專利名稱：一種構(gòu)建艾滋病靈長類動物模型的方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種艾滋病靈長類動物模型，尤其是獼猴急、慢性艾滋病感染模型的構(gòu)建方法及用途。
背景技術(shù)：
我國自1985年首次報告艾滋病病例以來，艾滋病的流行呈快速上升趨勢。2003年，國家衛(wèi)生部會同有關(guān)國際組織進(jìn)行了全國范圍的艾滋病流行病學(xué)調(diào)查，初步分析結(jié)果表明，中國現(xiàn)有艾滋病感染者約84萬人，其中艾滋病病人約8萬例。截止2003年，僅北京已累計發(fā)現(xiàn)艾滋病感染者1648例，位列全國第7位。有專家發(fā)出警告，如果對艾滋病不加一遏制，到2010年，我國艾滋病感染者將會激增到1000萬人，北京此類病人將接近2萬人，2010年后，滋病增長率繼續(xù)呈輻射性增長。
我國政府高度重視艾滋病防治工作，確立了“預(yù)防為主，宣傳教育為主，防治結(jié)合，標(biāo)本兼治，綜合治理”的艾滋病防治基本策略。自2001年起，中央財政艾滋病防治專項經(jīng)費(fèi)由原來的每年1500萬增加到1億元，投資12.5億元國債，地方配套10億元用于加強(qiáng)中西部地區(qū)的血站基礎(chǔ)建設(shè)和配套設(shè)備。2003年，國家又增加投入2.7億元用于重點(diǎn)地區(qū)的艾滋病防治工作。
避免艾滋病在我國的廣泛流行只有兩條途徑一是在近年內(nèi)發(fā)明出艾滋病疫苗或根治艾滋病的藥物；二是有效抑制其傳播途徑。對于后者，控制吸毒、性傳播及醫(yī)學(xué)感染是主要手段，但我國目前的一些現(xiàn)狀卻令人極為擔(dān)憂。而對于前者，需要全世界科研人員的艱辛努力，為解決艾滋病患者治療問題，中國政府有關(guān)部門建立了治療艾滋病藥品進(jìn)口注冊及研制報批快速通道，批準(zhǔn)了進(jìn)口艾滋病治療藥物的免稅，2002年，實(shí)現(xiàn)了部分抗病毒治療藥物的國產(chǎn)化。
雖然目前我國對艾滋病病原、診斷、來源等方面的研究均已取得一定進(jìn)展，但尚缺乏合適的艾滋病感染動物模型，尤其是靈長類動物模型。因此，缺乏艾滋病動物模型已經(jīng)成為限制預(yù)防或治療艾滋病藥物篩選、疫苗評價和發(fā)病機(jī)制等的研究瓶頸問題。在這種形勢下，猴子艾滋病模型是研發(fā)工作中一個重要環(huán)節(jié)。
雖然，已知建立了眾多針對不同病原體的靈長類動物感染模型，但是針對艾滋病建立靈長類動物感染模型而言，在動物品科、健康狀態(tài)的選擇、感染病毒的處理、劑量、途徑以及感染后的病毒檢測、免疫血清學(xué)確定等環(huán)節(jié)存在大量技術(shù)問題亟待解決。國外有關(guān)艾滋病病毒感染靈長類動物感染模型文獻(xiàn)，其中沒有披露具體的構(gòu)建方法，所得動物感染模型的效果也不甚清楚。
獼猴(恒河猴、食蟹猴)接種猴免疫缺陷病毒(SimianImmunodeficiency Virus，SIV)可以誘發(fā)建立猴SIV急性或慢性模型。這種動物模型是評價抗艾滋病藥物、艾滋病疫苗和免疫調(diào)節(jié)劑的最佳動物模型。因而它是抗艾滋病藥物疫苗和免疫調(diào)節(jié)劑療效評價必不可少的模型，也是研究艾滋病發(fā)病機(jī)制的最好模型。之所以稱它為最佳動物模型，是因?yàn)槠浒l(fā)病過程的臨床癥狀、體征和血液學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、病理生理學(xué)的變化與人HIV感染者和艾滋病人極為相似，就成為人的替身去進(jìn)行醫(yī)學(xué)生物學(xué)、藥物學(xué)的研究對象，也是現(xiàn)行的抗艾滋病藥物的報藥檢局批準(zhǔn)進(jìn)行人體試服的必要動物實(shí)驗(yàn)證明。
本發(fā)明人有效的克服了現(xiàn)有諸多技術(shù)問題，成功的構(gòu)建了中國獼猴急、慢性艾滋病感染模型。在所述動物中感染的重復(fù)性、穩(wěn)定性好，為進(jìn)一步研究該病毒的病原特性、發(fā)病機(jī)理、藥物篩選、疫苗評價等方面的研究奠定了重要基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面涉及一種艾滋病毒靈長類動物感染模型，尤其是艾滋病獼猴急、慢性艾滋病感染模型。
獼猴感染艾滋病病毒后，表現(xiàn)和艾滋病人極為相似，猴感染SIV后病情發(fā)展有3個階段急性感染、慢性感染早期和慢性感染中后期，產(chǎn)生抗艾滋病病毒抗體IgM和IgG，體液分離病毒陽性，檢測病毒陽性，此模型的建立，在病毒學(xué)及免疫學(xué)指標(biāo)上，對艾滋病病毒的病原學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、發(fā)病機(jī)理的研究，包括病毒載量、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量及其比值的變化、淋巴結(jié)的病理形態(tài)學(xué)和它們的逆轉(zhuǎn)、緩解和免疫重建過程的研究，以及藥物篩選、疫苗評價等應(yīng)用方面有著不可替代作用，在艾滋病病毒選擇敏感感染動物研究方面有代表性的意義。
猴艾滋病模型建立的原理是猴免疫缺陷病毒(SIV)感染猴子后，在體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制繁殖，一方面直接破壞CD4+T淋巴細(xì)胞及免疫系統(tǒng)，另一方面刺激機(jī)體產(chǎn)生的復(fù)雜的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，引起多方位的負(fù)面反應(yīng)，最后造成動物的嚴(yán)重免疫缺陷綜合癥和機(jī)遇性感染而死亡。
我們應(yīng)用非洲綠猴身上發(fā)現(xiàn)的猴免疫缺陷病毒感染恒河猴或食蟹猴，在猴體上出現(xiàn)SIV抗原與猴CD4+T淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞結(jié)合，病毒在CD4+T淋巴細(xì)胞復(fù)制，不斷破壞CD4+T淋巴細(xì)胞引發(fā)模型猴發(fā)病，同時猴體內(nèi)產(chǎn)生抗體和出現(xiàn)臨床癥狀，如發(fā)熱、食欲欠佳、體重下降及體表淺淋巴結(jié)腫大等，體內(nèi)體液和細(xì)胞免疫也發(fā)生改變，如CD4+T淋巴細(xì)胞降低、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比例下降，循環(huán)免疫復(fù)合物及大顆粒免疫復(fù)合物沉積，自身抗體出現(xiàn)和最終引發(fā)自身免疫反應(yīng)，形成與人HIV/AIDS相似的疾病全過程。
本發(fā)明的另一方面，涉及一種構(gòu)建艾滋病獼猴感染模型的方法。
1、動物選擇恒河猴、食蟹猴、成年，雌雄兼用。經(jīng)血清學(xué)檢測SIV，猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV)和猴T淋巴細(xì)胞性I型病毒(STLV-I)抗體陰性，結(jié)核菌素陰性，痢疾菌陰性。
2、毒株美國Aarond Diamond艾滋病研究中心的Marx教授贈與的SIVmac 251，經(jīng)健康猴PBMC體外擴(kuò)增，經(jīng)靜脈感染猴，滴定病毒滴度，按3MID100-10MID100劑量靜脈感染，該實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所完成。
3、感染SIV后不同時間點(diǎn)觀察動物臨床表現(xiàn)和體征，以及檢測血液學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)和淋巴結(jié)病理形態(tài)學(xué)。根據(jù)以上規(guī)律性的變化，可分為3個階段。
3.1 急性感染期特征為感染后10～20天為血漿病毒載量急性上升達(dá)高峰期，其后下降至感染后2～3個月降至“調(diào)定點(diǎn)”——即病毒平臺期。CD4+T細(xì)胞感染后2周略有下降后回升，持續(xù)一定水平。淋巴結(jié)病理組織學(xué)為增生型。
3.2 慢性感染早期或感染持續(xù)期病毒載量平穩(wěn)，CD4+T細(xì)胞數(shù)平穩(wěn)或緩慢下降，淋巴結(jié)病理組織學(xué)為增生為主，逐漸出現(xiàn)退變，感染后4～12個月或更長。
3.3 慢性感染中、后期或衰竭期病毒載量水平較高，CD4+T細(xì)胞下降，淋巴結(jié)病理組織學(xué)退變或耗竭，體重下降，感染后10～24個月或更長。
以上慢性感染期長、短或演變的快慢，視猴個體差異或環(huán)境，飼養(yǎng)因素可有差異。
4、模型的具體應(yīng)用4.1急性感染期模型的應(yīng)用觀察藥物、疫苗等的預(yù)防效果，先處理動物，后感染，觀察預(yù)防效果。藥物與感染同時進(jìn)行，觀察病毒高峰的改變(即病毒高峰低于正常感染對照組)，但受動物個體差異的影響較大。
4.2慢性感染早期(即病毒平臺期)模型的應(yīng)用觀察治療性藥物或疫苗的效果，較普遍適用。效果評定可用動物本身治療前后的比較，也同時治療組和對照組相比較。感染動物可經(jīng)合理選擇和分組，使數(shù)據(jù)更可靠。
4.3慢性感染中、后期模型的應(yīng)用觀察免疫調(diào)節(jié)劑、免疫重建和體能恢復(fù)等藥物的效果，應(yīng)用全身狀況的變化，病毒載量的下降、免疫學(xué)狀態(tài)的改善，尤其是淋巴結(jié)病理組織學(xué)的好轉(zhuǎn)，使破壞的淋巴組織恢復(fù)達(dá)到免疫重建，是我們使用的較明確的一個指標(biāo)。
4.4不同時期淋巴結(jié)活檢病理檢查是觀察動物病情好、壞的形態(tài)學(xué)平臺，通過治療前、后的對比，可以清楚知道抗艾滋病藥物的療效和藥效維持時間的長短，還運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法，可以測出幼稚淋巴細(xì)胞的再生的情況，這是很有說服力的指標(biāo)。
本發(fā)明的又一方面，涉及艾滋病獼猴感染模型用于艾滋病病毒體內(nèi)感染過程、發(fā)病機(jī)理、機(jī)體抵抗作用研究的用途。艾滋病目前有許多問題未能解決，包括感染的靶器官、靶組織和靶細(xì)胞，對免疫系統(tǒng)的攻擊，免疫系統(tǒng)細(xì)胞的反應(yīng)等，在人體內(nèi)無法取材，而在模型猴中可開展時間動力學(xué)任何指標(biāo)的取材、示蹤以及相關(guān)條件病原協(xié)同致病的研究中的用途。
本發(fā)明的又一方面，涉及艾滋病獼猴感染模型用于抗艾滋病藥物篩選和疫苗評價中的用途。
獼猴感染SIV后，均能檢測到病毒學(xué)和免疫學(xué)指標(biāo)，如在一定時間內(nèi)產(chǎn)生抗SIV IgM和IgG抗體，體液和組織內(nèi)成功分離病毒，感染后檢測病毒陽性，這些病毒學(xué)及免疫學(xué)指標(biāo)，對艾滋病病毒藥物篩選、疫苗評價等應(yīng)用方面有著不可替代作用。具體地說，所述動物模型能夠用于如任何抗艾滋病病毒藥物，包括中藥的效果評價中。如果待測藥物具有抗艾滋病病毒的作用，則所述藥物的效果能通過猴體內(nèi)改變以上指標(biāo)而評價藥效以及毒副作用。
在我國現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)動物中沒有其他動物比實(shí)驗(yàn)用猴更接近人類，因而，對疫苗的評價，這種模型具有無可替代的優(yōu)越性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將通過實(shí)施例進(jìn)一步說明實(shí)施例1、動物選擇選擇成年獼猴雌雄各一只，接種前按實(shí)驗(yàn)用猴國家標(biāo)準(zhǔn)微生物SPF級進(jìn)行復(fù)檢，并檢查艾滋病病毒抗體。經(jīng)血清學(xué)檢測SIV，猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV)和猴T淋巴細(xì)胞性I型病毒(STLV-I)抗體陰性；2、病毒接種美國Aarond Diamond艾滋病研究中心的Marx教授贈與的SIVmac 251，經(jīng)健康猴PBMC體外擴(kuò)增，經(jīng)靜脈感染猴，滴定病毒滴度，按5MID 100劑量靜脈感染，所有動物實(shí)驗(yàn)均按《實(shí)驗(yàn)動物所實(shí)驗(yàn)動物使用及實(shí)驗(yàn)規(guī)程》在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所艾滋病專用動物實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。
3、接種后動物相關(guān)表現(xiàn)3.1、急性感染期特征為感染后10～20天為血漿和病毒載量急性上升達(dá)高峰期，其后下降至感染后2～3個月降至“調(diào)定點(diǎn)”——即病毒平臺期。CD4+T細(xì)胞感染后2周略有下降后回升，持續(xù)一定水平。淋巴結(jié)病理組織學(xué)為增生型。
3.2、慢性感染早期或感染持續(xù)期病毒載量平穩(wěn)，CD4+T細(xì)胞數(shù)平穩(wěn)或緩慢下降，淋巴結(jié)病理組織學(xué)為增生為主，逐漸出現(xiàn)退變，感染后4～12個月或更長。
3.3、慢性感染中、后期或衰竭期病毒載量水平較高，CD4+T下降，淋巴結(jié)病理組織學(xué)退變或耗竭，體重下降，感染后10～24個月或更長。
4、接種后動物樣本病毒監(jiān)測在獼猴接種SIV后，每每1-2周收集標(biāo)本，接種CEMX 174細(xì)胞，進(jìn)行病毒分離，每3-4日觀察細(xì)胞病變和換液，持續(xù)觀察4周。
5、動物模型中SIV的RNA病毒載量的檢測在接種SIV后，每1-2周收集標(biāo)本，用RT_PCR方法測定RNA病毒載量。
上述結(jié)果證實(shí)本發(fā)明采用SIV接種能有效感染獼猴，所述病毒在該動物模型中有復(fù)制和排毒。
6、動物模型的病理學(xué)檢測在動物接受SIV接種后，用活檢方法取淋巴結(jié)，10％福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)病理組織切片處理后，染色，鏡檢。證實(shí)，采用本發(fā)明方法構(gòu)建的動物模型，能夠有效模擬SIV在靈長類動物中的感染過程。
運(yùn)用這個模型，發(fā)明人已經(jīng)為國內(nèi)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國中醫(yī)研究院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)研究所、藥物所、上海中國科學(xué)院藥物研究所、廣州中科院植物研究所、珠海健心藥業(yè)等提供服務(wù)，法國巴黎第五大學(xué)和發(fā)明人協(xié)作進(jìn)行了猴艾滋病樹突狀疫苗治療的研究也是使用這個模型。經(jīng)過這些服務(wù)證明猴艾滋病模型用于艾滋病病毒感染的發(fā)病機(jī)理研究、抗艾滋病病毒的藥物篩選、疫苗評價，是可信的、科學(xué)的、有價值的。
權(quán)利要求
1.一種艾滋病靈長類動物模型，其特征在于(A)選擇成年獼猴，經(jīng)血清學(xué)檢測SIV，猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV)和猴T淋巴細(xì)胞性I型病毒(STLV-I)抗體陰性；(B)毒株為SIVmac251，經(jīng)健康猴PBMC體外擴(kuò)增；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種艾滋病靈長類動物模型，其特征在于其為中國獼猴感染模型。
3.一種艾滋病靈長類動物模型構(gòu)建方法，其特征在于接種方式為靜脈注射病毒接種，接種量為3MID100-10MID100。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種艾滋病靈長類動物模型構(gòu)建方法，其特征在于獼猴接種艾滋病病毒后，每1-2周收集標(biāo)本，接種CEMX174細(xì)胞，進(jìn)行病毒分離。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種艾滋病靈長類動物模型構(gòu)建方法，其特征在于用RT_PCR方法測定體液和組織內(nèi)的病毒載量。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種艾滋病靈長類動物模型構(gòu)建方法，其特征在于在接受病毒接種后，用活檢方法取淋巴結(jié)，福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)病理組織切片處理后，染色，鏡檢。
7.一種艾滋病靈長類動物模型，其特征在于所述艾滋病靈長類動物感染模型用于抗艾滋病藥物篩選中的用途。
8.一種艾滋病靈長類動物模型，其特征在于所述艾滋病靈長類動物感染模型用于抗艾滋病疫苗評價中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種艾滋病靈長類動物中國獼猴感染模型。在我國現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)動物中實(shí)驗(yàn)用猴最接近人類，發(fā)明人經(jīng)靜脈注射病毒接種后，成功的構(gòu)建了中國獼猴艾滋病病毒感染模型。通過了解艾滋病病毒在模型體內(nèi)感染過程、病原特性、發(fā)病機(jī)理、機(jī)體抵抗作用，以研究包括感染的靶器官、靶組織和靶細(xì)胞，對免疫系統(tǒng)的攻擊，免疫系統(tǒng)細(xì)胞的反應(yīng)等，此模型的建立，在病毒學(xué)及免疫學(xué)指標(biāo)上，以及抗艾滋病病毒藥物篩選藥、疫苗評價等應(yīng)用方面有著不可替代作用，在所公開的獼猴艾滋病感染模型重復(fù)性、穩(wěn)定性好，為進(jìn)一步研究艾滋病的病原特性、發(fā)病機(jī)理、藥物篩選、疫苗評價等方面的研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號A61K49/00GK1683019SQ20051000857
公開日2005年10月19日 申請日期2005年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日
發(fā)明者盧耀增, 吳小閑, 秦川, 何伏秋, 涂新明, 張永榮, 魏強(qiáng), 李國橋, 符林春, 郭衛(wèi)中, 陳頌 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所