專利名稱：用于免疫犬使其抵抗犬傳染性呼吸道疾病(cird)的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗組合物，特別是用于抵抗犬傳染性呼吸道疾病的疫苗組合物。
犬傳染性呼吸道疾病(CIRD)是在如救助中心(re-homing centre)和寄宿場(chǎng)所或訓(xùn)練場(chǎng)所的稠密環(huán)境下飼養(yǎng)的犬類中的常見高傳染性疾病。許多狗僅是輕微的咳嗽，短時(shí)間后即痊愈，但是在某些場(chǎng)合就會(huì)發(fā)展成嚴(yán)重的支氣管炎(Appel和Binn，1987)。CIRD幾乎不會(huì)致命，但是它會(huì)耽誤救助中心的狗返家，從而破壞訓(xùn)練場(chǎng)所安排，花費(fèi)相當(dāng)多的治療費(fèi)用。
CIRD病因認(rèn)為是多因素的，包括多種病毒和細(xì)菌。認(rèn)為是主要病因性CIRD病原的傳染物是犬副流感病毒(CPIV)(Binn等，1967)，2型犬腺病毒(CAV-2)(Ditchfield等，1962)，和犬皰疹病毒(CHV)(Karpas等，1968a和1986b)，犬呼吸道冠狀病毒(CRCV)(WO 2004/011651(The Royal VeterinaryCollege)和Erles等，2003)以及細(xì)菌支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)(Bemis等，1977a，Keil等，1998)。
這些病毒和細(xì)菌經(jīng)常在爆發(fā)時(shí)被分離，并在實(shí)驗(yàn)性感染中表現(xiàn)出導(dǎo)致呼吸道癥狀或肺病變(Appel和Percy 1970，Swango等，1970，Karpas等，1986b)。
同時(shí)，還從有CIRD癥狀的狗中分離出人呼腸病毒和支原體物種(Lou和Wenner 1963，Randolph等，1993)。其它因素如壓力也是很重要的。
據(jù)報(bào)道，支氣管炎博德特氏菌是呼吸道疾病“舍咳”(Kennel cough)的原發(fā)性病原劑(Bemis等，1977b和Thompson等，1976)。這就使得狗易受其它呼吸道制劑影響，并常與它們同時(shí)存在?？捎眉毙灾夤苎撞┑绿厥暇舳股峥仍偕Ａ硗?，環(huán)境因素如寒冷，氣流和高濕度，犬舍的典型環(huán)境，都會(huì)增加疾病的易感性(Ellis等，2001)。通常認(rèn)為抗生素治療該原發(fā)疾病的效果不好(Ellis等，2001)。相反，接種免疫支氣管炎博德特氏菌提供了一種幫助控制疾病的相對(duì)有效手段。
支氣管炎博德特氏菌感染的明顯癥狀是粗厲的干咳，它會(huì)隨著活動(dòng)或刺激而惡化。突發(fā)咳嗽，然后就惡心或作嘔，試著從咽喉清出少量粘液。當(dāng)細(xì)菌二次侵入時(shí)體溫上升。因?yàn)樯峥仁歉邆魅拘缘?，所以該病很容易就傳染給易感狗，引發(fā)猛烈咳嗽。記錄的最重癥狀是在感染后開始的第2到5天，但可能會(huì)持續(xù)很長(zhǎng)的一段時(shí)間。壓力，特別是不利的環(huán)境條件，會(huì)導(dǎo)致該病在后期又復(fù)發(fā)。
通常舍咳(kennel cough)是上呼吸道病癥，特征是流鼻涕和咳嗽。鑒于舍咳主要包括上呼吸道變化，CIRD癥狀說明它包括肺損傷，在某些情況下支氣管肺炎。舍咳比CIRD的綜合癥狀輕，而且沒有CIRD中所提到的大范圍癥狀。CIRD的顯著之處還在于嚴(yán)重程度加重和死亡率增加。
CIRD是一種犬類綜合癥，它的呼吸道癥狀表現(xiàn)是從輕度到致命性疾病。它的特征包括上和下呼吸道感染，從炎癥進(jìn)展到滲出，浮腫，有時(shí)還有能在肺組織中廣泛傳播的出血性病理。CIRD也可在不存在支氣管炎博德特氏菌時(shí)發(fā)生，甚至在一些感染CIRD的狗中并沒有可檢出的支氣管炎博德特氏菌，這說明舍咳和CIRD是截然不同的傳染病。
我們還可以肯定的是支氣管炎博德特氏菌與呼吸道疾病相關(guān)，而且推斷其它制劑也參與了呼吸道疾病(Chalker等，2003)。
現(xiàn)在，我們顯示馬鏈球菌獸瘟亞種(Streptococcus equi sub specieszooepidemicus(參見實(shí)施例1)，狗支原體(Mycoplasma cynos)(參見實(shí)施例2)，和嗜衣原體(Chlamydophila)(參見實(shí)施例3)與CIRD相關(guān)。當(dāng)對(duì)我們研究的所有狗群進(jìn)行接種抵抗CPIV和CAV-2時(shí)，沒有新數(shù)據(jù)支持這些病毒參與了CIRD。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)狗中的犬皰疹病毒大量流行，呼吸道癥狀加重(參見實(shí)施例4)。
馬鏈球菌獸瘟亞種(S.zooepidemicus)是一種條件性致病菌，通常分離自各種動(dòng)物宿主，不只分離自馬。經(jīng)常發(fā)現(xiàn)它作為哺乳動(dòng)物上呼吸道粘膜的共生體(Timoney等，1988；Quinn等，1999)，并與多種疾病綜合癥相關(guān)，包括下呼吸道疾病，駒肺炎和馬子宮頸炎(Chanter，1997；Biberstein和Hirsh，1999)，駱駝肺炎(Biberstein和Hirsh，1999)，敗血病和豬關(guān)節(jié)炎(Timoney，1987)，母牛和山羊乳腺炎(Timoney等，1988)，家禽敗血病，羔羊心包炎和肺炎(Timoney，1987)，豚鼠淋巴腺炎(Quinn等，1999)，血人管球性腎炎(Balter等，2000)和人腦膜炎(Ural等，2003)。在狗中，馬鏈球菌獸瘟亞種與傷口感染和敗血病(Quinn等，1999)和急性壞死性肺炎(Garnett等，1982)相關(guān)。
雖然出血性鏈球菌性肺炎晚期(HSP)狗與患CIRD的狗共有一些組織學(xué)上的特性，但這并不是它早期的情形(參見Chalker等，2003)，HSP會(huì)出現(xiàn)膿毒性血栓癥(Garnett等，1982)。HSP迅速發(fā)作，沒有臨床癥狀而使大多數(shù)患者致命。而我們會(huì)看到CIRD慢慢發(fā)作，有大量的臨床癥狀，流鼻涕，咳嗽，噴嚏，惡心，食欲不振，肺炎和支氣管肺炎。
犬泌尿管感染與狗支原體(M.cynos)有關(guān)(Jang等，1984)。已從患犬瘟熱的犬肺中檢出狗支原體(Rosendal，1978)，而且發(fā)現(xiàn)支氣管內(nèi)接種狗支原體可促成狗肺炎(Rosendal & Vinther，1977)。
Rosendal(1978)所描述的犬瘟熱是一種在感染犬瘟熱病毒，各種支原體物種和細(xì)菌假單胞菌屬后的很復(fù)雜的疾病。這是一種有力的微生物攻擊組合，而且理所當(dāng)然會(huì)導(dǎo)致肺炎。還不清楚由支原體屬引發(fā)的病理學(xué)比例。再次用狗支原體攻擊的特點(diǎn)是狗無疾病癥狀，盡管在5只接種狗中有4只狗有些局部的小塊炎性損傷。Rosendal指出，在該綜合癥中狗支原體的意義是“很難評(píng)價(jià)”。
通過比較23S rRNA基因中的218個(gè)氨基酸序列，與CIRD相關(guān)的嗜衣原體物種與流產(chǎn)嗜衣原體(C.abortus)的關(guān)系非常近。此嗜衣原體物種中的此區(qū)域核苷酸序列(SEQ ID NO1)與流產(chǎn)嗜衣原體的核苷酸序列同一性超過99％，與鸚鵡熱嗜衣原體(Chlamydophila psittaci)的核苷酸序列同一性為98.6％，與貓嗜衣原體(Chlamydophila felis)的核苷酸序列同一性為96.3％。
在患CIRD狗的氣管和肺中檢出嗜衣原體物種。比較而言，流產(chǎn)嗜衣原體感染通常與生殖混亂有關(guān)，經(jīng)常導(dǎo)致不必要的流產(chǎn)，特別是羊。以前，并未描述過流產(chǎn)嗜衣原體在狗呼吸道感染中起作用。
現(xiàn)在幾乎沒有關(guān)于衣原體(Chlamydiae)物種侵染狗的出版物，這樣也就幾乎不了解犬衣原體物種的生物多樣性。最近，肺炎衣原體(C.pneumoniae)與狗動(dòng)脈硬化癥相關(guān)(Sako等，2002)。從患膿毒性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的狗中檢出未鑒別的衣原體屬(Lambrechts等，1999)。
先前，已從家養(yǎng)犬的糞便、腦、肝臟、脾、腎臟和肺組織中分離出了鸚鵡熱衣原體(C.Psittaci)(Arizmendi等，1992；Fraser等，1985和Gresham等，1996)。研究表明德國(guó)20％的寵物犬，日本10％的寵物犬已接觸過鸚鵡熱衣原體，并產(chǎn)生了抗體(Werth等，1987和Fukushi等，1985)。在英國(guó)，鸚鵡熱衣原體血清反應(yīng)陽性犬的流行還未知(Gresham等，1996.)。感染了鸚鵡熱衣原體的犬可能會(huì)發(fā)展成亞臨床慢性感染，動(dòng)脈硬化，關(guān)節(jié)炎，結(jié)膜炎，甚至呼吸道疾病(Gresham等，1996和Storz 1988)。Gresham等，(1996)從有呼吸道疾病癥狀的犬中分離出了鸚鵡熱衣原體，雖然其癥狀并不是CIRD癥狀。這說明犬可能是潛在的儲(chǔ)庫(kù)，從而在人衣原體傳染流行病學(xué)上具有重要的意義(Gresham等，1996；Werth 1989)。只有一篇文獻(xiàn)記載了從自然感染犬中分離出細(xì)胞培養(yǎng)液形式的鸚鵡熱衣原體的案例(Arizmendi等，1992)，還有一篇文獻(xiàn)記載了從實(shí)驗(yàn)性感染犬中分離出鸚鵡熱衣原體的案例(Young等，1972)。
目前已有一些抗CIRD相關(guān)感染因子即支氣管炎博德特氏菌以及CPIV和CAV-2的疫苗。但是，盡管使用了這些疫苗，CIRD仍在全世界犬舍中繼續(xù)流行，這可能是由于這些疫苗不能提供抵抗與CIRD相關(guān)的所有感染因子的保護(hù)作用。
這樣，本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供了一種用于接種犬的疫苗組合物，它包括任意一種或多種下述制劑a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑。
應(yīng)理解，組合物可以包括上述任意制劑，例如(a)和(b)，(a)和(c)，或(b)和(c)。組合物可包括所有這些制劑(a)，(b)和(c)。
能引發(fā)犬抵抗特定生物的免疫應(yīng)答的制劑是指當(dāng)對(duì)非免疫缺失或抑制免疫的犬給藥時(shí)，所述制劑能誘導(dǎo)該犬的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生可與該生物特異地結(jié)合的抗體。這樣，所述制劑就能誘導(dǎo)抵抗所述特定生物的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
優(yōu)選，產(chǎn)生的特異地結(jié)合所述特定生物的抗體親和力大于任何其它個(gè)體分子。優(yōu)選，結(jié)合所述特定生物的抗體親和力比任何其它個(gè)體分子高至少2，或至少5，或至少10或至少50倍。更優(yōu)選，結(jié)合所述特定生物的抗體親和力比任何其它個(gè)體分子高至少100，或至少1,000，或至少10,000倍。
能引發(fā)犬抵抗特定生物的免疫應(yīng)答的制劑還指當(dāng)對(duì)非免疫缺失或抑制免疫的犬給藥時(shí)，所述制劑能誘導(dǎo)所述犬的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異地結(jié)合高分子諸如分泌自所述生物的蛋白的抗體?？贵w會(huì)特異地結(jié)合此分泌性高分子，如毒素或溶血素，并使其滅活，從而減緩宿主的病原變化和疾病嚴(yán)重性，使宿主戰(zhàn)勝感染。這樣，能引發(fā)犬抵抗特定生物的免疫應(yīng)答的制劑包括那些能對(duì)部分生物如分泌性高分子引發(fā)免疫應(yīng)答的制劑。
典型地，能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑，包含滅活或減毒的馬鏈球菌獸瘟亞種，或馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫原片段或其衍生物，或編碼所述片段或所述衍生物的核酸(其中在此情況下，所述片段或所述衍生物包括多肽)。
馬鏈球菌獸瘟亞種已保藏在NCTC(保藏編號(hào)4676.S34)，ATCC(保藏編號(hào)43079)和國(guó)立乳品微生物保藏所(NCDO)(保藏編號(hào)1358)，并由Farrow等描述(1984)。
疫苗的“滅活”成分是指用可消除其致病能力，而又仍保持其激發(fā)保護(hù)性免疫能力的方式處理的特定疫苗成分，如細(xì)菌，支原體或病毒?！皽缁睢币呙绯煞职缁畹纳?。
用于將疫苗中使用的生物如細(xì)菌、支原體和病毒滅活或殺死的方法是本領(lǐng)域已知的，而且已用于如制備下文所述犬疫苗的某些成分。
在此，有許多種作為制備疫苗的滅活微生物的方法。最簡(jiǎn)單的方法是加熱滅活(例如，將病毒加熱至58℃，30分鐘；將細(xì)菌煮5分鐘，或加熱至65℃1小時(shí))或與福爾馬林混合滅活。還可以用其它化學(xué)品，或用紫外光處理來滅活微生物。
疫苗的“減毒”成分是指，以大大減弱致病能力、而又仍保持激發(fā)保護(hù)性免疫能力的方式篩選或處理的特定疫苗成分，如細(xì)菌，支原體或病毒。
用于將疫苗中使用的生物如細(xì)菌、支原體和病毒減毒的方法是本領(lǐng)域已知的，而且已用于如制備下文所述犬疫苗的某些成分。
可通過下述辦法來將微生物毒力減弱延長(zhǎng)在不同環(huán)境中即病毒或嗜衣原體細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)，以及固體培養(yǎng)基上或者用于不同細(xì)菌的宿主內(nèi)的傳代，直到觀察到毒力下降。另外，你可以定點(diǎn)突變或刪除細(xì)菌中的參與毒力的特定基因，從而限制微生物的病原潛力，或?qū)⑽⑸锿蛔兂蓪?duì)不存在于動(dòng)物宿主中的化合物具有特殊需求，而使其不能在宿主中繁殖和存活。還可以用化學(xué)處理和紫外光處理進(jìn)行減毒，而在基因組中點(diǎn)突變。
馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫原片段可以是任何能引發(fā)犬保護(hù)性免疫應(yīng)答的馬鏈球菌獸瘟亞種片段。這樣，當(dāng)將馬鏈球菌獸瘟亞種免疫原片段施給非免疫缺失或抑制免疫的犬時(shí)，它就能誘導(dǎo)所述犬的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生可特異地結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種的抗體。
典型地，特定微生物的免疫原片段是所述微生物的蛋白成分。微生物的“蛋白成分”包括是指全部蛋白或部分蛋白。應(yīng)該可以理解，所述蛋白片段可以是糖基化的或者非糖基化的。因此，“蛋白”還包括糖蛋白。不考慮其上所附糖的類型、數(shù)量、順序和位置，糖蛋白的氨基酸序列是指糖蛋白多肽骨架的氨基酸序列。
馬鏈球菌獸瘟亞種蛋白包括細(xì)胞表面蛋白前體(Genbank登錄號(hào)AAA86832和BAD00711)，Cpn60(Genbank登錄號(hào)AAM88472)，M-類蛋白(Genbank登錄號(hào)AAP33082，AAP33081，AAP33080，AAP33079，AAP22285，AAB92635，AAB92634，AAB92633，AAB92632，AAB92631，AAB92630，AAB92629，AAB92628，AAB92627，AAB92626，AAB92625，AAB92624，AAB92623，AAB92622，2111310A和BAD00712)，M-類蛋白前體(Genbank登錄號(hào)AAD37432)，M-類蛋白Szp2前體(Genbank登錄號(hào)AAF75674)，M-類蛋白Szp3前體(Genbank登錄號(hào)AAF75675)，M-類蛋白Szp4前體(Genbank登錄號(hào)AAF75676)，與肺炎鏈球菌ORF5相似的蛋白(Genbank登錄號(hào)BAB 16041)，推測(cè)的金屬結(jié)合/附著蛋白(Genbank登錄號(hào)CAB56710)，zoocinA免疫因子(Genbank登錄號(hào)AAC46073)和Walker等描述的Szp蛋白(1998，2003；包括Genbank登錄號(hào)AAQ08488-AAQ08510)。
優(yōu)選，馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫原片段是馬鏈球菌獸瘟亞種的結(jié)構(gòu)蛋白或其免疫原部分。更優(yōu)選，馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫原片段是分泌性毒素，或溶血素，或吸附因子/表面蛋白，或其免疫原部分。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法從細(xì)菌如馬鏈球菌獸瘟亞種中分離其它表面蛋白。Sambrook等(2001)“分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，第三版，Sambrook等(eds)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY，USA，在此引入作為參考，描述了可用于此目的的常規(guī)細(xì)菌克隆技術(shù)。
如果能引發(fā)犬免疫應(yīng)答的制劑是一種微生物成分如蛋白，那么所述蛋白就可以分離自所述微生物的培養(yǎng)物中。更優(yōu)選，蛋白可以通過表達(dá)編碼所述蛋白的適合的DNA構(gòu)建體，利用重組DNA技術(shù)?？寺?、操縱、修飾和表達(dá)核酸，以及純化表達(dá)蛋白的適合的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，而且在如Sambrook等(2001)中就有描述，在此引入以供參考。
另外，可利用蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)，如利用分離蛋白的部分蛋白水解(外部裂解或內(nèi)部裂解)，或通過從頭合成來制備蛋白?？衫肔u等(1981)J.Org.Chem.46，3433和本文所述參考文獻(xiàn)公開的固相肽合成的Fmoc-聚酰胺模式來進(jìn)行肽合成。
生物的免疫原片段的“衍生物”是指改變了在所述生物內(nèi)天然呈現(xiàn)的形態(tài)，但同時(shí)保持著在犬內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，如誘導(dǎo)產(chǎn)生特異地結(jié)合所述生物的抗體的能力的蛋白，或蛋白的一部分。
例如，衍生物可以包括蛋白或其部分的序列變體，其能用于誘導(dǎo)產(chǎn)生特異地結(jié)合所述生物的抗體。通常，可用氨基酸取代來提高疫苗的抗原性。優(yōu)選，序列變體與所述蛋白或其部分的天然序列具有至少90％，或至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％的同一性。更優(yōu)選，序列變體與所述蛋白或其部分的天然序列具有至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％，或至少99.5％的同一性。
兩多肽間的百分比序列同一性可以利用適合的計(jì)算機(jī)程序，如Wisconsin大學(xué)基因計(jì)算機(jī)小組的GAP程序來進(jìn)行測(cè)定。兩核苷酸或兩氨基酸序列間的百分同一性可以利用第10版GCG(遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組，(1991)，GCG軟件包程序指南，第7版，April 1991，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)來進(jìn)行測(cè)定。使用的GCG參數(shù)可以是DNA缺口產(chǎn)生罰分(Gapcreation penalty)50，缺口延伸罰分(gap extension penalty)3，蛋白缺口產(chǎn)生罰分8，缺口延伸罰分2。兩核苷酸或兩氨基酸序列間的百分同一性也可以利用第34版FASTA(Pearson WR.(1990)“Rapid and sensitive sequencecomparison with FASTP and FASTA”.Methods Enzymol.；18363-98)來進(jìn)行測(cè)定。FASTA設(shè)置可以是缺口開放罰分(Gap open penalty)-16和缺口延伸罰分-4。
應(yīng)理解，百分同一性是對(duì)那些序列已經(jīng)進(jìn)行了最佳對(duì)比的多肽進(jìn)行的計(jì)算。
作為選擇，可以利用Clustal W程序(Thompson等，(1994)Nucleic AcidsRes 22，4673-80)來進(jìn)行對(duì)比。使用的參數(shù)可以是下列快速逐對(duì)對(duì)比參數(shù)(fast pairwise alignment parament)K-tuple(字串)大小；1，窗口大?。?，缺口罰分；3，最高對(duì)角線數(shù)(number oftop diagonals)；5。記分方法x百分比。
多重對(duì)比參數(shù)缺口開放罰分；10，缺口延伸罰分；0.05。記分矩陣BLOSUM。
通常，序列變體有少于100，或少于50，或少于40，或少于30，或少于20個(gè)氨基酸殘基異于蛋白或其部分的天然序列。更優(yōu)選，序列變體有15或14或13或12或11或10或9或8或7或6或5或4或3或2或只有1個(gè)氨基酸殘基異于蛋白或其部分的天然序列。
可以改變衍生物的序列來提高媒介物的免疫原性，或者改變衍生物序列不會(huì)對(duì)其免疫原性有影響。例如，衍生物可以是去除了一個(gè)或多個(gè)免疫原性所必需的氨基酸序列的。
“衍生物”還包括在人工合成肽之前或之后，其氨基酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)行了化學(xué)修飾的肽，條件是所述多肽，也就是體內(nèi)特定抗體的產(chǎn)物的功能基本保持不變。所述修飾包括與酸或堿形成鹽，尤其是生理上可接受的有機(jī)或無機(jī)酸和堿，形成末端羧基的酯或酰胺，并連著氨基酸保護(hù)基團(tuán)如N-叔丁氧基羰基。所述修飾可以使所述肽免于體內(nèi)新陳代謝。所述多肽可以是單拷貝或多拷貝，例如串聯(lián)重復(fù)。充分進(jìn)行所述串聯(lián)或多拷貝可以使抗原本身避免使用載體。肽的N-末端和C-末端相連形成環(huán)，或在肽末端添加一個(gè)或多個(gè)Cys殘基而增加抗原性和/或讓形成二硫鍵是有利的。如果所述多肽與載體，優(yōu)選多肽共價(jià)連接，那么就優(yōu)選讓本發(fā)明的多肽形成環(huán)。
根據(jù)現(xiàn)有的免疫學(xué)理論，載體功能應(yīng)該存在于任何免疫原性配制劑中，從而可以刺激免疫系統(tǒng)或促進(jìn)對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激。已知，最佳載體包括有(或與抗原一起產(chǎn)生)T-細(xì)胞表位。多肽可以例如通過交聯(lián)而連接到其它載體如血清白蛋白，肌紅蛋白，細(xì)菌類毒素和匙孔帽貝血藍(lán)蛋白(keyhole limpethemocyanin)。最近發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)T-細(xì)胞輔助免疫應(yīng)答的載體包括乙型肝炎核心抗原(也稱作核衣殼蛋白)，推測(cè)的T-細(xì)胞表位，β-半乳糖苷酶，以及白細(xì)胞介素1的163-171肽。后一種化合物可以作為載體或佐劑或這兩種。作為選擇，幾個(gè)拷貝的相同或不同本發(fā)明多肽可以相互交聯(lián)，在這種情況下，不存在所述的不同載體，但是載體功能可以通過所述交聯(lián)來獲得。合適的交聯(lián)劑包括Sigma和Pierce目錄所列的那些交聯(lián)劑，例如戊二醛，碳化二亞胺和琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)已烷-1-羧酸酯，后面的交聯(lián)劑利用C-末端半胱氨酸殘基上的-SH基團(tuán)(如果存在)。
如果多肽是通過在合適的宿主中表達(dá)合適的核苷酸序列來制備的，那么與作載體的多肽序列一起以融合產(chǎn)物方式表達(dá)多肽是有利的。Kabigen′s“Ecosec”體系是此種安排的實(shí)例。
通常，編碼馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫原性片段的多核苷酸編碼功能蛋白，更優(yōu)選馬鏈球菌獸瘟亞種的表面蛋白或其免疫原性部分，或其衍生物。編碼各種馬鏈球菌獸瘟亞種蛋白的多核苷酸序列可以很容易地通過參考上述Genbank登記號(hào)來確定。而且，編碼任何免疫原性馬鏈球菌獸瘟亞種蛋白的多核苷酸序列可以很容易地通過常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)來確定。
通常，能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑包括滅活或減毒的狗支原體，或狗支原體或其衍生物的免疫原性片段，或編碼所述片段或所述衍生物的核酸。
狗支原體保藏在NCTC(保藏編號(hào)10142 H831)和ATCC(保藏編號(hào)27544)，并如Rosendal(1972)所述。
優(yōu)選，狗支原體的免疫原性片段是狗支原體或其免疫原性部分的功能蛋白，更優(yōu)選，狗支原體或其免疫原性部分或其衍生物的表面蛋白?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，從支原體如狗支原體分離表面蛋白。
通常，鑒定和分離支原體蛋白的方法與細(xì)菌相同，除某些基因可能需要能識(shí)別支原體獨(dú)特密碼子使用的專門載體(參見Molecular and DiagnosticProcedures in Mycoplasmology.Vol.1 Ed S.Razin & J.Tully.Academic PressInc.1995中Genome Characterisation and Genetics內(nèi)Section B中的所有章節(jié))。
最有效的支原體疫苗往往包括加熱-或福爾馬林滅活的全細(xì)胞或減毒活疫苗，因此包括全部或至少大部分的蛋白。用作疫苗的潛在支原體成分包括蛋白如主要吸附結(jié)構(gòu)膜蛋白，認(rèn)為約45kDA(等于獲自肺炎支原體(M.pneumoniae)的P1 cytadhesin和獲自生殖支原體(M.genitalium)的同系物如MgPa，它們?nèi)际且环N三基因操縱子的一部分)，表面暴露的蛋白和其它吸附蛋白，膜糖脂，膜多糖片段，脂多糖和那些提到的全部動(dòng)物支原體疫苗(Barile 1985和Barile等，1985)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，能引發(fā)抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑包括滅活或減毒的流產(chǎn)嗜衣原體，或流產(chǎn)嗜衣原體或其衍生物的免疫原性片段，或編碼所述片段或所述衍生物的核酸。
流產(chǎn)嗜衣原體(ATCC保藏編號(hào)VR-656)由Everett等作為綿羊嗜衣原體流產(chǎn)癥菌株B-577保藏。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，能引發(fā)抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑包括滅活或減毒的鸚鵡熱嗜衣原體，或鸚鵡熱嗜衣原體或其衍生物的免疫原性片段，或編碼所述片段或所述衍生物的核酸。
鸚鵡熱嗜衣原體也就是通常所說的鸚鵡熱衣原體，ATCC保藏編號(hào)VR-125(Lillie(1930)第1968頁(yè)，Int.J.Syst.Bacteriol.30274(AL))。
在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，能引發(fā)抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑包括滅活或減毒的貓嗜衣原體，或貓嗜衣原體或其衍生物的免疫原性片段，或編碼所述片段或所述衍生物的核酸。
貓嗜衣原體(ATCC保藏編號(hào)VR-120)由Everett等作為貓肺炎菌株No.1保藏。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，能引發(fā)抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑包括滅活或減毒的鼠衣原體(Chlamydia muridarum)(ATCC VR 123，MoPn；Everett等，1999，Int.J.Syst.Bacteriol.49431)；貓心衣原體(Chlamydia pecorum)(ATCC VR 628，Bo/E58；Fukushi和Hirai 1992，Int.J.Syst.Bacteriol.42307)；肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)(模式菌株TW-183；Grayston等，1989，Int.J.Syst.Bacteriol.3988)；豬衣原體(Chlamydia suis)(ATCC VR 1474，S45；Everett等，1999，Int.J.Syst.Bacteriol.49431)；或砂眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)(模式種)(ATCC VR 571；Busacca 1935 Rake 1957 amend.Everett等，1999，Int.J.Syst.Bacteriol.30274(AL)，或其免疫原性片段，或其衍生物，或編碼所述片段或所述衍生物的核酸。
流產(chǎn)衣原體，鸚鵡熱衣原體或貓衣原體，或鼠衣原體，貓心衣原體，肺炎衣原體，豬衣原體或砂眼衣原體的免疫原性片段可以是任何能引發(fā)犬保護(hù)性免疫應(yīng)答的片段。典型地，免疫原性片段是蛋白或其部分。優(yōu)選，免疫原性片段是結(jié)構(gòu)蛋白或其免疫原性部分。更優(yōu)選，免疫原性片段是表面蛋白，或其免疫原性部分或其衍生物。如上所述，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的常規(guī)方法從細(xì)菌如嗜衣原體分離表面蛋白。
流產(chǎn)衣原體蛋白包括60kD熱休克蛋白GroEL(Genbank登錄號(hào)AAD26144)，60kDa富含胱氨酸的膜復(fù)合蛋白(Genbank登錄號(hào)AAG60550)，90-kDa蛋白(Genbank登錄號(hào)AAC44400，AAC44401)，富含胱氨酸外膜蛋白Omp-2(Genbank登錄號(hào)AAD09597)，DnaK(Genbank登錄號(hào)AAN77259)，延伸因子P(Genbank登錄號(hào)AAK72389)，GrpE(Genbank登錄號(hào)AAN77258)，HrcA(Genbank登錄號(hào)AAN77257)，主要外膜蛋白(GenbankAccession Nos.AAK00237，CAA36152，CAD29327)，主要外膜蛋白前體(GenbankAccession Nos.AAD29103，AAD29102，AAG53881，P16567)，MutS(Genbank登錄號(hào)AAD25864)，Omp1(Genbank Accession Nos.CAA06182，CAA06620，CAA06621，CAA06622，CAA06624，CAA06625，CAA06183，CAA06184)，外膜蛋白(Genbank登錄號(hào)AAB02850)，外膜蛋白2(Genbank登錄號(hào)AAD20336)，POMP90A前體(Genbank登錄號(hào)AAC15922)，POMP90B前體(Genbank登錄號(hào)AAC15924)，POMP91A(Genbank登錄號(hào)AAC15921)，POMP91B前體(Genbank登錄號(hào)AAC15923)，推測(cè)的98 kDa外膜蛋白(Genbank登錄號(hào)AAB18188)，推測(cè)的外膜蛋白(Genbank登錄號(hào)AAB18187)，小型富含半胱氨酸的外膜脂蛋白(Genbank登錄號(hào)AAG60549)，富含硫的蛋白(Genbank登錄號(hào)AAG60551)，和OmpA(Genbank Accession Nos.AAT36355和AAT36356)。
鸚鵡熱衣原體蛋白包括60K富含半胱氨酸的外膜蛋白前體(GenbankAccession Nos.P23701，B39439，JC5204和P27606)；60K富含半胱氨酸的蛋白(Genbank Accession Nos.CAA37592和CAA37591)；chaperonin同系物(Genbank登錄號(hào)AAB22560)；早期上游開放閱讀框(EUO)(GenbankAccession Nos.AAA23124，Q06566和C36909)；EUO蛋白同系物(Genbank登錄號(hào)JC5207)；母羊流產(chǎn)蛋白(Genbank登錄號(hào)1601347A)；屬特異性蛋白(Genbank登錄號(hào)AAB22559)；高分子量富含半胱氨酸的包膜蛋白(Genbank登錄號(hào)AAB61619)；組蛋白H1-類蛋白(Genbank Accession Nos.AAA23132，JH0658，Q46204)；hypA蛋白(Genbank登錄號(hào)JL0116)；hypB蛋白(Genbank登錄號(hào)JL0117)；假設(shè)蛋白(Genbank Accession Nos.JC5206，NP_052329，NP_052332，NP_052331，NP_052330，NP_052328，NP_052327，NP_052326，NP_052325，NP_052323，CAA44340，CAA44339，CAA44334，CAA44341，CAA44338，CAA44337，CAA44336，CAA44335，CAA44332，A39999，NP_052324，CAA44333，S61492，S18143，C39999，D39999，E39999，F(xiàn)39999，S18148，G39999，H39999和I39999)；包涵體膜蛋白(Genbank Accession Nos.2108371A，S61491)，低分子量富含半胱氨酸的包膜蛋白(Genbank登錄號(hào)AAB61618)；富含賴氨酸的假設(shè)蛋白LRO(Genbank登錄號(hào)B36909)；主要外膜蛋白和前體(Genbank Accession Nos.CAA3 1177，2006276A1616229A，AAA23148，AAA23147，AAA17396，I40864，I40740，AAA23146，CAA40300，AAK00262，AAK00250，AAK00249，AAK00248，AAK00247，AAK00246，AAK00245，AAK00244，AAK00243，AAK00242，AAK00241，AAK00240，CAC84081，A60341，A40371，B60109，A60109，MMCWPM，MMCWP3，Q00087，P10332和AAQ91209)；主要sigma因子(Genbank登錄號(hào)AAA50747)；MutS(Genbank Accession Nos.AAD25866和AAD25863)；未知功能蛋白的N-末端部分(Genbank登錄號(hào)CAA90624)；ORF2(Genbank登錄號(hào)2108371B)；外膜蛋白1(Genbank Accession Nos.CAA76286和CAB96859)；外膜蛋白3前體(Genbank登錄號(hào)JC5203)；未知功能蛋白(Genbank登錄號(hào)CAA90623)；假設(shè)的多晶型膜蛋白(Genbank Accession Nos.AAL36963，AAL36962，AAL36961，AAL36960，AAL36959，AAL36958，AAL36957，AAL36956和AAL36955)；小型富含半胱氨酸的包膜蛋白envA前體(Genbank登錄號(hào)A39439)；富含硫的蛋白(Genbank Accession Nos.P28164，AAB61620和JC5205)；未知蛋白(Genbank Accession Nos.AAB22561和AAB22558)；毒質(zhì)粒parA家族蛋白pGP5-D(Genbank登錄號(hào)Q46263)；毒質(zhì)粒蛋白pGP2-D(Genbank登錄號(hào)Q46260)；毒質(zhì)粒蛋白pGP3-D(Genbank登錄號(hào)Q46261)；毒質(zhì)粒蛋白pGP4-D(Genbank登錄號(hào)Q46262)；毒質(zhì)粒蛋白pGP6-D(Genbank登錄號(hào)Q46264)，OmpA(Genbank AccessionNos.AAT3 6351和AAT36354)和60kDa chaperonin蛋白(Genbank登錄號(hào)AAT38208)。
貓衣原體蛋白包括熱休克蛋白GroEL(Genbank Accession Nos.AAL38954和AAO24106)；主要外膜蛋白(Genbank Accession Nos.AAK00238，AAK00239，AAO24108和CAA43409)；MutS(Genbank登錄號(hào)AAD25865)；和外膜蛋白2(Genbank Accession Nos.AAK38113，AAK38114，AAK38115，AAL89722，AAO24107，AAQ19779)。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所用的嗜衣原體蛋白是外膜蛋白如主要外膜蛋白(MOMP)。其它合適的嗜衣原體蛋白包括LPS或OmcB蛋白。
通常，編碼流產(chǎn)衣原體，鸚鵡熱衣原體或貓衣原體免疫原性片段的多核苷酸編碼結(jié)構(gòu)蛋白，更優(yōu)選表面蛋白，或其免疫原性部分，或其衍生物。編碼各種蛋白的核酸序列可以參考上述Genbank登記號(hào)來很容易地確定，而且可以很容易地利用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)來測(cè)定。
在一個(gè)實(shí)施方式中，能引發(fā)抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑包括滅活或減毒的嗜衣原體，其具有SEQ ID NO1序列的23S rRNA基因的218個(gè)核苷酸部分序列，或其免疫原性片段或其衍生物，或編碼所述片段或衍生物的核酸。具有SEQ ID NO1序列的23S rRNA基因的218個(gè)核苷酸部分序列的嗜衣原體可在患CIRD犬的氣管和肺中發(fā)現(xiàn)，或者從中分離，通?；糃IRD的犬來自救助中心和寄宿場(chǎng)所或訓(xùn)練場(chǎng)所。
嗜衣原體可以分離自犬，在存在或缺少環(huán)己酰亞胺的條件下，通過將組織提取物接種到McCoy細(xì)胞系上，在37℃，5％CO2將細(xì)胞培養(yǎng)到10天，然后通過凍裂細(xì)胞提取嗜衣原體。常用該方法從鳥、貓、人和其它宿主分離嗜衣原體。23S rRNA基因片段可通過實(shí)施例3所描述的PCR條件從嗜衣原體擴(kuò)增出來，所得序列通過與圖5或8的序列比較來證實(shí)。
對(duì)于疫苗應(yīng)用，可以用各種復(fù)制(如重組腺病毒疫苗)或非復(fù)制(DNA疫苗)載體來輸送多核苷酸制劑。
疫苗的典型劑量是含有約5-10μg的重組蛋白。細(xì)菌疫苗的典型劑量是形成108個(gè)菌落單位/ml。
通常，疫苗組合物進(jìn)一步包含生理上可接受的載體，稀釋劑或佐劑。
某些載體和佐劑如上所述。其它合適的佐劑包括弗氏完全佐劑或不完全佐劑，胞壁酰二肽，EP 109 942、EP 180 564和EP 231 039的“Iscoms”，氫氧化鋁，皂苷，DEAE-葡聚糖，中性油(如miglyol)，植物油(如花生油)，脂質(zhì)體，Pluronic多元醇或Ribi輔助系統(tǒng)(參見如GB-A-2 189 141)。
所述載體必須是“可接受的”的意思是與本發(fā)明的制劑相容，并且不能對(duì)其受體有害。典型的載體是水或鹽，它們是無菌且無致熱原的。
通常，疫苗經(jīng)口服、肌肉、皮下、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)或鼻內(nèi)途徑給藥。
適于腸胃外給藥的疫苗組合物包括水性或非水性的無菌注射液，其可以包括抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑、與目標(biāo)受體血液達(dá)到等滲的溶質(zhì)；和/或包含懸浮劑和增稠劑的水性或非水性的無菌懸浮液。
疫苗組合物可以裝入單位劑量的或多劑量的容器內(nèi)，例如，封密的安瓿和小管，可以貯存于冷凍干燥(凍干)條件下，在使用前，僅需加入無菌液態(tài)載體，如加入水來用于注射。即用注射液和懸浮液可用無菌粉末，顆粒和片劑來制成。
疫苗組合物可通過鼻內(nèi)給藥，可方便地以氣溶膠噴霧劑的形式由加壓容器、泵或噴霧器使用適宜的揮發(fā)劑給藥，適宜的揮發(fā)劑是例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氫氟烷烴如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A3或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EA3)，二氧化碳或其它適宜的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可通過提供的閥所釋放計(jì)量的量而確定。加壓容器、泵或噴霧器可含有制劑的溶液或懸浮液，例如使用乙醇和揮發(fā)劑作為溶劑的混合物，它們可另外含有潤(rùn)滑劑，例如脫水山梨醇三油酸酯。
對(duì)于獸藥用途，疫苗以正常獸藥實(shí)踐中可接受的制劑制備，并且獸醫(yī)會(huì)確定對(duì)于特定動(dòng)物最適合的給藥方案和給藥途徑。
適合犬給藥的疫苗劑型是本領(lǐng)域所熟知的，包括下述犬疫苗中所用的劑型。
如上所討論的，許多病毒和細(xì)菌制劑都已知與犬呼吸道疾病相關(guān)，包括犬呼吸道冠狀病毒(CRCV)，犬副流感病毒(CPIV)，2型犬腺病毒(CAV-2)，犬皰疹病毒(CHV)和支氣管炎博德特氏菌。
因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗組合物進(jìn)一步含有任一種或多種d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
因此，可選地，疫苗組合物還含有任兩種，或任三種，或任四種，或所有五種此其它制劑。
通常，能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑包括滅活或減毒的CRCV，或CRCV的免疫原性片段，或編碼所述免疫原性片段的核酸。
CRCV的適合免疫原性片段描述在WO 2004/011651(The RoyalVeterinary College)和Erles等，2003中。CRCV的適合免疫原性片段包括刺突蛋白(S)和血凝素-酯酶(HE)表面蛋白，膜糖蛋白(M)，和核殼蛋白(N)，或其免疫原性部分。WO 2004/011651中所描述的CRCV-類刺突蛋白和HE蛋白也很適合作為引發(fā)抵抗CRCV免疫應(yīng)答的制劑。關(guān)系非常近的冠狀病毒，如牛冠狀病毒和人冠狀病毒，和其免疫原性片段也很適合作為引發(fā)抵抗CRCV免疫應(yīng)答的制劑。與用作抵抗CRCV的疫苗成分的制劑相關(guān)的wO 2004/011651的全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考。
通常，能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑包括滅活或減毒的CPIV，或其免疫原性片段，或編碼所述免疫原性片段的核酸。
通常，能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑包括滅活或減毒的CAV-2，或其免疫原性片段，或編碼所述免疫原性片段的核酸。
1型犬腺病毒引起傳染性肝炎；2型犬腺病毒引起呼吸道疾病。已經(jīng)證實(shí)CAV-1提供抵抗CAV-2的交叉保護(hù)，反之亦然。因此，引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑可以包括CAV-1或CAV-2，或其免疫原性片段。除EURICANDHPPi之外，下列疫苗包含CAV-2，其并未指明所用的病毒類型。
引發(fā)犬抵抗CPIV和CAV-2的免疫應(yīng)答的適合制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。例如，下述犬疫苗在英國(guó)是得到許可的。
Fort Dodge Animal Health的KAVAKDA2PiP69是凍干活疫苗，包含在組織培養(yǎng)物上生長(zhǎng)的犬瘟熱病毒，2型犬腺病毒，2型犬副流感病毒和犬細(xì)小病毒減毒株。
Fort Dodge Animal Health的KAVAK副流感病毒包含在確定同源的細(xì)胞系上培養(yǎng)的衍生自2型犬副流感病毒減毒株的凍干活疫苗。
Intervet UK Limited的NOBIVACDHPPi是凍干活疫苗，病毒疫苗包含在細(xì)胞系組織培養(yǎng)物上生長(zhǎng)的犬瘟熱病毒，2型犬腺病毒，犬細(xì)小病毒和犬副流感病毒。
Intervet UK Limited的NOBIVACKC是修飾的凍干活疫苗，包含支氣管炎博德特氏菌菌株B-C2和犬副流感病毒菌株Cornell(此為鼻內(nèi)疫苗)。管理授權(quán)號(hào)Vm 06376/4026。
Merial Animal Health Ltd.的EURICANDHPPi是抵抗犬瘟熱病毒，傳染性犬肝炎，犬細(xì)小病毒和2型犬副流感病毒的重組凍干活疫苗。
Pfizer Ltd.的VANGUARD7包含在確定細(xì)胞系上傳代的減毒活犬瘟熱病毒(Snyder Hill菌株)，腺病毒(CAV-2 Manhattan菌株)，副流感病毒(NL-CPI-5菌株)，犬細(xì)小病毒(NL-35-D)，以及犬型鉤端螺旋體(Leptospiracanicola)和出血性黃疸鉤端螺旋體(Leptospira icterohaemorrhagiae)的滅活培養(yǎng)物。
Schering-Plough Animal Health的QUANTUMDOG 7包含犬瘟熱病毒，2型腺病毒，細(xì)小病毒，2型副流感病毒疫苗(活)以及滅活的犬型鉤端螺旋體和出血性黃疸鉤端螺旋體疫苗。
Virbac Ltd.的CANIGEN DHPPi是凍干的減毒活病毒疫苗，包含在細(xì)胞系組織培養(yǎng)物上生長(zhǎng)的犬瘟熱病毒，犬腺病毒(CAV-2)，犬細(xì)小病毒和犬副流感病毒。
Virbac Ltd.的CANIGEN Ppi是凍干的減毒活病毒疫苗，包含在細(xì)胞系組織培養(yǎng)物上生長(zhǎng)的犬瘟熱病毒，犬腺病毒(CAV-2)，犬細(xì)小病毒和犬副流感病毒。
通常，能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑包括滅活或減毒的CHV，或其免疫原性片段，或編碼所述免疫原性片段的核酸。
引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的適合制劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。例如，Merial的EURICAN Herpes 205是抵抗CHV的純化亞單位疫苗，其指示懷孕母犬防死亡率的主動(dòng)免疫，由于生命早期獲得性CHV感染而引起的臨床癥狀和狗仔損害。成年犬不能接種該疫苗用于防治呼吸道疾病。
通常，能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑包括滅活或減毒的支氣管炎博德特氏菌，或其免疫原性片段，或編碼所述免疫原性片段的核酸。
引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的適合制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。例如，下述犬疫苗是許可使用的。
Pfizer Animal Health(U.S.Vet.Lic.No.189)的COUGHGUARD-B包含滅活的支氣管炎博德特氏菌培養(yǎng)物。它用于免疫健康犬抵抗由支氣管炎博德特氏菌引起的疾病，尤其是舍咳。COUGHGUARD-B制備自支氣管炎博德特氏菌的高抗原性菌株，所述菌株已經(jīng)滅活，并且在施給犬時(shí)是無毒的。所報(bào)道的制備方法是保留支氣管炎博德特氏菌完整的免疫原特性。
Pfizer Animal Health (U.S.Vet.Lic.No.189)的VANGUARD5/B包含在確定犬細(xì)胞系上傳代的犬瘟熱病毒(CDV)，CAV-2，CPIV和犬細(xì)小病毒(CPV)的減毒菌株。CPV抗原通過在犬細(xì)胞系上低傳代來減毒，在此傳代水平上，CPV抗原具備壓倒母體抗體的免疫原特性。在真空中，將所述疫苗用惰性氣體以凍干形式包裝。含支氣管炎博德特氏菌滅活全培養(yǎng)物的疫苗成分作為稀釋劑使用。VANGUARD5/B中的支氣管炎博德特氏菌細(xì)菌成分制自已經(jīng)滅活并且在施給犬時(shí)無毒的高抗原性菌株。
Pfizer Animal Health(U.S.Vet.Lic.No.112)的NASAGUARD-BTM由支氣管炎博德特氏菌的無毒活培養(yǎng)物組成。
Intervet的PROGARD-KC是修飾的鼻內(nèi)活疫苗，包含減毒犬副流感病毒和支氣管炎博德特氏菌無毒活培養(yǎng)物。PROGARD-KC和無菌稀釋劑以干燥形式存在，用于再構(gòu)成。PROGARD-KC用于接種健康、易染幼犬和犬，預(yù)防由犬副流感病毒和支氣管炎博德特氏菌引起的犬傳染性氣管支氣管炎(″舍咳″)。
Intervet的PROGARD-KC PLUS包含支氣管炎博德特氏菌無毒菌株的活培養(yǎng)物，減毒的2型犬腺病毒和副流感病毒，用于鼻內(nèi)給藥。接種PROGARD-KC Plus，刺激呼吸道內(nèi)的快速局部免疫，從而抑制入口處感染并且預(yù)防臨床癥狀。除局部免疫之外，在鼻內(nèi)給藥3周內(nèi)還可刺激全身免疫。接種少量(0.4ml)和1鼻量的PROGARD-KC Plus用來緩解病癥，尤其是小仔和幼犬。PROGARD-KC Plus和無菌稀釋劑以干燥形式存在，用于再構(gòu)成。PROGARD-KC Plus用于接種健康犬和三周齡幼犬或者更大的犬，預(yù)防由2型犬腺病毒，副流感病毒和支氣管炎博德特氏菌引起的犬傳染性氣管支氣管炎(″舍咳″)。
Intervet的Intrac是凍干的修飾活疫苗，包括支氣管炎博德特氏菌菌株S55，用于鼻內(nèi)給藥。產(chǎn)品許可號(hào)PL 0201/4011。
NobivacKC，如上所述，還包括支氣管炎博德特氏菌。
在一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗組合物包括(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；和/或(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑，和任選，任意一種或多種下述制劑(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑；(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，疫苗組合物包括
(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，疫苗組合物包括(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；和任意一種或多種下述制劑(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
因此，應(yīng)理解，除制劑(b)和(d)，組合物可以包括制劑(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意兩種，或全部五種制劑(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意三種或任意四種。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，疫苗組合物包括(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；和(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；和任意一種或多種下述制劑(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
因此，應(yīng)理解，除制劑(a)，(b)和(d)，組合物可以包括制劑(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意兩種，或全部五種制劑(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意三種或任意四種。
本發(fā)明的第二方面提供了免疫接種犬抵抗CIRD的方法，包括對(duì)犬施用本發(fā)明第一方面的疫苗組合物。
本發(fā)明的第三方面提供了治療犬CIRD的方法，包括對(duì)犬施用本發(fā)明第一方面的疫苗組合物。
因此，可以看出本發(fā)明第一方面的疫苗組合物可用于預(yù)防性或治療性地對(duì)抗CIRD。
本發(fā)明的第四方面提供了任意一種或多種下述制劑制備預(yù)防或治療犬CIRD的藥物的用途(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物進(jìn)一步包括任意一種或多種下述制劑(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
在本發(fā)明的此方面和隨后的方面中，優(yōu)選(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)和(h)是如本發(fā)明第一方面所述的。
本發(fā)明的第五方面提供了刺激犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體和嗜衣原體中任意一種或多種微生物的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括分別對(duì)犬施用任意一種或多種下述制劑(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑。
在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括施用任意一種或多種下述制劑(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
本發(fā)明的第六方面提供了任意一種或多種下述制劑的用途(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑；
所述用途是制備藥物用于刺激犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體和嗜衣原體中相應(yīng)的任意一種或多種微生物的免疫應(yīng)答。
在一個(gè)實(shí)施方式中，該藥物進(jìn)一步包括任意一種或多種下述制劑(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
本發(fā)明的第七方面提供了用于醫(yī)學(xué)、且包括任意一種或多種下述制劑的組合物，該組合物因此被包裝成便于醫(yī)學(xué)應(yīng)用的形式(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑。
應(yīng)理解，該組合物可以包括任意兩種所述制劑，例如(a)和(b)，(a)和(c)，或(b)和(c)。組合物可以包括所有三種所述制劑(a)，(b)和(c)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，該組合物是用于獸醫(yī)學(xué)的組合物。所述組合物因此被包裝成便于獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用的形式。
通常，該組合物是用于犬獸醫(yī)學(xué)的組合物。所述組合物因此被包裝成便于犬獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用的形式，即所述組合物被包裝成適于在犬中使用。
在一個(gè)實(shí)施方式中，該組合物進(jìn)一步包括任意一種或多種下述制劑(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
在此方面的實(shí)施方式中，該組合物包括(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；和/或(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑，和任選，任意一種或多種下述制劑(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑；(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；
(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
在此方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，該組合物包括(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑。
在此方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該組合物包括(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；和任意一種或多種下述制劑(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
因此，應(yīng)理解，除制劑(b)和(d)，該組合物可以包括制劑(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意兩種，或全部五種制劑(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意三種或任意四種。
在此方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該組合物包括(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；和(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；和任意一種或多種下述制劑(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
因此，應(yīng)理解，除制劑(a)，(b)和(d)，該組合物可以包括制劑(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意兩種，或全部五種制劑(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意三種或任意四種。
本發(fā)明的第八方面提供了本發(fā)明第一方面的疫苗組合物的成套試劑盒(kit of parts)，它包括任意一種或多種下述制劑(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑，和任選地藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或佐劑。
應(yīng)理解，該成套試劑盒可以包括任意兩種所述制劑，例如(a)和(b)，(a)和(c)或(b)和(c)。該試劑盒可以包括這所有三種制劑(a)，(b)和(c)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，該試劑盒進(jìn)一步包括一種或多種(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
在此方面的實(shí)施方式中，該試劑盒包括(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；和/或(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑，和任選地一種或多種(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑；(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
在此方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，該試劑盒包括(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑。
在此方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該試劑盒包括(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；
和任意一種或多種下述制劑(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
因此，應(yīng)理解，除制劑(b)和(d)，該試劑盒可以包括制劑(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意兩種，或全部五種制劑(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意三種或任意四種。
在此方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該試劑盒包括(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；和(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；和任意一種或多種下述制劑(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
因此，應(yīng)理解，除制劑(a)，(b)和(d)，該試劑盒可以包括制劑(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意兩種，或全部五種制劑(c)，(e)，(f)，(g)和(h)中的任意三種或任意四種。
在第九方面，本發(fā)明提供了制備抗馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體或嗜衣原體中任意一種或多種微生物的抗體的方法，包括引發(fā)動(dòng)物對(duì)馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體或嗜衣原體中相應(yīng)的任意一種或多種微生物或者其免疫原性片段的免疫應(yīng)答，從所述動(dòng)物或其衍生的無限增殖細(xì)胞制備抗體。
制備單克隆抗體的方法和技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如公開于“Monoclonal AntibodiesA manual of techniques”，H Zola(CRC Press，1988)和“Monoclonal Hybridoma AntibodiesTechniques and Applications”，JG R Hurrell(CRC Press，1982)中的方法和技術(shù)，引入以供參考。
本發(fā)明的第十方面提供了獲得抗馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體或嗜衣原體中任意一種或多種微生物的抗體的方法，包括利用馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體或嗜衣原體中相應(yīng)的任意一種或多種微生物或其免疫原性片段，從抗體展示庫(kù)中選出抗體。嗜衣原體是流產(chǎn)嗜衣原體或鸚鵡熱嗜衣原體或貓嗜衣原體。在其它實(shí)施方式中，嗜衣原體是鼠嗜衣原體，貓心嗜衣原體，肺炎嗜衣原體，豬嗜衣原體或砂眼嗜衣原體。
本發(fā)明的第十一方面提供了特異地結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體或嗜衣原體的抗體。所述抗體可以通過本發(fā)明第九和第十方面的方法來制備。
在一個(gè)實(shí)施方式中，特異地結(jié)合嗜衣原體的抗體與流產(chǎn)嗜衣原體或鸚鵡熱嗜衣原體或貓嗜衣原體結(jié)合。在其它實(shí)施方式中，特異地結(jié)合嗜衣原體的抗體與鼠嗜衣原體，貓心嗜衣原體，肺炎嗜衣原體，豬嗜衣原體或砂眼嗜衣原體結(jié)合。
在本發(fā)明的此方面和隨后方面的內(nèi)容中，“抗體”不但包括完整免疫球蛋白分子，而且包括其片段，如Fab，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v和其保留抗原結(jié)合位點(diǎn)的其它片段。與此情況相似，術(shù)語“抗體”包括抗體的基因工程衍生物，如單鏈Fv分子(scFv)和功能域抗體(dAbs)。該術(shù)語還包括抗體樣分子，它利用噬菌體展示技術(shù)或其它隨機(jī)選擇技術(shù)來制備結(jié)合特定生物或該生物的區(qū)域的分子。因此，在此文中，術(shù)語抗體包括含天然抗體中作為識(shí)別位點(diǎn)(即與表位或抗原結(jié)合的抗體部分)的結(jié)構(gòu)(優(yōu)選肽結(jié)構(gòu))的所有分子。
抗體的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)參與抗原識(shí)別，這一事實(shí)最初由早期蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)所鑒定。通過嚙齒類抗體的“人源化”進(jìn)一步地證實(shí)該事實(shí)。嚙齒類來源的可變區(qū)可與人來源的恒定區(qū)融合，所得抗體保留了嚙齒類親本抗體的抗原特異性(Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，6851-6855)。
這種抗原特異性由可變區(qū)賦予，并且不依賴于恒定區(qū)，這可通過抗體片段(均包含一個(gè)或多個(gè)可變區(qū))的細(xì)菌表達(dá)實(shí)驗(yàn)得知。這些分子包括Fab樣分子(Better等(1988)Science 240，1041)；Fv分子(Skerra等(1988)Science 240，1038)；單鏈Fv(ScFv)分子，其中VH和VL配偶體結(jié)構(gòu)域通過一個(gè)柔性寡肽相連接(Bird等(1988)Science 242，423；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879)和包含分離的V結(jié)構(gòu)域的單結(jié)構(gòu)域抗體(dAbs)(Ward等(1989)Nature 341，544)。Winter和Milstein(1991)Nature 349，293-299中有在保留其特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段的合成中所涉及技術(shù)的一般性綜述。
“ScFv分子”是指其中VH和VL配偶體結(jié)構(gòu)域通過柔性寡肽連接的那些分子。工程抗體，如ScFv抗體可以利用J.Huston等(1988)“Proteinengineering of antibody binding sitesrecovery of specific activity in ananti-digoxin single chain FV analogue produced in E.coli”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，pp.5879-5883，和A.Pluckthun，(June 1991)“Antibody engineering；Advances from use of E.coli expression systems”，Bio/technology vol 9(引入供參考)中所描述的技術(shù)和方法來制備。
使用抗體片段而非整個(gè)抗體的好處是多方面的。小體積片段可能會(huì)改善藥理學(xué)特性，如更利于滲透到靶位點(diǎn)。完整抗體的效應(yīng)子功能，如補(bǔ)體結(jié)合被除去。Fab，F(xiàn)v，ScFv和dAb抗體片段可由大腸桿菌表達(dá)并分泌，從而可以容易地生產(chǎn)大量的所述片段。
完整抗體，以及F(ab’)2片段是“二價(jià)”的?！岸r(jià)”是指所述抗體和F(ab’)2片段有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。相反，F(xiàn)ab，F(xiàn)v，ScFv和dAb片段是單價(jià)的，僅有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
雖然所述抗體可以是多克隆抗體，但優(yōu)選是單克隆抗體。在某些情況下，特別是如果要對(duì)犬重復(fù)施用所述抗體時(shí)，優(yōu)選所述單克隆抗體是犬單克隆抗體或“犬化”抗體。
多克隆抗體可以制備成多特異性或單特異性的。優(yōu)選它們是單特異性的。Neuberger等(1998，8thInternational Biotechnology Symposium Part 2，792-799)討論了嵌合抗體。
優(yōu)選所述抗體是“犬化”抗體。適當(dāng)制備的非犬抗體可用已知方法進(jìn)行“犬化”，如通過將小鼠抗體的CDR區(qū)插入犬抗體的框架內(nèi)。犬化抗體可以利用M.Verhoeyen，C.Milstein和G.Winter(1988)“Reshaping humanantibodiesGrafting an antilysozyme activity”，Science，239，1534-1536，和C.Kettleborough等，(1991)“Humanisation of a mouse monoclonal antibody byCDR grafting；The importance of framework residues in loop conformation”，Protein Engineering，14(7)，773-783(引入以供參考)中所描述的相應(yīng)人源化抗體技術(shù)和方法來制備。
應(yīng)理解，通過施用與參與此疾病的制劑反應(yīng)的抗體，犬可以被動(dòng)獲得抵抗CIRD的免疫性。
因此，本發(fā)明的第十二方面提供了被動(dòng)地免疫犬而抵抗CIRD的方法，包括給所述犬施用一種或多種特異地結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體和嗜衣原體中相應(yīng)的一種或多種微生物的抗體。
特異地結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體和嗜衣原體的抗體可以利用常規(guī)技術(shù)如上面所述的技術(shù)來制備或獲得。
應(yīng)理解，犬CIRD可通過施用與該疾病相關(guān)制劑反應(yīng)的抗體來治愈。
在第十三方面，本發(fā)明提供了治療犬CIRD的方法，包括對(duì)所述犬施用一種或多種特異地結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體和嗜衣原體中相應(yīng)的一種或多種微生物的抗體。
在第十二或第十三方面的實(shí)施方式中，特異地結(jié)合嗜衣原體的抗體與流產(chǎn)嗜衣原體，或鸚鵡熱嗜衣原體或貓嗜衣原體結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，特異地結(jié)合嗜衣原體的抗體與鼠嗜衣原體，貓心嗜衣原體，肺炎嗜衣原體，豬嗜衣原體或砂眼嗜衣原體結(jié)合。
在第十二或第十三方面的實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包含施用特異地結(jié)合CRCV，CPIV，CAV-2，CHV和支氣管炎博德特氏菌中任意一種或多種微生物的抗體。
特異地結(jié)合CRCV，CPIV，CAV-2，CHV和支氣管炎博德特氏菌的抗體可以利用常規(guī)技術(shù)，如上所述的技術(shù)來制備。
本發(fā)明的第十四方面提供了一種或多種特異地結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體和嗜衣原體中相應(yīng)的一種或多種微生物的抗體用于制備使犬被動(dòng)免疫抵抗CIRD的藥物的用途。
本發(fā)明的第十五方面提供了一種或多種特異地結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體和嗜衣原體中相應(yīng)的一種或多種微生物的抗體用于制備治療犬CIRD的藥物的用途。
在第十四或第十五方面的實(shí)施方式中，特異地結(jié)合嗜衣原體的抗體與流產(chǎn)嗜衣原體，或鸚鵡熱嗜衣原體或貓嗜衣原體結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，特異地結(jié)合嗜衣原體的抗體與鼠嗜衣原體，貓心嗜衣原體，肺炎嗜衣原體，豬嗜衣原體或砂眼嗜衣原體結(jié)合。
在第十四或第十五方面的實(shí)施方式中，所述藥物進(jìn)一步包含特異地結(jié)合CRCV，CPIV，CAV-2，CHV和支氣管炎博德特氏菌中任意一種或多種微生物的抗體。
本發(fā)明的第十六方面提供了包含特異地結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種的抗體，特異地結(jié)合狗支原體的抗體，和特異地結(jié)合嗜衣原體的抗體中的任意兩種或多種抗體的組合物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，特異地結(jié)合嗜衣原體的抗體與流產(chǎn)嗜衣原體，或鸚鵡熱嗜衣原體或貓嗜衣原體結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，特異地結(jié)合嗜衣原體的抗體與鼠嗜衣原體，貓心嗜衣原體，肺炎嗜衣原體，豬嗜衣原體或砂眼嗜衣原體結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物進(jìn)一步包含特異地結(jié)合CRCV，CPIV，CAV-2，CHV和支氣管炎博德特氏菌中的任意一種或多種的抗體。
還應(yīng)理解，本發(fā)明包括治診斷方法和測(cè)定。因此，本發(fā)明提供了確定是否犬接觸過與CIRD相關(guān)的嗜衣原體物種的方法，該方法包括(a)獲得來自犬的合適的樣品；和(b)鑒定該樣品中與CIRD相關(guān)的嗜衣原體物種，或者其中的抗體。
通常，嗜衣原體物種具有包含SEQ ID Nos1-8任一序列(當(dāng)以RNA顯示時(shí))的23S RNA(參見顯示部分23S RNA序列的圖5和8，及實(shí)施例3)。
本發(fā)明還提供了確定犬是否患有或易染CIRD的方法，該方法包括(a)獲得來自犬的合適的樣品；和(b)鑒定該樣品中的馬鏈球菌獸瘟亞種或狗支原體或嗜衣原體中的任意一種或多種微生物，或者其任何抗體。
應(yīng)理解，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法例如通過對(duì)樣品中的生物本身或其片段(如蛋白或核酸)進(jìn)行檢測(cè)，可以檢測(cè)出當(dāng)前接觸的生物。所述方法還可以通過檢測(cè)樣品中的抗體來檢測(cè)出過去接觸過的生物。
通常，所述樣品是任何含有體的合適樣品，包括樣品如血清、唾液、氣管洗液和支氣管肺泡灌洗液(bronchiolar lavage)。
因此，通過對(duì)樣品中生物或其成分的存在進(jìn)行分析，可以確定樣品所來源犬中的生物存在情況。例如，對(duì)于含23S RNA的核酸成分來說，可以如利用高嚴(yán)格條件下雜交，特異性擴(kuò)增，核苷酸測(cè)序技術(shù)和本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它方法(Sambrook等(2001)見上)來提取核酸或者如果需要，將核酸復(fù)制到DNA內(nèi)并檢測(cè)?！霸诟邍?yán)格條件下雜交”是指該多核苷酸和它雜交的核酸具有足夠的核苷酸序列相似性，從而它們能在高嚴(yán)格條件下雜交。如本領(lǐng)域所知，核酸雜交的嚴(yán)格性依賴于諸如發(fā)生雜交的核酸長(zhǎng)度，雜交序列的同一性程度的因素，以及如溫度，離子強(qiáng)度和該序列的CG或AT含量的因素。
在高嚴(yán)格條件下，能與該生物的核酸分子雜交的核酸包括與該生物的至少部分核酸有＞90％的序列同一性的核酸，優(yōu)選＞95％或＞96％或＞97％或＞98％，更優(yōu)選＞99％的序列同一性的核酸。
常見的導(dǎo)致選擇性雜交的高嚴(yán)格雜交條件是本領(lǐng)域已知的，例如Sambrook等2001(見上)(引入供參考)中所述的條件。
當(dāng)核酸固定在尼龍膜上并且探針核酸≥500個(gè)堿基時(shí)，一個(gè)常用的雜交溶液的實(shí)例是6x SSC(檸檬酸鈉鹽)0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)100μg/ml變性的，斷裂的鮭精DNA該雜交在68℃下進(jìn)行。該固定有核酸的尼龍膜于68％下用0.1×SSC洗滌。
20×SSC可以下述方式制備。將175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉溶于800ml H2O中。用幾滴10N NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至7.0。用H2O將其體積調(diào)至1升。分成若干等份。高壓滅菌。
當(dāng)核酸固定于尼龍膜上并且探針為15-50個(gè)堿基的寡核苷酸時(shí)，一個(gè)常用的雜交溶液的實(shí)例是3.0M氯化三甲銨(TMACl)0.01M磷酸鈉(pH 6.8)1mm EDTA(pH 7.6)0.5％SDS100μg/ml變性的，斷裂的鮭精DNA0.1％脫脂奶粉最佳的雜交溫度通常選為比給定鏈長(zhǎng)的Ti低5℃。Ti是探針和其靶序列間所成的雜交體的不可逆解鏈溫度。Jacobs等(1988)，Nucl.Acids Res.16，4637討論了Ti的測(cè)定。對(duì)在3M TMACl中的1 7基體的建議雜交溫度為48-50℃；對(duì)19基體的為55-57℃；而對(duì)20基體則為58-66℃。
可使用任何已知的方法來分析獲自犬樣品的該生物的蛋白成分。通常，所述方法是基于抗體和與該生物或其成分結(jié)合的抗體的技術(shù)。
例如，可用經(jīng)典的免疫組織方法來研究該生物的蛋白表達(dá)。其中，第一抗體(多克隆或單克隆)提供特異性識(shí)別，而第二級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)可應(yīng)用熒光、酶或其它偶聯(lián)的第二抗體。結(jié)果，獲得用于病理檢查的組織切片的免疫組織染色。也可使用如尿素和中性去污劑提取組織，使蛋白釋放，用于Western印跡或斑點(diǎn)/印跡(dot/slot)測(cè)定(Jalkanen，M.等，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，M.等，J. Cell.Biol.1053087-3096(1987))。在基于應(yīng)用陽離子固相的此技術(shù)中，使用分離的蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)完成蛋白的定量。此技術(shù)也能用于體液樣品。
對(duì)檢測(cè)蛋白表達(dá)有利的其它基于抗體的方法包括免疫分析法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和放射免疫分析(RIA)。例如，反應(yīng)性的單克隆抗體既可用作免疫吸附劑又可用作酶標(biāo)記探針，以檢測(cè)和定量蛋白?？衫镁€性回歸計(jì)算機(jī)算法參照標(biāo)準(zhǔn)制劑中存在的量計(jì)算樣品中存在的蛋白量。檢測(cè)腫瘤抗原的ELISA描述在Iacobelli等，Breast Cancer Research and Treatment1119-30(1988)中。在另一種ELISA測(cè)定法中，可使用兩種獨(dú)特的特異單克隆抗體檢測(cè)體液中的蛋白。在此測(cè)定法中，一種抗體用作免疫吸附劑，而另一種用作酶標(biāo)記探針。
以上技術(shù)基本可按“一步”或“兩步”測(cè)定法進(jìn)行。“一步”測(cè)定法包括用固定的抗體接觸蛋白，不必洗滌，將混合物與標(biāo)記抗體接觸?！皟刹健睖y(cè)定法包括用標(biāo)記抗體接觸混合物之前洗滌。如果合適也可使用其它常規(guī)方法。通常希望將測(cè)定系統(tǒng)的一種成分固定于支持物上，由此允許系統(tǒng)的其它成分進(jìn)入并接觸此成分，并且易于從樣品中去除這些成分。
合適的酶標(biāo)記物包括，例如，通過與底物反應(yīng)催化過氧化氫產(chǎn)生的氧化酶。葡萄糖氧化酶是特別優(yōu)選的，因?yàn)樗哂辛己玫姆€(wěn)定性并且它的底物(葡萄糖)易于得到?？赏ㄟ^測(cè)定經(jīng)酶-標(biāo)記抗體/底物反應(yīng)形成的過氧化氫的濃度來測(cè)定氧化酶標(biāo)記物的活性。除酶之外，其它合適的標(biāo)記物包括放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(112In)和锝(99mTc)，以及熒光標(biāo)記物，如熒光素和羅丹明，和生物素。
可利用例如免疫吸附試驗(yàn)的已知技術(shù)來檢測(cè)生物或其成分抗體，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步的方面提供了檢測(cè)與CIRD相關(guān)的抗體的免疫吸附試驗(yàn)，該試驗(yàn)包括包被有(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑中的一種或多種的固相；和會(huì)與結(jié)合到該固相的抗體結(jié)合的可測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)物。
優(yōu)選，固相是微量孔。此外優(yōu)選，偶聯(lián)物包含抗-犬抗體抗體。優(yōu)選，偶聯(lián)物包含酶，例如辣根過氧物酶。此外優(yōu)選，免疫吸附試驗(yàn)還包含該酶的底物。本發(fā)明包括含該免疫吸附試驗(yàn)成分的成套試劑盒。這樣，該成套試劑盒就包括固相如微量滴定板，包被該固相的獲自一種生物或多種生物的蛋白，將會(huì)與結(jié)合到固相的抗-生物(或其成分)抗體結(jié)合的可測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)物，如抗-犬抗體。如果可測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)物是酶，那么該成套試劑盒就還包括該酶的底物。該試劑盒還可以包括陽性對(duì)照樣品，它包括與固相基底上的抗原反應(yīng)的已知抗體，以及陰性對(duì)照樣品。
本發(fā)明還包括包被有上面和本發(fā)明第一方面所述的全部三種(a)，(b)和(c)中任意一種或兩種的固相基底。常規(guī)能引發(fā)免疫應(yīng)答的制劑也能與抗體結(jié)合。常規(guī)的制劑是抗原蛋白。通常，取決于抗原的穩(wěn)定性，于4℃-37℃，在微量滴定板上包被蛋白過夜。用洗滌緩沖液，如磷酸緩沖鹽水或Tris緩沖鹽水將非結(jié)合蛋白洗去。通常于37℃，在平板上孵育血清或其它樣品1-數(shù)小時(shí)。洗去非結(jié)合物質(zhì)，于37℃用酶標(biāo)記(如辣根過氧物酶)的抗體，如對(duì)于血清樣品用抗-犬IgG或IgM，對(duì)于肺洗液用IgA孵育平板1-數(shù)小時(shí)。洗去非結(jié)合抗體，用底物如OPD孵育平板約10分鐘，在光度計(jì)下測(cè)量光密度。
優(yōu)選，固相基底是微量孔。
本文提到的所有文獻(xiàn)以其整體全部引入本文供參考。在本說明書中對(duì)現(xiàn)有公布文獻(xiàn)的列舉或者討論并不應(yīng)當(dāng)看成是承認(rèn)所述文獻(xiàn)是現(xiàn)有技術(shù)的一部分，或者是普通的一般知識(shí)。
現(xiàn)在，本發(fā)明將在下述附圖和實(shí)施例的幫助下進(jìn)行更詳細(xì)的描述。


圖1從209只犬舍犬中分離的狗鏈球菌(S.Canis)和馬鏈球菌獸瘟亞種的呼吸道癥狀臨床評(píng)分(n＝各組犬總數(shù))。誤差條代表置信區(qū)間(95％)。
圖2隨著在犬舍的時(shí)間，患CIRD，狗鏈球菌或馬鏈球菌獸瘟亞種的犬的百分?jǐn)?shù)(n＝總共209只犬分在各組的犬總數(shù))。誤差條代表置信區(qū)間(95％)。
圖3隨著CIRD嚴(yán)重度水平增加，氣管和肺感染狗支原體的犬的百分?jǐn)?shù)。
圖4隨著在犬舍的時(shí)間延長(zhǎng)，氣管和肺感染狗支原體的犬的百分?jǐn)?shù)。
圖5從CIRD犬分離的嗜衣原體獲得的23S rRNA基因的218個(gè)核苷酸的部分序列(SEQ ID NO1)(DHB10)。
圖6隨著CIRD嚴(yán)重度水平增加，氣管和肺感染嗜衣原體的犬的百分?jǐn)?shù)。
圖7部分23S rRNA犬序列(DHB)與衣原體和嗜衣原體已知物種(Cabor-C.abortus，Cpsit-C.psittaci，Cfel-C.felis，Ccavi-C.caviae，Cpne-C.pneumoniae，Cpec-C.pecorum，Csuis-C.suis，Ctrac-C.trachomatis，Wad-Waddlia，Sim-Simkania)的23S rRNA進(jìn)行比對(duì)。
圖8從CIRD犬分離的嗜衣原體物種獲得的另外7種分離物，它們的23S rRNA基因中218個(gè)核苷酸的部分序列(SEQ ID NO2-8)(DHB2，4，5，6，7，8和9)。
圖9隨著CIRD嚴(yán)重度水平增加，氣管和肺感染犬皰疹病毒的犬的百分?jǐn)?shù)。
實(shí)施例1馬鏈球菌獸瘟亞種與犬傳染性呼吸道疾病的關(guān)系概述盡管大范圍的使用疫苗，犬傳染性呼吸道疾病(CIRD)仍然是感染許多犬舍犬的多因素傳染病?，F(xiàn)在的疫苗目標(biāo)是保護(hù)防御病毒性制劑和單一細(xì)菌制劑，支氣管炎博德特氏菌。我們研究了鏈球菌物種在CIRD中的作用。對(duì)臨床健康犬和患CIRD犬下呼吸道中鏈球菌的分離和鑒定，可以證明在呼吸道疾病中存在有特定的鏈球菌物種。我們證明了在患地方性CIRD的犬舍犬中，馬鏈球菌獸瘟亞種(S.zooepidemicus)與疾病的嚴(yán)重度增加有關(guān)。
說明CIRD是一種傳染各年齡犬的傳染病，而且當(dāng)大量犬飼養(yǎng)在密封環(huán)境下時(shí)經(jīng)常爆發(fā)。該病發(fā)病率高，早期出現(xiàn)喉炎的干咳癥狀，流鼻涕和/或眼淚，和可變的厭食，并能發(fā)展成氣管支氣管炎，肺炎，甚至更嚴(yán)重的死亡。歷史上認(rèn)為該病是復(fù)雜感染，它組合或相繼用病毒(CPIV和CAV-2)和細(xì)菌制劑攻擊，使得臨床評(píng)分協(xié)同增強(qiáng)(Appel和Binn，1987)。從該病檢出的最常見細(xì)菌制劑是支氣管炎博德特氏菌(McCandlish等，1978)，但其它制劑物種如巴斯德菌屬，支原體菌屬和β-溶血性鏈球菌(βhS)也與該病有關(guān)(McCandlish等，1978；Rosendal，1978；Thrusfield等，1991)。
從病犬和健康犬的上(口和鼻腔)和下呼吸道(氣管和肺)分離細(xì)菌的許多研究都提到了存在βhS(Smith，1967；McCandlish等，1978；McKiernan等，1982；Azetaka和Konishi，1988)。然而，盡管在犬上呼吸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了許多βhS物種，但僅有少數(shù)研究關(guān)注于參與下呼吸道疾病的βhS物種(Garnett等，1982；Angus等，1997)。雖然Biberstein等(1980)注意到了犬呼吸道中的βhS物種，但是該研究忽略了上下呼吸道間的運(yùn)輸差異。另外，即使分離物是獲自獸醫(yī)院患者，但忽略了治療安排原因和與特定臨床條件的任何聯(lián)系。在犬中最流行的βhS，狗鏈球菌，Lancefield G組Streptococcus是一種常見的生殖和呼吸道的黏膜以及皮膚共棲物(Timoney，1987；Quinn等,1999)。已經(jīng)從60-73％的健康犬扁桃腺中分離出了狗鏈球菌(Streptococcus canis)(S.canis)(Smith，1967；Sadatsune和Moreno，1975；Biberstein和Hirsh，1999)。狗鏈球菌在犬中引起各種偶發(fā)和隨機(jī)感染，包括肺炎，敗血病，膿腫，乳腺炎，子宮積膿，直腸炎，中毒性休克綜合癥和壞死性肌膜炎(Biberstein和Hirsh，1999；Quinn等，1999)。
除了狗鏈球菌之外，還從犬中分離出了其它Lancefield組，如A，C和E組狗鏈球菌βhS。(Biberstein等，1980)。發(fā)現(xiàn)馬鏈球菌獸瘟亞種，LancefieldC組，是哺乳動(dòng)物上呼吸道黏膜的共棲物(Timoney等，1988；Quinn等，1999)。它與許多中疾病綜合癥有關(guān)，包括下呼吸道疾病，駒肺炎和馬的子宮頸炎(Chanter，1997；Biberstein和Hirsh，1999)，駱駝肺炎(Biberstein和Hirsh，1999)，豬敗血癥和關(guān)節(jié)炎(Timoney，1987)，母牛和山羊乳腺炎(Timoney等，1988)，家禽敗血癥，羔羊心包炎和肺炎(Timoney，1987)，豚鼠淋巴腺炎(Quinn等，1999)和人血管球性腎炎(Balter等，2000)。在犬中，馬鏈球菌獸瘟亞種與傷口傳染病有關(guān)，敗血病(Quinn等，1999)和急性壞死性出血性肺炎(Garnett等，1982)。在此項(xiàng)研究中，我們想要確定哪種βhS都在健康犬和患CIRD犬的呼吸道中存在。
材料和方法研究群體和取樣主要研究群體(n＝209，支氣管肺泡灌洗液，BAL)包括來自有地方性CIRD歷史的已確認(rèn)救助舍動(dòng)物(～600只犬)。一旦進(jìn)入犬舍，所有犬都要接種KAVAK DA2PiP69(Forr Dodge)，一種用于瘟病毒，CAV-2，CPIV和犬細(xì)小病毒的減毒活疫苗，和抵抗鉤端螺旋體病的KAVAKL。已經(jīng)證實(shí)在該中心患CIRD犬中存在犬冠狀病毒(CRCV)和支氣管炎博德特氏菌(Chalker等，2003；Erles等，2003)。由于福利原因，該犬舍每周都要獻(xiàn)出一些犬，從這些犬中任意選取2-3只作為樣本。通過以下方法，從1999-2001兩年間，總數(shù)209只犬個(gè)體中取集BAL樣品。在2小時(shí)安樂死內(nèi)，在分叉處上方夾住氣管，避免取樣過程中的任何肺氣管污染物。然后，用無菌導(dǎo)管將50ml HanksBalanced Salt solution放入肺葉頂部。然后用手按摩此肺葉30秒，回收BAL。在安樂死時(shí)，還將犬的臨床呼吸道評(píng)分嚴(yán)重度歸為下述等級(jí)(1)無呼吸道癥狀，n＝71(2)中度咳嗽，n＝37(3)咳嗽和流鼻涕，n＝76(4)咳嗽、流鼻涕和精神抑郁和/或食欲不振，n＝9(5)膿性支氣管肺炎，n＝16。
在BAL取樣后，從右肺葉末梢取肺組織切片，進(jìn)行組織分析。將用福爾馬林固定的(10％福爾馬林鹽水)組織塊嵌入石蠟內(nèi)，在光學(xué)顯微鏡(X40，X100，X400)下觀察標(biāo)準(zhǔn)蘇木素伊紅染色切片。對(duì)存在或缺少肺泡內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)行記錄。
記錄下每只犬在犬舍中所呆的總天數(shù)，然后以周計(jì)算在犬舍的時(shí)間。記下每只動(dòng)物進(jìn)入犬舍時(shí)的年齡和臨床情況，而且基于營(yíng)養(yǎng)狀況，皮毛，舉止，胃口和常規(guī)臨床檢查(溫度，脈搏數(shù)，呼吸數(shù))的臨床情況混和評(píng)分分為以下等級(jí)良好(1)，劣(2)，極劣(3)。
將另一犬群作為對(duì)照組，對(duì)照組由在RVC下參照診斷細(xì)菌學(xué)，于1998-2000兩年間有臨床呼吸癥狀的家養(yǎng)寵物犬組成(n＝71，BAL)。用Cocoran(1998)所述的內(nèi)鏡操縱技術(shù)從對(duì)照組采集樣品。將研究的全部樣品保存于4℃，直到細(xì)菌學(xué)上的檢測(cè)，除了在冷凍的BAL上進(jìn)行CFU/ml計(jì)算之外，在取樣24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
細(xì)菌分離和鑒定將50μl體積的BAL一式兩份鋪在含5％無菌羊血的哥倫比亞血瓊脂(Oxoid Ltd.，Hampshire，UK)平板上，于37℃有氧和厭氧孵育24小時(shí)。鑒定β-溶血性菌落，并純化單菌落。通過菌落和細(xì)胞形態(tài)將革蘭氏陽性過氧化氫酶陰性菌鑒定為鏈球菌，通過乳膠珠玻片凝集(Oxoid Ltd.，Hampshire，UK)鑒定血清群為L(zhǎng)ancefield組。然后用API20STREP手工鑒定試劑盒(bioMérieux UK Ltd.，Basingstoke，UK)通過生物化學(xué)應(yīng)用和酶反應(yīng)鑒定分離物的物種水平。
為了鑒定混和感染，用乳膠珠玻片凝集和API20STREP對(duì)來自研究的最初12只犬的3種菌落進(jìn)行檢測(cè)。將用磷酸緩沖鹽水(Sigma-Aldrich Co.Ltd.，Dorset，UK)連續(xù)稀釋的BAL鋪板三份，如上所述進(jìn)行孵育，計(jì)算CFU/mlBAL。βhS的生長(zhǎng)分為以下等級(jí)無(0)，＜100CFU/ml(1)，100-1000CFU/ml(2)，和＞1000CFU/ml(3)。
統(tǒng)計(jì)分析將所有分析的I型誤差(α)顯著性水平或可能性假定為0.05。用Prism(version 3.0，GraphPad Software Inc，San Diego，USA)統(tǒng)計(jì)分析軟件x2測(cè)驗(yàn)對(duì)進(jìn)入犬舍時(shí)的馬鏈球菌獸瘟亞種存在，年齡，臨床情況，犬舍內(nèi)周數(shù)，肺泡內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞和臨床呼吸評(píng)分進(jìn)行分析。細(xì)菌生長(zhǎng)和呼吸評(píng)分的關(guān)系使用各呼吸評(píng)分和馬鏈球菌獸瘟亞種生長(zhǎng)的組合平均得分，用Prism oneway ANOVA(非參數(shù)的)測(cè)驗(yàn)進(jìn)行分析來確定。還隨時(shí)間周數(shù)，計(jì)算取樣的犬舍犬內(nèi)狗鏈球菌，馬鏈球菌獸瘟亞種和呼吸道疾病的存在。
結(jié)果β-溶血性鏈球菌分離自兩個(gè)研究群體，而且從家養(yǎng)寵物BAL分離同犬舍犬有明顯地不同(1.4％家養(yǎng)，23.9％犬舍，x2分析***p＝0.000)。發(fā)現(xiàn)所有hS分離物都是狗鏈球菌或馬鏈球菌獸瘟亞種。未發(fā)現(xiàn)不同Lancefield組或物種的混和感染，而且所有獨(dú)立平板都產(chǎn)生了形態(tài)一致的菌落。狗鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種都分離自犬舍犬，但從家養(yǎng)寵物中只分離到了唯一的馬鏈球菌獸瘟亞種，而沒有狗鏈球菌。發(fā)現(xiàn)在犬舍犬中馬鏈球菌獸瘟亞種是主要的hS物種(92.0％)。對(duì)臨床呼吸評(píng)分各等級(jí)內(nèi)(圖1)的犬舍犬進(jìn)行狗鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種的攜帶情況檢測(cè)。在有和無臨床評(píng)分的犬內(nèi)都存在狗鏈球菌，分離物并不會(huì)使疾病嚴(yán)重性加劇。相反，相比于患病動(dòng)物，健康犬更不可能在下呼吸道內(nèi)含有馬鏈球菌獸瘟亞種(x2分析，**p＝0.004)，隨著臨床呼吸評(píng)分增加，馬鏈球菌獸瘟亞種分離物顯著地增加，從無癥狀犬內(nèi)的9.7％到膿性支氣管肺炎犬內(nèi)的87.5％(x2分析，***p＝0.000)。呼吸道評(píng)分更高的犬比臨床健康犬也更可能平均馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)菌生長(zhǎng)評(píng)分更高(one way ANOVA分析***p＝0.000.R squared＝0.194，F(xiàn)＝22.265)。進(jìn)入犬舍時(shí)的動(dòng)物年齡和臨床情況對(duì)分離馬鏈球菌獸瘟亞種沒有影響(x2分析，年齡p＝0.341，進(jìn)入時(shí)的臨床情況p＝0.295)。
犬舍內(nèi)患CIRD犬的百分?jǐn)?shù)從第一周的21.1％顯著增加到第二周的70.1％，直到第四周CIRD數(shù)也沒有減少(圖2)。雖然未檢測(cè)到明顯差異，肺內(nèi)有馬鏈球菌獸瘟亞種的犬?dāng)?shù)增加了20.6％，在犬舍第一周的16.7％到第三周的34.4％(圖2)，但是對(duì)狗鏈球菌就沒有此趨勢(shì)。
組織學(xué)分析揭示含馬鏈球菌獸瘟亞種的犬相比不含馬鏈球菌獸瘟亞種的犬更有可能含肺泡內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞(x2分析，**p＝0.006)。細(xì)菌評(píng)分更高的犬經(jīng)常會(huì)得中度到明顯巨噬細(xì)胞凝集的急性的膿性或壞死性肺炎，與Garnett等(1982)所發(fā)現(xiàn)的相似，含馬鏈球菌獸瘟亞種的犬會(huì)引發(fā)出血性鏈球菌肺炎(HSP)。在H和E染色的切片內(nèi)未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞。
討論在本研究中，我們關(guān)注于存在于患和未患呼吸道疾病的家養(yǎng)和犬舍犬下呼吸道的βhS物種。雖然，狗鏈球菌是犬呼吸道內(nèi)的主要βhS(Biberstein等，1980)，而且在本研究中從某些犬舍犬的下呼吸道內(nèi)分離得到該菌，但是它并不與犬舍犬的CIRD有關(guān)系。相反，馬鏈球菌獸瘟亞種分離物增加與CIRD嚴(yán)重度增加有關(guān)。相比于犬舍中的更健康動(dòng)物，有任何呼吸道癥狀的犬在下呼吸道內(nèi)更可能含有馬鏈球菌獸瘟亞種，在家養(yǎng)寵物中的馬鏈球菌獸瘟亞種比例比犬舍犬中的低。
先前，已經(jīng)報(bào)道馬鏈球菌獸瘟亞種與犬內(nèi)的HSP有關(guān)(Garnett等，1982)。HSP綜合癥是在小獵犬親密群體內(nèi)的一種重癥傳染病，該病相繼發(fā)生突然死亡而沒有任何臨床先兆。驗(yàn)尸發(fā)現(xiàn)在氣管和支氣管樹內(nèi)存在大量的出血性分泌物，肺擴(kuò)散為深紅色。此外，在其它組織范圍內(nèi)還出現(xiàn)斑狀出血。在犬內(nèi)通過導(dǎo)管內(nèi)接種馬鏈球菌獸瘟亞種而使該病再生。有意思的是，在此項(xiàng)研究中，相比于那些低生長(zhǎng)評(píng)分的犬，有更高馬鏈球菌獸瘟亞種生長(zhǎng)評(píng)分的犬更有可能會(huì)有肺泡內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞，并且分享Garnett等(1982)所述的HSP內(nèi)肺組織學(xué)特征。
歷史上認(rèn)為CIRD是復(fù)雜疾病，包括細(xì)菌和病毒制劑。事實(shí)上，許多其它制劑都在此犬的犬舍群體中描述過了，包括CRCV(Erles等，2003)和支氣管炎博德特氏菌(Chalker等，2003)。雖然并不清楚CRCV的病原潛力，但是Erles等(2003)提供的數(shù)據(jù)顯示CRCV在那些有輕微呼吸道疾病的犬(評(píng)分2)中占優(yōu)勢(shì)，相似地，Chalker等(2003)發(fā)現(xiàn)有支氣管炎博德特氏菌的犬在中度疾病的犬(評(píng)分3)中占優(yōu)勢(shì)。
我們發(fā)現(xiàn)，馬鏈球菌獸瘟亞種更常與更重CIRD病例(評(píng)分4-5)相關(guān)，這說明它可能作為次生侵入菌。事實(shí)上，以前已經(jīng)將βhS物種描述為CIRD“復(fù)合病”中的次生侵入菌(McCandlish等，1978)。但是，仍然不清楚馬鏈球菌獸瘟亞種是否在這些動(dòng)物的呼吸道疾病中起主要作用，或者僅僅是侵入呼吸道，而隨后被其它病原體破壞。流行病學(xué)上的證據(jù)表明在馬中，馬鏈球菌獸瘟亞種可能是呼吸道疾病的主要病原體(Wood等，1993；Chanter，1997)，但是通常認(rèn)為它是條件性病原體(Walker和Timoney 1998；Anzai等，2000)。即使馬鏈球菌獸瘟亞種不是導(dǎo)致這些犬CIRD的主要原因，從膿化支氣管肺炎犬的高分離率(87.5％)還是支持下述假說，認(rèn)為馬鏈球菌獸瘟亞種是造成在此犬舍內(nèi)所見的更重臨床癥狀的原因。從患呼吸道疾病的家養(yǎng)寵物的低分離率(1.4％)說明此制劑并不是常見的呼吸道傳染源，而很可能是針對(duì)此犬舍的特殊問題。雖然并未考慮過任何在先的放入犬舍，但本研究中的某些家養(yǎng)寵物犬很可能曾經(jīng)放入過犬舍。還未確定馬鏈球菌獸瘟亞種在犬舍犬內(nèi)CIRD其它病例中所起的作用。
隨著在犬舍的時(shí)間，而從這些犬分離的馬鏈球菌獸瘟亞種增加說明這些犬的肺在漸漸被這些細(xì)菌感染。所述感染也可能由上呼吸道的亞臨床感染或者單一病原菌菌株引起。用于可變M-類SzP蛋白基因的PCR分型系統(tǒng)能將馬鏈球菌獸瘟亞種的15種已知血清型分為5個(gè)不同組，HV1-5(Walker和Timoney，1998)。Anzai等，(2000)用該分型系統(tǒng)進(jìn)行分析，在患肺炎的馬肺內(nèi)發(fā)現(xiàn)馬鏈球菌獸瘟亞種的單克隆變體，并在健康馬的扁桃腺內(nèi)發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)類型。若感興趣的話，對(duì)參與此CIRD爆發(fā)的馬鏈球菌獸瘟亞種分離物進(jìn)行亞型分析，確定單克隆變體是否存在于患病群體內(nèi)，并檢查其關(guān)系，若有的話，犬馬鏈球菌獸瘟亞種分離物就不得不是導(dǎo)致馬和其它動(dòng)物內(nèi)呼吸道疾病的那些物種。與肺炎有關(guān)的馬鏈球菌獸瘟亞種在各年齡和急性出血性肺炎馬內(nèi)，以及被運(yùn)輸壓迫的年長(zhǎng)馬內(nèi)出現(xiàn)(Anzai等，2000)。在此次CIRD爆發(fā)中，年輕犬和在進(jìn)入犬舍時(shí)臨床情況差的犬與年長(zhǎng)犬和進(jìn)入時(shí)健康的犬一樣，都易受馬鏈球菌獸瘟亞種感染。
在此犬舍內(nèi)，感染范圍內(nèi)采用抗生素療法，而且除了重癥支氣管肺炎病例外，不對(duì)患CIRD犬進(jìn)行常規(guī)治療。治療很可能會(huì)影響此研究中所提到的細(xì)菌譜。但是，對(duì)自然爆發(fā)的呼吸道疾病進(jìn)行研究，能夠提供其它手段所不能獲得的有價(jià)值信息。
已知CIRD是包括多種制劑的多因素疾病，所述制劑包括CAV-2，CPIV，支氣管炎博德特氏菌和支原體菌屬。在大量各地犬聚集到一起并飼養(yǎng)的犬舍內(nèi)存在有許多病原體，而且疾病嚴(yán)重程度就可以作為反應(yīng)。
實(shí)施例2狗支原體與犬傳染性呼吸道疾病的關(guān)系研究生物培養(yǎng)物內(nèi)狗支原體的存在，并用PCR分析加以鑒定。在184只犬舍犬的調(diào)查中，我們發(fā)現(xiàn)在氣管或肺內(nèi)含狗支原體的犬的百分?jǐn)?shù)隨著呼吸道疾病癥狀而增加，從健康犬的10％到病犬的31％(圖3)。
我們還注意到隨著在犬舍的時(shí)間，呼吸道疾病增加，第一周，在犬舍犬氣管內(nèi)沒有可檢測(cè)的狗支原體，而第二周，184只犬中有24％氣管內(nèi)狗支原體呈陽性一說明24％的犬感染了該細(xì)菌。肺菌落定居(colonisation)中也觀察到更小但相似的增長(zhǎng)(從15％到23％)(參見圖4)。
實(shí)施例3嗜衣原體與犬傳染性呼吸道疾病的關(guān)系我們通過PCR分析對(duì)210只犬的嗜衣原體存在進(jìn)行了測(cè)定。
用下述PCR，從嗜衣原體擴(kuò)增出23S rRNA基因的218bp片段。反應(yīng)條件，95℃ 5分鐘(x1個(gè)循環(huán))，95℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 1分鐘(x40個(gè)循環(huán))和72℃5分鐘?？偭?0μl的PCR反應(yīng)混合物包括5.0μl 10x無鎂緩沖液(Promega)，1.5mM MgCl2(Promega)，0.5μl(0.5單位)Taq DNA聚合酶(Promega)，0.2mM PCR核苷酸混合物(Promega)，0.025μg上游引物Cl(5’-GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAG GA-3’，SEQ ID NO9)和下游引物C2(5’-TGGCTCATCATGCAAAAGGCA-3’，SEQ ID NO10)，40μl水和2μl樣品組織DNA。
通過序列分析并利用Fasta分析對(duì)PCR產(chǎn)物與GenBank的可得序列進(jìn)行比較，確定從8只犬獲得的PCR產(chǎn)物是嗜衣原體。一個(gè)所述序列的23SrRNA基因的部分序列(DHBC10)示于圖5(SEQ ID NO1)。此218bp序列與流產(chǎn)嗜衣原體的相同區(qū)域有99.08％同一性，與鸚鵡熱嗜衣原體有98.6％同一性，與貓嗜衣原體有96.3％同一性，而且大多數(shù)序列簇在初步的親緣分析上(用Megalign的clustal法)位于明顯的進(jìn)化枝內(nèi)(圖7)。7種其它嗜衣原體分離物的23S rRNA部分序列示于圖(SEQ ID NOs2-8)。
在此項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)隨著氣管和肺內(nèi)的呼吸道疾病嚴(yán)重度的增加，檢測(cè)的嗜衣原體也增加。在氣管樣品中發(fā)現(xiàn)了10％的微小檢測(cè)增加(從25％到34％)。在肺內(nèi)嗜衣原體檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)了更鮮明的差異，從健康犬中的0％增加到患CIRD犬中的37.5％(圖6)。另外，在PCR檢測(cè)的嗜衣原體陽性犬總數(shù)中，從健康犬中的25％增加到患重癥疾病犬的50％(圖6)。
實(shí)施例4犬皰疹病毒與犬傳染性呼吸道疾病的關(guān)系我們發(fā)現(xiàn)，在呼吸道癥狀更重的犬內(nèi)犬皰疹病毒的流行增加(圖9)。在對(duì)抗體應(yīng)答CHV進(jìn)行整整一年的監(jiān)測(cè)時(shí)，時(shí)常爆發(fā)呼吸道疾病的犬舍內(nèi)犬比無爆發(fā)的對(duì)照犬舍內(nèi)犬(8.3％)血清轉(zhuǎn)化為CHV更頻繁(58.3％)。
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權(quán)利要求
1.一種用于免疫接種犬的疫苗組合物，包含任意一種或多種下述制劑(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種(S.zooepidemicus)的免疫應(yīng)答的制劑；(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體(M.cynos)的免疫應(yīng)答的制劑；和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑。
2.權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑包含滅活或減毒的馬鏈球菌獸瘟亞種，或馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫原性片段或其衍生物，或編碼所述片段或所述衍生物的核酸。
3.權(quán)利要求1或2所述的疫苗組合物，其中能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑包含滅活或減毒的狗支原體，或狗支原體的免疫原性片段或其衍生物，或編碼所述片段或所述衍生物的核酸。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其中能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑包含滅活或減毒的流產(chǎn)嗜衣原體，或流產(chǎn)嗜衣原體的免疫原性片段或其衍生物，或編碼所述片段或所述衍生物的核酸。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其中能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑包含滅活或減毒的鸚鵡熱嗜衣原體，或鸚鵡熱嗜衣原體的免疫原性片段或其衍生物，或編碼所述片段或所述衍生物的核酸。
6.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其中能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑包含滅活或減毒的貓嗜衣原體，或貓嗜衣原體的免疫原性片段或其衍生物，或編碼所述片段或所述衍生物的核酸。
7.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其中能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑包含滅活或減毒的鼠嗜衣原體、貓心嗜衣原體、肺炎嗜衣原體、豬嗜衣原體或砂眼嗜衣原體，或其免疫原性片段，或其衍生物，或編碼所述片段或所述衍生物的核酸。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物和藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或佐劑。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物，進(jìn)一步包含任意一種或多種下述制劑(d)能引發(fā)犬抵抗犬呼吸道冠狀病毒(CRCV)的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗犬副流感病毒(CPIV)的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗2型犬腺病毒(CAV-2)的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗犬皰疹病毒(CHV)的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)的免疫應(yīng)答的制劑。
10.權(quán)利要求9所述的疫苗組合物，其中能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑包含滅活或減毒的CRCV，或其免疫原性片段，或編碼所述免疫原性片段的核酸。
11.權(quán)利要求10所述的疫苗組合物，其中CRCV的免疫原性片段包含刺突蛋白或血凝素-酯酶(HE)蛋白，或刺突蛋白或HE蛋白的免疫原性部分。
12.權(quán)利要求9-11所述的疫苗組合物，其中能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑包含滅活或減毒的CPIV，或其免疫原性片段，或編碼所述免疫原性片段的核酸。
13.權(quán)利要求9-12所述的疫苗組合物，其中能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑包含滅活或減毒的CAV-2，或其免疫原性片段，或編碼所述免疫原性片段的核酸。
14.權(quán)利要求9-13所述的疫苗組合物，其中能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑包含滅活或減毒的CHV，或其免疫原性片段，或編碼所述免疫原性片段的核酸。
15.權(quán)利要求9-14所述的疫苗組合物，其中能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑包含滅活或減毒的支氣管炎博德特氏菌，或其免疫原性片段，或編碼所述免疫原性片段的核酸。
16.一種免疫接種犬抵抗犬傳染性呼吸道疾病(CIRD)的方法，包含對(duì)犬施用權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的疫苗組合物。
17.一種治療犬的CIRD的方法，包含對(duì)犬施用權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的疫苗組合物。
18.一種刺激犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體和嗜衣原體中任意一種或多種微生物的免疫應(yīng)答的方法，該方法包含分別對(duì)犬施用一種或多種(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑。
19.權(quán)利要求18所述的方法，進(jìn)一步包含對(duì)犬施用任意一種或多種下述制劑(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
20.任意一種或多種下述制劑制備預(yù)防或治療犬CIRD的藥物的用途(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑。
21.任意一種或多種下述制劑制備刺激犬免疫應(yīng)答的藥物的用途(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑，所述免疫應(yīng)答是指，抵抗相應(yīng)的馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體和嗜衣原體中任意一種或多種微生物的免疫應(yīng)答。
22.權(quán)利要求20或21所述的用途，其中所述藥物進(jìn)一步包含任意一種或多種下述制劑(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
23.一種用于醫(yī)學(xué)的組合物，其包含任意一種或多種下述制劑(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑。
24.權(quán)利要求23所述的組合物，是用于獸醫(yī)學(xué)的組合物。
25.權(quán)利要求24所述的組合物，是用于犬獸醫(yī)學(xué)的組合物。
26.權(quán)利要求23-25中任一項(xiàng)所述的組合物，進(jìn)一步包含任意一種或多種下述制劑(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
27.一種疫苗組合物成套試劑盒，包含任意一種或多種下述制劑(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑和任選地藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或佐劑。
28.權(quán)利要求27所述的試劑盒，進(jìn)一步包含任意一種或多種下述制劑(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
29.一種制備特異性抗體的方法，所述抗體特異性結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體或嗜衣原體中任意一種或多種微生物，該方法包含引發(fā)動(dòng)物對(duì)馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體或嗜衣原體中相應(yīng)的任意一種或多種微生物或其免疫原性片段的免疫應(yīng)答，并從所述動(dòng)物或其衍生的無限增殖細(xì)胞來制備抗體。
30.一種獲得特異性抗體的方法，所述抗體特異性結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體或嗜衣原體中的任意一種或多種微生物，該方法包括，利用馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體或嗜衣原體中相應(yīng)的任意一種或多種微生物或其免疫原性片段，從抗體展示庫(kù)中選出抗體。
31.抗體，其特異性結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體或嗜衣原體。
32.一種被動(dòng)免疫犬使其抵抗CIRD的方法，包含給所述犬施用一種或多種特異地結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體和嗜衣原體中相應(yīng)的一種或多種微生物的抗體。
33.一種治療犬CIRD的方法，包含對(duì)所述犬施用一種或多種特異地結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體和嗜衣原體中相應(yīng)的一種或多種微生物的抗體。
34.權(quán)利要求32或33所述的方法，其進(jìn)一步包含對(duì)所述犬施用特異地結(jié)合CRCV，CPIV，CAV-2，CHV和支氣管炎博德特氏菌中的任意一種或多種微生物的抗體。
35.抗體用于制備藥物的用途，所述抗體特異地結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體和嗜衣原體中任意一種或多種微生物，所述藥物是用于對(duì)犬實(shí)施被動(dòng)免疫使其抵抗CIRD的藥物。
36.抗體用于制備治療犬CIRD的藥物的用途，所述抗體特異地結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種、狗支原體和嗜衣原體中相應(yīng)的一種或多種微生物。
37.權(quán)利要求35或36所述的用途，其中所述藥物進(jìn)一步包含特異地結(jié)合CRCV，CPIV，CAV-2，CHV和支氣管炎博德特氏菌中任意一種或多種微生物的抗體。
38.一種組合物，其包含任意兩種或多種以下抗體特異地結(jié)合馬鏈球菌獸瘟亞種的抗體，特異地結(jié)合狗支原體的抗體，和特異地結(jié)合嗜衣原體的抗體。
39.權(quán)利要求38所述的組合物，進(jìn)一步包含特異地結(jié)合CRCV，CPIV，CAV-2，CHV和支氣管炎博德特氏菌中任意一種或多種微生物的抗體。
40.一種疫苗組合物，包含(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(d)能引發(fā)犬抵抗CRCV的免疫應(yīng)答的制劑。
41.權(quán)利要求40所述的疫苗組合物，進(jìn)一步包括任意一種或多種下述制劑(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑；(e)能引發(fā)犬抵抗CPIV的免疫應(yīng)答的制劑；(f)能引發(fā)犬抵抗CAV-2的免疫應(yīng)答的制劑；(g)能引發(fā)犬抵抗CHV的免疫應(yīng)答的制劑；和(h)能引發(fā)犬抵抗支氣管炎博德特氏菌的免疫應(yīng)答的制劑。
42.權(quán)利要求40或41所述的疫苗組合物，進(jìn)一步包含(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑。
43.一種確定犬是否接觸過與CIRD相關(guān)的嗜衣原體物種的方法，該方法包括(a)獲得來自犬的合適的樣品；和(b)鑒定該樣品中與CIRD相關(guān)的嗜衣原體物種，或其抗體。
44.權(quán)利要求43所述的方法，其中與CIRD相關(guān)的嗜衣原體物種具有23SrRNA，且該RNA含有SEQ ID Nos1-8以RNA顯示時(shí)的任一序列。
45.一種確定犬是否患有或易染CIRD的方法，該方法包括(a)獲得來自犬的合適的樣品；和(b)鑒定該樣品中的微生物或其任何抗體，所述微生物是指馬鏈球菌獸瘟亞種或狗支原體或嗜衣原體中的任意一種或多種微生物。
46.權(quán)利要求45所述的方法，其中馬鏈球菌獸瘟亞種或狗支原體或嗜衣原體是利用抗體鑒定的。
47.權(quán)利要求45所述的方法，其中馬鏈球菌獸瘟亞種或狗支原體或嗜衣原體是利用核酸鑒定的。
48.權(quán)利要求45所述的方法，其中抗-馬鏈球菌獸瘟亞種抗體是利用馬鏈球菌獸瘟亞種或其抗原性部分進(jìn)行檢測(cè)的。
49.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述抗-狗支原體抗體是利用狗支原體或其抗原性部分進(jìn)行檢測(cè)的。
50.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述抗-嗜衣原體抗體是利用嗜衣原體或其抗原性部分進(jìn)行檢測(cè)的。
51.權(quán)利要求43-49任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品是含有抗體的樣品，如血清、唾液、氣管洗液或支氣管肺泡灌洗液。
52.一種檢測(cè)與CIRD相關(guān)的抗體的免疫吸附試驗(yàn)，該試驗(yàn)包含固相，其包被有一種或多種以下制劑(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑；(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑；和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑；和可檢測(cè)的標(biāo)記偶聯(lián)物，其與結(jié)合到該固相的抗體結(jié)合。
53.權(quán)利要求52所述的免疫吸附試驗(yàn)，其中所述固相包括(a)，(b)和(c)中的任意兩種或全部三種。
54.一種固相基底，其包被有權(quán)利要求52所述(a)，(b)和(c)中的任意一種或兩種或全部三種制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于免疫接種犬的疫苗組合物，其包含下述任意一種或多種制劑(a)能引發(fā)犬抵抗馬鏈球菌獸瘟亞種的免疫應(yīng)答的制劑，(b)能引發(fā)犬抵抗狗支原體的免疫應(yīng)答的制劑，和(c)能引發(fā)犬抵抗嗜衣原體的免疫應(yīng)答的制劑。
文檔編號(hào)A61K39/295GK1845754SQ200480025001
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2004年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月1日
發(fā)明者約翰·布朗利, 維托里亞·J·喬克, 克斯廷·厄爾斯 申請(qǐng)人:皇家獸醫(yī)學(xué)院