專利名稱：一種殺滅癌細(xì)胞、抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗惡性腫瘤的藥物。
背景技術(shù)：
作為腫瘤這種疾病、目前已構(gòu)成主要危害人類死亡的疾病之一。病因不明確。主要治療手段仍是沿用多年的手術(shù)切除，放射療法及化學(xué)療法。傳統(tǒng)的治療方法根治率很低，只能短時(shí)間延續(xù)患者生命和緩解病痛。絕大多數(shù)病人因復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡。以往的中、西治療惡性腫瘤的藥物，目前還沒有哪一種被公認(rèn)是治療惡性腫瘤的救命藥物，而且藥的價(jià)格非常昂貴。尤其是某些中藥，較多采用了名貴、和一些毒性很大的中藥藥材，堅(jiān)持服用這些藥物的病人，為較短的生命延續(xù)時(shí)間，付出了巨大的經(jīng)濟(jì)代價(jià)，多數(shù)病人得到的是人財(cái)兩空的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能殺滅癌細(xì)胞，抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物，提高惡性腫瘤藥物治療的治療效果，使惡性腫瘤的藥物治療在現(xiàn)有技術(shù)的水平上取得較大的進(jìn)步。
本發(fā)明的藥物由以下重量份數(shù)比的原料組成磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-ChitinIII)250-350、抗壞血酸鹽(維生素C)150-250、硝酸鈰30-50、硒酸鈉5-15。
本發(fā)明的藥物原料最佳重量份數(shù)比為磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-ChitinIII)、300、抗壞血酸鹽(維生素C)200、硝酸鈰40、硒酸鈉10。
本發(fā)明的藥物以磺化羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-ChitinIII)為主要活性成分。是基于1.6-0-磺酸化甲殼質(zhì)(S-Chitin)， 和6-0-磺酸化及羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-Chitin)，CH2OCH2COOH.SO3H CH2OCH2COOH.SO3H
具有明顯地抑制瘤細(xì)胞的滲透，并且其滲透通過基質(zhì)的能力與其磺酸化率有關(guān)系。(磺酸化率增高使瘤細(xì)胞滲透被抑制的能力增加)2.SCM-ChitinIII為高磺酸化率的羧甲基SCM-Chitin。
3.SCM-ChitinIII其抗凝活性很低使細(xì)胞遷移率低。(抗凝活性高可使細(xì)胞遷移率高。)4.SCM-ChitinIII能阻斷瘤細(xì)胞向昆布寧包被的底物的攻擊與移行。即意味著阻斷浸潤。
5.SCM-ChitinIII阻斷瘤細(xì)胞的浸潤與轉(zhuǎn)移機(jī)理被認(rèn)為是它與昆布寧分子特異結(jié)合的結(jié)果。
6.一定劑量的SCM-ChitinIII，能抑制肝素酶，即抑制了磺酸類肝素的降解。
7.SCM-ChitinIII能夠抑制瘤細(xì)胞的IV型膠原的水解活性。
8.SCM-ChitinIII的作用1)無毒。2)抵抗凝性。3)抑制肝素酶。4)抑制瘤細(xì)胞對IV型膠原的水解作用。5)它與昆布寧結(jié)合而使瘤細(xì)胞浸潤與轉(zhuǎn)移作用減弱。
本發(fā)明以微量元素硒為輔助成份是基于微量元素硒是抗氧化劑，又是谷胱甘肽過氧化物酶的重要成分，可抑制過氧化反應(yīng)，分解過氧化物，清除自由基及修復(fù)生物膜，保護(hù)易被氧化的物質(zhì)。含硒化合物可降低化學(xué)致癌物質(zhì)與DNA共價(jià)結(jié)合，硒能參與并促進(jìn)體內(nèi)多種抗氧化硒的合成，低水平硒會(huì)使酶的活性下降而導(dǎo)致癌的發(fā)生與發(fā)展，緩解氧化壓力。硒化合物可調(diào)整和激活身體免疫功能，能從多方面預(yù)防癌癥發(fā)生及間接抑制癌腫瘤的生長。
本發(fā)明以稀土元素鈰為輔助成份，是基于在用稀土元素進(jìn)行抵抗腫瘤細(xì)胞生長的免疫實(shí)驗(yàn)中，證明稀土元素(鈰、鑭等)有較強(qiáng)的絡(luò)合作用，可對細(xì)胞DNA進(jìn)行剪切，并對細(xì)胞內(nèi)多種酶活性有提高或抑制作用。對惡性腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺滅能力，能主動(dòng)向癌細(xì)胞進(jìn)攻，將癌細(xì)胞消滅在萌芽狀態(tài)。小鼠口服鈰后，自然殺傷細(xì)胞攻擊癌細(xì)胞的能力提高了38％。機(jī)體一體免疫功能也大有改善。鈰在調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因方面也證實(shí)有十分有益的作用。它能清除體內(nèi)有害的自由基外，還可使癌細(xì)胞內(nèi)的鈣調(diào)素水平降低，抑癌基因水平上升。表明鈰的抑癌作用可能是通過使癌細(xì)胞惡性程度下降來實(shí)現(xiàn)的，說明鈰對腫瘤的防治有確切的作用。
維生素C是公認(rèn)的抗氧化劑，能保護(hù)磺化羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-ChitinIII)不被氧化。并且與亞硒酸納協(xié)同對肝癌細(xì)胞有逆轉(zhuǎn)作用。
本發(fā)明的積極效果在于利用對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用SCM-ChitinIII和對惡性腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺滅能力稀土元素鈰及抗氧化劑硒和維生素C組成防治惡性腫瘤的藥物，其中的各原料成分相互協(xié)同，在抑制惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和殺滅腫瘤細(xì)胞具有突出的效果，有望使惡性腫瘤得到治愈，或大大地減少腫瘤病人的死亡。甚到可避免手術(shù)，放射與化療來實(shí)現(xiàn)治愈腫瘤。
本發(fā)明的藥物為口服藥，首選劑型為膠囊，裝入膠囊的磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)、抗壞血酸鹽、硝酸鈰、硒酸鈉均為粒度60目的藥粉。
本發(fā)明的藥物服用量為日服2次，每次用量按純藥計(jì)550mg，即磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)300mg、抗壞血酸鹽200mg、硝酸鈰40mg、硒酸鈉10mg。
本發(fā)明的藥物也可以和現(xiàn)有的各種藥用載體和/或賦形劑混合，制成其他口服劑型。
藥效實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用體外、針對體內(nèi)方法，研究已純化并修飾的羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-Chitin)惡性腫瘤細(xì)胞株體外粘附性、浸潤性、遷移性及腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)酶的降解等影響，同時(shí)制備體內(nèi)動(dòng)物模型，通過光鏡觀察和比較SCM-Chitin對腫瘤細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)移等影響。
一、SCM-ChitinIII抑癌轉(zhuǎn)移作用的體外研究(一)CM-Chitin對惡性腫瘤細(xì)胞株體外粘附性的檢測用RPMI-1640(含15％小牛血清和雙抗)將細(xì)胞制成密度為2×106/ml細(xì)胞懸液，加入12孔板，每孔加入1×106/0.2ml，同時(shí)加入不同濃度的SCM-Chitin(200ug/ml，300ug/ml，400ug/ml，500ug/ml)。
對照組不加SCM-Chitin。置CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)30分、60分、90分、120分鐘。取出后棄去未粘附細(xì)胞，胰酶消化，收集粘附細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)算、比較兩組粘附率。
(一)SCM-ChitinIII對ACC-M細(xì)胞浸潤抑制檢測1、濾膜準(zhǔn)備選用孔徑為80μm濾膜(Polyvinylpyrrolidone-freepolycarbonate)，其表面鋪有Matrigel(100μg/ml)，下面鋪有Fibronectin(100μg/ml)或鼠尾膠原。
2、Transwell小室，在下室加培養(yǎng)液，上室加密度為2×106/ml腫瘤細(xì)胞懸液和不同濃度的SCM-Chitin，對照不加SCM-Chitin。置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)8h、10h、12h后，取出濾膜，甲醇固定，HE染色，除去濾膜上表面的細(xì)胞，在放大400倍的光鏡下，計(jì)算、比較兩組通過濾膜進(jìn)入下表面的細(xì)胞數(shù)。
(二)SCM-ChitinIII對腫瘤細(xì)胞遷移性的影響將密度為2×106/ml腫瘤細(xì)胞懸液接種至預(yù)先在濾膜下表面鋪有Fibronectin或鼠尾膠原的上室中。不同濃度的SCM-Chitin加入下室，對照不加SCM-Chitin。置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)6h、8h、10h、12h后，固定，染色，計(jì)算、比較兩組通過濾膜進(jìn)入下表面的細(xì)胞數(shù)。
(三)SCM-ChitinIII對腫瘤細(xì)胞下基質(zhì)酶的降解作用1、H標(biāo)記從EHS腫瘤中提取并純化的IV型膠原。
2、將標(biāo)記的IV型膠原鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。
3、加入不同濃度的SCM-Chitin，孵育3h，加入腫瘤細(xì)胞懸液，孵育24h、48h、72h后，提取上清夜，檢測IV型膠原水解度。
二SCM-ChitinIII抑制ACC-M轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究將實(shí)驗(yàn)分為三組1、將ACC-M經(jīng)裸小鼠尾靜脈注射，造成肺轉(zhuǎn)移灶。
2、在注射ACC-M之前，服用不同濃度SCM-ChitinIII 6、8、10周。
3、在肺轉(zhuǎn)移灶形成后，服用不同濃度SCM-ChitinIII 6、8、10周通過光鏡觀察和比較不同濃度的SCM-ChitinIII對腫瘤細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)移等影響。
三、磺酸化甲殼質(zhì)衍生物抑制黑色素瘤的轉(zhuǎn)移是通過細(xì)胞外基質(zhì)和酶的降解的研究材料和方法B16-BL6黑色素瘤是一種高轉(zhuǎn)移瘤株，獲得它是通過腫瘤浸潤期分離篩選而成，由Dr.J.J.Fidler腫瘤中心，TX提供。黑色素瘤細(xì)胞在MEM中單層培養(yǎng)保持存在，內(nèi)含7.5％FBS中有維生素溶液，丙酮酸鈉，非必須氨基酸和L-谷氨酸。
甲殼質(zhì)來自于螃蟹殼，用常規(guī)方法在使用前將其碎至45～60目。CM-甲殼質(zhì)的制備，羧甲基度在0.40，0.56，和0.80，在使用之前甲殼質(zhì)衍生物用PBS溶解。
肝素鈉鹽(Lot TLP 3856；活性197.1units/mg)從Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd，Osaka，日本購之。
純化的鼠的纖維連結(jié)蛋白從Seikagaku Kogyo Co，Ltd，東京日本購買。
純化的鼠的昆布寧和基底膜膠質(zhì)(含昆布寧、IV型膠原、磺酸化肝素蛋白糖和entactin)從Collaborative Reseerch，Inc獲得。
Bedford，MA，所有的試劑和介質(zhì)均有很低的內(nèi)毒素(＜1.0mg/ml)，是由比色法來測試的。(Pyrodck；Seikagaku Kogyo Co.Ltd.東京日本)細(xì)胞黏附微量試驗(yàn)。通過資料所述的方法作出細(xì)胞浸潤模型，B16-BL6黑色素細(xì)胞在MEM培養(yǎng)基中[內(nèi)含5％FBS，加入0.3×μci/ml的[125I]碘脫氧尿嘧啶核苷(特異活性，200mci/mmol；新英格蘭原子能，Boswn，MA)]培養(yǎng)24小時(shí)，以對數(shù)生長相的方式進(jìn)行。然后，細(xì)胞用2倍體積的溫的PBS洗，以除去未結(jié)合上的放射性校記物，再通過加入0.02％EDTA，溫度37℃，1分鐘后收集，在冷的沒有血清存在下的MEM下再被懸浮，以形成細(xì)胞單個(gè)懸浮。在125I-碘脫氧尿嘧啶核苷-瘤細(xì)胞，(2×104)以0.05～1/洞加入，微量培養(yǎng)洞預(yù)先用昆布寧包被處理。培養(yǎng)在37℃，30分鐘，然后用其4倍體積的PBS洗，除去未浸潤的細(xì)胞。與基質(zhì)結(jié)合上的瘤細(xì)胞用0.1N NaOH.0.1ml溶解之溶解物用棉花簽吸之，再用r-計(jì)數(shù)器測之放射性，結(jié)合率(細(xì)胞結(jié)合數(shù)量/底物)用下列公式表示之 結(jié)合遷移實(shí)驗(yàn)。瘤細(xì)胞在細(xì)胞移動(dòng)培養(yǎng)室內(nèi)沿著與纖維連結(jié)蛋白或昆布寧結(jié)合的基質(zhì)的梯度移動(dòng)(Transwell Cell Culture Chembers即No.3422；Costar，Carmbrige，MA)參照或按McCarthy等人報(bào)導(dǎo)的方法，以及按改良的方法進(jìn)行。不含有碳酸鹽的吡咯吲嗓聚維尼龍濾器，其孔徑是8.0μm的微孔(Nucltopore，Pleasanton，CA)。在培養(yǎng)濾器(膜)的下部預(yù)先用5μg的纖維連結(jié)蛋白或昆布寧，其體積是50μl來包被，然后室溫下過夜干燥。包被上的濾器膜用PBS充分地洗滌，然后迅速干燥之。腫瘤細(xì)胞的對數(shù)方式培養(yǎng)后用含1mM的EDTA的PBS(洗滌)收集。再用3倍的不含MEM的血清洗滌，再用含0.1％的BSA的MEM懸浮至濃度為2×106/ml。將懸浮的細(xì)胞(100μl)分別加入(實(shí)驗(yàn)組)及不加入(對照組)實(shí)驗(yàn)用藥到膜上室內(nèi)，然后在5％CO2氣供給下進(jìn)行數(shù)小時(shí)孵育。然后濾膜用甲烷固定，用蘇木精及伊紅染色。在濾膜上池的細(xì)胞用棉簽檫的方式移出。從膜上移至膜下(通過濾膜)進(jìn)入下室各處的細(xì)胞在400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)，試驗(yàn)的每一樣品均為一式三份進(jìn)行。
侵潤試驗(yàn)。腫瘤侵潤活性是由Albini等人報(bào)導(dǎo)的方法來進(jìn)行的。也有些改良方法簡言之，用纖維連結(jié)蛋白或昆布寧來包被濾膜下表面(下池)，方法同前述。用冷的PBS來稀釋基質(zhì)膠達(dá)100μg/ml，使濾膜(器)的上層表面含5μg/filter使其在室溫下遮蓋干燥。然后該濾膜分別地用基質(zhì)膠/昆布寧或基質(zhì)膠/纖維連結(jié)蛋白包上被膜，以后的程序與肝素轉(zhuǎn)移的方法相同。浸潤的細(xì)胞通過基質(zhì)膠與濾膜到濾膜器的下層表面，然后被計(jì)數(shù)。
肝素結(jié)合實(shí)驗(yàn)?！?H〕肝素(放射活性0.49mci/mg；Du pont-New England，核研究產(chǎn)物Boston.MA)與昆布寧和BSA結(jié)合的定量試驗(yàn)是通固相放免法，是在96孔組織培養(yǎng)板來完成的。昆布寧(3μg/60μl.每3L，)被加入，寶溫干燥過夜。含有緩沖液的BSA(2mg/ml在6mM的磷酸，0.1MNaCl，68μM CaCl，pH6.8的溶液中。)加到再孔之中，然后37℃孵育2小時(shí)。除去緩沖液，將〔3H〕-肝素標(biāo)記物(肝素標(biāo)記物的放射活性為5×104dpm/0.05μ℃g)在50μl的體積，37℃孵育2h，其中有未標(biāo)記的肝素與甲殼質(zhì)衍生物存在與不存在兩個(gè)組。用含有0.1％3-〔(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio〕-1-Propanesulfonate的緩沖液洗3次，以除去未標(biāo)記上的肝素標(biāo)記物。被標(biāo)記上的標(biāo)記物通過用200μl的0.5N NaOH〔內(nèi)含硫酸十二酯)37℃孵育30′，然后液爍記數(shù)統(tǒng)計(jì)。
肝素酶的制備。肝素酶是從B16-BL6細(xì)胞中抽提出來的，使用肝素-瓊脂糖(偶聯(lián)體)和伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖(偶聯(lián)體)層析來完成。首先，用B16-BL6黑色素細(xì)胞(2×108)，它來自于部分融合培養(yǎng)在DME∶F12為1∶1的混合基質(zhì)，內(nèi)含5％的胎牛血清。提取是在0.5％Triton X-100，內(nèi)含1mM的苯甲磺酰氟，5mM N-ethylmaleimide，50mM Tris-HCl，pH7.5(緩沖液1)在4℃，30分鐘條件下進(jìn)行。提取物被離心，30000×g，30分鐘。上清大約含有100mg的蛋白質(zhì)作為層析樣品。肝素-瓊脂糖柱用緩沖液1來平衡，流速為30ml/h。平衡后再用200ml的緩沖液1,200ml的0.2％Triton×-100∶20mM醋酸鈉pH6.0(即緩沖液2)，以及用300ml的0.5M的氯化鈉20mM醋酸鈉，pH6.0(即緩沖液3)，約用10小時(shí)洗之。結(jié)合上的肝素-蛋白質(zhì)，用氯化鈉及醋酸鈉(20mM)pH6.0的梯度洗脫(0.15-1.2mol)，有活性的肝素酶被收集，然后對緩沖液3進(jìn)行透析，然后再離心1s30000×g，30分鐘。其上清夜上伴刀豆蛋白A-瓊脂糖柱(柱床體積為50ml)，用緩沖液3來平衡。在用200ml緩沖液3洗柱4小時(shí)后，與半刀豆球蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)用200ml，內(nèi)含1.0Mα-methyl-D-mannopyranoside的緩沖液3來洗脫。洗脫物被收集后再被濃縮，用Amicon濃縮器，YM-10型號(hào)的膜來濃縮。部分純化的肝素酶的特異活性是通過對3H-標(biāo)記的HS降解產(chǎn)物的分析來測定的這可在肝素酶抑制試驗(yàn)中來討論。在研究中，使用肝素酶中含有0.89mg/ml的蛋白質(zhì)和降解60μg的HS(底物)/ml的蛋白質(zhì)/h.在37℃。
肝素酶抑制試驗(yàn)。肝素酶抑制試驗(yàn)的理論根據(jù)文獻(xiàn)提及的方法HS(M34000)是從小牛肺被純化而來，其部分被N-脫磺酸基然后用〔3H〕-乙醋酐進(jìn)行乙酰化。用3H-標(biāo)記的HS(5μg)來孵育，條件37℃.3h.加26.7μg的部分純化的肝素酶於50μl的0.2M醋酸鈉的緩沖液之中，pH5.6。其中加入各不同濃度的修飾后的甲殼質(zhì)，以及空白等各管。孵育終結(jié)后加熱100℃.5′，煮沸后冷卻之，再離心18000g.5′?！?H〕HS的降解產(chǎn)物，取25μl的懸浮液用排組色譜層析進(jìn)行分析，使用Waters600E高效液相系統(tǒng)(Waters Milford，MA)用一個(gè)生物膠TSK-30-XL柱(300×7.5mm；Bio-Rad，Richmond，CA)。洗柱用12.5mMTris-HCI0.15M NaCI，pH7.5，流率0.5ml/分鐘，在23℃下進(jìn)行。樣品洗脫，塑管/30秒，7ml/塑管，每管加3ml的閃爍液(NaTionalDiagnostics，Manville，Nj)，每部分(管)放射活性使用LS2800液爍計(jì)數(shù)儀來測定(Beckman Irvine，CA)，(A).肝素酶的活性通過色譜〔3H〕HS℃峰整個(gè)半面積的減少來確定。
3H-標(biāo)記的IV型膠原的制備。從EHS瘤株純化IV型前膠原，其前膠原是在C57BL/6小鼠體內(nèi)生長的(在Nakajima等人的文獻(xiàn)中論述的)其乙?；谩?H〕標(biāo)記的乙酰酐來?；?，然后IV型膠原溶液(3mg/ml)溶于0.2M的乙酸中，再用2M的醋酸鈉調(diào)pH至8.0。再立即用1mci的〔3H〕乙酰酐(溶液50μl苯溶液)混合(100mci/mmol；ICN Radiochemicals，Lrvine CA)然后4℃孵育16h，〔3H〕標(biāo)記的IV型膠原溶液在3ml 0.5M的醋酸之中再用4升的0.2M醋酸，4℃透析6h，如此反復(fù)4次，3H-標(biāo)記的IV型膠原的放射活性應(yīng)是2220dpm/μg。
IV型膠原水解試驗(yàn)?！?H〕標(biāo)記的IV型膠原(20μg/孔)被放置在48-3L組織培養(yǎng)板的每孔內(nèi)(Costar，Cambriage MA)再吹干，過夜。將DMEF12介質(zhì)(500μl)加入到干燥了的IV型膠原膜上，再于37℃孵育3h。然后，再用新鮮的DMEF12介質(zhì)，內(nèi)含各種硫酸化甲殼質(zhì)衍生物(400μg/ml)更換之，同樣37℃孵育3h。B16-BL6(5×104)細(xì)胞被懸浮在含有0.5％BSA(小牛血清)的DMEF12介質(zhì)，然后在37℃下孵育，在humidifed孵育箱中(5％CO2∶95％空氣)。孵育48小時(shí)后，培養(yǎng)的上清被吸出，再用100μl的內(nèi)含50％三氯醋酸的水溶液來沉之，之后離心18000g，IV型膠原的水解活性是通過測定上清液的放射活性來計(jì)算。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對兩組進(jìn)行T檢查進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
結(jié)果甲殼質(zhì)衍生物對腫瘤細(xì)胞浸潤的抑制。我們首先在體外進(jìn)行了甲殼質(zhì)衍生物和肝素對B16-BL6黑色素細(xì)胞生長的直接作用。瘤細(xì)胞用500μg/ml的甲殼質(zhì)衍生物來孵育不能使〔3H〕胸腺嘧啶與瘤細(xì)胞摻入。重組體IFN-r(103單位)/ml在體外有明顯的抑制細(xì)胞生長的作用。第二步我們進(jìn)行了甲殼質(zhì)衍生物和肝素對黑色素瘤細(xì)胞浸潤作用的影響試驗(yàn)，這要使用基底膜基質(zhì)再建的方式來完成。(表2)將瘤細(xì)胞加入到Transwell Cham bers的上室，在Transwell Cham bers的上室內(nèi)設(shè)其甲殼質(zhì)衍生物及肝素存在與空白等組。SCM-Chitin II和SCM-ChitinIII，指C6位上不同量的硫酸化和羧甲基基團(tuán)的量，以及肝素均能抑制瘤細(xì)胞的浸潤，是通過基底物質(zhì)/纖維連結(jié)蛋白和基底物質(zhì)/包被的混布寧的通透來證實(shí)的(或移動(dòng))。而CM-Chitin和N-脫乙酰甲殼質(zhì)衍生物，SCM-殼聚糖就無此作用。
硫酸化甲殼質(zhì)衍生物對腫瘤細(xì)胞器的影響。腫瘤細(xì)胞被粘附在細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜上，被認(rèn)為是細(xì)胞浸潤的早期階段，這也是細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程。我們第二步的試驗(yàn)，將證實(shí)硫酸化甲殼質(zhì)衍生物對B16-BL6細(xì)胞在預(yù)先用混布寧包被的基底物質(zhì)上的黏附的影響，其基底物質(zhì)主要是基底膜物質(zhì)125I-標(biāo)記的B16-BL6細(xì)胞被加入到用昆布寧包被的Transwell，其試驗(yàn)設(shè)有含有硫酸化甲殼質(zhì)衍生物及空白不含有的對照組。6-0-硫酸化甲殼質(zhì)，以及肝素均具有明顯地抑制腫瘤細(xì)胞黏附于混布寧包被的Transwell。(P＜0.01)反之，CM-甲殼質(zhì)確無此作用。SCM-甲殼質(zhì)確無此作用。SCM-甲殼質(zhì)I、II和III均有抑制瘤細(xì)胞的粘附作用，但它是隨硫酸化率的增高而作用加強(qiáng)。相反，SCM-殼聚糖確無此作用，即使6-0和N-端完全硫酸化也無該作用。
用SCM-甲殼質(zhì)III處理的瘤細(xì)胞或混布寧底物對瘤細(xì)胞遷移的影響。我們所做的實(shí)驗(yàn)是使用SCM-甲殼質(zhì)III來預(yù)處理或不處理(空白)瘤細(xì)胞，以及混布寧底物，來看瘤細(xì)胞的移動(dòng)率。瘤細(xì)胞移動(dòng)到被固定在Transwell濾膜下面的混布寧處，被阻止是由于加入SCM-甲殼質(zhì)III或肝素〔3H〕-肝素預(yù)Transwell下室的緣故。用SCM-甲殼質(zhì)III或肝素預(yù)處理混布寧包被的濾膜引起腫瘤細(xì)胞移動(dòng)受阻。相反瘤細(xì)胞不被預(yù)處理，則無此現(xiàn)象。CM-甲殼質(zhì)無論用什么方式來處理也沒有抑制瘤細(xì)胞的移動(dòng)作用。我們觀察到，孵育2小時(shí)后〔3H〕-肝素與混布寧是主要的結(jié)合形式，在這一試驗(yàn)中，〔3H〕-肝素加入到用混布寧包被的室孔內(nèi)，其中有未標(biāo)記的肝素或硫酸化甲殼質(zhì)的衍生物存在及不存在(空白)等組，作為抑制劑用。Fig4表明依據(jù)其不同濃度，未標(biāo)記的肝素或SCM-甲殼質(zhì)III完全地抑制〔3H〕-標(biāo)記肝素與混布寧的結(jié)合(即抑制了轉(zhuǎn)移)。相反，SCM-甲殼質(zhì)I和CM-甲殼質(zhì)對腫瘤細(xì)胞的浸潤、黏附和遷移沒有作用。我們發(fā)現(xiàn)，加入SCM-甲殼質(zhì)III或沒標(biāo)記的肝素1個(gè)小時(shí)內(nèi)有70-80％混布寧-〔3H〕-肝素結(jié)合體被拆開，表明SCM-甲殼質(zhì)III和肝素對混布寧的結(jié)合是可逆的。硫酸化甲殼質(zhì)衍生物對瘤細(xì)胞外基質(zhì)酶降解的影響。在浸潤急性期，瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的蛋白水解酶和糖甙降解酶是使瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的主要因子，其機(jī)制是破壞了由纖維連結(jié)蛋白和硫酸化氨基多糖所構(gòu)成的幾道結(jié)締組織屏障所改瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。值得注意的是，肝素能抑制黑色素瘤的硫酸化肝素的降解。因此，我們研究硫酸化的甲殼質(zhì)衍生物是否有一個(gè)抵抗凝的性質(zhì)，SCM-甲殼質(zhì)III能抑制瘤細(xì)胞外基質(zhì)的酶的降解，SCM-甲殼質(zhì)III以及肝素通過存化的肝素酶能抑制HS的降解(硫酸化肝素)，其肝素酶來自于B16-BL6細(xì)胞，同時(shí)還要取決于其濃度與方法。CM-甲殼質(zhì)不能抑制瘤細(xì)胞對再建基底膜基質(zhì)的浸潤以及除了1000μg/ml濃度外的一些濃度也不能抑制HS的降解。另一方面，SCM-甲殼質(zhì)IIIB16-BL6細(xì)胞對IV型3H〕-標(biāo)記膠原的水解作用可直接用3H-標(biāo)記的IV型前膠原來進(jìn)一步研究，其前膠原可從EHS瘤株存化獲得。因?yàn)檠宄煞菽苡绊憗碜杂诹黾?xì)胞的IV型前膠原水解酶的活性。產(chǎn)生幾釋放(5)該實(shí)驗(yàn)使用小牛血清(BSA)。在放入B16-BL6細(xì)胞前，將干燥的IV型膠原與甲殼質(zhì)衍生物和肝素孵育3小時(shí)，然后再加入B16-BL6細(xì)胞，用400μg/ml的SCM-甲殼質(zhì)來施實(shí)，IV型膠超過75％的降解被抑制，而用肝素大約有20％的降解被抑制。CM-甲殼質(zhì)在IV型膠原的水解中沒有抑制作用。在加入B16-BL6細(xì)胞3個(gè)小時(shí)后，再將SCM-甲殼質(zhì)III加入到IV型膠原中，其IV型膠原的水解活性沒被觀察到，以作為未施實(shí)對照組和比較。
四、稀土硝酸鈰對喉癌細(xì)胞株Hep-2生長的抑制作用1、材料和方法1.1癌細(xì)胞株人喉癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞。
1.2硝酸鈰培養(yǎng)濃度將硝酸鈰加入培養(yǎng)體系中，調(diào)整其終濃度為0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2mmol/L。
1.3喉癌Hep-2細(xì)胞單層培養(yǎng)方法取培養(yǎng)瓶內(nèi)指數(shù)生長期的Hep-2細(xì)胞，經(jīng)0.25％的胰酶消化后，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)配成1×105/ml細(xì)胞懸液，接種于96孔板內(nèi)，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5％CO2培養(yǎng)。硝酸鈰組(10個(gè)復(fù)孔)在培養(yǎng)24h后加入硝酸鈰溶液并調(diào)節(jié)為相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)終濃度。連續(xù)培養(yǎng)3d，而對照組則連續(xù)培養(yǎng)4d。
1.4體外檢測硝酸鈰對Hep-2細(xì)胞生長影響的實(shí)驗(yàn)方法1.4.1MTT實(shí)驗(yàn)[2]癌細(xì)胞生長抑制率計(jì)算

1.4.2Hep-2細(xì)胞軟瓊脂克隆形成率測定[3]采用雙層瓊脂法，在每個(gè)平皿接種的細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)，其中瓊脂培養(yǎng)基中含有系列濃度梯度的硝酸鈰，以37℃、5％CO2在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10d，以104個(gè)細(xì)胞中形成的細(xì)胞克隆數(shù)計(jì)算。計(jì)算公式如下

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用x±s表示，采用t或t′檢驗(yàn)。
2、結(jié)果2.1硝酸鈰對喉癌Hep-2細(xì)胞增殖的影響硝酸鈰從0.4mmol/L起，細(xì)胞其細(xì)胞培養(yǎng)孔的光密度便開始下降，尤其是0.8-3.2mmol/L范圍中，光密度下降更為明顯，見表1。
表1 硝酸鈰對喉癌細(xì)胞增殖的影響(x±s)

注*與0濃度組比較，P＜0.05
2.2硝酸鈰對喉癌Hep-2細(xì)胞軟瓊脂克隆形成率的影響在0.4mmol/L濃度以上，硝酸鈰對Hep-2細(xì)胞軟瓊脂克隆形成率呈抑制狀態(tài)，見表2。
表2硝酸鈰對喉癌細(xì)胞克隆形成率的影響(x±s)

注*與0濃度組比較，P＜0.05由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見稀土元素鈰對惡性喉癌細(xì)胞有明顯的抑制增殖作用。亦有研究證實(shí)稀土元素對Lewis肺癌、Sigo肉瘤也有明顯的抑制作用。
五、硒酸鈉對人前列腺癌細(xì)胞PC-3細(xì)胞株活力和增殖的抑制1、材料和方法1.1材料、儀器 人前列腺癌細(xì)胞PC-3購自上海細(xì)胞所細(xì)胞庫，硒酸鈉和MTT購自Sigma公司，胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司，優(yōu)質(zhì)小牛血清(中國杭州四季青生物技術(shù)公司)，3H-TdR購自中國原子能研究所。冷凍離心機(jī)(Heraeus公司，400R)，CO2培養(yǎng)箱(Heraeus，BB5060UV)，BHC-1300生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad 550)，ZT-III型多空細(xì)胞樣品收集器，Beckman LS-6500液閃計(jì)數(shù)儀。
1.2PC-3細(xì)胞的培養(yǎng) 將購買的細(xì)胞培養(yǎng)于RP-MI-1640培養(yǎng)基中(其中添加10％小牛血清，100u/ml青霉素100μg/ml鏈霉素)，細(xì)胞傳代使用0.25％胰蛋白酶消化，每2天換1次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至一定規(guī)模時(shí)，用胰酶消化獲得細(xì)胞，PBS多次洗滌，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至105個(gè)/ml，將細(xì)胞接種到96孔板中，每孔0.1ml，細(xì)胞接種后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，然后用于不同的實(shí)驗(yàn)。
1.3MTT法檢測細(xì)胞的活力 將96孔板中的細(xì)胞分為4組，分別為對照組，分別為對照組，硒酸鈉抵、中、高劑量組。對照組用普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，硒酸鈉作用組用添加了硒酸鈉的培養(yǎng)基培養(yǎng)，藥物終濃度分別為5、10和15μmol/L。加藥后分別繼續(xù)培養(yǎng)24和48小時(shí)，然后每孔加MTT200μl(5mg/ml)，4小時(shí)后棄去培養(yǎng)基，每孔加二甲基亞砜100μl，酶標(biāo)儀上測定A570nm。
1.43H-TdR摻入實(shí)驗(yàn) 按上述方法以不同濃度的硒酸鈉處理細(xì)胞48小時(shí)后，加入3H-TdR(5×104Bq/cell)，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后，用胰酶消化細(xì)胞，用多空樣品收集器收集細(xì)胞于999型纖維膜上，烘干加閃爍液，于Beckman LS-6500液閃計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)〔13，14〕。
1.5統(tǒng)計(jì)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)方法為t檢驗(yàn)，結(jié)果以(x±s)表示。
2.結(jié)果硒酸鈉對PC-3細(xì)胞活力的抑制。由表1可見硒酸鈉可抑制PC-3細(xì)胞活力。24小時(shí)作用時(shí)，硒酸鈉中劑量組A值顯著地低于對照組，高劑量組A值與對照組有極顯著差異。48小時(shí)作用時(shí)硒酸納低劑量組A值顯著低于對照組中劑量和高劑量組A值與對照組有極顯著差異。
表1 硒酸納對PC-3細(xì)胞活力的影響

與對照組相比，*P＜0.05；#P＜0.01。
硒酸納對PC-3細(xì)胞細(xì)胞增殖的抑制48小時(shí)的硒酸納處理后，可抑制PC-3細(xì)胞的增殖，低劑量組(2057±217)cpm與對照組(2110±268)cpm與對照組相比差異有顯著性，高劑量組(1704±165)cpm與對照組相比，差異有極顯著性，并且硒酸納對細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)。
六、維生素C抗氧化的實(shí)驗(yàn)研究研究證實(shí)，維生素C有很強(qiáng)的抗氧化作用，它將氧化物質(zhì)還原，保護(hù)了有生物活性的物質(zhì)不被氧化或延長發(fā)揮其生物活性。
維生素C抗氧化實(shí)驗(yàn)1、原理維生素C能還原2，6二氯酚靛酚，同時(shí)本身被氧化成脫氫維生素C，既將氧化物質(zhì)還原，達(dá)到抗氧化作用。
維生素C 2，6二氯酚靛酚(氧化型)
脫氫維生素C 2，6二氯酚靛酚(還原型)2、材料與方法2.1材料2，6二氯酚靛酚(上?；瘜W(xué)試劑公司)維生素C(既抗壞血酸)(上海醫(yī)藥公司)2.2方法2，6二氯酚靛酚在鹼性或中性環(huán)境中呈藍(lán)色，在酸性溶液中為淺紅色，被還原后無色。用2，6二氯酚靛酚滴定維生素C，滴至全部溶液呈淺紅色(約15稱不退色)既達(dá)終點(diǎn)。此時(shí)表示溶液中的維生素C已被全部氧化。以滴定時(shí)所需要2，6二氯酚靛酚的量計(jì)算出所消耗的維生素C的量。
公式N標(biāo)·V標(biāo)＝N測·V測3、結(jié)果0.088mg維生素C氧化0.01N 2，6二氯酚靛酚1ml。
注由上述實(shí)驗(yàn)及化學(xué)反應(yīng)式可見維生素C是很強(qiáng)的抗氧化劑。在組織與細(xì)胞內(nèi)將氧化物質(zhì)還原而達(dá)到保護(hù)SCM-Chitin的作用。
七、抗壞血酸和亞硒酸鈉對肝癌細(xì)胞影響的研究采用細(xì)胞倍增時(shí)間、分裂指數(shù)、生化變化和軟瓊脂克隆形成率等指標(biāo)測定分化，研究了抗壞血酸和亞硒酸納對人肝癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的作用。結(jié)果表明用抗壞血酸4mmol·L-1聯(lián)合亞硒酸納2μmol·L-1處理細(xì)胞后，細(xì)胞的生長率和有絲分裂指數(shù)都顯著下降。一些與細(xì)胞惡性表型有關(guān)的指標(biāo)，如細(xì)胞表面電荷明顯下降電泳率從1.74μm·s-1·V-1·cm-1下降到0.91μm·s-1·V-1·un-1，甲胎蛋白含量從331μg·g-1(蛋白)下降到90μg·g-1，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性從0.74U·g-1(蛋白)下降到0.19U·g-1。與細(xì)胞分化有關(guān)的指標(biāo)，如酪氨酸-α-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)的活性從14.7μmoml·g-1(蛋白)升高至42.6μmoml·g-1，軟瓊脂克隆形成能力下降94.7％。由此可見，抗壞血酸和亞硒酸納聯(lián)合能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞在分化，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性表型。
具體實(shí)施例方式
1、羧甲基甲殼質(zhì)(SCM-Chitin)的制備磺酸黃甲殼質(zhì)來自于螃蟹殼，用常規(guī)方法在使用前將其粉碎至45～60目。CM-甲殼質(zhì)制備，羧甲基度可用0.40，0.56，和0.80的?；撬峄募讱べ|(zhì)和CM-甲殼質(zhì)是用Horton和Just的-般方法制備的。簡言之，甲殼質(zhì)和CM-甲殼質(zhì)是重蒸的吡啶來除去水然后在用吡啶懸出來處理?；酋Ｂ人?吡啶的混合物加入到甲殼質(zhì)懸液之中，混合物在攪拌下沸騰回流90分鐘。上清夜被輕輕地傾棄，將殘?jiān)鼞以诒?，然后?MnaOH調(diào)pH9。加以醇使沉淀形成，再在水中溶之，然后用無離子水透析，除去游離的鹽，然后凍干。
取制得的磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)300重量份和購得的抗壞血酸鹽200重量份，硝酸鈰40重量份，硒酸鈉10重量份粉碎成60目的粉末，裝入現(xiàn)有的藥用膠囊，即完成本發(fā)明的藥物的制備。
權(quán)利要求
1.一種殺滅癌細(xì)胞，抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物，其特征是由以下重量份數(shù)比的原料組成磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)250-350、抗壞血酸鹽150-250、硝酸鈰30-50、硒酸鈉5-15。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種殺滅癌細(xì)胞，抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物，其特征是所用原料重量份數(shù)比為磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)300、抗壞血酸200、硝酸鈰40、硒酸鈉10。
全文摘要
一種殺滅癌細(xì)胞，抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物，本發(fā)明的藥物由以下重量份數(shù)比的原料組成磺酸化羧甲基甲殼質(zhì)(SCM－ChitinIII)250－350、抗壞血酸鹽(維生素C)150－250、硝酸鈰30－50、硒酸鈉5－15。發(fā)明的積極效果在于利用對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用SCM－ChitinIII和對惡性腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺滅能力稀土元素鈰及抗氧化劑硒和維生素C組成防治惡性腫瘤的藥物，其中的各原料成分相互協(xié)同，在抑制惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和殺滅腫瘤細(xì)胞具有突出的效果，有望使惡性腫瘤得到治愈，或大大地減少腫瘤病人的死亡。甚到可避免手術(shù)，放射與化療來實(shí)現(xiàn)治愈腫瘤。
文檔編號(hào)A61K33/04GK1927221SQ20061001681
公開日2007年3月14日 申請日期2006年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日
發(fā)明者馮延民 申請人:姚春陽, 馮延民