專利名稱：一種重樓總皂苷的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，特別是公開了一種重樓有效部位-總皂苷的制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
重樓為百合科植物滇重樓Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.M azz.和七葉一枝花P.polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根莖。在我國，重樓是多種著名中成藥，如云南白藥、季德勝蛇藥片、宮血寧膠囊等的主要組成藥物。但這些藥物基本上仍是將重樓與其它藥物配伍之后，采用水或乙醇的提取物直接制劑而成，保留著傳統(tǒng)中藥的制備方式。重樓總皂苷為重樓多重藥理作用的主要有效成分，重樓有效部位就是應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)將其中的總皂苷類成分富集到50％以上含量。由重樓總皂苷制成的藥物具有服用量少、制劑性能好等多種優(yōu)點，克服了傳統(tǒng)中藥用量大，工藝粗的諸多缺點。目前，由重樓總皂苷制成的藥物主要用于治療子宮出血。已有的制備技術(shù)中，有兩種方法可以達(dá)到使重樓提取物中總皂苷的含量超過50％的要求。這兩種方法分別是單純的樹脂吸附法和膜過濾結(jié)合樹脂吸附法。單純的樹脂法是將重樓的提取液濃縮，離心，所得到的上清液通過大孔樹脂柱制備重樓總皂苷，這種方法的缺陷在于由于重樓總皂苷水溶性差，大量重樓總皂苷在提取液濃縮時沉淀出來，從而導(dǎo)致濃縮液離心后的上清液中僅保留了部分總皂苷，使得通過該方法制備重樓總皂苷，有效成分的提取回收率只有不到50％。膜過濾結(jié)合樹脂吸附法改進了單純樹脂法有效成分回收率低的的不足，但是工藝步驟繁瑣，生產(chǎn)過程中乙醇用量多，隨著能源價格的飛漲，工藝的繁復(fù)、乙醇用量過大都使得大工業(yè)生產(chǎn)的成本顯著提高。此外，該工藝中在脫色時，使用丙酮等有機溶劑，一定程度上也增加了生產(chǎn)的成本和危險性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是克服現(xiàn)有重樓總皂苷生產(chǎn)工藝中的不足，提供了一種重樓有效部位-總皂苷的制備方法，同時提供重樓總皂苷在制藥中的新用途。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的將重樓飲片或粗粉，加入6～12倍60％～95％的含水醇(V/W)，回流提取2～3次，每次提取時間為1～3小時，合并提取液，合并后的提取液離心；分出沉淀和上清液，然后將上清液濃縮至0.2～1.0g生藥/ml，靜置過夜后離心，得上清液A及沉淀A’。向沉淀A’中加入相當(dāng)于提取所用生藥量1～5倍(V/W)的去離子水進行攪拌、洗滌，然后再次離心，傾出上清液，得上清液B和沉淀B’；合并上清液A和B，將合并A、B后的上清液通過裝有大孔吸附樹脂的層析柱，上清液按重樓總皂苷的量計與干樹脂的比例為1∶4～1∶10，上柱流速1～4BV/h，樹脂徑高比為1∶3～1∶9；用水洗滌樹脂3～12BV，洗脫流速為1-6BV/h，水洗脫液棄去；用含65～95％含水乙醇(V/V)洗脫2～6BV，流速為1～6BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.1～1.25，與沉淀B’合并，干燥，即得重樓有效部位-總皂苷。
所述的大孔樹脂為非極性或弱極性大孔樹脂。
用上述方法制得的重樓總皂苷含量為50％～90％，其中重樓皂苷I和重樓皂苷II的量合計為10％～20％，重樓總皂苷的回收率大于85％。
本發(fā)明改變了現(xiàn)有技術(shù)中膜過濾結(jié)合樹脂吸附法中沉淀部分的處理方法，通過酒精提取、膜過濾、丙酮脫脂、樹脂脫色等步驟實現(xiàn)、縮減為僅通過醇提水沉和去離子水洗滌沉淀完成，使得制備工藝顯著簡化。同時，生產(chǎn)過程中減少了乙醇用量，顯著降低了生產(chǎn)成本，省去了丙酮的使用，進一步減少了成本和生產(chǎn)中的危險性；有效成分提取回收率高，含量高，質(zhì)量穩(wěn)定。
本發(fā)明的另一發(fā)明點是重樓總皂苷作為在制備抗炎、消腫、止痛的外用藥物、抗病毒藥物、抗腫瘤以及腫瘤輔助治療藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明以重樓總皂苷為原料，可將其作為活性成分與制藥學(xué)上可接受的載體或藥用輔料開發(fā)成相宜的抗炎、消腫、止痛、抗病毒、抗腫瘤以及腫瘤輔助的制劑，如膠囊劑(軟膠囊、硬膠囊)、凝膠劑、軟膏劑、滴丸劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液等。
重樓總皂苷的藥效學(xué)試驗藥物重樓軟膏，含藥量分別為5％、10％、15％；凝膠劑含藥量分別為5％、10％、15％；重樓總皂苷含量60％動物新西蘭大白兔、Wister種大鼠、昆明種小鼠菌株及病毒株、細(xì)胞株人食道癌細(xì)胞Eca-109、胃癌細(xì)胞SGC-7901、白血病細(xì)胞HL-60、柯薩奇病毒株(CVB2)、甲1型(A1)和甲3型(A3)流感病毒、Hela細(xì)胞株(一)外用消炎、止痛的藥效學(xué)數(shù)據(jù)1.抗炎試驗1.1小鼠耳廓腫脹法取18-22g昆明種雌性小鼠50只，隨機分為5組，分別為重樓軟膏組(高、中、低劑量組)、皮炎平霜和賦形劑對照組。將藥物涂于小鼠右耳兩面100mg/只，給藥30min后，再于小鼠右耳兩面涂二甲苯0.1ml/只，致腫，左耳不涂為正常耳。1h后脫頸椎處死小鼠，用直徑6mm打孔器沖下雙耳同一相應(yīng)部分的圓片，稱重，以左、右耳重量之差為腫脹度，比較藥物的抗炎作用。結(jié)果見表1。
表1 重樓軟膏對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

與賦形劑對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01
1.2重樓軟膏對角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足腫脹的試驗取大鼠50只，按體重，性別隨機分為5組。將大鼠右后肢用于固定，在其踝關(guān)節(jié)處用圓珠筆作一標(biāo)志，動物的右后肢浸入足容積測量裝置內(nèi)，浸入深度以標(biāo)志處為界。讀取動物右后肢的正常體積(ml)，給各組動物分別涂藥物于右后肢，均給藥300mg，30min后在每只鼠右后肢足掌心向踝關(guān)節(jié)方向進行皮下注射1％角叉菜膠液0.1ml/只。其后每30min測定鼠后肢的容積，連續(xù)3次，結(jié)果見表2表2 重樓軟膏對角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足腫脹的影響

與賦形劑對照組比較*P＜0.05，**P＜0.011.3對大鼠棉球肉芽腫試驗取大鼠50只，隨機分5組。腹腔注射巴比妥鈉30mg.kg-1麻醉，在每只鼠的左右蹊部用碘酊消毒，75％酒精棉球脫碘后，各1cm長的小口，用眼科鑷子將20mg的高壓滅菌棉球(青霉素和鏈霉素混合液0.2ml)浸泡，烘干，從切口處植入皮下，隨機縫合皮膚。從手術(shù)當(dāng)日分別涂以重樓凝膠、賦形劑及皮炎平霜，劑量均為300mg/只，涂藥于肉芽腫處，連續(xù)給藥8d，第9天打開原切口將棉球連同周圍結(jié)締組織一起取出，剔除脂肪組織，放烘箱中70℃恒溫烘干，稱重。將稱的重量減去棉球原重量即得肉芽腫重量。比較各組的差異，結(jié)果見表3。
表3 重樓凝膠對大鼠棉球肉芽的影響

與賦形劑對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
2.止痛作用藥效學(xué)試驗對小鼠的鎮(zhèn)痛試驗(熱板法)將熱板預(yù)熱10min，調(diào)節(jié)恒溫水浴裝置，使水溫控制在(75±0.5)℃。取18-22g小鼠50只，隨機分為5組，每次1只放在熱板上，小鼠自放在熱板上至出現(xiàn)舔后足所需時間(s)作為該鼠的痛閥值。舔后足時間小于5s或大于30s或跳躍者棄之不用。將合格的小鼠隨機分為5組，測其常痛閥值(即用藥前痛閥值)。重樓凝膠和賦形劑組動物脊部脫毛涂藥100mg，哌替啶組小鼠腹腔注射0.01g·kg-1，給藥后30、60s，分別測定小鼠痛閥值。如60s仍無反應(yīng)，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閥值以60s計算，結(jié)果見表4。
表4重樓凝膠對小鼠熱板出現(xiàn)痛反應(yīng)時間的影響

與賦形劑對照組比較**P＜0.01，*P＜0.05
(二)重樓總皂苷體外抗病毒試驗1.重樓總皂苷對感染了CVB3病毒的細(xì)胞發(fā)生病變的抑制作用在96孔培養(yǎng)板的Hela單層細(xì)胞內(nèi)，每孔感染CVB3100TCID50，2h后傾去病毒液，分別加入高、中、低濃度的重樓總皂苷，培養(yǎng)96h后觀察細(xì)胞病變。在另一組試驗中，每孔先加入CVB3100TCID50，培養(yǎng)96h后觀察病變(“-”表示無細(xì)胞病變；“+”表示有25％細(xì)胞病變；“++”表示有50％細(xì)胞發(fā)生病變，“+++”表示75％細(xì)胞發(fā)生病變；“++++”表示有100％細(xì)胞發(fā)生病變)。結(jié)果見表5。
表5重樓總皂苷對感染了CVB3病毒的細(xì)胞發(fā)生病變的抑制作用

2.重樓總皂苷對流感病毒的抑制作用將重樓總皂苷配成高、中、低(20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL)三個濃度，取人“O”型血配成0.75％濃度，將細(xì)胞培養(yǎng)(病毒液)25μL，加入微量V型血凝板上進行2倍稀釋，最終稀釋度1∶256，加入0.75％的紅細(xì)胞懸液50μL，37℃1h，觀察紅細(xì)胞凝集，以++為終點，以血凝滴度表示。結(jié)果顯示重樓總皂苷在以上三個濃度下，對A1型流感病毒的血凝滴度分別為1∶4、1∶8、1∶16，對A3型流感病毒的血凝滴度為1∶4、1∶4、1∶8，表明重樓總皂苷對A1和A3型流感病毒具有很好的抑制作用。
(三)重樓總皂苷抗腫瘤細(xì)胞試驗將重樓總皂苷(60％含量)配成高、中、低三個濃度，以人食道癌細(xì)胞Eca-109、胃癌細(xì)胞SGC-7901、白血病細(xì)胞HL-60為對象，進行體外細(xì)胞生長抑制試驗(MTT法)，結(jié)果見表6-8。
表6抑制食道癌細(xì)胞Eca-109生長試驗結(jié)果

表7抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901生長試驗結(jié)果

表8抑制白血病細(xì)胞HL-60生長試驗結(jié)果

具體實施方式
實施例1它重樓飲片1kg，加入6倍量60％的乙醇，回流提取2次，每次提取時間為1小時，合并乙醇提取液，合并后的乙醇提取液離心(轉(zhuǎn)速4000轉(zhuǎn)/分鐘，時間30分鐘)，分出沉淀和上清液，將上清液濃縮至0.25g生藥/ml，靜置過夜后離心，得上清液A及沉淀A’。向沉淀A’中加入相當(dāng)于提取所用生藥量1倍(V/W)的去離子水進行攪拌、洗滌，然后再次離心(轉(zhuǎn)速4000轉(zhuǎn)/分鐘，時間30分鐘)，傾出上清液，得上清液B和沉淀B’；合并上清液A和B，將合并A、B后的上清液通過裝有D101型大孔吸附樹脂(非極性)的層析柱，上清液按重樓總皂苷的量計與干樹脂的比例為1∶4，上柱流速1BV/h，樹脂徑高比為1∶3；用水洗滌樹脂3BV，洗脫流速為1BV/h，水洗脫液棄去；用含65％的乙醇洗脫2BV，流速為1BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.1，與沉淀B’合并，真空干燥(75℃，6h)，即得。所制得的重樓樣品中總皂苷的含量為50％，重樓皂苷I和重樓皂苷II的量合計為10％。
實施例2取重樓飲粗粉1kg，加入12倍量95％的乙醇，回流提取3次，每次提取時間為3小時，合并乙醇提取液，合并后的乙醇提取液離心(轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分鐘，時間90分鐘)；分出沉淀和上清液，將上清液濃縮至1.0g生藥/ml，靜置過夜后離心，得上清液A及沉淀A’，向沉淀A’中加入相當(dāng)于提取所用生藥量5倍(V/W)的去離子水進行攪拌、洗滌，然后再次離心(轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分鐘，時間90分鐘)，傾出上清液。得上清液B和沉淀B’；合并上清液A和B，將合并A、B后的上清液通過裝有AB-8型大孔吸附樹脂(弱極性)的層析柱，上清液按重樓總皂苷的量計與干樹脂的比例為1∶10，上柱流速4BV/h，樹脂徑高比為1∶9；用水洗滌樹脂12BV，洗脫流速為6BV/h，水洗脫液棄去；用含95％的乙醇洗脫6BV，流速為6BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.25，與沉淀B’合并，真空干燥(75℃，6h)，即得。所制得樣品中總皂苷的含量為90％，重樓皂苷I和重樓皂苷II的量合計為20％。
實施例3取重樓飲片1kg，加入8倍量70％的含水醇，回流提取2次，每次提取時間為2小時，合并乙醇提取液，過濾；將過濾后的乙醇提取液濃縮至0.5g生藥/ml，靜置過夜，過濾，得上清液A及沉淀A’，向沉淀A’中加入相當(dāng)于提取所用生藥量2倍量(V/W)的去離子水進行攪拌、洗滌，離心，傾出上清液，得上清液B和沉淀B’；合并上清液A和B，將合并A、B后的上清液通過裝有D101型大孔吸附樹脂(非極性)層析柱，上清液按重樓總皂苷的量計與干樹脂的比例為1∶7，上柱流速2BV/h，樹脂徑高比為1∶5；用水洗滌樹脂5BV，洗脫流速為3BV/h，水洗脫液棄去；用含70％的乙醇洗脫4BV，流速為3BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.15，與沉淀B’合并，真空干燥(75℃，6h)，即得。所制得樣品中總皂苷的含量為65％，重樓皂苷I和重樓皂苷II的量合計為17％。
實施例4重樓總皂苷50g，加入卡波姆940 10g、三乙醇胺6g、甘油50g、乙醇50g、氮酮50g、對羥基苯甲酸乙酯1g，蒸餾水加至1000ml，高速攪拌均勻后制成凝膠劑。
實施例5重樓總皂苷50g，加入羥丙基甲基纖維素50g、氮酮20g、丙二醇50g、苯酚1g、甘油50g、蒸餾水加至100ml，由乳均機混勻后制成凝膠劑。
實施例6重樓總皂苷50g，加入羊毛脂50g、對羥基苯甲酸乙酯0.3g、凡士林加至1000g，制成軟膏劑。
實施例7重樓總皂苷50g，加入硬脂酸300g、三乙醇胺40g、甘油80g、羊毛脂40g、液狀石蠟250ml、蒸餾水1000ml，制成軟膏劑。
權(quán)利要求
1.一種重樓總皂苷的制備方法，其特征在于該方法是重樓飲片或粗粉，加入體積重量比為6～12倍的60％～95％的含水醇，回流提取2～3次，每次提取時間為1～3小時，合并提取液，合并后的提取液離心；分出沉淀和上清液，然后將上清液濃縮至0.2～1.0g生藥/ml，靜置過夜后離心，得上清液A及沉淀A’；向沉淀A’中加入相當(dāng)于提取所用生藥量體積重量比為1～5倍的去離子水進行攪拌、洗滌，然后再次離心，傾出上清液，得上清液B和沉淀B’；合并上清液A和B，將合并A、B后的上清液通過裝有大孔吸附樹脂的層析柱，上清液按重樓總皂苷的量計與干樹脂的比例為1∶4～1∶10，上柱流速1～4BV/h，樹脂徑高比為1∶3～1∶9；用水洗滌樹脂3～12BV，洗脫流速為1-6BV/h，水洗脫液棄去；用含體積比為65～95％含水乙醇洗脫2～6BV，流速為1～6BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.1～1.25，與沉淀B’合并，干燥，即得重樓總皂苷。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法制得的重樓總皂苷在制備抗炎、消腫、止痛的外用藥物、抗病毒藥物、抗腫瘤以及腫瘤輔助治療的藥物中應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的一種重樓總皂苷的制備方法，其特征在于所述的大孔樹脂為非極性和弱極性大孔樹脂中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重樓有效部位－總皂苷的制備方法及其用途。本發(fā)明改變了現(xiàn)有技術(shù)中膜過濾結(jié)合樹脂吸附法中沉淀部分的處理方法，通過酒精提取、膜過濾、丙酮脫脂、樹脂脫色等步驟實現(xiàn)、縮減為僅通過醇提水沉和去離子水洗滌沉淀完成，使得制備工藝顯著簡化。同時，生產(chǎn)過程中減少了乙醇用量，顯著降低了生產(chǎn)成本，省去了丙酮的使用，進一步減少了成本和生產(chǎn)中的危險性；有效成分提取回收率高，含量高，質(zhì)量穩(wěn)定。本發(fā)明還提供了重樓總皂苷作為在制備抗炎、消腫、止痛的外用藥物、抗病毒藥物、抗腫瘤以及腫瘤輔助治療藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P31/12GK1899491SQ20061005222
公開日2007年1月24日 申請日期2006年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日
發(fā)明者張琳, 孫治國, 田景奎, 梁波, 李凌軍 申請人:浙江大學(xué)