專利名稱：含有佐劑的功能性重建病毒膜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)如來自病原體或腫瘤細(xì)胞的膜蛋白這樣的抗原的疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生具有膜融合活性的重建病毒膜的方法和包含該重建病毒膜的藥物組合物，所述重建病毒膜是含有病毒的天然脂質(zhì)、兩親性抗原以及兩親性佐劑的脂雙層。
背景技術(shù)：
典型地，抗有包膜病毒的疫苗含有滅活病毒或減毒活病毒，或者含有上述病毒組分的制劑(例如，裂解病毒或亞單位制劑)。對(duì)于接種疫苗而言，這些制劑通常被注射。注射后，存在于所述疫苗中的病毒或蛋白被免疫系統(tǒng)的抗原呈遞細(xì)胞例如樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞攝取，隨后將所述疫苗的抗原部分呈遞給免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞。由于皮膚下的抗原呈遞細(xì)胞最為豐富，因此疫苗在注射時(shí)是有效的。然而，目前已經(jīng)清楚類似的細(xì)胞也存在于例如鼻粘膜中(Ogra等，2001)。為了誘導(dǎo)存在于粘膜中的這些吞噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，需要比皮膚下存在的那些細(xì)胞所需刺激更強(qiáng)的刺激(Janeway等，2001)。
雖然注射某些含于疫苗中的病毒或蛋白例如流感或麻疹病毒誘發(fā)了足以抵御由同一病毒導(dǎo)致的后期感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答，然而對(duì)于很多其它病毒例如呼吸道合胞病毒則不是這樣。已經(jīng)對(duì)通過物理或化學(xué)的方式來加強(qiáng)免疫應(yīng)答進(jìn)行了大量的嘗試。從這種試驗(yàn)中所呈現(xiàn)出的最重要的原則是(1)對(duì)于物理刺激，多拷貝的病毒蛋白需要組合成顆粒。這些顆粒可以是完整的病毒、重建病毒膜或微粒載體上的蛋白。顆粒對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激優(yōu)于單個(gè)亞單位(Ogra等，2001；Janeway等，2001)。(2)另一方面，化學(xué)刺激需要免疫系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞通過存在于抗原呈遞細(xì)胞表面的受體，例如通過這些受體所識(shí)別的佐劑、化合物的使用接受某些信號(hào)。
由于病毒蛋白具有足夠的附加理化刺激，即使在應(yīng)用于粘膜例如用于鼻粘膜時(shí)它也可誘發(fā)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答(Ogra等，2001)。目前通過這樣的方式(通過化學(xué)和/或物理的方式)用于刺激免疫應(yīng)答的絕大多數(shù)方法和組合物均存在顯著的缺點(diǎn)，這將被概述于下。
現(xiàn)有技術(shù)中開發(fā)出的一種特殊種類的疫苗組合物被稱為“病毒體”，其為含有病毒糖蛋白的脂雙層。病毒體可含有重建病毒膜，其通常通過用去污劑從有包膜病毒提取膜蛋白和脂質(zhì)，然后添加脂質(zhì)，并除去從所提取的病毒膜蛋白和脂質(zhì)中除去所述去污劑而制備，從而形成具有從其突出的蛋白的特征性脂雙層(Stegmann等，1987)。病毒體也可包括由純化的病毒蛋白和合成脂質(zhì)或天然脂質(zhì)，或其它可能形成雙層的物質(zhì)所形成的膜。病毒體的特征是其精確地模擬了天然病毒包膜的組成、表面構(gòu)造和功能活性。所述病毒體的一個(gè)尤其重要的特征涉及天然病毒包膜的受體結(jié)合和膜融合活性的保留，這使得病毒體能夠進(jìn)入病毒可進(jìn)入的相同細(xì)胞，并可通過這些相同的細(xì)胞呈遞給免疫系統(tǒng)。受體結(jié)合和膜融合活性的保留對(duì)于所述病毒體的全部免疫原性特征的表達(dá)是必需的(Arkema 2000；Bungener 2002)。
對(duì)于某些病毒抗原而言，即使當(dāng)例如鼻內(nèi)輸送疫苗時(shí)，病毒體仍誘發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答可以是強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答(如WO 88/08718和WO 92/19267中所述)。然而，與滅活病毒或亞單位制劑相比，其它病毒體制劑僅展現(xiàn)出略微增強(qiáng)的免疫原性(如在Glück等1994中所述)。在這一所引用的實(shí)例中，病毒體通過包括添加外源脂質(zhì)的方法產(chǎn)生，申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這導(dǎo)致了與天然病毒包膜不同的病毒體組成和表面構(gòu)造。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這樣的不同的表面構(gòu)造可能影響所制備的病毒體的膜融合特性并從而影響其免疫原性。
為了增強(qiáng)免疫應(yīng)答，允許經(jīng)鼻內(nèi)施用該疫苗，將來自大腸桿菌(Escherichia coli)的佐劑蛋白(熱不穩(wěn)定毒素)與添加了脂質(zhì)的病毒體流感疫苗(EP0538437)混合。臨床試驗(yàn)顯示添加毒素是誘導(dǎo)與被注射的疫苗等效的血清抗體效價(jià)絕對(duì)必需的(Gliick等1994)。雖然添加毒素確實(shí)由此增強(qiáng)了該疫苗的免疫原性，但其也誘發(fā)了一系列的副作用，通稱貝耳氏麻痹，一種面肌的暫時(shí)性麻痹。由于毒素的輔助效應(yīng)歸因于抗原呈遞細(xì)胞對(duì)毒素的識(shí)別，在這種情況下毒素和病毒蛋白并非將必然接觸相同的細(xì)胞，因此為了確保激活每個(gè)細(xì)胞，增加抗原被激活細(xì)胞識(shí)別的機(jī)會(huì)將需要相對(duì)高濃度的毒素。因此，添加了脂質(zhì)的該類病毒體制劑有相當(dāng)多的缺點(diǎn)。
病毒體也已通過與胞壁酰二肽衍生物混合的純化的流感抗原進(jìn)行制備(EP 0205098和EP 0487909)。在該情況下，胞壁酰二肽衍生物形成膜。盡管胞壁酰二肽是一種佐劑，且該制劑被發(fā)現(xiàn)確實(shí)增強(qiáng)了對(duì)流感抗原的免疫應(yīng)答，胞壁酰二肽是熱原性的(Kotani等，1976；Dinarello等，1978)，在注射后被迅速地清除出體內(nèi)，且其具有局部毒性，可導(dǎo)致肉芽腫和炎癥(Ribi等，1979；Kohashi等，1980)。而且，它們?cè)谥行詐H值時(shí)的儲(chǔ)存壽命有限(Powell等，1988)，維持其結(jié)構(gòu)完整性的最佳pH值太低以至于不能使其與通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞的病毒的融合蛋白例如流感病毒的血凝素一起配制疫苗。而且，這樣的合成膜不能很好地模擬天然病毒膜，因此對(duì)它們的免疫應(yīng)答將與抗該病毒所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不同。
或者，本領(lǐng)域技術(shù)人員也已制備了與重建病毒膜不同的復(fù)合抗原，例如“免疫刺激復(fù)合物”(ISCOM，Morein等，1984)，其含有與佐劑例如皂苷象Quil A相復(fù)合的病毒蛋白(EP0231039B1；EP0109942A1；EP0180564A1)，其中絕大多數(shù)分離自Quillaia sopanaria Molina的莖皮。通過與抗原和脂質(zhì)例如膽固醇混合，這些佐劑形成30-40nm的籠狀結(jié)構(gòu)使得抗原顆?；?，且同時(shí)起佐劑的作用。盡管ISCOM已用于眾多獸醫(yī)疫苗中，且增強(qiáng)了病毒膜蛋白的免疫原性，其毒性和混合物的復(fù)雜性仍限制了開發(fā)用于人的這類疫苗(Cox等，1998)。
最近，開發(fā)出了蛋白體流感疫苗(美國專利申請(qǐng)20010053368)，其由抗原蛋白例如流感血凝素或人免疫缺陷包膜糖蛋白與純化的細(xì)菌外膜蛋白例如腦膜炎球菌素混合而成的非共價(jià)復(fù)合物所組成。盡管這些多種細(xì)菌蛋白可以用作佐劑，這種由多種蛋白質(zhì)組成的混合物的復(fù)合特性將提出一個(gè)關(guān)于調(diào)節(jié)的問題。而且，免疫應(yīng)答針對(duì)溶液中存在所有蛋白和其它抗原，而對(duì)病毒蛋白的特異性較低。
由Biovector Therapeutics開發(fā)的另一種微粒制劑由碳水化合物內(nèi)核組成，該內(nèi)核被含有抗原的脂質(zhì)包膜環(huán)繞。以流感血凝素作為抗原時(shí)，免疫應(yīng)答觀察到免疫應(yīng)答有少許增強(qiáng)，但并不顯著到足以確保進(jìn)一步的顯色。
呼吸道病毒的減毒活病毒形式，例如呼吸道中最小復(fù)制的流感病毒的冷適應(yīng)毒株已被開發(fā)成為鼻內(nèi)疫苗。這些疫苗在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答與野生型病毒感染誘導(dǎo)的自然免疫相接近的免疫應(yīng)答方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于流感而言，這種疫苗自20世紀(jì)80年代以來已為公眾所知，現(xiàn)已接近商業(yè)化。導(dǎo)致這一延遲的原因在于許多病毒共享的快速突變的能力致使減毒病毒部分或全部逆轉(zhuǎn)為野生型病毒，由此實(shí)際上導(dǎo)致了其本來想要預(yù)防的疾病。
由于上述原因，在本領(lǐng)域中已充分意識(shí)到，尤其是對(duì)于誘導(dǎo)針對(duì)其自身不誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答的病原體的免疫應(yīng)答，和對(duì)于鼻內(nèi)和其它粘膜應(yīng)用，盡管已開發(fā)出了組合物例如ISCOM和蛋白體，但仍非常需要可誘發(fā)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，不含有活病毒，且具有低毒性的特性良好的疫苗組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了解決上述多種問題和難題的新的手段和方法。本發(fā)明提供了一種重建病毒膜，其包含與重建病毒膜的脂雙層膜共存的兩親性佐劑和抗原，其中所述佐劑和所述抗原通過疏水作用而互相作用，其中重建病毒膜具有膜融合活性且其優(yōu)于根據(jù)EP0538437制備的病毒體的膜融合活性。重建病毒膜進(jìn)一步高度模擬重建病毒膜所來源的病毒包膜的組成、表面結(jié)構(gòu)和功能特性。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于生產(chǎn)所述重建病毒膜的方法，該方法包括下述步驟中的某些步驟或所有步驟i)在合適的去污劑中溶解病毒；ii)除去該病毒的遺傳物質(zhì)和核心蛋白；iii)在含有去污劑的溶液中，將具有佐劑活性的一種或多種兩親性分子與抗原接觸；和iv)在允許膜重新形成的條件下除去去污劑。
此外，本發(fā)明提供了一種藥物制劑，其包含根據(jù)本發(fā)明的重建病毒膜和一種藥學(xué)上可接受的載體；以及所述重建病毒膜或根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑經(jīng)鼻內(nèi)、口服或腸胃外輸送在治療或預(yù)防中的用途。

發(fā)明內(nèi)容
第一方面，本發(fā)明涉及一種重建病毒膜。該重建病毒膜優(yōu)選含有(a)脂雙層；(b)病毒的融合蛋白；(c)兩親性佐劑；和(d)任選地，一種其它抗原。在所述重建病毒膜中，優(yōu)選地，所述脂雙層具有的脂質(zhì)組成適合于在病毒膜與病毒的天然宿主的宿主細(xì)胞之間發(fā)生融合，如由所述融合蛋白誘導(dǎo)的融合。優(yōu)選地，脂質(zhì)組成適合于在最佳融合pH值時(shí)的融合。優(yōu)選地，所述融合蛋白、兩親性佐劑以及優(yōu)選地還有任選的其它抗原與脂雙層的疏水性內(nèi)部相互作用，即通過與所述脂雙層的脂質(zhì)和/或彼此間的疏水作用而與病毒膜的脂雙層相結(jié)合、摻入和/或包埋于病毒膜的脂雙層中。進(jìn)一步優(yōu)選所述融合蛋白與兩親性佐劑不發(fā)生共價(jià)連接。優(yōu)選地，所述兩親性佐劑和所述其它抗原也不發(fā)生共價(jià)連接。本發(fā)明的病毒膜優(yōu)選是功能性重建病毒膜，其含有脂質(zhì)優(yōu)選病毒的天然脂質(zhì)、兩親性佐劑、病毒融合蛋白和一種或多種抗原，其中所述兩親性佐劑、脂質(zhì)病毒融合蛋白和抗原主要通過疏水作用發(fā)生相互作用，其中所述兩親性佐劑的疏水部分優(yōu)選地形成脂雙層膜的膜內(nèi)在部分，所述雙層進(jìn)一步包含所述融合蛋白、抗原和脂質(zhì)。功能性重建意指重建病毒膜具有膜融合活性。優(yōu)選的重建病毒膜以小泡的形式存在。
病毒的融合蛋白在本申請(qǐng)中被理解為病毒的膜內(nèi)在蛋白，通常是有包膜病毒的膜內(nèi)在蛋白，其如果在適合的哺乳動(dòng)物或鳥類細(xì)胞表面上被表達(dá)，則可在合適的pH值下誘導(dǎo)細(xì)胞與該病毒的天然宿主細(xì)胞發(fā)生融合(例如參見Hernandez等，1996)。適于摻入重建病毒膜中的病毒融合蛋白的實(shí)例包括塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)E1蛋白、流感病毒血凝素(HA)蛋白、HIV gp120/gp41蛋白、副粘病毒的F蛋白。能區(qū)分出兩種類型的病毒融合蛋白誘導(dǎo)的融合。第一種類型的融合，例如由HIV gp120/gp41蛋白所誘導(dǎo)的融合，在中性pH值下發(fā)生于目標(biāo)宿主細(xì)胞的表面上。第二種類型的融合，例如由流感病毒血凝素(HA)蛋白誘導(dǎo)的融合，緊隨內(nèi)在化在較低的pH值(5.0-6.5)下從宿主細(xì)胞的內(nèi)體區(qū)室中發(fā)生。兩種類型的融合均被特別包含于本發(fā)明中。
因此本發(fā)明的重建病毒膜與宿主細(xì)胞相融合的能力依賴于是否存在合適的病毒融合蛋白。但是，由于現(xiàn)有技術(shù)中已描述了由合成脂質(zhì)和病毒融合蛋白組成的病毒體不能融合，故這一能力還進(jìn)一步依賴于重建病毒膜的脂雙層的脂質(zhì)組成。因此對(duì)重建病毒膜的脂質(zhì)組成進(jìn)行了優(yōu)選，以使得所述膜能在合適的pH值下與合適的宿主細(xì)胞融合。重建病毒膜的融合能力可以在如本申請(qǐng)實(shí)施例3中所描述的紅細(xì)胞血影融合分析(erythrocyte ghost fusion assay)中進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于含有流感血凝素的重建病毒膜，若將1μM病毒體與50μM紅細(xì)胞血影膜磷脂在所述血凝素的最適pH值下相混合，在該測(cè)定中的優(yōu)選融合活性在一分鐘后誘導(dǎo)了至少30％的重建病毒膜小泡與紅細(xì)胞血影的融合。
不能通過上述分析進(jìn)行檢測(cè)的其它重建病毒膜的優(yōu)選融合活性是能在向細(xì)胞中添加所述重建病毒膜后即發(fā)生融合，其中所述細(xì)胞能被其融合蛋白所來源的病毒感染。重建病毒膜應(yīng)與至少10％的細(xì)胞融合，所述細(xì)胞將被其融合蛋白所來源的病毒融合。
提供具有融合活性的重建病毒膜的一種優(yōu)選的脂質(zhì)組成是含有病毒的天然脂質(zhì)的脂質(zhì)組成。術(shù)語“病毒的天然脂質(zhì)”在本申請(qǐng)中意指理解為是生長在細(xì)胞優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞上或生長在含胎卵上的病毒的膜中存在的那些脂質(zhì)。與合成脂質(zhì)不同，病毒的天然脂質(zhì)因此優(yōu)選地獲自或分離自以這種方式生長的病毒顆粒。然而，除天然脂質(zhì)外，本發(fā)明的功能性重建病毒膜可以含有來自其它來源的純化脂質(zhì)，例如合成脂質(zhì)。因而，提供具有融合活性的重建病毒膜的脂質(zhì)組成優(yōu)選地是獲自或可獲自天然病毒膜的組成。因而，用于本發(fā)明的脂質(zhì)組成包括只由病毒的天然脂質(zhì)構(gòu)成的脂質(zhì)組成、由添加了其它來源的脂質(zhì)的病毒天然脂質(zhì)構(gòu)成的脂質(zhì)組成以及由多種來源的脂質(zhì)構(gòu)成的組成，它們可模擬天然病毒膜的脂質(zhì)組成。
佐劑在本申請(qǐng)中意指在包括任何當(dāng)其與抗原聯(lián)合使用對(duì)人或動(dòng)物進(jìn)行免疫時(shí)刺激免疫系統(tǒng)，并由此激發(fā)、增強(qiáng)或促進(jìn)抗所述抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)或化合物，優(yōu)選不產(chǎn)生針對(duì)該佐劑自身的特異性免疫應(yīng)答。在除了不含佐劑的相同條件下針對(duì)所述抗原所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相比，優(yōu)選的佐劑增強(qiáng)了抗給定抗原的免疫應(yīng)答至少1.5、2、2.5、5、10或20倍。測(cè)定在一組動(dòng)物或人中測(cè)定相對(duì)于相應(yīng)對(duì)照組由佐劑產(chǎn)生的抗給定抗原的免疫應(yīng)答的統(tǒng)計(jì)學(xué)平均增強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域中已知的。所述佐劑優(yōu)選地能增強(qiáng)針對(duì)至少兩種不同抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的佐劑通常為哺乳動(dòng)物外源性化合物，從而將哺乳動(dòng)物內(nèi)源性免疫刺激化合物例如白介素、干擾素和其它激素排除在外。待摻入至本發(fā)明的功能性重建病毒膜中的佐劑優(yōu)選為兩親性佐劑。
術(shù)語“兩親性佐劑”意指包括任何佐劑，其包括化合物如脂肽和糖脂，具有疏水膜包埋和環(huán)境導(dǎo)向的極性部分(頭部基團(tuán))，且其優(yōu)選地通過自身，可連接，或更優(yōu)選地可整合至于水中的脂雙層小泡和膠束中。該術(shù)語也包括任何被穩(wěn)定地?fù)饺氲街p層(含有病毒的天然脂質(zhì))中的兩親性佐劑，其疏水部分與內(nèi)區(qū)(脂雙層的疏水區(qū))接觸，其極性頭部基團(tuán)部分朝向外部(該膜的極性表面)。然而，更多的具有較低的顯著兩親性的疏水佐劑，即不具有或具有微弱極性的頭部基團(tuán)部分，但其可連接，或摻入到脂雙層小泡中，這樣的兩親性佐劑特別地包含在本發(fā)明中。本申請(qǐng)種使用具有佐劑活性的“兩親性佐劑”因此包括天然產(chǎn)生的或(部分)合成的佐劑，其能與一種或多種感興趣的抗原和病毒的天然脂質(zhì)一起在能夠形成重建病毒膜的條件下于水環(huán)境中形成重建病毒膜。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，存在于重建病毒膜中的兩親性佐劑對(duì)于用于人類是藥學(xué)上可接受的，與例如Quil ATM或其它皂苷不同，其是在本領(lǐng)域特定試驗(yàn)中已測(cè)定的具有佐劑活性的兩親物。本發(fā)明的兩親性佐劑優(yōu)選不與抗原共價(jià)連接而是共存于所述重建膜的脂雙層中?？乖妥魟┎话l(fā)生共價(jià)連接的事實(shí)確保抗原的處理和將其表位呈遞給免疫系統(tǒng)的情形與單獨(dú)的天然蛋白基本一致，這保證了對(duì)天然病原體上存在的蛋白質(zhì)的良好識(shí)別。另一方面，所述抗原和所述佐劑與所述脂雙層間(及互相間)的疏水作用使佐劑和抗原分散到制劑中重建病毒膜上，由此制劑中大多數(shù)膜小泡在單個(gè)小泡中同時(shí)包含抗原和佐劑，更優(yōu)選至少60、70、80、90、95或95％的小泡同時(shí)包含抗原和佐劑?？乖妥魟┰趩蝹€(gè)膜或小泡中的聯(lián)合使得抗原輸送給由佐劑激活的抗原呈遞細(xì)胞，由此增強(qiáng)了所述重建病毒膜的治療和/或預(yù)防作用。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述兩親性佐劑被存在于抗原呈遞細(xì)胞上的Toll-樣受體(TLR)識(shí)別。被TLR所識(shí)別的各種化合物是本領(lǐng)域中已知的，包括例如脂肽、脂多糖、肽聚糖、脂胞壁酸、脂蛋白(來自支原體、分枝桿菌、螺旋菌)、雙鏈RNA(聚I:C)、未甲基化的DNA、脂阿拉伯甘露聚糖、鞭毛蛋白、含CpG的DNA和咪唑喹啉。并非所有TLR識(shí)別的化合物都適于做佐劑，例如野生型革蘭氏陰性菌脂多糖的毒性對(duì)于將其用作佐劑來說就太高了，即其用于人在藥學(xué)上是不可接受的。然而其它TLR識(shí)別的化合物可用作佐劑。這種TLR識(shí)別的佐劑自身可以是兩親性佐劑，或任選地可被修飾成兩親性佐劑例如通過將疏水化合物(參見如下)連接至極性TLR配體上?；蛘?，所述兩親性佐劑可以靶向其它受體。優(yōu)選的兩親性佐劑是脂肽，其可通過合成或半合成進(jìn)行制備。優(yōu)選的用作兩親性佐劑的脂肽具有佐劑活性且用于人類在是藥學(xué)上可接受的。本發(fā)明的脂肽是將通常包含與一個(gè)或多個(gè)疏水化合物共價(jià)連接的一個(gè)或多個(gè)(寡)肽所組成的分子，所述疏水化合物選自脂肪酸、脂質(zhì)、神經(jīng)酰胺、縮醛磷脂、烷基或烯烴鏈或甾酮。一般而言，用于本發(fā)明的脂肽優(yōu)選含有3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸，更優(yōu)選該肽含有70-80％帶正電荷的氨基酸其中優(yōu)選賴氨酸和精氨酸，優(yōu)選地該肽含有一個(gè)或多個(gè)絲氨酸和/或半胱氨酸。尤其優(yōu)選的脂肽列于表1中。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中所述兩親性佐劑是糖脂。用作兩親性佐劑的優(yōu)選的糖脂具有佐劑活性且用于人體是藥學(xué)上可接受的。糖脂是共價(jià)連接于一個(gè)或多個(gè)糖的脂質(zhì)(或其它疏水化合物)。在本發(fā)明的一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方式中提供了根據(jù)本發(fā)明的重建病毒膜，其中糖脂是α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺或磷脂酰肌醇甘露糖苷。術(shù)語“α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺”和“磷脂酰肌醇甘露糖苷”是指包括其中任一種的任何衍生物。例如US5,936,076和US4,542,212中分別描述了具有佐劑活性且可用于本發(fā)明上下文中的這些分子的衍生物。其它適用于本發(fā)明的糖脂佐劑包括例如具有LPS的脂質(zhì)A部分降低的毒性但保留了(部分)佐劑活性的革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素脂多糖(LPS)的修飾形式，可獲自遺傳修飾的革蘭氏陰性病原體和參見WO02/09746。
本發(fā)明中的用作兩親性佐劑的修飾的LPS優(yōu)選具有毒性降低的修飾的脂質(zhì)A部分。優(yōu)選修飾的LPS的毒性低于相應(yīng)的野生型LPS的毒性，更優(yōu)選修飾的LPS的毒性低于相應(yīng)的野生型LPS毒性的90％、80％、60％、40％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.2％。野生型的毒性和各種毒性降低的修飾的LPS的毒性可在本領(lǐng)域種已知的任何適宜的分析方法中進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)選用于測(cè)定該毒性即修飾的LPS的生物學(xué)活性的分析是用于在檢測(cè)MM6巨噬細(xì)胞系中的TNF-α誘導(dǎo)的WEHI檢測(cè)(Espevik和Niessen，1986，J.Immunol.Methods 9599-105；Ziegler-Heitbrock等，1988，Int.J.Cancer 41456-461)。另一方面，毒性降低的修飾的LPS仍具有足夠的免疫刺激活性，即佐劑活性。毒性降低的修飾的LPS優(yōu)選具有相應(yīng)的野生型LPS的免疫刺激活性的至少10％、20％、40％、80％、90％或100％。可如上述或本申請(qǐng)實(shí)施例中所述，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中對(duì)免疫刺激活性進(jìn)行體內(nèi)測(cè)定；或例如通過測(cè)量LPS刺激的樹突細(xì)胞產(chǎn)生的至少一種細(xì)胞因子(例如IL12、IL10、TNF-α、IL-6和IL-1-β之一)的產(chǎn)量，或通過測(cè)量LPS刺激的樹突細(xì)胞上至少一種共刺激分子(例如CD40或CD86)的表達(dá)體外測(cè)定由待檢測(cè)的LPS溫育所刺激的樹突細(xì)胞的成熟度。
本發(fā)明的另一方面，存在于本發(fā)明的病毒體中的兩親性佐劑是一種肽，優(yōu)選為一種兩親性肽。用作兩親性佐劑的優(yōu)選的肽具有佐劑活性且用于人是藥學(xué)上可接受的。具有佐劑活性的肽，特別是極性肽，可通過將其(共價(jià))連接到一種合適的疏水化合物上是使其為兩親性佐劑(見上述)。或者，兩親肽可包括氨基酸的疏水分支例如下述的跨膜序列。一種優(yōu)選的肽包含來源于Notch配體Jagged-1的序列(見Weijzen等，2002；Genbank登錄號(hào)為AAC52020)或來源于金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白A的序列。優(yōu)選具有來源于Jagged-1或蛋白A的序列的肽被共價(jià)連接于一種合適的疏水化合物(見上述)和/或包含跨膜序列(參見如下)。從所述脂雙層突出的Jagged-1或蛋白A衍生肽的(極性)部分優(yōu)選包含不超過3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的重建病毒膜優(yōu)選地適于腸胃外和粘膜(例如鼻內(nèi)或口服)施用。然而，本發(fā)明的一個(gè)重要方面是本發(fā)明的重建病毒膜可用于抗原的鼻內(nèi)輸送，所述抗原在正常情況下經(jīng)鼻內(nèi)遞送不能在治療個(gè)體中誘發(fā)足夠的保護(hù)性免疫應(yīng)答以抵御含有抗原的致病性生物體的后繼感染。
本發(fā)明的重建病毒膜含有病毒融合蛋白和，任選地其它抗原。因而，只含有病毒融合蛋白而不含其它抗原的重建病毒膜應(yīng)被理解為是本發(fā)明的一部分，其中病毒融合蛋白除作為融合蛋白的功能外還具有作為抗原的功能。另一方面，重建病毒膜除病毒融合蛋白以外還可包含一種或多種其它抗原。
作為根據(jù)本發(fā)明的重建病毒膜一部分的抗原優(yōu)選具有能夠插入該重建病毒膜小泡的脂雙層中的疏水部分。許多病原體例如病毒、細(xì)菌、酵母和寄生蟲在其衣殼、細(xì)胞壁或膜上攜帶有可誘發(fā)宿主免疫應(yīng)答的蛋白。具有疏水元件如跨膜部分且適于作為本發(fā)明的重建病毒膜一部分的抗原的實(shí)例是存在于病原體膜(在病毒中也被稱為包膜)上的蛋白。因而，優(yōu)選地，存在于本發(fā)明的重建病毒膜上的抗原是膜內(nèi)在蛋白。本發(fā)明的重建病毒膜中的抗原蛋白的朝向與其在病毒或細(xì)胞膜上呈現(xiàn)的一致，但當(dāng)其存于膜脂雙層中時(shí)可以呈遞通常部分或至少暫時(shí)隱藏的表位。這些抗原呈遞重建病毒膜對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激可歸因于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞對(duì)它們的特異性識(shí)別、它們的特定特征、蛋白質(zhì)的呈遞和暴露出所隱藏的表位相結(jié)合。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的重建病毒膜的抗原蛋白包含一種或多種保護(hù)性表位，即能在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)免疫應(yīng)答從而提供對(duì)所述抗原所來源的病原體的感染的保護(hù)或提供對(duì)表達(dá)該抗原的腫瘤的保護(hù)。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗原來自病毒、寄生蟲、真菌或細(xì)菌。特別優(yōu)選的重建病毒膜，其中所述抗原來自流感病毒。優(yōu)選可用于本發(fā)明的重建病毒膜中的來自流感病毒的蛋白是血凝素(HA)蛋白、神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白和/或M2蛋白(單獨(dú)或其組合)。
可適用和用于根據(jù)本發(fā)明的重建病毒膜的形成的抗原可源自所有類別的病毒，所述病毒的非限制性實(shí)例是逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)例如人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency virus，HIV)；風(fēng)疹病毒(rubellavirus)；副粘病毒科(paramyxoviridae)例如副流感病毒(parainfluenza viruses)、麻疹(measles)、流行性腮腺炎(mumps)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、人梅塔肺病毒(humanmetapneumovirus)；黃病毒科(flaviviridae)如黃熱病毒(yellow fevervirus)、登革熱病毒(dengue virus)、C型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)、日本腦炎病毒(JEV)、森林腦炎(tick-borne encephalitis)、圣路易斯腦炎(St.Louis encephalitis)或西尼羅腦炎病毒(West Nile virus)；皰疹病毒科如單純皰疹病毒(Herpes Simplex virus)、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus)、EB病毒(Epstein-Barr virus)；本揚(yáng)病毒科(Bunyaviridae)；沙粒病毒科(Arenaviridae)；漢坦病毒科(Hantaviridae)如汗坦病毒(Hantaan)；冠狀病毒科(Coronaviridae)；乳多空病毒科(Papovaviridae)如人乳頭狀瘤病毒(humanPapillomavirus)；彈狀病毒科(Rhabdoviridae)如狂犬病病毒(rabies virus)；冠狀病毒科(Coronaviridae)如人冠狀病毒(human coronavirus)；甲病毒科(Alphaviridae)、動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)、纖狀病毒科(filoviridae)如埃博拉病毒(Ebolavirus)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、痘病毒科(poxviridae)如天花病毒(smallpox virus)和非洲豬熱病毒(African swine fever virus)。同樣所述抗原可來自致病性細(xì)菌、真菌(包括酵母)或寄生蟲。所述抗原包括細(xì)菌抗原例如卷旋桿菌屬(Helicobacter)如幽門螺旋桿菌(H.Pylori)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)如腦膜炎奈瑟氏球菌(N.mengitidis)、嗜血桿菌(Haemophilus)如流感嗜血桿菌(H.Influenza)、博德特氏桿菌屬(Bordetella)如百日咳博德特氏桿菌(B.Pertussis)、衣原體(Chlamydia)、鏈球菌(Streptococcus)如鏈球菌亞種血清型A(Streptococcus sp.SerotypeA)、弧菌屬(Vibrio)如霍亂弧菌(V.Cholera)、革蘭氏陰性腸道病原體包括例如沙門氏菌(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)和埃希氏桿菌屬(Escherichia)和來自導(dǎo)致炭疽、麻風(fēng)病、結(jié)核病、白喉、萊姆病、梅毒、傷寒和淋病的細(xì)菌的抗原。來自寄生蟲的抗原例如包括來自原生動(dòng)物如巴貝蟲(Babeosis bovis)、瘧原蟲(Plasmodium)、利什曼原蟲(Leishmania spp.)、鼠弓形體(Toxoplasmagondii)和錐蟲屬(Trypanosoma)如克氏錐蟲(T.Cruzi)的抗原。真菌抗原可包括來自真菌如曲霉屬(Aspergillus sp.)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、隱球酵母屬(Cryptococcus)如新型隱球酵母(C.Neoformans)和夾膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)的抗原。
雖然接種疫苗通常用于針對(duì)病原體的預(yù)防性保護(hù)或用于治療病原體感染后的疾病，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉疫苗在腫瘤治療中的應(yīng)用。此外發(fā)現(xiàn)數(shù)量漸增的腫瘤特異性蛋白是能被人或人源化抗體靶定的適宜的存在物。這種腫瘤特異性蛋白也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本領(lǐng)域中已知多種腫瘤特異性抗原。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了含有腫瘤特異性抗原的重建病毒膜。合適的腫瘤抗原包括例如癌胚抗原、前列腺-特異性膜抗原、前列腺特異性抗原、蛋白MZ2-E、多形上皮粘蛋白(PEM)、葉酸結(jié)合蛋白LK26、截短的上皮生長因子受體(EGRF)、Thomsen-Friedenreich(T)抗原、GM-2和GD-2神經(jīng)節(jié)苷酯、Ep-CAM、粘蛋白-1、上皮糖蛋白-2(Epithialial glycoprotein-2)和結(jié)腸特異性抗原。
優(yōu)選來自這些病原體的抗原是膜內(nèi)在蛋白。然而，包含保護(hù)性表位的非膜蛋白抗原或其部分也可被修飾而用于本發(fā)明中將其與跨膜序列相融合。跨膜序列或膜錨定序列是本領(lǐng)域中眾所周知的，它們是基于哺乳動(dòng)物跨膜分子的遺傳幾何學(xué)?？缒ば蛄型ǔＳ杉s10-30個(gè)，通常約20個(gè)氨基酸的序列組成，其中絕大多數(shù)具有疏水支鏈。已知多種蛋白的跨膜序列，其中任何一種均可使用。用于本發(fā)明的膜錨定序列的實(shí)例包括例如來自CD8、ICAM-2、IL-8R、CD4和LFA-1的那些序列。優(yōu)選地，跨膜序列來自病毒膜中天然存在的病毒膜內(nèi)在蛋白。其實(shí)例包括人呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白G的跨膜區(qū)(例如第38-63位氨基酸)或流感病毒神經(jīng)氨酸酶的跨膜區(qū)(例如第7-27位氨基酸)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種制備重建病毒膜的方法，包含以下步驟中的一些或全部(a)于一種含有去污劑的溶液中將一種兩親性佐劑、一種病毒融合蛋白、一種任選的其它抗原和脂質(zhì)相混合；(b)在使得病毒膜重建的條件下降低去污劑的濃度，所述病毒膜包含一種脂雙層，該脂雙層中的所述兩親性佐劑和病毒融合蛋白與所述脂雙層疏水性內(nèi)部相互作用，其中優(yōu)選所述兩親性佐劑和所述病毒融合蛋白不發(fā)生共價(jià)連接，其中還優(yōu)選所述兩親性佐劑和所述任選的其它抗原不發(fā)生共價(jià)連接，以及所述重建病毒膜具有膜融合活性；(c)任選地，純化所述重建病毒膜；和，(d)任選地，將所述重建病毒膜配制成藥物組合物。為提供病毒脂質(zhì)，所述方法可進(jìn)一步包括(i)將所述病毒溶于一種合適的去污劑如辛乙二醇單-正十二烷基醚中；(ii)例如通過差異超速離心除去病毒遺傳物質(zhì)和核蛋白。優(yōu)選通過透析、滲濾或吸附到疏水(和/或吸附進(jìn)大小排阻)珠上，以合適的速率除去去污劑從而使形成膜以降低去污劑的濃度，其中優(yōu)選所述兩親性佐劑和所述病毒融合蛋白以及還優(yōu)選所述其它抗原存在于所述重建病毒膜上，通過疏水作用與內(nèi)區(qū)(所述脂雙層的疏水區(qū))和/或相互之間相互作用。病毒優(yōu)選是含有膜的病毒例如絕大多數(shù)有包膜病毒。優(yōu)選用作天然病毒脂質(zhì)來源的病毒是流感病毒、塞姆利基森林病毒或副粘液病毒。
優(yōu)選地，本發(fā)明公開的用于制備重建病毒膜的方法包括純化所述重建病毒膜的步驟。用于純化重建病毒膜的方法是本領(lǐng)域公知的，包括例如差異和密度梯度離心和/或?qū)游?大小排阻層析、離子交換層析和/或親合層析)。去污劑是具有表面活性的兩親性分子。合適的去污劑是能有效溶解病毒膜組分但不會(huì)使融合蛋白、病毒衣殼和/或核蛋白變性的去污劑，例如兩性離子去污劑如辛乙二醇單-正十二烷基醚。
疏水作用由水環(huán)境中存在的疏水物質(zhì)之間的非共價(jià)、非靜電引力所產(chǎn)生。在本發(fā)明的另一方面中提供了一種藥物組合物，其包含作為活性成分的根據(jù)本發(fā)明的重建病毒膜和一種藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑、滲透劑、緩沖劑、分散劑等也可被摻入該藥物組合物中。優(yōu)選形式取決于所需給藥方式和治療用途。藥學(xué)載體可以是任何適于將重建病毒膜輸送給患者的相容性、無毒物質(zhì)。用于鼻內(nèi)輸送的藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例是水、緩沖鹽溶液、甘油、聚山梨醇酯20、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)和辛酸/癸酸甘油酯的水混合物，并可加入緩沖液以提供中性pH環(huán)境。用于腸胃外輸送的藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例是無菌緩沖的0.9％NaCl或5％葡萄糖，任選地添加了20％的白蛋白。用于親本施用的制劑必須是無菌的。用于多肽或抗體施用的親本途徑可以依據(jù)已知的方法例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或損傷內(nèi)途徑進(jìn)行注射或灌注。優(yōu)選通過藥丸注射施用重建病毒膜。一種用于肌內(nèi)注射的典型的藥物組合物可被制備成包含例如1-10ml磷酸鹽緩沖液和1-100μg優(yōu)選15-45μg本發(fā)明的重建病毒膜(的抗原蛋白)。對(duì)于口服施用，活性組分給予的方式可以是液體劑型，例如酏劑、糖漿和懸浮液。用于口服施用的液體劑型可包含色素和調(diào)味劑以增強(qiáng)病人的接受度。制備腸胃外、口服或鼻內(nèi)施用的組合物的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，并在多種來源有更多詳細(xì)描述包括例如Remington′s Pharmaceutical Science(15th ed.，Mack Publishing，Easton，PA，1980)(在此通過應(yīng)用將其整體完整地引入本發(fā)明)。另一方面，本發(fā)明涉及通過對(duì)需要預(yù)防或治療的患者施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的重建病毒膜(包含其的藥物組合物)以用于抗感染性疾病或腫瘤的接種或用于預(yù)防和治療感染疾病或腫瘤。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的重建病毒膜用作藥物，優(yōu)選用作用于抗感染性疾病或腫瘤的接種或用于預(yù)防和治療感染疾病或腫瘤的藥物的用途。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及本發(fā)明重建病毒膜在制備用于抗感染性疾病或腫瘤的接種或用于預(yù)防和治療感染疾病或腫瘤的藥物中的用途。


圖1用于分析包含佐劑的重建病毒膜的脂肽、蛋白和脂質(zhì)間的物理結(jié)合的蔗糖梯度的示意圖。
圖2從如圖1中所示梯度上的10/40％的蔗糖界面中回收的脂質(zhì)和脂肽的雙向薄層層析。板A對(duì)照，無脂肽的重建病毒膜，顯示了水合茚三酮反應(yīng)性天然病毒脂質(zhì)。板B包含脂肽的重建病毒膜，顯示了與水合茚三酮反應(yīng)的天然病毒脂質(zhì)以及水合茚三酮反應(yīng)性脂肽。進(jìn)行雙向?qū)游鱿到y(tǒng)1 CHC13/甲醇/H2O 65/25/4，系統(tǒng)2正丁醇/乙酸/水2/1/1，并以水合茚三酮染料通過衍生化作用染色。加樣位置標(biāo)記為“斑點(diǎn)”。
圖3根據(jù)本發(fā)明的包含脂肽的重建病毒膜的電子顯微照片；用磷鉬酸銨負(fù)染色。膜直徑大約為100-200nm。
圖4間隔14天進(jìn)行鼻內(nèi)接種A/巴拿馬/2007/99兩次后鼻和肺中的IgA效價(jià)；最后一次接種后3周測(cè)定效價(jià)。減去免疫前的效價(jià)。所用疫苗是標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)亞單位疫苗、根據(jù)EP 0538437制備的病毒體或根據(jù)本發(fā)明的包含脂肽的重建病毒膜。每組10只小鼠。
圖5間隔14天進(jìn)行鼻內(nèi)接種兩次后血液中的IgG效價(jià)；最后一次接種后3周測(cè)定效價(jià)。減去免疫前的效價(jià)。所用疫苗是根據(jù)EP 0538437制備的病毒體或根據(jù)本發(fā)明的包含脂肽的重建病毒膜。用各包含來自所示病毒中一株毒株的抗原的四種不同的疫苗制劑接種4組小鼠，每組10只。
圖6根據(jù)本發(fā)明的重建病毒膜的融合活性。將包含芘磷脂的重建病毒膜與紅細(xì)胞血影混合，根據(jù)本申請(qǐng)對(duì)融合進(jìn)行測(cè)定。
圖7單次肌內(nèi)接種后血液中的IgG效價(jià)；接種后3周測(cè)定效價(jià)。減去免疫前的效價(jià)。所用疫苗是根據(jù)EP 0538437制備的病毒體或根據(jù)本發(fā)明的包含脂肽的重建病毒膜。每組10只小鼠。
圖8來自A/懷俄明病毒株的重建病毒膜的平衡密度蔗糖梯度分析，顯示重建物質(zhì)的單密度峰；脂肽回收自級(jí)分4、5和6。
圖9在10只小鼠的1個(gè)組中，在0和14日鼻內(nèi)接種后血液中的IgG效價(jià)?？乖瓉碜訟/巴拿馬/2007/99病毒株，膜含有N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(脯氨酰)3-脯氨酸。
圖10在10只小鼠組的1個(gè)中，間隔14天兩次鼻內(nèi)接種A/巴拿馬/2007/99病毒株的重建病毒膜后在鼻和肺中的IgA效價(jià)，所述膜含有脂肽N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(脯氨酰)3-脯氨酸；最后一次接種后3周測(cè)定效價(jià)。減去免疫前的效價(jià)。
實(shí)施例實(shí)施例1含有脂肽N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴氨酰)3-賴氨酸、流感病毒的天然脂質(zhì)和流感病毒膜蛋白的重建病毒膜的制備。
采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法，通過培養(yǎng)獲自世界流感中心(World Influenza Center)或美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的病毒來制備流感病毒，例如通過在含胎卵或培養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)病毒。然后將病毒純化，優(yōu)選通過差異和/或密度梯度超速離心，隨后可以根據(jù)所建立的標(biāo)準(zhǔn)程序用β丙內(nèi)酯或甲醛滅活。
在中性pH的等滲緩沖液145mM NaCl，2.5mM HEPES，1mm EDTA，pH 7.4(緩沖液A)中，將被純化和濃縮的流感A/巴拿馬/2007/9病毒(1500nmol磷脂)用1ml去污劑辛(乙二醇)-正十二烷基單醚(C12E8)(Boehringer，Mannheim，Germany)在100mM的濃度(濃度需要大于去污劑的臨界膠束濃度)于4℃溫育10分鐘。然后在4℃以100,000×g離心30分鐘除去病毒核衣殼和基質(zhì)蛋白。棄去沉淀，將上清液與干燥的脂肽以0.5mg脂肽/750nmol病毒脂質(zhì)的比率混合，混合至脂肽被溶解。在每350微升的混合液中加入128mg BioBeads SM-2(Bio-Rad)，并劇烈振蕩混合物和珠1小時(shí)以除去去污劑。然后，將液體轉(zhuǎn)移到另一64mg的這種珠子中，繼續(xù)振蕩10分鐘。所得渾濁上清液包含所述重建病毒膜，經(jīng)或不經(jīng)進(jìn)一步的純化即可將其用于接種疫苗。
為了分析脂質(zhì)、脂肽和病毒蛋白之間的物理結(jié)合，將含有重建病毒膜的渾濁混合物加樣到含有于緩沖液A中的40％蔗糖(w/v)的1mL墊層和于緩沖液A中的10％蔗糖(w/v)的4mL頂層(如圖1中所示)不連續(xù)蔗糖梯度上。將所述梯度于100.000gmax離心90分鐘，從所述40％墊層，所述40％墊層和10％頂層之間的界面，和頂層取樣。在這些梯度中，未摻入的病毒蛋白在離心過程中移至墊層中，重建病毒膜中不存在的脂質(zhì)和脂肽移至梯度頂層，可以在界面上得到重建病毒膜(圖1)。在梯度頂層附近得到15％的病毒脂質(zhì)和6％的脂肽。加載于梯度上的85％的病毒脂質(zhì)，94％的脂肽和60％的病毒膜蛋白被發(fā)現(xiàn)與重建病毒膜條帶相結(jié)合。
為了分析條帶的脂質(zhì)組成，根據(jù)Folch等(1957)所述，從上述蔗糖梯度的40/10％界面回收根據(jù)上述步驟制備的，或沒有添加脂肽的重建病毒膜的兩個(gè)樣品，然后用CHCl3/MeoH抽提。以CHCl3/甲醇/H2O 65/25/4作為第一洗脫液，隨后用正丁醇/乙酸/水2/1/1，通過雙向薄層層析分析抽提出來的脂質(zhì)和脂肽，并用水合茚三酮染料通過衍生化作用染色(平板噴以于正丁醇中的2％的水合茚三酮，于80℃溫育10分鐘)。結(jié)果示于圖2中，其中清楚地證明了病毒的天然脂質(zhì)與脂肽間的物理結(jié)合。
從該梯度的條帶收集的病毒體的電子顯微照片示于圖3中，其中清楚地表明了顆粒病毒大小，顯示了流感病毒特征性的病毒抗原波峰。
實(shí)施例2采用包含脂肽N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴氨酰)3-賴氨酸、流感病毒的天然脂質(zhì)和流感膜蛋白的重建病毒膜進(jìn)行的鼻內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)。
將通過鼻內(nèi)施用包含流感病毒血凝素和N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴氨酰)3-賴氨酸的重建病毒膜的接種疫苗與鼻內(nèi)施用標(biāo)準(zhǔn)亞單位疫苗、或根據(jù)EP0538437制備的病毒體疫苗進(jìn)行比較。在第0和14日，通過鼻內(nèi)滴入10微升含有5μg流感蛋白的抗原對(duì)Balb/C小鼠。在第0、14和35日采取血樣，在第35日收集鼻和肺沖洗液。比較流感病毒的幾種不同的毒株；每只小鼠用一種類型的毒株進(jìn)行免疫。通過與氣管連接的注射器向肺中注射1.5ml PBS，隨后吸入1ml流體對(duì)肺進(jìn)行沖洗。通過逆向注射0.5ml PBS，通過氣管，進(jìn)入鼻咽，在鼻孔收集灌洗液來收集鼻內(nèi)沖洗液。通過離心立即除去灌洗液中的碎片和細(xì)胞成分，加入蛋白酶抑制劑混合物(化學(xué)抑制素、抗蛋白酶、亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制劑，終濃度1μg/ml，來自于干燥的DMSO中的1000×濃縮母液)，其后在液氮中冷凍該樣品并儲(chǔ)存于-20℃直至分析。通過抗流感蛋白的鼻和肺中的IgA及IgG ELISA對(duì)樣品進(jìn)行分析。結(jié)果分別示于圖4和圖5中。
實(shí)施例3包含脂肽N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴氨酰)3-賴氨酸、流感病毒的天然脂質(zhì)、芘標(biāo)記的磷脂酰膽堿和流感膜蛋白的重建病毒膜的膜融合活性。
在中性pH的等滲緩沖液145mM NaCl，2.5mM HEPES，1mm EDTA，pH 7.4(緩沖A)中，以100mM的濃度將經(jīng)純化和濃縮的流感A/巴拿馬/2007/9病毒(1500nmol磷脂)與1ml辛(乙二醇)-正十二烷基單醚(C12E8)(Boehringer，Mannheim，Germany)于4℃溫育10分鐘。然后，于4℃以100,000×g離心30分鐘除去病毒核衣殼和基質(zhì)蛋白。棄去沉淀物。將上清液與干燥的脂肽和芘標(biāo)記的磷脂以0.5mg脂肽和150nmol 1-十六烷酰-2-(1-芘癸酰)-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿/750nmol病毒脂質(zhì)的比率混合，混合直至脂肽和芘標(biāo)記的磷脂被溶解。然后，向每350微升的混合液中加入128mg BioBeads SM-2(Bio-Rad)，劇烈振蕩混合物和該珠一小時(shí)除去去污劑。然后將液體轉(zhuǎn)移到另一64mg的這種珠子中，繼續(xù)振蕩10分鐘。
為了測(cè)量膜融合，通過Steck和Kant(1974)的方法從過期的紅細(xì)胞濃縮液(B血型，Rh因子陰性)制備紅細(xì)胞血影靶膜。在0.06M血影磷脂和1μM病毒體磷脂的濃度下，在含有140mM NaCl，15mM檸檬酸鈉的pH 5.1的緩沖液中檢測(cè)融合。通過稀釋pyrPC監(jiān)測(cè)脂質(zhì)混合。為此目的，對(duì)芘受激子熒光進(jìn)行測(cè)定，在發(fā)射光束中存在475nm截?cái)嘀档臑V波器的情況下，刺激和發(fā)射波長分別為345nm(帶通2nm)和490nm(帶通16nm)。在探針無限稀釋的情況下通過加入35μl的0.2M C12E8對(duì)背景熒光進(jìn)行評(píng)定。通過計(jì)算f＝100×(E0-E)/(E0-Ey)，將熒光的變化轉(zhuǎn)換為融合程度(f)，其中E代表任何時(shí)候的受激子熒光，E0和Ey分別代表時(shí)間零和添加C12E8后于490nm處的光強(qiáng)，均針對(duì)稀釋效應(yīng)進(jìn)行了矯正。結(jié)果，如圖6所示，清楚地顯示了該重建病毒膜的強(qiáng)融合活性。
實(shí)施例4用包含脂肽N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴氨酰)3-賴氨酸、流感病毒的天然脂質(zhì)和流感膜蛋白的重建病毒膜的肌內(nèi)免疫與根據(jù)EP 0538437制備的病毒體的免疫的比較實(shí)驗(yàn)。
在第0日將25μl流感抗原(5μg蛋白)注射至Balb/C小鼠的一側(cè)后肢肌肉內(nèi)。在第0和14日采取血樣。用A/巴拿馬/2007/99株病毒制備疫苗。通過抗流感血凝素的IgG ELISA對(duì)樣品進(jìn)行分析。結(jié)果示于圖7中。
實(shí)施例5通過平衡密度梯度離心對(duì)包含A/懷俄明膜蛋白的功能性重建病毒膜進(jìn)行物理表征。
如實(shí)施例1中所述制備包含脂肽N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴氨酰)3-賴氨酸的重建病毒膜，加載于10-60％w/v蔗糖梯度上，在Beckman SW55轉(zhuǎn)子中以50,000rpm離心16小時(shí)。在該類梯度中，脂質(zhì)和脂肽保留在頂部，而蛋白移向最底層的級(jí)分。通過折光儀器、蛋白和磷脂測(cè)定對(duì)獲自梯度的樣品進(jìn)行分析。結(jié)果，如圖8中所示，表示基本上所有的病毒蛋白和絕大多數(shù)病毒脂質(zhì)共純化于一個(gè)單峰中。同樣，脂質(zhì)也僅回收自級(jí)分4、5和6。這些數(shù)據(jù)表明該重建病毒膜是密度約1.12g/ml的顆粒。
實(shí)施例6采用重建病毒膜的鼻內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)，所述膜包含脂肽N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(脯氨酰)3-脯氨酸、流感病毒的天然脂質(zhì)和流感膜蛋白。
如上述實(shí)施例1中所述，從A/巴拿馬/2007/99制備膜，并將其用于免疫如實(shí)施例2中所述的小鼠。血清中的ELISA IgG效價(jià)和鼻與肺中的IgA效價(jià)分別示于圖9和10中。這些數(shù)據(jù)表明N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-的賴氨酸和脯氨酸衍生物導(dǎo)致大約相當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答的增強(qiáng)。
表1特別適于制備本發(fā)明的重建病毒膜的脂質(zhì)

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權(quán)利要求
1.一種重建病毒膜，其脂雙層包含病毒融合蛋白、兩親性佐劑和任選地其它抗原，其中(a)所述脂雙層具有的脂質(zhì)組成適合于在所述病毒膜和一種細(xì)胞的膜之間發(fā)生由所述融合蛋白所誘導(dǎo)的融合，所述細(xì)胞可與所述融合蛋白所來源的病毒相融合；(b)所述融合蛋白和所述兩親性佐劑與所述脂雙層的疏水性內(nèi)部相互作用；和(c)所述融合蛋白、所述兩親性佐劑和任選的所述其它抗原不是共價(jià)連接的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重建病毒膜，其中所述脂雙層包含病毒膜的天然脂質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的重建病毒膜，其中所述兩親性佐劑是脂肽、糖脂或肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的重建病毒膜，其中所述兩親性佐劑是哺乳動(dòng)物Toll-樣受體的配體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的重建病毒膜，其中所述脂肽選自N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-絲氨酸、S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-絲氨酸、N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴氨酰)3-賴氨酸、S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴氨酰)3-賴氨酸、N-棕櫚酰-S-2，3(雙油酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴氨酰)3-賴氨酸、S-2，3(雙油酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-絲氨酸-(賴氨酰)3-賴氨酸、N-棕櫚酰-S-2，3(雙肉豆蔻酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴氨酰)3-賴氨酸、S-2，3(雙肉豆蔻酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴氨酰)3-賴氨酸、N-棕櫚酰-S-3(棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴氨酰)3-賴氨酸和N-棕櫚酰-S-2，3-羥基-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(賴氨酰)3-賴氨酸、N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(脯氨酰)3-脯氨酸、N-棕櫚酰-S-2，3(雙棕櫚酰氧基)-丙基-半胱氨酰-絲氨酰-(谷氨酰胺酰)3-谷氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的重建病毒膜，其中所述糖脂是磷脂酰肌醇甘露糖苷、α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺或經(jīng)修飾的毒性降低的脂多糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的重建病毒膜，其中所述抗原是膜內(nèi)在蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重建病毒膜，其中所述抗原是病毒抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的重建病毒膜，其中所述抗原來自流感病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的重建病毒膜，其中所述抗原是血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)或M2蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的重建病毒膜，其中所述抗原來自一種病毒，所述病毒選自逆轉(zhuǎn)錄病毒科、風(fēng)疹病毒、副粘病毒科、黃病毒科、皰疹病毒科、本揚(yáng)病毒科、沙粒病毒科、漢坦病毒科、冠狀病毒科、乳多空病毒科、彈狀病毒科、冠狀病毒科、甲病毒科、動(dòng)脈炎病毒科、纖狀病毒科、沙粒病毒科、痘病毒科和非洲豬熱病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重建病毒膜，其中所述抗原來自寄生蟲、細(xì)菌、真菌、酵母，或其中所述抗原是腫瘤特異性抗原。
13.一種制備重建病毒膜的方法，該方法包括如下步驟(a)將兩親性佐劑、病毒融合蛋白、任選的其它抗原和脂質(zhì)在含有去污劑的溶液中相混合；(b)在使得病毒膜重建的條件下降低去污劑的濃度，所述病毒膜包含一種脂雙層，其中所述兩親性佐劑和所述病毒融合蛋白與所述脂雙層疏水性內(nèi)部相互作用，其中所述兩親性佐劑和所述病毒融合蛋白不發(fā)生共價(jià)連接，其中所述兩親性佐劑和所述任選的其它抗原不發(fā)生共價(jià)連接，以及其中所述重建病毒膜具有膜融合活性；(c)任選地，純化所述重建病毒膜；和(d)任選地，將所述重建病毒膜配制成藥物組合物。
14.一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所定義的重建病毒膜和一種藥學(xué)上可接受的載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述組合物適于經(jīng)鼻內(nèi)、口服或腸胃外施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及疫苗，其針對(duì)抗原如病原體或腫瘤細(xì)胞的膜蛋白。本發(fā)明還涉及形成具有膜融合活性的重建病毒膜的方法，所述病毒膜是脂雙層，優(yōu)選地含有一種病毒的天然脂質(zhì)、一種病毒融合蛋白、一種或更多種任選的其它抗原以及兩親性佐劑。含有此類重建病毒膜的藥物組合物也是本發(fā)明的一部分。
文檔編號(hào)A61K39/135GK1805754SQ200480016758
公開日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2004年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者安東尼厄斯·約翰內(nèi)斯·亨德里克斯·斯特格曼, 揚(yáng)·克里斯蒂安·威爾舒特, 約翰內(nèi)斯·亨德里克斯·赫拉爾杜斯·范伯庫姆 申請(qǐng)人:貝斯特韋爾控股有限公司