種(命名為克隆SA12和SG 430)中的每個(gè)均腹膜內(nèi)注射入ICR nu/nu小鼠(雌性，7-8周齡)(106-107細(xì)胞/0.5ml/小鼠)。10-20天后，對(duì)小鼠麻醉后行剖腹術(shù)，用常規(guī)方法從腹水大量制備與“人JTT-1抗原”反應(yīng)的兩種單抗(SA 12和SG 430)。
實(shí)施例13 抗“人JTT-1抗原”的單抗對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞的效應(yīng)如實(shí)施例8所述，認(rèn)為“JTT-1抗原”可涉及免疫反應(yīng)中類似“CD28”和“CTLA-4”對(duì)淋巴細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)作用。為證實(shí)之，以細(xì)胞的生長(zhǎng)為證據(jù)分析抗“人JTT-1抗原”的單抗對(duì)人淋巴細(xì)胞的效應(yīng)。
96孔板每孔加入(1)實(shí)施例12制備的SA 12或SG 430抗“人JTT-1抗原”單抗，或(2)單抗SA 12或SG 430(1μg/ml)與抗CD 3單抗OKT-3(1μg/ml.Orthodiagnostic Systems)混合，其中用OKT-3是為了加入淋巴細(xì)胞活化中的初級(jí)信號(hào)。板于37℃培養(yǎng)1小時(shí)使每孔均被抗體包被。用RPMI 1640洗板后，每孔加正常人外周血淋巴細(xì)胞(1×105細(xì)胞/孔)。在含10％FCS的RPMI1640中溫育3天。若有必要，加1ng/ml大戟二萜醇肉豆蔻乙酸酯(PMA)。然后，每孔加[3H]胸嘧啶(3.7μkBg/孔)，板于37℃培養(yǎng)6小時(shí)。收集細(xì)胞，摻入DNA的[3H]胸嘧啶量用液相閃爍儀(Beckman)測(cè)量。結(jié)果示于圖15。
在包被有SA 12或SG 430的板的實(shí)驗(yàn)中，淋巴細(xì)胞增加數(shù)約10倍于對(duì)照板。在同時(shí)有OKT 3時(shí)，不管用SA 12還是SG 430，增加的淋巴細(xì)胞數(shù)約100倍。
這些結(jié)果說明“JTT-1抗原”作用于淋巴細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)。同時(shí)用OKT3增加了細(xì)胞生長(zhǎng)速率的這一事實(shí)說明“JTT-1抗原”象“CD28”和“CTLA-4”一樣，涉及協(xié)同刺激信號(hào)的傳遞。
實(shí)施例14 “JTT-2抗體”對(duì)實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎(EAE)的效應(yīng)如上文詳述，最近許多嘗試通過調(diào)節(jié)CD28/CTLA-4和CD80/CD86之間的傳遞來治療各種自身免疫病(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，自身免疫性狀腺狀，過敏性接觸性皮炎，慢性炎癥性皮膚病如扁平癬，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，胰島素依賴型糖尿病，牛皮癬等)。該效應(yīng)已在各種自身免疫病的動(dòng)物模型中得到證實(shí)((1)人系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)模型，(2)實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎(EAE)，多發(fā)性硬化癥(MS)模型，(3)胰島素依賴型糖尿病(IDDM)模型，(4)Goodpasture′s腎炎模型，(5)人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)。
為證實(shí)本發(fā)明的“JTT-1抗原”是否是涉及活化或抑制淋巴細(xì)胞的分子，如“CD28”和“CTLA-4”，制成實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎(EAE)模型大鼠，多發(fā)性硬化癥(MS)模型，并分析標(biāo)題的單元對(duì)模型中“JTT-1抗體”的效應(yīng)。
混合Hartley豚鼠腦脊髓勻漿(800mg/ml生理鹽水)與等量完全弗氏佐劑制成免疫原乳劑。對(duì)15只Lewis大鼠(雌，6周齡)左右腳掌皮內(nèi)注射該乳劑進(jìn)行免疫，每只腳掌0.25ml。調(diào)整給藥(免疫)使所制備的勻漿劑量為每只大鼠200mg。如此免疫可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎(EAE)。
如此免疫的大鼠分為三組，每組5只，以下(1)至(3)中任一個(gè)在免疫后0，3，6，9，12天立即靜脈注射給每組小鼠。
(1)實(shí)施例2制備的抗“大鼠JTT-1抗原”的單抗“JTT-2抗體”(劑量2mg/ml PBS，5mg/kg)(2)氫化潑尼松，類固醇劑(劑量4mg/ml PBS，10mg/kg)(3)不與“大鼠JTT-1抗原”反應(yīng)的對(duì)照抗體(劑量2mg/ml PBS，5mg/kg)。
免疫后隨時(shí)間推移觀察癥狀。發(fā)現(xiàn)EAE發(fā)病后，病癥程度根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)打分進(jìn)行評(píng)估。
(1分)尾緊張消失。
(2分)后腿拖長(zhǎng)，輕型麻痹(3分)后腿拖長(zhǎng)，嚴(yán)重麻痹(4分)全身麻痹或死亡。
結(jié)果示于圖16。對(duì)照抗體給藥組中，EAE的癥狀在免疫后11至15天達(dá)到高峰(最高分)，然后逐漸恢復(fù)。相反，“JTT-2抗體”給藥組在免疫后11天EAE的癥狀被顯著抑制。此抑制效應(yīng)明顯高于氫化潑尼松給藥組的。
這些結(jié)果說明“JTT-1抗原”是在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，如淋巴細(xì)胞受外來抗原免疫引導(dǎo)而活化，中起作用的分子，“JTT-1抗原”或其配體功能的調(diào)節(jié)可抑制各種自身免疫病的癥狀。
實(shí)施例15 “JTT-2抗體”對(duì)腎小球腎炎的效應(yīng)為了與實(shí)施例14相同的目的，制成腎小球基底膜(GBM)腎炎模型大鼠，分析標(biāo)題單抗對(duì)模型中“JTT-1抗原”的效應(yīng)。
經(jīng)膠原酶消化的牛的腎小球基底膜(Shigei醫(yī)研所)用生理鹽水稀釋至200μg/ml，再與完全弗氏佐劑混合制成乳劑免疫原，48只Wister Kyoto大鼠(約200g)麻醉后雙腳后足底皮內(nèi)注射該乳劑進(jìn)行免疫，劑量為每腳掌約0.2mg(約15μg)。這樣免疫誘導(dǎo)了腎小球基底膜(GBM)腎炎。
免疫大鼠分為8組，每組6只，以下(1)至(3)中任一個(gè)在免疫(0天)后立即及隨后5周中每周三次給每只大鼠注射。
(1)實(shí)施例2制備的“抗大鼠JTT-1抗原”的單抗“JTT-2抗體”(劑量3mg/kg(2ml PBS/kg)，靜脈注射)(2)氫化潑尼松，類固醇劑，作陽(yáng)性對(duì)照(懸浮于0.5％羧甲基纖維素(CMC))(劑量3mg/kg(5ml/kg)，口服)。
(3)0.5％CMC作陰性對(duì)照(劑量，5ml/kg，口服)。
給試驗(yàn)物質(zhì)后，每只大鼠強(qiáng)迫性口服無菌水(25ml/kg)，并收集尿樣5小時(shí)(大鼠關(guān)在代謝籠里不吃不喝)。測(cè)收集尿樣的體積后，并用ToneinTP-II(Otuka)測(cè)尿蛋白濃度，計(jì)算每5小時(shí)蛋白的尿排泄量(單位mg蛋白/5小時(shí))。上述尿收集和尿蛋白測(cè)定在免疫(0天)后的1，2，3，4周以相同方式重復(fù)進(jìn)行。
結(jié)果示于圖17。與對(duì)照組相比，免疫后第3周“JTT-2抗體”給藥組的蛋白尿排泄量明顯減少。
這些結(jié)果顯示，“JTT-1抗原”是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(如淋巴細(xì)胞受外來抗原免疫誘導(dǎo)而活化)的分子，調(diào)節(jié)“JTT-1抗原”或其配體的功能可抑制各種自身免疫病的癥狀。
實(shí)施例16 制備“JTT-1抗原”和IgFc的融合蛋白如實(shí)施例8，13-15所述，本發(fā)明的“JTT-1抗原”被認(rèn)為是涉及有關(guān)淋巴細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)的協(xié)同刺激信號(hào)的傳遞的分子如“CD28”和“CTLA-4”。此外，如實(shí)施例14所述，“CTLA-4”胞外區(qū)和人免疫球蛋白IgGI的Fc區(qū)融合蛋白對(duì)各種自身免疫病有療效。本實(shí)施例中，如下制備“JTT-1抗原”胞外區(qū)和人IgGFc的融合蛋白，以檢測(cè)可溶性JTT-1抗原象CTLA-4-IgFc，是否可用于治療各種自身免疫病。
(1)制備“大鼠JTT-1抗原”和人IgGI-Fc的融合蛋白(rJTT-1-IgFc)。為了用PCR擴(kuò)增編碼“大鼠JTT-1抗原”胞外區(qū)的cDNA，設(shè)計(jì)并合成了在其末端有XhoI限制性位點(diǎn)的5′引物(5′-CTGCTCGAGATGAAGCCCTACTTCTCG-3′，SEQ ID NO7)，和其末端有BamHI限制性位點(diǎn)的3′引物(5′-ACCCTACGGGTAACGGATCCTTCAGCTGGCAA-3′，SEQ ID NO8)。用實(shí)施例7所得的編碼全長(zhǎng)“大鼠JTT-1抗原”的cDNA克隆“T132A7”作模板，用上述引物進(jìn)行PCR制得包含在其兩個(gè)末端帶有XhoI和BamHI限制性位點(diǎn)的編碼“大鼠JTT-1抗原”胞外區(qū)的cDNA的cDNA。PCR產(chǎn)物用XhoI和BamHI消化，并用瓊脂糖凝膠電泳分離得到一條約450bp的帶，預(yù)測(cè)是編碼所需胞外區(qū)的cDNA片段。將該分離的cDNA片段亞克隆進(jìn)入用XhoI和BamHI切割的pBluescript IISK(+)(Stratagene)。自動(dòng)熒光DNA測(cè)序儀(AppliedBiosystems)分析序列揭示該cDNA片段包括編碼相應(yīng)于“大鼠JTT-1抗原”的1-141氨基酸殘基(SEQ ID NO4)的氨基酸序列的區(qū)域。
另一方面，編碼人IgGI Fc的DNA作為融合伙伴經(jīng)BamHI和XbaI消化B.Seed等(Massachusetts General Ctospital)制備的質(zhì)粒(見細(xì)胞，61卷，1303-1313頁(yè)(1990))而切得為約1.3kb的BamHI-XbaI片段。該片段包含編碼人IgG1絞鏈區(qū)，Cγ12和Cγ13的外顯子。
將上述制備的編碼“大鼠JTT-1抗原”胞外區(qū)的XhoI-BamHI片段和含編碼人IgGI的Fc(“IgFc”)的外顯子的BamH I-Xba I片段亞克隆進(jìn)入用Xho I和Xba I切割的pBluescript II SK(+)(Stratagene)。
然后用XhoI和XbaI消化該質(zhì)粒，切得一段約1.8kb含該融合DNA(包括“大鼠JTT-1抗原”的胞外區(qū)和人IgFc)的DNA片段。用T4 DNA連接酶將該融合DNA片段插入表達(dá)載體pME 18S的XhoI和XbaI位點(diǎn)(a醫(yī)學(xué)免疫學(xué)，20卷，1期，27-32頁(yè)(1990)；實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)增刊，“遺傳工程手冊(cè)”，Yodosha，101-107頁(yè)(1992))，構(gòu)建質(zhì)粒prJTT-1-IgFc。
在含10％FCS和氨芐青霉素的DMEM培養(yǎng)基中亞鋪滿培養(yǎng)為單層的HEK293細(xì)胞(ATCC CRL 1573)用prJTT-1-IgFc經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化體。
該轉(zhuǎn)化體在無血清ASF 104培養(yǎng)基上培養(yǎng)72小時(shí)以表達(dá)rJTT-1-IgFc。
用蛋白G Sepharose親和層析柱(Pharmacia)，如下純化rJTT-1-IgFc。
將離心上述培養(yǎng)基獲得的上清裝載到蛋白G Sepharose親和柱(事先用結(jié)合緩沖液平衡好)。柱經(jīng)結(jié)合緩沖液洗滌后，用洗脫緩沖液開始洗脫。收集洗脫液，在磷酸緩沖液中透析，更換透析外液兩次或更多次，獲得純r(jià)JTT-1-IgFc。
親和層析結(jié)果示于圖18，所得的純r(jià)JTT-1-IgFc的SDS-PAGE結(jié)果示于圖19。
(2)制備“人JTT-1抗原”和人IgGI-Fc的融合蛋白(hJTT-1-IgFc)如(1)制備hJTT-1-IgFc，除了用于PCR的模板cDNA和引物不同。本試驗(yàn)中，模板用實(shí)施例8制得的含編碼全長(zhǎng)“人JTT-1抗原”的cDNA的克隆“pBSh 41”，引物為5′-TAACTGTTTCTCGAGAACATGAAGTCAGGC-3′(SEQ ID NO9)和5′-ATCCTATGGGTAACGGATCCTTCAGCTGGC-3′(SEQ ID NO10)。
親和層析結(jié)果示于圖20，所得的純hJTT-1-IgFc的SDS-PAGE結(jié)果示于圖21。
實(shí)施例17 制備整合了編碼“大鼠JTT-1抗原”的cDNA的轉(zhuǎn)基因小鼠將實(shí)施例7所得的編碼“大鼠JTT-1抗原”全長(zhǎng)的cDNA用DNA Blunting試劑盒(Takara)插入帶雞β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)載體pCAGGS(基因，108卷193-200頁(yè)(1991))獲得質(zhì)粒prJTTT-1。為制備轉(zhuǎn)基因小鼠，prJTTT-1經(jīng)限制酶處理成而線性化。
將一只白色I(xiàn)CR小鼠(Nihon LSC)與一只雄性輸精管結(jié)扎的白色I(xiàn)CR小鼠(Nihon SLC)交配，得到一只雌性帶陰道栓的ICR小鼠作養(yǎng)母小鼠。將雌性BDF-1小鼠(Nihon SLC)(因施用PEAMEX(5單位，Sankyo Zoki)和人絨毛膜促性腺激素(Pregnil)(5單位，organon)而過度排卵)與雄性BDF-1小鼠(Nihon SLC)交配，產(chǎn)生可用于獲得受精卵以導(dǎo)入“大鼠JTT-1抗原”基因的小鼠。支配后，切出雌性BDF-1小鼠的輸卵管，經(jīng)透明質(zhì)酸酶處理專門收獲受精卵并貯于培養(yǎng)基中。
“大鼠JTT-1抗原”基因按常規(guī)方法顯微操作導(dǎo)入受精卵。該受精卵用維持針固定。含上述線性化的編碼“大鼠JTT-1抗原”的基因的溶液用Tris-EDTA緩沖液稀釋后，于37℃用DNA導(dǎo)入針顯微注射至受精卵的雄性前核中。
基因?qū)牒螅贿x擇保持正常狀態(tài)的受精卵且將如此選擇其中導(dǎo)入有“大鼠JTT-1抗原”基因的受精卵插入養(yǎng)母小鼠(白ICR小鼠)卵巢的卵巢傘。
剪去養(yǎng)母小鼠所生子代小鼠的尾巴，從中收集基因組基因。經(jīng)PCR證實(shí)“大鼠JTT-1抗原”基因確已整合入小鼠基因組。然后，將該建立者小鼠與正常小鼠支配產(chǎn)生高表達(dá)“大鼠JTT-1抗原”的雜種轉(zhuǎn)基因小鼠。使雜合小鼠互相間交配可得到純合轉(zhuǎn)基因小鼠。
含“大鼠JTT-1抗原”基因的顯微注射構(gòu)建體圖示于圖22。
實(shí)施例18 制備其內(nèi)源“小鼠JTT-1抗原”的編碼基因已被滅活的基因敲出小鼠(1)構(gòu)建靶向載體經(jīng)同源重組滅活(敲出)內(nèi)源“小鼠JTT-1抗原”的編碼基因的靶向載體(Nikkei科學(xué)，52-62頁(yè)，1994年5月)按如下制備。
將用PstI和HindIII消化實(shí)施例9-5克隆的含編碼“小鼠JTT-1抗原”的基因的小鼠基因組DNA克隆得到的PstI-HindIII片段“同源DNA(1)”亞克隆進(jìn)pGEM-3(Promega)。然后，pGEM-3用XhoI線性化，經(jīng)XhoI和SolI處理從pMCI-neo-polyA(Stratagene)中切出的新霉素抗性基因(“neo”)插入“同源DNA”(1)的上游并連接它們。上述小鼠基因組DNA克隆經(jīng)XhoI和NotI消化切出位于上述“同源DNA(1)”上游的一段約5.5kb的基因(“同源DNA(2)”)。上述pGEM-3(插入了“neo-同源DNA(1))分別經(jīng)XhoI和HindIII消化切出“neo-同源DNA(1)”。將如此獲得的“同源(DNA(2)”和“neo-同源DNA(1)”亞克隆進(jìn)入經(jīng)NotI和122HindIII線性化的pSEAP2-CONT(Clontech)。
這一插入了“同源(2)-neo-同源(1)”的質(zhì)粒經(jīng)NruI消化并在“同源DNA(1)”的下游區(qū)線性化后，用PvuII消化pMCI-TK(Stratagen)所得胸腺嘧啶激酶基因(TK)被插入“同源DNA(1)”的下游以獲得靶向載體，該載體中插有“同源DNA(2)-neo-同源(1)”。
(2)將靶向載體導(dǎo)入ES細(xì)胞培養(yǎng)于含15％FCS的DMEM培養(yǎng)基中的小鼠胚干細(xì)胞(自然，362卷，255-258頁(yè)(1993)；自然，326卷，292-295(頁(yè)(1987))用胰酶處理成單細(xì)胞，洗細(xì)胞三次，再加磷酸緩沖液以調(diào)至1×107細(xì)胞/ml。將上述靶向載體(25μg/ml細(xì)胞懸液)加入該細(xì)胞懸液，傳送一次350v/cm(25μF)的電脈沖。然后將1×107ES細(xì)胞置于10cm盤并在在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，并將培養(yǎng)基換成選擇培養(yǎng)基(含250μg/ml G418和2μm丙氧鳥苷)。用每?jī)商鞊Q一次的培養(yǎng)該細(xì)胞培養(yǎng)基，導(dǎo)入靶向載體后第10天，在顯微鏡下用微吸管獲得573個(gè)抗新霉素ES細(xì)胞克隆。將如此獲得的每個(gè)ES細(xì)胞克隆單獨(dú)培養(yǎng)于包被了飼養(yǎng)苷細(xì)胞的24孔板上以獲得768個(gè)抗新霉素ES細(xì)胞復(fù)制子。
(3)篩選ES敲除細(xì)胞用PCR確證每個(gè)新霉素抗藥ES細(xì)胞中的內(nèi)源的編碼“小鼠JTT-1抗原”的基因已通過同源重組被破壞(敲出)。
對(duì)于PCR而言，所用引物(1)的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)上述新霉素抗藥基因(“neo”)的序列5′-CGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGC-3′，SEQ IDNO11)和引物(2)根據(jù)上述“同源DNA(1)”(5′-CATTCAAGTTTCAGGGAACTAGTCCATGCGTTTC-3′，SEQ ID NO12)。
從每個(gè)抗新霉素ES細(xì)胞中抽提每個(gè)基因組DNA，并用該基因組DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR。PCR進(jìn)行一個(gè)反應(yīng)循環(huán)在94℃，3分鐘，30個(gè)反應(yīng)循環(huán)在94℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 3.5分鐘，1個(gè)反應(yīng)循環(huán)在72℃ 10分鐘，所得產(chǎn)物存于4℃。當(dāng)經(jīng)此PCR擴(kuò)增到一段小于約4kb的片段，就可判斷為內(nèi)源的編碼“小鼠JTT-1抗原”的基因已通過同源重組在ES細(xì)胞克隆中被破壞(敲出)。
從768個(gè)受檢ES細(xì)胞克隆的三個(gè)中獲得預(yù)期PCR產(chǎn)物。對(duì)此三個(gè)克隆進(jìn)行基因組Southern印跡分析以進(jìn)一步篩選和確證。抽提這三個(gè)克隆的基因組DNA，用BamHI酶切，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。所得DNA再轉(zhuǎn)移至尼龍膜，用含“小鼠JTT-1”的基因組DNA序列制備的探針進(jìn)行雜交。探針根據(jù)同源重組發(fā)生位點(diǎn)外圍序列而設(shè)計(jì)，可從正常型基因組中區(qū)分突變型基因組的大小。
結(jié)果，在三個(gè)克隆中有一個(gè)發(fā)現(xiàn)相應(yīng)于突變型和正常型的兩條帶。該ES細(xì)胞克隆被用于如下制備基因敲出小鼠。
(4)制備基因敲出小鼠上述內(nèi)源的“小鼠JTT-1抗原”編碼基因已經(jīng)同源重組而被滅活(敲出)的ES細(xì)胞(15個(gè)ES細(xì)胞/個(gè)胚泡)顯微注射入C57BL6小鼠雌雄(NihonCharles River)交配產(chǎn)生的胚泡中。微注射后立即將該胚泡移植進(jìn)假受孕處理2.5天的養(yǎng)母ICR小鼠(CLEA日本)子宮中(每側(cè)子宮約10個(gè)胚泡)。結(jié)果共獲得38只子代小鼠其中18只是所預(yù)期嵌合小鼠。嵌合小鼠的11只是毛色貢獻(xiàn)為80％或更多的嵌合小鼠。
如此所得的嵌合小鼠再與正常C57BL6小鼠交配，產(chǎn)生的野灰色小鼠，其顏色來自ES細(xì)胞的毛色基因。
實(shí)施例19 制備包含抗體的藥用組合物實(shí)施例1制備的抗“大鼠JTT-1抗原”的單抗(50-150μg/ml)，“JTT-1抗體”和“JTT-1抗體”，實(shí)施例12制備的抗“人JTT-1抗原”的單抗，“SA 12”和“SG 430”的每種被加入注射用蒸餾水(10ml)中制備注射液。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明中哺乳動(dòng)物如人，小鼠和大鼠源的新型細(xì)胞表面分子(稱“JTT-1抗原”)特征如下(1)“JTT-1抗原”與“CD28”(淋巴細(xì)胞如T細(xì)胞的細(xì)胞表面分子，通過細(xì)胞粘附傳遞對(duì)T細(xì)胞活化十分重要的協(xié)同刺激信號(hào))，和“CTLA-4”(淋巴細(xì)胞如T細(xì)胞的細(xì)胞表面分子，協(xié)同該信號(hào)調(diào)節(jié)活化的淋巴細(xì)胞如活化T細(xì)胞的功能)有以下相似(i)20個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基(包括半胱胺酸殘基)高度保守；(ii)配體結(jié)合區(qū)必需的脯氨酸重復(fù)序列“Pro-Pro-Pro(PPP)”在胞外區(qū)中保守；(iii)信號(hào)傳遞區(qū)必需的“Tyr-Xaa-Xaa-Met(YxxM)”(Xaa和x代表任意氨基酸)在胞質(zhì)區(qū)內(nèi)保守；還有(iv)編碼“小鼠JTT-1抗原”的基因在小鼠染色體上基因座是“IC3”，象“CD28”和“CTLA-4”一樣。
(2)“JTT-1抗原”可介導(dǎo)胸腺細(xì)胞，淋巴母細(xì)胞(絲裂原如ConA刺激的)，淋巴瘤的細(xì)胞粘附，就象介導(dǎo)細(xì)胞粘附的“CD28”和“CTLA-4”一樣。
(3)“JTT-1抗原”至少在胸腺細(xì)胞，絲裂原如ConA刺激的淋巴母細(xì)胞(如活化的T淋母細(xì)胞和活化的B淋母細(xì)胞，等等)，外周血淋巴細(xì)胞，及胸腺瘤中強(qiáng)烈表達(dá)。
(4)抗“JTT-1抗原”的抗體顯著增殖人外周血淋巴細(xì)胞，并且在有抗CD3單抗存在時(shí)更促進(jìn)這種增殖(該CD3組成T細(xì)胞表面TCR/CD3復(fù)合物，從抗原呈遞細(xì)胞接受T細(xì)胞活化必需的初級(jí)信號(hào))。
(5)給予抗“JTT-1抗原”的抗體顯著抑制實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎(EAE)的癥狀。
(6)給予抗“JTT-1抗原”的抗體至腎小球基底膜(GBM)腎炎的模型大鼠顯著抑制該病的癥狀。
本發(fā)明的“JTT-1抗原”被認(rèn)為象“CD28”和“CTLA-4”一樣。是傳遞淋巴細(xì)胞如T細(xì)胞活化必需的第二信號(hào)(協(xié)同刺激信號(hào))，并與該信號(hào)一起調(diào)節(jié)活化淋巴細(xì)胞如活化的T細(xì)胞的功能的分子。
因此，本發(fā)明的組成此細(xì)胞表面分子的多肽，其多肽片段，其融合多肽，其對(duì)應(yīng)抗體可提供特別有用的藥物，用于治療或預(yù)防各種自身免疫病，過敏性疾病，或炎癥性疾病，特別是，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，自身免疫性甲狀腺炎，過敏接觸性皮炎，慢性炎癥性皮膚病如扁平苔癬，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，胰島素依賴型糖尿病，和牛皮癬，這些由淋巴細(xì)胞如T細(xì)胞活化及活化淋巴細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的異常所引起的疾病。
相似的，本發(fā)明的多肽或多肽片段的編碼基因不僅可用于基因治療上述各種疾病，還可用于制備反義藥物。
本發(fā)明的多種抗體中，人類單克隆抗體及其藥物組合物作為抗體藥物具有顯著增加的藥用價(jià)值，因?yàn)樗鼈儗?duì)人無抗原性，而抗原性已成為含非人源抗體如小鼠源抗體的抗體藥物的嚴(yán)重問題(副作用)。
本發(fā)明的基因(DNA)，多肽，多肽片段和抗體不僅用作藥物，還用作尋找與本發(fā)明的細(xì)胞表面分子相互作用的分子(配體)，澄清該配體的功能，并開發(fā)靶向這些配體的藥物的試劑。
而且，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠不僅作為研究本發(fā)明的細(xì)胞表面分子“JTT-1抗原”的生理功能的模型動(dòng)物十分有用，而且作為篩選工具篩選具有調(diào)節(jié)(抑制，壓抑，活化，刺激等)“JTT-1抗原”的功能的各種藥物(低分子量化合物，抗體，反義物質(zhì)，多肽等)十分有用。特別是，這些試驗(yàn)物質(zhì)可給藥于轉(zhuǎn)基因小鼠以測(cè)量和分析該小鼠產(chǎn)生的各種生理學(xué)，生物學(xué)，或藥物學(xué)參數(shù)，從而評(píng)估所給試驗(yàn)物質(zhì)的活性。
此外，本發(fā)明的基因敲除小鼠可通過從各種不同角度(生理學(xué)，生物學(xué)，藥物學(xué)，病理學(xué)和遺傳角度)分析該小鼠的特點(diǎn)而弄清本發(fā)明的細(xì)胞表面分子的功能。
本發(fā)明中所涉及的保藏的微生物分別為于1996年10月11日保藏于國(guó)家生命科學(xué)和人類技術(shù)研究所工業(yè)科技機(jī)構(gòu)(日本)的保藏號(hào)為FERMBP-5707的分類名為PBJT-CL-7的微生物；于1996年10月11日保藏于國(guó)家生命科學(xué)和人類技術(shù)研究所工業(yè)科技機(jī)構(gòu)(日本)的保藏號(hào)為FERMBP-5708的分類名為PBJT-CL-8的微生物；以及于1996年10月25日保藏于國(guó)家生命科學(xué)和人類技術(shù)研究所工業(yè)科技機(jī)構(gòu)(日本)的保藏號(hào)為FERMBP-5725的分類名為PBJT-BA-8的微生物。
序列表(1)申請(qǐng)人姓名日本煙草公司(2)發(fā)明題目介導(dǎo)細(xì)胞粘附和信號(hào)傳遞的細(xì)胞表面分子(3)查詢號(hào)J1-802PCT(4)申請(qǐng)?zhí)?5)申請(qǐng)日(6)優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)遞交的國(guó)家和此申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)柸毡荆琋o.Hei 9-062290日本，1998年2月26日提交的專利申請(qǐng)(查詢號(hào)，J1-802DP1)(7)優(yōu)先權(quán)日1997年2月27日(8)序列數(shù)12SEQ ID NO1序列長(zhǎng)度600序列類型核酸拓樸構(gòu)型線性分子類型cDNA至mRNA原始來源生物Homo sapiens特征名稱/關(guān)鍵詞CDS位置1..600鑒定方法E序列描述SEQ ID NO1ATG AAG TCA GGC CTC TGG TAT TTC TTT CTC 30Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu1 5 10TTC TGC TTG CGC ATT AAA GTT TTA ACA GGA 60Phe Cys Leu Arg Ile Lys Val Leu Thr Gly15 20GAA ATC AAT GGT TCT GCC AAT TAT GAG ATG 90Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met25 30
TTT ATA TTT CAC AAC GGA GGT GTA CAA ATT 120Phe Ile Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile35 40TTA TGC AAA TAT CCT GAC ATT GTC CAG CAA 150Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val Gln Gln45 50TTT AAA ATG CAG TTG CTG AAA GGG GGG CAA 180Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln55 60ATA CTC TGC GAT CTC ACT AAG ACA AAA GGA 210Ile Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly65 70AGT GGA AAC ACA GTG TCC ATT AAG AGT CTG 240Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu75 80AAA TTC TGC CAT TCT CAG TTA TCC AAC AAC 270Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn85 90AGT GTC TCT TTT TTT CTA TAC AAC TTG GAC 300Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp95 100CAT TCT CAT GCC AAC TAT TAC TTC TGC AAC 330His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn105 110CTA TCA ATT TTT GAT CCT CCT CCT TTT AAA 360Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys115 120GTA ACT CTT ACA GGA GGA TAT TTG CAT ATT 390Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His Ile125 130TAT GAA TCA CAA CTT TGT TGC CAG CTG AAG 420Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys135 140TTC TGG TTA CCC ATA GGA TGT GCA GCC TTT 450Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe145 150
GTT GTA GTC TGC ATT TTG GGA TGC ATA CTT480Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu155 160ATT TGT TGG CTT ACA AAA AAG AAG TAT TCA510Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser165 170TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAC GGT GAA TAC540Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr175 180ATG TTC ATG AGA GCA GTG AAC ACA GCC AAA570Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys185 190AAA TCT AGA CTC ACA GAT GTG ACC CTA TAA600Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu195序列2序列長(zhǎng)度199序列類型氨基酸拓樸構(gòu)型線性分子類型蛋白質(zhì)原始來源生物Homo sapiens序列描述SEQ ID NO21 5 10Phe Cys Leu Arg Ile Lys Val Leu Thr Gly15 20Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met25 30Phe Ile Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile35 40
Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val Gln Gln45 50Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln55 60Ile Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly65 70Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu75 80Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn85 90Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp95 100His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn105 110Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys115 120Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His Ile125 130Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys135 140Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe145 150Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu155 160Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser165 170Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr175 180Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys185 190Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu195SEQ ID NO3
序列長(zhǎng)度2610序列類型核酸拓樸構(gòu)型線性分子類型其它核酸(含3′-和5′-非轉(zhuǎn)譯序列的cDNA)原始來源生物Homo sapiens特征名稱/關(guān)鍵詞CDS位置26..625鑒定方法E序列描述SEQ ID NO3GGACTGTTAA CTGTTTCTGG CAAAC25ATG AAG TCA GGC CTC TGG TAT TTC TTT CTC55Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu5 10TTC TGC TTG CGC ATT AAA GTT TTA ACA GGA85Phe Cys Leu Arg Ile Lys Val Leu Thr Gly15 20GAA ATC AAT GGT TCT GCC AAT TAT GAG ATG115Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met25 30TTT ATA TTT CAC GGC GGA GGT GTA CAA ATT145Phe Ile Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile35 40TTA TGC AAA TAT CCT GAC ATT GTC CAG CAA175Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val Gln Gln45 50TTT AAA ATG CAG TTG CTG AAA GGG GGG CAA205Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln55 60ATA CTC TGC GAT CTC ACT AAG ACA AAA GGA235Ile Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly65 70AGT GGA AAC ACA GTG TCC ATT AAG AGT CTG265Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu75 80
AAA TTC TGC CAT TCT CAG TTA TCC AAC AAC295Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn85 90AGT GTC TCT TTT TTT CTA TAC AAC TTG GAC3Z5Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp95 100CAT TCT CAT GCC AAC TAT TAC TTC TGC AAC355His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn105 110CTA TCA ATT TTT GAT CCT CCT CCT TTT AAA385Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys115 120GTA ACT CTT ACA GGA GGA TAT TTG CAT ATT415Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His Ile125 130TAT GAA TCA CAA CTT TGT TGC CAG CTG AAG445Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys135 140TTC TGG TTA CCC ATA GGA TGT GCA GCC TTT475Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe145 150GTT GTA GTC TGC ATT TTG GGA TGC ATA CTT505Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu155 160ATT TGT TGG CTT ACA AAA AAG AAG TAT TCA535Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser165 170TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAC GGT GAA TAC565Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr175 180ATG TTC ATG AGA GCA GTG AAC ACA GCC AAA595Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys185 190AAA TCT AGA CTC ACA GAT GTG ACC CTA TAA625Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu195TATGGAACTC TGGCACCCAG GCATGAAGCA CGTTGGCCAG TTTTCCTCAA 675CTTGAAGTGC AAGATTCTCT TATTTCCGGG ACCACGGAGA GTCTGACTTA 725ACTACATACA TCTTCTGCTG GTGTTTTGTT CAATCTGGAA GAATGACTGT 775
ATCAGTCAAT GGGGATTTTA ACAGACTGCC TTGGTACTGC CGAGTCCTCT 825CAAAACAAAC ACCCTCTTGC AACCAGCTTT GGAGAAAGCC CAGCTCCTGT 875GTGCTCACTG GGAGTGGAAT CCCTGTCTCC ACATCTGCTC CTAGCAGTGC 925ATCAGCCAGT AAAACAAACA CATTTACAAG AAAAATGTTT TAAAGATGCC 975AGGGGTACTG AATCTGCAAA GCAAATGAGC AGCCAAGGAC CAGCATCTGT 1025CCGCATTTCA CTATCATACT ACCTCTTCTT TCTGTAGGGR TGAGAATTCC 1075TCTTTTAATC AGTCAAGGGA GATGCTTCAA AGCTGGRGCT ATTTTATTTC 1125TGAGATGTTG ATGTGAACTG TACATTAGTA CATACTCAGT ACTCTCCTTC 1175AATTGCTGAA CCCCAGTTGA CCATTTTACC AAGACTTTAG ATGCTTTCTT 1225GTGCCCTCAA TTTTCTTTTT AAAAATACTT CTACATGACT GCTTGACAGC 1275CCAACAGCCA CTCTCAATAG AGAGCTATGT CTTACATTCT TTCCTCTGCT 1325GCTCAATAGT TTTATATATC TATGCATACA TATATACACA CATATGTATA 1375TAAAATTCAT AATGAATATA TTTGCCTATA TTCTCCCTAC AAGAATATTT 1425TTGCTCCAGA AAGACATGTT CTTTTCTCAA ATTCAGTTAA AATGGTTTAC 1475TTTGTTCAAG TTAGTGGTAG GAAACATTGC CCGGAATTGA AAGCAAATTT 1525AWWTTATTAT CCTATTTTCT ACCATTATCT ATGTTTTCAT GGTGCTATTA 1575ATTACAAGTT TAGTTCTTTT TGTAGATCAT ATTAAAATTG CAAACAAAAT 1625CATCTTTAAT GGGCCAGCAT TCTCATGGGG TAGAGCAGAA TATTCATTTA 1675GCCTGAAAGC TGCAGTTACT ATAGGTTGCT GTCAGACTAT ACCCATGGTG 1725CCTCTGGGCT TGACAGGTCA AAATGGTCCC CATCAGCCTG GAGCAGCCCT 1775CCAGACCTGG GTGGAATTCC AGGGTTGAGA GACTCCCCTG AGCCAGAGGC 1825CACTAGGTAT TCTTGCTCCC AGAGGCTGAA GTCACCCTGG GAATCACAGT 1875GGTCTACCTG CATTCATAAT TCCAGGATCT GTGAAGAGCA CATATGTGTC 1925AGGGCACAAT TCCCTCTCAT AAAAACCACA CAGCCTGGAA ATTGGCCCTG 1975GCCCTTCAAG ATAGCCTTCT TTAGAATATG ATTTGGCTAG AAAGATTCTT 2025AAATATGTGG AATATGATTA TTCTTAGCTG GAATATTTTC TCTACTTCCT 2075GTCTGCATGC CCAAGGCTTC TGAAGCAGCC AATGTCGATG CAACAACATT 2125TGTAACTTTA GGTAAACTGG GATTATGTTG TAGTTTAACA TTTTGTAACT 2175GTGTGCTTAT AGTTTACAAG TGAGACCCGA TATGTCATTA TGCATACTTA 2225TATTATCTTA AGCATGTGTA ATGCTGGATG TGTACAGTAC AGTACWTAAC 2275TTGTAATTTG AATCTAGTAT GGTGTTCTGT TTTCAGCTGA CTTGGACAAC 2325CTGACTGGCT TTGCACAGGT GTTCCCTGAG TTGTTTGCAG GTTTCTGTGT 2375GTGGGGTGGG GTATGGGGAG GAGAACCTTC ATGGTGGCCC ACCTGGCCTG 2425GTTGTCCAAG CTGTGCCTCG ACACATCCTC ATCCCAAGCA TGGGACACCT 2475CAAGATGAAT AATAATTCAC AAAATTTCTG TGAAATCAAA TCCAGTTTTA 2525AGAGGAGCCA CTTATCAAAG AGATTTTAAC AGTAGTAAGA AGGCAAAGAA 2575TAAACATTTG ATATTCAGCA ACTGAAAAAA AAAAA 2610
SEQ ID NO4序列長(zhǎng)度2072序列類型核酸拓樸構(gòu)型線性分子類型其它核酸(含3′-和5′-非轉(zhuǎn)譯序列的cDNA)原始來源生物特征Rattus名稱/關(guān)鍵詞CDS位置35-637鑒定方法E序列描述SEQ ID NO4CTGGAGGGGA AGAGTGCAGC TGTTCCTGGC AGAC 34ATG AAG CCC TAC TTC TCG TGC GTC TTT GTC64Met Lys Pro Tyr Phe Ser Cys Val Phe Val1 5 10TTC TGC TTC CTA ATC AAA CTT TTA ACA GGA94Phe Cys Phe Leu Ile Lys Leu Leu Thr Gly15 20GAA CTC AAT GAC TTG GCC AAT CAC AGG ATG124Glu Leu Asn Asp Leu Ala Asn His Arg Met25 30TTT TCG TTT CAC GAT GGA GGT GTA CAG ATT154Phe Ser Phe His Asp Gly Gly Val Gln Ile35 40TCT TGT AAC TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG184Ser Cys Asn Tyr Pro Glu Thr Val Gln Gln45 50TTA AAA ATG CAG TTG TTC AAA GAC AGA GAA214Leu Lys Met Gln Leu Phe Lys Asp Arg Glu55 60GTC CTC TGC GAC CTC ACC AAG ACC AAG GGA244Val Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly65 70AGC GGA AAC ACC GTG TCC ATC AAG AAT CCG274
Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Asn Pro75 80ATG TCC TGT CCA TAT CAG CTG TCC AAC AAC304Met Ser Cys Pro Tyr Gln Leu Ser Asn Asn85 90AGT GTC TCT TTT TTC CTA GAC AAC GCA GAC334Ser Val Ser Phe Phe Leu Asp Asn Ala Asp95 100AGC TCC CAG GGC AGC TAC TTT TTA TGC AGC364Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Phe Leu Cys Ser105 110CTG TCG ATT TTC GAC CCA CCC CCT TTT CAA394Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln115 120GAA AAG AAC CTT AGT GGA GGA TAT TTG CTT424Glu Lys Asn Leu Ser Gly Gly Tyr Leu Leu125 130ATT TAT GAA TCC CAG CTT TGT TGC CAG CTG454Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu135 140AAG CTT TGG TTA CCC GTA GGG TGT GCA GCT484Lys Leu Trp Leu Pro Val Gly Cys Ala Ala145 150TTT GTG GCA GCG CTC CTT TTT GGA TGC ATA514Phe Val Ala Ala Leu Leu Phe Gly Cys Ile155 160TTT ATC GTC TGG TTT GCA AAA AAG AAG TAC544Phe Ile Val Trp Phe Ala Lys Lys Lys Tyr165 170AGA TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAT AGC GAG574Arg Ser Ser Val His Asp Pro Asn Ser Glu175 180TAC ATG TTC ATG GCG GCA GTC AAC ACA AAC604Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn185 190AAA AAG TCC AGA CTT GCA GGT ATG ACC TCA634
Lys Lys Ser Arg Leu Ala Gly Met Thr Ser195 200TAA 637TCTGGAACAC GGGAACCCAT GGAGGAACTA CACTGTCTAG TTCCCCTGAA 687ACTTGAATGG AGAAAGTCTT CTATTTTCTG GACCACAGGG CATCTGACTT 737GATTAACTAC TGATACCTCC TTTTGGKGTT TTGTTTGTCT GGATCAGTGA 787CTATCAGTCA CTCGGAATTT CAGCAGACTG CCCTGGGTTT GCTGAGTCCT 837TTTAAGGCAA ACCCCTTCTT ATAGAAGACC CGGCTCATAT GTATTCAACA 887AACAGACCTC ACTGGGATAC AATCCCCTCT TTCTGCGCCT GCTTCTAGCT 937ATGCACCGGC CAGCAAGACA AACATATCTC CAGCATTTTT ACAAAAATGC 987CAGGGTATGA ATCTGTAAAG TACACAGGCA GCCATTGACC ACCGTCTGTC 1037CTCGTTTTTT CAGATTCTAT TTTTTTCCAT AGAGATCAGC ATTCCTTCTA 1087GAATCAGACA GTAGAGGGAG ATGCTTCACA ACAGAAGCTC TTATGTTTCT 1137GAGATGTTGA TGAATTCATG CTTTAGTACC ACCATGTTCT CTAACAACTT 1187CTATATTCCA GCTGATCACT GCTTCAGGGC TTAGATGCCT GCTTTTGCCT 1237TCAAGTCTCC CCTTAAAGAT ACTCCCACAG GTCTACTTGG TGGCCTGCAG 1287CCACTCTGAA TAGGAAGTTT GGTCTACAAT TTCCCCCCTC TGCTGCTCAA 1337AAAAAAAAAT TAGTAGATAT GATTTTCCCA TATTCTCCCT GCCAAAGTAA 1387TTTTTTCCAG CAAAGACATC TAAATTCAGT TAATATGGTT TACTGTGTTG 1437ATATTAGTGG CAGTAAACAT TTCTCAGAAT CAAAAGCAAA TTAATTTTGC 1487GGTGGTGTTT TTCTACCATT ATCTTGGGTT TCCATGGTGC TATTACTCAC 1537AAGTTTAGCT ATTTTTTTAT GCATCATATT AAAGTTGCAA GCAAGCAGAG 1587CAACCCTCGG TTAATGGGCA AACATTCTCC TGGGGTAGAA TGAATTGTCT 1637ATTTAGCCCG AAAACTGCAG TTTCTGTGGG TGGCTGCCAG ACTACAGCCG 1687TGCTTTGCTC TGGCTTTGAC AGGTTGAAAT AGYCCCCATG ASCSTGGAAC 1737AGWACTCCAG ACTGTGCTGG AGTCCCAAAG TTAGGAGGGC CATGGAGCCT 1787GGGACAGGCT GCTGCTTTGG TCTTTAGGAT CTAGGAARAA TTACAGAGGG 1837GCCAAGACAG AGTTCCCTCC CCTAGAAACT GTGCAGCCTG GAAGTCAGCC 1887CTGGCACTTT AAGATAGCCT TCTTTAGAAC ATGAGTTAGT TGGTAGTATT 1937CTGACGTGTA AACAGCCTAT KGTTGCTCGG AGCTGGACCA TTTTCTCCAC 1987TTCCCTGTCT GCATGCCTAA GACTTCTAGA GCAGCCAACG TATATGCAAC 2037ATTAAAGAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 2072
SEQ ID NO5序列長(zhǎng)度603序列類型核酸拓樸構(gòu)型線性分子類型cDNA至mRNA原始來源生物Mus特征名稱/關(guān)鍵詞CDS位置1..603鑒定方法E序列描述SEQ ID NO5ATG AAG CCG TAC TTC TGC CAT GTC TTT GTC30Met Lys Pro Tyr Phe Cys His Val Phe Val1 5 10TTC TGC TTC CTA ATC AGA CTT TTA ACA GGA60Phe Cys Phe Leu Ile Arg Leu Leu Thr Gly15 20GAA ATC AAT GGC TCG GCC GAT CAT AGG ATG90Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met25 30TTT TCA TTT CAC AAT GGA GGT GTA CAG ATT120Phe Ser Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile35 40TCT TGT AAA TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG150Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val Gln Gln45 50TTA AAA ATG CGA TTG TTC AGA GAG AGA GAA180Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu55 60GTC CTC TGC GAA CTC ACC AAG ACC AAG GGA210Val Leu Cys Glu Leu Thr Lys Thr Lys Gly65 70AGC GGA AAT GCG GTG TCC ATC AAG AAT CCA240Ser Gly Asn Ala Val Ser Ile Lys Asn Pro75 80
ATG CTC TGT CTA TAT CAT CTG TCA AAC AAC270Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn85 90AGC GTC TCT TTT TTC CTA AAC AAC CCA GAC300Ser Val Ser Phe Phe Leu Asn Asn Pro Asp95 100AGC TCC CAG GGA AGC TAT TAC TTC TGC AGC330Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser105 110CTG TCC ATT TTT GAC CCA CCT CCT TTT CAA360Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln115 120GAA AGG AAC CTT AGT GGA GGA TAT TTG CAT390Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr Leu His125 130ATT TAT GAA TCC CAG CTC TGC TGC CAG CTG420Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu135 140AAG CTC TGG CTA CCC GTA GGG TTG CCA GCT450Lys Leu Trp Leu Pro Val Gly Leu Pro Ala145 150TTC GTT GTG GTA CTC CTT TTT GGA TGC ATA480Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys Ile155 160CTT ATC ATC TGG TTT TCA AAA AAG AAA TAC510Leu Ile Ile Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr165 170GGA TCC AGT GTG CAT GAC CCT AAT AGT GAA540Gly Ser Ser Val His Asp Pro Asn Ser Glu175 180TAC ATG TTC ATG GCG GCA GTC AAC ACA AAC570Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn185 190AAA AAG TCT AGA CTT GCA GGT GTG ACC TCA600Lys Lys Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser195 200TAA603
SEQ ID NO6序列長(zhǎng)度836序列類型核酸拓樸構(gòu)型線性分子類型其它核酸(含3′-和5′-非轉(zhuǎn)譯序列的cDNA)原始來源生物Rattus特征名稱/關(guān)鍵詞CDS位置35..685鑒定方法E序列描述SEQ ID NO6CTGGAGGGGA AGAGTGCAGC TGTTCCTGGC AGAC 34ATG AAG CCC TAC TTC TCG TGC GTC TTT GTC64Met Lys Pro Tyr Phe Ser Cys Val Phe Val1 5 10TTC TGC TTC CTA ATC AAA CTT TTA ACA GGA94Phe Cys Phe Leu Ile Lys Leu Leu The Gly15 20GAA CTC AAT GAC TTG GCC AAT CAC AGG ATG124Glu Leu Asn Asp Leu Ala Asn His Arg Met25 30TTT TCG TTT CAC GAT GGA GGT GTA CAG ATT154Phe Ser Phe His Asp Gly Gly Val Gln Ile35 40TCT TGT AAC TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG184Ser Cys Asn Tyr Pro Glu Thr Val Gln Gln45 50TTA AAA ATG CAG TTG TTC AAA GAC AGA GAA214Leu Lys Met Gln Leu Phe Lys Asp Arg Glu55 60GTC CTC TGC GAC CTC ACC AAG ACC AAG GGA244Val Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly65 70
AGC GGA AAC ACC GTG TCC ATC AAG AAT CCG274Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Asn Pro75 80ATG TCC TGT CCA TAT CAG CTG TCC AAC AAC304Met Ser Cys Pro Tyr Gln Leu Ser Asn Asn85 90AGT GTC TCT TTT TTC CTA GAC AAC GCA GAC334Ser Val Ser Phe Phe Leu Asp Asn Ala Asp95 100AGC TCC CAG GGC AGC TAC TTT TTA TGC AGC364Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Phe Leu Cys Ser105 110CTG TCG ATT TTC GAC CCA CCC CCT TTT CAA394Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln115 120GAA AAG AAC CTT AGT GGA GGA TAT TTG CTT424Glu Lys Asn Leu Ser Gly Gly Tyr Leu Leu125 130ATT TAT GAA TCC CAG CTT TGT TGC CAG CTG454Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu135 140AAG CTT TGG TTA CCC GTA GGG TGT GCA GCT484Lys Leu Trp Leu Pro Val Gly Cys Ala Ala145 150TTT GTG GCA GCG CTC CTT TTT GGA TGC ATA514Phe Val Ala Ala Leu Leu Phe Gly Cys Ile155 160TTT ATC GTC TGG TTT GCA AAA AAG AAG TAC544Phe Ile Val Trp Phe Ala Lys Lys Lys Tyr165 170AGA TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAT AGC GAG574Arg Ser Ser Val His Asp Pro Asn Ser Glu175 180TAC ATG TTC ATG GCG GCA GTC AAC ACA AAC604Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn185 190AAA AAG TCC AGA CTT GCA GGT ACA GCA CCC634Lys Lys Ser Arg Leu Ala Gly Thr Ala Pro
195 200CTT AGG GCT TTG GGG AGA GGA GAA CAC TCT664Leu Arg Ala Leu Gly Arg Gly Glu His Ser205 210TCA TGT CAA GAC CGG AAT TAA685Ser Cys Gln Asp Arg Asn215TTTGTTTATT TCTATTTTAA AAGAAAGACA TTTTTTCCCC TAAAGATAAT 735TTTTGTATTT TTATGTGAAA GTCTGAATCT TCATTTTAAC TCGACTTATA 785TACTCTGTGG TATATTAAAA ATAATGTTTG TGAAAAAAAA AAAAAAAAAA 835A836SEQ ID NO7序列長(zhǎng)度27序列類型核酸拓樸構(gòu)型線性分子類型其他核酸(合成DNA)特征名稱/關(guān)鍵詞引物結(jié)合位置1..27鑒定方法E序列描述SEQ ID NO7CTGCTCGAGA TGAAGCCCTA CTTCTCG 27SEQ ID NO8序列長(zhǎng)度32序列類型核酸拓樸構(gòu)型線性分子類型其他核酸(合成DNA)
特征名稱/關(guān)鍵詞引物結(jié)合位置1..32鑒定方法E序列描述SEQ ID NO8ACCCTACGGG TAACGGATCC TTCAGCTGGC AA32SEQ ID NO9序列長(zhǎng)度30序列類型核酸拓樸構(gòu)型線性分子類型其他核酸(合成DNA)特征名稱/關(guān)鍵詞引物結(jié)合位置1..30鑒定方法E序列描述SEQ ID NO9TAACTGTTTC TCGAGAACAT GAAGTCAGGC 30SEQ ID NO10序列長(zhǎng)度30序列類型核酸拓樸構(gòu)型線性分子類型其它核酸(合成DNA)特征名稱/關(guān)鍵詞引物結(jié)合位置1..30鑒定方法E序列描述SEQ ID NO10ATCCTATGGG TAACGGATCC TTCAGCTGGC 30
SEQ ID NO11序列長(zhǎng)度35序列類型核酸拓樸構(gòu)型線性分子類型其它核酸(合成DNA)特征名稱/關(guān)鍵詞引物結(jié)合位置1..35鑒定方法E序列描述SEQ ID NO11CGTGATATTG CTGAAGAGCT TGGCGGCGAA TGGGC 35SEQ ID NO12序列長(zhǎng)度34序列類型核酸拓樸構(gòu)型線性分子類型其它核酸(合成DNA)特征名稱/關(guān)鍵詞引物結(jié)合位置1..34鑒定方法E序列描述SEQ ID NO12CATTCAAGTT TCAGGGAACT AGTCCATGCG TTTC 3權(quán)利要求
1.由選自下組的氨基酸序列組成的多肽a)由對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4中核苷酸殘基35-634的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；b)由對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO5中核苷酸殘基1-600的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；或c)由對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO6中核苷酸殘基35-682的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
2.一種多肽片段，其由權(quán)利要求1的多肽的胞外區(qū)組成。
3.一種編碼權(quán)利要求2的多肽片段的DNA。
4.一種含兩個(gè)多肽片段的同二聚體分子，其中所述兩個(gè)片段為權(quán)利要求2的多肽片段，且這兩個(gè)多肽片段通過二硫鍵彼此橋連。
5.一種融合多肽，包含權(quán)利要求1的多肽的胞外區(qū)和人免疫球蛋白(Ig)重鏈的恒定區(qū)或該恒定區(qū)的一部分。
6.權(quán)利要求5的融合多肽，其中該免疫球蛋白為IgG。
7.權(quán)利要求5的融合多肽，其中恒定區(qū)的一部分包含IgG的絞鏈區(qū)，C2區(qū)和C3區(qū)。
8.一種同二聚體分子，包含兩個(gè)根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中這兩個(gè)多肽經(jīng)二硫鍵彼此橋聯(lián)。
9.一種非-倉(cāng)鼠或非小鼠抗體或其部分，可與權(quán)利要求1的多肽，或與權(quán)利要求2的多肽片段，或與權(quán)利要求4的同二聚體分子，或與由所述多肽組成的細(xì)胞表面分子反應(yīng)，其中所述部分選自F(ab′)2，F(xiàn)ab′，F(xiàn)ab，F(xiàn)v，sFv，dsFv，或dAb。
10.權(quán)利要求9的抗體或其部分，其中該抗體為單克隆抗體。
11.一種非-倉(cāng)鼠或非小鼠單克隆抗體或其部分，可與權(quán)利要求1的多肽，或與權(quán)利要求2的多肽片段，或與權(quán)利要求4的同二聚體分子，或與由所述多肽組成的細(xì)胞表面分子反應(yīng)，其中所述部分選自F(ab′)2，F(xiàn)ab′，F(xiàn)ab，F(xiàn)v，sFv，dsFv，或dAb。
12.權(quán)利要求11的單克隆抗體或其部分，其中該單克隆抗體對(duì)絲裂原刺激的淋巴母細(xì)胞的作用，實(shí)質(zhì)上等同于國(guó)際保藏號(hào)FERM BP-5707或FERM BP-5708所限定的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體對(duì)絲裂原刺激的大鼠淋巴母細(xì)胞的作用。
13.一種抗體生成細(xì)胞，它產(chǎn)生權(quán)利要求10至12中任一個(gè)的單克隆抗體。
14.一種用于制備基因敲出小鼠的胚胎干細(xì)胞，其編碼小鼠多肽的內(nèi)源基因被滅活，從而不產(chǎn)生該小鼠多肽，其中所述小鼠多肽含有由對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO5中核苷酸殘基1-600的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
15.一種治療炎癥或預(yù)防該病癥狀的藥物組合物，其包含選自如下的任一物質(zhì)a)一種多肽片段，其由具有氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽的胞外區(qū)組成；b)一種含兩個(gè)上述(a)的多肽片段的同二聚體分子，其中所述兩個(gè)多肽片段通過二硫鍵彼此橋連；c)一種融合多肽，包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽的胞外區(qū)和人免疫球蛋白(Ig)重鏈的恒定區(qū)或該恒定區(qū)的一部分；d)一種二聚體分子，包含兩個(gè)上述(c)的融合多肽，其中所述兩個(gè)多肽通過二硫鍵彼此橋連；e)一種非-倉(cāng)鼠單克隆抗體或其部分，可與具有氨基酸序列SEQ IDNO2的多肽，或與上述(a)的多肽片段，或與上述(b)的同二聚體分子，或與由所述多肽組成的人源的細(xì)胞表面分子反應(yīng)，其中所述部分選自F(ab′)2，F(xiàn)ab′，F(xiàn)ab，F(xiàn)v，sFv，dsFv，或dAb，以及可藥用載體。
全文摘要
分離和鑒定了一種新的由單克隆抗體識(shí)別的細(xì)胞表面分子，其特異性表達(dá)在胸腺細(xì)胞，ConA刺激活化的淋巴細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞中，由抗對(duì)自身免疫病和過敏性疾病有十分重要作用的淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面分子的單克隆抗體所發(fā)現(xiàn)。更進(jìn)一步，還分析了該分子的功能。而且發(fā)現(xiàn)抗該分子的抗體顯著改善了自身免疫病和過敏性疾病的狀況。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1908012SQ20061010066
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期1998年2月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月27日
發(fā)明者玉谷卓也, 手塚克成 申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社