專利名稱：用于傳染病檢測和診斷的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及用于檢測和診斷傳染病的方法和組合物。確切地說，本發(fā)明涉及包含分枝桿菌抗原的透皮釋放系統(tǒng)或裝置，其中該系統(tǒng)或裝置的用藥刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答，后者對活性分枝桿菌感染的檢測和診斷來說是足夠的。
背景技術(shù)：
傳染病的檢測通常是利用監(jiān)測免疫應(yīng)答的試驗來完成的。不過在很多情況下，這些試驗是麻煩的，經(jīng)常得出不一致的結(jié)果。另外，對生活在不發(fā)達地區(qū)的個人來說，缺少高級實驗室設(shè)備，通常降低了試驗的有效性，不相稱的是在這些地區(qū)傳染病的發(fā)病率可能較高。傳染病的準確診斷和檢測不僅對于治療、而且對于預(yù)防發(fā)病和疾病傳播來說也是重要的。對于靈敏和準確的檢測方法的需求目前已經(jīng)變得特別明確，尤其根據(jù)由分枝桿菌等引起的感染不斷增加來說更是如此。
分枝桿菌感染通常表現(xiàn)為結(jié)核等疾病。由分枝桿菌引起的人感染自古已經(jīng)廣為傳播，結(jié)核在今天仍是一個引起死亡的原因。盡管至少自從十九世紀中葉以來發(fā)病率隨著生活水平的提高而下降，不過分枝桿菌感染仍然構(gòu)成醫(yī)學(xué)資源有限的國家一個引起發(fā)病和死亡的原因，可導(dǎo)致無免疫應(yīng)答患者壓倒多數(shù)的廣為傳播的疾病。盡管世界上多數(shù)衛(wèi)生組織都作出了努力，也從沒有實現(xiàn)分枝桿菌疾病的根除，或者接近根除。世界人口幾乎三分之一被結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物感染，普遍稱之為結(jié)核(TB)，每年新增大約八百萬患者，并且每年有三百萬患者死于TB。
經(jīng)過幾十年的下降，TB又在上升。在美國，多達一千萬人據(jù)信被感染。據(jù)報道1990年新增近28000例，比1989年增長9.4％。從1985年到1990年增長了16％。生活狀況和分享空間過于擁擠更有助于TB的傳播，例如在美國觀察到在監(jiān)獄囚犯和大城市的無家可歸者當中發(fā)病增加。
所有獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者的大約一半將會感染分枝桿菌，其中TB是尤其具有毀滅性的并發(fā)癥。AIDS患者臨床發(fā)展為TB的風險更高，并且抗TB治療似乎沒有對非AIDS患者那么有效。因此，感染通常發(fā)展為致命的廣為傳播的疾病。
在折磨AIDS患者的機會感染中逐漸發(fā)現(xiàn)了除結(jié)核分枝桿菌以外的分枝桿菌。來自胞內(nèi)鳥分枝桿菌復(fù)合物(MAC)的生物體、尤其是第四和第八血清型，占來自AIDS患者的分枝桿菌隔離種群的68％。發(fā)現(xiàn)了龐大數(shù)量的MAC(多達1010個耐酸桿菌每克組織)，因此，感染的AIDS患者預(yù)后不良。
世界衛(wèi)生組織(WHO)繼續(xù)支持對抗TB的戰(zhàn)斗，推薦了主動預(yù)防措施，例如“致免疫法的擴展程序”(EPI)，和主動治療應(yīng)變性措施，例如“直接觀察的短期治療”(DOTS)。對TB的根除來說，診斷、治療和預(yù)防是同等重要的?；顒悠赥B患者的快速檢測有利于早期治療，而通過早期治療，治愈率預(yù)期為90％。因此，早期診斷對于對抗TB的戰(zhàn)斗來說是關(guān)鍵的。另外，治療應(yīng)變性不僅確保消除感染，而且減少耐藥菌株的出現(xiàn)。
耐藥性結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)是極為令人不安的現(xiàn)象。新增TB病例證實耐受至少一種標準藥物的速度從二十世紀八十年代的10％增加到1991年的23％。因此，治療方案的應(yīng)變性在為消除TB和防止耐藥菌株的出現(xiàn)所作的努力中也起決定性作用。
盡管已經(jīng)鑒別出37種以上的分枝桿菌，不過所有人感染的95％以上都是由六種分枝桿菌引起的結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌和麻風分枝桿菌。最普遍的人分枝桿菌疾病是結(jié)核(TB)，引起結(jié)核的分枝桿菌菌種包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌或非洲分枝桿菌(Merck Manual 1992)。感染通常開始于吸入傳染性粒子，它能夠到達肺內(nèi)末端路徑。在被肺泡巨噬細胞吞噬后，桿菌能夠自由地復(fù)制，最后破壞吞噬細胞。繼而發(fā)生級聯(lián)效應(yīng)，其中，吞噬細胞被破壞，導(dǎo)致另外的巨噬細胞和淋巴細胞移行到感染部位，在這里它們也最終被消除了。在最初階段，疾病通過被感染的巨噬細胞進一步傳播，因為被感染的巨噬細胞游走到局部淋巴結(jié)，以及進入血流和其他組織，例如骨髓、脾、腎、骨和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(參見Murray等《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》The C.V.Mosby Company 219-230(1990))。
對引起分枝桿菌毒性的因素尚不清楚。很多研究暗示，細胞壁脂質(zhì)和細菌表面是引起菌落形態(tài)和毒性的因素。有證據(jù)表明，在某些分枝桿菌細胞表面上的C-分枝菌糖苷脂具有重要的促進巨噬細胞內(nèi)生物體存活的作用。對于其他分枝桿菌，暗示為海藻糖-6，6’-二分枝菌酸酯，它是一種索狀因子。
菌落形態(tài)與毒性的相互關(guān)系在鳥分枝桿菌中特別明顯。鳥分枝桿菌以幾種顯著的菌落形式存在。在常規(guī)實驗室培養(yǎng)基上長成透明或粗糙菌落的桿菌能夠在組織培養(yǎng)物中的巨噬細胞內(nèi)繁殖，在被注射到易感小鼠體內(nèi)后是有毒性的，對抗生素是耐受的。保持在實驗室培養(yǎng)基上的粗糙或透明桿菌通常自發(fā)地呈現(xiàn)不透明的菌落形態(tài)，此時它們不能在巨噬細胞內(nèi)生長，對小鼠是無毒的，對抗生素是高度易感的。透明、粗糙和不透明的鳥分枝桿菌菌株之間的菌落形態(tài)差異幾乎肯定是由一種糖脂的存在而引起的，該糖脂包被在透明和粗糙生物體的表面上，起到保護莢膜的作用。這種莢膜或包被主要是由C-分枝菌糖苷脂組成的，它顯然保護了毒性鳥分枝桿菌生物體不受溶菌酶和抗生素的作用。相形之下，鳥分枝桿菌的無毒的不透明形式在其表面幾乎不含有C-分枝菌糖苷脂。對抗生素的耐受性和對被巨噬細胞殺死的耐受性都已被認為是鳥分枝桿菌表面上的糖脂屏障。
分枝桿菌感染的診斷是通過病原體的分離和鑒別而得以確認的，不過常規(guī)診斷是基于唾液涂片、胸部X-射線檢查(CXR)和臨床癥狀的。培養(yǎng)基上分枝桿菌的分離需要長達四至八周的時間。菌種鑒別進一步需要兩周。另有其他若干用于檢測分枝桿菌的技術(shù)，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、結(jié)核分枝桿菌直接試驗或放大的結(jié)核分枝桿菌直接試驗(MTD)，以及利用放射性標記物的測定法。
一種廣泛用于檢測由結(jié)核分枝桿菌引起的感染的診斷試驗是結(jié)核菌素皮膚試驗。盡管可以得到多種版本的皮膚試驗，不過通常使用這兩種結(jié)核菌素抗原制劑之一舊結(jié)核菌素(OT)或純化蛋白衍生物(PPD)。將抗原制劑皮內(nèi)注射到皮膚內(nèi)，或者局部用藥，然后利用一種多叉接種器侵入性地轉(zhuǎn)運到皮膚內(nèi)(Tine試驗)。皮膚試驗診斷方法存在幾個問題。例如，Tine試驗一般是不被推薦的，因為注射到皮內(nèi)層的抗原量不能精確地加以控制(參見Murray等《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》TheC.V.Mosby Company 219-230(1990))。
盡管結(jié)核菌素皮膚試驗是廣泛使用的，不過它們通常需要2-3天才能產(chǎn)生結(jié)果，很多時候結(jié)果是不準確的，因為已經(jīng)接觸分枝桿菌但仍健康的受試者有時見到假陽性。另外，經(jīng)常發(fā)生誤診，這是由于不僅活動期TB患者觀察到陽性結(jié)果，而且BCG-疫苗接種過的人員和已經(jīng)被分枝桿菌感染但還沒有發(fā)展為疾病的人員也觀察到陽性結(jié)果。因此，通過結(jié)核菌素皮膚試驗難以區(qū)分活動期TB患者和其他人，例如家庭TB接觸人。此外，結(jié)核菌素試驗通常引起被除結(jié)核分枝桿菌以外的其他分枝桿菌(MOTT)感染的個體的交叉反應(yīng)。目前可得到的利用皮膚試驗所進行的診斷經(jīng)常引起誤差和錯誤。
需要有效的試驗，用于檢測分枝桿菌感染的存在。特別是不需要侵入受試者皮膚表面的試驗，將減少對受試者體液進行試驗的保健人員的接觸，減少被可能存在于受試者中的其他傳染劑傳染的風險。另外，易于進行并且具有易于測定的陽性或陰性結(jié)果的試驗在監(jiān)測結(jié)核等高傳染性疾病治療方案的應(yīng)變性時是必要的，特別是針對無家可歸者、監(jiān)獄囚犯、學(xué)童和高齡公民等個體。
還需要廉價和準確的方法，用于區(qū)分處于疾病活動期的人員和僅在免疫學(xué)上接觸過傳染劑但不處于活動期的人員(例如事先被分枝桿菌感染的人員)，或者已經(jīng)用BCG進行過疫苗接種的人員。此外，沒有已知方法用于監(jiān)測被分枝桿菌感染的人員中的藥物治療效果，例如能夠區(qū)分活動期結(jié)核和治愈或接觸前的其他階段的試驗。而且，還需要能夠易于對兒童進行的試驗，兒童對目前所用的涉及針頭或刺入皮膚的皮膚試驗尤其感到害怕。這樣的試驗對監(jiān)測AIDS患者來說是特別需要的，他們對分枝桿菌感染是高度易感的。另外，易于進行并且具有易于測定的陽性或陰性結(jié)果的試驗在監(jiān)測無家可歸者或監(jiān)獄囚犯的結(jié)核等疾病時是必要的。
發(fā)明概述本發(fā)明包含用于傳染病檢測的方法和組合物。按照本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，提供了透皮釋放系統(tǒng)或裝置，例如含有分枝桿菌抗原組合物的藥貼。將該藥貼貼在皮膚上，在預(yù)定時間后揭去。然后檢查皮膚對藥貼內(nèi)存在的抗原所產(chǎn)生的免疫原性應(yīng)答。
與現(xiàn)有技術(shù)方法不同，本文提供的診斷方法和組合物是高度靈敏的和特異性的。最重要的是，本發(fā)明的診斷方法和組合物尤其有效地檢測活動期結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌感染，從而消除誤診已經(jīng)接種疫苗或者已經(jīng)接觸該生物體而又沒有疾病表現(xiàn)的個體的可能性。
本文所述診斷方法包括局部施用包含分枝桿菌抗原的組合物，用于透皮釋放和隨后的免疫原性應(yīng)答檢測，其中分枝桿菌抗原包含但不限于MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83?？乖梢詥为毷褂茫部梢越M合使用。特別優(yōu)選的是局部施用包含MPB64的抗原組合物。本發(fā)明針對任何具有MPB64特征的抗原，其特征在于在活動期結(jié)核疾病的情況下，存在對抗原的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，而對沒有接觸分枝桿菌者、或者通過疫苗接觸或其他非活動期結(jié)核狀態(tài)則沒有反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供用于傳染病檢測的方法和組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于活動期結(jié)核檢測的方法和組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于活動期結(jié)核檢測的方法和組合物，將用于透皮釋放的抗原組合物局部用藥。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于分枝桿菌感染檢測的方法和組合物。
本發(fā)明還有另一個目的是提供用于由分枝桿菌菌種引起的活動期疾病檢測的方法和組合物，其中分枝桿菌菌種包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物、胞內(nèi)鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、麻風分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于由結(jié)核分枝桿菌引起的活動期疾病檢測的方法和組合物。
本發(fā)明還有一個目的是提供用于由牛分枝桿菌引起的活動期疾病檢測的方法和組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于分枝桿菌感染的免疫檢測的方法和組合物，利用局部用藥而無需侵入操作。
本發(fā)明還有另一個目的是提供用于由分枝桿菌引起的活動期疾病檢測的靈敏的診斷方法和組合物，其中抗原組合物被局部施用和透皮釋放，隨后檢查皮膚的免疫原性應(yīng)答。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于由分枝桿菌引起的活動期疾病檢測的方法和組合物，其中局部用藥的分枝桿菌抗原組合物包含MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83。
本發(fā)明還有一個目的是提供用于由分枝桿菌引起的活動期疾病檢測的方法和組合物，其中局部用藥的分枝桿菌抗原組合物包含MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83，其中該抗原是單獨或與另一種分枝桿菌抗原組合用藥的。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于由分枝桿菌引起的活動期疾病檢測的方法和組合物，其中局部用藥的分枝桿菌抗原組合物包含MPB64。
本發(fā)明還有另一個目的是提供易于進行的用于傳染病診斷的方法和組合物。
本發(fā)明另外一個目的是提供用于活動期結(jié)核檢測的方法和組合物，用于監(jiān)測治療功效。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于由分枝桿菌引起的活動期疾病診斷和檢測的試劑盒。
本發(fā)明還有一個目的是提供用于家庭TB或分枝桿菌疾病接觸人由分枝桿菌引起的活動期疾病檢測的方法和組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于分枝桿菌感染患者在化療后的臨床狀態(tài)監(jiān)測的方法和組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于活動期結(jié)核兒童的靈敏的診斷方法和組合物。
本發(fā)明的進一步目的是提供用于由分枝桿菌引起的活動期疾病檢測的靈敏的方法和組合物，其中該方法涉及皮膚藥貼的使用。
本發(fā)明的這些和其他目的、特征與優(yōu)點在回顧下列對所公開的實施方式和所附加的權(quán)利要求書的詳細說明之后將變得顯而易見。
附圖的簡要說明

圖1顯示不同量MPB64抗原通過豚鼠皮膚反應(yīng)所產(chǎn)生的劑量效應(yīng)圖。
圖2是顯示接種BCG后的豚鼠對MPB64抗原藥貼的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的時間過程的圖形。
詳細說明參照下列本文所包括的具體實施方式
的詳細說明可以更易于理解本發(fā)明。盡管本發(fā)明已經(jīng)參照某些實施方式的具體細節(jié)加以描述，這些細節(jié)也不應(yīng)當被認為是對本發(fā)明范圍的限制。本文提到的參考文獻全文引用在此作為參照，包括1998年2月6日提交的美國臨時申請60/073911和1998年8月11日提交的美國臨時申請60/096140。
引起結(jié)核等的分枝桿菌感染一旦被認為發(fā)病率下降，又有反彈并再次對健康構(gòu)成嚴重威脅。人員擁擠在一起或者居住環(huán)境在標準以下的地區(qū)逐漸發(fā)現(xiàn)感染了分枝桿菌的人員。無免疫應(yīng)答的人員有被分枝桿菌感染并死于該感染的巨大風險。另外，分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)也增加了感染人員的治療難度。
很多被分枝桿菌感染的人是貧窮的，或者生活在保健設(shè)施不完備的地區(qū)。這些人不易于進行分枝桿菌感染的試驗，他們需要廉價和非侵入型感染檢測方法。此外，監(jiān)獄里的人員或無家可歸者一般不具有充分的保健條件，身體狀況較差，通常也得不到充分或成功的保健介入。
本發(fā)明提供了包含抗原組合物的局部用藥的方法和組合物，該組合物用于抗原、特別是分枝桿菌抗原的透皮釋放。更確切地說，本發(fā)明提供了方法和組合物，用于檢測活動期結(jié)核等疾病，用于區(qū)分活動期疾病人員和僅在免疫學(xué)上接觸過分枝桿菌等傳染劑的人員。
本發(fā)明的方法和組合物可用于試驗人以及其他動物中分枝桿菌感染的存在。例如，本發(fā)明特別可以用于被牛分枝桿菌感染的母牛的疾病檢測。
醫(yī)學(xué)上“活動期結(jié)核”是通過胸部X-射線(CXR)、唾液試驗或其他癥狀等熟知的醫(yī)學(xué)操作進行診斷的。因為分枝桿菌傳染劑的存在的精確鑒別是昂貴的，并且需要較長時間，所以活動期疾病的診斷不必包括分枝桿菌存在的鑒別。因此，結(jié)核等活動期疾病的診斷可以依靠檢測分枝桿菌感染的其他方面，例如特定免疫應(yīng)答的產(chǎn)生或某些癥狀的表現(xiàn)。本文所用的術(shù)語“結(jié)核”包括通常與感染有關(guān)的疾病狀態(tài)，該感染是由包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物在內(nèi)的分枝桿菌菌種引起的。由除結(jié)核分枝桿菌以外的分枝桿菌(MOTT)引起的分枝桿菌感染通常是由包括胞內(nèi)鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、麻風分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌在內(nèi)的分枝桿菌菌種引起的。
本發(fā)明包括用于局部用藥的方法和組合物，局部用藥能夠?qū)崿F(xiàn)抗原的透皮釋放，抗原引起由分枝桿菌感染引起的結(jié)核等活動期疾病人員產(chǎn)生免疫應(yīng)答，例如遲發(fā)型超敏反應(yīng)。該抗原來源于分枝桿菌，或者與分枝桿菌蛋白質(zhì)或碳水化合物部分具有交叉反應(yīng)性。優(yōu)選的抗原包括但不限于來源于分枝桿菌的MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83。特別優(yōu)選的是抗原MPB64(參見Kawajiri等日本專利申請公報09206092，其全文引用在此作為參考文獻)。
另一種優(yōu)選的抗原組合包括MPB64與MPB59的組合使用。例如，MPB59與MPB64的組合可以指示非典型分枝桿菌的感染，因為被不分泌MPB64的其他種類分枝桿菌感染的受試者將對MPB59顯示陽性應(yīng)答。
MPB64是一種經(jīng)常與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物有關(guān)的分枝桿菌抗原。Harboe等首先描述其為MPT64(《傳染與免疫性》1986；52293-902，全文引用在此)，此后已經(jīng)進行了充分的特征化鑒定，并用在各種實驗室中(例如參見Yamaguchi等《傳染與免疫性》1989；57283-288，全文也引用在此)?！癕PB64”和“MPT64”指同一種抗原MPT64是從結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)物濾液中分離到的，因此命名為結(jié)核分枝桿菌蛋白，MPB64是后來從牛分枝桿菌(或BCG)的培養(yǎng)物濾液中分離到的，因此命名為牛分枝桿菌蛋白。隨后發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白質(zhì)是相同的。MPB64和MPT64指選自分枝桿菌菌種的抗原，所選擇的分枝桿菌菌種包括但不限于結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG的某些菌株。抗原是在細菌生長過程中分泌出來的，并且是免疫原性的，引起豚鼠和人產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)。
重組抗原也可以用在本發(fā)明所預(yù)期的診斷方法和組合物中。例如參見Haga等《白細胞生物學(xué)雜志》1995；57221-225；Roche等《臨床與實驗免疫學(xué)》1996；103(2)226-232；Roche等《傳染病雜志》1994；107(5)1326-30，各自全文引用在此。
本發(fā)明抗原通常用于透皮釋放到供試者皮膚內(nèi)?？乖氖褂梅椒ㄊ潜３职乖慕M合物與皮膚緊密接觸。組合物中抗原的濃度在大約1至150微克/所用劑量的范圍內(nèi)，更確切為10至100微克/所用劑量，最確切為30至75微克/所用劑量。抗原組合物可以包含一種生理學(xué)上有效的溶液，溶液中含有表面活性劑、緩沖劑和溶劑，能夠?qū)崿F(xiàn)抗原組合物的透皮釋放。優(yōu)選使用這樣的表面活性劑、緩沖劑和溶劑，它們增加抗原的滲透和轉(zhuǎn)運，本身不引發(fā)反應(yīng)或者干擾抗原的免疫原性。優(yōu)選用于抗原組合物的表面活性劑包括吐溫20、吐溫40、吐溫60和吐溫80；各自在磷酸鹽緩沖鹽水中的使用濃度可以是0.001-10％、0.001-1％，優(yōu)選為0.005％。一種優(yōu)選用于用藥的實施方式在100微升磷酸鹽緩沖鹽水中包含30至75微克抗原，進一步包含優(yōu)選的表面活性劑吐溫80。最優(yōu)選用于用藥的實施方式是在100微升磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中含有75微克抗原和0.005％吐溫80。所制備的抗原組合物可以根據(jù)需要量分批或分等份貯藏在適當?shù)臒o菌玻璃或塑料容器內(nèi)。
本發(fā)明特別涉及抗原組合物到皮膚細胞的透皮釋放方法，用于活動期疾病的檢測。照此包括所有所預(yù)期的能夠?qū)崿F(xiàn)傳染劑抗原到皮膚細胞的釋放從而進行活動期疾病檢測的溶劑和抗原組合物。
本文所用的術(shù)語“透皮釋放”指組合物到皮膚各層的釋放，包括但不限于表皮(角質(zhì)層、透明層、顆粒層、生發(fā)層、基底層)、真皮和皮下層。本文所用的術(shù)語“局部用藥”指組合物施用或放置在皮膚上，而不用針頭等刺穿或侵入性地進入皮膚。
本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式包括透皮釋放系統(tǒng)或裝置，用于使上述組合物與人皮膚保持密切接觸。非常優(yōu)選的實施方式包括藥貼帶，例如皮膚藥貼帶，用于使組合物與皮膚保持密切接觸。適合用在用于釋放本發(fā)明抗原組合物的藥貼中的材料包括TORII藥貼繃帶“ToriibanTM”(從Torii and Co.，Ltd.，Tokyo得到)、Finn-chamber和Perme-aid S.(Nitto-Denkou Co.Japan)。另外，也可以使用醫(yī)用橡皮膏或膠帶等材料，其中一部分硬膏或膠帶包括一部分浸潤了抗原組合物的材料，并使該材料固定，使其直接與皮膚接觸。適合的醫(yī)用橡皮膏、膠帶和織物由多家廠商制造，例如Nichiban(Japan)、Kimberly-Clark(Neenah，Wisconsin)和3M(St.Paul，Minnesota)。該裝置可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種固定方法固定。例如，可以利用細繩將裝置系在受試者手臂上，或者可以利用橡皮膏將裝置貼上。優(yōu)選地，用于固定裝置的橡皮膏等材料應(yīng)當是透氣的和防水的，使其不會由于出汗或沐浴而受潮脫落。
本發(fā)明一個特別有利的方面涉及本發(fā)明使用和實施容易。例如，抗原組合物整體可以通過在適當溫度條件下將組合物裝運或保持在無菌容器內(nèi)進行保存?？乖M合物可以分所需量的等份貯藏，例如100或200μl，然后用于紗布、硬膏或膠帶等，這對試驗患者來說是必要的。進而，組合物的各必要組分和本發(fā)明的方法可以一起提供在試劑盒中，有助于使用。
除了藥貼型實施方式以外，本發(fā)明也可以采取本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他透皮藥物釋放載體的形式，包括但不限于凝膠、霜劑、液體噴霧劑等。
本發(fā)明所預(yù)期的優(yōu)選方法包括包含分枝桿菌抗原的組合物的局部給藥，用于人的透皮釋放。例如，將含有抗原組合物的藥貼施用在人的前臂上，并保持與皮膚的密切接觸。藥貼留置預(yù)定時間，使抗原能夠充分地透皮釋放。這樣一種時間范圍可以是1至7天，優(yōu)選為2至5天，最優(yōu)選為3天。經(jīng)過指定時間后，揭去藥貼，檢查皮膚的免疫原性應(yīng)答。
本領(lǐng)域已知，響應(yīng)于某些抗原的存在，在皮膚上觀察到遲發(fā)型超敏反應(yīng)。通常，這種反應(yīng)是在抗原組合物的侵入之后觀察到的，這種反應(yīng)的特征是發(fā)紅、紅斑、硬結(jié)(皮膚增厚)、紅色水泡的出現(xiàn)或潰瘍。在本發(fā)明方法中所要尋找的應(yīng)答類似于用分枝桿菌抗原皮內(nèi)注射所見到的應(yīng)答。
本發(fā)明人已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明抗原通過局部用藥的透皮釋放導(dǎo)致患有結(jié)核等活動期分枝桿菌疾病的人員產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答(具體來說是遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng))。如本文實施例所示，TB感染的豚鼠對抗原MPB64表現(xiàn)出遲發(fā)型超敏皮膚反應(yīng)，只要該細菌繼續(xù)生長；相形之下，用BCG-Tokyo致免疫的豚鼠在疫苗接種后一定時間喪失對MPB64的遲發(fā)型超敏性。正如發(fā)明人所公開的，包含分枝桿菌抗原、特別是MPB64的本發(fā)明方法和組合物可用于活動期分枝桿菌疾病的診斷，例如活動期TB。令人驚奇的是，被結(jié)核分枝桿菌感染但是還沒有發(fā)展為結(jié)核的個體和預(yù)先已經(jīng)接受過BCG疫苗接種的個體不顯示響應(yīng)于MPB64的陽性皮膚反應(yīng)。
抗原、特別是MPB64通過局部用藥的透皮釋放用于診斷結(jié)核等活動期分枝桿菌疾病，這一新發(fā)現(xiàn)尤其是令人期望的，因為不需要侵入性操作。事實上，MPB64的皮內(nèi)釋放最近已經(jīng)顯示在區(qū)分TB患者與健康對照者上是不成功的(Wilcke等《結(jié)核與肺疾病》(1996)77250-256)。分枝桿菌抗原通過局部用藥的有效透皮釋放迄今是未知的，利用本發(fā)明的方法和組合物，本發(fā)明人已經(jīng)成功地研究出診斷操作，用于區(qū)分活動期TB患者與健康PPD-陽性對照者。
抗原的皮內(nèi)注射可能不如透皮用藥那么有效的一個原因被認為涉及抗原的溶解度和/或抗原呈遞的機會不當，不過并不希望受到該理論的局限。例如，借助皮內(nèi)注射，抗原可能快速溶解在體液中，免疫系統(tǒng)沒有充分的時間識別和/或響應(yīng)它。相形之下，本發(fā)明的新方法能夠使抗原逐漸引入到受試者的免疫系統(tǒng)內(nèi)，由于抗原緩慢地通過皮孔和汗腺滲透到皮內(nèi)的局部，免疫系統(tǒng)有足夠時間封固應(yīng)答，通常是以遲發(fā)型超敏反應(yīng)的形式?？乖钠?nèi)和透皮引入也可能引起顯著的免疫應(yīng)答。
超敏反應(yīng)(已知也叫IV型或細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng))被認為大部分是由T細胞介導(dǎo)的，并繼之以單核細胞的參與，不過并不希望受到該理論的局限。該反應(yīng)通常具有在經(jīng)過一段時間后才觀察到的應(yīng)答，即18-24小時，因此稱之為遲發(fā)型超敏性?？乖蔬f細胞被認為向T細胞呈遞抗原，在激活后T細胞釋放淋巴因子，導(dǎo)致巨噬細胞、單核細胞和非免疫淋巴細胞的蓄積和激活。
本發(fā)明也可用于檢測以前感染的TB患者的家庭接觸人的活動期結(jié)核。這可以監(jiān)測疾病傳播到與最初感染人員有密切接觸的其他人。因為公眾可能患有結(jié)核，并通過咳嗽傳播，因此本發(fā)明可用于監(jiān)測為公眾工作的人員接觸，例如飛機乘務(wù)員或保健人員。為無家可歸者或監(jiān)獄人群工作的人員也易于監(jiān)測活動期結(jié)核的存在。
本發(fā)明的一個尤為可取的用途是監(jiān)測對患有分枝桿菌感染的人員的治療功效。例如，隨著耐藥性分枝桿菌的增加，非常需要檢測活動期結(jié)核患者不再具有活動期TB、即治療有效的能力。一種優(yōu)選的方法包括在治療前將本發(fā)明的抗原對具有活動期TB的人員局部用藥，經(jīng)過充分的時間后，觀察皮膚反應(yīng)。在治療方案的后面的步驟中，將抗原再次用藥，觀察皮膚反應(yīng)。沒有皮膚反應(yīng)說明治療已經(jīng)有效地改變了活動期結(jié)核狀態(tài)。皮膚的連續(xù)反應(yīng)說明治療是無效的，或者還沒有足夠的時間使治療生效，人員仍具有活動期TB。此時，可以改變治療，可以測定感染的分枝桿菌的藥物敏感性，或者可以繼續(xù)相同的治療較長時間。
本發(fā)明的一個用途將用于人群的快速篩選，例如調(diào)查相鄰地區(qū)或貧民區(qū)的感染率，用于試驗入獄人員、收容所或街頭的無家可歸者。例如，入獄人員在剛?cè)氇z時即發(fā)給他們含有本發(fā)明抗原的藥貼。佩帶藥貼一定時間后，檢查囚犯的皮膚反應(yīng)。陽性反應(yīng)者將被單獨安置。因為本發(fā)明檢測活動期TB，所以可以將這些囚犯與其他囚犯隔離，并立即開始治療。其他TB試驗?zāi)軌驒z測在其生命中的某時接觸過TB和也許不能將TB傳染給其他人的囚犯。不能將TB傳染給其他人的囚犯不需要隔離和治療。
在世界上的很多地區(qū)，人們接種了抗TB疫苗。在這些人身上極難檢測活動期TB，因為在標準TB皮膚試驗的條件下，所有接觸過分枝桿菌的人都呈陽性，而無論存在活動期TB還是疫苗接種的結(jié)果。本發(fā)明在這種情況下用于檢測個體中活動期TB的存在，將他們與預(yù)先接種過疫苗的人員區(qū)分開來。
給藥的簡易性是本發(fā)明的一個特別有利的方面。例如，兒童對藥貼等局部裝置用藥不感到害怕，不加遲疑地佩帶這樣的裝置一定時間，足以產(chǎn)生皮膚反應(yīng)。藥貼等局部裝置易于貯藏和運輸?shù)介]塞的地方，那里可能缺乏冷藏條件和凈水。本發(fā)明可以從廉價材料制成，生產(chǎn)成本低，可以被世界范圍內(nèi)的保健組織使用。
本發(fā)明通過下列實施例加以進一步闡述，實施例無論如何不被解釋為對發(fā)明范圍的限制。相反，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明精神的前提下，在閱讀說明書之后可以訴諸其他各種實施方式、改進和等價方式。
實施例1為了試驗新穎、簡便和快速的活動期結(jié)核診斷方法，試驗受試者對MPB64的皮膚反應(yīng)，利用可揭去的藥貼進行抗原組合物的局部用藥，然后進行透皮釋放。
皮膚貼劑盡管MPB59、MPB70、MPB44、MPB45、MPB51或MPB64等抗原都可以用在本發(fā)明的藥貼試驗中，不過在下例中所用抗原是MPB64，濃度大約為75μg每貼。預(yù)期使用大約50至100μg抗原每貼是成功的。優(yōu)選的抗原溶液包含大約750μg抗原每ml磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其中的PBS由0.005％吐溫80組成。
將藥貼施用到受試者皮膚上，留置三天，揭去藥貼后觀察用藥部位。存在免疫應(yīng)答指示陽性結(jié)果，例如遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)(發(fā)紅、硬結(jié)或小紅泡)，也就是存在活動期結(jié)核。用藥部位沒有變化表示陰性反應(yīng)。
受試者試驗了53名活動期結(jié)核患者和43名健康的純化蛋白衍生物(PPD)陽性對照，以測定對MPB64的反應(yīng)是否僅在活動期結(jié)核患者中是陽性。檢查了來自菲律賓馬尼拉附近的四個診所Our Lady of Grace Parish、Sto.Nino de Tondo Parish、Canossa Health and Social Center和Health Care Development Center的結(jié)核患者。
53名活動期結(jié)核患者中，52名顯示對MPB64的陽性反應(yīng)，而43名PPD-陽性對照中沒有一名具有對MPB64的陽性反應(yīng)。MPB64對活動期結(jié)核的特異性為100％，靈敏度為98.1％。試驗的效力為98.9％。
MPB64藥貼試驗是有效和準確的用于活動期結(jié)核診斷的方法，區(qū)分患者與BCG-疫苗接種過的個體和自然感染但沒有發(fā)展為結(jié)核的個體。用于該發(fā)現(xiàn)的實驗設(shè)計詳見實施例2所述。
實施例2為了測定MPB64作為皮膚藥貼法診斷活動期TB的特異性抗原的可靠性，在下列三組不同個體間進行對比試驗(1)活動期TB患者；(2)健康的結(jié)核菌素-陽性人員；(3)家庭TB接觸人。
觀察了人對MPB64的皮膚反應(yīng)與TB的臨床狀態(tài)之間的相互關(guān)系。因為本項研究的目的是測定MPB64作為用于活動期TB的特異性診斷抗原的可靠性，所以活動期TB患者的選擇是最重要的。
檢查門診患者的臨床記錄。將唾液涂片陽性、CXR異常和具有活動期TB臨床癥狀的患者分為活動期TB患者第1組。培養(yǎng)結(jié)果在多數(shù)情況下是不可得到的。不久前剛開始化療的患者是優(yōu)選的，因為長期化療對MPB64皮膚反應(yīng)的影響是未知的。不過，第1組中也有一些患者已經(jīng)治療了6個月。根據(jù)在最近的檢查中涂片呈陽性以及癥狀表現(xiàn)，他們被認為是活動期TB患者。
患者生活在診所附近，那里的社會經(jīng)濟條件非常差。他們居住的地理位置是重要的，因為他們被安排3天后返回診所以讀取結(jié)果。105名試驗患者中只有12名沒有返回。在返回的患者中，53名可用于最后的分析。分析結(jié)果如表1所示。其余患者排除在外，因為他們的藥貼在讀取結(jié)果當天之前已經(jīng)揭去或脫落了。
根據(jù)臨床記錄篩選患者，僅選擇涂片陽性、CXR異常和具有咳嗽、發(fā)燒或體重降低等指示TB的其他癥狀的患者作為活動期TB患者。培養(yǎng)物陽性的患者是優(yōu)選的，但是培養(yǎng)物的結(jié)果僅有七例可以利用。多數(shù)活動期TB患者已經(jīng)化療1-4個月。有一些在進行研究時已經(jīng)治療了6個月。健康的結(jié)核菌素陽性志愿者是不顯示任何TB指征的菲律賓人和日本人。在進行試驗時，一些家庭成員陪TB患者也來到診所。他們作為“家庭TB接觸人”進行試驗。所有受試者都被告知研究的大致情況，并同意進行試驗。三組供試者數(shù)量如下第1組活動期TB患者，53；第2組健康對照，43；第3組家庭TB接觸人，41。
從東京牛分枝桿菌BCG(從日本東京的日本BCG實驗室得到)的8天培養(yǎng)物濾液中分離到MPB64。將純化蛋白懸浮在PBS中，貯藏在-20℃下。用Lowry法測量蛋白質(zhì)的量。將從牛分枝桿菌BCG的8天培養(yǎng)物濾液中用硫酸銨沉淀出來的全蛋白命名為PPD-eT，以區(qū)分純化蛋白衍生物結(jié)核菌素(PPD)，用作藥貼試驗的對照。從結(jié)核分枝桿菌AoyamaB制備的PPD是從日本BCG實驗室(日本東京)得到的。將五個結(jié)核菌素單位(TU)的懸浮在0.1ml重建緩沖液中的PPD用于芒圖氏皮內(nèi)注射試驗。
藥貼試驗材料使用15mm紗布大小的TORII藥貼繃帶“ToriibanTM”從ToriiandCo.，Ltd.，Tokyo得到)。將抗原溶液(75μg抗原的100μl PBS溶液，含有0.005％吐溫80)倒在紗布上，將藥貼貼在受試者前臂上，前臂上藥貼用藥的皮膚區(qū)域已經(jīng)用酒精清潔過。藥貼放置在受試者皮膚上，使浸潤有抗原溶液的紗布直接與皮膚接觸。藥貼留置72小時。
藥貼試驗安排試驗活動期TB患者和結(jié)核菌素陽性健康對照對左臂上的MPB64藥貼和右臂上的PPD-eT藥貼的皮膚反應(yīng)。每種藥貼含有75μg抗原。將PPD皮內(nèi)注射(5TU/100μl)到右前臂上不同于藥貼的位置。PPD-eT藥貼用于確認蛋白質(zhì)抗原沒有透皮進入到體內(nèi)。如果PPD試驗陽性而PPD-eT藥貼試驗陰性，那么透皮給藥是不完全的。這種情況排除在試驗結(jié)果之外。
3天(72小時)后揭去藥貼，將反應(yīng)結(jié)果判斷為陽性或陰性。用藥部位皮膚沒有變化為“陰性”，而用藥部位出現(xiàn)紅斑、硬結(jié)或若干小紅泡則記錄為對抗原呈“陽性”應(yīng)答。
我們比較了藥貼在前臂和上臂的用藥。在讀取結(jié)果當天以前，藥貼從上臂脫落(41.2％)比從前臂脫落(17.6％)更為容易。因此，前臂是成人試驗所推薦的。
統(tǒng)計學(xué)二乘二偶然性試驗用于評價人MPB64藥貼試驗結(jié)果。
活動期TB患者和結(jié)核菌素陽性健康對照表1顯示第1組和第2組中對MPB64反應(yīng)陽性或陰性的實際數(shù)目。所有受試者都對PPD芒圖氏試驗和PPD-eT藥貼試驗呈陽性。由這些結(jié)果計算下列數(shù)值靈敏度98.1％；特異性100％；假陽性率0％；假陰性率1.9％；陽性預(yù)期值100％；陰性預(yù)期值97.7％；試驗效力98.9％。結(jié)果說明，MPB64藥貼試驗是有效區(qū)分活動期TB與健康結(jié)核菌素陽性人員的方法。
表1MPB64藥貼試驗第1組與第2組之間的二乘二偶然性試驗
家庭TB接觸人家庭TB接觸人(第3組)的數(shù)量是41，包括12名男性和29名女性。藥貼試驗結(jié)果如表2所示。有26名受試者顯示對PPD-eT和MPB64藥貼的陽性反應(yīng)(63.4％)，九名受試者對PPD-eT陽性而對MPB64陰性(22.0％)。六人(14.6％)對PPD-eT和MPB64陰性。在這些雙陰性人員中，三名對PPD芒圖氏試驗陰性。
第3組受試者在臨床上不被記錄為TB患者。各人的臨床狀態(tài)是未知的，盡管觀察到了某些提示為TB的癥狀。
表2家庭TB接觸人的MPB64和PPD-eT藥貼試驗
本項研究強烈地提示，MPB64藥貼試驗是有希望用于活動期TB的快速診斷的工具。它能夠區(qū)分活動期TB患者與接種過BCG疫苗的個體或被TB感染但還沒有發(fā)展為疾病的個體，靈敏度為98.1％，特異性為100％。該藥貼試驗還具有優(yōu)于皮內(nèi)注射的優(yōu)點，即技術(shù)簡易和用藥安全。該藥貼試驗據(jù)認為能夠為患者產(chǎn)生應(yīng)答而連續(xù)地供應(yīng)抗原，不過并不希望受任何理論的局限。
實施例3為了測定MPB64作為利用皮膚藥貼法用于活動期TB的特異性診斷抗原的可靠性，在豚鼠上進行了對比試驗。
從Japan Laboratory Animals，Inc.，Tokyo購買雌性白化體Hartley豚鼠，在實驗開始時重300至400g。動物在日本BCG實驗室保持在無特異性病原體的條件下。
抗原按照實施例2所述方法和材料制備抗原。
豚鼠的致免疫按照廠商說明書重建活體BCG疫苗(日本BCG實驗室，日本東京)，無佐劑方式皮下注射給豚鼠，劑量為0.5mg每只動物。在BCG注射后的4與25周之間對動物進行試驗。
藥貼試驗材料使用7mm紗布大小的TORII藥貼繃帶(從Torii and Co.，Ltd.，Tokyo，Japan得到)。將抗原溶液(75μg抗原的15μl PBS溶液，含有0.005％吐溫80)倒在紗布上，將藥貼貼在每只豚鼠的去毛部位上。
將MPB64用在藥貼上，劑量如圖1所示，將藥貼貼在BCG-致免疫的豚鼠右側(cè)與左側(cè)脅腹上，其上的毛已被除去。
藥貼試驗安排24小時后揭去藥貼，立即讀取反應(yīng)結(jié)果。用藥部位皮膚沒有變化為“陰性”，而用藥部位出現(xiàn)紅斑、硬結(jié)或若干小紅泡則記錄為對抗原呈“陽性”應(yīng)答。
BCG-致免疫的豚鼠藥貼試驗中對MPB64的劑量應(yīng)答預(yù)先用BCG Tokyo致免疫4周的豚鼠用于MPB64藥貼試驗，抗原劑量各不相同。藥貼試驗的最高劑量為75μg/貼。用含有2.3至75μg/貼不等的MPB64的藥貼對動物進行試驗。24小時后揭去藥貼，讀取反應(yīng)結(jié)果為陽性或陰性。為了確使動物對BCG敏感，皮內(nèi)注射0.05μg PPD的0.1ml緩沖溶液，在24小時后測量皮膚反應(yīng)。圖1顯示劑量-應(yīng)答實驗結(jié)果。在4.7μg/貼的劑量或更高濃度下，對MPB64的應(yīng)答為陽性。在2.3μg MPB64每貼的劑量下沒有觀察到陽性反應(yīng)。陰性對照藥貼僅含有PBS，PBS含有0.005％吐溫80，在BCG-致免疫的豚鼠中沒有引起任何皮膚反應(yīng)。未致免疫的豚鼠未顯示出對PPD或MPB64的任何應(yīng)答。
BCG-致免疫的豚鼠對MPB64的皮膚反應(yīng)的時間過程已知在用MPB64的皮內(nèi)注射進行試驗時，BCG-致免疫的豚鼠在BCG致免疫后15周喪失對MPB64的皮膚反應(yīng)。為了確認這一點在藥貼試驗中是否也是如此，將豚鼠用BCG Tokyo致免疫，在BCG注射后的不同時間用MPB64藥貼進行試驗。各動物僅試驗一次，以避免加強效應(yīng)。作為對照，同時對每只動物施用PPD-eT藥貼試驗。結(jié)果如圖2所示。DTH以3+、2+等表示，因為反應(yīng)直徑是通過藥貼大小來調(diào)節(jié)的，而不是通過抗原劑量。所有動物對MPB64藥貼試驗的皮膚反應(yīng)直到BCG注射后13周還都是陽性。后來變得幾乎不可檢測，在23周后完全為陰性。相形之下，對PPD-eT藥貼試驗的反應(yīng)直到BCG注射后25周實驗結(jié)束仍然保持陽性。
在BCG注射后不同時間檢查對MPB64和PPD-eT的遲發(fā)型超敏性(DTH)。圖2各點代表3只豚鼠的遲發(fā)型超敏性，表示如下3+紅斑和硬結(jié)；2+紅斑；1+小泡；+/-顏色模糊(可疑反應(yīng))；-沒有反應(yīng)。
豚鼠藥貼試驗確認，用于人的抗原劑量的1/16引起陽性反應(yīng)。
當然，不言而喻的是，前述內(nèi)容僅涉及本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下可以作出大量改進或變更。
權(quán)利要求
1.檢測活動期疾病的方法，包括通常將透皮釋放裝置施用到皮膚上，其中所述的裝置包含一種抗原組合物；在預(yù)定時間階段后除去所述的透皮釋放裝置；觀察皮膚的免疫應(yīng)答；和使免疫應(yīng)答的存在與活動期疾病發(fā)生相互關(guān)聯(lián)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的透皮釋放裝置包括一種選自由醫(yī)用膠帶、醫(yī)用橡皮膏、紗布、TORII繃帶、Finn-chamber和Permiade S.組成的組中的材料。
3.權(quán)利要求1的方法，其中的抗原組合物包含生理學(xué)上有效的溶液，還進一步包含來源于下列分枝桿菌菌種的抗原結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物、胞內(nèi)鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、麻風分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌。
4.權(quán)利要求3的方法，其中的抗原包含MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83。
5.權(quán)利要求3的方法，其中的生理學(xué)上有效的溶液包含表面活性劑、緩沖劑和溶劑。
6.權(quán)利要求5的方法，其中的生理學(xué)上有效的溶液包含磷酸鹽緩沖溶液，其中包含吐溫20、吐溫40、吐溫60或吐溫80。
7.權(quán)利要求3的方法，其中的抗原組合物包含MPB64，磷酸鹽緩沖溶液進一步包含吐溫80。
8.權(quán)利要求7的方法，其中的活動期疾病包括結(jié)核。
全文摘要
提供了用于傳染病檢測和診斷的方法和組合物。特別是提供了用于活動期分枝桿菌疾病檢測的有效和靈敏的方法和組合物，用于區(qū)分患有活動期疾病的個體與已經(jīng)在免疫學(xué)上接觸過的個體，例如被分枝桿菌感染過但沒有活動期疾病的個體或已經(jīng)進行過BCG疫苗接種的個體。該方法包括將用于透皮釋放的抗原組合物局部用藥。
文檔編號A61K49/00GK1679928SQ200510009118
公開日2005年10月12日 申請日期1999年2月4日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月6日
發(fā)明者中村玲子 申請人:日本Bcg制造株式會社, 中村玲子