專利名稱：脂肪酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供含有來自茶的黃烷-3-醇二聚體的脂肪酶抑制劑。
背景技術(shù)：
近年來，隨著日本人生活方式的歐美化，對高脂肪食物的攝取也向著增加的方向發(fā)展。根據(jù)平成11年日本國國民營養(yǎng)調(diào)查的報告顯示，盡管對能量的攝取量在逐年減少，但其脂質(zhì)能量比超過適合比率的25％、中性脂肪值和膽固醇值高的人的比例，60歲以上的占5～6成[日本國厚生勞動省平成11年國民營養(yǎng)調(diào)查結(jié)果的概要臨床營養(yǎng)2001；98(5)577-588](日語原名；日本國厚生労働省平成11年國民栄養(yǎng)調(diào)查結(jié)果の概要臨床栄養(yǎng)2001；98(5)577-588)。
肥胖是現(xiàn)今社會最重大的疾病之一，其主要原因是脂肪攝取過剩。且脂肪攝取過剩不僅會造成肥胖，還可由肥胖引發(fā)糖尿病、高脂血癥、高血壓、動脈硬化等。針對此肥胖的治療藥物，在日本國內(nèi)唯一被認(rèn)可的是食欲抑制劑馬吲哚(Mazindol)(日本國注冊商標(biāo)「マジンド一ル」)，但有報告指出其具有口渴、便秘、胃部不適感、惡心嘔吐等的副作用[臨床評價1985；13(2)419-459、臨床評價1985；13(2)461-515](臨床評価1985；13(2)419-459、臨床評価1985；13(2)461-515)。另外，在海外，通過抑制脂肪酶活性而具有抑制腸道吸收脂肪作用的賽尼可(Xenical)(日本國注冊商標(biāo)「ゼニカル」)也作為肥胖改善藥于市場銷售，但還是有脂肪便、排便次數(shù)增加、軟便、腹瀉、腹痛等的副作用，所以很難說是安全的(Lancet 1998；35267-172)。
為預(yù)防肥胖，雖然控制膳食減少攝取的熱量是有效的手段，但必須接受嚴(yán)格的營養(yǎng)指導(dǎo)，所以在日常生活中的實行多數(shù)比較困難。因此，安全、健康地抑制來自膳食的脂肪被體內(nèi)吸收，是治療肥胖及其相關(guān)疾病或增進健康的現(xiàn)實而有效的方法。
在此背景下，被證明是既安全又對人體有效的指定保健食品的開發(fā)非常引人注目。至今為止，作為抑制餐后血清中性脂肪值上升的食品原料，已被銷售的有通過抑制胰脂肪酶抑制脂肪吸收的珠蛋白水解物[J.Nutr.1988；12856-60，日本臨床·食糧學(xué)會志1999；52(2)71-77健康·營養(yǎng)食品研究2002；5(3)131-144] (J.Nutr.1988；12856-60、日語原名；日本臨床·食糧學(xué)會誌1999；52(2)71-77、日語原名；健康·栄養(yǎng)食品研究2002；5(3)131-144)、具有不同于甘油三酯的消化吸收特性的甘油二酯[J.Am.Coll.Nutr.2000；19(6)789-796 Clin.Chim.Acta.2001；11(2)109-117]、由魚油提煉的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等的日本國指定保健食品。
最近來自植物的抑制脂肪酶活性的物質(zhì)也受到注目，特別是關(guān)于具有抑制脂肪酶活性的多酚類，已報到的有來自植物樹皮的單寧(日本國特公昭60-11912)；豆科植物豆茶決明中含有的單寧類、類黃酮類及其糖苷(日本國特開平8-259557)；配合了綠茶中的主要成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯及表兒茶素沒食子酸酯的抑制脂質(zhì)吸收的食品(日本國特開平3-228664)；含有青椒、叢生口蘑、南瓜、灰樹花、羊棲菜、綠茶、烏龍茶等的水提取物的脂肪酶抑制劑(日本國特開平3-219872)；黃酮及黃酮醇類(日本國特開平7-61927)羥基安息香酸類(沒食子酸)(日本國特開平1-102022)；三萜類化合物及其衍生物(日本國特開平9-40689)；羅望子的以原花青素為有效成分的抗肥胖劑(日本國特開平9-291039)等。且還已知葡萄籽提取物的脂肪酶抑制作用[Nutrition 2003；19(10)876-879]；來自五層龍的多酚的脂肪酶抑制作用和對大鼠的抗肥胖作用(J.Nutr.2002；1321819-1824)；烏龍茶提取物對小鼠的抗肥胖作用(Int.J.Obes.1999；2398-105)等。
但是，如上所示已報導(dǎo)的來自植物的脂肪酶抑制劑還不能說效果十分顯著。例如，某些植物的提取物即使有效果，但因其中含有的活性成分的量還不明確，且是起源于天然物質(zhì)，所以很難維持穩(wěn)定的脂肪酶抑制活性。而且來自嗜好性低的植物的抑制劑作為飲料食品利用時，還存在著影響其香味的問題。例如，在顯示烏龍茶改善脂質(zhì)的效果的報道中，報道了每日1330ml、飲用6星期市售的烏龍茶后，血液中中性脂肪值顯著降低的結(jié)果[日本營養(yǎng)·食糧學(xué)會志1991；44(4)251-259](日語原名；日本栄養(yǎng)·食糧學(xué)會誌1991；44(4)251-259)；還有以單純性肥胖癥的男性女性102名為對象，連續(xù)6星期經(jīng)口攝取烏龍茶(2g×4/日)，其結(jié)果67％的被驗者體重減少了1kg以上，而且血液中中性脂肪值呈高值的被驗者在攝取烏龍茶后表現(xiàn)出了顯著的改善效果[日本臨床營養(yǎng)學(xué)會雜志1998；20(1)83-90] (日語原名；日本臨床栄養(yǎng)學(xué)會雑誌1998；20(1)83-90)。如此大量飲用烏龍茶雖有效果，但在日常生活中很難持續(xù)。并且，即使提供單純濃縮的烏龍茶，也會因苦味、澀味過強，咖啡因量增加而成為不現(xiàn)實的方法。
專利文獻1日本國特公昭60-1191專利文獻2日本國特開平8-25955專利文獻3日本國特開平3-2286專利文獻4日本國特開平3-2198專利文獻5日本國特開平7-6192專利文獻6日本國特開平1-10202專利文獻7

日本國特開平9-40689專利文獻8日本國特開平9-291039非專利文獻1日本國厚生勞動省“平成11年國民營養(yǎng)調(diào)查結(jié)果”的概要(日語原名；厚生労働省「平成11年國民栄養(yǎng)調(diào)查結(jié)果」的概要)非專利文獻2臨床營養(yǎng)2001；98(5)577-588(日語原名；臨床栄養(yǎng)2001；98(5)577-588)非專利文獻3臨床評價1985；13(2)419-459、臨床評價1985；13(2)461-515(日語原名；臨床評価1985；13(2)419-459、臨床評価1985；13(2)461-515)非專利文獻4Lancet 1998；35267-1非專利文獻5J.Nutr.1988；12856-60，1988非專利文獻6日本臨床·糧食學(xué)會志[日語原名；日本臨床·食糧學(xué)會誌1999；52(2)71-77]非專利文獻7健康·營養(yǎng)食品研究2002；5(3)131-144[日語原名；健康·栄養(yǎng)食品研究2002；5(3)131-144]非專利文獻8J.Am.Coll.Nutr.2000；19(6)789-79非專利文獻9Clin.Chim.Acta.2001；11(2)109-117
非專利文獻10Nutrition 2003；19(10)876-879非專利文獻11J.Nutr.2002；1321819-182非專利文獻12Int.J.Obes.1999；2398-10非專利文獻13日本營養(yǎng)·糧食學(xué)會志1991；44(4)251-259[日語原名；日本栄養(yǎng)·食糧學(xué)會誌1991；44(4)251-259]非專利文獻14日本臨床營養(yǎng)學(xué)會雜志1998；20(1)83-90[日語原名；日本臨床栄養(yǎng)學(xué)會雑誌1998；20(1)83-90]非專利文獻15Chem.Pharm.Bull 1987；35(2)611-61非專利文獻16Chem.Pharm.Bull 1989；37(12)3255-35非專利文獻17Chem.Pharm.Bull.1988；36(5)1676-168非專利文獻18Chem.Pharm.Bull.1983；31(11)3906-391非專利文獻19Chem.Pharm.Bull.1992；40(6)1383-1389非專利文獻20Chem.Pharm.Bull.1989；37(1)77-8非專利文獻21FEMS Microbiol.Lett.1996；14335-40

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明著眼于嗜好性高的茶中含有的成分，提供含有發(fā)源于茶的黃烷-3-醇二聚體中至少一種的脂肪酶抑制劑。
本發(fā)明還提供添加了上述脂肪酶抑制劑，嗜好性高且可降低血液中中性脂肪、增進健康的飲料食品。
本發(fā)明進一步提供含有上述脂肪酶抑制劑，抑制來自膳食的脂肪的吸收，抑制血液中中性脂肪上升的醫(yī)藥組合物。
作為解決上述課題的手段，從茶中尋找抑制脂肪吸收時必需的胰脂肪酶的成分，評價其中存在的種種多酚的脂肪酶抑制活性，并證實了黃烷-3-醇二聚體具有強的脂肪酶抑制活性。
更具體地說，本發(fā)明脂肪酶抑制劑的特征在于，含有從用下式化學(xué)式1
或 (式中，G是沒食子?；?表示的assamicain類、用下式
化學(xué)式2
或 (式中，R1是G或H，R2是G)表示的theasinensin類及用下式化學(xué)式3
(式中，R1及R2分別獨立，是G或H)表示的茶黃素類中選擇的黃烷-3-醇二聚體中的至少一種。且沒食子酰基G的結(jié)構(gòu)式為化學(xué)式4

本發(fā)明脂肪酶抑制劑中含有的assamicain類，例如可以是assamicain A(化合物9)及assamicain B(化合物10)。
本發(fā)明脂肪酶抑制劑中含有的theasinensin類，例如可以是theasinensin A(化合物11)、theasinensin B(化合物12)、theasinensin D(化合物13)及去氫雙兒茶素A(dehydro-dicatechinA)(化合物14)。
本發(fā)明脂肪酶抑制劑中含有的茶黃素類，例如可以是茶黃素(theaflavin)(化合物15)、茶黃素3’-O-沒食子酸酯(theaflavin 3’-O-gallate)(化合物16)及茶黃素3，3’-O-沒食子酸酯(theaflavin 3，3’-O-gallate)(化合物17)。
本發(fā)明的黃烷-3-醇的二聚體，有市售商品，也可從市售的綠茶、紅茶、烏龍茶等天然材料中提取獲得。例如，從烏龍茶茶葉中精制黃烷-3-醇二聚體，見Chem.Pharm.Bull.1987；35(2)611-616，Chem.Pharm.Bull.1988；36(5)1676-1684，Chem.Pharm.Bull.1983；31(11)3906-3914，Chem.Pharm.Bull.1992；40(6)1383-1389，Chem.Pharm.Bull.1989；37(12)3255-3563，Chem.Pharm.Bull.1989；37(1)77-85中的報道。去氫雙兒茶素A可用FEMS Microbiol.Lett.1996；14335-40中所述的方法，如本說明書實施例2中所述獲得。
脂肪酶抑制劑本發(fā)明的黃烷-3-醇的二聚體，可不包含其他成分單獨作為脂肪酶抑制劑使用，或也可與溶劑、固體載體同時作為脂肪酶抑制劑使用?？紤]到溶劑或載體作為下述飲料食品及/或醫(yī)藥品使用，所以優(yōu)選可安全地作為食品或醫(yī)藥品使用的物質(zhì)。本發(fā)明的脂肪酶抑制劑具有種種用途，例如用于試驗研究，用作預(yù)防中性脂肪積累的食品、醫(yī)藥品的有效成分。
脂肪酶抑制活性的測定方法本發(fā)明的脂肪酶抑制劑對脂肪酶、特別是胰脂肪酶有強抑制作用。其抑制活性可按照實施例1中具體記載的方法測定。
含有脂肪酶抑制劑的飲料食品將含有本發(fā)明的黃烷-3-醇二聚體的脂肪酶抑制劑作為抑制脂肪酶活性的成分添加于飲料食品中，可防止伴隨進餐時脂肪成分的攝取使血液中中性脂肪產(chǎn)生不期望的上升，及/或可降低已上升了的血液中的中性脂肪。飲料食品的優(yōu)選例為日常攝取的飲料食品，例如綠茶、麥茶、烏龍茶、紅茶、咖啡、運動飲料、飲料水、調(diào)料、調(diào)味汁。但飲料食品只要是通常食用的飲料食品即可，可為清涼飲料、雞尾酒、啤酒、威士忌、燒酒、葡萄酒、清酒、調(diào)料、調(diào)味汁、調(diào)味米、加工食品、方便食品、軟罐頭食品、巧克力、鮮奶油、西式糕點、乳制品、健康食品、營養(yǎng)補助食品等。
飲料食品中本發(fā)明脂肪酶抑制劑的添加量，每餐黃烷-3-醇二聚體的攝取量為0.1mg～10g。但因本發(fā)明的黃烷-3-醇二聚體來自食品，安全性非常高，所以在飲料食品中的添加量實際上無上限。
含有脂肪酶抑制劑的醫(yī)藥品含有本發(fā)明黃烷-3-醇二聚體的脂肪酶抑制劑，可抑制來自膳食的脂肪的吸收，可用作防止不期望的血液中中性脂肪的上升及/或使其降低的藥劑的有效成分。優(yōu)選的藥劑為經(jīng)口投藥的藥劑，例如保健飲料、片劑、膠囊、顆粒劑、散劑、糖果、滴丸劑等。藥劑中含有的本發(fā)明黃烷-3-醇二聚體的量，1次服用量為0.1mg～10g。
因本發(fā)明醫(yī)藥品的脂肪酶抑制成分安全性高，所以長期服用也很安全。因此，為防止或消除生活習(xí)慣病所引起的肥胖，可日常服用。
本發(fā)明可提供添加含有來自茶葉的黃烷-3-醇二聚體中至少一種的脂肪酶抑制劑后，既不損壞香味，嗜好性高，又可降低中性脂肪、增進健康的飲料食品。為抑制食用脂肪的吸收，優(yōu)選與膳食同時攝取，所以強化了從茶中獲得的有效成分的飲料具有重大意義。特別是通過增強這些成分，可提供具有抗肥胖作用、能增進健康的飲料。


圖1表示實施例3中用于評價脂肪酶抑制活性的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
實施例實施例1脂肪酶抑制活性的測定脂肪酶活性的測定使用底物中熒光性的4-甲基傘形酮的油酸酯(4-UMO)，通過測定由反應(yīng)生成的4-甲基傘形酮的熒光進行。
測定時，緩沖液使用含有150mM NaCl、1.36mM CaCl2的13mM Tris-HCl(pH值為8.0)。將底物4-UMO(Sigma公司制)，其為將配制的0.1M的DMSO溶液用上述緩沖液稀釋1000倍的產(chǎn)物，和脂肪酶，其為將豬胰脂肪酶(Sigma公司制)同樣用上述緩沖液制成400U/ml溶液的產(chǎn)物用于酶測定。
酶反應(yīng)在25℃條件下，在96孔酶標(biāo)板中添加、混合50μl的4-UMO緩沖液溶液和25μl的蒸餾水(或試樣水溶液)后，由添加25μl的脂肪酶緩沖液溶液使反應(yīng)開始。反應(yīng)進行30分鐘后，添加100μl的0.1M檸檬酸緩沖液(pH值為4.2)使反應(yīng)停止，將反應(yīng)生成的4-甲基傘形酮的熒光(激發(fā)波長355nm、發(fā)射波長460nm)用熒光分析儀(Labsystems公司制Fluoroskan Asent CF)測定。
被測試樣的抑制活性，相對于對照(蒸餾水)的活性，以抑制50％的試樣量作為IC50(μM)求出。
測定樣品兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、沒食子兒茶素(GC)、表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)由和光純藥株式會社[和光純薬(株)]購入。
兒茶素類的二聚體中，去氫雙兒茶素A通過茶葉酶進行合成。方法如實施例2所示。
其以外的化合物用下述論文中所述的方法獲得。Chem.Pharm.Bull.1987；35(2)611-616，Chem.Pharm.Bull.1988；36(5)1676-1684，Chem.Pharm.Bull.1983；31(11)3906-3914，Chem.Pharm.Bull.1992；40(6)1383-1389，Chem.Pharm.Bull.1989；37(12)3255-3563，Chem.Pharm.Bull.1989；37(1)77-85。概括地說，用80％丙酮提取烏龍茶茶葉后，去除丙酮，用葡聚糖凝膠(Sephadex)LH-20[Pharmacia公司制]，使用水、甲醇、50％丙酮進行分離。將各分離物通過MCI-gel CHP-20P[三菱化學(xué)公司制]及Fuji gel ODS-G3[FUJI SILYSIA CHEMECAL LTD.制]精制。
實施例2去氫雙兒茶素A的合成將茶葉品種-京研129號(由日本京都府立茶葉研究所提供)100g置于液氮中粉碎，加入提取用緩沖液(由0.01M KH2PO4和0.02M K2HPO4調(diào)整到pH值為7.0)600ml和聚酰胺100ml攪拌后，用紗布過濾。將過濾液用8000rpm離心分離20分鐘。在上清500ml中加入預(yù)先冷卻到-20℃的丙酮500ml攪拌后，在4℃條件靜置1小時。將此溶液在4℃條件下用8000rpm離心分離20分鐘后，得到白色沉淀。將此沉淀溶解于反應(yīng)用緩沖液(用0.01M檸檬酸和0.02M KH2PO4調(diào)整到pH值為5.6)100ml中作為酶溶液。
酶溶液100ml中加入D-(+)-catechin 100mg和8.8mM的H2O2，在32℃條件靜置反應(yīng)。5小時后，加入100ml含有1％TFA的90％乙腈停止反應(yīng)。將此溶液用水稀釋5倍，注入吸附樹脂HP-20[200ml、三菱化學(xué)公司制]，水洗后，用400ml含有0.1％TFA的90％乙腈洗脫反應(yīng)生成物，減壓濃縮后冷凍干燥。反應(yīng)物由以下的制備HPLC精制。
色譜柱Develosil C30-UG-5[20mmφ×250mm，野村化學(xué)公司制]
流動相(A)0.1％TFA/H2O、(B)90％CH3CN，0.1％TFA檢測A280nm流速6ml/min梯度進行從B20％到B70％的線性梯度洗脫40分鐘。
通過此色譜法，洗脫時間21分鐘時得到了去氫雙兒茶素A(dehydro-dicatechinA)。(參考論文FEMS Microbiol.Lett.143 35-40，1996)實施例3兒茶素類及其二聚體的脂肪酶抑制活性對茶中主要的多酚兒茶素類(單體)以及兒茶素類聚合形成二聚體的化合物按照實施例1的方法測定脂肪酶抑制活性。其結(jié)果如表1所示。圖1記載了用于評價的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。茶中存在的主要兒茶素類(8種)中，顯示了脂肪酶抑制活性的是沒食子酸形成酯鍵的黃烷-3-醇。特別是茶中大量含有的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)在主要的兒茶素類中顯示了最強的活性。
在二聚體的多酚中，可判斷出結(jié)構(gòu)內(nèi)具有沒食子酸酯基團的物質(zhì)、特別是EGCG的二聚體比EGCG本身具有更強的脂肪酶抑制活性。
表1表1.來自茶多酚的脂肪酶抑制作用

由以上結(jié)果可知，茶中除主要的兒茶素類(8種)以外，還存在著具有非常強的活性的二聚體。
權(quán)利要求
1.脂肪酶抑制劑，其含有用下式化學(xué)式1
或 (式中，G是沒食子?；?表示的assamicain類、用下式化學(xué)式2
或 (式中，R1是G或H，R2是G)表示的theasinensin類及用下式化學(xué)式3
(式中，R1及R2分別獨立，是G或H)表示的茶黃素類中的至少一種。
2.權(quán)利要求1中所述的脂肪酶抑制劑，其中，assamicain類是assamicain A或assamicain B。
3.權(quán)利要求1中所述的脂肪酶抑制劑，其中，theasinensin類從含有theasinensin A、theasinensin B、theasinensin D及去氫雙兒茶素A(dehydro-dicatechin A)的群中選擇。
4.權(quán)利要求1中所述的脂肪酶抑制劑，其中，茶黃素類從含有茶黃素(theaflavin)、茶黃素3’-O-沒食子酸酯(theaflavin 3’-O-gallate)及茶黃素3，3’-O-沒食子酸酯(theaflavin 3，3’-O-gallate)的群中選擇。
5.飲料食品，其添加了權(quán)利要求1～4中任一項所述的脂肪酶抑制劑。
6.權(quán)利要求5中所述的飲料食品，其中，飲料食品從含有茶飲料、清涼飲料及健康食品的群中選擇。
7.醫(yī)藥組合物，其含有權(quán)利要求1～4中任一項所述的脂肪酶抑制劑。
8.權(quán)利要求7中所述的醫(yī)藥組合物，其用于抑制來自膳食的脂肪的吸收。
全文摘要
本發(fā)明提供含有發(fā)源于茶的黃烷－3－醇二聚體的脂肪酶抑制劑及添加該抑制劑的飲料食品、醫(yī)藥品。更具體地說，本發(fā)明是含有用化學(xué)式1
(式中，G是沒食子酰基)表示的assamicain類、用化學(xué)式2
(式中，R
文檔編號A61P3/06GK1980654SQ20058002227
公開日2007年6月13日 申請日期2005年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月5日
發(fā)明者中井正晃, 福井祐子, 淺見純生, 橋本文雄 申請人:三得利株式會社