專利名稱：攜帶人胸腺素β4基因的重組質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因治療領(lǐng)域，具體的說(shuō)，就是以人胸腺素β4基因插入到一真核表達(dá)啟動(dòng)子下，構(gòu)建成的一種重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒能進(jìn)入橫紋肌細(xì)胞，且在細(xì)胞內(nèi)利用細(xì)胞本身的蛋白合成系統(tǒng)，合成Tβ4，且分泌到胞外，從而加速傷口的愈合，以及阻止細(xì)胞的死亡。
二.
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)是人體的防御系統(tǒng)。參與免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞有T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。而胸腺是T淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化的免疫中樞器官。胸腺分泌的胸腺因子(或激素)是T淋巴細(xì)胞發(fā)育分化所需的一系列必需物質(zhì)，其中胸腺素β4(Tβ4)是現(xiàn)已結(jié)構(gòu)和功能較為明確的一種主要的胸腺因子。正如用Tβ4(一種涉及正在發(fā)育的胚胎中細(xì)胞遷移和存活的蛋白)的活性所做的一項(xiàng)研究所表明的那樣，“胸腺素-貝塔4”增強(qiáng)組織培養(yǎng)物中胚胎及出生后心肌細(xì)胞的存活能力，在大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后腹膜內(nèi)注射該蛋白，能成功刺激心臟修復(fù)和激活A(yù)kt“存活激酶”。這些結(jié)果說(shuō)明，“胸腺素-貝塔4”對(duì)于急性冠狀動(dòng)脈閉塞是一個(gè)可能的治療目標(biāo)。德克薩斯州大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)一種在心臟發(fā)育過(guò)程中制造的蛋白質(zhì)(胸腺素β-4)在心臟病發(fā)作后能夠幫助心臟器官的自我修復(fù)。這些在大鼠實(shí)驗(yàn)中獲得的發(fā)現(xiàn)最終可能導(dǎo)致新的心臟病療法的出現(xiàn)并且可能改變醫(yī)護(hù)人員對(duì)心臟病的處理方式。
胸腺素β-4是一種胚胎在心臟發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的蛋白，它能促進(jìn)心臟細(xì)胞的遷移并影響這些細(xì)胞的生死存亡。新研究表明這種蛋白能夠在實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的心臟病發(fā)作后防止細(xì)胞的死亡并限制疤痕組織形成的程度。胸腺素β-4已經(jīng)被用于臨床試驗(yàn)，以促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷的痊愈。研究人員相信不久的將來(lái)這種蛋白將會(huì)進(jìn)入心臟病治療的臨床試驗(yàn)階段。
Tβ4是Goldstein等最早從小牛胸腺中提取的胸腺素組分5(TF5)中分離出來(lái)的一種多肽，含43個(gè)氨基酸，分子量4.963KD，無(wú)二硫鍵與糖基化。
目前，臨床上使用的Tβ4主要是來(lái)源于化學(xué)合成或基因重組得到的蛋白形式。由于Tβ4蛋白形式在體內(nèi)的半衰期很短，這就使得臨床病人必須在一定時(shí)間段內(nèi)多次使用Tβ4。所以只需一到兩次使用，就可在體內(nèi)一段時(shí)間內(nèi)表達(dá)Tβ4對(duì)受損組織起作用的基因治療類Tβ4藥物將會(huì)大大降低各項(xiàng)成本。但目前用于攜帶Tβ4作為基因治療的載體主要有腺病毒載體(AV)、腺相關(guān)病毒載體(AAV)，在這兩種載體中，AAV使用較多，主要是由于它們的病毒特性，使得轉(zhuǎn)染率很高，易于攜帶基因進(jìn)入人體細(xì)胞，然而正是由于它們的病毒特性，使得基因治療的安全性成為倍受關(guān)注的問題。與AV與AAV相比，重組質(zhì)粒由于其無(wú)生命形式，除非進(jìn)入細(xì)胞，否則很快消失，使得基因治療的安全性大大提高。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先是提供一種利用裸質(zhì)粒作為載體，運(yùn)輸Tβ4基因到細(xì)胞內(nèi)去合成、分泌Tβ4蛋白，并通過(guò)此蛋白對(duì)周圍組織中受損細(xì)胞起作用，阻止細(xì)胞死亡的重組裸質(zhì)?；蛑委熡肨β4，尤其是針對(duì)冠心病、頑固性皮膚潰瘍等疾病。目前的研究已證明Tβ4是一種在人體組織受損時(shí)起重要作用的蛋白，它能刺激表面細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞的遷移，調(diào)節(jié)層粘連蛋白的表達(dá)，以及刺激血管的生成，甚至于阻止細(xì)胞的死亡，所以，人們已經(jīng)開始把Tβ4用于臨床，比如美國(guó)的RegenRx公司就用Tβ4治療表皮受傷的病人，現(xiàn)在更發(fā)現(xiàn)Tβ4在心臟病上的效果也很好，但以上所述的臨床治療時(shí)都是使用的Tβ4的蛋白形式，這種方式是目前疾病治療的常用方式，但是它的缺點(diǎn)是Tβ4蛋白在體內(nèi)的半衰期短，病人要在一段時(shí)間內(nèi)多次用藥，這就大大增加了病人的治療成本，要解決這個(gè)問題，本發(fā)明想到了基因治療，基因治療中最簡(jiǎn)單有效的方法，就是選擇病毒載體來(lái)攜帶Tβ4進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)蛋白，但正是由于病毒載體的特性，使得此種方法的安全性成為了很大的問題，特別是怕載體進(jìn)入生殖細(xì)胞、干細(xì)胞等重要細(xì)胞。選用質(zhì)粒載體目前大家都認(rèn)為安全性比較高，但是它進(jìn)入細(xì)胞很困難，人們常常得選用病毒外殼、基因槍、脂質(zhì)體等外部條件協(xié)助質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞。這就使得操作復(fù)雜，且目的蛋白的表達(dá)效果不理想，本發(fā)明構(gòu)建出一種帶有Tβ4基因的質(zhì)粒載體，該重組質(zhì)粒載體是裸質(zhì)粒載體，不含病毒外殼與脂質(zhì)體，在使用時(shí)也不使用基因槍，僅把質(zhì)粒注射到病灶部位的肌肉內(nèi)即可產(chǎn)生Tβ4蛋白并對(duì)受損組織起作用。
本發(fā)明其次是提供一種重組質(zhì)粒載體pNL-Tβ4，該質(zhì)粒的第一個(gè)特征是含有Tβ4全長(zhǎng)氨基酸序列對(duì)應(yīng)的核酸序列；第二個(gè)特征是該質(zhì)粒含有大腸桿菌內(nèi)的自我復(fù)制區(qū)ColEI序列，人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子p(CMV)序列，卡那霉素抗性基因序列，牛生長(zhǎng)激素基因的polyA信號(hào)轉(zhuǎn)錄終止序列；第三個(gè)特征是該質(zhì)粒具備上述兩個(gè)特征后，大小沒有超過(guò)4kb，使得pNL-Tβ4能利用橫紋肌細(xì)胞的細(xì)胞表面的溝回結(jié)構(gòu)進(jìn)入肌細(xì)胞，再利用蛋白表達(dá)系統(tǒng)合成Tβ4，分泌到胞外對(duì)周圍組織的受損細(xì)胞起作用。
在實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)注射了pNL-Tβ4的心肌肉組織中一個(gè)月內(nèi)持續(xù)分泌Tβ4，而Tβ4與其它兩種蛋白一起，通過(guò)激活A(yù)kt/蛋白激酶B來(lái)促進(jìn)心肌細(xì)胞的遷移和存活。在研究了培養(yǎng)的細(xì)胞活性后，本發(fā)明將20只成年大鼠的冠狀動(dòng)脈結(jié)扎模擬心臟病發(fā)作，從而創(chuàng)造出大鼠模型。接著給10只大鼠局部注射胸腺素Tβ4 250ug/只，給10只大鼠局部注射鹽水200uL作為空白對(duì)照。注射pNL-Tβ4的大鼠一月后受損心臟中的細(xì)胞很少死亡，并在心臟病發(fā)后數(shù)周改善了心臟功能。而對(duì)照組大鼠受損心臟的細(xì)胞大量死亡。試驗(yàn)結(jié)果表明質(zhì)粒pNL-Tβ4進(jìn)入肌細(xì)胞，并使肌細(xì)胞分泌出Tβ4，Tβ4能夠改變細(xì)胞的代謝并創(chuàng)造出更強(qiáng)大的心肌細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠抵抗心臟病發(fā)后的低氧狀況。如果這種蛋白對(duì)人類同樣有效，那么這種蛋白將會(huì)成為一種強(qiáng)有力的心臟病治療藥物。
四.


圖1是pNL-Tβ4的結(jié)構(gòu)圖譜。
圖2是pNL-Tβ4的純化后的Agarose純度電泳圖譜。
圖3是對(duì)大鼠模型注射pNL-Tβ4后，對(duì)大鼠心臟壁厚度的影響結(jié)果。
圖4是對(duì)大鼠模型注射pNL-Tβ4后，對(duì)大鼠心臟壁纖維化程度的影響結(jié)果。
圖5是對(duì)小鼠模型注射pNL-Tβ4后，Tβ4蛋白在體內(nèi)的表達(dá)情況。
五.
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)例僅是為了對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，而不會(huì)對(duì)本發(fā)明造成任何的限制。
一)、裸質(zhì)粒pNL-Tβ4的構(gòu)建首先通過(guò)全基因合成擴(kuò)增出胸腺素β4的全基因序列GCT AGC ATG TCT GGT GAC AAA CCC GAT ATG GCT GAG ATC GAG AAA TTC GATAAG TCG AAA CTG AAG AAG ACA GAG ACG CAA GAG AAA AAT CCA CTG CCT TCCAAA GAA ACG ATT GAA CAG GAG AAG CAA GCA GGC GAA TCG TAA CTC GAG目的片段經(jīng)NdeI、XhoI雙酶切后分別回收小片段，質(zhì)粒pNL經(jīng)XhoI和EcoR I雙酶切后回收大片段，18℃在T4連接酶體系中三段目的基因片斷進(jìn)行連接，經(jīng)篩選得到的重組質(zhì)粒命名為pNL-Tβ4(具體結(jié)構(gòu)見圖1)。然后用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB平板，挑選陽(yáng)性菌落在LK中培養(yǎng)至OD600為1.5時(shí)離心收集菌體，用堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)1％Agarose電泳鑒定，表達(dá)量大于1mg質(zhì)粒/克菌體。經(jīng)NdeI、XhoI雙酶切檢定，切出150bp片斷。所獲得的的工程菌命名為pNL-Tβ4/DH5a。
二)、裸質(zhì)粒pNL-Tβ4的生產(chǎn)1.發(fā)酵1).搖瓶表達(dá)含胸腺素β4基因的pNL-Tβ4/DH5a，在含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中搖瓶過(guò)夜(37℃，200rpm)，再按1∶30接種含有50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10小時(shí)，收集菌體經(jīng)1％Agarose電泳分析，表達(dá)量約為1mg pNL-Tβ4/克菌。
2)發(fā)酵工藝a.培養(yǎng)基a)種子液培養(yǎng)基(LK)胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化鈉10克/升、卡那霉素50微克/毫升。
b)種養(yǎng)基(15升)磷酸氫二鈉315克、磷酸二氫鉀100克、氯化鈉10.05克、氯化銨50克、胰蛋白胨90克。
以上成分一起在罐中滅菌；下面的成分單獨(dú)滅菌后加入發(fā)酵罐。
硫酸鎂15克、葡萄糖450克、補(bǔ)料(500克/升)葡萄糖
b.發(fā)酵過(guò)程1.種子培養(yǎng)從已鑒定的平皿上劃取菌種，接種到50毫升(250毫升的三角瓶)LC中，36度、200轉(zhuǎn)/分、8小時(shí)后將這50毫升種子液轉(zhuǎn)接到700毫升LC中，36度、200轉(zhuǎn)/分，過(guò)夜。
2.發(fā)酵過(guò)程將培養(yǎng)好的種子液(OD600＝3-4)加入罐中，調(diào)好各參數(shù)，36度、150轉(zhuǎn)、溶氧100％，開始發(fā)酵；7小時(shí)后開始以2.5速流加3小時(shí)，約加入1500毫升補(bǔ)料，收集菌體。
2.前處理與層析(1)前處理采用堿裂解法破菌，離心并用0.45um的濾膜過(guò)濾后，準(zhǔn)備上層析。
(2)凝膠過(guò)濾層析上一步的澄清破菌液上Sepharose 6 Fast Flow層析柱，平衡液為100mM Tris-HCl，10mM EDTA，2M(NH4)2SO4，pH7.0，260nm監(jiān)測(cè)，收集前峰。
(3)親和層析采用Plasmidselect層析介質(zhì)，平衡液為100mM Tris-HCl，10mM EDTA，2M(NH4)2SO4，pH7.0，上一步的樣品直接上樣，洗脫液為100mM Tris-HCl，10mM EDTA，2M(NH4)2SO4，1.4M NaCl，pH7.0，收集洗脫峰。
(4)離子交換層析采用Source30Q層析介質(zhì)，平衡液為100mM Tris-HCl，10mM EDTA，0.4M NaCl，pH7.0，上一步的樣品用水稀釋5倍上樣，洗脫液為100mM Tris-HCl，10mM EDTA，1MNaCl，pH7.0，收集洗脫峰，即為pNL-Tβ4質(zhì)粒的純品。
得到的pNL-Tβ4通過(guò)Agarose純度檢測(cè)和反相HPLC檢測(cè)，純度大于95％(見圖2)。
三)、裸質(zhì)粒pNL-Tβ4對(duì)大鼠心臟缺血模型的治療效果評(píng)價(jià)1、病態(tài)動(dòng)物模型的制作與試驗(yàn)方法為了評(píng)價(jià)裸質(zhì)粒pNL-Tβ4的藥物有效性，建立了急性心肌梗塞的病態(tài)動(dòng)物模型——大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支再灌流模型。
肌肉注射甲苯噻嗪5mg/kg；氯胺酮50mg/kg麻醉，用碘酒、酒精消毒大鼠前胸壁；完全干燥后鋪無(wú)菌手術(shù)巾，暴露手術(shù)部位，在完全無(wú)菌狀態(tài)下進(jìn)行手術(shù)。切開大鼠前胸壁皮膚，切斷第3到第6肋骨，露出胸腔，將肺推向一側(cè)，打開心囊，露出心臟。從冠狀動(dòng)脈左前降支起點(diǎn)到3mm處，用6-0聚丙烯(polypropylene)結(jié)扎絲與NELATON結(jié)扎血管，1小時(shí)后再灌注。確認(rèn)無(wú)出血后，將切斷的肋骨與胸骨縫合，再縫合皮膚。手術(shù)后肌肉注射慶大霉素3mg/kg/天，共3天，防止感染。
2、利用超聲心動(dòng)圖比較左心室前壁厚度建立大鼠心臟缺血模型后，注射陰性對(duì)照物(生理鹽水)，試驗(yàn)物質(zhì)(裸質(zhì)粒PNL-Tβ4)。注藥后第14、28、56天利用心臟超聲心動(dòng)圖(Live 3D Echo 7500)與探針(probe 15-16L)，測(cè)定各組左心室前壁厚度。
基礎(chǔ)值(第0天，給藥前)，生理鹽水組0.2352±0.0332，裸質(zhì)粒pNL-Tβ4組0.2413±0.025，各組之間無(wú)顯著性差異。
給藥第14天生理鹽水組0.1265±0.0021，裸質(zhì)粒pNL-Tβ4組0.1278±0.014，各組之間無(wú)顯著性差異。
給藥第28天，生理鹽水組0.1221±0.0125，裸質(zhì)粒pNL-Tβ4組0.1295±0.009，各組之間無(wú)顯著性差異。
給藥56天，生理鹽水組0.1189±0.0135，裸質(zhì)粒pNL-Tβ4組0.1574±0.008，裸質(zhì)粒pNL-Tβ4組心臟左心室前壁厚度增加(p＜0.05)。
這些結(jié)果顯示，裸質(zhì)粒pNL-Tβ4能有效恢復(fù)心肌梗塞引起的左心室壁厚度的減少(見圖3)。
3、利用組織學(xué)圖片比較在心室纖維化程度上述試驗(yàn)動(dòng)物第56天，取心臟，以乳頭狀肌肉為準(zhǔn)，橫切心臟，做成切片。用1％福爾馬林浸泡24小時(shí)，制造石臘組織切片及玻片，進(jìn)行Masson’trichrom染色。各組之間比較采用了Image-pro PLUS ver.4.1(Media Cybernetics)方法。
心肌纖維化部分占全左心室心肌的比率為，生理鹽水組28.13±2.1％，pN L-Tβ4組22.91±2.3％(P＜0.05)；生理鹽水組、裸質(zhì)粒pNL-Tβ4組之間有顯著性差異。這些結(jié)果表明心肌注射裸質(zhì)粒pNL-Tβ4能有效減少心肌梗塞引起的心肌損傷和心肌纖維化(見圖4)。
4、Tβ4蛋白體內(nèi)表達(dá)的測(cè)定4.1動(dòng)物標(biāo)本的制定4.1.1取4周齡雄性小鼠，飼養(yǎng)一周，淘汰一般狀況不好的小鼠。
4.1.2用乙醚麻醉小鼠，用胰島素注射器緩慢肌注(5-10/秒)藥物0.1ml，針頭深度為3-5mm，注射完等5秒鐘再撥針，撥針后壓5秒。
4.1.3分別于0，1，2，3，4，5，6，7，8天取肌肉組織(在兩側(cè)肌腱處切斷，取完整的一塊肌肉)檢測(cè)。(如圖5)4.2 Tβ4蛋白量的測(cè)定4.2.1取肌肉組織和臟器，稱體重，并記下體重4.2.2裝在1.5ml試管(conical tube)內(nèi)，-80℃保存(液氮冰凍)4.2.3常溫下解凍，裝肌肉的試管內(nèi)放入500μl細(xì)胞緩沖液，用勻漿器制成勻漿(手動(dòng))4.2.4 4℃放置16小時(shí)4.2.5 4℃5000rpm離心30分鐘，取上清液。
4.2.6測(cè)上清液的總蛋白4.2.7按HGF測(cè)定盒說(shuō)明測(cè)定上清液有Tβ4蛋白量(ELISA方法)4.2.8將測(cè)定出來(lái)的Tβ4蛋白量換算成每100mg肌肉內(nèi)的Tβ4蛋白量，換算方法如下100mg肌肉的Tβ4蛋白＝ELISA方法測(cè)得的蛋白量÷(100/肌肉體重mg×總蛋白量)ELISA方法測(cè)得的蛋白單位為pg/ml，應(yīng)換算成ng/ml，1000pg＝1ng。
權(quán)利要求
1.一類通過(guò)質(zhì)粒載體介導(dǎo)的基因治療載體組合物，特征為該質(zhì)粒能進(jìn)入橫紋肌細(xì)胞，且在肌細(xì)胞內(nèi)合成、分泌人胸腺素β4；合成的胸腺素β4氨基酸序列為Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser。
2.能編碼出權(quán)利要求1所述的人胸腺素β4氨基酸序列的基因序列。
3.包含權(quán)利要求2所述基因的重組質(zhì)粒。
4.權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，尤其是pNL-Tβ4。
5.用權(quán)利要求4的載體轉(zhuǎn)化的微生物。
6.權(quán)利要求5的微生物，尤其是經(jīng)權(quán)利要求4中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的TOP10F’、DH5α。
7.以權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒為組合物成分，用于治療或預(yù)防肢體潰瘍、糜爛。
8.以權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒為組合物主要成分，用于治療或預(yù)防心臟疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因治療領(lǐng)域，具體的說(shuō)，就是以人胸腺素β4基因插入到一真核表達(dá)啟動(dòng)子下，構(gòu)建成的一種重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒能進(jìn)入橫紋肌細(xì)胞，且在細(xì)胞內(nèi)利用細(xì)胞本身的蛋白合成系統(tǒng)，合成Tβ4，且分泌到胞外，從而加速傷口的愈合，以及阻止細(xì)胞的死亡，可用于皮膚、心臟損傷的修復(fù)。
文檔編號(hào)A61P17/00GK1940075SQ20051010579
公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者馬素永, 聶李亞, 許松山, 文美玉 申請(qǐng)人:北京諾思蘭德生物技術(shù)有限責(zé)任公司