專利名稱：通過控制下丘腦的長(zhǎng)鏈脂肪?；o酶A(LC－CoA)的水平來調(diào)控食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求美國(guó)的臨時(shí)申請(qǐng)No.60/447,138的優(yōu)先權(quán)，于2003年2月13日提交。
有關(guān)聯(lián)邦贊助的研究或開發(fā)的聲明美國(guó)政府擁有本發(fā)明的付費(fèi)許可和有限范圍的權(quán)利從而要求本發(fā)明的擁有者按照合理的條件許可給其他人，例如被國(guó)家健康協(xié)會(huì)授權(quán)的DK 48321，DK 45024，DK 20541，R01-45024和R01-48231所提供的條件。
背景技術(shù)：
(1)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及調(diào)控食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及通過控制下丘腦的脂類代謝來調(diào)控食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生。
(2)相關(guān)技術(shù)描述引用的文獻(xiàn)Ahima，R.S.，Prabakaran，D.，Mantzoros，C.，Qu，D.，Maratos-Flier，E.，& Flier，J.S.Role of Leptin in the Neuroendocrine Response to Fasting.Nature 382，250-252(1996).
Air，E.L.，et al.Small Molecule Insulin Mimetics Reduce Food Intake and BodyWeight and Prevent Development of Obesity.Nat.Med.8，179-83(2002).
Ausman，L.M.，Rasmussen，K.M.，and Gallina，D.L.Am.J.Physiol241，R316-R321(1981).
Barzilai，N.，Wang，J.，Massilon，D.，Vuguin，P.，Hawkins，M.，and Rossetti，L.J.Clin.Invest 100，3105-3110(1997).
Berthoud，H.R.and Jeanrenaud，B.Endocrinology 105，146-151(1979).
Birikh，K.R.，Heaton，P.A. & Eckstein，F(xiàn).the Structure，F(xiàn)unction and Application ofthe Hammerhead Ribozyme.Eur.J.Biochem.245，1-16(1997).
Blazquez，C.，Sanchez，C.，Daza，A.，Galve-Roperh，I. & Guzman，M.the Stimulationof Ketogenesis by Cannabinoids in Cultured Astrocytes Defines Carnitine PalmitoyltransferaseI as a New Ceramide-activated Enzyme.J.Neurochem.72，1759-1768(1999).
Boden，G.，Chen，X.，Ruiz，J.，White，J.V.，and Rossetti，L.J.Clin.Invest 93，2438-2446(1994).
Boussif，O.et al.A Versatile Vector for Gene and Oligonucleotide Transfer into Cellsin Culture and in VivoPolyethylenimine.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，7297-7301(1995).
Brief，D.J.and Davis，J.D.Brain Res.Bull.12，571-575(1984).
Bruning，J.C.，et al.Role of Brain Insulin Receptor in Control of Body Weight andReproduction.Science 289，2122-25(2000).
Cinti，S.，F(xiàn)rederich，R.C.，Zingaretti，M.C.，De Matteis，R.，F(xiàn)lier，J.S.，and Lowell，B.B.Endocrinology 138，797-804(1997).
Clore，J.N.，Helm，S.T.，and Blackard，W.G.J.Clin.Invest 96，1967-1972(1995).
Combs，T.P.，Berg，A.H.，Obici，S.，Scherer，P.E.，and Rossetti，L.J.Clin.Invest 108，1875-1881(2001).
Coleman，D.L.Diabetologia 14，141-148(1978).
Coleman，D.L.Science 203，663-665(1979).
Di Marzo，V.，et al.Leptin-regulated Endocannabinoids Are Involved in MaintainingFood Intake.Nature 410，822-825(2001).
Esser，V.，Britton，C.H.，Weis，B.C.，F(xiàn)oster，D.W. & McGarry，J.D.Cloning，Sequencing，and Expression of a cDNA Encoding Rat Liver Camitine Palmitoyltransferase I.Direct Evidence That a Single Polypeptide Is Involved in Inhibitor Interaction and CatalyticFunction.J.Biol.Chem.268，5817-5822(1993).
Flegal，K.M.，Carroll，M.D.，Ogden，C.L.，and Johnson，C.L.JAMA 288，1723-1727(2002).
Frederich，R.C.，Hamann，A.，Anderson，S.，Lollmann，B.，Lowell，B.B.，and Flier，J.S.Nat.Med.1，1311-1314(1995).
Friedman，J.M..Obesity in the New Millennium.Nature 404，632-634(2000).
Friedman，J.M.Science 299，856-858(2003).
Giaccari，A.and Rossetti，L.J.Chromatogr.497，69-78(1989).
Giaccari，A.and Rossetti，L.J.Clin.Invest 89，36-45(1992).
Goto M.，Spitzer J.J.Fatty Acids Profiles of Various Lipids in the Cerebrospinal Fluid.Proc.Exp.Biol.Med.136，1294-1296(1971).
Goula，D.et al.Size，Diffusibility and Transfection Performance of Linear PEI/DNAComplexes in the Mouse Central Nervous System.Gene Ther.5，712-717(1998).
Halaas，J.L.，Boozer，C.，Blair-West，J.，F(xiàn)idahusein，N.，Denton，D.A.，and Friedman，J.M.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94，8878-8883(1997).
Hall，J.E.，Brands，M.W.，Zappe，D.H.，Dixon，W.N.，Mizelle，H.L.，Reinhart，G.A.，and Hildebrandt，D.A.Hypertension 25，994-1002(1995).
Hawkins，M.，et al.Diabetes 51，2179-2189(2002).
Hill，J.O. & Peters，J.C.Environmental Contributions to Obesity.Science 280，1371(1998).
Kopelman，P.G. & Hitman，G.A.Diabetes.Exploding typeII.Lancet 352，SIV5(1998).
Kraegen，E.W.，Clark，P.W.，Jenkins，A.B.，Daley，E.A.，Chisholm，D.J.，andStorlien，L.H.Diabetes 40，1397-1403(1991).
Inoue，S.and Bray，G.A.Endocrinology 100，108-114(1977).
Kahn，B.B.and Flier，J.S.J.Clin.Invest 106，473-481(2000).
Kersten，S.EMBO Rep.2，282-286(2001).
Liu，et.al.Intraeerebroventricular(ICV)Leptin Regulates Hepatic but Not PeripheralGlucose Fluxes.J.Biol.Chem.273，31160(1998).
Loftus，T.M.，Jarkowsky，D.E.，F(xiàn)rehynot，G.L.，Towsend，C.A.，Ronnet，G.V.，LaneM.D.，Kuhajda，F(xiàn).P.Reduced Food Intake and Body Weight in Mice Treated with Fatty AcidSynthase Inhibitors.Science 288，2379(2000).
Lunzer，M.A.，Manning，J.A.，& Ockner，R.K.Inhibition of Rat Liver Acetyl-CoACarboxylase by Long-chain Acyl CoA and Fatty Acid.J.Biol.Chem.252，5283(1977).
Makimura，H.，Mizuno，T.M.，Yang，X.J.，Silverstein，J.，Beasley，J.，& Mobbs，C.V.Cerulenin Mimics Effects of Leptin on Metabolic Rate，F(xiàn)ood Intake，and Body WeightIndependent of the Melanocortin System，but Unlike Leptin，Cerulenin Fails to BlockNeuroendocrine Effects of Fasting.Diabetes 50，733-739(2001).
Massillon，D.，Chen，W.，Barzilai，N.，Prus-Wertheimer，D.，Hawkins，M.，Liu，R.，Taub，R.，and Miller，J.C.，Gnaedinger，J.M.，and Rapoport，S.I.J.Neurochem.49，1507-1514(1987).
Massillon，D.，Barzilai，N.，Chen，W.，Hu，M.，and Rossetti，L.J.Biol.Chem.271，9871-9874(1996).
Massillon，D.，Barzilai，N.，Hawkins，M.，Prus-Wertheimer，D.，and Rossetti，L.Diabetes 46，153-157(1997).
McGarry，G.D.，Mannaert，G.P.，F(xiàn)oster，D.W.A Possible Role for Malonyl-CoA in theRegulation of Hepatic Fatty Acid Oxidation and Ketogenesis.J.Clin.Invest.60，265-270(1977).
Miller，J.C.，Gnaedinger，J.M.，Rapaport，S.I.Utilization of Plasma Fatty Acid in RatBrainDistribution of[14C]Palmitate Between Oxidative and Synthetic Pathways.J.Neurochem.49，1507-1514(1987).
Morgan，K.，Obici，S.，F(xiàn)eng，Z.，& Rossetti，L.Central Effects of Oleic Acid onGlucose Production Are Nutritionally Regulated.Keystone Symposia Abstract Book，Keystone，Colorado，January 10-16，2002(2002).
Neel，J.V.Nutr.Rev.57，S2-S9(1999).
NHLBI(National Heart，Lung，and Blood Institute)Obesity Education Initiative.ThePractical Guide-Identification，Evaluation and Treatment of Overweight and Obesity inAdults.NIH Publication No.00-4084(2000).Obtainable athttp://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/obesity/prctgd_b.pdf.
Obici，S.，F(xiàn)eng，Z.，Tan，J.，Liu，L.，Karkanias，G.& Rossetti，L.Central MelanocortinReceptors Regulate Insulin Action.J.Clin.Invest.108，1079-1085(2001).
Obici，S.，F(xiàn)eng，Z.，Morgan，K.，Stein，D.，Karkanias，G.& Rossetti，L.CentralAdministration of Oleic Acid Inhibits Glucose Production and Food Intake.Diabetes 51，271-275(2002a).
Obici，S.，F(xiàn)eng，Z.，Karkanias，G.，Baskin，D.G.，and Rossetti，L.DecreasingHypothalamic Insulin Receptors Causes Hyperphagia and Insulin Resistance in Rats.Nat.Neurosci.5，566-572(2002b).
Obici，S.，F(xiàn)eng，Z.，Morgan，K.，Conti，R.，Arduini，A.，& Rossetti，L.Inhibition ofHypothalamic Carnitine Palmitoyltransferase I(CPT-1)Inhibits Glucose Production and FoodIntake.Keystone Symposia Abstract Book，Keystone，Colorado，January 10-16，2002(2002c).
Obici，S.，Wang，J.，Chowdury，R.，F(xiàn)eng，Z.，Siddhanta，U.，Morgan，K.，and Rossetti，L.J.Clin.Invest 109，1599-1605(2002d).
Obici，S.，Zhang，B.B.，Karkanias，G.，and Rossetti，L.Nat.Med.8，1376-1382(2002e).
Obici，S.，F(xiàn)eng，Z.，Karkanias，G.，Baskin，D.G.，and Rossetti，L.Nat.Neurosci.5，566-572(2002f).
Obici，S.，F(xiàn)eng，Z.，Arduini，A.，Conti，R.，and Rossetti，L.Nat.Med.9，756-761(2003).
Ogden，C.L.，F(xiàn)legal，K.M.，Carroll，M.D.，and Johnson，C.L.JAMA 288，1728-1732(2002).
Pagliassotti，M.J.，Gayles，E.C.，and Hill，J.O.Ann.N.Y.Acad.Sci.827，431-448(1997).
Palkovits M.Isolated Removal of Hypothalamic or Other Brain Nuclei of the Rat.Brain Research.59，449-450(1973).
Paxinos，G.，and Watson，C.The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.3rd Edition，Academic Press，CA，USA(1997).
Pitha，J.，Gerloczy，A.，and Olivi，A.J.Pharm.Sci.83，833-837(1994).
Porte，D.，Jr.，Seeley，R.J.，Woods，S.C.，Baskin，D.G.，F(xiàn)iglewicz，D.P.，andSchwartz，M.W.Diabetologia 41，863-881(1998).
Qi，K.，Hall，M.，and Deckelbaum，R.J.Curr.Opin.Clin.Nutr.Metab Care 5，133-138(2002).
Rajala，M.W.，Obici，S.，Scherer，P.E.，and Rossetti，L.J.Clin.Invest 111，225-230(2003).
Rapoport，S.I.Lipids 31 Suppl，S97-101(1996).
Rapoport，S.I.J.Mol.Neurosci.16，243-261(2001).
Ravussin，E.and Gautier，J.F.Int.J.Obes.Relat Metab Disord.23 Suppl 1，37-41(1999).
Rebrin，K.，Steil，G.M.，Getty，L.，and Bergman，R.N.Diabetes 44，1038-1045(1995).
Roden，M.，Price，T.B.，Perseghin，G.，Petersen，K.F.，Rothman，D.L.，Cline，G.W.，and Romsos，D.R.，Miller，E.R.，and Leveille，G.A.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.157，528-530(1978).
Rossetti，L.，Giaccari，A.，Barzilai，N.，Howard，K.，Sebel，G.，and Hu，M.J.Clin.Invest 92，1126-1134(1993).
Rossetti，L.，Barzilai，N.，Chen，W.，Harris，T.，Yang，D.，and Rogler，C.E.J.Biol.Chem.271，203-208(1996).
Rossetti，L.J.Biol.Chem.273，228-234(1998).
Schemmel， R.，Mickelsen，O.，and Gill，J.L.J.Nutr.100，1041-1048(1970).
Schwartz，M.W.，Seeley，R.J.，Campfield，L.A.，Burn，P.，and Baskin，D.G.J.Clin.Invest 98，1101-1106(1996a).
Schwartz，M.W.，Baskin，D.G.，Bukowski，T.R.，Kuijper，J.L.，F(xiàn)oster，D.，Lasser，G.，Prunkard，D.E.，Porte，D.，Jr.，Woods，S.C.，Seeley，R. J.，and Weigle，D.S.Diabetes 45，531-535(1996b).
Schwartz，M.W.，Woods，S.C.，Porte，D.Jr.，Seeley，R.J.，Baskin，D.G.CentralNervous System Control of Food Intake.Nature 404，661-671(2000).
Sclafani，A.and Springer，D.Physiol Behav.17，461-471(1976).
Shimazu，T.，Matsushita，H.，and Ishikawa，K Brain Res.144，343-352(1978).
Shimazu，T.Nutrition 12，65-66(1996).
Shimokawa，T.，Kumar，M.V.，& Lane，M.D.Effect of a Fatty Acid Synthase Inhibitoron Food Intake and Expression of Hypothalamic Neuropeptides.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99，66-71(2002).
Shimomura，I.，Hammer，R.E.，Ikemoto，S.，Brown，M.S.，and Goldstein，J.L.Nature401，73-76(1999).
Shulman，G.I.J.Clin.Invest 97，2859-2865(1996).
Spiegelman，B.M.and Flier，J.S.Cell 104，531-543(2001).
Thupari，J.N.，Landree，L.E.，Ronnett，G.V.，and Kuhajda，F(xiàn).P.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99，9498-9502(2002).
Wang，Q.，Bing，C.，Al Barazanji，K.，Mossakowaska，D.E.，Wang，X.M.，McBay，D.L.，Neville，W.A.，Taddayon，M.，Pickavance，L.，Dryden，S.，Thomas，M.E.，McHale，M.T.，Gloyer，I.S.，Wilson，S.，Buckingham，R.，Arch，J.R.，Trayhurn，P.，and Williams，G.Diabetes46，335-341(1997).
Wang，J.，Liu，R.，Hawkins，M.，Barzilai，N.，Rossetti，L.A Nutrient-sensing PathwayRegulates Leptin Gene Expression in Muscle and Fat.Nature 393，684-688(1998).
Wang，J.，Obici，S.，Morgan，K.，Barzilai，N.，F(xiàn)eng，Z.，and Rossetti，L.Diabetes 50，2786-2791(2001).
West，D.B.，Boozer，C.N.，Moody，D.L.，and Atkinson，R.L.Am.J.Physiol 262，R1025-R1032(1992).
West，D.B.，Waguespack，J.，and McCollister，S.Am.J.Physiol 268，R658-R665(1995).
Widdowson，P.S.，Upton，R.，Buckingham，R.，Arch，J.，and Williams，G.Diabetes 46，1782-1785(1997).
Woods，S.C.，Lotter，E.C.，McKay，D.L.，&Porte，D.Jr..ChronicIntracerebroventricular Infusion of Insulin Reduces Food Intake and Body Weight of Baboons.Nature.282，503-5(1979).
Woods，S.C.，Seeley，R.J.，Porte，D.，Jr.，and Schwartz，M.W.Science 280，1378-1383(1998).
Yaksh，T.L.，Jang，J.D.，Nishiuchi，Y.，Braun，K.P.，Ro，S.G.，and Goodman，M.LifeSci.48，623-633(1991).
Zammit，V.A.Regulation of Ketone Body Metabolism.A Cellular Perspective.Diabetes Rev.2，132-155(1994).
Zhang，Y.，Proenca，R.，Maffei，M.，Barone，M.，Leopold，L.，and Friedman，J.M.Nature 372，425-432(1994).
復(fù)雜的代謝性疾病例如肥胖和2型糖尿病是基因和環(huán)境之間的多種交互作用的結(jié)果(Hill和Peters，1998；Kopelman和Hitman，1998)。下丘腦的中心感覺外周營(yíng)養(yǎng)的存在，部分是通過多余的營(yíng)養(yǎng)引起的外周信號(hào)例如瘦素(Leptin)和胰島素(Woods等人，2000；Bruning等人，2000；Friedman，2000；Air等人，2002；S；chwartz等人，2000；Ahima等人，1996；Wang等人，1998)以及通過直接的代謝信號(hào)，例如，通過添加油酸到下丘腦(Loftus等人，2000；Obici等人，2002a；Makimura等人，2001；Shimokawa等人，2002)。在這點(diǎn)上，在選擇性的下丘腦神經(jīng)元中的脂類代謝已經(jīng)被假定為營(yíng)養(yǎng)存在的中樞生物傳感器，其反過來對(duì)食物攝取(Loftus等人，2000；Makimura等人，2001；Obici等人，2002a；Obici等人，2002c；Shimokawa等人，2002)以及體內(nèi)葡萄糖產(chǎn)生(GP)(Obici等人，2002a)施加一種負(fù)反饋。到目前為止這一理論還沒有被確定，以及現(xiàn)在有一些證據(jù)表明這種負(fù)反饋對(duì)于過量進(jìn)食的動(dòng)物是無效的(Morgan等人，2002)。
因此，這里需要進(jìn)一步說明下丘腦代謝信號(hào)的中樞機(jī)制。本發(fā)明滿足了這種需求。
發(fā)明概述因此，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物中食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生可以通過調(diào)控哺乳動(dòng)物下丘腦長(zhǎng)鏈脂肪?；?輔酶-A(LC-CoA)的水平來進(jìn)行調(diào)整。
因此，本發(fā)明涉及減少哺乳動(dòng)物中食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的方法。該方法包括增加下丘腦LC-CoA的水平。在這些方法中，哺乳動(dòng)物優(yōu)選具有至少一種選自以下的病癥肥胖、2型糖尿病、瘦素抗性、胰島素抗性、促性腺激素缺乏癥、無月經(jīng)和多囊卵巢綜合癥。
在另外的實(shí)施方式中，本申請(qǐng)涉及提高哺乳動(dòng)物中食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的方法。這種方法包括減少哺乳動(dòng)物下丘腦LC-CoA的水平。在這些方法中這種哺乳動(dòng)物優(yōu)選處于一種特征在于食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生缺乏的狀態(tài)下。
本發(fā)明另外涉及在肝臟自我調(diào)整功能不全的哺乳動(dòng)物體內(nèi)修復(fù)肝臟的自我調(diào)整功能的方法。這種方法包括增加哺乳動(dòng)物下丘腦中長(zhǎng)鏈脂肪酰基-輔酶-A(LC-CoA)的水平。
在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及減少哺乳動(dòng)物中食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的方法。這種方法包括刺激肝細(xì)胞迷走神經(jīng)傳出纖維。
本申請(qǐng)還涉及在肝臟自我調(diào)控功能不全的哺乳動(dòng)物中修復(fù)肝臟自我調(diào)整功能的方法。這種方法包括刺激一種肝細(xì)胞迷走神經(jīng)傳出纖維。
附圖簡(jiǎn)述

圖1所示的圖表，northern印跡，和圖形描述了與下丘腦肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1(CPT1)的抑制有關(guān)的脂類代謝和實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)。圖A顯示了一種被提議的CPT1在下丘腦中調(diào)控食物攝取作用的模型。有效的節(jié)食藥物例如脂肪酸合酶(FAS)抑制劑提高了丙二酰-輔酶A的水平，其得自于乙酰基-輔酶A羧化酶(ACC)對(duì)乙?；?輔酶A所進(jìn)行的羧化反應(yīng)。丙二酰-輔酶A的高水平反過來抑制依賴CPT1的長(zhǎng)鏈脂肪?；?輔酶-A(LC-CoA)的氧化反應(yīng)。類似的，外源脂肪酸(LCFA)的ICV施用直接提高了LC-CoA的細(xì)胞水平。在任一種情況下提高細(xì)胞內(nèi)LC-CoA濃度的結(jié)果導(dǎo)致了對(duì)進(jìn)食行為的抑制。圖B顯示了在整個(gè)大鼠下丘腦中CPT1表達(dá)的northern印跡分析。左邊CPT1的肝臟同種型(isoform)的特異探針(CPT1L)在肝臟中(L)和下丘腦(H)檢測(cè)到～4.3Kb的條帶，但是在后肢肌肉中沒有檢測(cè)到(M)。右邊與肌肉特異CPT1探針雜交后(CPT1M)在肝臟(L)和肌肉(M)中檢測(cè)到約3Kb的片段，但是下丘腦中沒有。每一泳道(lame)含有1.5μg的mRNA。圖C顯示為CPT1L mRNA選擇的核酶設(shè)計(jì)。CPT1L-Ribo轉(zhuǎn)錄子(更低的序列)包含一段中心序列其具有特征為錘頭狀核酶的基環(huán)結(jié)構(gòu)，兩側(cè)的序列可以與目標(biāo)CPT1L mRNA(上面的序列)進(jìn)行雜交。箭頭標(biāo)記了預(yù)測(cè)的切割位點(diǎn)。圖D顯示了CPT1L-Ribo質(zhì)粒的構(gòu)建。將CPT1L-Ribo片段克隆到在CMV啟動(dòng)子控制下的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中(pTarget)內(nèi)含子盒的下游以及SV40聚腺苷酸化信號(hào)(An)的上游。圖E顯示表達(dá)CPT1L-Ribo的AtT20細(xì)胞減少了CPT1L mRNA的水平。通過新霉素抗性選擇了大約200個(gè)穩(wěn)定的克隆選擇用于northern印跡的分析。每一條泳道含有1.0μg的來自僅僅利用載體(泳道A)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，CPT1L-Ribo質(zhì)粒(泳道B)轉(zhuǎn)染，或者沒有轉(zhuǎn)染的(泳道C)的AtT20的多聚腺苷酸化的mRNA。印跡點(diǎn)與CPT1L探針(上面的電泳圖)或者與β-肌動(dòng)蛋白(下面的電泳圖)進(jìn)行雜交。圖F顯示了AtT20northern印跡的量化分析。表達(dá)CPT1L-Ribo的細(xì)胞(■)與單獨(dú)用載體轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞(□)相比含有少于～50％的CPT1L mRNA。數(shù)據(jù)在利用β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化后用對(duì)照的％進(jìn)行表達(dá)。圖G顯示了CPT1抑制劑的系統(tǒng)施用增加了細(xì)胞內(nèi)LC-CoA的水平。利用HPLC測(cè)試到靜脈滴注對(duì)照(■)或CPT1抑制劑(□)的大鼠的肝臟和骨骼肌組織的LC-CoAs水平。
圖2所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)得到的圖表確定了遺傳學(xué)和藥理學(xué)上的CPT1抑制作用在弓狀核中降低了CPT1活性并提高了LC-CoAs水平。圖A顯示了一個(gè)試驗(yàn)步驟的示意圖。在第一天實(shí)現(xiàn)手術(shù)植入ICV套管(在進(jìn)行體內(nèi)研究前三周)。在第7天實(shí)現(xiàn)了體重和食物攝取的完全恢復(fù)。在第17天進(jìn)行隨機(jī)化核酶處理的大鼠接受CPT1L-Ribo，CPT抑制劑或?qū)φ盏腎CV注射。在第21天，在收獲大腦前6小時(shí)進(jìn)行TDGA處理的實(shí)驗(yàn)組接受抑制劑的ICV注射。圖B.和C.顯示了經(jīng)過實(shí)時(shí)PCR的CPT1L(B)和CPT1M(C)mRNA數(shù)量。RNA從個(gè)體的下丘腦核中(PVN，LHA，和弓狀核)進(jìn)行純化，其是在pTarget對(duì)照(■；N＝4)或CPT1L-Ribo(□；N＝5)ICV注射后3天利用微孔技術(shù)得到的。CPT1 mRNA的拷貝數(shù)利用β-肌動(dòng)蛋白拷貝數(shù)×106進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。圖D.和E.顯示了在個(gè)體的弓狀核(D)或整個(gè)下丘腦(E)中的CPT1活性。分別在TDGA或CPT1L-Ribo的ICV注射前6小時(shí)和3天進(jìn)行大腦的收獲，以及弓狀核被利用微孔技術(shù)取出。在從經(jīng)過ICV對(duì)照注射(■；N＝6，接受aCSF+2％DMSO或?qū)φ盏腞ibo)，TDGA( N＝6)或CPT1L-Ribo(□；N＝5)處理過的動(dòng)物提取的蛋白質(zhì)微部分中檢測(cè)CPT1活性。圖F和G確認(rèn)了CPT1抑制劑的ICV施用增加了弓狀核中的LC-CoAs水平。在利用對(duì)照化合物(■；ST134O)或ST1326(□)ICV注射的大鼠弓狀核中分別測(cè)定得到硬脂酰-CoA(F)和油酰-CoA(G)的水平。
圖3所示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)總結(jié)得到的圖表通過遺傳學(xué)或藥理學(xué)方法確認(rèn)了下丘腦CPT1L的抑制作用減少了食物攝取。圖A Sprague-Dawley大鼠在第0天接受單一的CPT1L-Ribo質(zhì)粒(□)或?qū)φ蛰d體(■)的ICV注射。在ICV注射CPT1L-Ribo后1～3天每日的食物攝取明顯被抑制。圖B顯示了由ICV CPT1L-Ribo(□)相比較于載體注射(■)引起的食物攝取的改變。與基值和載體相比檢測(cè)到了顯著的區(qū)別。圖C顯示了與載體對(duì)照(■)或核酶( )對(duì)照的ICV注射相比CPT1L-Ribo的ICV注射(□)對(duì)24小時(shí)食物攝取的影響。圖D顯示了在第0天進(jìn)行ST1326(分別為5pmoles， 和25pmoles，-●-)或者無活性的立體異構(gòu)體sT1340(-○-)的單次ICV注射后的每日食物攝取。ST1326的兩種劑量在第1天和第2天都產(chǎn)生了對(duì)食物攝取的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)重要性的抑制作用。在第3天，與對(duì)照組相比只有高劑量的ST1326顯著降低了食物攝取。圖E顯示了由ICV ST1326(分別為5pmoles， 和25pmoles，□)，或?qū)φ誗T1340(■)引起的食物攝取的改變。與基值和ST1340相比利用ICV ST1326檢測(cè)到顯著的區(qū)別。與對(duì)照組和基值進(jìn)行對(duì)比*P＜0.001。僅僅對(duì)于高劑量ST1326與賦形劑相比#P＜0.01。圖F顯示了利用ICV CPT1L-Ribo對(duì)CPT1L的下調(diào)增加了在ARC中NPY和AgRP的表達(dá)。利用實(shí)時(shí)PCR對(duì)經(jīng)過載體對(duì)照(■)或CPT1L-Ribo(□)處理的大鼠ARC中NPY和AgRP(上面的圖)和POMC(下面的圖)進(jìn)行定量分析。神經(jīng)肽mRNA水平利用每個(gè)β-肌動(dòng)蛋白拷貝數(shù)×103的形式來表達(dá)其拷貝數(shù)。
圖4所示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)總結(jié)得到的圖表確認(rèn)了下丘腦CPT1L的抑制作用改善了肝細(xì)胞胰島素作用但是沒有影響外周系統(tǒng)的胰島素作用。圖A顯示了實(shí)驗(yàn)步驟的示意圖。在第一天實(shí)現(xiàn)手術(shù)的植入ICV套管(在進(jìn)行體內(nèi)研究前-三周)。在完全的修復(fù)后，在第14天放入靜脈導(dǎo)管以及在第17天進(jìn)行CPT1L-Ribo或?qū)φ蛰d體的ICV注射。最后，在第21天進(jìn)行鉗夾研究。圖B顯示了胰腺的-胰島素鉗夾步驟的示意流程。滴注研究持續(xù)總共360min的時(shí)間。在鉗夾研究(如圖11所示)前3天以團(tuán)(bolus)注方式使大鼠得到CPT1L-Ribo或?qū)φ蛰d體。所有其他的組在t＝0時(shí)接受對(duì)照或CPT1抑制劑的預(yù)處理的-連續(xù)ICV注入，并在實(shí)驗(yàn)的剩余時(shí)間進(jìn)行保持。在t＝120時(shí)開始注入標(biāo)記的葡萄糖(HPLC-純化的[3H-3]-葡萄糖；New England Nuclear，Boston，MA)并維持到實(shí)驗(yàn)的最后4小時(shí)。最后，胰腺-胰島素鉗夾試驗(yàn)在t＝120時(shí)進(jìn)行并保持2小時(shí)。這個(gè)過程包括注入生長(zhǎng)激素抑制素(3μg/kg/min)，胰島素(1mU/kg/min)，和葡萄糖來防止低血糖癥的步驟。胰島素注入的速率被設(shè)計(jì)成替代吸收后大鼠中的正常的基礎(chǔ)水平。圖B，D和F顯示了與它們的適當(dāng)?shù)膶?duì)照進(jìn)行對(duì)比在用ICV TDGA，ST1326和CPT1L-Ribo處理過的大鼠中進(jìn)行胰腺-胰島素鉗夾試驗(yàn)之前(■)和過程中(□)的葡萄糖的處理速率(Rd)。Rd不是顯著的受到ICV處理的影響。圖C，E和G顯示了與它們的適當(dāng)?shù)膶?duì)照進(jìn)行對(duì)比在用ICV TDGA，ST1326和CPT1L-Ribo處理過的大鼠中進(jìn)行胰腺-胰島素鉗夾試驗(yàn)之前(■)和過程中(□)的葡萄糖的生產(chǎn)速率(GP)。在開始胰腺-胰島素鉗夾試驗(yàn)(■)之前GP在所有的處理組中都是相似的。在進(jìn)行胰腺的鉗夾試驗(yàn)過程中，在提供了～基礎(chǔ)的胰島素濃度時(shí)(□)，TDGA，ST1326和CPT1L-Ribo的ICV施用與單獨(dú)的ICV載體對(duì)照進(jìn)行對(duì)比顯著抑制了GP(p＜0.01)。圖H顯示了相應(yīng)于～基礎(chǔ)胰島素濃度時(shí)與它們各自的對(duì)照(aCSF+2％ DMSO，ST1340，對(duì)照載體)相比TDGA，ST1326和CPT1L-Ribo的施用可以顯著提高GP的抑制(％從吸收后水平所減少的)。
圖5是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的流程和圖的一個(gè)示意性的表述，其顯示在標(biāo)準(zhǔn)飼喂，高脂肪飲食，或高蔗糖飼喂的動(dòng)物的每日食物攝取方面ICV油酸(OA)的作用。圖a顯示了飼喂試驗(yàn)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意性表述。隨著從ICV植入手術(shù)中恢復(fù)，所有的大鼠允許自由進(jìn)食它們的標(biāo)準(zhǔn)正常飲食。在ICV注射前3天(-3天)，一組動(dòng)物被轉(zhuǎn)為喂養(yǎng)更美味的飼料(高脂肪或高蔗糖)同時(shí)另一組繼續(xù)保持標(biāo)準(zhǔn)的飲食。所有的組都可以自由進(jìn)食并且紀(jì)錄它們的每日食物攝取作為基值。在第0天，OA(30nmol)或者對(duì)照(HPB)都被作為ICV團(tuán)注射。在注射后對(duì)所有的組持續(xù)3天監(jiān)控其每日食物攝取。圖b顯示，在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)飲食的組中，ICV OA(●)迅速導(dǎo)致食欲減退的開始，并持續(xù)48小時(shí)。而ICV對(duì)照(▲)沒有顯著改變飲食行為。圖c顯示，在飼喂高脂肪飼料的動(dòng)物中，ICY OA(●)或者ICV對(duì)照(▲)都沒有顯著改變每日的食物攝取。圖d顯示，在飼喂高蔗糖飼料的動(dòng)物中，與ICV對(duì)照(▲)比較ICV OA(●)沒有顯著改變食物攝取。圖e顯示了在標(biāo)準(zhǔn)飼喂(■)，高蔗糖( )，或高脂肪飼喂(□)的動(dòng)物中ICV注射后的1，2和3天的每日食物攝取的改變，顯示的是從基值(-2，-1和0天的平均值)下降的百分比。ICV Office Action在標(biāo)準(zhǔn)飼喂的大鼠中連續(xù)兩天顯著地降低了食物攝取(以～50％)；但是，ICV OA對(duì)于接受高蔗糖或高脂肪飼喂的大鼠沒能顯著改變其進(jìn)食行為。數(shù)值是平均值±SEM的形式。對(duì)于對(duì)照*P＜0.001，對(duì)于對(duì)照**P＜0.0O01，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)食組#P≤0.05。
圖6是試驗(yàn)方案，試驗(yàn)結(jié)果的照片和圖形的示意性描述，其顯示了ICV OA對(duì)于下丘腦NPY表達(dá)的影響被營(yíng)養(yǎng)調(diào)控。圖a是對(duì)下丘腦NPY表達(dá)確定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意性表述。在進(jìn)行手術(shù)性ICV導(dǎo)管植入后10天并緊接著使所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完全的恢復(fù)，對(duì)大鼠飼喂高脂肪食物以55 kcal/d(55)或自由進(jìn)食(140)持續(xù)3天。在第13天，將OA(+在圖b；n=6/組)或者對(duì)照(-；n=6/組)以ICV團(tuán)注射的形式在暗循環(huán)開始前1小時(shí)注射進(jìn)去。ICV注射后，將食物撤回并在注射后16小時(shí)收集下丘腦。圖b顯示了下丘腦NPY mRNA的northern分析的代表性印跡的照片。這項(xiàng)分析證明了與ICV對(duì)照相比在向大鼠以55kcal/d的量飼喂ICV OA后下丘腦NPY mRNA的減少。但是，ICV OA沒有顯著改變自由進(jìn)食的大鼠的NPY mRNA。圖c顯示了利用密度計(jì)量學(xué)進(jìn)行的northern印跡分析的定量，其證明在以55 kcal/d的量進(jìn)行飼喂的動(dòng)物中與ICV對(duì)照(■)相比ICV油酸(□)顯著的降低了下丘腦的NPY表達(dá)。ICV OA沒能顯著改變自由進(jìn)食的動(dòng)物的NPY表達(dá)。圖d顯示的數(shù)據(jù)表示了在以55 kcal/d的量進(jìn)行飼喂或自由進(jìn)食的動(dòng)物中ICV賦形劑(左邊的柱)或自由進(jìn)食(右邊的柱)的動(dòng)物中與ICV對(duì)照相比ICV OA所引發(fā)的下丘腦NPY mRNA減少的百分?jǐn)?shù)。所有的數(shù)據(jù)用β-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)于55 kcal/d #P＜O.05。
圖7顯示了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表和方案，其說明了ICV OA對(duì)于全身胰島素活性的影響是受每日熱量攝取調(diào)控的。圖a是胰腺-胰島素鉗夾試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的示意性描述。在對(duì)飲食進(jìn)行干涉前至少2周進(jìn)行手術(shù)性ICV導(dǎo)管的植入從而提供充足的時(shí)間進(jìn)行恢復(fù)。相同地，血管內(nèi)導(dǎo)管的植入在干涉飲食前4天完成。在第0天，大鼠分別以55kcal/d，80 kcal/d或者自由進(jìn)食(～140 kcal/d)高脂肪飲食并持續(xù)3天。在鉗夾步驟進(jìn)行前的晚上，所有的大鼠進(jìn)行一次確定成分的進(jìn)食(55 kcal)以確保它們?cè)陂_始代謝實(shí)驗(yàn)前處在一種可比較的吸收后狀態(tài)。圖b顯示了胰腺-胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)步驟的示意圖。ICV OA或?qū)φ盏牡巫⒃趯?shí)驗(yàn)的開始進(jìn)行(t＝-120)并且持續(xù)貫穿整個(gè)鉗夾實(shí)驗(yàn)的全過程。在t＝0時(shí)注入標(biāo)記的葡萄糖并且一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束前的最后4小時(shí)。最后，在t＝120時(shí)開始生長(zhǎng)激素抑制劑和胰島素的注入并且持續(xù)2小時(shí)。注入25％的葡萄糖溶液以防止血漿中葡萄糖濃度出現(xiàn)任何的降低。圖c顯示了在胰腺-胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)中葡萄糖的注入速率(GIR)。在提供HPB(■)的ICV注射和～基礎(chǔ)胰島素濃度時(shí)，GIR對(duì)于所有的組是可以忽略的。但是，在進(jìn)行OA的ICV注射時(shí)(□)，在接受55和80 kcal/d的組中需要以～4.5和9mg/kg/min的速率注入外部葡萄糖以防止出現(xiàn)低血糖癥。在進(jìn)行自由進(jìn)食的組中(140)，在提供對(duì)照注射，低劑量(30nmol，□)和高劑量(300nmol， )OA注射時(shí)GIR小于2mg/kg/min。圖d顯示了在胰腺-胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)期間的葡萄糖消失速率(Rd)。在任意的實(shí)驗(yàn)組中Rd都沒有被ICV OA明顯影響。**P＝0.0001對(duì)于對(duì)照注射，*P＜0.03對(duì)于賦形劑注射。
圖8是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表，其顯示了ICV OA對(duì)肝的胰島素活性的影響是受每日熱量攝取控制的，其是體重增加和每日熱量攝取的函數(shù)。圖a顯示了葡萄糖產(chǎn)生速率(GP)。在提供基礎(chǔ)的胰島素濃度時(shí)，與相應(yīng)的對(duì)照(■)相比在55和80 kcal/d的組中OA的ICV施用(□)顯著的抑制了GP的速率。相比較而言，與對(duì)照和高OA的組相比ICV OA的低劑量(30nmol，□)和高劑量(300nmol， )都沒有顯著改變過量進(jìn)食大鼠的GP。圖b顯示了在ICV OA和賦形劑處理過程中GP的改變。GP的改變被表述為從基值的抑制％。在胰腺-胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)中與相應(yīng)的對(duì)照(■)相比在接受ICV OA注射后(□)接受55-或80kcal/d的大鼠表現(xiàn)出GP的顯著降低。但是，在自由進(jìn)食組中(140)，由30nmol(□)或300nmol( )的ICV OA所引起的GP改變與對(duì)照所導(dǎo)致的GP改變是相近的。**P＜0.001對(duì)于對(duì)照注射，*P＝0.05對(duì)于對(duì)照注射。圖c和d顯示了將由對(duì)照和OA引起的內(nèi)源葡萄糖產(chǎn)生的變化百分比相對(duì)于ICV注射前的3天中體重和每日食物攝取的下降百分比繪制得到的圖形。圖c顯示，在提供ICV OA時(shí)，GP的抑制百分比與體重的下降百分比直接相關(guān)。圖d顯示，在提供ICV OA時(shí)，GP的抑制百分比與每日熱量攝取的下降百分比直接相關(guān)。
圖9是示意圖，照片和圖表顯示了ICV OA對(duì)肝的葡萄糖變化和葡萄糖-6-磷酸酶/PEPCK基因表達(dá)的作用。圖a是肝臟葡萄糖變化的示意圖。GP代表葡糖基單元對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸鹽(葡萄糖-6-P)池的凈貢獻(xiàn)，其中所述葡糖基單元來自葡糖異生(主要是通過磷酸烯醇丙酸鹽，PEP)和糖原骨架。但是，一部分葡萄糖借助葡糖激酶(GK)的磷酸化作用進(jìn)入了肝臟同時(shí)也成為由葡萄糖-6-磷酸酶再次磷酸化的底物(G6Pase)。這個(gè)在葡糖激酶和葡萄糖-6-磷酸酶之間的耗能循環(huán)一般稱為葡萄糖消耗并且這也解釋了總葡萄糖產(chǎn)出(由葡萄糖-6-磷酸酶引起的變化)和GP之間的差異的原因。圖b顯示了與對(duì)照(■)相比ICV OA(□)對(duì)于接受55或者140 kcal/d的大鼠的總葡萄糖產(chǎn)出(體內(nèi)由葡萄糖-6-磷酸酶引起的變化)的作用。在熱量受限時(shí)ICV OA明顯抑制了總葡萄糖產(chǎn)出但是對(duì)于過量進(jìn)食的大鼠無效。圖c顯示了ICV OA對(duì)于接受55或者140 kcal/d的大鼠的總葡萄糖循環(huán)的作用。與對(duì)照(■)相比ICV OA(□)適當(dāng)?shù)牟⑼瑯拥臏p少了熱量受限和過量進(jìn)食的大鼠的葡萄糖循環(huán)。圖d顯示了在進(jìn)行ICV OA(+)或者對(duì)照(-)輸注前已經(jīng)以55或140kcal/d飼喂3天的動(dòng)物體內(nèi)葡糖異生酶葡萄糖-6-磷酸酶和PEPCK的northern分析的印跡照片。圖e顯示了通過密度計(jì)量學(xué)得到的葡萄糖-6-磷酸酶的northern印跡的量化分析。與ICV對(duì)照(■)相比在55kcal/d的動(dòng)物中ICV OA(□)顯著的降低了肝內(nèi)葡萄糖-6-磷酸酶的表達(dá)(以73％)但是不能顯著降低進(jìn)食140kcal/d組的酶的表達(dá)。圖f顯示了通過密度計(jì)量學(xué)得到的PEPCK的northern印跡的量化分析。與ICV對(duì)照(■)相比ICV OA(□)不能顯著降低以55kcal/d或140kcal/d進(jìn)食的動(dòng)物中PEPCK的表達(dá)。對(duì)于對(duì)照*P＜0.05。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明部分的基于發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物的食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生可以通過調(diào)控哺乳動(dòng)物下丘腦的長(zhǎng)鏈脂肪?；?輔酶-A(LC-CoA)的水平來進(jìn)行調(diào)節(jié)。參見實(shí)施例1和2。
因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及減少哺乳動(dòng)物中食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的方法。該方法包括增加哺乳動(dòng)物下丘腦的LC-CoA的水平。
如這里所使用的，LC-CoA是輔酶A的飽和或不飽和C14-C22酯。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這種LC-CoA是C16或C18并且是單不飽和的。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解這些方法可以有效地處理例如肥胖，2型糖尿病和胰島素抗性等病癥。因此，CPT1對(duì)于弓狀核中NPY和刺豚鼠-相關(guān)蛋白(AgRP)水平的抑制效果證明這些方法可以有效地處理瘦素抗性以及胰島素和瘦素抗性的效果，例如控制LH排放，無月經(jīng)和其它與促性腺激素缺乏有關(guān)的生殖功能紊亂，包括多囊卵巢綜合癥。
在這些方法的一些方面，這種LC-CoA通過減少下丘腦的一種LC-CoA-減少分子的活性而得到了增加。如這里所使用的，這種LC-CoA-減少分子是一種影響脂類代謝作用的分子，其可以抑制LC-CoA的產(chǎn)生或促進(jìn)LC-CoA的代謝。所包括的是酶和載體蛋白，現(xiàn)在已知的或之后發(fā)現(xiàn)的，其促使脂類代謝作用偏離LC-CoA的產(chǎn)生，或者指向LC-CoA的代謝。所述酶包括，但是不限于，直接代謝LC-CoA的酶。在這些實(shí)施例中包括的非限定性的酶的例子是肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)，丙二酰-輔酶A脫羧酶，肉堿?；鈮A移位酶，?；?輔酶A脫氫酶，2-烯?；?輔酶A水合酶，3-羥酰-輔酶A脫氫酶，3-氧酰-輔酶A硫解酶，和酰基-輔酶A水解酶。
如這里所使用的，對(duì)分子“減少活性”是指可以減少與LC-CoA的生產(chǎn)或代謝有關(guān)的預(yù)先存在的分子的活力(例如，酶活性或與配體例如LC-CoA的結(jié)合)，或者減少這種分子的數(shù)量，或者它們的結(jié)合。應(yīng)該可以理解這種分子的數(shù)量的減少可以通過提高這種分子的降解和除去速率和/或減少這種分子的生物合成來實(shí)現(xiàn)。相反的，“增加活性”的方法為增加這種與LC-CoA的生產(chǎn)或代謝有關(guān)的預(yù)先存在的分子的活力，或者增加這種分子的數(shù)量，或者它們的結(jié)合。這種分子的數(shù)量的增加可以通過減少這種分子的降解和除去速率和/或增加這種分子的生物合成和/或添加這種分子來實(shí)現(xiàn)。
還包括的LC-CoA-減少分子是小干擾RNAs(siRNAs)或者其它(例如，細(xì)胞因子和抑制劑)可以直接或間接抑制那些促進(jìn)LC-CoA生產(chǎn)或形成的酶的分子。眾所周知，siRNAs，細(xì)胞因子，抑制劑和其它分子可以在調(diào)節(jié)酶或載體蛋白生產(chǎn)或活性方面具有強(qiáng)大的作用。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，這種LC-CoA-減少分子是CPT1，考慮到這種酶是LC-CoA的β-氧化過程中的重要限速步驟。另外，已知這種CPT1在下丘腦和肝臟中的形式—肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶-1，肝臟同種型(CPT1L)與在肌肉中的CPT1(CPT1M)的形式不同，這使得可以使用CPT1L的抑制劑而對(duì)CPT1M并不起作用，因此限制了由這種方法所引起的副作用。發(fā)明人還已經(jīng)證明了降低下丘腦CPT1L活性在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。參見，例如，實(shí)施例1和2。無論如何，對(duì)于靶目標(biāo)CPT1L的效力強(qiáng)有力的證明了任意其它LC-CoA-減少分子的抑制作用同樣也可以預(yù)期在減少食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生中的作用。
在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，這種CPT1是CPT1L，以及處理選擇性地或特異地減少那種變體而非CPT1M的活性，從而將對(duì)CPT1M的抑制作用這一副作用最小化。
在一些實(shí)施方式中，這種LC-CoA-減少分子的活性可以通過向哺乳動(dòng)物大腦施用藥物組合物來降低。如這里所使用的，這種藥物組合物是一種組合物，其包括至少一種能降低LC-CoA-減少分子活性的小分子，以及藥物學(xué)可接受的賦形劑。如這里所使用的，“小分子”是小于大約2000MW的非低聚肽或低聚核苷酸的分子。低聚肽和低聚核苷酸分別是至少兩個(gè)肽或核苷酸的不分支的鏈。在這些實(shí)施方式中有用的小分子是任意LC-CoA-減少分子的抑制劑，包括ST1326和2-十四烷縮水甘油酸(TDGA)，CPT1的已知抑制劑。
在這些實(shí)施方式中，這種藥物組合物直接施用大腦以便小分子進(jìn)入下丘腦(例如，供藥到在第三腦室(ICV)中)，或者通過組合物的施用，其中小分子可以通過血腦屏障。這里，這種小分子可以自己通過血腦屏障，和/或依靠這種藥物組合物所提供的至少一種賦形劑的幫助來通過血腦屏障。
在其它的實(shí)施方式中，可以通過向哺乳動(dòng)物大腦(例如，ICV)施用抗體或包含抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。在這些實(shí)施方式中，這種抗體或者抗體片段可以結(jié)合LC-CoA-減少分子來抑制這種分子的活性。這里，這種抗體或者抗體片段不限于任何特定的形式(例如，多克隆，單克隆，F(xiàn)ab片段，等)或者由任何特定的方法制備(例如，從動(dòng)物或者動(dòng)物的雜交瘤細(xì)胞刺激和收獲抗體，或者通過例如噬菌體或重組酵母或細(xì)菌的重組方法來進(jìn)行生產(chǎn))。
也可以通過向哺乳動(dòng)物大腦中施用抑制作用的核酸或模擬體來降低這種LC-CoA-減少分子的活性。如這里所使用的，模擬體是人工化合物，就如現(xiàn)在已知的或隨后發(fā)現(xiàn)的，其表現(xiàn)近似于核酸具有和配對(duì)的核酸形成堿基對(duì)的能力。已知的模擬體的非限定性實(shí)施例包括肽核酸和硫代磷酸酯模擬體。
抑制作用的核酸或模擬體的例子包括核酶，反義化合物和siRNA，其可以結(jié)合目標(biāo)mRNA(反義)或者直接內(nèi)部代謝以降解這種mRNA(siRNA)，或者裂解mRNA(核酶)，防止翻譯成目標(biāo)蛋白。另一種抑制性核酸或模擬體的例子是適配子(aptamer)，其以與抗體或小分子抑制劑相似的方式結(jié)合和抑制目標(biāo)分子。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，抑制作用的核酸或模擬體是核酶(參見實(shí)施例1，提供了一種大鼠CPT1L-特異核酶)。這里L(fēng)C-CoA-減少分子是人CPT1L，在這些方法中所使用的核酶的一個(gè)例子包括序列5′-ACAGCACGCCGCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCACGUUCUUCGUC-3′(SEQ ID NO1)，其中粗體的序列是錘頭狀核酶的催化核心。
這種抑制作用的核酸優(yōu)選施用到哺乳動(dòng)物的大腦，最優(yōu)選施用到第三腦室?？蛇x擇的，可以施用編碼抑制作用的核酸的載體，其中這種載體編碼的抑制作用的核酸可操作的連接于控制元件例如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子或者終止子，以便這種抑制作用的核酸被合成并出現(xiàn)在下丘腦中。生產(chǎn)這種載體的方法是本領(lǐng)域所公知的。已知病毒載體(例如，慢病毒或腺病毒載體)特別適合用到這些實(shí)施方式中。
在這些方法的其它方面，可以通過提高下丘腦LC-CoA-增加分子的活性來增加LC-CoA。如這里所使用的，LC-CoA-增加分子是一種可以影響脂類代謝的分子，其具有提高LC-CoA產(chǎn)生或減少LC-CoA代謝的作用。包括酶或者載體蛋白，如已知的或隨后被發(fā)現(xiàn)的，其促使脂類代謝指向LC-CoA的合成，或者偏離LC-CoA的代謝。這種酶包括，但是不限于，直接產(chǎn)生LC-CoA的酶。在這些實(shí)施方式中非限定性的這種酶的實(shí)施例是乙酰-輔酶A羧化酶，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)分子，?；?輔酶A合成酶，肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶II，和?；?輔酶A硫酯酶。
在這些方法的一些實(shí)施方式中，可以通過向哺乳動(dòng)物大腦施用藥物組合物來增加這種LC-CoA-增加分子的活性，這種藥物組合物包括一種可以刺激LC-CoA-增加分子生產(chǎn)或提高其活性的小分子。
如在先前的實(shí)施方式中，這種藥物組合物可以直接施用到大腦以便這種小分子進(jìn)入下丘腦(例如，供藥到第三腦室(ICV)中)，或者施用一種組合物，其中的小分子可以通過血腦屏障。
在這些方法中也可以通過與一種藥物可接受的賦形劑配合使用向哺乳動(dòng)物施用這種分子從而使這種分子可以進(jìn)入下丘腦從而提高這種LC-CoA-增加分子的活性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這種分子直接施用到哺乳動(dòng)物大腦下丘腦的附近(例如，進(jìn)入第三腦室)。
可以選擇的，在這些方法中可以通過與一種藥物可接受的載體一起將編碼這種分子的載體施用哺乳動(dòng)物從而使這種載體可以進(jìn)入下丘腦并且在那里進(jìn)行這種分子的生產(chǎn)來提高LC-CoA-增加分子的活性。如前面的實(shí)施方式，編碼分子的載體的一部分優(yōu)選可操作性的連接到控制元件上從而可以在下丘腦中直接從載體進(jìn)行這種分子的生產(chǎn)。
在這些方法的另外方面，這種LC-CoA的增加可以通過直接向哺乳動(dòng)物大腦施用LC-CoA來實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選第3腦室。
上述方法可以有效地減少任意哺乳動(dòng)物的食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生，包括嚙齒類和人類。
這些方法特別可以用于處理2型糖尿病和肥胖癥。推想其可以處理任何程度的肥胖癥。優(yōu)選，這種哺乳動(dòng)物超過標(biāo)準(zhǔn)體重至少5％。在另一個(gè)實(shí)施方式中，這種哺乳動(dòng)物超過標(biāo)準(zhǔn)體重至少20％。如這里所使用的，人類標(biāo)準(zhǔn)體重被定義為BMI指數(shù)18.5-24.9Kg/米2(NHLBI，2000)。在這里BMI指數(shù)超過24.9Kg/米2被認(rèn)為是肥胖的。
這些方法預(yù)期可以減少食物攝取至少5％，雖然減少食物攝取至少10％，20％，30％，或40％也同樣不是不可以預(yù)期的。
本發(fā)明另外涉及對(duì)那些處在食物攝取或葡萄糖產(chǎn)生不足狀態(tài)下的哺乳動(dòng)物增加其食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的方法。該方法包括減少哺乳動(dòng)物下丘腦長(zhǎng)鏈脂肪?；?輔酶A(LC-CoA)水平。
這些方法可以應(yīng)用于任意需要使哺乳動(dòng)物增加其食物攝取或葡萄糖產(chǎn)生的情形。這種情形的例子是當(dāng)這種哺乳動(dòng)物進(jìn)行一種導(dǎo)致食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生不足的處理時(shí)，例如癌癥化學(xué)療法，或者當(dāng)這種哺乳動(dòng)物被感染時(shí)，例如病毒感染(例如，HIV-1感染)，其導(dǎo)致食物攝取或葡萄糖產(chǎn)生的不足。這種方法對(duì)于血糖低的哺乳動(dòng)物也是有效的。
在這些實(shí)施方式的一些方面，可以通過減少下丘腦中LC-CoA-增加分子(例如，乙酰-輔酶A羧化酶，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)分子，?；?輔酶A合成酶，肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶II，和?；?輔酶A硫酯酶)活性來降低LC-CoA水平。如前面所討論的，這種分子活性可以被降低的方法的例子是(a)向哺乳動(dòng)物大腦施用藥物組合物，其中這種藥物組合物包括可以抑制LC-CoA-減少分子活性的小分子；(b)向哺乳動(dòng)物的大腦施用抗體或包含抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，其中這種抗體或者抗體片段可以結(jié)合LC-CoA-增加分子從而抑制這種分子的活性；和/或(c)向哺乳動(dòng)物施用抑制作用的核酸或模擬體(例如，核酶，反義化合物，適配子或者iRNA)。
在這些實(shí)施方式的其它方面，可以通過提高下丘腦中LC-CoA-減少分子(例如，肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1(CPT1)，丙二酰-輔酶A脫羧酶，肉堿酰基肉堿移位酶，?；?輔酶A脫氫酶，2-烯?；?輔酶A水合酶，3-羥酰-輔酶A脫氫酶，3-氧酰-輔酶A硫解酶，和?；?輔酶A水解酶)活性來減少LC-CoA的水平。如前面所討論，可以增加分子活性的方法的例子是(a)通過對(duì)哺乳動(dòng)物施用一種藥物組合物，該藥物組合物包括一種可以增加LC-輔酶A-增加分子活性的小分子；(b)向下丘腦施用該分子，和(c)向下丘腦施用編碼該分子的載體。
這些方法可用于增加任意哺乳動(dòng)物的食物攝入和葡萄糖產(chǎn)生，尤其是嚙齒類或者人類。在一些具體實(shí)施方式
中，這種哺乳動(dòng)物至少低于正常體重10％或者20％。
這些方法期望可以提高哺乳動(dòng)物食物攝入量至少5％，10％，20％，30％，或者40％。
發(fā)明者還成功的發(fā)現(xiàn)肝臟的自我調(diào)節(jié)可以通過下丘腦LC-CoA水平來進(jìn)行調(diào)節(jié)。參見實(shí)例4。因而，在一些具體實(shí)施方式
，本發(fā)明涉及對(duì)肝自我調(diào)節(jié)不全的哺乳動(dòng)物恢復(fù)肝臟自我調(diào)節(jié)功能的方法。該方法包括提高哺乳動(dòng)物下丘腦LC-CoA水平。
如這里所使用的，“肝臟自我調(diào)節(jié)”描述了一種現(xiàn)象，在提供基礎(chǔ)胰島素水平時(shí)，通過脂類注射刺激葡糖異生來增加游離脂肪酸的循環(huán)水平但是由于肝臟肝糖分解的代償性降低使內(nèi)生的葡萄糖產(chǎn)生并沒有改變。在糖尿病中，由于高血糖這種現(xiàn)象可以功能障礙(參見，例如，Hawkins等人，2002)。
在這些實(shí)施方式中，可以通過前面的實(shí)施方式所描述的方法來增加下丘腦的LC-CoA水平，例如，通過減少下丘腦LC-CoA-減少分子的活性，例如，這里L(fēng)C-CoA-減少分子是CPT1，特別是CPT1L，例如通過向哺乳動(dòng)物大腦施用一種藥物組合物，這種藥物組合物包含一種能夠減少LC-CoA-減少分子活性的小分子，通過向哺乳動(dòng)物大腦施用抗體或包含抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，其中這種抗體或者抗體片段可以結(jié)合到LC-CoA-減少分子從而抑制這種分子的活性；通過向哺乳動(dòng)物的大腦施用抑制性核酸或者模擬體(例如，核酶)。在這些實(shí)施方式中也可以通過增加下丘腦LC-Co-A-減少分子的活性來增加LC-CoA水平，如上面所描述的，或者通過直接向大腦施用LC-CoA。同樣類似于前面的具體實(shí)施方式
，這些方法可以用于任意的哺乳動(dòng)物，例如嚙齒類或人類，特別是患有糖尿病的哺乳動(dòng)物。
另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)下丘腦LC-CoA的增加通過刺激肝臟迷走神經(jīng)傳出纖維引起食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的減少。參見實(shí)施例4。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解通過刺激肝臟迷走神經(jīng)傳出纖維可以減少食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物中減少食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的方法。這種方法包括刺激哺乳動(dòng)物中的肝臟迷走神經(jīng)傳出纖維。在這些實(shí)施方式中，這種哺乳動(dòng)物具有至少一種選自以下的病癥肥胖，2型糖尿病，瘦素抗性，胰島素抗性，促性腺激素缺乏癥，無月經(jīng)，和多囊卵巢綜合癥。
在本領(lǐng)域中迷走神經(jīng)也被稱為副交感神經(jīng)系統(tǒng)以及其分支，和膽堿能神經(jīng)。肝臟迷走神經(jīng)傳出纖維可以利用本領(lǐng)域所公知的任何方法進(jìn)行刺激。非限定性實(shí)施例包括機(jī)械方法例如針刺，超聲波，或振動(dòng)；任何電磁放射例如紅外，可見或紫外光；加熱，或任何其它能量源。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，迷走神經(jīng)是進(jìn)行電刺激的，使用例如一種商業(yè)的迷走神經(jīng)刺激器比如Cyberonics NCP，或者電探針。對(duì)傳出的迷走神經(jīng)進(jìn)行刺激可以通過刺激整個(gè)的迷走神經(jīng)(也就是，傳入的以及傳出的神經(jīng))，或者直接單獨(dú)的刺激傳出的迷走神經(jīng)。下面的方法的實(shí)施需要在兩種神經(jīng)都存在的地方把傳入的迷走神經(jīng)從傳出的迷走神經(jīng)中分離出來?？蛇x擇的，肝臟傳出神經(jīng)纖維在沒有傳入神經(jīng)纖維的地方進(jìn)行刺激，例如在接近肝臟的地方。這種傳出神經(jīng)纖維的刺激也可以通過直接刺激肝臟來實(shí)現(xiàn)，例如，利用電，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)為肝臟服務(wù)的傳出神經(jīng)纖維的刺激。這種迷走神經(jīng)也可以被切斷從而對(duì)末梢進(jìn)行刺激，因此僅僅刺激傳出神經(jīng)纖維。
抑制食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的這種刺激的數(shù)量對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員無需復(fù)雜的試驗(yàn)就可以確定。一種被認(rèn)為是迷走神經(jīng)刺激方法的電刺激的例子是1至5V的恒壓刺激，在2ms和1Hz，持續(xù)10分鐘。
在相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在肝臟自我調(diào)節(jié)功能不全的哺乳動(dòng)物中進(jìn)行肝臟自我調(diào)節(jié)功能的恢復(fù)。方法包括刺激迷走神經(jīng)傳出纖維。這些刺激肝臟迷走神經(jīng)傳出纖維的方法就像上面剛剛介紹的有關(guān)減少食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的實(shí)施方式一樣。
在下面的實(shí)施例中對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述。對(duì)于本領(lǐng)域的一名技術(shù)人員在考慮到本發(fā)明說明書或這里所描述的本發(fā)明實(shí)踐后很明顯的可以得到這里權(quán)利要求范圍所包括的其它實(shí)施方式。這意味著說明書，以及這些實(shí)施例，僅僅應(yīng)該被看作是示例性的，在下面的實(shí)施例后面的權(quán)利要求顯示了本發(fā)明的范圍和精神。
實(shí)施例1.抑制下丘腦肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶-1以減少食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生實(shí)施例概要肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶-1這種酶控制長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體，這些長(zhǎng)鏈脂肪酸將在線粒體中進(jìn)行β-氧化。為了檢驗(yàn)脂類中心代謝可以調(diào)控能量平衡的新的機(jī)理，我們目的在于選擇性的降低下丘腦的脂類氧化。為了這個(gè)目的，通過向第三腦室施用包含核酶的設(shè)計(jì)用來特異性降低肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶-1表達(dá)的質(zhì)?；蛘呦虻谌X室注射這種酶活性的藥理學(xué)抑制劑來減少這種肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶-1的活性。對(duì)下丘腦肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶-1活性的基因?qū)W和生化學(xué)的抑制方法都可以充分的顯著減少食物攝取和內(nèi)部的葡萄糖產(chǎn)生。這些結(jié)果顯示在所選擇的下丘腦神經(jīng)元改變脂類氧化速率將向下丘腦發(fā)送營(yíng)養(yǎng)可用的信號(hào)，其反過來調(diào)整循環(huán)中內(nèi)源和外源的營(yíng)養(yǎng)輸入。
引言該實(shí)施例通過檢驗(yàn)下丘腦脂類氧化的作用描述了涉及負(fù)責(zé)脂類依賴信號(hào)的機(jī)制的試驗(yàn)結(jié)果。這種酶，肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶-1(CPT1)，調(diào)控長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體，它們將在線粒體進(jìn)行β-氧化(McGarry等人，1977；Zammit，1994)。兩個(gè)觀察結(jié)果驅(qū)使我們注意下丘腦CPT1的可能作用a)脂肪酸合酶(FAS)抑制劑對(duì)于食物攝取的抑制效果要求丙二酰-CoA-CPT-1活性的有效抑制劑的水平增加(Loftus等人，2000)(圖1a)；以及b)運(yùn)送到第三腦室的長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)油酸對(duì)于食物攝取和GP的抑制效果并沒有被與之等摩爾的施用量的辛酸(一種短鏈脂肪酸，無需CPT1就可以進(jìn)入線粒體)所重復(fù)(Obici等人，2002a)?；谶@些早前的發(fā)現(xiàn)我們推測(cè)在神經(jīng)元中LC-CoA水平的增加是一個(gè)下丘腦的有關(guān)營(yíng)養(yǎng)存在的信號(hào)?？梢酝ㄟ^LCFAs(例如油酸)的ICV施用(Id.)或者通過增加丙二酰-CoA的水平來抑制LC-CoA進(jìn)入線粒體(Loftus等人，2000)來實(shí)現(xiàn)這種LC-CoA水平的增加。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)我們需要知道是否下丘腦的CPT-1活性的顯著降低足以抑制進(jìn)食行為和GP。
結(jié)果CPT1抑制的分子學(xué)和藥理學(xué)方法。為了抑制Lc-CoAs進(jìn)入線粒體，我們繼續(xù)進(jìn)行藥理學(xué)和分子學(xué)的研究。我們首先通過northern印跡分析證明了下丘腦CPT1的普遍形式是肝臟的同種型(CPT1L)而不是肌肉的同種型(CPT1M)(圖1b)。因此我們?cè)O(shè)計(jì)了一種特異性裂解CPT1L mRNA的核酶(CPT1L-Ribo；圖1c)并且將其引入到一種哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中(圖1d)。然后我們?cè)诜€(wěn)定的轉(zhuǎn)染AtT20細(xì)胞中檢測(cè)這種構(gòu)建體減少CPT1L表達(dá)的能力(圖1e和1f)。我們還證明系統(tǒng)輸注CPT1抑制劑可以顯著增加肝臟和骨骼肌中LC-CoAs的濃度(圖1g)。因此，我們確定了CPT1L-Ribo減少哺乳動(dòng)物細(xì)胞CPT1表達(dá)的作用并且提供了證據(jù)證明從本質(zhì)上抑制CPT1活性足以增加LC-CoAs的組織濃度。
基于這些結(jié)果，CPT1活性的兩個(gè)特異抑制劑，ST1326和2-十四烷縮水甘油酸(TDGA)，或者CPT1L-Ribo被ICV輸注到有知覺的大鼠中以在其下丘腦減少CPT1活性和增加LC-CoAs。與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比(表1)在每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中大鼠的基礎(chǔ)anthropometrical和生化學(xué)特性都是相似的。很顯然，在培養(yǎng)3天后與配對(duì)培養(yǎng)的對(duì)照組相比利用CPT1L-Ribo進(jìn)行ICV處理的大鼠出現(xiàn)了低禁食血漿胰島素和瘦素水平的趨勢(shì)(表1)。
表1

通過在試驗(yàn)過程中測(cè)試至少4組血漿樣品得到鉗夾實(shí)驗(yàn)中代表穩(wěn)定水平的數(shù)值。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，載體組的食物攝取和CPT1L-Ribo組是相當(dāng)?shù)?。在急性ICV輸注測(cè)試樣品前進(jìn)行在剩下其它實(shí)驗(yàn)組的食物攝取的測(cè)定。
通過立體定向外科手術(shù)將ICV導(dǎo)管植入雄性Sprague-Dawley大鼠中(Obici等人，2002a；Obici等人，2001；Liu等人，1998)。從手術(shù)完全恢復(fù)后3周(圖2a)，進(jìn)行生物學(xué)或分子分析，代謝或飼喂試驗(yàn)。在試驗(yàn)前3天進(jìn)行CPT1L-Ribo的ICV運(yùn)送(圖2a)。將CPT1抑制劑或賦形劑(CON)通過快速的注射或緩慢的6小時(shí)的ICV輸注運(yùn)送到插入導(dǎo)管的Sprague Dawley大鼠中(Obici等人，2002a；Obici等人，2001)(圖2a)。我們首先測(cè)試CPT1L-Ribo對(duì)于通過微穿孔技術(shù)選擇的下丘腦核樣品中CPT1L(圖2b)和CPT1M(圖2c)mRNA水平的影響。利用定量的實(shí)時(shí)PCR(調(diào)整為β-肌動(dòng)蛋白的拷貝數(shù))我們證明了在弓狀核(ARC)中CPT1L mRNA顯著降低，但是并沒有出現(xiàn)在下丘腦的更多的側(cè)區(qū)，例如室旁核(PVN)或者下丘腦側(cè)核(LHA)。相反的，CPT1M mRNA表現(xiàn)出更低的水平特別是在ARC中并且CPT1L-Ribo對(duì)其表達(dá)沒有任何改變。如果這種CPT1L mRNA的顯著降低具有重要的生物學(xué)作用，它也應(yīng)該導(dǎo)致ARC中CPT1活性的降低。因此，接下來我們測(cè)試了在ARC中和在整個(gè)下丘腦的CPT1活性。ICV施用CPT1L-Ribo后在ARC中而不是整個(gè)下丘腦發(fā)現(xiàn)了CPT1活性的顯著降低(圖2e)，與從CPT1L mRNA觀察到的選擇性效果是相同的(圖2b)。我們也驗(yàn)證了不可逆的CPT1抑制劑TDGA對(duì)于ARC(圖2d)和整個(gè)下丘腦(圖2e)中CPT1活性的影響。最后，我們目的在于驗(yàn)證這種假設(shè)即CPT1活性抑制劑的ICV施用可以增加ARC中的LC-CoAs。為了這個(gè)目的我們使用了可逆的CPT1L抑制劑ST1326并以其無活性立體異構(gòu)體ST1340作為對(duì)照。ST1326的ICV施用導(dǎo)致了ARC中硬脂酰-CoA(圖2f)和油酰-CoA(圖2g)水平的顯著增加但是在PVN和LHA中沒有出現(xiàn)。通過ST1326的ICV施用其它的LA-CoAs(沒有顯示)也明顯增加了。因此，ICV運(yùn)送CPT1的分子學(xué)的和藥物學(xué)的抑制劑有效地降低了ARC中的CPT1活性并且CPT1L活性的抑制顯著的增加了特定的LC-CoAs的濃度?；谝陨线@些發(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)了兩套試驗(yàn)來檢測(cè)下丘腦中CPT1活性的抑制作用對(duì)于進(jìn)食行為和胰島素作用的效果。
對(duì)下丘腦CPT1的抑制減少了食物攝取。首先我們?cè)囼?yàn)是否中樞施用CPT1的分子學(xué)或藥物學(xué)上的抑制劑可以調(diào)控有知覺大鼠的進(jìn)食行為(圖3)。為了這個(gè)目的，在暗循環(huán)開始前3小時(shí)對(duì)成對(duì)的大鼠組通過內(nèi)置的ICV導(dǎo)管接受對(duì)照載體或CPT1L-Ribo，或者ST1340-ST1326的一種無活性立體異構(gòu)體，或者CPT1L抑制劑(ST1326)的團(tuán)注。在代謝籠中監(jiān)控ICV注射前直到注射后72小時(shí)大鼠的食物攝取情況(Obici等人，2002a)。通過CPT1L-Ribo的ICV注射產(chǎn)生的ARC中CPT1L表達(dá)和活性的這種選擇性的降低(圖2b和2d)迅速導(dǎo)致了厭食的開始(圖3a-c)在ICV施用開始后的第一個(gè)晚上(平均食物攝取13.0±1.9對(duì)23.0±3.2gr./天；p＜0.01)。當(dāng)與對(duì)照載體或者不相關(guān)的核酶進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)CPT1L-Ribo的ICV施用對(duì)于食物攝取的顯著作用是非常明顯的(圖3c)。相似的，一種CPT1L的有效的和特異的抑制劑(ST1326)的快速ICV注射顯著的抑制了大鼠的食物攝取而無活性的立體異構(gòu)體(ST1340)則不能改變進(jìn)食行為(圖3d，e)。這種由中樞CPT1抑制作用引起的厭食行為在單一的ICV施用后持續(xù)了至少48小時(shí)。這些食物攝取的降低與基值和賦形劑/載體相比是非常明顯的(圖3a-e)。這種由CPT1抑制作用引起的從基值的改變?cè)诜謩e中樞ICV注射CP1L-Ribo和高劑量ST1326后的24小時(shí)(-17.6±2.0g和-12.4±3.9g)和48小時(shí)(-13.4±1.8g和-7.8±3.8g)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖3b和e)。其顯示每日食物攝取減少了～50％，經(jīng)過72小時(shí)返回到基值。
為了開始研究ARC中CPT1抑制的厭食特性的相關(guān)機(jī)制，我們接下來分析了CPT1L-Ribo對(duì)于主要ARC肽基因表達(dá)的影響。經(jīng)過實(shí)時(shí)PCR的定量分析顯示與對(duì)照-Ribo相比經(jīng)過ICV CPT1L-Ribo處理的大鼠的ARC中AgRP和NPY mRNA顯著降低(圖3f)。相反的，ARC中POMC的表達(dá)沒有被CPT1L-Ribo的施用所顯著影響(圖3f)。總的來說，這些厭食行為支持了這樣一個(gè)觀點(diǎn)即在神經(jīng)元中LC-CoAs水平的改變通過它們對(duì)離散的下丘腦中心的作用可以直接控制食物攝取。此外，在選擇的下丘腦神經(jīng)元中LC-CoAs水平的增加可能可以說明油酸和FAS抑制劑對(duì)食物攝取的有效作用(Loftus等人，2000；Obici等人，2002a；Makimura等人，2001；Shimokawa等人，2002)。
對(duì)下丘腦CPT1的抑制減少了葡萄糖產(chǎn)生。試驗(yàn)也被設(shè)計(jì)成檢測(cè)CPT-1的中樞抑制作用對(duì)于整體胰島素作用的影響(圖4a，b)。胰島素作用是通過ICV輸注和系統(tǒng)的胰腺-胰島素鉗夾試驗(yàn)結(jié)合來進(jìn)行測(cè)定的(圖4b)。在這些實(shí)驗(yàn)中，比較接受了ICV載體和ICV PT1L-Ribo的大鼠的每日食物攝取(表1)。所有的大鼠都在ICV注射最后4小時(shí)接受了主動(dòng)脈[3-3H]-葡萄糖的注射(Obici等人，2002a；Obici等人，2001)和在每項(xiàng)研究的最后2小時(shí)進(jìn)行胰腺/胰島素鉗夾(胰島素1mU/kg.min；生長(zhǎng)激素抑制素3μg/kg/min)試驗(yàn)。如所期望的在提供～基礎(chǔ)循環(huán)胰島素水平(鉗夾步驟；表1)時(shí)，需要保持正常血糖的葡萄糖的注射速率(GIR)在ICV對(duì)比試驗(yàn)的邊緣(marginal)(載體-ST1340-或者賦形劑-注射的動(dòng)物；～0.8mg/kg/min)。通過對(duì)比，經(jīng)過CPT-1表達(dá)和活性的抑制劑的ICV注射后以～5mg/kg/min的速率進(jìn)行葡萄糖的注射以防止出現(xiàn)低血糖癥。因此，在提供確定的和基礎(chǔ)的胰島素濃度時(shí)CPT-1的中樞抑制作用刺激胰島素維持葡萄糖平衡的作用。
我們接下來測(cè)試潛在的有關(guān)ICV施用CPT-1拮抗劑可以提高整體胰島素作用的機(jī)理。我們采用痕量稀釋方法學(xué)測(cè)定葡萄糖動(dòng)力學(xué)(Obici等人，2002a；Obici等人，2001)從而確定由CPT1的中樞拮抗劑引起的GIR的增加是否是由于葡萄糖攝取的刺激或內(nèi)部葡萄糖產(chǎn)生(GP)的抑制。葡萄糖的吸收速率沒有被ICV處理所顯著的影響(圖4c，e，g)。相反的，在提供基礎(chǔ)的和相等的胰島素水平時(shí)(～20μU/ml)，通過ICV注射CPT1L-Ribo(以30±3％；n＝5)，ST1326(以44±7％；n＝8)，和TDGA(以47±6％；n＝7)GP被顯著的和明顯的降低(圖4d，f，人)。這些葡萄糖輸出的降低完全說明了CPT-1的中樞抑制作用對(duì)整體葡萄糖代謝的影響。
討論在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們總結(jié)得出對(duì)CPT1活性的中樞抑制足以顯著的抑制食物攝取和內(nèi)源葡萄糖產(chǎn)生。此外，我們認(rèn)為CPT1活性的中樞抑制導(dǎo)致在選擇的下丘腦神經(jīng)元中LC-CoA水平的增加。這種增加代表一個(gè)重要的信號(hào)“營(yíng)養(yǎng)充足”，其反過來激活一系列的神經(jīng)傳導(dǎo)用來促進(jìn)從碳水化合物到脂類的能量源轉(zhuǎn)換從而限制進(jìn)一步的外在的和內(nèi)生的營(yíng)養(yǎng)進(jìn)入循環(huán)中。
再與中樞運(yùn)送長(zhǎng)鏈脂肪酸油酸和FAS抑制劑的有效作用結(jié)合在一起(Loftus等人，2000；Obici等人，2002a；Makimura等人，2001；Shimokawa等人，2002)，目前的發(fā)現(xiàn)證明這樣一個(gè)觀點(diǎn)即在下丘腦神經(jīng)元中細(xì)胞內(nèi)LC-CoAs水平的增加是可用營(yíng)養(yǎng)增加的一個(gè)重要傳感器(圖1a)。其反過來刺激涉及調(diào)整能量動(dòng)態(tài)平衡和肝臟內(nèi)胰島素作用的中樞神經(jīng)元途徑。既然肝臟的葡萄糖產(chǎn)生是內(nèi)源能量的主要來源，中樞神經(jīng)元回路伴隨著調(diào)控外源的和內(nèi)源的能量來源(Obici等人，2002a；Obici等人，2001)。這與設(shè)計(jì)用于控制和調(diào)整循環(huán)中營(yíng)養(yǎng)的輸入以應(yīng)付它們可利用度的改變的負(fù)反饋系統(tǒng)是一致的。
既然循環(huán)的游離脂肪酸可以迅速接近中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Miller等人，1987；Goto和Spitzer，1971)，下丘腦中脂肪酸氧化的改變可以通過神經(jīng)元中LC-CoA水平的改變來控制能量平衡和胰島素作用的調(diào)節(jié)。在生理學(xué)條件下，當(dāng)神經(jīng)元中丙二酰-CoA水平提高時(shí)可以出現(xiàn)對(duì)下丘腦CPT1活性的抑制。細(xì)胞內(nèi)丙二酰-CoA水平的提高一般是由碳水化合物代謝的增加引起的。因此，當(dāng)存在LCFA并同時(shí)出現(xiàn)碳水化合物的增加時(shí)(丙二酰-CoA的增加)這種假設(shè)的“中樞脂類信號(hào)”就將被產(chǎn)生。由于下丘腦中CPT1活性的抑制本身再現(xiàn)了ICV施用LCFA油酸(Obici等人，2002a)對(duì)于食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的作用，所以可能LC-CoAs的積聚而不是進(jìn)入線粒體是下丘腦脂類傳感的主要組分。這也與觀察到的短鏈脂肪酸辛酸(Id.)存在的顯著增加不能再現(xiàn)油酸對(duì)于葡萄糖產(chǎn)生(Id.)的有效作用這一結(jié)論相一致。應(yīng)該指出，盡管丙二酰-CoA可能在下丘腦CPT1活性的生理學(xué)調(diào)整中發(fā)揮重要作用，但是當(dāng)存在對(duì)CPT1活性有遺傳性或藥物學(xué)抑制作用的情況下這里不可能出現(xiàn)丙二酰-CoA水平的增加。實(shí)際上，CPT1活性的抑制導(dǎo)致LC-CoAs水平的增加，其通過ACC抑制反過來導(dǎo)致丙二酰-CoA水平的減少(Lunzer等人，1977)。
最后，大麻素的有效增食(食欲刺激)效果和CB1受體(Blazquez等人，1999)拮抗性的有效厭食效果可能也可以部分的通過調(diào)控下丘腦CPT-1活性和LC-CoA水平來進(jìn)行調(diào)節(jié)。實(shí)際上，內(nèi)部的大麻素可以不依靠丙二酰-CoA單獨(dú)刺激培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的CPT1活性和脂肪酸氧化并通過和CB1受體相互作用來發(fā)揮作用(Di Marzo等人，2001)。因此脂肪酸氧化的中樞抑制作用可能代表一種新的對(duì)肥胖和2型糖尿病的預(yù)防和治療方法。
方法CPT1L核酶的設(shè)計(jì)和克隆。兩個(gè)互補(bǔ)的51-堿基長(zhǎng)的寡聚核苷酸(ODN)，5′-CTGTACCAAAGAGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGCCGCTCACAATGA-3′(SEQ ID NO2)，和5′-CATTGTGAGCGGCGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGCTCTTTGGTACAGA-3′(SEQ ID NO3)被合成(Operon Technologies，Inc.，Alameda，CA)，其中包含錘頭狀核酶序列的催化核心(如上面粗體字母所示，也可以參見圖1c)，側(cè)接來自肝臟的肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1的同種型(CPT1L)的13-核苷酸長(zhǎng)度的序列(Esser等人，1993；Birikh等人，1997)。兩條ODNs通過退火得到雙鏈片段并將其插入到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中(來自Stratagene的pTargeT)。這種CPT1L-Ribo盒包括細(xì)胞巨化病毒(CMV)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，CPT1L-Ribo上游的內(nèi)含子元件，以及下游的猿病毒40晚期多聚腺苷酸化位點(diǎn)(圖1d)。得到的CPT1L-Ribo構(gòu)建體可以指導(dǎo)這種對(duì)CPT1L mRNA特異的錘頭狀催化RNA的轉(zhuǎn)錄(圖1e)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)如所示使用pTarget載體自身，或者核酶對(duì)照質(zhì)粒(RiboC)，其中CPT-特異序列被隨機(jī)序列5′-GGAGCCTCGAGATCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGTGAGCGTTTGG-3′(SEQID NO4)代替。
CPT1L-核酶的表達(dá)。如前面所述的將CPT1L-Ribo質(zhì)?；蛘咻d體自身轉(zhuǎn)染到如前述含有polyethilenimine(PEI-Sigma-Aldrich，MW25,000)的AtT20細(xì)胞中(Boussif等人，1995)。對(duì)含有～200個(gè)獨(dú)立克隆的池進(jìn)行Northern分析。對(duì)于體內(nèi)表達(dá)，將CPT1L-Ribo質(zhì)粒與PEI復(fù)合并如前面所述的進(jìn)行ICV注射(Goula等人，1998)。簡(jiǎn)要的，將5μl含有5μg質(zhì)粒的D5W(5％葡萄糖溶液)與5μl含有18mMPEI的D5W進(jìn)行混合。在室溫下孵育10分鐘后，將這10μl混合物以1μl/min的速率進(jìn)行ICV輸注。
大腦立體定向微穿孔。如前面所述的制備大腦微穿孔個(gè)體的下丘腦核(Palkovits，1973；Obici等人，2002b)。
通過Northern和實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行CPT1和神經(jīng)肽的定量。特異探針利用大鼠下丘腦RNA作為模板通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增針對(duì)肝臟和肌肉同種型的(分別是CPT1L和M)CPT1并克隆到pTarget中。CPT1L探針跨越CPT1L cDNA位置10到765的755個(gè)核苷酸(GeneBamk登錄號(hào)L07736)；CPT1M探針跨越CPT1M cDNA位置688到1233的545個(gè)核苷酸(GeneBank登錄號(hào)NM_013200)。
總核酸是利用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，California)從個(gè)體的下丘腦核(例如，弓狀核，PVN等)中分離出來的。單鏈cDNA合成和實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)如前面所述的方法進(jìn)行(Obici等人，2002b)。CPT1L和CPT1M mRNA特異探針包含下面的序列CPT1前引物(F)5′-CTCCGAGCTCAGTGAGGACCTAAAG-3′(SEQ ID NO5)和反向引物(R)5′-CAAATACCACTGCAATTTGTG-3′(SEQ ID NO6)；CPT1M F5′-CCAGACTGCAGAAATACCTGGTGCTC-3′(SEQ ID NO7)和R5′-GTTCTGACGTGCTTCTGCCCACTCTAC-3′(SEQ ID NO8)。下丘腦神經(jīng)肽表達(dá)是通過使用下面的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR技術(shù)得到的NPY-F5′-GCCATGATGCTAGGTAACAAACG-3′(SEQ ID NO9)，R5′-GTTTCATTTCCCATCACCACATG-3′(SEQ ID NO10)，POMC-F5′-CCAGGCAACGGAGATGAAC-3′(SEQ ID NO11)，R5′-TCACTGGCCCTTCTTGTGC-3′(SEQ ID NO12)，AgRP-F5′-GCCATGCTGACTGCAATGTT-3′(SEQ ID NO13)，R5′-TGGCTAGGTGCGACTACAGA-3′(SEQ ID NO14)，和β-肌動(dòng)蛋白-F5′-TGAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′(SEQ ID NO15)，R5′-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3′(SEQ ID NO16)。轉(zhuǎn)錄水平被表述成每個(gè)基因利用β-肌動(dòng)蛋白的拷貝數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后得到的拷貝數(shù)。每個(gè)轉(zhuǎn)錄的拷貝數(shù)針對(duì)一條標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行評(píng)價(jià)，標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過對(duì)與進(jìn)行連續(xù)稀釋的含有目標(biāo)模板序列的質(zhì)粒結(jié)合的每個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)得到的。
體內(nèi)試驗(yàn)的動(dòng)物準(zhǔn)備。我們研究了93個(gè)10-周齡雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Breeding Laboratories，Wilmington，MA)。這些大鼠在單獨(dú)的籠子中和正常的晝-夜循環(huán)下進(jìn)行飼養(yǎng)。在進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)前3周，我們通過立體定向外科手術(shù)在第三腦室插入一根長(zhǎng)期的導(dǎo)管(Obici等人，2002a；Obici等人，2001；Liu等人，1998)。在胰腺-胰島素鉗夾步驟前一星期，我們?cè)僭谟覀?cè)頸靜脈和左側(cè)頸動(dòng)脈中插入另外的導(dǎo)管(Obici等人，2001；Liu等人，1998)。所有的ICV溶液都溶解到人造腦脊髓液中(aCSF)。監(jiān)控每天的食物攝取。
CPT1的中樞抑制和食物攝取的效果。我們?cè)囼?yàn)了ICV CPT1L-Ribo和ST1326對(duì)于食物攝取的效果。在暗循環(huán)開始前3小時(shí)，將CPT1L-Ribo或載體對(duì)照，ST1326或ST1340通過內(nèi)置的導(dǎo)管團(tuán)注到第三腦室。在飼喂試驗(yàn)中，大鼠接受25 pmoles ST1340的單一團(tuán)注或者兩種不同劑量(5和25 pmoles)ST1326的團(tuán)注。在進(jìn)行ICV注射前至少經(jīng)過3天以保證大鼠已經(jīng)適應(yīng)代謝籠的生活并且它們的食物攝取已經(jīng)保持穩(wěn)定。在接下來的72小時(shí)連續(xù)監(jiān)控其食物攝取。
體內(nèi)葡萄糖動(dòng)力學(xué)和胰腺-胰島素鉗夾步驟的測(cè)定。這種輸注研究持續(xù)總共360min(圖3a)。簡(jiǎn)要的，在t＝0min時(shí)開始CPT1抑制劑或者對(duì)照溶液的致敏-連續(xù)ICV輸注并在剩余的時(shí)間內(nèi)保持這一狀態(tài)。2-十四烷縮水甘油酸(TDGA，獲贈(zèng)于Dr.Manuel Guzman)溶解到DSMO中，稀釋到aCSF(Harvard Apparatus)中并以50 pmoles/hr每小時(shí)的速率進(jìn)行ICV輸注。將ST1326[(R)-N-(十四烷氨基甲?；?-氨基肉堿]和ST1340(ST1326的非活性立體異構(gòu)體)[(S)-N-(十四烷氨基甲?；?-氨基肉堿]溶解到aCSF中并以50pmoles/hr每小時(shí)的速率進(jìn)行輸注。在進(jìn)行胰腺-胰島素鉗夾試驗(yàn)前，將鉗夾步驟前3天接受CPT1L-Ribo或載體對(duì)照ICV注射的大鼠隨機(jī)的分成兩個(gè)對(duì)照進(jìn)食試驗(yàn)組。在t＝120min時(shí)開始致敏-連續(xù)注射HPLC-純化的[3-3H]葡萄糖(New England Nuclear，Boston，MA；40μCi bolus，0.4μCi/min)并在實(shí)驗(yàn)中持續(xù)進(jìn)行(Obici等人，2002a；Obici等人，2001；Liu等人，1998)。最后，在t＝240時(shí)開始胰腺-胰島素鉗夾試驗(yàn)(Obici等人，2002a；Obici等人，2001；Liu等人，1998)并持續(xù)2小時(shí)。這一步驟包括生長(zhǎng)激素抑制素的輸注(3μg/kg/min)，胰島素的輸注(1mU/kg/min)，以及為了防止血糖過低而必需的葡萄糖的輸注，或者C肽(Linco)和2型黑皮質(zhì)素受體(Chemicon)的抗體的輸注。胰島素的輸注速率要求替換吸收后大鼠中的正?；A(chǔ)水平。
在所有的鉗夾步驟的最后60min得到穩(wěn)定的血糖和胰島素的濃度和葡萄糖特異活性的穩(wěn)定狀態(tài)。在蒸發(fā)干燥除去氚水(Somogyipellet)后通過測(cè)量Ba(OH)2和ZnSO4沉淀的上清液得到[3H]葡萄糖的放射活性。在血漿中氚水(Somogyi pellet)的特異活性通過測(cè)量蒸發(fā)干燥前后無蛋白上清液的總量得到。在血糖濃度的恒定狀態(tài)下，葡萄糖的消失速率(Rd)等同于葡萄糖的產(chǎn)生速率(Ra)。在恒定狀態(tài)下Ra是由[3H]葡萄糖注射速率(每分鐘分解量)和血[3H]葡萄糖特異活性(每分鐘每mmol葡萄糖分解量)決定的。在基礎(chǔ)狀態(tài)下葡萄糖的生產(chǎn)速率(GP)等于Ra而在胰腺的鉗夾步驟中葡萄糖產(chǎn)生速率得自于Ra和葡萄糖注射速率的差值。
所有的數(shù)值以平均值±SE的形式給出。不同組之間的對(duì)比是利用適當(dāng)?shù)姆讲顧z驗(yàn)或不配對(duì)資料t檢驗(yàn)進(jìn)行分析的。試驗(yàn)方案是得到動(dòng)物關(guān)懷機(jī)構(gòu)以及Albert Einstein藥學(xué)院使用委員會(huì)的視察和認(rèn)可的。
實(shí)施例2.調(diào)控下丘腦長(zhǎng)鏈CoA(LC-CoAs)水平以調(diào)控食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生該實(shí)施例描述的試驗(yàn)使用了實(shí)施例1中所述的方法。
飲食-引起的肥胖導(dǎo)致下丘腦中的LC-CoAs顯著降低。為了測(cè)試下丘腦“脂類信號(hào)”的下降是否可以對(duì)飲食引起的肥胖發(fā)揮作用，我們測(cè)試了經(jīng)過3天高營(yíng)養(yǎng)食物飼喂的大鼠弓狀核(ARC)中的LC-CoAs水平(Obici等人，2002a)。由于它不是基于單一的基因缺陷所以后者是研究人類肥胖和飲食-引起的胰島素抗性的很好的模型。盡管接受了富含飽和脂肪酸的飲食，與正常飲食的大鼠或與正常飲食大鼠成對(duì)飼喂的高脂肪攝取大鼠相比過量飼喂的大鼠的ARC LC-CoAs水平下降了60％。這些驚奇的結(jié)果說明當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)缺乏一種循環(huán)營(yíng)養(yǎng)和下丘腦能量中心之間的負(fù)反饋時(shí)傾向于增加體重。
下丘腦CPT-1的抑制顯著改善了具有飲食引起的肥胖和胰島素抗性的大鼠肝臟的胰島素活性。這里，我們假定下丘腦CPT-1的抑制可以降低過量進(jìn)食大鼠中的葡萄糖產(chǎn)生(GP)。因此，我們?cè)囼?yàn)了是否下丘腦LC氧化的降低可以強(qiáng)烈的抑制進(jìn)食高脂肪食物(33％的熱量來源于脂肪)的大鼠中的GP。為了抑制LC進(jìn)入線粒體，我們向有知覺的大鼠ICV注射一種CPT-1活性的選擇抑制劑(CPTI)或者它的非活性立體異構(gòu)體(CON)。CPTI或CON被快速的持續(xù)6小時(shí)的ICV注射到帶有長(zhǎng)期導(dǎo)管的大鼠中。當(dāng)提供基礎(chǔ)胰島素水平時(shí)，在CPTI(4.2±0.4mg/kg/min)組中需要進(jìn)行葡萄糖注射以防止出現(xiàn)低血糖癥，但是在CON((0.5±0.2mg/kg/min)組中不必。GP被CPTI顯著的和明顯的降低了(-37±5％，p＜0.01；n＝4)但是CON沒有相同作用(+3±7％；n＝5)。我們推測(cè)過量進(jìn)食大鼠中對(duì)LC中樞施用的代謝應(yīng)答的缺乏是由于神經(jīng)元CPT-1活性的增加。
CPT1活性的中樞抑制作用應(yīng)該是由飲食引起的胰島素抗性的一個(gè)有效的處理手段。總而言之，上面提供的數(shù)據(jù)證明了這樣的觀點(diǎn)即任何增加ARC中LC-CoAs濃度的藥理學(xué)方法都是一種預(yù)防和處理肥胖和2型糖尿病的有效的和新穎的方法。除了CPT-1活性或表達(dá)的選擇性抑制劑外，也可以使用其它可以降低LC-CoA代謝的酶。例如，ARC LC-CoA水解酶或硫酯酶的抑制也可以增加LC-CoAs以及預(yù)期可以降低GP和食物攝取。相同地，增加下丘腦的丙二酰-CoA水平通過抑制丙二酰-CoA脫羧酶或者通過刺激乙酰-CoA羧化酶也可以抑制食物攝取和葡萄糖輸出。最后，增加神經(jīng)元中脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或LC-CoA合成酶活性也可以增加下丘腦的LC-CoAs水平因此可以抑制葡萄糖產(chǎn)生和食物攝取。
總而言之，該實(shí)施例證明了下丘腦LC-CoAs水平的增加可以降低食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生。
實(shí)施例3.下丘腦對(duì)于長(zhǎng)鏈脂肪酸的響應(yīng)是營(yíng)養(yǎng)控制的。
實(shí)施例概要長(zhǎng)鏈脂肪酸油酸的中樞施用抑制了大鼠的食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生。這里我們測(cè)試營(yíng)養(yǎng)可利用度的短期改變是否可以控制油酸的這些代謝和行為效果。大鼠被分成三組接受一種高營(yíng)養(yǎng)的能量密集食物并逐漸增加每日熱量水平(分別為飼喂標(biāo)準(zhǔn)食物的平均以下，相同水平或在其之上)。在進(jìn)行指定食物攝取三天后，檢測(cè)大鼠對(duì)于第三腦室中輸注油酸的急性生物學(xué)反應(yīng)。三天的過量喂食實(shí)際上消除了由中樞的油酸施用引起的代謝和食欲不振效果。此外，在短期的過量飲食后向第三腦室中輸注油酸沒能減少下丘腦神經(jīng)肽Y和肝臟中葡萄糖-6-磷酸酶的表達(dá)。短期過量飲食后下丘腦對(duì)油酸反應(yīng)的缺乏可能歸功于這種動(dòng)物模型中體重增加和肝臟胰島素抗性的迅速開始。
引言肥胖和2型糖尿病(DM2)共同具有一些代謝特點(diǎn)，其中包括胰島素抗性(Kahn and Flier，2000；Kopelman和Hitman，1998；Porteet al，1998)。肥胖和DM2在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家中的影響范圍顯著提高了。例如，最近十年僅僅在美國(guó)在兒童和成人中肥胖的程度就出現(xiàn)顯著的增加(Flegal等人，2002；Ogden等人，2002)。對(duì)高熱量飲食的消費(fèi)和久坐的生活方式在這種趨勢(shì)中扮演了重要的作用(Kopelman和Hitmanl Flegal等人，2002；Friedman，2000)。相似地，暴露于具有高熱量密度(高脂肪)的美味食品引起了小鼠(West等人，1992；West等人，1995)，大鼠((Kraegen等人，1991；Schemmel等人，1970；Sclafani和Springer，1976)，豬(Romsos等人，1978)，狗(Hall等人，1995)，和猴子(Ausman等人，1981)中體重和胰島素抗性的變化。
進(jìn)化壓力可能有利于基因的選擇，其在存在的食物很多時(shí)將能量?jī)?chǔ)存最大化(Coleman，1978；Coleman，1979；Neel，1999；Wang等人2001)。其它人和我們已經(jīng)提出的即熱量攝取的快速增長(zhǎng)開始了外周“合成代謝信號(hào)”(Kersten，2001)和下丘腦“分解代謝信號(hào)”(Woods等人，1998；Loftus等人，2000；Obici等人，2002a；2002d；2002e；2002f；2003)之間的一個(gè)“戰(zhàn)爭(zhēng)拉鋸”。下丘腦中激素的影響，例如瘦素(Zhang等人，1994；Schwartz等人，1996a；1996b；Frederich等人，1995；Cinti等人，1997)和胰島素(Obici等人，2002e；2002f；Woods等人，1979；Brief和Davis，1984)，和營(yíng)養(yǎng)，例如脂肪酸(Loftus等人，2002；Obici等人，2002a；Obici等人，2003)，啟動(dòng)了一個(gè)負(fù)反饋，這包括食物攝取的抑制，能量支出的刺激，和來自內(nèi)部能量源(主要來自肝臟)的營(yíng)養(yǎng)輸出的降低。當(dāng)這種負(fù)反饋中斷時(shí)動(dòng)物和人類可能更易于增加體重和改變代謝調(diào)控。在過量飲食的嚙齒動(dòng)物模型中瘦素抗性的迅速出現(xiàn)為這種理論提供了最初的支持(Halaas等人，1997；Widdowson等人，1997)。
這里，我們測(cè)試這種假設(shè)即熱量攝取的短期增長(zhǎng)快速引發(fā)對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸，油酸(OA)中樞作用的抗性。因此，我們檢驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)狀況的改變是否會(huì)導(dǎo)致油酸對(duì)進(jìn)食行為和葡萄糖產(chǎn)生中樞作用的改變。
簡(jiǎn)寫ICV，進(jìn)入第三腦室；OA，油酸；NPY，神經(jīng)肽Y；DM2，2型糖尿??；PEPCK，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；Glc-6-pase，葡萄糖-6-磷酸酶；HPB，羥丙基-β-環(huán)糊精；SC，標(biāo)準(zhǔn)飲食；HF，高脂肪飲食；LCFA，長(zhǎng)鏈脂肪酸實(shí)驗(yàn)步驟動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)。將10周齡的雄性Sprague-Dawley(S-D)大鼠(Charles River Breeding Laboratories，Inc.，Wilmington，MA)在獨(dú)立的籠子中進(jìn)行飼養(yǎng)并暴露于標(biāo)準(zhǔn)的晝-夜循環(huán)(0600-1800/1800-0600)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)前的第14天，如前面所述在所有的大鼠中通過立體定向外科手術(shù)植入ICV導(dǎo)管(36)。在所有的體內(nèi)試驗(yàn)開始前大鼠必須經(jīng)過充足的恢復(fù)。分別對(duì)動(dòng)物飼喂標(biāo)準(zhǔn)的飲食(SC，貓，編號(hào)5001，Purina Mills Ltd，其中碳水化合物提供59％的熱量，蛋白提供28％的熱量和脂肪提供12％的熱量，3.3kcal/g)，高蔗糖的飲食(HS；動(dòng)物除標(biāo)準(zhǔn)飲食外可自由接觸20％蔗糖溶液)，或一種美味的高脂肪飲食(HF，貓，編號(hào)9389；Purina Mills Ltd.，其中碳水化合物提供45％的熱量，蛋白提供22％的熱量和脂肪提供33％的熱量，5.32kcal/g)其是通過向標(biāo)準(zhǔn)飲食中補(bǔ)充10％的豬油來實(shí)現(xiàn)的。這種豬油含有2％的肉豆蔻酸，24％的棕櫚酸，13％的硬脂酸，46％的油酸，和12％的亞油酸。HF飲食中脂肪的總組成是按照重量5.2％的飽和的，6.2％的單不飽和的，和2.7％的多不飽和的脂肪。SC飲食分別含有重量比為1％，1.5％，和1.6％的飽和的，單不飽和的，和多不飽和的脂肪。在進(jìn)行下面所述食物攝取(表2)3天后的飲食和代謝實(shí)驗(yàn)(下面所述)中包括五組的動(dòng)物1)SC自由進(jìn)食(SC，～80kcal/天)；2)HS自由進(jìn)食(HS；～95kcal/天)；3)HP自由進(jìn)食(HF140；～140kcal/天)；4)HF熱量限制(HF55；～55kcal/天)；和5)HF配合-喂食SC(HF80；～80kcal/天)。
OA的中樞運(yùn)輸。OA與羥丙基-β-環(huán)糊精聚合物進(jìn)行復(fù)合(HPB，CTDInc)。后者顯示出為脂肪酸的中樞運(yùn)輸提供了很好的賦形劑(Obici等人，2002a；Yaksh等人，1991；Pitha等人，1994)。OA溶解到45％的HPB中形成17mM的終濃度。將這種HPB-OA溶液在人造腦脊髓液(aCSF)中稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛扔糜谶M(jìn)行每一次ICV注射(30或300nmol/5μl)。在所有的賦形劑對(duì)照實(shí)驗(yàn)中使單獨(dú)的HPB濃度與在OA實(shí)驗(yàn)中保持一致。
進(jìn)食行為試驗(yàn)。這個(gè)試驗(yàn)步驟用來檢驗(yàn)ICV OA對(duì)喂食標(biāo)準(zhǔn)飲食(SC)，高蔗糖飲食(HS95)和高脂肪飲食(HF140)的三個(gè)試驗(yàn)組中食物攝取的急性作用。SC和HF140的動(dòng)物允許自由進(jìn)食他們的飲食。HS的動(dòng)物除其標(biāo)準(zhǔn)飲食3天外，可以自由進(jìn)食20％蔗糖溶液。接下來所有的組進(jìn)行3天的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)食，在試驗(yàn)的第0天(圖5a)，在暗循環(huán)開始前1小時(shí)使用一種氣推注射器(Hamilton Corp)以1μl/min的速率向大鼠團(tuán)注5ml的OA或賦形劑。注射后3天每天同一時(shí)間測(cè)試食物攝取。
NPY表達(dá)試驗(yàn)。為了分析NPY的表達(dá)，我們研究了兩組大鼠，HF55和HF140。在按照各自的飲食攝取3天后，在暗循環(huán)開始前1小時(shí)將ICV賦形劑(10％HPB在aCSF中)或ICV OA(30nmol)團(tuán)注到第三腦室。撤去食物并在注射后16小時(shí)收集下丘腦。
胰島素作用試驗(yàn)。這里該試驗(yàn)步驟是設(shè)計(jì)用來檢驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)對(duì)下丘腦長(zhǎng)鏈脂肪酸調(diào)控碳水化合物代謝能力的影響。利用前面所述的方法(Liu等人，1998)向大鼠(n＝43)中植入長(zhǎng)期的導(dǎo)管。從導(dǎo)管插入術(shù)中完全恢復(fù)后，將動(dòng)物隨機(jī)的分成3組HF55(n＝16)，HF80(n＝9)，或者HF140(n＝18)并允許進(jìn)食分配給它們的食物3天。在對(duì)它們體內(nèi)試驗(yàn)前的晚上所有的大鼠接受55 kcal以確保在開始代謝試驗(yàn)時(shí)它們具有相同的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。所有的研究是在清醒的，不受脅迫的，長(zhǎng)期插入導(dǎo)管的大鼠中進(jìn)行。在t＝-120時(shí)(圖7a)，開始一種ICV OA(總劑量為30-或300-nmol)或賦形劑(10％的HBP在aCSF中)的致敏-連續(xù)注射并在試驗(yàn)的剩下時(shí)間中保持。在ICV注射的開始(t＝-120)和在試驗(yàn)的整個(gè)持續(xù)過程中周期性地進(jìn)行血糖的測(cè)定。在開始(t＝-120)和實(shí)驗(yàn)中每間隔30min收集得到用于胰島素，瘦素，和非酯化脂肪酸濃度測(cè)定的血漿樣品。在t＝0時(shí)，開始HPLC-純化的[3-3H]-葡萄糖(New England Nuclear，Boston，MA；40μCi團(tuán)注，0.4μCi/min在試驗(yàn)過程中)的致敏-連續(xù)注射并保持到試驗(yàn)的最后4小時(shí)。在注射中每間隔10min取一次樣品用于3H-葡萄糖特異活性的檢測(cè)。最后，在t＝120時(shí)，開始胰腺-胰島素鉗夾試驗(yàn)并保持2小時(shí)。在這一過程中，施用常規(guī)量的胰島素的致敏-連續(xù)注射，在t＝120時(shí)開始25％葡萄糖溶液的可變注射并周期性的調(diào)整從而保持血糖濃度為～7mM。胰島素的注射速率被設(shè)計(jì)用來替換吸收后大鼠中處于平均基礎(chǔ)水平的血漿胰島素濃度。為了控制ICV注射對(duì)內(nèi)分泌胰腺的可能作用，生長(zhǎng)激素抑制素與胰島素共同輸注以抑制內(nèi)生的胰島素分泌。在體內(nèi)試驗(yàn)的最后，將大鼠麻醉(戊巴比妥55mg/kg體重，靜脈內(nèi))并利用在液氮中預(yù)冷的鋁鉗對(duì)組織樣品進(jìn)行原位冷凍-鉗夾。所有的組織樣品在-80℃下儲(chǔ)存以供進(jìn)一步分析。
分析步驟和計(jì)算。血糖濃度通過葡萄糖氧化酶方法進(jìn)行測(cè)定(葡萄糖分析器II，Beckman Instruments，Inc. Fullerton，California，USA)。血漿中胰島素和瘦素水平通過RIA進(jìn)行測(cè)定(大鼠瘦素RIA工具包，Linco Research Inc.，St.Charles，MO)。血清脂肪連接素(adiponectin)通過RIA進(jìn)行測(cè)定(Linco Research，Inc.，St.Charles，MO)。血漿非酯化脂肪酸濃度按照廠商的說明書利用一個(gè)自動(dòng)工具包(Waco Pure Chemical Industries.Osaka，Japan)進(jìn)行酶學(xué)方法測(cè)定。在對(duì)其進(jìn)行了蒸發(fā)以干燥除去氚水后，血漿中[3-3H]葡萄糖放射性從Ba(OH)2和ZnSO4沉淀的上清液(Somogyi步驟)進(jìn)行測(cè)定。肝臟中尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)的濃度和特異的活性通過兩步連續(xù)的色譜分離獲得，如前面所述(Giaccari和Rossetti，1989；1992；Rossetti等人，1993；1996)。算法利用描述的方法進(jìn)行(Barzilai等人，1997)。
Northern印跡分析。利用Trizol(Invitrogen Corp.，California，USA)從下丘腦和肝臟分離得到總RNA。利用Northern印跡分析NPY，葡萄糖-6-磷酸酶或者PEPCK的表達(dá)。利用prepro-NPY和β-肌動(dòng)蛋白的探針分析下丘腦的RNA。為了評(píng)價(jià)ICV OA對(duì)于肝臟的酶的表達(dá)的作用，從經(jīng)過胰島素鉗夾試驗(yàn)的大鼠取得的冷凍-鉗夾肝臟組織中分離得到總RNA。如前面所述的方法(Combs等人，2001；Massillon等人，1996；1998)得到葡萄糖-6-磷酸酶和PEPCK cDNA。使用隨機(jī)的引物試劑盒(Stratagene)，對(duì)探針進(jìn)行[α-32P]dCTP標(biāo)記。利用掃描密度計(jì)量學(xué)進(jìn)行量化，標(biāo)準(zhǔn)化成β-肌動(dòng)蛋白信號(hào)和18S核糖體RNA以校正加樣變化。
通過方差檢驗(yàn)對(duì)各組進(jìn)行對(duì)比并且所有的數(shù)據(jù)都是以平均值±S.E.的形式給出。特別是，對(duì)于圖5中賦形劑和油酸的兩條曲線所列出的飼喂數(shù)據(jù)首先利用方差分析的方法對(duì)于反復(fù)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比。如果顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(曲線間)，則對(duì)每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異利用學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
這一實(shí)驗(yàn)步驟是經(jīng)過動(dòng)物關(guān)懷機(jī)構(gòu)和Albert Einstein藥學(xué)院使用委員會(huì)視察和認(rèn)可的。
結(jié)果為了引發(fā)自動(dòng)的攝食過量，對(duì)雄性的S-D大鼠自由施用高美味飲食，持續(xù)3天(表2)。每天檢測(cè)它們的食物攝取和對(duì)食物熱量水平增加的適應(yīng)。不論高瘦素血癥和高胰島素血癥，這組的動(dòng)物都不能適應(yīng)飲食中提高的熱量水平并且以～70％到140％kcal/天的量增加了它們的每日能量攝取。因?yàn)楫?dāng)喂食標(biāo)準(zhǔn)飲食的時(shí)候同窩出生的小崽在進(jìn)行同樣試驗(yàn)時(shí)消費(fèi)～80kcal/天，我們還將自由喂養(yǎng)的大鼠與一組接受80-kcal每天的成對(duì)喂養(yǎng)的大鼠以及一組使用同樣的高美味飲食的接受55-kcal/天的熱量限制大鼠進(jìn)行比較。這種方法讓我們可以在反映適度熱量限制，成對(duì)喂養(yǎng)(pairfeeding)，和過量喂養(yǎng)三個(gè)每日熱量攝取水平上對(duì)中樞系統(tǒng)OA的作用進(jìn)行研究。應(yīng)該指出下面給出的關(guān)于成對(duì)喂養(yǎng)組的數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)的大鼠的數(shù)據(jù)非常相似(Obici等人，2002a)。因此，這一實(shí)驗(yàn)方法讓我們可以驗(yàn)證油酸(OA)對(duì)于食物攝取和胰島素作用的重要作用是否可以被短期的熱量攝取變化所調(diào)整。
表2.實(shí)驗(yàn)組的一般特征。數(shù)據(jù)為平均值±SE.。鉗夾步驟中的數(shù)值表示通過對(duì)實(shí)驗(yàn)中至少五個(gè)樣品取平均值得到的穩(wěn)定狀態(tài)水平。對(duì)HF55或HF80*P＜0.01。

自動(dòng)的過量飲食迅速地減弱了中樞的OA對(duì)進(jìn)食行為和下丘腦NPY表達(dá)的作用。我們檢測(cè)了ICV OA是否可以調(diào)控經(jīng)過三天自由過量進(jìn)食的動(dòng)物的進(jìn)食行為。在ICV注射前3天每日檢測(cè)自由進(jìn)食可引發(fā)攝食過量的高美味飲食(HF140)或標(biāo)準(zhǔn)飲食(SC；熱量攝取78±3kcal/天)的動(dòng)物體內(nèi)的食物吸收。為了檢測(cè)飲食中大量養(yǎng)料成分(例如高脂肪對(duì)高碳水化合物)對(duì)于OA靈敏度的影響，我們還測(cè)試了另外一組動(dòng)物其除允許自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飲食外，還可以自由進(jìn)食20％蔗糖(HS；熱量攝取93±4kcal/天，反映出與SC動(dòng)物相比其熱量攝取增加了～20％)。在按它們制定的攝取量進(jìn)行三天后，在暗循環(huán)開始前1小時(shí)所有的動(dòng)物通過內(nèi)置的ICV導(dǎo)管接受OA(30nmol)或賦形劑(HPB)的團(tuán)注。在ICV注射后總共3天的時(shí)間內(nèi)監(jiān)控食物攝取(圖5a)并且在每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中將OA的效果與單獨(dú)使用賦形劑得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。當(dāng)向SC動(dòng)物(圖5b，e)進(jìn)行施用ICV OA時(shí)，在ICV注射后的第1天和第2天發(fā)現(xiàn)與注射前的基礎(chǔ)水平相比食物攝取分別減少了48％和52％。但是，在中度過量進(jìn)食(HS95)3天后ICV OA減少的每日食物攝取第一天減少了21％以及第二天減少了17％(圖5d，e)。最后，在經(jīng)過3天顯著的自由過量攝食后(HF140)，ICV OA對(duì)每日食物攝取的減少量第一天為11％以及第二天為-2％(圖5c，e)。在HS95和HF140組中發(fā)現(xiàn)的中度降低與單一ICV注射賦形劑的數(shù)據(jù)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5c，d)。所有的組在OA注射3天后返回到了基值的食物攝取(圖5b-e)。
我們接下來測(cè)試了一種潛在的機(jī)制，通過這種機(jī)制可以發(fā)展對(duì)下丘腦OA的抑制。我們先前報(bào)道了在對(duì)經(jīng)過延長(zhǎng)的(16h)禁食(Obici等人，2002a)后喂食標(biāo)準(zhǔn)食物的大鼠中與ICV賦形劑相比ICV OA后下丘腦的NPY mRNA降低了(以～50％)。這里我們懷疑是否營(yíng)養(yǎng)情況的改變調(diào)整了ICV OA抑制下丘腦中NPY表達(dá)的能力。為了這個(gè)目的，在以高美味食物(～140kcal/d)或以55kcal/d的相同食物的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)食3天后，我們利用northern印跡分析方法測(cè)試了下丘腦NPY mRNA的豐度。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組在進(jìn)行了一個(gè)晚上的禁食后都進(jìn)行單次30nmol OA或賦形劑(HPB)的團(tuán)注。在第二天早上收集下丘腦組織并且進(jìn)行northern印跡分析方法(圖6a)。通過密度計(jì)量學(xué)的定量，使用β-肌動(dòng)蛋白作為參考轉(zhuǎn)錄子，證明了NPY mRNA的平均水平在HF55和HF140中相似(圖6c)。ICV OA以～60％的量抑制了55-kcal/d組的NPY mRNA的表達(dá)(圖6d)。這種降低與先前報(bào)道的延長(zhǎng)禁食(Obici等人，2002a)后以～70kcal/d進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飲食的大鼠的數(shù)據(jù)相同。但是，對(duì)于過量進(jìn)食3天后實(shí)行禁食的動(dòng)物中ICV OA僅僅以28％的水平降低了下丘腦NPY mRNA(圖6c，d)。這些數(shù)據(jù)提供證據(jù)證明對(duì)于提供了高美味飲食的動(dòng)物表現(xiàn)出的過量飲食是部分地由于下丘腦NPY表達(dá)調(diào)控的缺陷。
自由的過量進(jìn)食迅速地鈍化了中樞系統(tǒng)OA對(duì)于胰島素作用和肝臟葡萄糖產(chǎn)生的作用。我們接下來測(cè)試了營(yíng)養(yǎng)狀況的短期改變是否足以改變OA對(duì)于體內(nèi)胰島素作用的效果(圖7a)。通過ICV注射和胰腺-胰島素鉗夾試驗(yàn)的結(jié)合我們?cè)u(píng)價(jià)了ICV OA在有知覺的大鼠中對(duì)于胰島素作用的效果(圖7b)。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(HF55，HF80，和HF140)隨機(jī)的接受ICV OA或者賦形劑(HPB)處理(表2和圖7b)?；A(chǔ)的血漿FFA和葡萄糖濃度在所有的組中都是相似的(表2)。在進(jìn)行胰腺的-血糖正常鉗夾試驗(yàn)前一天，所有的大鼠接受相同量的熱量(55kcal)以確保代謝測(cè)試前相同的吸收后狀態(tài)(圖7a)。當(dāng)提供ICV賦形劑和接近循環(huán)胰島素的基礎(chǔ)水平時(shí)，需要提供葡萄糖注射的邊緣速率(GIR)以保持3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(HF55-2.4，HF80-1.2，和HF140-1.4mg/kg/min)中的正常血糖(圖3c)。相反，在HF55和HF80組中，在OA的ICV注射后(30nmol)為了維持正常血糖的GIR顯著增加了(分別是9.55和4.64mg/kg/min)。但是，相同劑量OA的ICV注射沒能增加自由進(jìn)食組中的GIR。實(shí)際上，即使10倍計(jì)量OA(300nmol)的注射也沒有顯著增加這組的GIR(圖7c)。由于HF55組中ICV OA對(duì)于GIR的刺激作用顯然高于(約2倍)在HF80組中的水平，因此，這一增加的出現(xiàn)更多的依靠前面所述的動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，即使是在通常至低水平的熱量攝取范圍內(nèi)。在鉗夾實(shí)驗(yàn)中(表2)血漿FFA濃度沒有改變說明由ICV OA引起的代謝作用是由在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中它的作用啟動(dòng)的。
在基礎(chǔ)胰島素水平的情況下由OA的ICV施用引起的外源葡萄糖需求的增長(zhǎng)可能是由于葡萄糖攝取的刺激和/或內(nèi)源葡萄糖產(chǎn)生(GP)的抑制。但是，在三個(gè)組中葡萄糖的消逝速率(在圖7d中的Rd)是相似的以及最重要的是ICV OA沒有顯著的改變它們。因此，在HF55和HF80組中由ICV OA引起的整個(gè)體內(nèi)胰島素作用的增加不能表現(xiàn)出外周葡萄糖攝取的增加(圖7d)。在另一方面，ICV OA(以30nmol)在HF55和HF80組中顯著地抑制了GP，但是在自由進(jìn)食的大鼠中沒有(HF140)。實(shí)際上，即使10倍的OA中樞施用也沒有顯著降低自由進(jìn)食組中的GP(圖8a)。與從GIR所觀察到的作用相同，由于ICV OA引起的GP的抑制在HF55組中(從基值下降了71％)比在HF80組中(從基值下降了-45％)更顯著(圖8b)。最后，由于ICV OA引起的GP的抑制完全解釋了ICV OA對(duì)GIR的刺激。為了進(jìn)一步驗(yàn)證營(yíng)養(yǎng)狀況在代謝變化中調(diào)控ICV OA效果方面的作用，我們將由ICV OA或者賦形劑引起的GP的改變作為體重下降百分比(圖8c)和每日食物攝取(圖8d)的函數(shù)繪制了圖。ICV OA的抑制作用直接正比于每日食物攝取和體重增加的減少。重要的是，在接受ICV對(duì)照的組中發(fā)現(xiàn)GP和GIR的改變與食物攝取/體重的改變之間沒有顯著的相關(guān)性(數(shù)據(jù)沒有顯示)。通過設(shè)計(jì)的僅僅正常進(jìn)食不同熱量攝取水平的標(biāo)準(zhǔn)飲食的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在OA和GP的抑制之間具有相似的相關(guān)性(數(shù)據(jù)沒有顯示)。因此，OA的中樞施用引起的GP抑制程度呈現(xiàn)出高度依賴于熱量攝取和/或體重的短期改變。
ICV OA顯著地降低了由葡萄糖-6-磷酸酶引起的體內(nèi)變化。GP表示由糖異生和肝糖元分解得到的葡糖基單元的凈貢獻(xiàn)。但是，通過葡糖激酶的磷酸化作用進(jìn)入肝臟的一部分葡萄糖也是葡萄糖-6-磷酸酶去磷酸化作用的底物。這個(gè)葡糖激酶和葡萄糖-6-磷酸酶之間的循環(huán)一般被稱為葡萄糖循環(huán)并用解釋了總葡萄糖輸出(葡萄糖-6-磷酸酶引起的變化)和GP之間的差異(圖9a)。
為了進(jìn)一步描繪ICV OA注射對(duì)于肝臟葡萄糖產(chǎn)生的作用我們?cè)u(píng)價(jià)了由葡萄糖-6-磷酸酶引起的體內(nèi)變化和葡萄糖循環(huán)對(duì)葡萄糖輸出的相關(guān)貢獻(xiàn)(表3；圖9b，c)。圖9b，c顯示了在胰腺-胰島素鉗夾試驗(yàn)中ICV OA和ICV賦形劑對(duì)于肝臟葡萄糖變化的作用。在提供相似的血漿胰島素濃度時(shí)，在HF55和HF80組中通過ICV Office Action葡萄糖產(chǎn)率(如圖8a所示的)降低了但是沒有出現(xiàn)在自由進(jìn)食的大鼠中(HF140)。表3顯示了用于計(jì)算血糖對(duì)肝臟葡萄糖-6-磷酸池貢獻(xiàn)(％直接在表3中)的[3H]-UDP-葡萄糖，和[3H]-UDP-葡萄糖特異活性。這些數(shù)據(jù)允許我們?cè)谒械慕M中測(cè)試由葡萄糖-6-磷酸酶(在圖9b中的總葡萄糖輸出)和葡萄糖循環(huán)的速率(圖9c)引起的體內(nèi)變化。如圖9b中所示，與HF55組的動(dòng)物對(duì)于GP的效果相同ICV OA顯著地降低了由葡萄糖-6-磷酸酶引起的變化。與接受ICV賦形劑相比較在接受ICV OA的大鼠中與這種整體的葡萄糖輸出的顯著降低相一致葡萄糖循環(huán)的速率也降低了(圖9c)。但是，這種葡萄糖循環(huán)速率的降低遠(yuǎn)不如葡萄糖-6-磷酸酶變化明顯并且實(shí)際上它沒有取得統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。下面的發(fā)現(xiàn)結(jié)合在直接途徑中中度增加的％(表3)與中樞的OA對(duì)于肝臟的葡萄糖磷酸化的刺激作用相一致。因此，短期的OA中樞注射顯著地導(dǎo)致了由葡萄糖-6-磷酸到葡萄糖的凈去磷酸化作用的降低，這主要?dú)w因于與通過葡糖激酶引起的體內(nèi)變化的中度刺激相結(jié)合的通過葡萄糖-6-磷酸酶得到的體內(nèi)變化的降低。這些ICV OA的效果通過3天的自動(dòng)過量進(jìn)食就可以鈍化。
表3.ICV OA對(duì)于肝臟UDP葡萄糖形成“直接”途徑的影響。血糖和肝臟UDP葡萄糖(UDPG1c)的特異活性用于計(jì)算在胰腺/胰島素鉗夾試驗(yàn)完成[3H-3]-葡萄糖注射后的大鼠中血糖對(duì)于肝臟UDP葡萄糖的貢獻(xiàn)。

ICV OA對(duì)于肝臟葡萄糖-6-磷酸酶和PEPCK表達(dá)的影響。OA的中樞施用對(duì)于肝臟葡萄糖變化的潛在作用提示我們?nèi)y(cè)試肝臟內(nèi)主要代謝酶的mRNA水平的變化是否可以部分地解釋這些效果。因此，我們接下來對(duì)熱量限制或過量飼喂的大鼠中進(jìn)行OA或賦形劑的ICV注射后的組織樣品檢測(cè)了作為18S核糖體RNA(圖9d)或β-肌動(dòng)蛋白mRNA(沒有顯示)函數(shù)的葡萄糖-6-磷酸酶和PEPCK在肝臟中的豐度。ICV OA顯著地減少了熱量限制的大鼠中葡萄糖-6-磷酸酶基因的表達(dá)。利用密度計(jì)量學(xué)對(duì)多印跡進(jìn)行量化分析(圖9e，f)，利用β-肌動(dòng)蛋白作為一個(gè)參考轉(zhuǎn)錄子，證明了ICV OA在HF55組中以～73％的量抑制了葡萄糖-6-磷酸酶mRNA的表達(dá)，但是在HF140組中沒有檢測(cè)到任何改變。相反地，ICV OA在兩個(gè)組中都沒有顯著地改變肝臟的PEPCK表達(dá)。ICVOA對(duì)于葡萄糖-6-磷酸酶的顯著抑制作用可能是由于它對(duì)熱量限制大鼠中葡萄糖-6-磷酸酶引起的體內(nèi)變化的潛在限制作用。
討論肥胖和DM2的發(fā)展是受環(huán)境和基因因素的復(fù)雜相互關(guān)系所影響的(Friedman，2003；Hill和Peters，1998；Ravussin和Gautier，1999)。其它人和我們已經(jīng)提出這種觀點(diǎn)即通常的中樞路徑能夠引發(fā)對(duì)營(yíng)養(yǎng)可利用度的應(yīng)答，其包括飲食行為和代謝過程的改變(Woods等分，1998；Obici等人，2002e；2002f；Barzilai等人，1997；Shimomura等人，1999；Spiegelman和Flier，2001；Wang等人，1997；Schwartz等人，2000)。在這方面，營(yíng)養(yǎng)-依賴信號(hào)(例如，瘦素和胰島素)將生物體的營(yíng)養(yǎng)狀況傳達(dá)給下丘腦，在這里信息得到整合并且被轉(zhuǎn)換成輸出信號(hào)從而限制外源的或內(nèi)源的營(yíng)養(yǎng)輸入到循環(huán)中。此外，最近已經(jīng)提出了在選擇的下丘腦神經(jīng)元中的脂類代謝是營(yíng)養(yǎng)可利用度的一個(gè)主要的生物傳感器，其反過來表現(xiàn)對(duì)食物攝取(Loftus等人，2000；Obici等人，2002a；2003)和內(nèi)源葡萄糖產(chǎn)生(GP)(Obici等人，2002a；2003)的負(fù)反饋。實(shí)際上，脂肪酸合酶(FAS)抑制劑(Loftus等人，2000)，和肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)拮抗劑(Obici等人，2003)，或者LCFA油酸(Obici et等人，2002a)的中樞施用導(dǎo)致了食物攝取的降低(Obici等人，2002d；2002e；Zhang等人，1994)和內(nèi)生葡萄糖產(chǎn)生的抑制(Obici等人，2002d；2002e；Zhang等人，1994)?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)這些中樞厭食劑的通常作用是增加下丘腦弓狀核中LCFA-CoAs的細(xì)胞濃度(Obici et等人，2003)。后者的增加可能可以反過來參加一種負(fù)反饋系統(tǒng)從而用于調(diào)整在循環(huán)中的營(yíng)養(yǎng)量以應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)可利用度的改變(Obici等人，2003)。
這里，我們報(bào)道了長(zhǎng)鏈脂肪酸油酸的中樞施用抑制食物攝取和下丘腦NPY表達(dá)的能力被隨后在大鼠中進(jìn)行的為期3天的自由過量進(jìn)食所鈍化。類似地，暴露于可以導(dǎo)致食欲抗進(jìn)的美味飲食導(dǎo)致了對(duì)于易感動(dòng)物模型下丘腦瘦素和胰島素的厭食和代謝作用的抗性(Friedman，2000；Coleman，1979；Neel，1999；Wang等人，2001)。神經(jīng)肽Y(NPY)，一種有效的外生神經(jīng)肽，是下丘腦瘦素和胰島素的下游靶而它們沒能抑制NPY可能部分地解釋了為什么肥胖的一般特征表現(xiàn)為正常的或升高的食物攝取而不是血漿中瘦素和胰島素水平的提高。有意思的是，NPY也是LCFA-CoAs的下游靶，因?yàn)楫?dāng)進(jìn)行油酸，F(xiàn)AS或CPT-1抑制劑的中樞施用時(shí)防止了由節(jié)食引起的下丘腦NPYmRNA的提高(Loftus等人，2000；Obici等人，2002a；2003)。這種在過量進(jìn)食的大鼠中觀察到的由脂肪酸引起的對(duì)下丘腦NPY表達(dá)抑制的削弱可能對(duì)確定禁食后的食欲抗進(jìn)水平起到了非常重要的作用，此時(shí)循環(huán)脂肪酸升高并且血漿瘦素和胰島素水平降低。但是，還應(yīng)該被記住的是下丘腦中脂肪酸的細(xì)胞代謝可能在調(diào)控營(yíng)養(yǎng)信號(hào)方面扮演重要角色(Zhang等人，1994)。在這方面，已經(jīng)很好地-確定的細(xì)胞碳水化合物和脂類代謝之間的生化聯(lián)系可能起到了非常重要的作用。實(shí)際上，我們推測(cè)LCFA CoAs的細(xì)胞水平可能代表應(yīng)答脂肪酸的增長(zhǎng)的利用度而產(chǎn)生的主要信號(hào)。相同地，簡(jiǎn)單的碳水化合物(例如蔗糖)的利用度的增長(zhǎng)可以通過增加可抑制脂肪酸氧化的(糖分解得到的)丙二酰-CoA的水平來顯著地增加LCFA-CoAs的細(xì)胞水平。因此，可能這種中樞營(yíng)養(yǎng)-傳感機(jī)制可能可以對(duì)脂類或碳水化合物的的利用度的增加做出反應(yīng)。反過來細(xì)胞內(nèi)LCFA-CoAs的持續(xù)增長(zhǎng)可能導(dǎo)致相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)脂類代謝的適應(yīng)性改變(例如，ACC的抑制導(dǎo)致丙二酰-CoA形成的下降)。與這一假設(shè)相符，我們發(fā)現(xiàn)通過高脂肪或高蔗糖飲食達(dá)到的每日熱量攝取的增加同樣地鈍化了ICV OA對(duì)于食物攝取的作用，表明與飲食中大量營(yíng)養(yǎng)組分的改變相比每日熱量攝取的改變可能更能解釋這種效果。在這點(diǎn)上，有意義的是FAS抑制劑C75的厭食效果在小鼠由于飲食引起的和基因原因的肥胖中得到了保留(Thupari等人，2002)。作為對(duì)比，在過量禁食的大鼠中ICV OA的弱響應(yīng)可能繼發(fā)于由酰基-CoA合成酶活性的降低或者?；?硫酯酶活性的升高引起的LCFA酯化的減少和/或由于CPT1活性提高或丙二酰-CoA的耗竭而引起的LCFA-CoAs代謝的加速。如其它由于飲食引起的肥胖的模型中(Friedman，2000；Coleman，1979；Neel，1999；Wang等人，2001)，對(duì)于厭食劑應(yīng)答的缺乏可能預(yù)示了(油酸)對(duì)飲食行為的削弱的作用和/或無法抵消高脂肪和高蔗糖飲食的高美味效果。
為什么食物攝取的短期增長(zhǎng)導(dǎo)致下丘腦響應(yīng)的削弱？可能，這是一種企圖為了促進(jìn)有效能量的儲(chǔ)存以作為對(duì)食物利用度增加的“適應(yīng)性”響應(yīng)。根據(jù)Neel的節(jié)約基因型假設(shè)(Neel，1999)這一機(jī)制可能已經(jīng)發(fā)展成為一種進(jìn)化壓力的結(jié)果。有趣的是已經(jīng)證明外周的營(yíng)養(yǎng)-傳感途徑存在對(duì)過量進(jìn)食的簡(jiǎn)單反常適應(yīng)性，所述傳感途徑的刺激應(yīng)答于營(yíng)養(yǎng)可利用度的增加而減少了線粒體功能和能量支出(Obici等人，2002d)。
最近的關(guān)于胰島素(Obici等人，2002e)，瘦素(Liu等人，1998)，黑皮質(zhì)素(Obici等人，2001)，和游離脂肪酸的中樞施用的代謝作用的研究支持了這個(gè)觀點(diǎn)，即這些中樞下丘腦路徑也包括在肝臟葡萄糖輸出和胰島素作用的調(diào)控中。由于肝臟的葡萄糖產(chǎn)生是主要的內(nèi)生能量來源，我們已經(jīng)提出中樞神經(jīng)回路伴隨地調(diào)整外生和內(nèi)生的能量源，與設(shè)計(jì)用來監(jiān)控和調(diào)節(jié)循環(huán)中營(yíng)養(yǎng)輸入的負(fù)反饋系統(tǒng)相協(xié)調(diào)(Obici等人，2002a)。循環(huán)中的脂肪酸通常以及主要通過自由形式的簡(jiǎn)單擴(kuò)散來通過血腦屏障(BBB)。未結(jié)合的脂肪酸也可以通過血液中或大腦毛細(xì)血管床處脂蛋白脂肪酶對(duì)脂蛋白的水解作用來獲得。因此，乳糜微?？赡苁秋埡鬆顟B(tài)的大腦脂肪酸的主要循環(huán)來源而在禁食狀態(tài)中未結(jié)合的脂肪酸和局部的水解脂肪酸結(jié)合在一起構(gòu)成大腦脂肪酸池。一小部分進(jìn)入大腦的脂肪酸也可能是通過位于腦血管內(nèi)皮內(nèi)腔表面上的脂蛋白受體的媒介作用而直接吸收的脂蛋白顆粒(Rapoport，2001；Qi等人，2002)。全面的，循環(huán)的游離脂肪酸進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)通常正比于它們的血漿濃度(Miller等人，1987；Rapoport，1996)以及在禁食麻痹狗中它們?cè)谀X脊髓液中的濃度是血漿濃度的～6％(Goto和Spitzer，1971)。因此，盡管不能簡(jiǎn)單地推斷出ICV油酸對(duì)生理學(xué)狀況的影響，我們的發(fā)現(xiàn)提出了這種可能性，即在下丘腦中營(yíng)養(yǎng)引起的有效行為和脂肪酸代謝效果的改變可能有助于能量平衡和胰島素作用的調(diào)整。在另一方面，已經(jīng)很早就被公認(rèn)的熱量攝取的改變對(duì)于與葡萄糖代謝有關(guān)的胰島素作用具有一個(gè)很大的影響(Pagliassotti等人，1997)。在這點(diǎn)上，在動(dòng)物和人類過量飲食后的幾天和/或幾周內(nèi)肝臟的胰島素抗性得以發(fā)展(Clore等人，1995)。
這里我們報(bào)道了在由于ICV OA引起的GP抑制和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)(例如，體重/熱量吸收)之間的很強(qiáng)的相關(guān)性。在提供基礎(chǔ)的胰島素水平時(shí)，下丘腦胰島素信號(hào)的刺激(Obici等人，2002e)或OA的中樞施用(Obici等人，2002a)導(dǎo)致了內(nèi)源葡萄糖產(chǎn)生的抑制。這種LCFAs的“胰島素樣”中樞效果呈現(xiàn)出與它們已經(jīng)很好的建立的在外周組織中的活性不同(Boden等人，1994；Roden等人，1996；Rebrin等人，1995)。例如，循環(huán)中和肝臟中FFA水平的提高減少了胰島素對(duì)于內(nèi)源葡萄糖產(chǎn)生的抑制作用(也就是說，減少了肝臟胰島素抗性)，然而中樞脂肪酸水平的提高增強(qiáng)了對(duì)內(nèi)生葡萄糖產(chǎn)生的抑制作用，即使在提供基礎(chǔ)胰島素的情況下。相同地，脂肪酸可利用度的增加誘導(dǎo)了了葡萄糖-6-磷酸酶在肝臟中的表達(dá)(Massillon等人，1997)而OA的中樞施用減少了肝臟中同一種酶的表達(dá)?？梢韵胂蟮玫街舅岬闹袠行Ч麑?duì)于它們?cè)诟闻K葡萄糖變化方面的作用提供了重要的抑制。既然OA的中樞施用不能抑制過量進(jìn)食大鼠的GP，我們假設(shè)這種OA對(duì)于抑制肝臟葡萄糖產(chǎn)生和葡萄糖-6-磷酸酶表達(dá)水平方面的無能剩下了那些不被它們的中樞作用所反對(duì)的脂肪酸的外周作用。因此可能是對(duì)下丘腦LCFA響應(yīng)的缺乏導(dǎo)致了葡萄糖輸出速率的增加并有助于在這個(gè)模型中所觀察到的肝臟胰島素抗性。
這種下丘腦營(yíng)養(yǎng)傳感可能在能量劃分上也具有作用。在一般的情況下，下丘腦脂肪酸可利用度的增加導(dǎo)致肝臟中葡萄糖輸出的減少(Obici等人，2002a；2003)從而促進(jìn)了肌肉和其它外周組織的脂肪的優(yōu)先利用。但是，當(dāng)這種脂肪酸的可利用度持續(xù)增加時(shí)，它就觸發(fā)了“節(jié)約”代謝機(jī)制的活性，該機(jī)制用來促進(jìn)脂類有效地進(jìn)入能量?jī)?chǔ)存(甘油三酸酯)位點(diǎn)的變化。在過量進(jìn)食的大鼠中肝臟葡萄糖產(chǎn)生的增加可能通過提供另一種氧化能量來達(dá)到這個(gè)目標(biāo)。
這種OA調(diào)控肝臟葡萄糖變化的下游機(jī)制尚待進(jìn)行描繪。但是，這種體內(nèi)葡萄糖-6-磷酸酶引起的變化和由ICV OA引起的肝臟內(nèi)葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基的表達(dá)的顯著減少可能起到了關(guān)鍵作用。下丘腦的脂類傳感是如何調(diào)控肝臟葡萄糖變化和基因表達(dá)的呢？可能自主神經(jīng)系統(tǒng)傳出的快速改變起到了一個(gè)最主要的作用。瘦素的ICV施用增加了不同區(qū)域位點(diǎn)的自主傳出(Liu等人，1998)。眾所周知交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)系統(tǒng)都直接的提供了對(duì)于肝臟，胰腺，和脂肪組織(分別通過內(nèi)臟神經(jīng)和迷走神經(jīng))的神經(jīng)支配。實(shí)際上，下丘腦腹側(cè)正中的損傷導(dǎo)致了急性的和慢性的高胰島素血癥并且其可以通過進(jìn)行膈下迷走神經(jīng)切割術(shù)來逆轉(zhuǎn)(Berthoud和Jeanrenaud，1979；Inoue andBray，1977)。在另一方面，對(duì)于下丘腦側(cè)的電刺激沒能增加胰島素分泌或改變血胰高血糖素濃度(Berthoud和Jeanrenaud，，1979；Inoue和Bray，1977；Shimazu等人，1978)。但是，應(yīng)當(dāng)指出在進(jìn)行胰腺鉗夾實(shí)驗(yàn)中所有的研究都已經(jīng)進(jìn)行了。因此，這些胰腺激素水平的改變不可能用來解釋ICV OA對(duì)于肝臟葡萄糖變化的影響。如所指出的，對(duì)于下丘腦腹側(cè)正中的電刺激導(dǎo)致了對(duì)于大鼠肝臟中主要葡糖異生酶PEPCK和葡萄糖-6-磷酸酶活性的增加，以及對(duì)于丙酮酸激酶-主要的糖酵解酶的顯著抑制(Inoue和Bray，1977；Shimazu，1996)。在另一方面，對(duì)于下丘腦側(cè)的刺激導(dǎo)致了PEPCK活性的降低。最后，不同的脂肪庫(kù)接受來自自主神經(jīng)系統(tǒng)的輸入。后者已經(jīng)顯示可以反過來調(diào)控基因表達(dá)和脂肪來源的激素和細(xì)胞因子的分泌(在Kahn和Flier發(fā)表的評(píng)論中，2000)，其對(duì)于胰島素作用具有有效的作用(Combs等人，2001；Rajala等人，2003)。為此，ICV OA對(duì)于葡萄糖-6-磷酸酶表達(dá)和肝臟葡萄糖變化的作用使人想起那些由于向小鼠中注射了重組脂肪連接素所產(chǎn)生的變化(Combs等人，2001)。但是，在任意試驗(yàn)組的ICV注射過程中我們都無法檢測(cè)到血漿瘦素和血漿脂肪連接素水平的改變(表2)。
總之，我們已經(jīng)證明了長(zhǎng)鏈脂肪酸對(duì)于食物攝取和GP的中樞影響是營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的。在正常情況下生物學(xué)反應(yīng)(例如，食物攝取和葡萄糖輸出的改變)在一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆秶鷥?nèi)保持體內(nèi)脂肪和葡萄糖的動(dòng)態(tài)平衡。但是，營(yíng)養(yǎng)可利用度的持續(xù)增長(zhǎng)誘導(dǎo)下丘腦營(yíng)養(yǎng)傳感系統(tǒng)的迅速癱瘓(當(dāng)短期熱量限制提高時(shí))。我們推測(cè)下丘腦對(duì)于例如瘦素，胰島素和脂肪酸等多種營(yíng)養(yǎng)信號(hào)抗性的迅速開始有助于易感的人體和動(dòng)物體對(duì)于肥胖病和對(duì)于胰島素抗性的易感性。
實(shí)施例4.依靠ATP的鉀通道和迷走神經(jīng)在下丘腦調(diào)控葡萄糖產(chǎn)生方面的作用下丘腦脂氧化的減少通過刺激鉀通道(KATP)和迷走神經(jīng)來抑制內(nèi)源葡萄糖產(chǎn)生(GP)。向第三腦室(ICV)中施用長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)油酸(OA)或者CPT-1活性抑制劑(CPTi)來抑制GP。這里，我們假設(shè)CPTi的下丘腦脂類氧化抑制作用減少GP，這一點(diǎn)是通過依靠ATP的鉀通道(KATP)的中樞活化作用導(dǎo)致迷走神經(jīng)到肝臟的輸入的增加實(shí)現(xiàn)的。為了抑制LCFA進(jìn)入線粒體，我們劇烈地(持續(xù)6小時(shí))輸注帶有(CPTi-GLY和CON-GLY)或者不帶有(CPTi和CON)ICV格列苯脲(GLY，KATP“阻滯劑”)的ICV CPTi或者它的無活性立體異構(gòu)體(CON)到長(zhǎng)期帶有導(dǎo)管的S-D大鼠中。所有的大鼠還在ICV注射中的最后4小時(shí)接受了[3-3H]葡萄糖的靜脈輸注和在每項(xiàng)研究的最后兩小時(shí)進(jìn)行胰腺/胰島素鉗夾(胰島素1mU/kg.min；生長(zhǎng)激素抑制素3mg/kg/min)試驗(yàn)。在提供基礎(chǔ)胰島素水平時(shí)，在CPTi(4.9±1.0mg/kg/min)組中需要進(jìn)行葡萄糖注射(GIR)以防止低血糖癥，但是在CON(2.1±0.4mg/kg/min)組中和CPTi-GLY(1.4±0.5mg/kg/min)組中不用注射。在CPTi組中GP顯著地和明顯地降低了(-47±5％對(duì)應(yīng)于基礎(chǔ)值；p＜0.01；n＝7)，但是在CON(-15±6％；n＝6)或CPTi-GLY(-11±8％；n＝6)組中沒有。ICV GLY沒有改變CON-注射大鼠中的GIR和GP(沒有顯示)。為了研究這種神經(jīng)路徑是否通過迷走神經(jīng)肝臟支路來發(fā)揮作用，還對(duì)接受肝臟選擇性迷走神經(jīng)切斷術(shù)(LV)或者假手術(shù)(SH)的大鼠進(jìn)行了ICV CPTi或CON注射。與CON-SH(1.3±0.4mg/kg/min)和CPTi-LV(0.8±0.5mg/kg/min)相比，在CPTi-SH(4.7±1.3mg/kg/min)組中GIR明顯更高。這些GIR的不同完全可以用在CPTi-SH組中出現(xiàn)而在CON-SH(-5±3％；n＝6)組中或在CPTi-LV(-11±4％；n＝7)組中沒有出現(xiàn)的GP的顯著降低(-48±2％；P＜0.01；n＝5)來解釋。LV本身(CON-LV)不影響GIR和GP。因此，下丘腦脂類傳感通過需要KATP活性和迷走神經(jīng)對(duì)肝臟的輸入的神經(jīng)環(huán)路來有效的調(diào)控GP。
應(yīng)答脂類注射的肝臟“自我調(diào)控”需要K-通道(KATP)的中樞刺激和肝臟的迷走神經(jīng)分布。在提供基礎(chǔ)的胰島素水平時(shí)，通過脂類注射增加的血漿中長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)水平刺激了糖異生(GNG)但是因?yàn)檠a(bǔ)償性的肝臟內(nèi)肝糖分解的下降(GLG)所以并不改變內(nèi)源葡萄糖產(chǎn)生(GP)(肝臟的“自我調(diào)控”)。由于向第三腦室施用LCFA油酸通過對(duì)KATP的刺激而抑制了GP，所以在這里我們推測(cè)1)在脂類注射過程中通過LCFA對(duì)KATP的中樞激活作用抑制GP，和2)這種作用需要肝臟內(nèi)迷走神經(jīng)的輸入。為了這個(gè)目的，經(jīng)過5小時(shí)禁食的S-D大鼠被隨機(jī)的接受以下物質(zhì)進(jìn)行6小時(shí)IV Intra lipid+肝素(IL)(增加了3倍的LCFA水平)或者鹽(S)結(jié)合ICV格列苯脲(G)[KATP阻斷劑]或者賦形劑(C)。所有的大鼠還在ICV注射的最后4小時(shí)接受[3-3H]-葡萄糖的靜脈注射并在最后10分鐘進(jìn)行[U-14C]-乳酸鹽的注射以及在每項(xiàng)研究的最后兩小時(shí)進(jìn)行胰腺/胰島素鉗夾試驗(yàn)。在鉗夾過程中，當(dāng)提供接近的基礎(chǔ)胰島素水平時(shí)(～27μU/ml)，在S+ICVC，S+ICVG或IL+ICVC中GP(～6mg/kg.min)都沒有改變。帶有ICVC或ICYG的脂類注射增加了GNG但是只有IL+ICVG沒有抑制GLG，導(dǎo)致GP的增加(達(dá)到9.8±0.3；P＜0.001)。為了驗(yàn)證LCFA對(duì)GP的中樞作用是否通過迷走神經(jīng)的刺激所介導(dǎo)，我們接下來在進(jìn)行了選擇性肝臟迷走神經(jīng)切斷術(shù)(HV)的大鼠中重復(fù)了脂類注射試驗(yàn)。在胰腺鉗夾實(shí)驗(yàn)中，S-處理HV和S或IL處理的假手術(shù)大鼠中GP(～6mg/kg/min)是相似的。重要的是，IL在HV組中將GP增加到了9.7±0.5(P＜0.001)，概述了ICVG的作用。在所有的組中葡萄糖利用都是相同的。
總而言之，外周LCFA引起的肝臟葡萄糖“自我調(diào)控”需要下丘腦KATP和肝臟迷走神經(jīng)。因此，我們推測(cè)系統(tǒng)性高血脂激活了中樞脂類傳感途徑，其通過需要中樞KATP激活和迷走神經(jīng)傳出纖維向肝臟的輸入降低的神經(jīng)回路來有效地控制GP。
回顧上面的描述，可以看出本發(fā)明的一些優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)獲得而其它優(yōu)點(diǎn)也達(dá)到了。
由于對(duì)于上述方法和組成進(jìn)行的不同的改變并不超出本發(fā)明的范圍，這意味著在上述說明書中和附圖中顯示的所有內(nèi)容都應(yīng)該解釋為描述性的而不是一種限定意義。
所有在說明書中所引用的參考文件在這里作為參考完整的引入本發(fā)明中。這里對(duì)于參考文件的討論僅僅是為了總結(jié)作者所提出的理論并且沒有承認(rèn)這里所有的參考文件都看作現(xiàn)有技術(shù)。申請(qǐng)人保留挑戰(zhàn)這些參考文件精確性和相關(guān)性的權(quán)利。
附錄-SEQ ID NOsSEQ ID NO1-核酶ACAGCACGCCGCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCACGUUCUUCGUCSEQ ID NO2-核酶CTGTACCAAAGAGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGCCGCTCACAATGASEQ ID NO3-核酶CATTGTGAGCGGCGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGCTCTTTGGTACAGASEQ ID NO4-隨機(jī)序列GGAGCCTCGAGATCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGTGAGCGTTTGGSEQ ID NO5-CPT1L前引物CTCCGAGCTCAGTGAGGACCTAAAG-3′SEQ ID NO6-CPT1L反向引物CAAATACCACTGCAATTTGTGSEQ ID NO7-CPT1M前引物CCAGACTGCAGAAATACCTGGTGCTCSEQ ID NO8-CPT1M反向引物GTTCTGACGTGCTTCTGCCCACTCTACSEQ ID NO9-NPY前引物GCCATGATGCTAGGTAACAAACGSEQ ID NO10-NPY反向引物GTTTCATTTCCCATCACCACATG
SEQ ID NO11-POMC前引物CCAGGCAACGGAGATGAACSEQ ID NO12-POMC反向引物TCACTGGCCCTTCTTGTGCSEQ ID NO13-AgRP前引物GCCATGCTGACTGCAATGTTSEQ ID NO14-AgRP反向引物TGGCTAGGTGCGACTACAGASEQ ID NO15-β-肌動(dòng)蛋白 前引物TGAGACCTTCAACACCCCAGCCSEQ ID NO16-β-肌動(dòng)蛋白 反向引物GAGTACTTGCGCTCAGGAGGAG
權(quán)利要求
1.一種在哺乳動(dòng)物中減少食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的方法，該方法包括增加哺乳動(dòng)物下丘腦的長(zhǎng)鏈脂肪?；?輔酶-A(LC-CoA)水平，其中所述哺乳動(dòng)物具有至少一種選自以下的病癥肥胖、2型糖尿病、瘦素抗性、胰島素抗性、促性腺激素缺乏癥、無月經(jīng)和多囊卵巢綜合癥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中LC-CoA是通過減少下丘腦LC-CoA-減少分子的活性來增加的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中LC-CoA-減少分子選自肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1(CPT1)，丙二酰-輔酶A脫羧酶，肉堿酰基肉堿移位酶，酰基-輔酶A脫氫酶，2-烯酰基-輔酶A水合酶，3-羥酰-輔酶A脫氫酶，3-氧酰-輔酶A硫解酶，和?；?輔酶A水解酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中LC-CoA-減少分子是CPT1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中CPT1是肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶-1的肝臟同種型(CPT1L)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動(dòng)物大腦施用藥物組合物來減少的，所述藥物組合物包括可以減少LC-CoA-減少分子活性的小分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中藥物組合物是通過組合物向大腦的直接施用方式來施用給哺乳動(dòng)物大腦的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中小分子當(dāng)出現(xiàn)在藥物組合物中時(shí)是可以通過血-腦屏障的。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動(dòng)物大腦施用抗體或包含抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段來減少的，其中抗體或者抗體片段可以與LC-CoA-減少分子結(jié)合從而抑制這種分子的活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動(dòng)物大腦施用抑制性的核酸或模擬體來減少的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中抑制性的核酸或者模擬體選自核酶，反義化合物，適配子和iRNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中抑制性的核酸或者模擬體是核酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中LC-CoA-減少分子是CPT1L并且核酶包括序列5′-ACAGCACGCCGCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCACGUUCUUCGUC-3′。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中LC-CoA水平是通過增加下丘腦LC-CoA-增加分子的活性來增加的。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中LC-CoA-增加分子選自乙酰-輔酶A羧化酶，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)分子，酰基-輔酶A合成酶，肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶II，和酰基-輔酶A硫酯酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中LC-CoA-增加分子的活性是通過向哺乳動(dòng)物大腦施用藥物組合物來增加的，所述藥物組合物包括能夠刺激LC-CoA-增加分子生產(chǎn)或活性的小分子。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中藥物組合物是通過直接施用給大腦的方式來施用給哺乳動(dòng)物大腦的。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中藥物組合物可以通過血-腦屏障。
19.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中LC-CoA-增加分子的活性是通過向下丘腦施用這種分子或者編碼這種分子的載體來增加的。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中這種分子是包含在藥物可接受載體中施用給下丘腦的。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中將編碼這種分子的載體施用給下丘腦。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中載體是病毒載體。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中LC-CoA是通過直接向大腦施用LC-CoA來增加的。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動(dòng)物是人類。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動(dòng)物是患有糖尿病的。
27.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動(dòng)物超過正常體重至少5％。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動(dòng)物超過正常體重至少20％。
29.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中食物攝取減少至少5％。
30.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中食物攝取減少至少20％。
31.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中食物攝取減少至少40％。
32.一種在患有食物攝取或葡萄糖產(chǎn)生不足的病癥的哺乳動(dòng)物中增加食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的方法，該方法包括減少哺乳動(dòng)物下丘腦長(zhǎng)鏈脂肪?；?輔酶-A(LC-CoA)的水平。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中LC-CoA的水平是通過減少下丘腦LC-CoA-增加分子的活性來減少的。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中LC-CoA-增加分子是選自乙酰-輔酶A羧化酶、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)分子、酰基-輔酶A合成酶、肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶II和酰基-輔酶A硫酯酶。
35.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中LC-CoA-增加分子的活性是通過向哺乳動(dòng)物大腦施用藥物組合物來減少的，所述藥物組合物包括能夠抑制LC-CoA-減少分子活性的小分子。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中藥物組合物是通過直接向哺乳動(dòng)物大腦施用的形式來施用給哺乳動(dòng)物大腦的。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中小分子當(dāng)出現(xiàn)在藥物組合物中時(shí)可以通過血-腦屏障。
38.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中LC-CoA-增加分子的活性是通過向哺乳動(dòng)物大腦施用抗體或包含抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段來減少的，其中抗體或者抗體片段能夠與LC-CoA-增加分子結(jié)合從而抑制這種分子的活性。
39.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中LC-CoA-增加分子的活性是通過向哺乳動(dòng)物大腦施用抑制性的核酸或模擬體來減少的。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中抑制性的核酸或模擬體選自核酶、反義化合物、適配子和iRNA。
41.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中這種抑制性的核酸或模擬體是核酶。
42.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中LC-CoA的水平是通過增加下丘腦LC-CoA-減少分子的活性來減少的。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中LC-CoA-減少分子選自肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)，丙二酰-輔酶A脫羧酶，肉堿?；鈮A移位酶，?；?輔酶A脫氫酶，2-烯?；?輔酶A水合酶，3-羥酰-輔酶A脫氫酶，3-氧酰-輔酶A硫解酶，和?；?輔酶A水解酶。
44.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中LC-CoA-減少分子是CPT1。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中CPT1是肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶-1的肝臟同種型(CPT1L)。
46.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動(dòng)物大腦施用藥物組合物來增加的，所述藥物組合物包括能增加LC-CoA-增加分子活性的小分子。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中藥物組合物通過直接施用給大腦的方式施用到大腦。
48.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中這種藥物組合物可以通過血-腦屏障。
49.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中這種LC-CoA-增加分子的活性是通過向下丘腦施用這種分子或編碼這種分子的載體來增加的。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中這種分子是包含在藥物可接受載體中施用下丘腦的。
51.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中將編碼這種分子的載體施用到下丘腦。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中這種載體是病毒載體。
53.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中這種哺乳動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物。
54.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中這種哺乳動(dòng)物是人類。
55.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中這種哺乳動(dòng)物低于正常體重至少10％。
56.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中這種哺乳動(dòng)物低于正常體重至少20％。
57.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中食物攝取提高至少5％。
58.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中食物攝取增加至少20％。
59.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中食物攝取增加至少40％。
60.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中這種哺乳動(dòng)物正在經(jīng)受導(dǎo)致食物攝取或葡萄糖產(chǎn)生不足的治療。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中這種治療是進(jìn)行癌癥化療。
62.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中這種哺乳動(dòng)物具有導(dǎo)致食物攝取或葡萄糖產(chǎn)生不足的病毒感染。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中這種哺乳動(dòng)物是人類并且這種感染是HIV-1。
64.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中這種哺乳動(dòng)物是低血糖癥患者。
65.一種在具有肝臟自我調(diào)節(jié)功能不全的哺乳動(dòng)物中恢復(fù)肝臟自我調(diào)節(jié)功能的方法，這種方法包括增加哺乳動(dòng)物下丘腦長(zhǎng)鏈脂肪酰基-輔酶-A的水平。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中LC-CoA是通過減少下丘腦LC-CoA-減少分子活性來增加的。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中這種LC-CoA-減少分子是CPT1。
68.根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其中這種CPT1是肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶-1的肝臟同種型(CPT1L)。
69.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中這種LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動(dòng)物大腦施用藥物組合物來減少的，所述藥物組合物包括能夠減少這種LC-CoA-減少分子活性的小分子。
70.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中這種LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動(dòng)物大腦施用抗體或包含抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段來減少的，其中這種抗體或者抗體片段能夠與LC-CoA-減少分子結(jié)合從而抑制這種分子的活性。
71.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中這種LC-CoA-減少分子的活性是通過向哺乳動(dòng)物大腦施用抑制性的核酸或模擬體來減少的。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的方法，其中這種抑制性的核酸或模擬體是核酶。
73.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中LC-CoA水平是通過增加下丘腦LC-CoA-增加分子的活性來增加的。
74.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中LC-CoA是通過直接向大腦施用LC-CoA來增加的。
75.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中這種哺乳動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物。
76.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中這種哺乳動(dòng)物是人類。
77.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中這種哺乳動(dòng)物是糖尿病患者。
78.一種在哺乳動(dòng)物中減少食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的方法，這種方法包括刺激肝臟的迷走神經(jīng)傳出纖維，其中這種哺乳動(dòng)物具有至少一種選自以下的病癥肥胖、2型糖尿病、瘦素抗性、胰島素抗性、促性腺激素缺乏癥、無月經(jīng)和多囊卵巢綜合癥。
79.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中這種肝臟的迷走神經(jīng)傳出纖維是被電刺激的。
80.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中肝臟的迷走神經(jīng)傳入纖維沒有被刺激的。
81.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中這種肝臟的迷走神經(jīng)傳出纖維是通過直接刺激肝臟來進(jìn)行刺激的。
82.一種在具有肝臟自我調(diào)節(jié)功能不全的哺乳動(dòng)物中恢復(fù)肝臟自我調(diào)節(jié)功能的方法，該方法包括刺激肝臟的迷走神經(jīng)傳出纖維。
全文摘要
本發(fā)明涉及減少哺乳動(dòng)物食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的方法，或者恢復(fù)肝臟的自我調(diào)整功能的方法。該方法包括提高下丘腦的長(zhǎng)鏈脂肪?；o酶A(LC－CoA)的含量，或者刺激迷走神經(jīng)肝臟分支的傳出纖維。本發(fā)明還提供了提高哺乳動(dòng)物食物攝取和葡萄糖產(chǎn)生的方法。該方法包括減少哺乳動(dòng)物中下丘腦的長(zhǎng)鏈脂肪?；o酶A(LC－CoA)的含量。
文檔編號(hào)A61K31/7105GK1964630SQ200480008673
公開日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2004年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月13日
發(fā)明者L·羅塞蒂, S·奧比西 申請(qǐng)人:耶希瓦大學(xué)艾伯塔·愛恩斯坦醫(yī)學(xué)院