專利名稱：一種抗apoA I、apoB抗體制備方法以及用于檢測apoA I、apoB的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體的制備方法以及測定血清成分的試劑盒，特別是抗APOA I、APOB抗體的制備方法及測定血清中的apoA I、apoB的試劑盒，可廣泛應用在醫(yī)學及生物化學技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
載脂蛋白A I(apoA I)是apoA族最多的一種組份，apoA I為單一多肽鏈，由243個氨基酸殘基組成，分子量為28300D，是高密度脂蛋白(HDL)的主要載脂蛋白。HDL具有防止動脈粥樣硬化的作用，因此，測定血清(漿)中apoA I的含量已成為防止心腦血管疾病的常規(guī)檢測項目。載脂蛋白B(apoB)是低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白質(zhì)，而LDL增高是公認的致動脈粥樣硬化的危險因子，因此，血清apoB的測定在臨床上有著非常重要的作用，聯(lián)合檢測apoA I、apoB對早診斷、早預防、早治療心腦血管疾病提供了可靠的依據(jù)。
已知測定apoA I、apoB的方法有層析法、電泳法、免疫分析法、其中層析法和電泳法操作繁瑣，不能進行批量樣本分析和直接上全自動生化分析儀等缺點，而免疫分析法中的免疫擴散法、放射免疫分析法、熒光標記免疫分析法、酶標記免疫分析法、化學發(fā)光免疫分析法也存在諸多不足之處，如需要特殊的設備，樣品需要預處理，不能上全自動生化分析儀進行批量檢測分析等。臨床上常用的免疫透射比濁法因其樣本用量少，可直接在全自動生化分析儀上進行批量樣本分析、操作簡單受其歡迎，但目前建立的方法及試劑都存在一些缺點和/或不足，主要表現(xiàn)在一是抗體效價不高，都在1∶16以下，特異性、親合力、親和力不好，二是校準血清是以人血清為基質(zhì)，雖然乙肝表面抗原陰性、HIV檢測陰性、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶正常的人血清，但這也很難排除沒有其他傳染病的可能，給操作者帶來很大的危險性，而且為凍干品，每批的定值不一，使用前需用水復溶，操作極其不便，而且不同的復溶者復溶后瓶間差異大，復溶后必須冰凍保存，特別是不能反復解凍使用，不但造成試劑浪費，而且質(zhì)量也得不到保證，測定結(jié)果差異大，其穩(wěn)定性也不好；三是對高脂、黃疸、溶血樣本抗干擾能力差。四是采用單點校準液定標，不符合曲線回歸方程計算，導致出現(xiàn)高值偏低，低值偏高的現(xiàn)象，所測結(jié)果不準確。五是抗血清在短時間內(nèi)出現(xiàn)沉淀，使上機操作困難，影響檢測效果。
另外，檢測apoA I、apoB所需的抗apoA I、apoB抗體的制備過程中，抗原的提取方式直接關(guān)系到抗體(抗血清)質(zhì)量的好壞。已知的方法是采用倍比稀釋的密度梯度超離心技術(shù)收集到apoA I、apoB量極高的HDL和LDL，然后再采用雙脫脂法去除脂肪和剩余的雜蛋白，即可得到電泳純的apoA I和apoB抗原，然后進行免疫。上述方法的缺點是超離心所用的時間較長，而且其脫脂和超離的過程中往往使蛋白發(fā)生了變性和改變了蛋白的空間結(jié)構(gòu)，改變了蛋白的免疫原性，從而免疫所得抗血清效價不高。采用雙擴散免疫電泳，apoA I效價大于1∶32，apoB效價大于1∶256的機率非常的小。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是克服上述背景技術(shù)的不足，提供一種抗apoA I、apoB抗體制備方法的改進，所述的抗體制備方法在制備過程中應具有無須超速離心處理、制備時間短、抗體的效價高的特點；本發(fā)明的另一個目的是克服上述背景技術(shù)的不足，提供一種用于檢測apoA I、apoB的試劑盒的改進，所述的檢測試劑盒應具有樣本無需稀釋、操作簡單、準確度高、重復性好、抗干擾能力強，基質(zhì)穩(wěn)定的特點。
為了達到上述目的，本發(fā)明人進行了廣泛深入的研究，結(jié)果通過用特殊的方法提起的apoAI、apoB抗原經(jīng)免疫動物后，制得一種與人血清中的apoA I、apoB抗原有高度特異反應性的抗體；并利用該抗體配置成檢測試劑，并配以相應的校準液，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種制備抗apoA I、apoB抗體的方法，該方法包括apoA I、apoB抗原的提取，動物免疫和抗體純化，所述的apoA I、apoB抗原的提取步驟是用脂蛋白沉淀劑與表面活性劑-血清復合物或表面活性劑-血漿復合物混合，使脂蛋白沉淀，沉淀劑、表面活性劑、血清或血漿三者體積配比為1∶2∶1至1∶4∶3；然后棄去上清液，收集沉淀物后洗滌，將洗滌后所得到的沉淀物用脫脂劑脫脂，除去脫脂劑，加入apoA1溶解劑，得apoB，或加入apoB溶解劑，得apoA1，最后將所得apoA1、apoB采用SDS-PAGE電泳凝膠切割，收集含AapoA1、apoB凝膠研碎，提取apoA1、apoB抗原。
所述的動物免疫中，第一次免疫動物時采用的是抗原-表面活性劑復合物，其中抗原用量按50公斤動物體重0.5-5mg，抗原與表面活性劑的體積配比為1∶1至1∶2，且抗原微粒完全被表面活性劑包復。
所述的沉淀劑、表面活性劑、血清或血漿三者體積配比為1∶3∶2；所述的抗原-表面活性劑復合物中，抗原與表面活性劑的體積配比為4∶6。
一種檢測人血清中apoA I、apoB含量的試劑盒，其雙試劑劑型包括
a、一種使樣品中apoA I、apoB抗原位點充分暴露，有利于與抗apoA I、apoB抗體充分結(jié)合的反應劑，所述的反應劑包括50-200mmol/L緩沖液、20-80％重量比的高分子加速劑、0.1-5％重量比的防腐劑和0.1-10％重量比的穩(wěn)定劑，其余為純化水；b、抗體試劑，其中分別包括，一種與人血清中的apoA I、apoB抗原有高度特異反應性的抗apoA I抗血清、抗apoB抗血清和抗血清稀釋液，抗apoA I抗血清與抗血清稀釋液以及抗apoB抗血清與和抗血清稀釋液的混合的體積比為1∶1-1∶10；所述的抗血清稀釋液包括50-200mmol/L緩沖液、20-80％重量比的高分子加速劑、0.1-5％重量比的防腐劑和0.1-10％重量比的穩(wěn)定劑，其余為純化水；c、一種用來與樣品比較，進行結(jié)果計算的液體血清型恒定值校準液，包括20-100mmol/L的緩沖液、0.1-2.5g/L apoAl抗原、0.1-2.5g/L AapoB抗原、0.01-2％重量比的抗氧化劑、0.1-5％重量比的防腐劑、0.1-10％重量比的穩(wěn)定劑、0.1-0.3％重量比的防霉劑，其余是基質(zhì)；所述的反應劑包括0.1-10％重量比的表面活性劑，所述的抗體試劑中還包括0.01-5％重量比的抗氧化劑；所述的血清型恒定值校準液中的基質(zhì)是小牛血清。
一種檢測人血清中apoA I、apoB含量的試劑盒，其單試劑劑型包括a、抗體液，其中分別包括，一種與人血清中的apoA I、apoB抗原有高度特異反應性的抗apoA I抗血清、抗apoB抗血清和反應劑，抗apoA I抗血清與反應劑以及抗apoB抗血清與反應劑的混合的體積比分別為1∶1-1∶30；所述的反應劑包括50-200mmol/L緩沖液、20-80％重量比的高分子加速劑、0.1-5％重量比的防腐劑和0.1-10％重量比的穩(wěn)定劑，其余為純化水；b、一種用來與樣品比較，進行結(jié)果計算的液體血清型恒定值校準液，包括20-100mmol/L的緩沖液、0.1-2.5g/L apoAl抗原、0.1-2.5g/LAapoB抗原、0.01-2％重量比的抗氧化劑、0.1-5％重量比的防腐劑、0.1-10％重量比的穩(wěn)定劑、0.1-0.3％重量比的防霉劑，其余是基質(zhì)；所述的抗體液還包括0.1-10％重量比的表面活性劑，以及0.01-5％重量比的抗氧化劑；所述的血清型恒定值校準液中的基質(zhì)是小牛血清。
所述的反應劑和抗血清稀釋液中還可分別包括0.1-0.5％重量比的反應促進劑。
所述的抗體液中還可分別包括重量比為.0.1-0.5％的反應促進劑。
所述的液體血清型恒定值校準液中還包括0.01-4％重量比的增效劑。
所述的反應劑和抗血清稀釋液中還可分別加入適量的電解質(zhì)。
由于本發(fā)明所提供的制備抗apoA I、apoB抗體的方法，首次提出采用表面活性劑結(jié)合沉淀劑直接免疫電泳法提取apoA I和apoB抗原，由于表面活性劑與血清形成復合物，使apoAI和apoB在提取過程中不受沉淀劑或有機溶劑的影響，并且該方法不需超速離心，時間短(從人血清(漿)到apoA I、apoB純品制備成功，僅需要2個工作日)，避免了因長時間離心破壞抗原的免疫源性和使apoA I、apoB發(fā)生脫酰氨基和氧化作用，并改變蛋白質(zhì)的空間位阻的弊端，從而保證了所得的apoA I、apoB的免疫源性高。通過大量的研究證實采用本發(fā)明所提取的apoA I、apoB抗原(免疫原)所免疫出的抗血清效價，采用雙擴散免疫電泳法，apoA I效價大于或等于1∶32，apoB效價大于或等于1∶516。
本發(fā)明所提供的試劑盒，它是利用抗原抗體反應，加入反應劑(樣品稀釋液)，解除樣本中抗原周圍的電子層和水化層，使抗原位點充分暴露，然后加入apoA I抗體(即抗血清)或apoB抗體(即抗血清)，高特異反應性的apoA I、apoB抗體與樣本中相應的apoA I、apoB抗原反應，形成不溶性的抗原-抗體復合物，產(chǎn)生一定的濁度，其濁度高低與樣本中的apoA I、apoB含量成正比，在規(guī)定波長下測定該不溶性抗原-抗體復合物的吸光度值，與已知恒定的校準液比較，則可計算出樣本中apoA I、apoB的含量。此方法及試劑操作簡單、樣本不用預稀釋；所采用的血清型液體恒定值校準液不需每批更改參數(shù)、準確度高、重復性好、抗干擾能力強，適用于各種類型的全自動生化分析儀；另外由于用牛血清取代了人血清，使用更加安全方便。
具體實施例方式
本發(fā)明的有關(guān)細節(jié)描述如下本發(fā)明的抗apoA I、apoB是用apoA I、apoB抗原免疫動物而產(chǎn)生的，該抗體具有與人血清中的apoA I、apoB抗原有高度的特異反應性，與其它無關(guān)載脂蛋白不發(fā)生交叉反應。
對于本發(fā)明中用于免疫的動物，可以是成熟健壯的兔子，山羊、綿羊、牛、馬等等，這里并無特別限制，條件是只要用apoA I、apoB抗原免疫后能產(chǎn)生具有與apoA I、apoB抗原有高度的特異反應性的抗apoA I、apoB抗體即可。本發(fā)明中優(yōu)選的是綿羊作為免疫對象，最好是同一種直系綿羊。作為用于免疫綿羊的免疫原是用本發(fā)明方法中所提出的方法獲得。
抗原的提取及抗體(抗血清)制備的優(yōu)選方法A.抗原的提取本發(fā)明提供了一種apoA I、apoB抗原提取的方法，主要是用脂蛋白沉淀劑與表面活性劑-血清復合物或表面活性劑-血漿復合物混合，使脂蛋白沉淀，沉淀劑、表面活性劑、血清或血漿三者比例為1∶2∶1至1∶4∶3(推薦1∶3∶2)；然后棄去上清液，收集沉淀物后洗滌，將洗滌后所得到的沉淀物用脫脂劑脫脂，除去脫脂劑，加入apoA I溶解劑，得apoB，或加入apoB溶解劑，得apoA I，最后將所得apoA I、apoB采用SDS-PAGE電泳凝膠切割，收集含apoA I、apoB凝膠研碎，提取apoA I、apoB抗原。
具體操作步驟為1、將200ml混合血清與300ml的脂肪族的表面活性劑混勻，使其形成表面活性劑-血清復合物。2、采用已知的肝素錳沉淀劑100ml在攪拌器上慢慢加入到200mI表面活性劑-混合血清或血漿中，使脂蛋白沉淀，收集沉淀物后用生理鹽水洗滌。3、脫去脂蛋白中的脂質(zhì)用已知的Scanu法進行脫脂，即將洗滌后的脂蛋白沉淀物加入到預冷的(-15℃)無水乙醇∶無水乙醚(3∶2)的混合液中，不斷攪拌，經(jīng)12小時過夜后，在-10℃至4℃間離心，去上清得沉淀物，再重復脫脂過程一次，3.將上述脫脂后的沉淀物用已知的SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺)凝膠電泳，根據(jù)apoA I和apoB所在凝膠中的不同位置，分別將兩部份凝膠分開，然后將其搗碎，分別使apoAI和apoB析出，最后進行濃縮后真空干燥放-20℃保存。
B、抗體的制備本發(fā)明公開的抗體制備分為兩大部份一是免疫過程；二是抗體的分離。其中一、本發(fā)明方法只需分4次免疫過程就能完成；第1次在免疫之前給綿羊腹股溝和腹腔以及背部多處注射少劑量的抗生素，7天后給予注射能降低綿羊免疫能力的物質(zhì)，如姥鮫烷等.3天后，用表面活性劑與apoA I、apoB抗原混合液在綿羊的背部和大腿內(nèi)兩側(cè)采用皮內(nèi)結(jié)合皮下進行多點少劑量注射。apoA I、apoB抗原用量按綿羊的體重而定，一般是50公斤體重抗原用量為0.5-5mg，優(yōu)選1-2mg?？乖c表面活性劑的體積比為1∶1至1∶2(推薦4∶6)，形成抗原-表面活性劑的復合物，使抗原完全被表面活性劑包復在所述的抗原-表面活性劑復合物中(在振蕩器上慢慢振搖得到)，結(jié)構(gòu)不受外境因素影響而發(fā)生改變，從而保持完整；另外還能使抗原在體內(nèi)慢慢地施放，從而達到延長吸收時間的作用。這里的表面活性劑為陰離子表面活性子，作為實例可以是十二烷基硫酸鈉(SDS)，濃度為0.01-1％，優(yōu)選0.1-0.5％的十二烷基硫酸鈉。第2次在第1次免疫后1-8周，優(yōu)選第3周，用已知方法制得的不完全佐劑(即取石蠟油6份、羊毛脂4份與5份內(nèi)含0.1％SDS，不含抗原緩沖液混勻，滅菌即得不完全佐劑)，分別與apoA I、apoB抗原按比例混合，其混合比例為比0.1∶10(V/V)，優(yōu)選1∶2。將不完全佐劑-抗原的混合物在振蕩器上慢慢振搖，促使其成為油包水抗原乳化復合物。將此油包水抗原乳化復合物在綿羊腹部和淋巴節(jié)處采用進行5-20點注射，優(yōu)選10點，其注射劑量為0.05ml-1ml/點，優(yōu)選0.5ml/點。第3次在第2次免疫后1-4周，優(yōu)選第2周，在上述不完全佐劑中加入免疫促進劑，如明礬、殺死的結(jié)核分桿菌或卡介苗，即得完全佐劑。然后將其與apoAI、apoB抗原按比例混合，其混合比例為0.1∶10(W/W)，優(yōu)選1∶2.將不完全佐劑-抗原的混合物在振蕩器上慢慢振搖，促使其成為油包水抗原乳化復合物。將此油包水抗原乳化復合物在綿羊腹部和淋巴節(jié)處采用進行5-20點注射，優(yōu)選10點，其注射劑量為0.05ml-1ml/點，優(yōu)選0.5ml/點。第4次采用與第3次一樣的方法對綿羊進行加強一次，間隔7天后，用注射器抽取10ml靜脈血測定抗體效價，如apoA I效價大于或等于1∶32，apoB效價大于或等于1∶516，則一次性采取頸動脈放血。
二、抗體分離將上述頸動脈血放置25-30℃24小時，使紅細胞收縮凝固，吸取上清液(即血清)用3000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄去沉淀物，即得apoA I、apoB抗血清，然后用已知的親合層析或離子交換層析法對上述apoA I、apoB抗血清進行純化，從而得到高效價的、高純度的羊抗人apoA I、apoB抗體(抗血清)。
為保持抗體(抗血清)效價，本發(fā)明還加入了0.1-30％重量比穩(wěn)定劑和0.05-1％重量比防腐劑，作為穩(wěn)定劑可以是非還原性的糖(如蔗糖、麥芽糖)、丙三醇或乙二胺四乙酸二鈉鹽，作為防腐劑可以是疊氮鈉、乙基汞硫代硫酸鈉等。
本發(fā)明提供的檢測載脂蛋白apoA I、apoB的試劑盒分為單試劑和雙試劑二種。
其中雙試劑的試劑盒中包括A.反應劑主要包括50-200mmol/L緩沖液、0.1-10％重量比的表面活性劑、20-80％重量比的高分子加速劑、0.1-5％重量比的防腐劑和0.1-10％重量比的穩(wěn)定劑，還可酌情加入0.1-0.5％重量比的反應促進劑和適量的電解質(zhì)。
作為緩沖液可以是磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、PIPES緩沖液、HEPES緩沖液、TAPS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液等，本發(fā)明優(yōu)選磷酸鹽緩沖液，緩沖液的PH值為5-10，優(yōu)選7.0-9.0。
作為表面活性劑可以是非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑，這里優(yōu)選非離子表面活性劑，作為實例有Theist、Tween系列、聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等，這些表面活性劑可以單獨使用，也可以兩種或兩種以上混合使用，這里不作限制。
作為電解質(zhì)的實例可以是陰離子或陽離子，本發(fā)明優(yōu)選陽離子中的氯化鈉(NaCl)。
作為高分子加速劑的實例可以是聚乙二醇，其分子量在1500-200000中的一種或其混合物，優(yōu)選聚乙二醇6000。
作為防腐劑的實例可以是疊氮鈉、乙基汞硫代硫酸鈉、對羥基苯甲酸酯類、苯酚、廣譜抗生素，本發(fā)明從環(huán)保角度考慮，優(yōu)選廣譜抗菌素。
作為穩(wěn)定劑的實例可以是乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、牛(或人)血清白蛋白、乙二醇、甘露糖醇、海藻糖等。
作為反應促進劑的實例是溴化己二甲胺。
B.抗體試劑本發(fā)明中的抗apoA I抗體試劑、抗apoB抗體試劑，主要包括經(jīng)前述方法制備所得的抗apoA I血清、抗apoB血清和抗血清稀釋液，抗apoA I血清、抗apoB血清分別用抗血清稀釋液按1∶1-1∶10比例稀釋，還加入0.01-5％重量比的抗氧化劑。
抗血清稀釋液主要包括50-200mmol/L緩沖液、20-80％重量比的高分子加速劑、0.1-5％重量比的防腐劑和0.1-10％重量比的穩(wěn)定劑，還可酌情加入0.1-0.5％重量比的反應促進劑和適量的電解質(zhì)。
作為抗氧化劑的實例可以是柳氮磺胺吡啶、丁基羥基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羥基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、磷脂等。
作為抗氧化劑可以先溶解在丙二醇或乙醇中(抗氧化劑與丙二醇或乙醇的重量比＝1∶5)，然后加入到抗apoA I試劑和apoB抗體試劑中。
C.液體血清型恒定值校準液校準液是決定試劑準確度的重要因素之一。載脂蛋白apoA I、apoB在液體狀態(tài)下，會自發(fā)氧化，使校準液的值在短時間內(nèi)發(fā)生很大的下降，所以必須使用抗氧化劑來減緩或阻止載脂蛋白apoA I、apoB的氧化速度，但是由于時間過長或某些客觀的因素，抗氧化劑本身也發(fā)生了還原，使其抗氧化效果下降。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)抗氧化劑被還原的同時，產(chǎn)生了一定量的自由基，為了提高校準液在液體狀態(tài)下的穩(wěn)定性，我們在其中加入適量的增效劑，使增效劑與抗氧化劑還原產(chǎn)生的自由基作用，使抗氧化劑得以再生，從而提高了校準液的穩(wěn)定性。
本發(fā)明首次采用抗氧化劑的再生技術(shù)來穩(wěn)定載脂蛋白校準液，使校準液的值在2-8℃一年幾乎保持不變。另外，為方便操作，每批測試不用更改參數(shù)，本發(fā)明采用了“恒定”的校準液定值(恒定指每個批次的定值都保持不變)，本發(fā)明的apoA I定值為第1點0.1-0.6g/L，優(yōu)選0.55g/L；第2點0.7-1.1g/L，優(yōu)選1.10g/L；第3點1.2-1.7g/L，優(yōu)選1.6g/L；第4點1.8-2.5g/L，優(yōu)選2.2g/L。
apoB的定值為第1點0.1-0.6g/L，優(yōu)選0.50g/L；第2點0.7-1.1g/L，優(yōu)選1.00g/L；第3點1.2-1.7g/L，優(yōu)選1.5g/L；第4點1.8-2.5g/L，優(yōu)選2.0g/L。
作為恒定值的校準液主要包括20-100mmol/L的緩沖液、0.1-2.5g/LapoA I抗原、0.1-2.5g/L apoB抗原、0.01-2％重量比的抗氧化劑、0.1-5％重量比的防腐劑、0.1-10％重量比的穩(wěn)定劑、0.1-0.3％重量比的防霉劑，還可加入0.01-4％重量比的增效劑和適量小牛血清。
作為緩沖液的實例有PBS、Tris、TAPS、、HEPPS、CHES、CAPS、CAPSO、POPSO、Tricie、甘氨酸、雙甘氨肽、二甘氨酸、硼酸鹽等緩沖液等。
作為抗氧化劑的實例有柳氮磺胺吡啶、丁基羥基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羥基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、磷脂等?？寡趸瘎┛梢韵热芙庠?0-100ml丙二醇或乙醇中，然后加入到校準液中。
作為增效劑的實例有檸檬酸、酒石酸、抗壞血酸等。
作為防腐劑的實例有疊氮鈉、乙基汞硫代硫酸鈉、對羥基苯甲酸酯類、苯酚、廣譜抗生素、山梨酸及其鹽類等。
作為穩(wěn)定劑的實例可以是乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、牛(或人)血清白蛋白、丙三醇、單糖、多糖等。
作為防霉劑的實例有丙酸鈉、過氧乙酸及其鹽類、百里酚等。
其中單試劑的試劑盒中包括A.抗體液主要包括經(jīng)前述方法制備所得的抗apoA I抗血清、抗apoB抗血清和反應劑，抗apoA I抗血清與抗apoB抗血清分別和反應劑按1∶1-1∶30體積比例稀釋，還分別加入重量比為0.01-5％的抗氧化劑。
反應劑主要包括50-200mmol/L緩沖液、0.1-10％重量比的表面活性劑、20-80％重量比的高分子加速劑、0.1-5％重量比的防腐劑和0.1-10％重量比的穩(wěn)定劑；還可加入0.1-0.5％重量比的反應促進劑和0.1-40％重量比的電解質(zhì)、B、校準液校準液主要包括20-100mmol/L的緩沖液、0.1-2.5g/L apoA I抗原、0.1-2.5g/L apoB抗原、0.01-2％重量比的抗氧化劑、0.1-5％重量比的防腐劑、0.1-10％重量比的穩(wěn)定劑、0.1-0.3％重量比的防霉劑，還可加有0.01-4％重量比的增效劑和適量小牛血清。
可知單試劑、雙試劑中的反應劑均相同；抗apoA I、apoB抗體制備方法實施例實施例1一、抗原提取1、將200ml混合血清與300ml的脂肪族的表面活性劑混勻，使其形成表面活性劑-血清復合物。2、采用已知的肝素錳沉淀劑100ml在磁力攪拌器上慢慢加入到200ml表面活性劑-混合血清或血漿中，使脂蛋白沉淀，收集沉淀物后用生理鹽水洗滌3次。3、脫去脂蛋白中的脂質(zhì)用已知的Scanu法進行脫脂，即將洗滌后的脂蛋白沉淀物加入到預冷的(-15℃)無水乙醇無水乙醚(3∶2)的混合液中，不斷攪拌，經(jīng)12小時過夜后，在-10℃(或4℃)離心(2000r/min)，去上清得沉淀物，再重復脫脂過程一次，3.將上述脫脂后的沉淀物用已知的SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺)凝膠電泳，根據(jù)apoA I和apoB所在凝膠中的不同位置，分別將兩部份凝膠分開，然后將其搗碎，分別使apoA I和apoB析出，最后進行濃縮后真空干燥放-20℃保存。
二、動物免疫第1次在免疫之前給動物多處注射少劑量的抗生素，7天后給予注射能降低免疫能力的物質(zhì)，3天后，在動物的背部和大腿內(nèi)兩側(cè)采用皮內(nèi)結(jié)合皮下進行多點少劑量注射抗原-表面活性劑復合物，其中抗原用量按50公斤動物體重0.5mg；第2次在第1次免疫后1-8周，在動物腹部和淋巴節(jié)處注射不完全佐劑與apoA I、apoB抗原油包水抗原乳化復合物；第3次在第2次免疫后1-4周，在動物腹部和淋巴節(jié)處注射完全佐劑與apoA I、apoB抗原油包水抗原乳化復合物；第4次采用與第3次一樣的方法對動物進行加強注射一次，間隔7天后，用注射器抽取10ml靜脈血測定抗體效價，如apoA I效價大于或等于1∶32，apoB效價大于或等于1∶516，則一次性采取頸動脈放血。
在上述四次動物免疫時，其第一次免疫動物過程所采用的抗原-表面活性劑復合物中，抗原與表面活性劑的體積配比為4∶6，且抗原微粒完全被表面活性劑包復(在振蕩器上慢慢振搖得到)。
實施例2基本與實施例1相同，只是第一次免疫中注射抗原-表面活性劑復合物時，其中抗原用量是按50公斤動物體重2mg。
實施例3基本與實施例1相同，只是第一次免疫中注射抗原-表面活性劑復合物時，其中抗原用量是按50公斤動物體重5mg。
apoA I、apoB檢測試劑盒的實施例實施例4(雙試劑)試劑1apoA I反應劑包括磷酸鹽緩沖液100mmol/L聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑) 5％NaCl(電解質(zhì))0.5％PEG-6000(高分子加速劑) 80％廣譜抗生素(防腐劑) 0.3％溴化己二甲胺(反應促進劑)0.3％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)0.5％其余為純化水試劑2apoA I抗體試劑
apoA I抗血清稀釋液 1000ml羊抗人apoA I抗血清 1000ml丁基羥基茴香醚(抗氧化劑) 5％其中，apoA I抗體稀釋液包括磷酸鹽緩沖液 100mmol/LNaCL(電解質(zhì)) 0.5％PEG-6000(高分子加速劑) 80％廣譜抗生素(防腐劑) 0.3％溴化己二甲胺(反應促進劑) 0.3％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑) 0.5％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑) 5％其余為純化水試劑1apoB反應劑包括磷酸鹽緩沖液 100mmol/LTWeen-20(表面活性劑) 5％PEG-6000(高分子加速劑) 80％廣譜抗生素(防腐劑) 0.3％溴化己二甲胺(反應促進劑) 0.3％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑) 0.5％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑) 5％其余為純化水試劑2apoB抗體試劑apoB抗體稀釋液 1000ml羊抗人apoB抗血清 1000ml丁基羥基茴香醚(抗氧化劑) 0.04％
其中apoB抗血清稀釋液包括磷酸鹽緩沖液100mmol/LPEG-6000(高分子加速劑) 80％廣譜抗生素(防腐劑) 0.3％溴化己二甲胺(反應促進劑)0.3％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)5％其余為純化水3、液體血清型恒定值校準液CAPSO(緩沖液) 100mmol/L柳氮磺胺吡啶(抗氧化劑) 0.5％檸檬酸(增效劑) 3％廣譜抗生素(防腐劑) 0.5％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑) 1％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑) 8％丙酸鈉(防霉劑) 0.3％其余為小牛血清校準液共有8份，分別加入apoA I、apoB的各4種不同重量的抗原，形成不同濃度的抗原，濃，濃度按照apoA I、apoB各自不同的4個恒定值濃度確定，然后用0.22μm的濾膜抽濾除菌，放2-8℃保存。
實施例5(雙試劑)試劑1apoA I反應劑包括磷酸鹽緩沖液200mmol/L聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑) 10％NaCL(電解質(zhì))0.3％
PEG-6000(高分子加速劑)60％廣譜抗生素(防腐劑)5％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑) 0.5％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑) 10％溴化己二甲胺(反應促進劑) 0.5％其余為純化水試劑2apoA I抗體試劑apoA I抗血清稀釋液1000ml羊抗人apoA I抗血清100ml丁基羥基茴香醚(抗氧化劑) 0.03％其中apoA I抗血清稀釋液包括磷酸鹽緩沖液200mmol/LNaCL(電解質(zhì)) 0.3％PEG-6000(高分子加速劑)60％廣譜殺菌劑(防腐劑)5％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑) 0.5％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑) 10％其余為純化水試劑1apoB反應劑包括磷酸鹽緩沖液 200mmol/LTWeen-20(表面活性劑) 10％PEG-6000(高分子加速劑)60％廣譜殺菌劑(防腐劑)5％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑) 0.5％
牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)10％溴化己二甲胺(反應促進劑)0.5％其余為純化水試劑2apoB抗體試劑apoB抗血清稀釋液1000ml羊抗人apoB抗血清100ml丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)0.04％其中apoB抗血清稀釋液包括磷酸鹽緩沖液200mmol/LPEG-6000(高分子加速劑) 60％廣譜殺菌劑(防腐劑) 5％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)10％其余為純化水3、液體血清型恒定值校準液CAPSO(緩沖液) 100mmol/L丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)2％檸檬酸(增效劑) 1％廣譜殺菌劑(防腐劑) 1％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)6％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)8％丙酸鈉(防霉劑) 0.3％其余為小牛血清校準液共有8份，分別加入apoA I、apoB的各4種不同重量的抗原，形成不同濃度的抗原，濃，濃度按照apoA I、apoB各自不同的4個恒定值濃度確定，然后用0.22μm的濾膜抽濾除菌，放2-8℃保存。
實施例6(雙試劑)試劑1apoA I反應劑包括磷酸鹽緩沖液50mmol/L聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑) 0.1％NaCL(電解質(zhì))0.1％PEG-6000(高分子加速劑) 20％廣譜殺菌劑(防腐劑) 0.1％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.1％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)0.1％溴化己二甲胺(反應促進劑)0.1％其余為純化水試劑2apoA I抗體試劑apoA I抗血清稀釋液 1000ml羊抗人apoA I抗血清 100ml丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)0.01％其中APOA I抗血清稀釋液包括磷酸鹽緩沖液 50mmol/LNaCL(電解質(zhì))0.1％PEG-6000(高分子加速劑) 20％廣譜殺菌劑(防腐劑) 0.1％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.1％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)0.1％
其余為純化水試劑1apoB反應劑包括磷酸鹽緩沖液50mmol/LTWeen-20(表面活性劑)0.1％PEG-6000(高分子加速劑) 20％廣譜殺菌劑(防腐劑) 0.1％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.1％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)0.1％溴化己二甲胺(反應促進劑)0.1％其余為純化水試劑2apoB抗體試劑apoB抗血清稀釋液1000ml羊抗人apoB抗血清100ml丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)0.01％其中apoB抗血清稀釋液包括磷酸鹽緩沖液50mmol/LPEG-6000(高分子加速劑) 20％廣譜殺菌劑(防腐劑) 0.1％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.1％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)0.1％其余為純化水3、液體血清型恒定值校準液CAPSO(緩沖液) 20mmol/L丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)0.01％
檸檬酸(增效劑) 0.0l％廣譜抗生素(防腐劑) 0.1％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑) 0.1％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑) 0.1％丙酸鈉(防霉劑) 0.01％其余為小牛血清校準液共有8份，分別加入apoA I、apoB的各4種不同重量的抗原，形成不同濃度的抗原，濃度按照apoA I、apoB各自不同的4個恒定值濃度確定，然后用0.22μm的濾膜抽濾除菌，放2-8℃保存。
上述雙試劑使用時的操作步驟是取試劑(反應劑)210μl加入樣品3μl混勻，37℃水浴5分鐘后在340nm處測定吸光度A1，再加入試劑2(抗體試劑)70μl混勻，，37℃水浴5分鐘后在340nm處測定吸光度A2，計算出ΔA，即ΔA＝A2-A1，與同樣處理的恒定值校準液比較，可計算出樣品中apoA I、apoB的濃度。
實施例7(單試劑)1.apoA I抗體液apoA I反應劑1000ml羊抗人apoA I抗血清 1000ml丁基羥基茴香醚 5％溴化己二甲胺(反應促進劑)0.3％其中，apoA I反應劑包括磷酸鹽緩沖液100mmol/L聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑) 5％NaCL(電解質(zhì))0.5％
PEG-6000(高分子加速劑)80％廣譜殺菌劑(防腐劑)0.3％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑) 0.05％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑) 0.5％其余為純化水2、apoB抗體液apoB反應劑1000ml羊抗人apoB抗血清 1000ml丁基羥基茴香醚(抗氧化劑) 0.04％溴化己二甲胺(反應促進劑) 0.3％其中，apoB反應劑包括磷酸鹽緩沖液 100mmol/LTWeen-20(表面活性劑) 5％PEG-6000(高分子加速劑)80％廣譜殺菌劑(防腐劑)0.3％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑) 0.05％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑) 0.5％其余為蒸餾水3、液體血清型恒定值校準液CAPSO(緩沖液) 100mmol/L柳氮磺胺吡啶(抗氧化劑)0.6％檸檬酸(增效劑)4％廣譜抗生素(防腐劑)0.5％
乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)5％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)10％丙酸鈉(防霉劑) 0.3％其余為小牛血清校準液共有8份，分別加入apoA I、apoB的各4種不同重量的抗原，形成不同濃度的抗原，按照apoA I、apoB各自不同的4個恒定值濃度確定，然后用0.22μm的濾膜抽濾除菌，放2-8℃保存。
實施例8(單試劑)1、apoA I抗體液apoA I反應劑1000ml羊抗人apoA I抗血清 50ml丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)2％溴化己二甲胺(反應促進劑)0.5％其中apoA I反應劑包括磷酸鹽緩沖液200mmol/L聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑) 10％NaCL(電解質(zhì))0.3％PEG-6000(高分子加速劑) 60％廣譜抗生素(防腐劑) 5％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)0.5％其余為純化水2、apoB抗體液apoB反應劑 1000ml
羊抗人apoB抗血清40ml丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)2％溴化己二甲胺(反應促進劑)0.5％其中apoB反應劑包括磷酸鹽緩沖液200mmol/LTWeen-20(表面活性劑)10％PEG-6000(高分子加速劑) 60％廣譜殺菌劑(防腐劑) 5％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)0.5％其余為純化水3、液體血清型恒定值校準液CAPSO(緩沖液) 100mmol/L丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)2％檸檬酸(增效劑) 1％廣譜殺菌劑(防腐劑) 1％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)6％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)10％丙酸鈉(防霉劑) 0.5％其余為小牛血清校準液共有8份，分別加入apoA I、apoB的各4種不同重量的抗原，形成不同濃度的抗原，濃度按照apoA I、apoB各自不同的4個恒定值濃度確定，然后用0.22μm的濾膜抽濾除菌，放2-8℃保存。
實施例9(單試劑)1、apoA I抗體液apoA I反應劑 1000ml羊抗人apoA I抗血清100ml丁基羥基茴香醚(抗氧化劑) 0.01％溴化己二甲胺(反應促進劑) 0.1％其中apoA I反應劑包括磷酸鹽緩沖液 50mmol/L聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑)0.1％NaCL(電解質(zhì)) 0.1％PEG-6000(高分子加速劑)20％廣譜殺菌劑(防腐劑)0.1％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑) 0.1％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑) 0.1％其余為純化水2、apoB抗體液apoB反應劑 1000ml羊抗人apoB抗血清 100ml丁基羥基茴香醚(抗氧化劑) 0.01％溴化己二甲胺(反應促進劑) 0.1％其中apoB反應劑包括磷酸鹽緩沖液 50mmol/LTWeen-20(表面活性劑) 0.1％
PEG-6000(高分子加速劑)20％廣譜殺菌劑(防腐劑)0.1％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑) 0.1％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑) 0.1％其余為純化水3、液體血清型恒定值校準液CAPSO(緩沖液) 20mmol/L丁基羥基茴香醚(抗氧化劑) 0.01％檸檬酸(增效劑)0.01％廣譜抗生素(防腐劑)5％乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑) 0.5％牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑) 10％丙酸鈉(防霉劑)0.3％其余為小牛血清校準液共有8份，分別加入apoA I、apoB的各4種不同重量的抗原，形成不同濃度的抗原，濃度按照apoA I、apoB各自不同的4個恒定值濃度確定，然后用0.22μm的濾膜抽濾除菌，放2-8℃保存。
上述單試劑使用時的操作步驟是取試劑300μl加入樣品3μl混勻，37℃水浴5分鐘后在340nm處測定吸光度，與同樣處理的恒定值校準液比較，可計算出樣品中apoA I、apoB的濃度。
(本發(fā)明提供的試劑盒已生產(chǎn)銷售。商品名稱為載脂蛋白(APOA/B)檢測試劑盒。生產(chǎn)廠商為伊利康生物技術(shù)有限公司。公司地址浙江省溫州市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)高科技園區(qū)27號小區(qū)。)
權(quán)利要求
1.一種制備apoA I、apoB抗體的方法，該方法包括apoA I、apoB抗原的提取，動物免疫和抗體純化，其特征在于所述的apoA I、apoB抗原的提取步驟是用脂蛋白沉淀劑與表面活性劑-血清復合物或表面活性劑-血漿復合物混合，使脂蛋白沉淀，沉淀劑、表面活性劑、血清或血漿三者體積配比為1∶2∶1至1∶4∶3；然后棄去上清液，收集沉淀物后洗滌，將洗滌后所得到的沉淀物用脫脂劑脫脂，除去脫脂劑，加入apoA1溶解劑，得apoB，或加入apoB溶解劑，得apoA1，最后將所得apoA1、apoB采用SDS-PAGE電泳凝膠切割，收集含AapoA1、apoB凝膠研碎，提取apoA1、apoB抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備抗apoA I、apoB抗體的方法，其特征在于所述的動物免疫中，第一次免疫動物時采用的是抗原-表面活性劑復合物，其中抗原用量按5公斤動物體重0.5-5mg，抗原與表面活性劑的體積配比為1∶1至1∶2，且抗原微粒完全被表面活性劑包復。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備抗apoA I、apoB抗體的方法，其特征在于所述的沉淀劑、表面活性劑、血清或血漿三者體積配比為1∶3∶2；所述的抗原-表面活性劑復合物中，抗原與表面活性劑的體積配比為4∶6。
4.一種檢測人血清中apoA I、apoB含量的試劑盒，其雙試劑劑型包括a、一種使樣品中apoA I、apoB抗原位點充分暴露，有利于與抗apoA I、apoB抗體充分結(jié)合的反應劑，所述的反應劑包括50-200mmol/L緩沖液、重量比為0.1-10％的表面活性劑、重量比為20-80％的高分子加速劑、重量比為0.1-5％的防腐劑和0.1-10％的穩(wěn)定劑，其余為純化水；b、抗體試劑，其中分別包括，一種與人血清中的apoA I、apoB抗原有高度特異反應性的抗apoA I抗血清、抗apoB抗血清和抗血清稀釋液，抗apoA I抗血清與抗血清稀釋液以及抗apoB抗血清與和抗血清稀釋液的混合的體積比分別為1∶1-1∶10；所述的抗血清稀釋液包括50-200mmol/L緩沖液、重量比為20-80％的高分子加速劑、重量比為0.1-5％的防腐劑和0.1-10％的穩(wěn)定劑，其余為純化水；c、一種用來與樣品比較，進行結(jié)果計算的液體血清型恒定值校準液，包括20-100mmol/L的緩沖液、0.1-2.5g/L apoA1抗原、0.1-2.5g/L AapoB抗原、重量比為0.01-2％的抗氧化劑、重量比為0.1-5％的防腐劑、重量比為0.1-10％的穩(wěn)定劑、重量比為0.1-0.3％的防霉劑，其余是基質(zhì)；其特征在于所述的反應劑包括重量比為0.1-10％的表面活性劑，所述的抗體試劑中還包括重量比為0.01-5％的抗氧化劑；所述的血清型恒定值校準液中的基質(zhì)是小牛血清。
5.一種檢測人血清中apoA I、apoB含量的試劑盒，其單試劑劑型包括a、抗體液，其中分別包括，一種與人血清中的apoA I、apoB抗原有高度特異反應性的抗apoA I抗血清、抗apoB抗血清和反應劑，抗apoA I抗血清與反應劑以及抗apoB抗血清與反應劑的混合的體積比分別為1∶1-1∶30；所述的反應劑包括50-200mmol/L緩沖液、重量比為20-80％的高分子加速劑、重量比為0.1-5％的防腐劑和重量比為0.1-10％的穩(wěn)定劑，其余為純化水；b、一種用來與樣品比較，進行結(jié)果計算的液體血清型恒定值校準液，包括20-100mmol/L的緩沖液、0.1-2.5g/L apoA1抗原、0.1-2.5g/L AapoB抗原、重量比為0.01-2％抗氧化劑、重量比為0.1-5％防腐劑、重量比為0.1-10％穩(wěn)定劑、重量比為0.1-0.3％防霉劑，其余是基質(zhì)；其特征在于所述的抗體液中還包括重量比為0.1-10％的表面活性劑、重量比為0.01-5％的抗氧化劑；所述的血清型恒定值校準液中的基質(zhì)是小牛血清。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測人血清中apoA I、apoB含量的試劑盒，其特征在于所述的反應劑和抗血清稀釋液中還可分別包括重量比為0.1-0.5％的反應促進劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測人血清中apoA I、apoB含量的試劑盒，其特征在于所述的抗體液中還可分別包括重量比為0.1-0.5％的反應促進劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種檢測人血清中apoA I、apoB含量的試劑盒，其特征在于所述的液體血清型恒定值校準液中還包括重量比為0.01-4％增效劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種檢測人血清中apoA I、apoB含量的試劑盒，其特征在于所述的反應劑和抗血清稀釋液中還可分別加入適量電解質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種檢測人血清中apoA I、apoB含量的試劑盒，其特征在于所述的反應劑和抗血清稀釋液中還可分別加入適量電解質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗apoA I、apoB抗體的制備方法及測定血清中的apoA I、apoB的試劑盒。本發(fā)明提供的抗體制備方法在制備過程中應具有無須超速離心處理、制備時間短、抗體的效價高的特點；本發(fā)明提供的檢測試劑盒應具有樣本無需稀釋、操作簡單、準確度高、重復性好、抗干擾能力強，基質(zhì)穩(wěn)定的特點。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種制備抗apoA I、apoB抗體的方法，該方法包括apoA I、apoB抗原的提取，動物免疫和抗體純化。一種檢測人血清中apoA I、apoB含量的試劑盒，其雙試劑劑型包括a.反應劑；b.抗體試劑；c.液體血清型恒定值校準液。其單試劑劑型包括a.抗體試劑；b.液體血清型恒定值校準液。
文檔編號A61K39/395GK1752107SQ20051006127
公開日2006年3月29日 申請日期2005年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月23日
發(fā)明者王賢理, 蒙凱, 蔡其浩 申請人:王賢理