專利名稱：截短的lhrh制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含截短形式的LHRH與T輔助細胞表位的肽。這些制劑可用于在動物體內增加針對LHRH的抗體。
背景技術：
任何能誘導有效抗體應答的肽必須含有被免疫系統(tǒng)識別的特定氨基酸序列，稱為表位。尤其是在抗體應答時，表位需要被B淋巴細胞表面的特異免疫球蛋白(Ig)受體所識別。這些細胞最終分化為漿細胞，其能夠產生特異于該表位的抗體。除這些B細胞表位以外，免疫原還必須含有被抗原呈遞細胞(APC)呈遞給輔助性T淋巴細胞上存在的特異受體的表位，輔助T細胞對于提供B細胞分化為抗體生成細胞所需的信號是必需的。
病毒感染及多種癌癥的情況下，抗體對于機體恢復的作用有限，此時免疫系統(tǒng)以殺傷性T細胞(CTL)進行應答，CTL能殺死病毒感染細胞或癌細胞。與輔助性T細胞相似，CTL首先通過與表面上攜帶特異性肽表位的APC相互作用而被激活，此時CTL與MHC I類分子而不是MHC II類分子相結合。CTL一旦被激活即可結合帶有相同肽/I類復合物的靶細胞，導致其裂解。顯然，輔助性T細胞在此過程中發(fā)揮了作用；APC激活CTL前必須首先從輔助性T細胞接受信號，以上調所需共刺激分子的表達。
輔助性T細胞表位與APC表面存在的、由主要組織相容性復合物(MHC)的II類基因編碼的分子相結合。II類分子與肽表位的復合物隨后被T輔助淋巴細胞表面的特異性T細胞受體(TCR)所識別。這樣，通過MHC分子中的抗原表位呈遞，激活了T細胞，提供了B淋巴細胞分化所需信號。傳統(tǒng)上，肽免疫原的輔助性T細胞表位的來源是肽共價偶聯(lián)的載體蛋白，但這種偶聯(lián)過程可能引入其它問題，如偶聯(lián)過程中抗原決定簇的修飾和誘導產生針對載體的抗體而減少針對肽的抗體(Schutze，M.P.，Leclerc，C.Jolivet，M.Audibert，F.Chedid，L.Carrier-induced epitopic suppression，a major issue for future syntheticvaccines.J Immunol.1985，135，23 19-2322；Dijohn，D.，Torresi，J.R.Murillo，J.Herrington，D.A.et al.Effect of priming with carrier onresponse to conjugate vaccine.The Lancet.1989，2，1415-1416)。此外，在制備過程中使用無關蛋白會引入質量控制的問題。選擇適當的載體蛋白對于肽疫苗的設計非常重要，這一選擇受到如毒性和大規(guī)模生產可行性等因素限制。這種方法的其它限制因素還包括可被偶聯(lián)的肽負載(peptide load)的大小及可以安全施用的載體劑量(Audibert，F.a.C，L.1984.Modern approaches to vaccines.Molecular and chemical basisof virus virulence and immunogenicity.，Cold Spring Harbor Laboratory，New York.)。盡管載體分子可以誘導強烈的免疫應答，但同樣會導致不良反應，例如抗肽抗體應答的抑制(Herzenberg，L.A.and Tokuhisa，T.1980.Carrier-priming leads to hapten-specific suppression.Nature 285664；Schutze，M.P.，Leclerc，C，JOLIVET，M.，Audibert，F.，and Chedid，L.1985.Carrier-induced epitopic suppression，a major issue for futuresynthetic vaccines.J Immunol 1352319；Etlinger，H.Mv Felix，A.M.，Gillessen，D.，Heimer，E.P.，JUST，M.，Pink，J.R.，Sinigaglia，F.，Sturchler，D.，Takacs，B.，Trzeciak，A.，1988.Assessment in humans of asynthetic peptide-based vaccine against the sporozoite stage of the humanmalaria parasite，Plasmodium falciparum.J Immunol 140626)。
總之，免疫原除了被表面Ig或殺傷性T細胞受體所識別的表位外，還必須含有能被輔助性T細胞識別的表位。應認識到這些類型的表位可能千差萬別。對于B細胞表位，由于B細胞受體直接結合天然免疫原，因此構象非常重要。相反，T細胞識別的表位則不依賴于表位的構象完整性，且對于CTL，所述表位由大約9個氨基酸的短序列組成，而對于輔助性T細胞，其由稍長的序列組成，對長度的限制較小。對這些表位的唯一要求是它們分別能被I類或II類分子的結合槽(binding cleft)容納，并且復合物能與T細胞受體結合。II類分子的結合位點在兩端是開放的，從而允許被結合的肽的長度變動較大(Brown，J.H.，T.S.Jardetzky，J.C.Gorga，L.J.Stern，R.G.Urban，J.L.Strominger and D.C.Wiley.1993.Three-dimensional structure of thehuman class II histocompatibility antigen HLA-DR1.Nature 36433)，據報道，表位可短至8個氨基酸殘基(Fahrer，A.M.，Geysen，H.M.，White，D.O.，Jackson，D.C.and Brown，L.E.Analysis of the requirements forclass II-restricted T-cell recognition of a single determinant revealsconsiderable diversity in the T-cell response and degeneracy of peptidebinding to I-ED J.Immunol.1995.1552849-2857)。
LHRH(促黃體生成素釋放激素)是一種10個氨基酸長的肽激素，其序列在哺乳動物中是保守的。其序列如下pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH1 2 34 5 6 7 8 9 10LHRH由下丘腦分泌，控制雄性和雌性的生殖生理?；贚HRH的免疫避孕疫苗開發(fā)原理以如下觀測為依據，即在哺乳動物中，抗LHRH抗體可阻斷所述激素對黃體生成素和促卵泡激素的垂體分泌的作用，導致性腺萎縮與不孕不育。
目前開發(fā)的大多數LHRH疫苗由化學綴合于蛋白質載體的LHRH組成，以提供給T細胞輔助產生抗LHRH抗體。已經示出經LHRH-蛋白質載體綴合物的重復接種后，由于已知的“載體誘導的表位抑制”現象，抗LHRH抗體滴度降低。
WO 88/05308是一個已公開的將LHRH及其片段與如血清白蛋白和卵清蛋白的大蛋白質載體連接的例子。
發(fā)明簡述發(fā)明人發(fā)現特定的截短形式的LHRH即LHRH4-10(SYGLRPG)，其與包括T輔助細胞表位在內的相對較小的肽連接，對于產生抗LHRH應答特別有效。
第一方面，本發(fā)明提供了包括第一區(qū)域和第二區(qū)域的肽，第一區(qū)域由少于60個氨基酸的序列組成，其包括至少一個T輔助細胞表位，第二區(qū)域由SYGLRPG序列組成。
第二方面，本發(fā)明提供了包含肽和可接受載體的組合物，所述肽包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域由少于60個氨基酸的序列組成，其包括至少一個T輔助細胞表位，第二區(qū)域由SYGLRPG序列組成。
第三方面，本發(fā)明提供了脂肽，所述脂肽包含第一區(qū)域、第二區(qū)域和第三區(qū)域，所述第一區(qū)域由少于60個氨基酸的序列組成，其包括至少一個T輔助細胞表位，第二區(qū)域由SYGLRPG序列組成，第三區(qū)域包含脂質部分，其中第二與第三區(qū)域共價偶聯(lián)于第一區(qū)域。
第四方面，本發(fā)明提供了在動物中產生抗LHRH應答的方法，該方法包括給動物施用本發(fā)明第一方面的肽、第二方面的組合物或第三方面的脂肽。
第五方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的肽或第三方面的脂肽在制備用于誘導動物抗LHRH應答的藥物中的應用。
附圖簡述

圖1用LHRH(2-10)或LHRH(6-10)接種后，動物的抗LHRH抗體滴度。
圖2用LHRH(2-10)或LHRH(6-10)接種后，犬的睪酮水平。
圖3用LHRH(2-10)或LHRH(6-10)接種后，犬的孕酮水平。
圖4不同初始免疫與加強免疫誘導的抗LHRH抗體滴度。
圖5第1組睪酮水平LHRH(6-10)初始，LHRH(6-10)加強。
圖6第1組孕酮水平LHRH(6-10)初始，LHRH(6-10)加強。
圖7第2組睪酮水平LHRH(2-10)初始，LHRH(2-10)加強。
圖8第2組孕酮水平LHRH(2-10)初始，LHRH(2-10)加強。
圖9第3組睪酮水平LHRH(2-10)初始，LHRH(6-10)加強。
圖10第3組孕酮水平LHRH(2-10)初始，LHRH(6-10)加強。
圖11LHRH(6-10)與LHRH(4-10)誘導的抗LHRH抗體滴度。
圖12用LHRH(6-10)接種后的睪酮水平。
圖13用LHRH(6-10)接種后的孕酮水平。
圖14用LHRH(4-10)接種后的睪酮水平。
圖15用LHRH(4-10)接種后的孕酮水平。
圖16用LHRH(4-10)與LHRH(6-10)接種后的睪丸體積。
圖17用LHRH(4-10)和LHRH(6-10)接種后的睪丸體積。
圖18通過噬菌體淘選實驗得到的含LHRH相關基序的肽序列。
發(fā)明詳述發(fā)明人發(fā)現特定的截短形式的LHRH即LHRH4-10，其與包括T輔助細胞表位在內的相對較小的肽連接，對于產生抗LHRH應答特別有效。
第一方面，本發(fā)明提供了包含第一區(qū)域和第二區(qū)域的肽，第一區(qū)域由少于60個氨基酸的序列組成，其包括至少一個T輔助細胞表位，第二區(qū)域由SYGLRPG序列組成。
第二方面，本發(fā)明提供了包含肽和可接受載體的組合物，所述肽包含第一區(qū)域和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域由少于60個氨基酸的序列組成，其包括至少一個T輔助細胞表位，第二區(qū)域由SYGLRPG序列組成。
第三方面，本發(fā)明提供了脂肽，所述脂肽包含第一區(qū)域、第二區(qū)域和第三區(qū)域，所述第一區(qū)域由少于60個氨基酸的序列組成，其包括至少一個T輔助細胞表位，第二區(qū)域由SYGLRPG序列組成，第三區(qū)域包含脂質部分，其中第二與第三區(qū)域共價偶聯(lián)于第一區(qū)域。
第四方面，本發(fā)明提供了在動物中產生抗LHRH應答的方法，該方法包括給動物施用本發(fā)明第一方面的肽、第二方面的組合物或第三方面的脂肽。
第五方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的肽或第三方面的脂肽在制備用于誘導動物抗LHRH應答的藥物中的應用。
在一個優(yōu)選實施方案中，第一區(qū)域的C端由少于40個氨基酸、優(yōu)選少于20個氨基酸組成。
在另一優(yōu)選實施方案中，第一區(qū)域包含1個、2個或3個T輔助細胞表位，優(yōu)選一個T輔助細胞表位。
在另一優(yōu)選實施方案中，第一區(qū)域的C端殘基與第二區(qū)域的N端殘基連接。
在進一步的優(yōu)選實施方案中，每個T輔助細胞表位選自如下一組SSKTQTHTQQDRPPQPS；QPSTELEETRTSRARHS；RHSTTSAQRSTHYDPRT；PRTSDRPVSYTMNRTRS；TRSRKQTSHRLKNIPVH；SHQYLVIKLIPNASLIE；IGTDNVHYKIMTRPSHQ；YKIMTRPSHQYLVIKLI；KLIPNASLIENCTKAEL；AELGEYEKLLNSVLEPI；KLLNSVLEPINQALTLM；EPINQALTLMTKNVKPL；FAGWLAGVALGVATAA；GVALGVATAAQITAGIA；TAAQITAGIALHQSNLN；GIALHQSNLNAQAIQSL；NLNAQAIQSLRTSLEQS；QSLRTSLEQSNKAIEEI；EQSNKAIEEIREATQET；TELLSIFGPSLRDPISA；PRYIATNGYLISNFDES；CIRGDTSSCARTLVSGT；DESSCVFVSESAICSQN；TSTIINQSPDKLLTFIA，SPDKLLTFIASDTCPLV，SGRRQRRFAGWLAGVA及其組合。
在另一優(yōu)選實施方案中，所述肽含有選自如下一種的序列QPSTELEETRTSRARHSSYGLRPG，TRSRKQTSHRLKNIPVHSYGLRPG，SHQYLVIKLIPNASLIESYGLRPG，KLIPNASLIENCTKAELSYGLRPG，AELGEYEKLLNSVLEPISYGLRPG，TAAQITAGIALHQSNLNSYGLRPG及PRYIATNGYLISNFDESSYGLRPG。
本發(fā)明可能用到的T輔助細胞表位的進一步信息見WO00/46390，其內容以交叉引用的方式并入本文中。
如前所述，本發(fā)明第二方面的組合物包含可接受的載體。優(yōu)選該載體是佐劑。
可接受的載體或稀釋劑在適于口服、直腸、鼻飼、局部(包括口腔與舌下)、陰道、腸胃外(包括皮下、肌內、靜脈內、皮內、鞘內及硬膜外)給藥的組合物中所用的那些。其在使用的劑量與濃度下對于受者是無毒的。
藥學上可接受的載體或稀釋劑的代表例子包括但不限于水、優(yōu)選在生理pH值且具有緩沖能力的等滲溶液(例如磷酸鹽緩沖生理鹽水或Tris緩沖生理鹽水)，該等滲溶液還可含有甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖、甘油、乙醇或多肽(例如人血清白蛋白)中的一種或多種。組合物能夠方便地制成單位劑量形式，并且可以采用制藥領域中的任何熟知方法進行制備。
如前所述，優(yōu)選組合物包括佐劑?！白魟笔且环N組合物，其包含一或多種能夠加強疫苗組合物的免疫原性和效力的物質。適當的佐劑的非限制性例子包括角鯊烷和角鯊烯(或其它動物源性油)；嵌段共聚物；去污劑，如Tween-80等；QUILA，礦物油，如Drakeol或Marcol，植物油，如花生油；棒狀桿菌衍生(Corynebacterium-derived)佐劑，如小棒桿菌(Corynebacterium parvum)等；丙酸桿菌衍生(Propionibacterium-derived)的佐劑，如瘡皰丙酸桿菌(Propionibacterium acne)等；牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)(卡介苗，BCG)；白細胞介素，如白細胞介素2和白細胞介素12；單核因子，如白細胞介素1；腫瘤壞死因子；干擾素，如γ-干擾素；如皂苷-氫氧化鋁或Quil-A氫氧化鋁等組合；脂質體；ISCOM佐劑；分枝桿菌細胞壁提取物；合成糖肽，如胞壁酰二肽或其它衍生物；阿夫立定(Avridine)；脂質A衍生物；硫酸葡聚糖；DEAE-葡聚糖或其與磷酸鋁；羧聚乙烯，如Carbopol′EMA；丙烯酸共聚物乳液，如NeocrylA640(例如美國專利號5,047,238)；牛痘或動物痘病毒蛋白；亞病毒顆粒佐劑，如霍亂毒素，或上述物質的混合物。
可通過多種方式制備本發(fā)明的肽，但優(yōu)選采用本領域熟知方法合成生產。例如，可采用溶液合成或固相合成法合成肽，例如BlackwellScientific Publications出版、Nicholson編輯的“Peptide Synthesis”中Atherton和Sheppard的第9章“Peptide Synthesis”中所述。優(yōu)選采用固相支持物，其可以是聚苯乙烯凝膠珠，其中聚苯乙烯與少量二乙烯基苯(例如1％)交聯(lián)，然后被親脂性溶劑如二氯甲烷或更極性溶劑如二甲基甲酰胺(DMF)等溶脹?？刹捎寐燃谆虬奔谆鶊F對聚苯乙烯進行功能化?；蛘?，使用交聯(lián)的和功能化的聚二甲基-丙烯酰胺凝膠，該凝膠可被DMF及其它雙極性非質子溶劑高度溶劑化與溶脹。也可以使用其它基于聚乙二醇的支持物，聚乙二醇常接枝或以其它方式附著于惰性聚苯乙烯珠的表面。在一個優(yōu)選形式中，可使用商購的固相支持物或選自PAL-PEG-PS、PAC-PEG-PS、KA、KR或TGR的樹脂。
固相合成時，使用具有雙重功能的可逆性保護基團，它們既能阻斷α-氨基、羧基或側鏈功能基團的非所需的反應性，又能破壞氨基酸和肽的雙極性特征，使其失活。這種功能性基團可選自具有RCO-OCMe3結構的叔丁酯。也可使用具有RCO-OCH2-C6H5結構的相應芐酯和具有已知為芐氧羰基或Z-衍生物的C6H5CH2OCO-NHR結構的氨基甲酸酯以及已知為叔丁氧羰基或Boc衍生物的任何Me3-COCO-NHR。還可使用芴甲醇特別是芴甲氧羰基或Fmoc基團的衍生物。這些類型的保護基團的每一種在存在另一種時都可以獨立地被裂解，因此常采用例如BOC-芐基與Fmoc-叔丁基保護策略。
連接被保護氨基酸或肽的氨基或羧基還可能用到縮合劑。這可通過活化羧基實現，使其自發(fā)與游離伯胺或仲胺反應。為此，可以使用活化的酯，如衍生自對硝基苯酚與五氟苯酚的那些。加入催化劑如1-羥基苯并三唑可增加其反應性。也可使用三嗪DHBT的酯類(前述Nicholson參考文獻215-216頁對此進行了討論)。用縮合劑處理羧酸(即N端α-保護的氨基酸或肽)可在原位形成其它酰化組分(acylatingspecies)，并立即與氨基成分(羧基或C端保護的氨基酸或肽)反應。常用的縮合劑是二環(huán)己基碳二亞胺、BOP試劑(見Nicholson參考文獻216頁)、O’苯并三唑-N，N，N′N′-四甲基脲六氟磷酸酯(O’Benzotriazole-N，N，N′，N′-tetra methyl-uronium hexafluorophosphate，HBTU)及其類似物四氟硼酸酯。
以任何適當方式利用BOC-氨基酸可進行起始氨基酸與固相支持物的附著。一個方法中，通過對樹脂和三乙銨鹽進行加溫可將BOC氨基酸附著于氯甲基樹脂。以相似方式，還可將Fmoc-氨基酸偶聯(lián)于對烷氧芐醇樹脂?；蛘撸褂枚喾N連接劑或“支臂(handle)”將初識氨基酸結合于樹脂。在這方面，可以使用與氨甲基聚苯乙烯連接的對羥甲基苯乙酸。
如第三方面所述，本發(fā)明提供了脂肽。所述脂肽優(yōu)選是“分枝”結構，其它關于脂肽的詳細信息可見于WO 04/014956和WO04/014957，其內容以交叉引用的方式并入本文中?；蛘?，可將脂質部分簡單地附著到肽的N端。
第三方面，本發(fā)明提供了脂肽，所述脂肽包含第一區(qū)域、第二區(qū)域和第三區(qū)域，所述第一區(qū)域由少于60個氨基酸的序列組成，其包括至少一個T輔助細胞表位，第二區(qū)域由SYGLRPG序列組成，第三區(qū)域含有脂質部分，其中第二與第三區(qū)域共價偶聯(lián)于第一區(qū)域。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述第一區(qū)域由少于40個、優(yōu)選少于20個氨基酸組成。在另一優(yōu)選實施方案中，所述第一區(qū)域包含1個、2個或3個T輔助細胞表位，優(yōu)選包含一個T輔助細胞表位。
在另一優(yōu)選實施方案中，所述脂質部分與第一區(qū)域的C端偶聯(lián)。另外，優(yōu)選第一區(qū)域的C端殘基與所述第二區(qū)域的N端殘基連接。
在另一優(yōu)選實施方案中，所述第一區(qū)域的C端殘基是賴氨酸或其類似物，脂質部分與ε-氨基連接，第二區(qū)域與羧基連接。或者，可將賴氨酸或其類似物通過其ε-氨基與第一區(qū)域的其余部分連接，脂質部分與α-氨基連接，第二區(qū)域與羧基連接。
賴氨酸類似物的例子包括鳥氨酸、二氨基丙酸和二氨基丁酸。
在另一優(yōu)選實施方案中，T輔助細胞表位選自以下一組SSKTQTHTQQDRPPQPS；QPSTELEETRTSRARHS；RHSTTSAQRSTHYDPRT；PRTSDRPVSYTMNRTRS；TRSRKQTSHRLKNIPVH；SHQYLVIKLIPNASLIE；IGTDNVHYKIMTRPSHQ；YKIMTRPSHQYLVIKLI；KLIPNASLIENCTKAEL；AELGEYEKLLNSVLEPI；KLLNSVLEPINQALTLM；EPINQALTLMTKNVKPL；FAGWLAGVALGVATAA；GVALGVATAAQITAGIA；TAAQITAGIALHQSNLN；GIALHQSNLNAQAIQSL；NLNAQAIQSLRTSLEQS；QSLRTSLEQSNKAIEEI；EQSNKAIEEIREATQET；TELLSIFGPSLRDPISA；PRYIATNGYLISNFDES；CIRGDTSSCARTLVSGT；DESSCVFVSESAICSQN；TSTIINQSPDKLLTFIA，SPDKLLTFIASDTCPLV，SGRRQRRFAGWLAGVA及其組合。
優(yōu)選脂肽第一區(qū)域的序列選自如下一組QPSTELEETRTSRARHSK，TRSRKQTSHRLKNIPVHK，SHQYLVIKLIPNASLIEK，KLIPNASLIENCTKAELK，AELGEYEKLLNSVLEPIK，TAAQITAGIALHQSNLNK及PRYIATNGYLISNFDESK。
優(yōu)選脂質部分是脂氨基酸部分，并且優(yōu)選選自如下一組Pam2Cys，Pam3CyS，Ste2Cys，Lau2CyS，Oct2Cys，Pam2Asp，Pam3Asp，Ste2Asp，Lau2Asp，及Oct2Asp，最優(yōu)選Pam2CyS或Pam3Cys。
對于本領域技術人士已知Pam3Cys也已知為N-棕櫚酰-S-[2，3-二(棕櫚?；趸?丙基]半胱氨酸；Pam2CyS也已知為二棕櫚酰-S-甘油基-半胱氨酸或S-[2，3-二(棕櫚?；趸?丙基]半胱氨酸；Ste2Cys也已知為S-[2，3-二(硬脂?；趸?丙基]半胱氨酸或二硬脂酰-S-甘油基-半胱氨酸；Lau2CyS也已知為S-[2，3-二(月桂?；趸?丙基]半胱氨酸或二月桂酰-S-甘油基-半胱氨酸；Oct2Cys也已知為S-[2，3-二(辛?；趸?丙基]半胱氨酸或二辛?；?S-甘油基-半胱氨酸。
在優(yōu)選實施方案中，脂質部分通過間隔區(qū)與第一區(qū)域連接。間隔區(qū)優(yōu)選包含精氨酸或絲氨酸二聚體、三聚體或四聚體等。或者，可采用6-氨基己酸間隔區(qū)。
本說明書中術語“包含”應理解為包括所述元件、整數、步驟或者元件組、整數組或步驟組，但并不排除任何其它元件、整數、步驟或者元件組、整數組或步驟組。
本說明書中提到的所有出版物均并入本文中。關于本說明書所包括的文件、法條、材料、設備、文獻等的任何討論僅用于提供本發(fā)明背景資料的目的。應理解并不表示承認這些內容中的全部或任意部分形成了部分現有技術基礎，也不表示它們是與本發(fā)明相關領域中的普遍技術知識，因為其在本申請每項權利要求的優(yōu)先權日期之前存在于澳大利亞或其他地方。
本領域專業(yè)人士了解在不偏離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，可對如具體實施例所示的本發(fā)明進行多種改變和/或修改。因此，本發(fā)明實施方案在所有方面都應被認為是說明性的，而不是限制性的。
為了使本發(fā)明的性質可以被更清楚的理解，將參照以下實施例對其優(yōu)選形式進行描述。
實施例肽整合了不同LHRH片段和T輔助細胞表位的肽采用標準技術合成。
這些肽的每一種都包括了一個WO 00/46390中所揭示的T輔助細胞表位。這些T輔助細胞表位的序列如下
實施例1各組犬接受總共5n摩爾由偶聯(lián)于LHRH(2-10)的P25、P35和P62組成的混合肽作為第一劑。作為第二劑和第三劑，一組犬接受相同的疫苗，而第二組接受僅由偶聯(lián)于LHRH(6-10)的P25組成的疫苗。犬在0、4、14周接受三劑疫苗。
疫苗制備稱取每種肽1至1.5mg，分別溶于100ul的4M尿素中。將相當于1.7n摩爾的每種肽的溶液混合并用等滲生理鹽水稀釋至用于注射的規(guī)定劑量體積(每劑1ml)。向每劑中加入150ug的Iscomatrix·(CSL，Melbourne，Australia)作為佐劑。將疫苗給予犬的頸背部。
測得的抗體滴度見圖1。同時睪酮和孕酮水平分別見圖2和圖3。
實施例2接種方案將比格犬(Beagle)/獵狐犬(foxhound)分成三組。一組(12只犬)接受三劑5n摩爾的總肽，總肽由偶聯(lián)于LHRH(6-10)的p25、p35和p62肽的混合物組成。
第二組(6只犬)接受三劑5n摩爾的總肽，總肽由偶聯(lián)于LHRH(2-10)的p25、p35和p62肽的混合物組成。
第三組(6只犬)接受三劑5n摩爾的總肽，總肽由偶聯(lián)于LHRH(2-10)的p25、p35和p62肽的混合物組成，作為第一劑。第二劑和第三劑，疫苗由與LHRH(6-10)偶聯(lián)的相同肽的混合物組成。
犬分別在0、4、14周接受三劑疫苗。
疫苗制備稱取每種肽1至1.5mg，分別溶于100ul的4M尿素中。將相當于1.7n摩爾的每種肽的溶液混合并用等滲生理鹽水稀釋至用于注射的規(guī)定劑量體積(每劑1ml)。向每劑中加入150ug的Iscomatrix·(CSL，Melbourne，Australia)作為佐劑。將疫苗給予犬頸背部實驗結果見圖4至圖10。
第二劑疫苗之后，無論是由LHRH(2-10)還是由LHRH(6-10)所引發(fā)的抗體，其滴度幾乎沒有顯著差別。接種方案看上去也沒有產生差別，即無論其施用順序是LHRH(2-10)[初始劑量]，繼而LHRH(2-10)[加強]；還是LHRH(2-10)[初始]，繼而LHRH(6-10)[加強]；還是LHRH(6-10)[初始]，繼而LHRH(6-10)[加強]。而初次抗體應答的滴度出現了差別，以LHRH(2-10)-LHRH(6-10)示出最低的滴度。對于睪酮和孕酮，接種兩劑LHRH(6-10)的較大部分動物中觀察到了某些差別，顯示較低水平的睪酮和孕酮。
實施例3接種方案將比格犬/獵狐犬分成兩組。第一組(15只犬)接受三劑35n摩爾的總肽，總肽由偶聯(lián)于LHRH(6-10)的p4、p10、p24、p25、p27、p35和p62肽的混合物組成。
第二組(15只犬)接受三劑35n摩爾的總肽，總肽由偶聯(lián)于LHRH(4-10)的p4、p10、p24、p25、p27、p35和p62肽的混合物組成。
犬分別在0、4、14周接受三劑疫苗。
疫苗制備稱取每種肽1至1.5mg，分別溶于100ul的4M尿素中。將相當于5n摩爾每種肽的溶液混合并用等滲生理鹽水稀釋至用于注射的規(guī)定劑量體積(每劑1ml)。向每劑中加入150ug的Iscomatrix·(CSL，Melbourne，Australia)作為佐劑。將疫苗給予犬頸背部。
實驗結果見圖11至圖17。
接種LHRH(4-10)的動物具有更高的抗體滴度。而且LHRH(4-10)似乎誘導對睪酮和孕酮水平具有更顯著作用的抗體；與接種LHRH(6-10)動物不同，接種LHRH(4-10)時動物均未表現出激素突破點(hormone breakthrough)。
實施例4通過噬菌體淘選實驗得到的含LHRH-相關基序的肽序列。
使用抗P25-LHRH(2-10)抗體和酸洗脫夜，淘選獲得如圖18所示的肽序列。在三輪淘選的每一輪后、沒有進行ELISA篩選前，隨機挑取總共20個噬菌體克隆進行序列分析。高亮的氨基酸殘基為與P25-LHRH(2-10)序列相同的氨基酸殘基。PCR/測序成功的克隆總數中的相關序列基序總數顯示在陰影框內，括號內為百分比。例如“4/20(20％)”表示在20個成功測序的克隆中有4個克隆含有LHRH-相關基序，占第一次淘選后所分析克隆的20％。
上述結果顯示，使用較大的LHRH片段傾向于產生針對所述序列C末端的抗體應答。
本領域技術人士了解在不偏離本發(fā)明所述的精神或范圍的前提下，可對特異實施方案所示的本發(fā)明進行多種變化和/或修飾。因此，本發(fā)明實施方案在所有方面都應被認為是說明性的，而不是限制性的。
權利要求
1.一種肽，其包含第一和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域由少于60個氨基酸的序列組成，其包括至少一個T輔助細胞表位，所述第二區(qū)域由SYGLRPG序列組成。
2.權利要求1的肽，其中所述第一區(qū)域由少于40個、優(yōu)選少于20個的氨基酸組成。
3.權利要求1的肽，其中所述第一區(qū)域包含1個、2個、或3個T輔助細胞表位，優(yōu)選包含1個T輔助細胞表位。
4.權利要求1至3中任一項的肽，其中所述第一區(qū)域的C末端殘基與所述第二區(qū)域的N末端殘基連接。
5.權利要求1至4中任一項的肽，其中T輔助細胞表位選自如下一組SSKTQTHTQQDRPPQPS；QPSTELEETRTSRARHS；RHSTTSAQRSTHYDPRT；PRTSDRPVSYTMNRTRS；TRSRKQTSHRLKNIPVH；SHQYLVIKLIPNASLIE；IGTDNVHYKIMTRPSHQ；YKIMTRPSHQYLVIKLI；KLIPNASLIENCTKAEL；AELGEYEKLLNSVLEPI；KLLNSVLEPINQALTLM；EPINQALTLMTKNVKPL；FAGWLAGVALGVATAA； GVALGVATAAQITAGIA；TAAQITAGIALHQSNLN；GIALHQSNLNAQAIQSL；NLNAQAIQSLRTSLEQS；QSLRTSLEQSNKAIEEI；EQSNKAIEEIREATQET；TELLSIFGPSLRDPISA；PRYIATNGYLISNFDES；CIRGDTSSCARTLVSGT；DESSCVFVSESAICSQN；TSTIINQSPDKLLTFIA，SPDKLLTFIASDTCPLV，SGRRQRRFAGWLAGVA及其組合。
6.權利要求1至5中任一項的肽，其中所述肽具有選自如下一組的序列QPSTELEETRTSRARHSSYGLRPG，TRSRKQTSHRLKNIPVHSYGLRPG，SHQYLVIKLIPNASLIESYGLRPG，KLIPNASLIENCTKAELSYGLRPG，AELGEYEKLLNSVLEPISYGLRPG，TAAQITAGIALHQSNLNSYGLRPG及PRYIATNGYLISNFDESSYGLRPG。
7.一種組合物，其包含權利要求1至7中任一項的肽和可接受的載體。
8.權利要求7的組合物，其中所述載體是佐劑。
9.一種脂肽，所述脂肽包含第一區(qū)域、第二區(qū)域和第三區(qū)域，所述第一區(qū)域由少于60個氨基酸的序列組成，其包含至少一個T輔助細胞表位，所述第二區(qū)域由SYGLRPG序列組成，所述第三區(qū)域包含脂質部分，其中第二與第三區(qū)域共價偶聯(lián)于第一區(qū)域。
10.權利要求9的脂肽，其中所述第一區(qū)域由少于40個、優(yōu)選少于20個的氨基酸組成。
11.權利要求9的脂肽，其中所述第一區(qū)域包含1個、2個或3個T輔助細胞表位，優(yōu)選包含1個T輔助細胞表位。
12.權利要求9到11中任一項的脂肽，其中所述第一區(qū)域的C末端殘基與所述第二區(qū)域的N末端殘基連接。
13.權利要求9到12中任一項的脂肽，其中所述脂質部分與所述第一區(qū)域的C末端殘基偶聯(lián)。
14.權利要求9到13中任一項的脂肽，其中所述第一區(qū)域的C末端殘基為賴氨酸或其類似物，所述脂質部分與ε-氨基連接，所述第二區(qū)域與羧基連接。
15.權利要求9到13中任一項的脂肽，其中所述第一區(qū)域的C末端殘基為賴氨酸或者其類似物，并且該賴氨酸或者其類似物通過其ε-氨基與所述第一區(qū)域的其余部分連接，所述脂質部分與α-氨基連接，所述第二區(qū)域與羧基連接。
16.權利要求14到15的脂肽，其中所述賴氨酸類似物是鳥氨酸、二氨基丙酸或二氨基丁酸。
17.權利要求9到11中任一項的脂肽，其中所述脂質部分與所述第一區(qū)域的N末端殘基偶聯(lián)。
18.權利要求9到17中任一項的脂肽，其中T輔助細胞表位選自如下一組SSKTQTHTQQDRPPQPS；QPSTELEETRTSRARHS；RHSTTSAQRSTHYDPRT；PRTSDRPVSYTMNRTRS；TRSRKQTSHRLKNIPVH；SHQYLVIKLIPNASLIE；IGTDNVHYKIMTRPSHQ；YKIMTRPSHQYLVIKLI；KLIPNASLIENCTKAEL；AELGEYEKLLNSVLEPI；KLLNSVLEPINQALTLM；EPINQALTLMTKNVKPL；FAGWLAGVALGVATAA； GVALGVATAAQITAGIA；TAAQITAGIALHQSNLN；GIALHQSNLNAQAIQSL；NLNAQAIQSLRTSLEQS；QSLRTSLEQSNKAIEEI；EQSNKAIEEIREATQET；TELLSIFGPSLRDPISA；PRYIATNGYLISNFDES；CIRGDTSSCARTLVSGT；DESSCVFVSESAICSQN；TSTIINQSPDKLLTFIA，SPDKLLTFIASDTCPLV，SGRRQRRFAGWLAGVA及其組合。
19.權利要求9到18中任一項的脂肽，其中所述第一區(qū)域的序列選自如下一組QPSTELEETRTSRARHSK，TRSRKQTSHRLKNIPVHK，SHQYLVIKLIPNASLIEK，KLIPNASLIENCTKAELK，AELGEYEKLLNSVLEPIK，TAAQITAGIALHQSNLNK及PRYIATNGYLISNFDESK。
20.權利要求9到19中任一項的脂肽，其中所述脂質部分是脂氨基酸部分。
21.權利要求20的脂肽，其中所述脂氨基酸部分選自如下一組Pam2CyS，Pam3CyS，Ste2Cys，Lau2CyS，Oct2Cys，Pam2Asp，Pam3Asp，Ste2Asp，Lau2Asp及Oct2Asp。
22.權利要求21的脂肽，其中所述脂質部分為Pam2Cys或Pam3Cys。
23.權利要求9到22中任一項的脂肽，其中所述脂質部分通過間隔區(qū)與所述第一區(qū)域連接。
24.權利要求21的脂肽，其中所述間隔區(qū)包含精氨酸或絲氨酸二聚體、三聚體或四聚體。
25.權利要求21的脂肽，其中所述間隔區(qū)包含6-氨基己酸。
26.誘導動物產生抗LHRH應答的方法，該方法包括給動物施用權利要求1到6中任一項所述的肽、權利要求7或8的組合物或者權利要求9到25中任一項所述的脂肽。
27.權利要求1到6中任一項所述的肽或者權利要求9到25中任一項所述的脂肽在制備用于誘導動物抗LHRH應答的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于提高動物抗LHRH應答的肽。所述肽包含第一和第二區(qū)域，所述第一區(qū)域由包含至少一個T輔助細胞表位的少于60個氨基酸的序列組成，所述第二區(qū)域由序列SYGLRPG組成。
文檔編號A61P15/18GK101084239SQ200580038373
公開日2007年12月5日 申請日期2005年9月12日 優(yōu)先權日2004年9月10日
發(fā)明者戴維·查爾斯·杰克遜, 約翰·沃克, 曾偉光 申請人:昆士蘭醫(yī)學研究所理事會(Qimr)