專利名稱：藤黃酸在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藤黃酸在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用，特別是涉及藤黃酸在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
世界上惡性腫瘤的發(fā)生率繼續(xù)呈上升趨勢，2000年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計全球的癌癥新發(fā)病例達到1千萬例，有600萬例癌癥死亡，其中死亡原因大多為惡性腫瘤晚期轉(zhuǎn)移所致。癌癥已經(jīng)成為威脅人類生命健康的主要疾病之一，怎樣克服腫瘤細胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為人類攻克癌癥道路上最大的障礙。
腫瘤侵襲是指惡性腫瘤離開原發(fā)生長部位，突破基底膜和細胞外基質(zhì)構(gòu)成的屏障，侵犯毗鄰的正常組織，被侵襲的組織發(fā)生變性和壞死。腫瘤轉(zhuǎn)移指惡性腫瘤細胞脫離其原發(fā)部位，通過各種渠道的轉(zhuǎn)運到不連續(xù)的組織繼續(xù)增殖生長，形成同樣性質(zhì)腫瘤的過程。侵襲和轉(zhuǎn)移互為依存，即一個伴隨另一個出現(xiàn)。腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜多步驟的過程，一般可分為以下幾步腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤病灶脫離、腫瘤細胞穿過細胞外基質(zhì)(ECM)浸潤、遷移于血管內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞進入循環(huán)系統(tǒng)，隨著血流到達并停留于遠處位點的血管壁、腫瘤細胞穿出血管，通過ECM，最后在特定的組織或器官形成轉(zhuǎn)移灶。
近年來腫瘤化療取得了很大的進展，腫瘤患者生存時間明顯延長，但由于化療藥物的毒副作用，使臨床應(yīng)用受到一定限制。目前細胞毒性藥物依然是抗腫瘤的基礎(chǔ)和主要途徑，但真正能夠達到高效低毒目標的藥物少之又少，其中能夠抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物更少。使用細胞毒性藥物雖然能夠殺死腫瘤細胞，但同時也往往對正常的細胞產(chǎn)生傷害，因此使用劑量不宜過大，在化療過程中也不斷應(yīng)用新技術(shù)提高藥物在腫瘤局部高濃度分布(如定向注射、制成靶向前體藥物等)，以減輕全身毒副反應(yīng)，但由于這些藥物不能有效抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，常常是腫瘤原發(fā)灶有所減輕，但身體其他部分又出現(xiàn)多處轉(zhuǎn)移灶，最終導(dǎo)致病情惡化。
藤黃酸(Gambogic Acid，GA，C38H44O8)是中藥藤黃中有效成分之一。藤黃系藤黃科植物藤黃所分泌的干燥樹脂。實驗研究結(jié)果表明，藤黃酸的抗癌作用與一般的化療抗癌藥有所區(qū)別，能選擇性的殺死癌細胞，而對正常的造血系統(tǒng)和白細胞沒有影響。這為尋找新型抗癌藥提供新穎的前景，同時有可能啟示新的抗癌機理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供藤黃酸在制藥領(lǐng)域中的新用途，即藤黃酸在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過下列措施來實現(xiàn)的藤黃酸在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用。
更進一步，藤黃酸在制備抗肝癌、胃癌、乳腺癌、腸癌或肺癌轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
有益效果1、藤黃酸對人肝癌SMMC-7721及QGY-7701細胞株、人肺腺癌SPC-A1細胞株、人乳腺癌MDA-MB-231、人胃癌MGC-803及SGC-7901細胞株的體外生長具有顯著的抑制作用。
2、藤黃酸對腫瘤轉(zhuǎn)移具有良好的抑制作用。
3、藤黃酸對腫瘤細胞的抑制作用具有較好的選擇性。
4、藤黃酸對腫瘤細胞的抑制作用表現(xiàn)在(1)對接種的人乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、腸癌及其它瘤株的裸小鼠轉(zhuǎn)移模型又顯著的抗轉(zhuǎn)移作用；(2)對轉(zhuǎn)移相關(guān)基因有明顯影響；(3)對轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白有明顯影響。


圖1為藤黃酸作用于人乳腺癌細胞MDA-MB-231 48h量效曲線。
圖2為空白對照組裸小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)實體照片。
圖3為ADM(2mg/kg)對照組裸小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)實體照片。
圖4為藤黃酸高劑量(8mg/kg)組裸小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)實體照片。
圖5為藤黃酸低劑量(4mg/kg)組裸小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)實體照片。
圖6為藤黃酸作用于MDA-MB-231細胞后對MMP-2基因表達的影響的RT-PCR結(jié)果圖，其中Actin為內(nèi)參；1為NS；2為Taxol(0.30μM)；3為GA(3.00μM)；4為GA(1.50μM)；5為GA(0.75μM)；6為GA(0.30μM)。
圖7為藤黃酸作用于MDA-MB-231細胞后對MMP-2基因表達的影響的柱形圖，是將圖6經(jīng)灰度掃描后各組表達轉(zhuǎn)化為數(shù)值，除去actin的內(nèi)參值后得到相對值。
圖8為藤黃酸作用于MDA-MB-231細胞后對TIMP-1基因表達的影響的RT-PCR結(jié)果圖，其中Actin為內(nèi)參；1為NS；2為Taxol(0.30μM)；3為GA(3.00μM)；4為GA(1.50μM)；5為GA(0.75μM)；6為GA(0.30μM)。
圖9為藤黃酸作用于MDA-MB-231細胞后對TIMP-1基因表達的影響的柱形圖，是將圖8經(jīng)灰度掃描后各組表達轉(zhuǎn)化為數(shù)值，除去actin的內(nèi)參值后得到相對值。
圖10為藤黃酸作用于MDA-MB-231細胞后對TIMP-2基因表達的影響的RT-PCR結(jié)果圖，其中Actin為內(nèi)參；1為NS；2為Taxol(0.30μM)；3為GA(3.00μM)；4為GA(1.50μM)；5為GA(0.75μM)。
圖11為藤黃酸作用于MDA-MB-231細胞后對TIMP-2基因表達的影響的柱形圖，是將圖10經(jīng)灰度掃描后各組表達轉(zhuǎn)化為數(shù)值，除去actin的內(nèi)參值后得到相對值。
圖12為藤黃酸對MDA-MB-435裸小鼠肺轉(zhuǎn)移模型瘤組織TIMP-1影響的RT-PCR圖，其中GAPDH為內(nèi)參；NS為未給藥空白對照組；ADM為阿霉素(2mg/kg)陽性對照組；GA8為藤黃酸(8mg/kg)組；GA4為藤黃酸(4mg/kg)組。
圖13為藤黃酸對MDA-MB-435裸小鼠肺轉(zhuǎn)移模型瘤組織TIMP-1影響的柱形圖，是將圖12經(jīng)灰度掃描后各組表達轉(zhuǎn)化為數(shù)值，除去GAPDH的內(nèi)參值后得到相對值。
圖14為藤黃酸對MDA-MB-435裸小鼠肺轉(zhuǎn)移模型瘤組織TIMP-2影響的RT-PCR圖，其中GAPDH為內(nèi)參；NS為未給藥空白對照組；ADM為阿霉素(2mg/kg)陽性對照組；GA8為藤黃酸(8mg/kg)組；GA4為藤黃酸(4mg/kg)組。
圖15為藤黃酸對MDA-MB-435裸小鼠肺轉(zhuǎn)移模型瘤組織TIMP-2影響的柱形圖，是將圖14經(jīng)灰度掃描后各組表達轉(zhuǎn)化為數(shù)值，除去GAPDH的內(nèi)參值后得到相對值。
圖16為藤黃酸作用于MDA-MB-231細胞后對MMP-2和MMP-9蛋白及其活性影響的電泳圖，圖中NS為未給藥對照組；1為藤黃酸給藥(8μM)組；2為藤黃酸給藥(0.4μM)組；3為藤黃酸給藥(0.08μM)組。
圖17為藤黃酸作用于MDA-MB-231細胞后對MMP-2和MMP-9蛋白及其活性影響的柱形圖，是將圖16經(jīng)灰度掃描后各組表達轉(zhuǎn)化為數(shù)值得到的相對值。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述，但不對本發(fā)明作任何限制。
本發(fā)明實施例所用的藤黃酸的制備可參見專利CN1557816A公開的內(nèi)容，也可以采用市售的藤黃酸標準品。
實施例1 藤黃酸對乳腺癌細胞株體外生長抑制作用體外培養(yǎng)乳腺癌細胞株MDA-MB-231，加入藤黃酸，測定藤黃酸作用48h后乳腺癌細胞的情況，結(jié)果表明，IC50為3.16μM，并呈現(xiàn)良好量效曲線(見圖1)。
實施例2 藤黃酸對裸小鼠肺轉(zhuǎn)移模型藥效作用取對數(shù)生長的體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞MDA-MB-435，細胞濃度調(diào)整為1×107/ml。無菌條件下，接種于裸小鼠左側(cè)第二乳頭的脂肪墊，接種量為0.1ml/只(細胞數(shù)為1.0×106/只)。2周后將動物隨機分組。藤黃酸高劑量(8mg/kg)組、藤黃酸低劑量(4mg/kg)組、ADM(阿霉素)對照組每周靜脈注射給藥一次，共10次；空白對照組給等量生理鹽水。停藥后11天處死動物，稱體重、肺重和瘤重，裸小鼠實際體重為所稱體重減去瘤重。將肺組織于Bouin氏液(飽和苦味酸∶甲醛∶冰醋酸＝75∶25∶5)中固定24小時，再用無水酒精浸泡至肺組織顏色恢復(fù)，轉(zhuǎn)移灶為白色結(jié)節(jié)。在解剖顯微鏡下記數(shù)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量。將部分肺組織和瘤組織于福爾馬林中固定，常規(guī)脫水包埋，H.E染色進行病理檢查。結(jié)果采用方差不齊性Aspin-Welch檢驗。
結(jié)果顯示，相對于空白對照組，藤黃酸給藥組的肺重系數(shù)有極顯著差異，說明給藥后肺部狀態(tài)得到顯著改善，轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)減少(見表1)。肉眼觀察，空白對照組結(jié)節(jié)數(shù)多而凸起，且已逐步向肺中央轉(zhuǎn)移，肺呈實質(zhì)狀(見圖2)；ADM對照組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)多，大多集中于邊緣，凸起較對照組少，轉(zhuǎn)移灶大多隱含于肺中(見圖3)；藤黃酸高劑量(8mg/kg)組肺轉(zhuǎn)移灶僅數(shù)個，集中于邊緣，肺組織完好(見圖4)；藤黃酸低劑量(4mg/kg)組肺轉(zhuǎn)移灶較高劑量組多數(shù)個，集中于邊緣，肺組織完好(見圖5)。
表1.裸小鼠給藥后各項指標(體重、瘤重、肺重、轉(zhuǎn)移率和轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù))統(tǒng)計。

與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01實施例3 藤黃酸對金屬蛋白水解酶MMP2及金屬蛋白水解酶抑制劑TIMP1、TIMP2基因水平影響。
1.RT-PCR
采用RT-PCR方法檢測藤黃酸作用于乳腺癌MDA-MB-231細胞后MMP-2、TIMP-1和TIMP-2基因表達的改變。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
(1)藤黃酸對乳腺癌細胞MDA-MB-231 MMP-2、TIMP-1和TIMP-2的影響結(jié)果表明，藤黃酸作用于乳腺癌MDA-MB-231細胞后3.00μM和1.5μM劑量組結(jié)果明顯，顯著降低了MMP-2表達，對MMP-2的抑制作用具有量效關(guān)系(實驗重復(fù)三次，均值±SD)，結(jié)果見圖6、7；亦可促進TIMP-1和TIMP-2基因表達，但不具量效關(guān)系，對TIMP-1影響的結(jié)果見圖8、9，對TIMP-2影響的結(jié)果見圖10、11。圖8、9表明，藤黃酸作用于MDA-MB-231細胞后促進TIMP-1基因表達。實驗重復(fù)三次，均值±SD；圖10、11表明，藤黃酸作用于MDA-MB-231細胞后除1.50μM劑量組外，兼促進TIMP-2基因表達。實驗重復(fù)三次，均值±SD。
(2)藤黃酸對接種有乳腺癌細胞MDA-MB-435裸小鼠瘤組織TIMP-1和TIMP-2的影響藤黃酸作用于MDA-MB-435裸小鼠肺轉(zhuǎn)移模型后，提取瘤組織總RNA，RT-PCR實驗。結(jié)果表明，給予藤黃酸后促進TIMP-1(見圖12，13)和TIMP-2表達(見圖14，15)。
2.明膠酶譜分析。
藤黃酸(8μM、0.4μM、0.08μM)作用于MDA-MB-231細胞48h后，換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時，收集上清，各組活細胞用MTT方法定量以確定各組上清上樣量一致。制備含0.1％明膠的10％聚丙烯酰胺凝較，上樣，100V電泳。膠在2.5％Trixon-100溶液中于室溫搖床輕搖以去除SDS，置反應(yīng)液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，10mMCaCl2，and 0.5mMZnCl2)中，37℃孵育過夜，后用0.1％考馬斯亮藍(用30％甲醇和10％乙酸配制)染色1h，于脫色液(30％甲醇，10％乙酸)中脫色至條帶清晰為止(見圖16、17)。
結(jié)果顯示，相對未給藥對照組(NS)，給藥后pro-MMP-2和pro-MMP-9被抑制。
實施例4取藤黃酸10g按注射劑常規(guī)工藝添加適當輔料制成注射劑。
實施例5取藤黃酸10g按片劑常規(guī)工藝添加適當輔料制成片劑。
權(quán)利要求
1.藤黃酸在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于藤黃酸在制備抗肝癌、胃癌、乳腺癌、腸癌或肺癌轉(zhuǎn)移的藥物中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，公開了藤黃酸在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了藤黃酸在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的新應(yīng)用，特別是在制備抗肝癌、胃癌、乳腺癌、腸癌或肺癌轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。藤黃酸對腫瘤轉(zhuǎn)移具有良好的抑制作用，對腫瘤細胞的抑制作用具有較好的選擇性，對轉(zhuǎn)移相關(guān)基因有明顯影響，對轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白有明顯影響。
文檔編號A61K31/352GK1706376SQ20051003912
公開日2005年12月14日 申請日期2005年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月27日
發(fā)明者尤啟冬, 郭青龍, 顧紅燕, 肖偉, 齊琦, 袁勝濤, 趙麗, 劉娓, 張坤, 戴翔翎, 凌婭 申請人:中國藥科大學(xué), 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司