專利名稱：蠟樣芽孢桿菌在制備治療血栓疾病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蠟樣芽孢桿菌在制備治療血栓疾病藥物中的用途，具體地說是一種由蠟樣芽孢桿菌所產(chǎn)生的溶纖維蛋白酶在制備治療血栓疾病藥物中的用途，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血栓疾病是危害人類健康的主要疾病之一，如腦血栓、急性心肌梗死的死亡率已達40％以上，血栓病逐漸成為死亡率占首位的病癥。溶解血栓是治療這類疾病的重要手段。當(dāng)今用于臨床治療的溶栓藥物如鏈激酶(Streptokinase，SK)、尿激酶(Urokinase，UK)、重組組織型纖溶酶原激活劑(Recombinant Tissue-type Plasminogen Activator，rt-PA)等均存在一定的缺陷毒性較強、副作用較大、體內(nèi)半衰期短、價格昂貴等。
納豆激酶(Nattokinase，NK)，是從納豆中提取的一種絲氨酸蛋白酶。這種溶纖維蛋白酶(Plasmin)由275個氨基酸組成，無毒、無副作用。相對分子量為27728，遠遠小于尿激酶等，因此作為藥物具有易于吸收的優(yōu)點。等電聚焦顯示其pI為8.6±0.3，在pH6.0～12.0的條件下穩(wěn)定，低于pH5.0則不穩(wěn)定。通過人體實驗發(fā)現(xiàn)納豆激酶能將纖維蛋白溶酶原、尿激酶原激活成纖維蛋白溶酶和尿激酶而達到溶血栓的效果，同時還發(fā)現(xiàn)納豆激酶可激活血漿中組織型溶纖酶原激活劑(Tissue-type Plasminogen Activator，t-PA)的產(chǎn)生，從而間接表現(xiàn)出其溶栓活性。納豆激酶在自然狀態(tài)下較穩(wěn)定，且在胃腸環(huán)境中不會失活。實驗發(fā)現(xiàn)它不僅作用迅速，而且療效時間長。
納豆激酶制劑的口服及其纖溶作用實驗顯示至第4小時活性達最高，然后開始下降，至8小時仍有作用。同時發(fā)現(xiàn)內(nèi)源組織型纖溶酶原激活劑的量亦有增加，表明納豆激酶通過腸道吸收進入血液后除它本身的纖溶活性外，還激活血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)，增加其內(nèi)源纖溶活性。而且納豆激酶是直接破壞交鏈纖維蛋白，而不是破壞體內(nèi)的纖維蛋白原。納豆激酶的纖維蛋白原水解活性遠低于纖溶酶和尿激酶，與t-PA基本相同。提示納豆激酶在發(fā)揮纖溶作用時，不易引起出血傾向。
蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)又稱蠟樣芽孢桿菌，廣泛分布于自然界中。菌體桿狀，直或接近直，0.3～2.2×1.2～7.0微米。多數(shù)運動；鞭毛典型側(cè)生。形成抗熱內(nèi)生孢子；在一個孢子囊中，孢子不多于1個。暴露于空氣中時，不妨礙孢子的形成。革蘭氏反應(yīng)為陽性、僅在生長早期為陽性、陰性。孢子橢圓或柱狀，孢子囊不明顯膨脹，孢子中生；接觸酶、V.P反應(yīng)、厭氧生長陽性，50℃生長陰性，平板菌落和斜面劃線生長呈蠟質(zhì)狀。有些菌株報道的DNA的G+C含量為32～33克分子％(熔解溫度法)和33～37克分子％(分析法)。桿狀菌體有成鏈的趨勢；鏈的穩(wěn)定性決定了菌落的形態(tài)，在不同的菌株中菌落形態(tài)變化很大。一種特殊的菌落為暗的或毛玻璃狀，并有起伏的邊緣，從邊緣移出的生長物不發(fā)育。另一種特殊菌落，根狀生長，在洋菜表面上廣泛擴展。生長物呈現(xiàn)不規(guī)則地糾纏，在不同的菌株中，它們的根狀多以順時針彎曲或呈逆時針彎曲。目前為止，未見蠟樣芽孢桿菌用于制備治療血栓疾病的藥物中相關(guān)報道，也未見由蠟樣芽孢桿菌所產(chǎn)生的溶纖維蛋白酶用于制備治療血栓疾病的藥物中相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供蠟樣芽孢桿菌在制備治療血栓疾病藥物中的用途，本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供一種用于治療血栓疾病的溶栓酶，具體地說是一種由蠟樣芽孢桿菌所產(chǎn)生的溶纖維蛋白酶，在本發(fā)明中，發(fā)明人將其命名為蠟激酶，英文名Cerekinase，CK。
本發(fā)明供了蠟樣芽孢桿菌用于制備治療血栓疾病藥物中的用途以及一種由蠟樣芽孢桿菌所產(chǎn)生的溶纖維蛋白酶，即蠟激酶用于制備治療血栓疾病藥物中的用途。
本發(fā)明提供的由蠟樣芽孢桿菌所產(chǎn)生的溶纖維蛋白酶，即蠟激酶(Cerekinase，CK)，有如下HPLC指紋圖譜特征HPLC檢測條件色譜柱Waters Proein-PakTM60 7.8×300mm流動相0.2mol/L NaH2PO4-CH3OH(95∶5)流速1ml/min檢測波長220nm蠟激酶在7～9min之間出峰。
所述蠟激酶是由以下方法制備得到a、中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCC NOM204092的蠟樣芽孢桿菌DIAO 1502(Bacillus cereus Diao 1502)，培養(yǎng)后作為發(fā)酵用種子液；b、利用a步驟種子液經(jīng)液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵得到本發(fā)明蠟激酶。
其中，所述液態(tài)發(fā)酵為種子液按照5％～20％ v/v(以培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn))的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30～40℃，180～220rpm培養(yǎng)24～72h，離心，上清液濾膜濃縮，噴霧干燥后得到本發(fā)明蠟激酶成品。
液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)為C源5～35，N源5～45，Na2HPO4·12H2O 0.5～3，NaH2PO4·2H2O 0.5～4，CaCl20.05～1，MgSO4·7H2O 0.05～1.5，pH7.5±1.0，121℃滅菌20min。
其中，C源(蔗糖)可以用葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、糖蜜等代替，N源(大豆蛋白胨)可以用玉米漿、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨(植物、動物)、豆?jié){等代替。
所述噴霧干燥，添加20％～40％(W/V)的硬脂酸美、β-環(huán)狀糊精、明膠、大豆分離蛋白、糊精中的一種或幾種輔料。
所述固態(tài)發(fā)酵為將豆渣噴灑營養(yǎng)液(重量配比為每1000g豆渣噴灑營養(yǎng)液20～120ml)，于100℃蒸煮得到培養(yǎng)基，冷卻后將制備好的種子液按照5％～20％ v/w(以培養(yǎng)基的重量為基準(zhǔn))的接種量接入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基于30～45℃，濕度≥80％，培養(yǎng)12～56h，干燥后得到本發(fā)明蠟激酶成品。
其中，固態(tài)發(fā)酵營養(yǎng)液組分(g/L)甘油50～300，蛋白胨50～300，牛肉膏50～100，Na2HPO4·12H2O 5～20，NaH2PO4·2H2O 5～20，CaCl20.5～10，MgSO4·7H2O 0.5～10，pH7.5±1.0。
本發(fā)明還提供了蠟激酶的制備方法a、種子液制備本發(fā)明使用的菌種是由具有溶栓能力的發(fā)酵性食品中分離得到，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)鑒定為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，并且予以保藏，保藏編號為M204092。
工作種子批菌種啟開后，營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，保存于NA試管斜面，經(jīng)過形態(tài)、純度、生產(chǎn)能力檢查合格后，(即在培養(yǎng)好的NA試管斜面上勾取少量培養(yǎng)物涂片，革蘭氏染色后顯微鏡下觀察，凡鏡下形態(tài)一致，無雜菌污染的種子為合格種子。生產(chǎn)能力檢查是通過實驗室水平的發(fā)酵來檢測菌株的生產(chǎn)能力(即每毫升發(fā)酵液的酶活)，凡生產(chǎn)能力大于1000IU/ml即為合格種子。)作為生產(chǎn)用種子，種子于30～40℃，180～220rpm，NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～24h作為一級種子；然后按5～10％的接種量接種于NB(營養(yǎng)肉湯)培養(yǎng)基中，于30～40℃，180～220rpm培養(yǎng)8～24h可作為二級種子，也可作為發(fā)酵用種子液。
b、發(fā)酵所述發(fā)酵可以是液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵。
本發(fā)明所述培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基，供搖床培養(yǎng)用；營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基供制備平板和斜面用，含0.5％瓊脂的營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基供短期保存菌種用。
NB培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10、牛肉浸膏5、氯化鈉5，pH7.2±0.2，121℃/20minNA培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10、牛肉浸膏5、氯化鈉5、瓊脂13，pH7.1±0.1，121℃/20min。
液態(tài)發(fā)酵液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)C源(蔗糖)5～35，N源(大豆蛋白胨)5～45，Na2HPO4·12H2O 0.5～3，NaH2PO4·2H2O0.5～4，CaCl20.05～1，MgSO4·7H2O 0.05～1.5，pH7.5±1.0，121℃滅菌20min。
其中，C源可以用葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、糖蜜等代替。N源可以用玉米漿、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨(植物、動物)、豆?jié){等代替。
將制備好的種子液按照5％～20％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵培養(yǎng)基于30～40℃，180～220rpm培養(yǎng)24～72h。離心除去菌體，上清液采用截流分子量8000Da的濾膜濃縮，填加輔料，噴霧干燥后得到本發(fā)明溶栓酶成品。
填加輔料主要是為了滿足噴霧干燥的需要，輔料主要為硬脂酸美、β-環(huán)狀糊精、明膠、大豆分離蛋白、糊精中的一種或幾種，用量為20％～40％(W/V)。
發(fā)酵過程中對氧氣的需求量極大，因此需要充分供養(yǎng)(提高通氣量、加快攪拌速度)。其中通氧量、溫度及培養(yǎng)基組分是關(guān)鍵，過低和過高都會嚴(yán)重影響蠟激酶產(chǎn)量。
固態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵營養(yǎng)液組分(g/L)甘油50～300，蛋白胨50～300，牛肉膏50～100，Na2HPO4·12H2O 5～20，NaH2PO4·2H2O 5～20，CaCl20.5～10，MgSO4·7H2O 0.5～10，pH7.5±1.0。
新鮮豆渣噴灑營養(yǎng)液(重量配比為每1000g豆渣噴灑營養(yǎng)液20～120ml)，于100℃蒸煮得到培養(yǎng)基，冷卻后將制備好的種子液按照5％～20％的接種量接入混有營養(yǎng)液的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基于30～45℃，濕度≥80％，培養(yǎng)12～56h，干燥后得到本發(fā)明蠟激酶。期間注意通氧(空氣流通)保持濕度和溫度。發(fā)酵過程中的溫度、濕度和營養(yǎng)液均為關(guān)鍵因素，過低和過高都會嚴(yán)重影響蠟激酶產(chǎn)量。
本發(fā)明蠟激酶(Cerekinase，CK)是由富含納豆激酶的食用納豆中分離、純化得到一株蠟樣芽孢桿菌所產(chǎn)生的一種溶纖維蛋白酶，因此命名為蠟激酶。實驗顯示該酶在pH6.0～12.0的條件下穩(wěn)定，低于pH5.0則不穩(wěn)定。56℃以下溫度保溫30min其酶活基本保持不變。等電聚焦顯示其pI為8.6±0.3。該酶與NK一樣可以水解纖維蛋白原，且都是由芽孢桿菌屬的菌產(chǎn)生，理化性質(zhì)相似。但是納豆激酶在胃內(nèi)pH較低條件下是不穩(wěn)定的，口服后療效較低。Mitsugu FUJITA，Kyomgsu HONG，Yae ITO et al.Transport of nattokinaseacross the rat intestinal tract.Biol Pharm Bull，1995，18(9)1194～1196.指出在小鼠的十二指腸中注入納豆激酶后在血液檢測到納豆激酶及其與纖維蛋白分解物的復(fù)合物，表明納豆激酶可以由消化道吸收到血液中起溶栓作用。而本發(fā)明提供的蠟激酶用5％NaHCO3配制后，用于制備治療血栓疾病的藥物，口服療效顯著，克服了納豆激酶在胃內(nèi)pH較低條件下的不穩(wěn)定性，因此認為本發(fā)明制備的蠟激酶可能屬于納豆激酶類產(chǎn)品，但又與現(xiàn)有的納豆激酶不同，為治療血栓疾病提供了一種新的臨床用藥選擇。當(dāng)然，本發(fā)明提供的蠟激酶由于分子量小也可通過注射或其它方式給藥。
小鼠灌胃急性毒性實驗表明LD50大于6.0g/kg。大鼠頸動脈血栓形成試驗表明5％NaHCO3配制的蠟激酶具有較明顯的抗血栓形成作用，而且呈現(xiàn)一定的量效趨勢，有效劑量范圍較寬，4～100mg/kg均有抗血栓作用；同時，蠟樣芽孢桿菌的單一菌株也表現(xiàn)出一定的延長大鼠頸動脈血栓形成時間。


圖1為實施例2制備的蠟激酶的HPLC譜圖，橫坐標(biāo)為保留時間，縱坐標(biāo)為吸收值；圖2為實施例3制備的蠟激酶的HPLC譜圖，橫坐標(biāo)為保留時間，縱坐標(biāo)為吸收值。
以下通過具體實施方式
進一步說明本發(fā)明的有益效果，但不應(yīng)理解為是對本發(fā)明的限制，凡是基于本發(fā)明的技術(shù)基本思想所做的其它多種形式的修改、替換或變更所實現(xiàn)的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式
實施例1種子液的制備工作種子批菌種啟開后，劃NA培養(yǎng)基平板2～3塊，培養(yǎng)后挑取平板中典型集落8～10個，分別培養(yǎng)后保存于NA試管斜面，經(jīng)過形態(tài)、純度、生產(chǎn)能力檢查合格后作為生產(chǎn)用種子。
由檢查合格的菌株斜面中勾取一環(huán)培養(yǎng)物于20ml NB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)20h(作為一級種子)，然后按5％的接種量接種于400ml NB培養(yǎng)基中37℃，180～220rpm培養(yǎng)18h作為發(fā)酵用種子液。
實施例2液態(tài)發(fā)酵制備溶栓酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)蔗糖5g/L，大豆蛋白胨12g/L，Na2HPO4·12H2O 0.50g/L，NaH2PO4·2H2O 2g/L，CaCl20.08g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，pH7.5±1.0，121℃滅菌20min。蔗糖可以用葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、糖蜜等代替。大豆蛋白胨可以用玉米漿、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨(植物、動物)、豆?jié){等代替。
將制備好的種子液250ml按照12％的接種量接入1000ml發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵培養(yǎng)基于37℃，180rpm培養(yǎng)50h。4000rpm離心30min除去菌體，上清液采用截流分子量8000Da的濾膜濃縮到原體積的1/10，添加輔料硬脂酸美和明膠，使溶液固形物含量達20％，140℃噴霧干燥得到本發(fā)明溶栓酶成品。
蠟激酶的純化將發(fā)酵液于5000rpm條件下離心20min，收集上清液。上清液加入硫酸銨((NH4)2SO4)上樣于用20mM PB-1.5M(NH4)2SO4pH7.0平衡完畢的Phenyl SepharoseTM6 Fast Flow疏水柱。用750mM PB進行洗脫，去除雜蛋白，再用20mM PB進行洗脫，收集洗脫液，凍干后得精制品。
HPLC檢測將上述凍干前的洗脫液或精制品(用20mM PB配制成1mg/ml的溶液)用于HPLC檢測。
HPLC檢測條件色譜儀Waters 600+996；色譜柱Waters Protein-PakTM60 7.8×300mm；流動相0.2mol/L NaH2PO4-CH3OH(95∶5)；流速1ml/min；檢測波長220nm。
蠟激酶在7～9min之間出峰，詳見圖1。
發(fā)酵液或收集的洗脫液干燥即得本發(fā)明蠟激酶成品。
實施例3固態(tài)發(fā)酵制備溶栓酶營養(yǎng)液(g/L)甘油100g/L，蛋白胨150g/L，牛肉膏80g/L，Na2HPO4·12H2O 18g/L，NaH2PO4·2H2O 15g/L，CaCl210g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，pH7.5±1.0。
取新鮮豆渣1000g，噴灑營養(yǎng)液100ml后，于100℃蒸煮30min，冷卻；將制備好的種子液按照20％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。于40℃，濕度≥80％，培養(yǎng)40h后，干燥得到蠟激酶成品。
蠟激酶的純化將蠟激酶成品用10倍體積的生理鹽水浸提，浸提液超聲處理20min，過濾，收集上清液。上清液配制成終濃度含20mM PB(pH8.0)的溶液。用20mM pH8.0的PB緩沖溶液平衡DEAE SepharoseTMFast Flow柱，平衡完畢后上樣。收集穿透DEAE SepharoseTMFastFlow柱的溶液。調(diào)穿透溶液pH值至6.5，上樣于用20mM pH8.0的PB緩沖溶液平衡完畢的CM SepharoseTMFast Flow柱。用200mM PB緩沖溶液洗脫出，收集洗脫液，加入固體硫酸銨((NH4)2SO4)至該溶液濃度為1.5mol/L。將該溶液上樣于用20mM PB-1.5M(NH4)2SO4pH7.0平衡完畢的Phenyl SepharoseTM6 Fast Flow疏水柱。用750mM PB進行洗脫，去除雜蛋白，再用20mM PB進行洗脫，收集洗脫液，凍干后得精制品。
HPLC檢測將上述凍干前的洗脫液或精制品(用20mM PB配制成1mg/ml的溶液)用于HPLC檢測。
HPLC檢測條件色譜儀Agilent 1100 series；色譜柱Waters Protein-PakTM60 7.8×300mm；流動相0.2mol/L NaH2PO4-CH3OH(95∶5)；流速1ml/min；檢測波長220nm。
蠟激酶在7～9min之間出峰。詳見圖2。
固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵完成后)或收集的洗脫液干燥即得本發(fā)明蠟激酶成品。
以下通過蠟激酶凍干粉抗大鼠頸動脈血栓形成作用研究，進一步說明本發(fā)明的有益效果。
試驗藥物蠟激酶凍干粉原料藥，批號20040617，土色粉末，溶于水，由成都地奧制藥集團有限公司微生物組陳軍提供。
配制方法以5％NaHCO3配制成20mg/ml的溶液作為母液，然后以5％NaHCO3按等比稀釋配制成0.8mg/ml供大鼠灌胃用；劑量設(shè)置低、中、高劑量分別取4、20、100mg/kg劑量設(shè)置依據(jù)初步以臨床病人每天最大3.0g，即3000mg/60kg＝50mg/kg轉(zhuǎn)換成大鼠等效劑量為9.26mg/kg，取其2倍量的整數(shù)即20mg/kg作為大鼠藥效的中劑量。為便于摸索有效劑量范圍，將高中低劑量范圍取大一些，組間倍數(shù)為5。
配制依據(jù)資料顯示NK類藥物在pH6.0～12.0穩(wěn)定，pH低于5.0則不穩(wěn)定。一般在消化道內(nèi)胃的pH為0.9～1.5，小腸為6.0～6.8，在結(jié)腸為6.5～7.5，因而用一般助溶劑配制后直接灌胃NK藥物肯定不穩(wěn)定易分解。通過預(yù)試驗說明用5％NaHCO3直接配制蠟激酶室溫放置4天很穩(wěn)定。
腸溶阿斯匹林片石家莊制藥集團歐意藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號040401以蒸餾水配成8mg/ml的藥液供大鼠灌胃用；劑量設(shè)置依據(jù)80～300mg，一日1次；成人按60kg人計算，為1.33～5mg/kg/天，轉(zhuǎn)換成大鼠為8～30mg/Kg/天；本次試驗大鼠劑量依據(jù)上述劑量及以往試驗經(jīng)驗，設(shè)定為40mg/Kg/天；葡激酶白色凍干粉，5mg/支，批號20040301，溶于水，由地奧公司基因組吳洽慶提供。每支以蒸餾水配成0.3mg/ml的藥液供大鼠灌胃用；劑量設(shè)置依據(jù)臨床成人一次性15mg，15mg/60kg＝0.25mg/kg，轉(zhuǎn)換成大鼠等效劑量為1.35～1.5mg/kg，本次試驗取1.5mg/kg試驗動物SD大鼠，84只，體重250～320g，雄性，購于河南醫(yī)科大學(xué)動物中心；試驗儀器BT87-3型實驗性體內(nèi)血栓形成測定儀，包頭醫(yī)學(xué)院心血管研究室研制；試驗方法84只大鼠，按體重隨機分為七組，每組各12只，均為雄性。每天按0.5ml/100g體重灌胃給予試驗藥物蠟激酶凍干粉、陽性藥物阿斯匹林、對照組給予5％NaHCO3，連續(xù)給予七天；陽性藥葡激酶于第七天靜脈注射。
灌胃末次給藥后1.0小時、靜脈給藥后15分鐘按文獻資料方法分離頸總動脈，用直流電持續(xù)刺激(2mA、7min)后，大鼠頸總動脈內(nèi)膜損傷逐漸形成血栓，當(dāng)血流阻斷后儀器自動報警，并記錄血栓形成時間。
試驗結(jié)果1、給藥一周各組大鼠體重變化如下(詳見表1)
典型病例2李慈慈，女，2周歲。二周前出現(xiàn)咳嗽，食欲差、多汗。服多種止咳化痰藥無效，且癥狀逐漸加重。5天前出現(xiàn)痙攣性咳嗽咳時面紅耳赤，涕淚交流，頭頸筋脈怒張，連續(xù)咳嗽十余聲而無間歇，最后以深吸氣而暫停。當(dāng)她深吸氣時，喉中發(fā)出宛如雞鳴的吼聲。這種痙攣性咳嗽一日發(fā)作二十余次，日輕夜重，肺部聽診無異常，診為百日咳。施用本發(fā)明合劑每日42毫升，分3-4次口服，3日后痙攣性咳嗽次數(shù)減少，7日后雞鳴樣回音消失，10日后全部癥狀消失。
效果對比(選擇年齡、性別、體質(zhì)、病情一致的小兒以3日為期作對比)

由此可見，本發(fā)明3日內(nèi)總顯效率94.7％，3日內(nèi)總有效率99.3％。優(yōu)于對照組。
權(quán)利要求
1.中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCC NOM204092的蠟樣芽孢桿菌DIAO 1502(Bacillus cereus Diao 1502)在制備治療血栓疾病藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于蠟樣芽孢桿菌所產(chǎn)生的蠟激酶在制備治療血栓疾病藥物中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述蠟激酶的HPLC圖譜如圖1所示，由1個特征峰組成，其中色譜條件為色譜柱Waters Protein-PakTM607.8×300mm流動相0.2mol/L NaH2PO4-CH3OH(95∶5)流速1ml/min檢測波長220nm蠟激酶的保留時間在7～9min之間出峰。
4.一種蠟激酶，其特征在于它的HPLC圖譜如圖1所示，由1個特征峰組成，其中色譜條件為色譜柱Waters Protein-PakTM607.8×300mm流動相0.2mol/L NaH2PO4-CH3OH(95∶5)流速1ml/min檢測波長220nm蠟激酶的保留時間在7～9min之間出峰。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蠟激酶，其特征在于所述蠟激酶是由以下方法制備a、中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCC NOM204092的蠟樣芽孢桿菌DIAO 1502(Bacillus cereus Diao 1502)，培養(yǎng)后作為發(fā)酵用種子液；b、利用a步驟種子液經(jīng)液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵得到本發(fā)明蠟激酶。
6.一種制備權(quán)利要求4所述的蠟激酶的方法，包括a、中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCC NOM204092的蠟樣芽孢桿菌DIAO 1502(Bacillus cereus Diao 1502)，培養(yǎng)后作為發(fā)酵用種子液；b、利用a步驟種子液經(jīng)液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵得到本發(fā)明蠟激酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備蠟激酶的方法，其特征在于所述液態(tài)發(fā)酵為種子液按照5％～20％v/v的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30～40℃，180～220rpm培養(yǎng)24～72h，離心，上清液濾膜濃縮，干燥后得到本發(fā)明蠟激酶成品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備蠟激酶的方法，其特征在于所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為C源5～35g/L，N源5～45g/L，Na2HPO4·12H2O 0.5～3g/L，NaH2PO4·2H2O 0.5～4g/L，CaCl20.05～1g/L，MgSO4·7H2O 0.05～1.5g/L，pH 7.5±1.0；所述C源為蔗糖、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉或蜜糖，N源為動物蛋白胨、玉米漿、酵母膏、牛肉膏、植物或豆?jié){。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備蠟激酶的方法，其特征在于所述固態(tài)發(fā)酵為按重量配比每1000g豆渣噴灑固態(tài)發(fā)酵營養(yǎng)液20～120ml，于100℃蒸煮得到培養(yǎng)基，冷卻后將制備好的種子液按照5％～20％v/w的接種量接入培養(yǎng)基中，于30～45℃，濕度≥80％，培養(yǎng)12～56h，干燥后得到本發(fā)明蠟激酶成品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備蠟激酶的方法，其特征在于固態(tài)發(fā)酵營養(yǎng)液組分甘油50～300g/L，蛋白胨50～300g/L，牛肉膏50～100g/L，Na2HPO4·12H2O 5～20g/L，NaH2PO4·2H2O 5～20g/L，CaCl20.5～10g/L，MgSO4·7H2O 0.5～10g/L，pH 7.5±1.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種溶栓酶，具體地說是一種由蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)所產(chǎn)生的溶纖維蛋白酶，即蠟激酶。本發(fā)明提供的蠟激酶在HPLC檢測條件色譜柱Waters Protein－Pak
文檔編號A61K35/74GK1857722SQ20051002083
公開日2006年11月8日 申請日期2005年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月30日
發(fā)明者陳軍, 魏琪, 蔣飛, 賴亞娜, 何俊蓉 申請人:成都地奧九泓制藥廠