專利名稱：對抗支氣管敗血性博德特氏桿菌的犬疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及包含支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原的疫苗；及將其使用來保護(hù)狗對抗由支氣管敗血性博德特氏桿菌所造成的傳染性氣管、支氣管炎(“犬舍咳”)。本發(fā)明也涉及一種聯(lián)合疫苗，其包含氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原及一種或多種的其它犬科病原體抗原諸如犬瘟熱(canine distemper)(CD)病毒、2型犬腺病毒(canine adenovirus)(CAV-2)、犬副流感(canine parainfluenza)(CPI)病毒、犬冠狀病毒(canine coronavirus)(CCV)、犬細(xì)小病毒(canine parvovirus)(CPV)、布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體(Leptospira bratislava)、犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola)、感冒傷寒型鉤端螺旋體(Leptospira grippotyphosa)、黃疸出血型鉤端螺旋體(Leptospira icterohaemorrhagiae)或波摩那鉤端螺旋體(Leptospira pomona)。本發(fā)明也提供使用聯(lián)合疫苗來保護(hù)狗對抗由犬科病原體所引起的疾病的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在商業(yè)上可購得的犬支氣管敗血性博德特氏桿菌疫苗產(chǎn)品由滅活的、非佐劑化的支氣管敗血性博德特氏桿菌全細(xì)胞細(xì)菌所組成。此全細(xì)胞細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致與細(xì)胞蛋白質(zhì)相關(guān)的接種后反應(yīng)。支氣管敗血性博德特氏桿菌的p68蛋白質(zhì)與百日咳桿菌(B.pertussis)的外膜蛋白質(zhì)(OMP)及副百日咳桿菌(B.parapertussis)的OMP抗原類似(Shahin等人，“百日咳博德特氏桿菌(Bordetella pertussis)的69-kD外膜蛋白質(zhì)的保護(hù)能力及免疫原性特征”，J.Exp.Med.，17163-73，1990)。此OMP對于老鼠已顯示出保護(hù)角色(Shahin等人，前述；Novotny等人，“百日咳博德特氏桿菌的69-kD外膜蛋白質(zhì)的生物學(xué)及保護(hù)性質(zhì)一種新穎的無細(xì)胞百日咳疫苗配方”，J.Infect.Dis.164114-22，1991)、人類(He等人，“免疫球蛋白G抗體對在副百日咳博德式桿菌感染中的百日咳博德特氏桿菌的絲狀血凝素(FilamentousHemagglutinin)及百日咳桿菌粘附素(pertactin)的保護(hù)角色”，Eur.J Clin Microbiol Infect Dis.10793-798，1996)及豬(Kobisch等人，“使用無特定病原體的小豬來鑒別做為支氣管敗血性博德特氏桿菌的主要保護(hù)抗原的68-KD的外膜蛋白質(zhì)”，Infect.Immun.58(2)352-357，1990)。
在本發(fā)明之前尚未出現(xiàn)對于狗既安全又有效的支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原的疫苗。因此，需要發(fā)展合適于犬科使用的包含p68抗原的支氣管敗血性博德特氏桿菌疫苗。甚至更優(yōu)良的是，希望此支氣管敗血性博德特氏桿菌p68疫苗能安全施用于幼犬并能提供一段長時(shí)間的保護(hù)。
CD為具有易變表征的、世界性分布的高死亡率病毒性疾病。大約50％被CD病毒感染的未接種、未免疫的狗會(huì)發(fā)展出臨床征象，其中大約90％會(huì)死亡。
由1型犬腺病毒(CAV-1)所造成的傳染性犬肝炎或ICH為世界性分布的、有時(shí)具致命性的狗的病毒性疾病，其特征為肝及全身性內(nèi)皮病灶。CAV-2會(huì)造成呼吸道疾病，其在嚴(yán)重的情況下可包括肺炎及支氣管炎。
CPI為平常的病毒上呼吸道疾病。無并發(fā)癥時(shí)的CPI溫和或臨床癥狀不明顯，但若同時(shí)感染其它呼吸道病原體時(shí)征象會(huì)變更嚴(yán)重。
CPV感染會(huì)產(chǎn)生腸道疾病，其特征為突然開始嘔吐及腹瀉，經(jīng)常是出血性。通常伴隨的臨床征象為白血球減少癥。任何年齡的易感狗群皆會(huì)受影響，但是死亡率最高在幼犬。在年齡4-12周的幼犬中，CPV偶爾會(huì)造成心肌炎，此會(huì)在短暫及不顯著的病癥后導(dǎo)致急性心衰竭。在感染后，許多狗對該疾病有一年或多年的抵抗力。血清反應(yīng)呈陽性的母狗會(huì)類似地將CPV抗體傳送至其幼犬，此會(huì)以自動(dòng)免疫作用干涉所述幼犬至16周犬齡。
CCV也會(huì)在世界范圍內(nèi)于全部年齡的易感狗群中造成腸道疾病。該病毒具有高度接觸傳染性，其主要通過直接與感染性排泄物接觸而傳送，且可在接觸后的1-4天內(nèi)造成的臨床的腸炎。該疾病的嚴(yán)重性會(huì)由于其它原因的同時(shí)感染而加劇。CCV感染的主要征象包括厭食、嘔吐及腹瀉。嘔吐頻率在一或兩天內(nèi)開始腹瀉后通常減弱，但腹瀉會(huì)持續(xù)整個(gè)感染病程，且糞便偶爾會(huì)包含血紋。在CCV感染后，在無并發(fā)的情況下，大部分的狗仍然無發(fā)熱且不會(huì)觀察到白血球減少癥。
鉤端螺旋體病會(huì)發(fā)生在全部年齡的狗中，在急性感染后發(fā)生通常有廣泛的臨床征象范圍及慢性腎炎。無法臨床區(qū)別由犬鉤端螺旋體及黃疸出血型鉤端螺旋體的感染。
在本發(fā)明之前，尚無能有效保護(hù)狗對抗支氣管敗血性博德特氏桿菌及一種或多種其它犬科病原體諸如CD病毒、CAV-2、CPI病毒、CPV、CCV及細(xì)螺旋體種(諸如布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體及波摩那鉤端螺旋體)的聯(lián)合疫苗。在發(fā)展聯(lián)合疫苗上的問題包括功效干擾，即因?yàn)樵谠摻M合物中存在有其它抗原，于該聯(lián)合組合物中的一種或多種抗原不能維持或?qū)崿F(xiàn)功效。據(jù)信這是在施用于宿主(例如，狗)的組合物中的抗原受干擾的結(jié)果，諸如該抗原會(huì)因?yàn)榇嬖谟谠摻M合物中的其它抗原于宿主中所引發(fā)的在免疫學(xué)、抗原、抗體或保護(hù)上的反應(yīng)而受干擾。但是，對其它宿主(諸如狗)而言，聯(lián)合疫苗是已知的。據(jù)信在狗上的功效干擾是由于犬科生物系統(tǒng)的某些特征，或由于所述抗原與犬科生物系統(tǒng)反應(yīng)。
因此，需要發(fā)展適宜施用于狗的聯(lián)合疫苗，以對抗支氣管敗血性博德特氏桿菌及一種或多種其它犬科病原體，而不會(huì)在犬科動(dòng)物中顯示出功效干擾。甚至更優(yōu)良的是，此聯(lián)合疫苗可安全施用于幼犬并能提供長時(shí)間的保護(hù)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于保護(hù)狗對抗由犬科病原體所引起的疾病的疫苗及方法。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供適宜施用于狗且能保護(hù)狗對抗由支氣管敗血性博德特氏桿菌所引起的疾病的p68疫苗。本發(fā)明的此疫苗包括支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原及獸醫(yī)可接受的載體(諸如佐劑)。
在另一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供保護(hù)狗對抗由支氣管敗血性博德特氏桿菌所引起的疾病的方法，該方法對狗施用包含支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原與獸醫(yī)可接受的載體(諸如佐劑)的疫苗。
在還有另一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供適宜施用于狗的聯(lián)合疫苗。本發(fā)明的聯(lián)合疫苗包括支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原與至少一種來自其它犬科病原體的其它抗原(其能在狗中引發(fā)對抗由這樣的其它病原體所引起的疾病的保護(hù)性免疫反應(yīng))的聯(lián)合。這樣的其它病原體可選自于犬瘟熱(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感病毒、犬細(xì)小病毒(CPV)、犬冠狀病毒(CCV)、犬皰疹病毒、狂犬病病毒、布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體、Leptospirahardjobovis、單胞菌屬(Porphyromonas spp.)、擬桿菌屬(Bacteriodes spp.)、利什曼原蟲屬(Leishmania spp.)、包柔氏鉤端螺旋體屬(Borrelia spp.)、埃利希氏體屬(Ehrlichia spp.)、霉?jié){菌屬(Mycoplasma spp.)及犬小孢子菌(Microsporum canis)。
本發(fā)明優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括犬瘟熱(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感病毒及犬細(xì)小病毒(CPV)的減毒株；犬冠狀病毒(CCV)株的滅活制劑；及支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括犬瘟熱(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感(CPI)病毒及犬細(xì)小病毒(CPV)的減毒株；犬冠狀病毒(CCV)株的滅活制劑；支氣管敗血性博德特氏桿菌p68蛋白質(zhì)；及五種血清型螺旋體(布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體及波摩那鉤端螺旋體)的經(jīng)滅活的細(xì)胞制劑。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒的減毒株；CPV株系；及支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒的減毒株；CPV株系；支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原；及犬鉤端螺旋體與黃疸出血型鉤端螺旋體的經(jīng)滅活的細(xì)胞制劑。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒的減毒株；CPV株系；支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原及五種血清型螺旋體(布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體及波摩那鉤端螺旋體)的經(jīng)滅活的細(xì)胞制劑。
另一個(gè)優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原與經(jīng)減毒的CPI病毒。
還有另一個(gè)優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原、經(jīng)減毒的CPI病毒及犬鉤端螺旋體與黃疸出血型鉤端螺旋體的經(jīng)滅活的細(xì)胞制劑。
本發(fā)明也提供保護(hù)狗對抗由犬科病原體所引起的疾病的方法，該方法對狗施用本發(fā)明的聯(lián)合疫苗。


圖1在未接種與接種博德特氏桿菌p68(15微克/劑量)的狗中，對抗支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后的p68 ELISA終點(diǎn)滴度幾何平均值的總結(jié)。
圖2以支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠對狗激發(fā)免疫反應(yīng)后，血清淀粉狀蛋白質(zhì)A滴度的總結(jié)。
圖3未接種的狗與接種博德特氏桿菌p68的狗在接種后，以支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后，p68 ELISA終點(diǎn)滴度幾何平均值的總結(jié)。
圖4以支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠對狗激發(fā)免疫反應(yīng)后，血清淀粉狀蛋白質(zhì)A滴度的總結(jié)。
圖5蛋白質(zhì)印跡法顯示出p68單克隆抗體Bord 2-7對p68全細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的反應(yīng)性。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供適宜施用于狗的單價(jià)疫苗，其能保護(hù)狗對抗由支氣管敗血性博德特氏桿菌所引起的疾病。本發(fā)明的單價(jià)疫苗包括重組產(chǎn)生的支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原與獸醫(yī)可接受的載體(諸如佐劑)。
在另一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供保護(hù)狗對抗由支氣管敗血性博德特氏桿菌所引起的疾病的方法，其可通過對狗施用包含重組產(chǎn)生的支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原與獸醫(yī)可接受的載體(諸如佐劑)的單價(jià)疫苗。
在還有另一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供適宜施用于狗的聯(lián)合疫苗。本發(fā)明的聯(lián)合疫苗包括重組產(chǎn)生的支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原與至少一種其它抗原(其能在狗中引發(fā)對抗由此其它抗原所引起的疾病的保護(hù)性免疫反應(yīng))的組合。
本發(fā)明的優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括犬瘟熱(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感病毒及犬細(xì)小病毒(CPV)的減毒株；犬冠狀病毒(CCV)株的滅活制劑；及支氣管敗血性博德特氏桿菌p68蛋白質(zhì)。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括犬瘟熱(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感病毒及犬細(xì)小病毒(CPV)的減毒株；犬冠狀病毒(CCV)株的滅活制劑；支氣管敗血性博德特氏桿菌p68蛋白質(zhì)；及五種血清型螺旋體(布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體及波摩那鉤端螺旋體)的制劑。
本發(fā)明還有另一個(gè)優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒的減毒株；CPV株系；及支氣管敗血性博德特氏桿菌p68蛋白質(zhì)。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒的減毒株；CPV株系；支氣管敗血性博德特氏桿菌p68蛋白質(zhì)；及犬鉤端螺旋體及黃疸出血型鉤端螺旋體的制劑。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括CD病毒、CAV-2、CPI病毒的減毒株；CPV株系；及五種血清型螺旋體(布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體及波摩那鉤端螺旋體)的制劑。
本發(fā)明也提供保護(hù)狗對抗由犬科病原體所引起的疾病的方法，該方法對狗施用本發(fā)明的聯(lián)合疫苗。
為了公開的清楚性且不由其所限制，于此將本發(fā)明的詳細(xì)說明劃分成下列數(shù)小節(jié)來描述或闡明本發(fā)明的某些特征、具體實(shí)施例或應(yīng)用。
定義及縮寫在此使用的術(shù)語“保護(hù)狗對抗由犬科病原體所引起的疾病”指稱減低或消除由病原體感染的風(fēng)險(xiǎn)、使病情好轉(zhuǎn)或緩和該感染癥狀、或加速從感染狀態(tài)恢復(fù)。例如，若降低病毒或細(xì)菌負(fù)荷、降低病毒或細(xì)菌脫落(shedding)、減小感染發(fā)生率或持續(xù)期間、降低急性階段的血清蛋白質(zhì)水平、降低直腸溫度和/或增加食物吸收性和/或發(fā)育時(shí)，則實(shí)現(xiàn)了保護(hù)。
術(shù)語“p68抗原”指稱具有分子量如SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳所確定的68kDa的蛋白質(zhì)，其被p68-特異的單克隆抗體Bord 2-7(ATCC#)識(shí)別，且具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列或?qū)嵸|(zhì)上與SEQ ID NO1相同的氨基酸序列。
術(shù)語“實(shí)質(zhì)上相同”指稱其序列一致性至少約90％，優(yōu)選為至少約95％，或更優(yōu)選為至少約98％。
在此使用的術(shù)語“單價(jià)疫苗”指為具有主要抗原組分的疫苗。例如，p68單價(jià)疫苗包括支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原，其作為該疫苗的主要抗原組分且能保護(hù)已施用該疫苗的動(dòng)物對抗由支氣管敗血性博德特氏桿菌所引起的疾病。
“聯(lián)合疫苗”指稱能在狗中引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原的二價(jià)或多價(jià)聯(lián)合。該聯(lián)合疫苗對抗一種或多種病原體的保護(hù)效應(yīng)通常借助在動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)(細(xì)胞介導(dǎo)的或體液免疫反應(yīng)或二者的聯(lián)合)而實(shí)現(xiàn)。
“免疫原性”指稱組合物在狗中導(dǎo)致對抗特別病原體的免疫反應(yīng)的能力。該免疫反應(yīng)可為主要由細(xì)胞毒素的T細(xì)胞與產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，或主要由輔助性T細(xì)胞所介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，其依次可活化B細(xì)胞導(dǎo)致抗體生成。
術(shù)語“處理有效量”或“有效量”指為足以在施用了該疫苗的狗中引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的單價(jià)或聯(lián)合疫苗量。該免疫反應(yīng)可包括(不限于)誘導(dǎo)細(xì)胞和/或體液免疫。該疫苗的處理有效量可根據(jù)使用在該疫苗中的特別抗原、狗的年齡及狀態(tài)和/或感染程度而變化，且可由獸醫(yī)決定。
p68疫苗本發(fā)明第一次展示包含支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原的疫苗組合物有效保護(hù)狗對抗由支氣管敗血性博德特氏桿菌所引起的疾病。本發(fā)明的疫苗組合物不會(huì)產(chǎn)生明顯的接種后反應(yīng)、可安全施用于幼犬且可在狗中引發(fā)持續(xù)一段長時(shí)間的保護(hù)性免疫。
據(jù)此，本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例涉及包含支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原(或“p68疫苗”)的疫苗組合物，其適宜施用于狗并能保護(hù)狗對抗由支氣管敗血性博德特氏桿菌所引起的疾病，例如，傳染性氣管與支氣管炎(“犬舍咳”)。
對本發(fā)明的目的而言，“p68抗原”指為具有分子量如SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳所確定的68kDa的蛋白質(zhì)，其被p68-特異的單克隆抗體Bord 2-7(ATCC#)識(shí)別，且具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列或?qū)嵸|(zhì)上與SEQ ID NO1相同的氨基酸序列?！皩?shí)質(zhì)上相同”指稱該序列一致性至少約90％，優(yōu)選為至少約95％或更優(yōu)選為至少約98％。具有實(shí)質(zhì)上SEQ ID NO1一致的氨基酸序列的p68抗原的實(shí)例有描述在WO 92/17587中的p68抗原，其以SEQ ID NO3加以說明。本發(fā)明的p68特定的單克隆抗體可例如識(shí)別出天然的p68蛋白質(zhì)、重組型p68蛋白質(zhì)及在細(xì)菌表面上的p68蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，適用于本發(fā)明的p68抗原包括天然的p68蛋白質(zhì)(即，從支氣管敗血性博德特氏桿菌中純化出的天然存在的p68蛋白質(zhì))和重組產(chǎn)生的p68蛋白質(zhì)二者。
來自支氣管敗血性博德特氏桿菌的天然p68的純化則例如描述在Montaraz等人，Infection and Immunity47744-751(1985)中；且也闡明在提供于下文的實(shí)施例中。p68的重組產(chǎn)生可使用任何一種由本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的分子克隆及重組表達(dá)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。例如，可將能編碼p68的核酸分子引進(jìn)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，諸如細(xì)菌、酵母細(xì)胞(例如，畢赤氏酵母(Pichia)細(xì)胞)、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞)。所述編碼p68的核酸分子可以被置于針對能實(shí)現(xiàn)p68抗原在宿主細(xì)胞中表達(dá)的起動(dòng)子的可操作的鍵合中。由該宿主細(xì)胞表達(dá)的p68可以使用例行的蛋白質(zhì)純化技術(shù)易于純化。
在本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施例中，可將如SEQ ID NO2所示編碼SEQ ID NO1的氨基酸序列的p68抗原的核酸序列在表達(dá)載體中克隆，且置于針對溫度敏感的起動(dòng)子的可操作的鍵合中。將該表達(dá)載體引進(jìn)大腸桿菌，且以加熱誘導(dǎo)表達(dá)該p68抗原。溶解所述細(xì)胞，使用離心機(jī)分離積聚該p68抗原的內(nèi)含體。使用SDS或其它本領(lǐng)域中熟知的增溶劑(諸如尿素、鹽酸胍、膽酸鈉、牛磺膽酸鹽及脫氧膽酸鈉)溶解該內(nèi)含體中的重組型p68。根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)純化的天然或重組型p68蛋白質(zhì)聯(lián)合獸醫(yī)可接受的載體而形成p68疫苗組合物。
術(shù)語“獸醫(yī)可接受的載體”包括任何及全部的溶劑、分散介質(zhì)、涂布物、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌及抗真菌劑、等滲劑、吸收延緩劑及其類似物。稀釋劑可包括水、鹽水右旋糖、乙醇、甘油及其類似物。等滲劑尤其可包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇及乳糖。穩(wěn)定劑尤其包括白蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，合適于使用的佐劑包括(但是不限于)數(shù)種佐劑種類，諸如無機(jī)鹽類，例如礬、氫氧化鋁、磷酸鋁及磷酸鈣；表面活性劑及微粒子類，例如非離子嵌段聚合物表面活性劑(例如，膽固醇)、病毒脂蛋白體、皂素(例如Quil A、QS-21及GPI-0100)、蛋白體、免疫刺激復(fù)合物、蝸形載體(cochleates)、季胺(二甲基雙十八烷基銨溴化物(DDA))、阿夫立定、維生素A、維生素E；細(xì)菌產(chǎn)物，諸如RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi Inc.)、草分枝桿菌的細(xì)胞壁骨架(Detox)、胞壁?；念?MDP)及三肽類(MTP)、單磷?；|(zhì)A、卡介苗(Bacillus Calmete-Guerin)、熱不穩(wěn)定的大腸桿菌腸毒素、霍亂毒素、海藻糖二霉菌酸酯、CpG寡脫氧核糖核酸；細(xì)胞因子及激素類，例如白細(xì)胞介素(IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、脫氫表雄甾酮、1，25-二羥基維生素D3；多聚陰離子類，例如，葡聚糖；聚丙烯酸類(例如，聚甲基丙烯酸甲酯、Carbopol 934P)；載劑，例如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、霍亂毒素B亞基、腸毒性大腸桿菌的突變型熱不穩(wěn)定的腸毒素(rmLT)、熱休克蛋白質(zhì)；水包油乳液，例如AMPHIGEN(Hydronics，美國)；及油包水乳液，諸如例如弗式(Freund′s)完全及不完全佐劑。
可使用在本發(fā)明的疫苗中的優(yōu)選佐劑包括Quil A及膽固醇。
p68抗原與獸醫(yī)可接受的載體可以任何簡便和實(shí)際的方式結(jié)合以形成疫苗組合物，例如混合物、溶液、懸浮液、乳化、膠囊化、吸收等，且可制做成制劑，諸如合適于注射、植入、吸入、攝入或其類似方法的片劑、膠囊、粉末、糖漿、懸浮液。優(yōu)選將該疫苗配制成可利用注射而以約0.1至5毫升的劑量，或優(yōu)選為約0.5至2.5毫升，或更優(yōu)選以約1毫升的劑量施用于狗。若適當(dāng)?shù)?，?yīng)該利用熟知的步驟將本發(fā)明制成的醫(yī)藥組合物消毒。
在疫苗中的p68量應(yīng)該具有免疫有效性，且范圍通常為每劑量0.5-1000微克。優(yōu)選的p68量范圍為每劑量1-260微克。更優(yōu)選p68量范圍為每劑量10-100微克。甚至更優(yōu)選p68量為每劑量約15至25微克。
適用于疫苗中的佐劑量根據(jù)所使用的佐劑本質(zhì)而定。例如，當(dāng)使用Quil A及膽固醇作為佐劑時(shí)，Quil A通常的量為每劑量約1-1000微克，優(yōu)選為每劑量30-100微克，更優(yōu)選為每劑量約50-75微克；及膽固醇通常的量為每劑量約1-1000微克，優(yōu)選為每劑量約30-100微克，更優(yōu)選為每劑量約50-75微克。
在另一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供能保護(hù)狗對抗由支氣管敗血性博德特氏桿菌所引起的疾病的方法，其可通過對狗施用如上所述的p68疫苗組合物。根據(jù)本發(fā)明，該p68疫苗組合物可提供狗具有長時(shí)間(至少約4個(gè)月)的免疫性，優(yōu)選為至少約6個(gè)月或甚至更優(yōu)選為約一年。
根據(jù)本發(fā)明，可利用任何熟知的途徑對狗施用該p68疫苗，包括口服、鼻內(nèi)、粘膜、局部、經(jīng)皮及腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮膚內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))。也可使用無針傳遞裝置來實(shí)現(xiàn)施用疫苗?？墒褂媒M合途徑來實(shí)現(xiàn)施用疫苗，例如首先使用腸胃外(parental)途徑施加，隨后使用粘膜途徑施加疫苗。
優(yōu)選的施用途徑包括皮下及肌肉內(nèi)施用疫苗。
本發(fā)明的p68疫苗組合物可施用于至少6周大的狗，優(yōu)選為至少7周大及更優(yōu)選為至少8或9周大?？梢砸淮蝿┝炕蛞远嘤谝淮蔚膭┝繉方臃Np68疫苗。優(yōu)選以約2-4周的間隔對狗施用二次劑量的p68疫苗，優(yōu)選兩次施用之間為約3周。若狗在年齡4個(gè)月前接種，則推薦在到達(dá)年齡4個(gè)月后再以單一劑量接種，因?yàn)樵谛∮?個(gè)月大的幼犬中母體抗體會(huì)干擾足夠的免疫反應(yīng)的發(fā)展。狗也可每年以單一劑量再接種。若可能接觸支氣管敗血性博德特氏桿菌(諸如生育、供食及顯示出狀況)，可在這些事件發(fā)生1年(或優(yōu)選6個(gè)月)內(nèi)提供額外的強(qiáng)化免疫一次(an additional booster)。
p68聯(lián)合疫苗在另一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供用來保護(hù)對抗支氣管敗血性博德特氏桿菌與一種或多種其它犬科病原體的聯(lián)合疫苗及方法，該方法施用此聯(lián)合疫苗。本發(fā)明的聯(lián)合疫苗組合物不會(huì)顯示出功效干擾，且可安全施用于幼犬。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗包括支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原(其可如上述制得)，與至少一種來自其它犬科病原理的抗原(其能在狗中引發(fā)對抗由此其它病原體所引起的疾病的保護(hù)性免疫反應(yīng))的組合。
此其它病原體包括(但是不限于)犬瘟熱(CD)病毒、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感(CPI)病毒、犬極小DN病毒(CPV)、犬冠狀病毒(CCV)、犬皰疹病毒及狂犬病病毒。來自這些病原體而可使用在本發(fā)明的疫苗組合物的抗原可以是經(jīng)改性的活病毒制劑或滅活的病毒制劑形式。減毒這些病毒的毒性株系的方法及制造滅活的病毒制劑的方法在本領(lǐng)域是已知的，且描述在例如美國專利4,567,042及4,567,043中。
其它病原體還包括布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體、波摩那鉤端螺旋體、Leptospira hardjobovis、單胞菌屬、擬桿菌屬、利什曼原蟲屬、包柔氏鉤端螺旋體屬、埃利希氏體屬、霉?jié){菌屬及犬小孢子菌。來自這些病原體而使用在本發(fā)明的疫苗組合物中的抗原可為滅活的完整或部分細(xì)胞制劑的形式，其使用在本領(lǐng)域已知的方法來制備。例如，制備滅活的完整或部分螺旋體細(xì)胞制劑的方法在本領(lǐng)域是已知的，且描述在例如Yan，K-T，“Aspects of Immunity to Leptospiraborpetersenii serovar hardjo”，PhD Thesis，Appendix I，1996.Faculty of Agriculture and Food Science，The Queen′s Universityof Belfast；Mackintosh等人，“The use of a hardjo-pomona vaccineto prevent leptospiruria in cattle exposed to natural challengewith Leptospia interrogans serovar hardjo”，New Zealand Vet.J.28174-177，1980；Bolin等人，“Effect of vaccination with apentavalent leptopsiral vaccine on Leptospira interrogansserovar hardjo type hardjo-boivs infection of pregnant cattle”，Am.J.Vet.Res.50161-165，1989。
根據(jù)本發(fā)明，該聯(lián)合疫苗通常包括獸醫(yī)可接受的載體。如上所述，獸醫(yī)可接受的載體包括任何及全部的溶劑、分散介質(zhì)、涂布物、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌及抗微菌劑、等滲劑、吸收延緩劑及其類似物。稀釋劑可包括水、鹽水右旋糖、乙醇、甘油及其類似物。等滲劑尤其可包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇及乳糖。穩(wěn)定劑尤其包括白蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，合適于使用的佐劑包括(但是不限于)數(shù)種佐劑種類，諸如無機(jī)鹽類，例如礬、氫氧化鋁、磷酸鋁及磷酸鈣；表面活性劑及微粒子類，例如非離子嵌段聚合物表面活性劑(例如，膽固醇)、病毒脂蛋白體、皂素(例如Quil A、QS-21及GPI-0100)、蛋白體、免疫刺激復(fù)合物、蝸形載體(cochleates)、季胺(二甲基雙十八烷基銨溴化物(DDA))、阿夫立定、維生素A、維生素E；細(xì)菌產(chǎn)物，諸如RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi Inc.)、草分枝桿菌的細(xì)胞壁骨架(Detox)、胞壁?；念?MDP)及三肽類(MTP)、單磷?；|(zhì)A、卡介苗、熱不穩(wěn)定的大腸桿菌腸毒素、霍亂毒素、海藻糖二霉菌酸酯、CpG寡脫氧核糖核酸；細(xì)胞因子及激素類，例如白細(xì)胞介素(IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、脫氫表雄甾酮、1，25-二羥基維生素D3；多聚陰離子類，例如，葡聚糖；聚丙烯酸類(例如，聚甲基丙烯酸甲酯、Carbopol 934P)；載劑，例如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、霍亂毒素B亞基、腸毒性大腸桿菌的突變型熱不穩(wěn)定的腸毒素(rmLT)、熱休克蛋白質(zhì)；水包油乳液，例如AMPHIGEN(Hydronics，美國)；及油包水乳液，諸如例如弗式完全及不完全佐劑。
用于根據(jù)本發(fā)明的聯(lián)合疫苗的優(yōu)選佐劑包括Quil A及膽固醇。
可以任何簡便和實(shí)際的方式(例如，通過混合物、溶液、懸浮液、乳化、膠囊化、吸收等方式)來結(jié)合p68抗原、一種或多種來自其它病原體的抗原與該獸醫(yī)可接受的載體，以形成聯(lián)合疫苗組合物；且可制成制劑，諸如合適于注射、植入、吸入、攝入或其類似方法的片劑、膠囊、粉末、糖漿、懸浮液。優(yōu)選將該疫苗配制成可利用注射以約0.1至5毫升的劑量，或優(yōu)選為約0.5至2.5毫升，或更優(yōu)選以約1毫升的劑量施用于狗。
根據(jù)本發(fā)明，該p68聯(lián)合疫苗可施用于至少6周大的狗，優(yōu)選為至少7周大及更優(yōu)選為至少8或9周大。該施用疫苗可利用任何熟知的途徑來完成，包括口服、鼻內(nèi)、粘膜、局部、經(jīng)皮及腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮膚內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))。該施用疫苗也可使用無針傳遞裝置來實(shí)現(xiàn)。該施用疫苗也可使用組合途徑來實(shí)現(xiàn)，例如首先使用腸胃外(parental)途徑施加，隨后使用粘膜途徑施加疫苗。優(yōu)選的施用途徑包括皮下及肌肉內(nèi)施用。
優(yōu)選的p68聯(lián)合疫苗及接種方法本發(fā)明優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括經(jīng)減毒的CD病毒株、經(jīng)減毒的CAV-2株、經(jīng)減毒的CPI病毒株、經(jīng)減毒的CPV株、CCV株的滅活制劑及支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原。
特別優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括所述經(jīng)減毒的CD病毒株，其標(biāo)示為“Snyder Hill”株(National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)；所述經(jīng)減毒的CAV-2株，其標(biāo)示為“Manhattan”株(NationalVeterinary Service Laboratory，Ames，IA)；所述經(jīng)減毒的CPI病毒株，其標(biāo)號(hào)為“NL-CPI-5”(National Veterinary ServiceLaboratory，Ames，IA)；所述經(jīng)減毒的CPV株，其標(biāo)號(hào)為“NL-35-D”(National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)；所述CCV株的滅活制劑，其標(biāo)號(hào)為“NL-18”(National Veterinary ServiceLaboratory，Ames，IA)；及所述重組型支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原，其序列為SEQ ID NO1。此聯(lián)合疫苗(于本文中也指為“p68/5CV聯(lián)合疫苗”)可優(yōu)選地通過用液體制劑再水合所述減毒株及病毒制劑的經(jīng)冷凍干燥的制劑來制備，而該液體制劑由溶解在無菌鹽水溶液中的p68抗原組成，并經(jīng)Quil A及膽固醇佐劑化。
另一個(gè)特別優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括該p68/5CV聯(lián)合疫苗的抗原組分和五種螺旋體的滅活全細(xì)胞制劑布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體(例如，布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體株，其獲自National Veterinary ServiceLaboratory，Ames，IA)、犬鉤端螺旋體(例如，C-5株，NationalVeterinary Service Laboratory，Ames，IA)、感冒傷寒型鉤端螺旋體(例如，MAL 1540株，National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)、黃疸出血型鉤端螺旋體(例如，NADL 11403株，NationalVeterinary Service Laboratory，Ames，IA)及波摩那鉤端螺旋體(例如，T262株，National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)。此聯(lián)合疫苗(于本文也指為“p68/5CV-螺旋體聯(lián)合疫苗”)可優(yōu)選地通過用液體制劑再水合所述減毒株及病毒制劑的經(jīng)冷凍干燥的制劑(或利用其它方法諸如噴霧干燥或干燥作用制得的制劑)來制備，而該液體制劑由溶解在無菌的鹽水溶液中的p68抗原及鉤端螺旋體抗原，并經(jīng)Quil A及膽固醇佐劑化。
根據(jù)本發(fā)明，可將該p68/5CV及p68/5CV-螺旋體聯(lián)合疫苗施用于年齡4周或較大(優(yōu)選為6周或較大)的健康的狗，優(yōu)選為3次劑量，每次給藥間隔約3周。每年可再對狗接種單一劑量。若可能接觸支氣管敗血性博德特氏桿菌及犬科病毒(諸如生育、供食及顯示出狀況)，可在這些事件發(fā)生1年(或優(yōu)選6個(gè)月)內(nèi)提供額外的強(qiáng)化免疫一次。
本發(fā)明還有另一優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括經(jīng)減毒的CD病毒株、經(jīng)減毒的CAV-2株、經(jīng)減毒的CPI病毒株、經(jīng)減毒的CPV株及重組型支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原。
特別優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括所述經(jīng)減毒的CD病毒株，其標(biāo)示為“Synder Hill”株(National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)；所述經(jīng)減毒的CAV-2株，其標(biāo)示為“Manhattan”株(NationalVeterinary Service Laboratory，Ames，IA)；所述經(jīng)減毒的CPI病毒株，其標(biāo)號(hào)為“NL-CPI-5”(National Veterinary ServiceLaboratory，Ames，IA)；所述經(jīng)減毒的CPV株，其標(biāo)示為“NL-35-D”(National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)；及所述重組型支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原，其具有SEQ ID NO1的序列。此聯(lián)合疫苗(于本文也指為“p68/DA2PP聯(lián)合疫苗”)可優(yōu)選地通過用液體制劑再水合所述減毒株及病毒制劑的經(jīng)冷凍干燥的制劑(或利用其它方法諸如噴霧干燥或干燥作用制得的制劑)來制備，而該液體制劑由溶解在無菌鹽水溶液中的p68抗原組成，并經(jīng)Quil A及膽固醇佐劑化。
另一個(gè)特別優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括該p68/DA2PP聯(lián)合疫苗的抗原組分和二種螺旋體的滅活的全細(xì)胞制劑犬鉤端螺旋體(例如，C-51株，National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)及黃疸出血型鉤端螺旋體(例如，NADL 11403株，National Veterinary ServiceLaboratory，Ames，IA)。可代替地，優(yōu)選的聯(lián)合疫苗可包括該p68/DA2PP聯(lián)合疫苗的抗原組合和五種螺旋體的滅活的全細(xì)胞制劑布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體及波摩那鉤端螺旋體。這些聯(lián)合疫苗(于本文也指為“p68/DA2PP-螺旋體聯(lián)合疫苗”)可優(yōu)選地通過用液體制劑再水合所述減毒株及病毒制劑的經(jīng)冷凍干燥的制劑(或利用其它方法諸如噴霧干燥或干燥作用制得的制劑)來制備，而該液體制劑由溶解在無菌的鹽水溶液中的p68抗原及鉤端螺旋體抗原，并經(jīng)Quil A及膽固醇佐劑化。
根據(jù)本發(fā)明，可將p68/DA2PP及p68/DA2PP-螺旋體聯(lián)合疫苗施用于6周或較大(或優(yōu)選年齡為8周或較大)的健康的狗，優(yōu)選為2次劑量，每次給藥間隔約3周。若提供至年齡至少12周的狗時(shí)，單一劑量即足夠。每年可再對狗接種單一劑量。若可能接觸支氣管敗血性博德特氏桿菌及犬科病毒(諸如生育、供食及顯示出狀況)，可在這些事件發(fā)生1年(或優(yōu)選6個(gè)月)內(nèi)提供額外的強(qiáng)化免疫一次。另一種優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括p68抗原(優(yōu)選為具有SEQ ID NO1的重組型p68抗原)與CPI減毒株的聯(lián)合。
還有另一個(gè)優(yōu)選的聯(lián)合疫苗包括p68抗原(優(yōu)選為具有SEQ ID NO1的重組型p68抗原)、CPI減毒株及二種至少二種的螺旋體諸如犬鉤端螺旋體(例如，C-51株，National Veterinary Service Laboratory，Ames，IA)及黃疸出血型鉤端螺旋體(例如，NADL 11403株，NationalVeterinary Service Laboratory，Ames，IA)。
在本發(fā)明的聯(lián)合疫苗中的p68抗原及來自一種或多種其它病原體的抗原量應(yīng)該具有免疫有效性。通常而言，在該聯(lián)合疫苗中的p68抗原量應(yīng)該至少為每劑量約0.5微克。該減毒的CD病毒量應(yīng)該至少為每劑量TCID50約102至約109TCID50，每劑量TCID50(組織培養(yǎng)傳染劑量50％細(xì)胞病變效應(yīng))，優(yōu)選的范圍為每劑量約104至約106TCID50。該減毒的CAV-2量應(yīng)該為每劑量至少約102TCID50至約109TCID50，優(yōu)選的范圍為每劑量104.0至約106.0TCID50。該減毒的CPI病毒量應(yīng)該為每劑量至少約102TCID50至約109TCID50，及優(yōu)選的范圍為每劑量106至約108TCID50。該減毒的CPV量應(yīng)該為每劑量至少約102TCID50至約109TCID50，優(yōu)選的量范圍為每劑量107至約109TCID50。CCV在滅活的病毒制劑中的量應(yīng)該為每劑量至少約100個(gè)相對單位，優(yōu)選的范圍為每劑量1000-4500個(gè)相對單位。每種螺旋體在該疫苗中的范圍應(yīng)該為每疫苗劑量約100-3500NU(濁度測定單位)，優(yōu)選的范圍為每劑量200-2000NU。
可將該疫苗配制成可利用注射以約0.1至5毫升的劑量，或優(yōu)選為約0.5至2.5毫升，或更優(yōu)選以約1毫升的劑量施用于狗。
本發(fā)明利用下列非為限制的實(shí)施例來進(jìn)一步闡明。
實(shí)施例1犬博德特氏桿菌p68重組抗原劑量滴定法研究疫苗該實(shí)驗(yàn)疫苗抗原為大腸桿菌菌株LW68所產(chǎn)生的支氣管敗血性博德特氏桿菌的重組型p68外膜蛋白質(zhì)(SEQ ID NO1)。該疫苗包含不同程度的經(jīng)SDS(十二烷基硫酸鈉)溶解的p68，用在1毫升劑量中含有50微克的QAC(Quil A/50微克的膽固醇)佐劑化。
激發(fā)免疫反應(yīng)物質(zhì)使用支氣管敗血性博德特氏桿菌(dog isolate #85B，passage#3，lot #051597)的氣溶膠作為該激發(fā)免疫反應(yīng)物質(zhì)。此平均板計(jì)數(shù)為1.59×108CFU/毫升。
動(dòng)物將六十只雄性及雌性幼犬隨意分配成六個(gè)處理組(每組10只幼犬)。在第一次接種前41天，對所述幼犬抽血且氣管擦拭；在第一次接種前28天再次進(jìn)行一次，并將任何血清反應(yīng)或培養(yǎng)物呈陽性的動(dòng)物從該研究中移除。
根據(jù)隨機(jī)完全區(qū)集設(shè)計(jì)，將動(dòng)物隨意分配處理并分配至房間中。在無疫苗分配組的認(rèn)知下完成該接種后觀察。
設(shè)計(jì)

1SC＝皮下步驟IVP給藥在第0天時(shí)，以安慰劑或?qū)嶒?yàn)疫苗接種動(dòng)物。在第21天時(shí)，進(jìn)行第二次接種。第一次接種施用在右頸皮下處，第二次接種施用在左頸皮下處。
激發(fā)免疫反應(yīng)實(shí)施在第二次接種后28天，以支氣管敗血性博德特氏桿菌的氣溶膠對全部的動(dòng)物激發(fā)免疫反應(yīng)。在激發(fā)免疫反應(yīng)后的2至14天(第51至63天)，每日兩次(一次早上，一次下午)監(jiān)視動(dòng)物的咳嗽狀態(tài)30分鐘。
觀察及樣品收集在每次接種后，觸診全部的注射位置并進(jìn)行三維測量七天(第0至7天及第21至28天)，且在每次接種后的第14天(第14及35天)進(jìn)行相同步驟。
在接種當(dāng)天及在每次接種后的三天(第0至3天及第21至24天)記錄直腸溫度。
在接種當(dāng)天(第0及21天)和在第42、50及63天收集血液，利用ELISA來分析特異抗體對抗從支氣管敗血性博德特氏桿菌純化的p68蛋白質(zhì)。也在第42、49、50、52、54、56及58天時(shí)收集血液，來進(jìn)行血清淀粉狀蛋白質(zhì)A(SAA)分析。
對全部動(dòng)物進(jìn)行氣管擦拭法分離支氣管敗血性博德特氏桿菌離；在接種前(在此供應(yīng)下，于-41天及-28天)及在第49天時(shí)收集血液用于支氣管敗血性博德特氏桿菌凝集滴度。
博德特氏桿菌p68的狗及老鼠抗體滴定DAB ELISA以0.01M的硼酸鹽緩沖液將經(jīng)純化的天然p68稀釋成600納克/毫升，并以100微升/孔加入至各孔。在4℃下培養(yǎng)所述平板過夜。然后以過量PBS-Tween 20清洗所述平板一次。將在PBS中1％脫脂干燥的牛奶以200微升/孔加入至所述平板。然后在37℃下培養(yǎng)所述平板1小時(shí)。然后以過量PBS-Tween 20清洗所述平板一次。
將狗或老鼠血清以1∶50稀釋加入至所述ELISA平板的頂端列，然后將二倍連續(xù)稀釋的血清依序加入所述平板。在37℃下培養(yǎng)所述平板1小時(shí)。隨后，以過量PBS-Tween 20清洗這些平板3次。
將經(jīng)過氧化物酶標(biāo)定的山羊抗狗IgG(H+L)(以1∶2000稀釋)，以100微升/孔加入至培養(yǎng)有上述狗血清的平板。然后在37℃下培養(yǎng)所述平板1小時(shí)。將經(jīng)過氧化物酶標(biāo)定的山羊抗老鼠IgG(H+L)(以1∶4000稀釋)，以100微升/孔加入至培養(yǎng)有上述老鼠血清的平板。然后在37℃下培養(yǎng)所述平板1小時(shí)。然后以過量PBS-Tween 20清洗所述平板3次。
以100微升/孔加入ABTS底物。大約20分鐘后，于405-490納米用分子裝置(Molecular Devices)或相當(dāng)?shù)钠桨逵?jì)讀器讀取所述平板。數(shù)據(jù)分析使用Fisher′s精準(zhǔn)檢定(Fisher′s Exact Test)來測試咳嗽狗數(shù)的處理差異。使用5％的顯著性水準(zhǔn)。
在分析前，使用一般線性混合模型(general linear mixed model)將ELISA滴度進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。使用95％的置信度水準(zhǔn)來評(píng)估處理差異。每日進(jìn)行兩次激發(fā)免疫反應(yīng)觀察，每次30分鐘。
結(jié)果氣管擦拭培養(yǎng)物及凝集滴度評(píng)估氣管擦拭培養(yǎng)物及凝集滴度，以監(jiān)視在研究時(shí)所登記的動(dòng)物的支氣管敗血性博德特氏桿菌狀況。一些狗在不同的時(shí)間點(diǎn)處顯示出增加的滴度，但是在激發(fā)免疫反應(yīng)前并無滴度增加大于128。
注射位置觀察第一次接種后的注射位置反應(yīng)顯示于表1。在接種T05(64微克)的動(dòng)物中可觀察到最大的注射位置反應(yīng)(接種后2天)，測量該最大平均注射位置反應(yīng)，僅有14.69cm3。接種T03(4微克)、T04(16微克)及T06(256微克)的動(dòng)物在接種后多至7天表露出變化的注射位置反應(yīng)。接種T02(1微克)的動(dòng)物僅在接種后第1天表露出反應(yīng)。接種后第七天，在處理組當(dāng)中，于注射位置反應(yīng)上并無統(tǒng)計(jì)上的顯著差異。第14天時(shí)，全部的注射位置反應(yīng)已經(jīng)消失。
第二次接種后的注射位置反應(yīng)顯示于表2。在第二次接種后，在T06(256微克)中觀察到最大的平均注射位置反應(yīng)，測量該最大的平均注射位置反應(yīng)，其為50.03cm3(接種后1天)。在T05(64微克)及T04(16微克)的動(dòng)物中，于第二次接種后表露出多至7天的注射位置反應(yīng)。在T03(4微克)及T02(1微克)動(dòng)物中，于接種后多至7天表露出最小注射位置反應(yīng)。在接種T02(1微克)及T03(4微克)后，與安慰劑的組相比并無表露出統(tǒng)計(jì)上的注射位置反應(yīng)差異。第二次接種后14天并無觀察到注射位置反應(yīng)。
第一次接種后的注射位置反應(yīng)頻率顯示于表3。在第一次接種后的任何時(shí)間處，用T06(256微克)接種的顯示出反應(yīng)的注射位置的最高整體LSM頻率76％。下一個(gè)最常發(fā)生的為用T05(64微克)進(jìn)行的第一次接種，其有72％的注射位置顯示出反應(yīng)，用T04(16微克)的第一次接種后為69％，及用T03(4微克)的第一次接種后為63％。在T02(1微克)的第一次接種后發(fā)生頻率最低，為38％。
第二次接種后的注射位置反應(yīng)頻率顯示于表4。每種疫苗的整體LSM頻率與第一次接種后所看見的一致。
接種后的注射位置反應(yīng)的發(fā)生率及持續(xù)期間總結(jié)于表5。在第一及第二次接種后，可測量的注射位置反應(yīng)的發(fā)生率(或在任何時(shí)間顯示出反應(yīng)的狗數(shù))，對T03、T04、T05及T06(分別為4微克、16微克、64微克及256微克)而言皆為100％。接收T02(1微克)的動(dòng)物表露出最小的接種后注射位置反應(yīng)發(fā)生率(57.1％)。
對接種T04、T05及T06(分別為16微克、64微克及256微克)的動(dòng)物而言，該反應(yīng)(以反應(yīng)的天數(shù)的最小平方平均值表示，顯示于表5)在第一及第二次接種后的持續(xù)期間較長(第一次接種后的2.7至5.1天及第二次接種后的6.0至6.7天)。接種T02及T03(分別為1微克及4微克)的動(dòng)物在第一及第二次接種后表露出最少的注射位置反應(yīng)天數(shù)(第一次接種后的0.3及1.3天和第二次接種后的1.9及4.5天)。
直腸溫度平均直腸溫度測量則總結(jié)于表6。T02(1微克)在第1及24天、T03(4微克)在第1、21及24天、T04(16微克)在第2及24天、T05(64微克)在第23天及T06(256微克)在第0、1及24天的LSM直腸溫度明顯與安慰劑不同。在第23天時(shí)，所有與安慰劑的對比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不明顯(P＞0.05)。
p68 ELISA血清學(xué)p68 ELISA數(shù)據(jù)總結(jié)于表7。p68 ELISA特異抗體的接種前幾何平均值病毒滴度在全部組中皆為低值(范圍為24.9至28.9)，且該安慰劑的滴度遍及研究期間保持低值。在第一次接種后21天，在接種處理中的p68 ELISA幾何平均值滴度已經(jīng)增加(范圍為55.2至4，411.7)，但是T02(1微克)滴度在統(tǒng)計(jì)上與安慰劑(T01)并無差異。在第二次接種后42天，在全部的接種組中的幾何平均值滴度會(huì)進(jìn)一步增加(范圍為674.6至48，382.0)，此說明針對接種有良好的血清學(xué)反應(yīng)。血清淀粉狀蛋白質(zhì)A(SAA)血清學(xué)SAA滴度總結(jié)于表8。在激發(fā)免疫反應(yīng)前，幾何平均值SAA滴度在全部的處理組中為低值(范圍為0.1至0.5)。激發(fā)免疫反應(yīng)后，T01GMT滴度范圍從1.5至146.0，其中p68處理組的范圍從0.3至23.1。在第50、52、54及56天時(shí)，全部的處理組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上皆與安慰劑不同。在p68疫苗當(dāng)中并無表露出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，除了在第52天的T02(1微克)外，因其表露出與全部其它p68處理組統(tǒng)計(jì)上不同的幾何平均值。
激發(fā)免疫反應(yīng)激發(fā)免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)顯示于表9。在激發(fā)免疫反應(yīng)后通過監(jiān)視咳嗽來測量反應(yīng)，使用二種方法來分析觀察有咳嗽的天數(shù)的最小平方平均值及連續(xù)二天咳嗽(疾病發(fā)生率)。
平均咳嗽天數(shù)分析說明在p68處理組之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異；但是以安慰劑接種的狗平均咳嗽8.6天，然而施用p68疫苗的狗其咳嗽明顯較少，平均范圍在2.2至4.7天間。
當(dāng)使用疾病發(fā)生率來評(píng)估狗時(shí)，全部的T01(安慰劑)皆觀察到連續(xù)二天咳嗽(100％的疾病發(fā)生率)。接種T04(16微克)及T05(64微克)的狗分別表現(xiàn)出55.6％及66.7％的疾病發(fā)生率。接種T02(1微克)的狗僅有28.6％、接種T03(4微克)的有50％及接種T06(256微克)的有33.3％觀察到連續(xù)咳嗽二天。
討論在此研究中，目標(biāo)為在狗中建立抗原劑量、免疫反應(yīng)與保護(hù)之間的關(guān)系。所檢驗(yàn)的p68抗原劑量為1微克、4微克、16微克、64微克及256微克。
注射位置反應(yīng)測量的分析說明可忽略在p68處理組中的反應(yīng)，除了在第二次接種后第一天的T06(256微克)外。所觀察到的反應(yīng)趨向于小，通常尺寸在觀察期間會(huì)減少。這些反應(yīng)尺寸臨床上不明顯且在未修剪毛的狗上最可能被忽略。
接種后的直腸溫度在全部組中皆不顯著，且全部組的狗皆在正常限度內(nèi)。
在T03至T06組中，針對接種的血清學(xué)反應(yīng)優(yōu)良。在這些處理組中，當(dāng)與第21天至第63天的安慰劑比較時(shí)，全部皆表露出明顯較高的p68 ELISA滴度。與第42天至第63天的T01(安慰劑)比較，T02(1微克)表露出明顯的p68 ELISA滴度。在T05(64微克)及T06(256微克)中觀察到最高的滴度。
在激發(fā)免疫反應(yīng)后，檢驗(yàn)全部經(jīng)p68接種的狗的SAA反應(yīng)顯示當(dāng)與對照組的狗比較，激發(fā)免疫反應(yīng)后僅顯示出很小幅的SAA升高。在激發(fā)免疫反應(yīng)后，p68疫苗劑量水平之間并無表露出差異，除了在第52天時(shí)的T02(1微克)外，其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上表露出與全部其它p68處理組有不同的幾何平均值。
使用咳嗽天數(shù)的最小平方平均值(LSM)或連續(xù)二天咳嗽(疾病發(fā)生率)來分析激發(fā)免疫反應(yīng)后的咳嗽觀察。使用咳嗽天的LSM時(shí)，雖然在不同的p68疫苗劑量水平之間無表露出差異，但在安慰劑與全部接種p68的組之間則表露出顯著的差異。使用疾病發(fā)生率時(shí)，接種T02(1微克)、T03(4微克)及T06(256微克)的狗的咳嗽明顯少于安慰劑組。
結(jié)論此研究在狗中建立起抗原劑量、免疫反應(yīng)與保護(hù)之間的關(guān)系。所檢驗(yàn)的p68抗原劑量為1微克、4微克、16微克、64微克及256微克。
全部的疫苗可由最小的注射位置反應(yīng)、正常的直腸溫度及針對接種無負(fù)面反應(yīng)而表露出安全性。注射位置反應(yīng)的尺寸及這些反應(yīng)的持續(xù)期間在較低抗原處理組中較少。如由ELISA滴度測量，其針對接種的血清學(xué)反應(yīng)優(yōu)良，用較高的抗原劑量組顯示出較高的血清學(xué)反應(yīng)。當(dāng)使用咳嗽天數(shù)的LSM作為比較方法時(shí)，與安慰劑比較，全部的處理組在咳嗽上表露出有明顯的減低。在處理組之間沒有注意到差異。當(dāng)使用連續(xù)二天咳嗽(或疾病發(fā)生率)來比較時(shí)，接種T02(1微克)、T03(4微克)及T06(256微克)的狗的咳嗽明顯少于安慰劑組。
表1.在以p68抗原或安慰劑第一次接種后，于狗中的注射住置反應(yīng)的體積

表2.在以p68抗原或安慰劑第二次接種后，注射位置反應(yīng)的體積

1具有不同上標(biāo)的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同(P≤0.05)
表3.在以p68抗原或安慰劑第一次接種后，注射位置反應(yīng)的頻率

表4.在以p68抗原或安慰劑第二次接種后，注射位置反應(yīng)的頻率

2每次處理二欄3具有不同上標(biāo)的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同(P≤0.05)
表5.在以p68抗原或安慰劑第一次接種后，注射位置反應(yīng)的持續(xù)期間

4具有不同上標(biāo)的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同(P≤0.05)
表6.在以p68抗原或安慰劑第二次接種后，狗的平均直腸溫度

表7.在以p68抗原或安慰劑接種后，在狗中的血清學(xué)p68 DAB ELISA滴度6

1在第0及21研究日時(shí)施用疫苗。具有不同上標(biāo)的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同(P≤0.05)6在第0及21研究日時(shí)施用疫苗，且在第49研究日時(shí)施加激發(fā)免疫反應(yīng)。
2具有不同上標(biāo)的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同(P≤0.05)
表8.在激發(fā)免疫反應(yīng)經(jīng)p68抗原或安慰劑接種的狗后，在狗中的血清淀粉狀蛋白質(zhì)A(SAA)滴度

1具有不同上標(biāo)的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同(P≤0.05)表9.在激發(fā)免疫反應(yīng)經(jīng)p68抗原或安慰劑接種的狗后，在狗中的咳嗽發(fā)生率及持續(xù)期間

8以連續(xù)二天咳嗽為準(zhǔn)。
2具有不同上標(biāo)的值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同(P≤0.05)
實(shí)施例2犬博德特氏桿菌p68免疫原性研究動(dòng)物購買45只混合育種的雄性及雌性狗。在幼犬到達(dá)研究場所那天，對全部的幼犬施加MLV細(xì)小病毒疫苗。在研究期間，除了實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物外，并無對所述幼犬施用其它疫苗。在第0天(第一次接種當(dāng)天)時(shí)犬齡大約為9周(±1周)。
在激發(fā)免疫反應(yīng)前，需要將狗保持在隔離設(shè)備中，以防止接觸博德特氏桿菌及其它犬科病原體。在以博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后，繼續(xù)隔離步驟以防止接觸其它犬科病原體。
疫苗在處理組T01及T02中使用無菌的鹽水作為安慰劑疫苗。在處理組T03及T04中使用犬重組p68支氣管敗血性博德特氏桿菌疫苗。將p68抗原的結(jié)構(gòu)基因克隆在大腸桿菌中，由溫度敏感的起動(dòng)子調(diào)節(jié)該基因的表達(dá)。溶解細(xì)胞，且利用離心機(jī)分離所述內(nèi)含體。通過SDS處理來增溶在該內(nèi)含體內(nèi)的重組p68。將該重組p68(每毫升15微克)與在無菌的鹽水(作為稀釋劑)中每毫升50微克的Quil A及50微克的膽固醇結(jié)合。每1毫升的劑量包含0.28％的乙醇及0.01％的硫柳汞。
激發(fā)免疫反應(yīng)接種物使用現(xiàn)在由生物學(xué)控制實(shí)驗(yàn)室-微生物學(xué)(Biologics ControlLaboratories-Microbiology)所使用的方法，來制備支氣管敗血性博德特氏桿菌的伯爾貓(Bihr Cat)株作為該激發(fā)免疫反應(yīng)接種物。以Bordet-Genou瓊脂板接種匯合生長的支氣管敗血性博德特氏桿菌-伯爾貓株，并在37.5+/-2.5℃下培養(yǎng)48小時(shí)。選擇毒性階段I(virulentphase I)菌落且在Bordet-Genou瓊脂上劃線，并在37.5+/-2.5℃下培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)后，使用博德特氏桿菌鹽水清洗來自該瓊脂的菌落，且將該抗原稀釋成在600納米下的光學(xué)密度為0.80。在激發(fā)免疫反應(yīng)前及后進(jìn)行的細(xì)胞計(jì)數(shù)，以確證該比濁計(jì)讀數(shù).免疫抗原劑量標(biāo)的濃度大約1×109CFU。免疫激發(fā)標(biāo)的的濃度為2.37×109CFU(100％的階段I)及激發(fā)免疫反應(yīng)后的濃度計(jì)數(shù)為1.35×109CFU(100％的階段I)。研究設(shè)計(jì)總結(jié)表

隨機(jī)選擇/盲測試對從接種至激發(fā)免疫反應(yīng)日的期間而言，針對處理根據(jù)一般區(qū)集設(shè)計(jì)(generalized block design)來分配動(dòng)物。針對房間隨意分配處理。在激發(fā)免疫反應(yīng)日時(shí)，利用區(qū)集將動(dòng)物隨意分配至激發(fā)免疫反應(yīng)房間。
確認(rèn)個(gè)體資格，隨意分配處理組，進(jìn)行微生物學(xué)及血清學(xué)測試并評(píng)估注射位置，測量直腸溫度及觀察咳嗽。
數(shù)據(jù)分析接種后反應(yīng)變量由注射位置數(shù)據(jù)、直腸溫度及p68 ELISA滴度組成。以下列方法總結(jié)注射位置數(shù)據(jù)1)因處理而具有可測量的反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)目與研究日；2)因處理而具有可測量的反應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)目；3)在任何時(shí)間點(diǎn)因處理而具有可測量的反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)目。
使用一般線性混合模型，分別對第一及第二接種分析注射位置體積(cm3)、直腸溫度及經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換的p68 ELISA滴度數(shù)據(jù)。
通過觀察時(shí)間點(diǎn)最小平方平均值為建構(gòu)處理的事前線性對比，以測試處理組在每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)處的差異及比較在每次處理內(nèi)的時(shí)間點(diǎn)。對全部的比較而言，使用5％的顯著性水準(zhǔn)。
激發(fā)免疫反應(yīng)后變量由每日的咳嗽觀察、p68 ELISA滴度及血清淀粉狀蛋白質(zhì)A滴度所組成。使用一般線性混合模型來分析在激發(fā)免疫反應(yīng)后期間的咳嗽天數(shù)。
建構(gòu)該處理最小平方平均值的事前對比，以測試處理組差異。對全部的比較而言，使用5％的顯著性水準(zhǔn)。
使用Fisher′s精準(zhǔn)檢定，分別對第一及第二接種比較處理組的連續(xù)二天咳嗽的發(fā)生率。對全部的比較而言，使用5％的顯著性水準(zhǔn)。
對激發(fā)免疫反應(yīng)后的血清淀粉狀蛋白質(zhì)A(SAA)滴度數(shù)據(jù)而言，在使用一般線性混合模型分析前，對滴度值進(jìn)行自然對數(shù)轉(zhuǎn)換。
通過觀察時(shí)間點(diǎn)最小平方平均值來建構(gòu)處理的事前線性對比，以測試處理組在每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)的差異及比較在每次處理內(nèi)的時(shí)間點(diǎn)。對全部的比較而言，使用5％的顯著性水準(zhǔn)。
研究步驟詳細(xì)的動(dòng)物步驟將四十五(45)只血清反應(yīng)及培養(yǎng)物呈陰性幼犬隨意分配成4個(gè)處理組。分別將八只及七只狗分配成肌肉內(nèi)(IM)或皮下(SC)對照組，總共有15只對照狗。將十五只狗分配給p68 SC處理組及15只狗分配給p68 IM處理組。處理組則詳述在上述的研究設(shè)計(jì)一節(jié)中。
第0天標(biāo)示為第一次接種那天。在第0天時(shí)，施用疫苗且21天后重復(fù)。第一次接種使用右頸，第二次接種使用左頸。第一及第二次接種分別在右及左半膜肌肌肉中進(jìn)行肌肉內(nèi)注射給藥。在每次接種后，對全部的注射位置進(jìn)行七天的三維測量，在接種后14天進(jìn)行跟蹤測量。在接種當(dāng)天(在接種前)和在每次接種后三天監(jiān)視直腸溫度。
在第35天時(shí)，對全部的動(dòng)物進(jìn)行氣管擦拭用于支氣管敗血性博德特氏桿菌培養(yǎng)物，且收集用于凝集滴度的血液。全部的動(dòng)物針對博德特氏桿菌呈氣管擦拭陰性且呈血清學(xué)陰性，并針對激發(fā)免疫反應(yīng)而言被認(rèn)為合格。
在第45天時(shí)，在第二次接種后24天，對全部的狗施加支氣管敗血性博德特氏桿菌的氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)。使用一次性鼻錐(被舒適地安裝在經(jīng)鎮(zhèn)靜的狗的口套上)來激發(fā)經(jīng)鎮(zhèn)靜的狗的免疫反應(yīng)。將該鼻錐接附于噴霧器，而該噴霧器接附于設(shè)定在5.5至6.0磅/平方英寸(psi)的真空壓力泵上。將1毫升的激發(fā)免疫反應(yīng)物質(zhì)置于該噴霧器中，且對每只狗施加該經(jīng)霧化的激發(fā)免疫反應(yīng)物質(zhì)4分鐘。觀察人員并不知道處理組的分配狀況。
在激發(fā)免疫反應(yīng)后，監(jiān)視動(dòng)物的咳嗽狀況14天(第46-59天)。每天觀察2(二)次，每次時(shí)間點(diǎn)大約相同大約30分鐘，一次在早上及一次在下午進(jìn)行，并記錄結(jié)果。
血液收集在第一次接種前及在激發(fā)免疫反應(yīng)前收集用于凝集滴度的血液。在接種前，在第0及21天及在第35、45及59天時(shí)，收集用于ELISA評(píng)估抗-p68的血液。在激發(fā)免疫反應(yīng)那天(第45天)及在第46、48、50、52及54天時(shí)，收集血清淀粉狀蛋白質(zhì)A(SAA)測試用的血液。
在樣品上進(jìn)行的測試?yán)门囵B(yǎng)來評(píng)估氣管擦拭上支氣管敗血性博德特氏桿菌的存在。將每個(gè)氣管擦拭劃線到肯博德特氏桿菌選擇性的瓊脂板上。包括正和負(fù)對照。在37.5±2.5℃下培養(yǎng)這些平板48±4小時(shí)。將在每片平板上所產(chǎn)生的菌落與正對照組比較，且進(jìn)一步測試顯示出與正對照組相同的任何菌落，以確定支氣管敗血性博德特氏桿菌存在。證實(shí)性測試包括使用TSI、檸檬酸鹽及尿素瓊脂及硝酸鹽紅介質(zhì)(Nitrate Redmedia)。
使用下列下列方法來評(píng)估血清的凝集滴度、p68 ELISA分析或SAA分析凝集滴度-使用博德特氏桿菌鹽水將血清連續(xù)稀釋在微滴板中。每片板中包含正及負(fù)對照。使用支氣管敗血性博德特氏桿菌株87(在Bordet Genou瓊脂上生長、采集、滅活及稀釋成在630納米下呈20％T)作為凝集抗原，且將其加入至每個(gè)孔。搖晃這些平板，并在35±2℃下溫育2小時(shí)。在室溫下第二次溫育22小時(shí)后，讀取這些平板。終點(diǎn)滴度可使用最后的孔顯示出50％的凝集來決定。
p68 ELISA滴度-在涂布有對博德特氏桿菌p68抗原特異的多克隆抗血清的96孔微滴板上捕獲該重組p68抗原。將連續(xù)二倍級(jí)數(shù)稀釋的狗血清加入至該平板且溫育。每片滴板上包含以1∶1000稀釋的正及負(fù)對照。使用經(jīng)過氧化物酶標(biāo)定的親和純化的山羊抗狗IgG指示劑共軛物來偵測對p68抗原特異的抗體。然后加入發(fā)色底物ABTS并當(dāng)正對照孔具有1.2+0.2的O.D.時(shí)讀取該板。以最后稀釋液的倒數(shù)計(jì)算所提供的樣品的滴度，其光學(xué)密度大于該負(fù)對照血清稀釋液的平均加上五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
SAA滴度-使用購置于Accuplex Co.University of NebraskaMedical Center，Omaha，NE 68198的試劑盒來評(píng)估狗血清淀粉狀蛋白質(zhì)A滴度。簡單地說，在涂布有單克隆抗狗的SAA抗體的微滴板上捕獲狗的SAA。將該狗血清的經(jīng)稀釋的樣品加入至該板，隨后加入經(jīng)生物素標(biāo)定的抗狗抗體共軛物。在溫育后，加入經(jīng)過氧化物酶結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素發(fā)色底物。在30分鐘后讀取該平板。
結(jié)果直腸溫度直腸溫度的測量總結(jié)于表10及11。
表10在接種鹽水或p68博德特氏桿菌后(第一次接種后a)，在狗中的直腸溫度(℃)的最小平方平均值

a在第0天時(shí)，施用第一次接種。
表11在接種鹽水或p68博德特氏桿菌后(第二次接種后a)，在狗中的直腸溫度(℃)的最小平方平均值

a在第21天時(shí)，施用第二次接種。
在第一次接種后，在任何一天上，于任何組之間均沒有注意到顯著的差異。在第21天時(shí)，在接種鹽水的狗及接種p68的全部狗之間均注意到有顯著的差異(對T01T02 v T03T04而言，p＝0.0053)。在第24天時(shí)，在p68 SC與IM接種間表露出顯著的差異(p＝0.0124)。
注射位置反應(yīng)注射位置反應(yīng)總結(jié)于表12及13。由于工藝誤差，在第二次接種后的14天觀察中(第35天)沒有進(jìn)行注射位置觀察。
在T03(p68 SC)中觀察到可測量的位置反應(yīng)，且在尺寸上最小。在第3天的T04(p68 IM)的一只狗中注意到有小的注射位置反應(yīng)，但是此測量的最小沖擊不反映在該組的整體平均中。
表12.在接種鹽水或p68(15微克/劑量)博德特氏桿菌后(第一次接種后a)，在狗中的注射位置反應(yīng)的最小平方平均值(cm3)

a在第0天時(shí)，施加第一次接種b標(biāo)準(zhǔn)誤差，T01＝0.80、T02＝0.84、T03＝0.70及T04＝0.70c一只狗具有小的位置反應(yīng)(0.5平方公分)，但是由于攝入，此最小的沖擊值并不反映在整體平均中。
表13.在接種鹽水或p68(15微克/劑量)博德特氏桿菌后(第二次接種后a)，狗的注射位置反應(yīng)的最小平方平均值(cm3)

a在第21天時(shí)，施加第二次接種b標(biāo)準(zhǔn)誤差，T01＝1.12、T02＝1.19、T03＝0.92及T06＝0.92在注射位置測量上的顯著差異總結(jié)于表14。在T02(鹽水SC)對T03(p68 15微克SC)之間的注射位置測量的顯著差異可在第一次接種后的六天注意到。第7天及再次在第14天(二周的再評(píng)估觀察)時(shí)，在任何處理組之間并無注意到顯著的差異。
在第二次接種后的七天，在T02(鹽水SC)對T03(p68 15微克SC)之間的注射位置測量上注意到顯著的差異。
表14.在注射位置反應(yīng)測量的最小平方平均值當(dāng)中，事前對比的顯著性值。

僅顯示出顯著的(P＜0.05)對比。
p68 ELISA滴度p68 ELISA數(shù)據(jù)總結(jié)于表15及圖1。由于在經(jīng)接種的狗中對p68有相當(dāng)大的滴定反應(yīng)，故在研究時(shí)的不同時(shí)間點(diǎn)處使用不同的滴定最小值。第0及21天的滴定從50開始。對第35、45及59天而言，以200開始滴定。任何報(bào)導(dǎo)為“少于”的值皆在分析前除以2。在研究進(jìn)程中，在對照組(T01及T02)的p68 ELISA值中所觀察到的增值歸因于這些最小滴定值。凝集滴度仍然＜4。
當(dāng)與接種安慰劑的運(yùn)行比較時(shí)，全部接種p68的動(dòng)物從接種的第一天至激發(fā)免疫反應(yīng)那天(第0至第45天)在滴度上皆表露出至少增加四倍。
表15.在接種鹽水或p68(15微克/劑量)后及在支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后，狗的p68(15微克/劑量)ELISA終點(diǎn)滴度a的幾何平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差。

a第0及21天的滴定以50開始。第35、45及59天的滴定以200開始。任何報(bào)導(dǎo)為“少于”的值皆在分析前除以2。
b在第0天時(shí)進(jìn)行第一次接種；在第21天時(shí)進(jìn)行第二次接種；及在第45天時(shí)施加時(shí)施加激發(fā)免疫反應(yīng)。
接種后及激發(fā)免疫反應(yīng)后的ELISA滴度的最小平方平均值的顯著差異則編列于表16中。在完成接種后，在接種p68 SC與p68 IM的動(dòng)物之間并無注意到顯著的差異。
表16在接種后及激發(fā)免疫反應(yīng)后的p68 ELISA終點(diǎn)滴度的最小平方平均值當(dāng)中，事前對比的顯著性值。

僅顯示出顯著的(p＜0.05)對比。
血清淀粉狀蛋白質(zhì)A滴度在激發(fā)免疫反應(yīng)后的第0、1、3、5、7及9天的SAA值測量。血清淀粉狀蛋白質(zhì)A值顯示于表17及表示在圖2。
表17在接種鹽水及p68(15微克/劑量)博德特氏桿菌的狗中，于以支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后，血清淀粉狀蛋白質(zhì)A滴度的幾何平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差

a在第45天時(shí)，施加激發(fā)免疫反應(yīng)在SAA滴度中的顯著差異總結(jié)于表18。鹽水對照組的SAA滴度表露出比經(jīng)接種的狗在激發(fā)免疫反應(yīng)后第1、3及5天的還高。當(dāng)與經(jīng)接種的SC狗在激發(fā)免疫反應(yīng)后第7及9天比較時(shí)，鹽水SC對照組繼續(xù)顯示出明顯較高的SAA滴度。
表18.在激發(fā)免疫反應(yīng)后的血清淀粉狀蛋白質(zhì)A滴度的最小平方平均值當(dāng)中，事前對比的顯著性值。

僅顯示出顯著的(p＜0.05)對比。
咳嗽觀察在第二次接種后的24天(第45天)，對全部的處理組進(jìn)行氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)。使用二種方法來檢驗(yàn)咳嗽觀察以連續(xù)二天咳嗽為準(zhǔn)的疾病狀況(顯示于表19)及咳嗽天數(shù)的百分比(顯示于表20及21)。當(dāng)使用連續(xù)二天咳嗽的準(zhǔn)則來評(píng)估狗時(shí)，80％接種p68的狗(SC及IM)會(huì)至少連續(xù)二天咳嗽，然而接種鹽水SC及鹽水IM的狗有咳嗽的分別為100％及87.5％。當(dāng)使用觀察到咳嗽的天數(shù)的百分比來評(píng)估狗時(shí)，p68 SC及IM接種的狗有咳嗽的分別為觀察天數(shù)的38.72％及41.05％鹽水SC及鹽水IM接種的狗有咳嗽的分別為69.04％及62.66％。
表19.在接種鹽水及p68(15微克/劑量)博德特氏桿菌的狗中，在以支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后，以連續(xù)二天咳嗽為準(zhǔn)的疾病狀況的總結(jié)

當(dāng)該疾病狀況以連續(xù)二天咳嗽為準(zhǔn)時(shí)，在接種鹽水及接種p68的狗之間無顯示出顯著的差異。
表20.在接種鹽水及p68(15微克/劑量)博德特氏桿菌的狗中，在以支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后，咳嗽天數(shù)的平均百分比

在T02(鹽水SC)與T03(p6815微克SC)間表露出顯著的差異(p＝0.0112)。在T01(鹽水IM)與T04(p6815微克IM)間表露出無顯著的差異。
表21.在接種鹽水及p68(15微克/劑量)博德特氏桿菌的狗中，在以支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后，經(jīng)由處理的咳嗽天數(shù)的平均百分比

在鹽水對照組與接種p68的狗之間表露出顯著差異(p＝0.0022)。討論設(shè)計(jì)該研究以闡明p68博德特氏桿菌15微克/劑量疫苗在狗中的安全性及功效。
使用注射位置及直腸溫度觀察來檢驗(yàn)安全性。注射位置反應(yīng)測量的分析說明在IM接種的組中可忽略反應(yīng)，而在SC接種的組中有最小的反應(yīng)。所觀察的反應(yīng)趨向于小，尺寸通常會(huì)在觀察期間減少。這些反應(yīng)的尺寸將最可能在未剪毛的狗中被忽略。雖然在第21天時(shí)在鹽水與經(jīng)接種的狗之間及在第24天時(shí)在IM與SC接種之間觀察到顯著的差異，但在全部的組中，全部狗的直腸溫度臨床不顯著且皆在正常限度內(nèi)。
使用p68 ELISA終點(diǎn)滴度的測量及咳嗽的觀察來檢驗(yàn)功效。不管施用途徑，在第35天時(shí)于經(jīng)p68接種的組中顯示出好的p68抗體反應(yīng)。在激發(fā)免疫反應(yīng)后的接種者中觀察到好的回憶應(yīng)答。與SC途徑比較，雖然傳統(tǒng)上更多血管及較少脂肪的IM途徑可獲得較高的抗體反應(yīng)，但在p68 SC與IM接種間的差異遍及整個(gè)研究進(jìn)程并不顯著。
在激發(fā)免疫反應(yīng)后，在經(jīng)接種及未接種p68博德特氏桿菌的狗中的SAA反應(yīng)檢驗(yàn)指出，在接種的動(dòng)物組中，特別是在激發(fā)免疫反應(yīng)后第1、3及5天時(shí)的SAA值很小幅提高。
結(jié)論在此研究中，使用犬激發(fā)免疫反應(yīng)模型在接種后24天，來檢驗(yàn)15微克/劑量的p68犬博德特氏桿菌疫苗的功效。疫苗的安全性可由正常的直腸溫度、最小的注射位置反應(yīng)表明，且可在結(jié)合的IM及SC組中說明功效。SAA值的比較表露出在氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后第1、3及5天，于接種鹽水與p68的狗之間有顯著的差異。
實(shí)施例3犬博德特氏桿菌p68疫苗持續(xù)六個(gè)月的免疫性研究動(dòng)物購買九十只混合育種的雄性及雌性狗，多數(shù)的幼犬在第一次接種當(dāng)天為9周(±1周)。
在狗到達(dá)研究場所后施加MLV細(xì)小病毒疫苗。氣管擦拭及凝集滴度測定為對支氣管敗血性博德特氏桿菌呈陰性的動(dòng)物適用于研究。在研究期間，并無施用實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品以外的疫苗。
將狗保持在必需的隔離設(shè)備中，以防止在激發(fā)免疫反應(yīng)前接觸支氣管敗血性博德特氏桿菌及犬科病原體。在以支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后，繼續(xù)該隔離步驟以防止接觸其它犬科病原體。
疫苗在處理組T01及T02中使用無菌的鹽水作為安慰劑疫苗。在處理組T03及T04中使用犬重組p68支氣管敗血性博德特氏桿菌疫苗。將p68抗原的結(jié)構(gòu)基因克隆在大腸桿菌中，且由溫度敏感的起動(dòng)子來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。溶解細(xì)胞，并由離心機(jī)分離這些內(nèi)含體。通過SDS處理來增溶在該內(nèi)含體中的重組p68。將15微克的p68和60微克的p68分別與在無菌的Lepto鹽水中(作為稀釋劑)每毫升50微克的Quil A及50微克的膽固醇結(jié)合。在4℃下混合這些聯(lián)合的組分24小時(shí)，且通過三次微流器(microfluidizer)。每1毫升的劑量包含2.7微升的乙醇及0.0001％的硫柳汞。p68在實(shí)驗(yàn)疫苗中的濃度可由p68 ELISA測量。全部的分析物復(fù)制五(5)份。全部的疫苗在組合后的6個(gè)月內(nèi)使用。
激發(fā)免疫反應(yīng)接種物以Bordet-Genou瓊脂板來平板接種支氣管敗血性博德特氏桿菌-伯爾貓株，且在37.5+/-2.5℃下培養(yǎng)48小時(shí)。選擇毒性階段I菌落且劃線在Bordet-Genou瓊脂上，并在37.5+/-2.5℃下培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)后，使用博德特氏桿菌鹽水來清洗來自瓊脂的菌落，且將細(xì)胞稀釋成在600納米下的光學(xué)密度為0.80。激發(fā)免疫反應(yīng)前及后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，來確證比濁計(jì)讀數(shù)。激發(fā)免疫反應(yīng)標(biāo)的濃度大約1×109CFU。對組I而言，激發(fā)免疫反應(yīng)前的濃度計(jì)數(shù)為1.94×109及激發(fā)免疫反應(yīng)后的濃度計(jì)數(shù)為1.43×109。對組II而言，該激發(fā)免疫反應(yīng)前的濃度計(jì)數(shù)為2.55×109及該激發(fā)免疫反應(yīng)后的濃度計(jì)數(shù)為2.13×109。
研究設(shè)計(jì)總結(jié)表

以二階段或組(在組I中由48只狗組成及在組II中為42只狗)進(jìn)行研究。每個(gè)組在第0天時(shí)進(jìn)行接種#1。20天后進(jìn)行接種#2。在組1中的事件與在組II中的事件偏差大約15天。在最后的接種后181天，以支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)狗的免疫反應(yīng)。
隨機(jī)選擇/盲目測試根據(jù)完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)，將動(dòng)物隨意分配處理及分配至房間。
在每個(gè)研究組內(nèi)，對從接種#1至激發(fā)免疫反應(yīng)那天的期間，使用隨機(jī)計(jì)劃將動(dòng)物隨意分配處理及分配至房間(每個(gè)房間3至5只狗)。
在激發(fā)免疫反應(yīng)那天，使用一般區(qū)集設(shè)計(jì)，將在研究組內(nèi)經(jīng)預(yù)先處理的動(dòng)物隨機(jī)分配至激發(fā)免疫反應(yīng)房間。
確認(rèn)個(gè)體資格，隨意分配處理組，進(jìn)行微生物學(xué)及血清學(xué)測試，且評(píng)估咳嗽及注射位置。
數(shù)據(jù)分析接種后反應(yīng)變量由注射位置數(shù)據(jù)、直腸溫度及p68 ELISA滴度所組成。注射位置數(shù)據(jù)總結(jié)如下1)因處理而具有可測量的反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)及研究日；2)因處理而具有可測量的反應(yīng)的動(dòng)物時(shí)間點(diǎn)數(shù)；3)因處理而在任何時(shí)間點(diǎn)具有可測量的反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)；4)每只動(dòng)物的可測量的反應(yīng)的持續(xù)期間。
使用一般線性混合模型，分別對第一及第二接種進(jìn)行注射位置體積(cm3)、直腸溫度及經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換的p68 ELISA滴度數(shù)據(jù)的分析。
通過觀察時(shí)間點(diǎn)最小平方平均值為建構(gòu)該處理的事前線性對比，以測試處理組在每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)的差異，及比較在每次處理內(nèi)的時(shí)間點(diǎn)。有興趣的特定比較為T01對T03、T01對T05、T03對T05、T02對T04、T02對T06及T04對T06。若時(shí)間點(diǎn)處理研究組(timepoint-by-treatment-by-study group)的交互作用項(xiàng)目(interactionterm)在P＜0.05處顯著時(shí)，在每次時(shí)間點(diǎn)的處理組當(dāng)中與在處理組內(nèi)的時(shí)間點(diǎn)當(dāng)中的對比皆在每個(gè)研究組內(nèi)，否則這些對比以時(shí)間點(diǎn)對處理的交互作用效應(yīng)最小平方平均值為準(zhǔn)。對全部的比較而言，使用5％的顯著性水準(zhǔn)。
激發(fā)免疫反應(yīng)后變量由p68 ELISA滴度、血清淀粉狀蛋白質(zhì)A滴度及每日的咳嗽觀察所組成。如前述來分析激發(fā)免疫反應(yīng)后的p68ELISA滴度。對激發(fā)免疫反應(yīng)后血清淀粉狀蛋白質(zhì)A(SAA)滴度量數(shù)據(jù)而言，在使用一般線性混合模型分析前，對該滴度值進(jìn)行自然對數(shù)轉(zhuǎn)換。
改善咳嗽分析以反映出USDA需求。對每只狗而言，計(jì)算在觀察咳嗽期間的觀察時(shí)期的百分比。在分析前，使用反正弦平方根轉(zhuǎn)換來轉(zhuǎn)換該百分比。使用一般線性混合模型來分析咳嗽。
將來自此分析的最小平方平均值轉(zhuǎn)換回百分比，且在咳嗽上的減低百分比可如下計(jì)算
減低百分比＝100×(對照組平均-處理組平均)/(對照組平均)建構(gòu)處理最小平方平均值的事前線性對比，以測試處理組差異。有興趣的特定比較為T01對T03、T01對T05、T03對T05、T02對T04、T02對T06及T04對T06。若研究處理組(treatment-by-study group)的交互作用項(xiàng)目在P＜0.05處顯著時(shí)，在處理組當(dāng)中的對比在每個(gè)研究組內(nèi)，否則在處理組當(dāng)中的對比以該處理主要有效最小平方平均值為準(zhǔn)。對全部的比較而言，使用5％的顯著性水準(zhǔn)。
研究步驟詳細(xì)的動(dòng)物步驟在達(dá)到研究前提前及在第一次接種前，對幼犬進(jìn)行氣管擦拭支氣管敗血性博德特氏桿菌培養(yǎng)物，且收集用于凝集滴度的血液。全部的動(dòng)物針對博德特氏桿菌呈氣管擦拭陰性及血清學(xué)陰性，被認(rèn)為合適于研究。將48只幼犬隨意分配至六個(gè)處理組之一，此為組I。重復(fù)該步驟，使用42只狗做為組II。讓動(dòng)物適應(yīng)研究場所至少5天。
組及處理詳述在第7.4.A節(jié)。由于設(shè)備限制及由于提高在激發(fā)免疫反應(yīng)后咳嗽觀察的準(zhǔn)確性，接種及分別的激發(fā)免疫反應(yīng)時(shí)期交錯(cuò)15天，以產(chǎn)生二組狗。對組I及II二者而言，第0天指為接種#1天。20天后進(jìn)行接種#2。經(jīng)由皮下途徑進(jìn)行處理T01、T03及T05。經(jīng)由肌肉內(nèi)途徑進(jìn)行處理T02、T04及T06。在頸的背面及側(cè)面方位進(jìn)行皮下注射。對接種#1而言，使用右頸；及對接種#2而言，使用左頸。對接種#1及接種#2而言，分別在右及左半膜肌肌肉處施加肌肉內(nèi)注射。在每次接種后對全部的注射位置進(jìn)行三維測量七天，在接種后14天進(jìn)行跟蹤測量。在接種當(dāng)天(在接種前)和在每次接種后三天監(jiān)視直腸溫度。在每次接種(在第-1天及第19天)前及在第50天時(shí)收集用于p68ELISA滴度測量的血液。
每個(gè)月，對全部經(jīng)鎮(zhèn)靜的狗進(jìn)行氣管擦拭用于支氣管敗血性博德特氏桿菌培養(yǎng)物，以確認(rèn)呈支氣管敗血性博德特氏桿菌陰性狀態(tài)。還收集用于凝集及ELISA滴度的血液。在激發(fā)免疫反應(yīng)前對每個(gè)組重復(fù)該步驟7天。將氣管擦拭培養(yǎng)物顯示陽性或凝集滴度提高的動(dòng)物從研究中排除。
在接種#2后181天，對狗施加激發(fā)免疫反應(yīng)。使用一次性鼻錐對經(jīng)鎮(zhèn)靜的狗進(jìn)行激發(fā)免疫反應(yīng)，該鼻錐被舒適地安裝在經(jīng)鎮(zhèn)靜的狗的口套上。將該鼻錐接附于噴霧器，而該噴霧器接附于設(shè)定在5.5至6.0磅/平方英寸的真空壓力泵上。將1毫升的激發(fā)免疫反應(yīng)物質(zhì)置于該噴霧器中，且對每只狗施加該經(jīng)霧化的激發(fā)免疫反應(yīng)物質(zhì)4分鐘。
在激發(fā)免疫反應(yīng)前，改變了激發(fā)免疫反應(yīng)后的咳嗽觀察，以符合USDA的推薦。在激發(fā)免疫反應(yīng)后，觀察在激發(fā)免疫反應(yīng)后第三至第十天間的每群狗，總共8天。每日觀察動(dòng)物咳嗽狀況兩次，每次觀察時(shí)間大約45分鐘。觀察期之間的間隔大約為12小時(shí)。觀察人員并不知道經(jīng)記錄的咳嗽觀察的處理組的分配狀況。
血液收集在第一次接種前、每個(gè)月及在對每個(gè)組激發(fā)免疫反應(yīng)前收集用于凝集滴度的血液。
在接種#1及#2前的當(dāng)天、在第50天及在大約30天之后，對每組收集用于評(píng)估抗p68 ELISA的血液。還收集激發(fā)免疫反應(yīng)當(dāng)天及激發(fā)免疫反應(yīng)后觀察的最后那天的血液。
在激發(fā)免疫反應(yīng)當(dāng)天(激發(fā)免疫反應(yīng)前)及在激發(fā)免疫反應(yīng)后1、3、5、7及9天對每組收集用于測試血清淀粉狀蛋白質(zhì)A(SAA)的血液。
在樣品上進(jìn)行的測試通過培養(yǎng)來評(píng)估氣管擦拭是否存在有支氣管敗血性博德特氏桿菌。將每個(gè)氣管擦拭劃線到對博德特氏桿菌具選擇性的瓊脂板上。包括正及負(fù)對照。在37.5±2.5℃下培養(yǎng)這些平板48±4小時(shí)。將在每個(gè)平板上所產(chǎn)生的菌落與正對照比較，且進(jìn)一步測試任何顯示出與正的對照相同的菌落，以確認(rèn)支氣管敗血性博德特氏桿菌存在。證實(shí)測試包括使用TSI、檸檬酸鹽及尿素瓊脂及硝酸鹽紅介質(zhì)。
使用下列方法來評(píng)估用于凝集滴定、p68 ELISA分析或SAA分析的血清凝集滴度-使用博德特氏桿菌鹽水將血清連續(xù)稀釋在微滴板中。每片板中包含正及負(fù)對照。使用支氣管敗血性博德特氏桿菌株87(在Bordet Genou瓊脂上生長、采集、滅活及稀釋成在630納米下呈20％T)作為凝集抗原，且將其加入至每個(gè)孔。搖晃這些平板，并在35±2℃下溫育2小時(shí)。在室溫下第二次溫育22小時(shí)后，讀取這些平板。終點(diǎn)滴度可使用最后的孔顯示出50％的凝集來決定。
p68 ELISA滴度-在涂布有對博德特氏桿菌p68抗原特異的多克隆抗血清的96孔微滴板上捕獲該重組p68抗原。將連續(xù)二倍級(jí)數(shù)稀釋的狗血清加入至該平板且溫育。每片滴板上包含以1∶1000稀釋的正及負(fù)對照。使用經(jīng)過氧化物酶標(biāo)定的親和純化的山羊抗狗IgG指示劑共軛物來偵測對p68抗原特異的抗體。然后加入發(fā)色底物ABTS并當(dāng)正對照孔具有1.2+0.2的O.D.時(shí)讀取該板。以最后稀釋液的倒數(shù)計(jì)算所提供的樣品的滴度，其光學(xué)密度大于該負(fù)對照血清稀釋液的平均加上五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
SAA滴度-在涂布有單克隆抗犬SAA抗體的96孔微滴板上捕獲犬科血清淀粉狀蛋白質(zhì)A。將犬血清的經(jīng)稀釋的樣品加入至該板并溫育。加入?yún)⒖紭?biāo)準(zhǔn)，以獲得從0.31納克/毫升至20納克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)曲線。加入經(jīng)生物素標(biāo)定的抗犬抗體共軛物。在溫育該經(jīng)生物素標(biāo)定的抗犬抗體后，加入結(jié)合過氧化物酶的抗蛋白鏈菌素。加入發(fā)色底物TMB且在30分鐘讀取該板。通過將樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來測量血清淀粉狀蛋白質(zhì)A的濃度，且通過適當(dāng)?shù)南♂屢蜃臃糯蟆?br> 結(jié)果除非其它方面有提到，否則結(jié)果為來自組I及II的結(jié)合數(shù)據(jù)。
氣管擦拭培養(yǎng)及凝集滴度在研究進(jìn)程中，有11只狗顯示出氣管擦拭培養(yǎng)物陽性和/或凝集滴度提高。將這些狗與任何與呈陽性的狗關(guān)在一起的狗從該研究中移除，此導(dǎo)致減少20只狗。從每群中移除的狗數(shù)分別為T01-4只狗，T02-2只狗，T03-3只狗，T04-1只狗，T05-5只狗，T06-5只狗。
注射位置觀察注射位置反應(yīng)總結(jié)于表22-25。由于工藝誤差，在第21天時(shí)不對組I的狗81595收集注射位置信息。改變該實(shí)施方案以致因此在第22天時(shí)不收集在組II中的狗的注射位置反應(yīng)數(shù)據(jù)，來自第22天的數(shù)據(jù)總結(jié)僅包含來自在組I中的每個(gè)處理組的八只狗的信息。沒有觀察任何接受IM處理的狗的注射位置反應(yīng)。對于SC接種的二處理組(T03及T05)注射位置測量是最小的。
表22.在接種鹽水或p68博德特氏桿菌后(第一次接種后a)狗的注射位置反應(yīng)的最小平方平均值(cm3)

a接種#1，在第0天時(shí)施用b全部平均的標(biāo)準(zhǔn)誤差＝0.64
表23.在接種鹽水或p68博德特氏桿菌后(第二次接種后a)，狗的注射位置反應(yīng)的最小平方平均值(cm3)

a接種#2，在第20天時(shí)施用b在此天的標(biāo)準(zhǔn)誤差＝0.55c在此天的標(biāo)準(zhǔn)誤差＝0.70d在第21天時(shí)T06的標(biāo)準(zhǔn)誤差＝0.57表24.在接種鹽水或p68博德特氏桿菌后(第一次接種后a)，具有可測量的注射位置反應(yīng)的狗的百分比

a接種#1，在第0天時(shí)施用表25.在接種鹽水或p68博德特氏桿菌后(第二次接種后a)，具有可測量的注射位置反應(yīng)的狗的百分比

a接種#2，在第0天時(shí)施用b對第22天而言，n＝8c在第21天時(shí)的T06 n＝14
在注射位置測量中的顯著差異則總結(jié)于表26中。在第一次接種后的七天，在T01(鹽水SC)對T03(60微克SC)間注意到有注射位置測量的顯著差異。在第一次接種后，僅有前四天在T01(鹽水SC)與T05(15微克SC)間注意到顯著的差異。在第3至7天時(shí)，在T03(60微克SC)與T05(15微克SC)間發(fā)現(xiàn)顯著的差異。在第14天(二周的再評(píng)估觀察)時(shí)，在任何組之間并無注意到差異。
在第二次接種后的七天，在T01(鹽水SC)對T03(60微克SC)及T05(15微克SC)間的注射位置測量注意到顯著的差異(P＝0.0138)。在第23至27天時(shí)，在T03(60微克SC)與T05(15微克SC)間發(fā)現(xiàn)顯著的差異。第34天(二周的再評(píng)估觀察時(shí)，在任何組之間無注意到差異)。
表26.在注射位置反應(yīng)測量的最小平方平均值當(dāng)中，事前對比的顯著性值。

僅顯示顯著的(P＜0.05)對比直腸溫度直腸溫度測量則總結(jié)于表27及28。改變方案，以便在第22天時(shí)不收集組II的狗的直腸溫度數(shù)據(jù)，因此，第22天的數(shù)據(jù)總結(jié)僅包括在組I中每個(gè)處理組的狗的信息。
表27.在接種鹽水或p68博德特氏桿菌后(第一次接種后a)，狗的直腸溫度的最小平方平均值(℃)

a接種#1，在第20天時(shí)施用b標(biāo)準(zhǔn)誤差＝0.09表28.在接種鹽水或p68博德特氏桿菌后(第二次接種后a)，狗的直腸溫度的最小平方平均值(℃)

a接種#2，在第20天時(shí)施用b標(biāo)準(zhǔn)誤差＝0.08c標(biāo)準(zhǔn)誤差＝0.11在第一次接種后第1天，在T02(鹽水IM)與T04(60微克IM)間注意到直腸溫度有顯著的差異。在第二次接種后，在任何一天，在任何組之間于直腸溫度上無發(fā)現(xiàn)顯著的差異。
p68 ELISA滴度激發(fā)免疫反應(yīng)前p68 ELISA數(shù)據(jù)總結(jié)于表29。由于在第19天時(shí)，在T06中組I的狗有反應(yīng)，在p68 ELISA滴度的數(shù)據(jù)分析中可觀察到由于組的影響。此影響小且不影響其它分析的時(shí)間點(diǎn)。因此，結(jié)合自組I及II的數(shù)據(jù)用于報(bào)告目的。
在經(jīng)接種的狗中，由于對p68有相當(dāng)大的滴度反應(yīng)，在此研究中，在不同的時(shí)間點(diǎn)使用不同的滴定最小值。第-1及19天的滴定以50開始。對第50至195天而言，滴定以200開始。在第201及211天時(shí)收集的樣品的滴定以1000開始。任何報(bào)導(dǎo)為“少于”的值，在分析前皆除以2。在研究進(jìn)程中，在對照組(T01及T02)的p68 ELISA值中所觀察到的增值歸因于這些最小滴定值。除了如先前提到的外，凝集滴度仍然＜4。
在第50天時(shí)，全部接種安慰劑的狗皆具有p68滴度＜200。在第二次接種后(第0天對第50天)，當(dāng)與接種安慰劑的動(dòng)物比較時(shí)，全部接種p68的動(dòng)物的滴度顯示出增加至少四倍。
表29.在接種p68博德特氏桿菌后，在第0天及第20天時(shí)，狗的p68ELISA終點(diǎn)滴度的幾何平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差。

a第-1及19天的滴定以50開始。任何報(bào)道為“少于”的值在分析前皆除以2b第50天的滴定以200開始。任何報(bào)導(dǎo)為“少于”的值在分析前皆除以2接種后ELISA滴度的最小平方平均值的顯著差異列于表30。在接種前(第-1天)、在SC對照與SC接種間或在IM對照與IM接種間，在p68 ELISA滴度上并無觀察到顯著的差異。
表30.在接種后p68 ELISA終點(diǎn)滴度的最小平方平均值當(dāng)中，事前對比的顯著性值。

僅顯示顯著的(P＜0.05)對比在研究進(jìn)程中所測量的p68 ELISA滴度總結(jié)于表31并顯示于圖3。
在此研究進(jìn)程中，嘗試每種方法以協(xié)調(diào)在組I及II間的活動(dòng)。對關(guān)鍵的數(shù)據(jù)收集時(shí)間點(diǎn)(即環(huán)繞著接種及激發(fā)免疫反應(yīng)的事件)而言，此可實(shí)現(xiàn)。在此研究的過渡期間的三個(gè)例子中，組之間的血液及氣管擦拭的收集會(huì)變化1或2天。為了總結(jié)及報(bào)導(dǎo)此過渡期間的p68 ELISA數(shù)據(jù)，結(jié)合了這些天的數(shù)據(jù)。因此，第79天包括來自第79天(組I)與第81天(組II)的結(jié)合數(shù)據(jù)，第111天與第110天(組II)及第111天(組I)相應(yīng)，而第169天則與第169天(組II)及第170天(組I)相應(yīng)。根據(jù)所述方案，不對超過第50天的p68 ELISA數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
表31.在接種及以支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后，在未接種及接種p68博德特氏桿菌的狗中的p68 ELISA終點(diǎn)滴定的幾何平均值的總結(jié)

a第50至195天的滴定以200開始。在第201及211天時(shí)所收集的樣品的滴定以1000開始。任何報(bào)導(dǎo)為“少于”的值在分析前皆除以2。
b接種#1及#2，分別在第0及20天施用。在第201天施加激發(fā)免疫反應(yīng)。
c在此研究進(jìn)程中，嘗試每種方法以協(xié)調(diào)在組I及II間的活動(dòng)。在三個(gè)例子中，組的血液收集會(huì)變化1或2天。為了數(shù)據(jù)總結(jié)，結(jié)合了來自這些天的數(shù)據(jù)。不對在超過第50天所收集的p68 ELISA滴度值進(jìn)行分析。第79天與第79及81天相應(yīng)，第110天與第110及111天相應(yīng)，第169天與第169及170天符合。
咳嗽觀察在第二次接種后，對二組進(jìn)行181天的氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)。為了符合USDA推薦，將咳嗽標(biāo)準(zhǔn)改變成大約45分鐘的觀察，在激發(fā)免疫反應(yīng)后第三至八天大約間隔十二小時(shí)。咳嗽觀察總結(jié)于表32及33。
表32.在以支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后，在未接種及接種p68博德特氏桿菌的狗中的咳嗽時(shí)間點(diǎn)的平均百分比

表33.在以支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后，在未接種及接種p68博德特氏桿菌的狗中的處理的咳嗽時(shí)間點(diǎn)的平均百分比

當(dāng)與鹽水對照組比較時(shí)，對15微克/劑量組的咳嗽減低百分比為51.55％，對60微克/劑量組為11.09％。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異總結(jié)于表34。
表34.在咳嗽時(shí)間點(diǎn)的百分比的最小平方平均值當(dāng)中，事前對比的顯著性值

(僅顯示顯著的(P＜0.05)對比。)血清淀粉狀蛋白質(zhì)A在激發(fā)免疫反應(yīng)后第0、1、3、5、7及9天時(shí)測量SAA值。血清淀粉狀蛋白質(zhì)A值顯示于表35及表示在圖4。
表35在以支氣管敗血性博德特氏桿菌氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后，在未接種及接種p68博德特氏桿菌的狗中，血清淀粉狀蛋白質(zhì)A滴度的幾何平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差

a在第201天時(shí)施加激發(fā)免疫反應(yīng)SAA滴度的顯著差異總結(jié)于表36。
表36.在血清淀粉狀蛋白質(zhì)A滴定激發(fā)免疫反應(yīng)后的最小平方平均值當(dāng)中，事前對比的顯著性值。

僅顯示顯著的(P＜0.05)對比。
討論設(shè)計(jì)該研究以顯示出重組p68博德特氏桿菌疫苗在狗中的安全性及六個(gè)月的功效。15微克/劑量及60微克/劑量疫苗二者皆顯示出安全性。在研究上，15微克/劑量可良好地支持免疫性功效及6個(gè)月的持續(xù)性。
使用注射位置及直腸溫度觀察來檢驗(yàn)安全性。注射位置反應(yīng)測量的分析顯示出在IM接種的組中并無反應(yīng)，且在接種15微克/劑量與60微克/劑量SC的二組中有最小的反應(yīng)。在接種15微克/劑量SC的狗中，所觀察到的反應(yīng)趨向于較小。此已看見的反應(yīng)短暫，通常在14天或較少會(huì)消除。這些反應(yīng)的尺寸在注射位置未剪毛的狗中最可能被忽略。接種后的直腸溫度不顯著，且對全部組的全部狗而言皆在正常限度內(nèi)。
使用咳嗽觀察及p68 ELISA終點(diǎn)滴度的測量來檢驗(yàn)從接種后181天的免疫性功效及持續(xù)期間。在鹽水對照組中的咳嗽百分比(78.26％)指出施加至該研究動(dòng)物的免疫抗原計(jì)量為可接受的。當(dāng)與對照組比較時(shí)，15微克/劑量組的咳嗽時(shí)間點(diǎn)的百分比(37.92％)說明在咳嗽上減低51.55％，而滿足由USDA所規(guī)定的功效要求。當(dāng)與對照組比較時(shí)，在60微克/劑量組中顯示出并無保護(hù)性(69.58％)，而狗在咳嗽上顯示極小的減弱。
雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)上無比較，但可從表29及31中看見，當(dāng)與IM接種比較時(shí)，SC接種趨向具有較高的抗體反應(yīng)。為了討論的目的，進(jìn)一步評(píng)論則考慮到不同的劑量組結(jié)合IM及SC施用途徑的結(jié)果。
不管施用途徑，在二經(jīng)接種的組中的第50天時(shí)皆顯示出優(yōu)良的p68抗體反應(yīng)，且由該接種反應(yīng)可持續(xù)整個(gè)研究進(jìn)程。在激發(fā)免疫反應(yīng)后，該接種者可觀察到好的回憶應(yīng)答。
比較15微克/劑量與60微克/劑量在研究進(jìn)程中的p68 ELISA滴度可顯示出，60微克/劑量組具有稍微較高的滴度反應(yīng)(圖3)。此反應(yīng)雖然優(yōu)良，但不與在氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)后的保護(hù)有相互關(guān)聯(lián)。p68ELISA滴度反應(yīng)在從該研究移除了具有氣管擦拭呈陽性或升高的凝集滴度的狗的狗中是變化的。從該研究移除了具有氣管擦拭培養(yǎng)物呈陽性和/或升高的凝集滴度的六個(gè)對照的三個(gè)，維持p68 ELISA滴度＜200。此顯示出p68 ELISA滴度與從該研究移除的狗的氣管擦拭或凝集滴度狀況并無相關(guān)聯(lián)性。
在接種及未接種p68博德特氏桿菌的狗中，在激發(fā)免疫反應(yīng)后，SAA反應(yīng)的檢驗(yàn)指出SAA值在15微克/劑量組中僅稍微升高，特別是在激發(fā)免疫反應(yīng)后第5及7天。
結(jié)論在此研究中，在接種后6個(gè)月，使用犬激發(fā)免疫反應(yīng)模型來檢驗(yàn)15微克/劑量與60微克/劑量的p68犬博德特氏桿菌疫苗的功效。由正常直腸溫度及最小的注射位置反應(yīng)可說明二疫苗皆安全。雖然接種15微克/劑量與60微克/劑量二者的狗對接種皆顯示出好的血清學(xué)反應(yīng)(如可由p68 ELISA滴度來測量)，在接種60微克/劑量的狗中，該反應(yīng)與臨床保護(hù)無相互關(guān)聯(lián)性。當(dāng)接種60微克/劑量的狗與未接種的對照比較時(shí)在咳嗽上沒有顯示出顯著差異。當(dāng)與對照組比較時(shí)，15微克/劑量疫苗的好功效則可由減低大于50％的咳嗽來說明。假定SDS在60微克/劑量疫苗中的增加程度可在保護(hù)上造成明顯的差異。SAA值的比較可說明在接種與對照組間的差異。
實(shí)施例4VANGUARDPlus 5/CV-L的安全性及功效VANGUARDPlus 5/CV-L為一種經(jīng)冷凍干燥的制劑，其由CD病毒、CAV-2、CPI病毒、CPV的減毒株和犬鉤端螺旋體及黃疸出血型鉤端螺旋體的滅活的完整培養(yǎng)物，加上滅活的CCV與佐劑的液體制劑所組成。全部的病毒皆在經(jīng)建立的細(xì)胞系上增殖。CPV部分可通過在該犬細(xì)胞系上低傳代而減毒，而該細(xì)胞系可于表38所指出的程度下提供該CPV能使母體抗體干擾無效的免疫性質(zhì)。所述液體組分可使用來再水合該經(jīng)冷凍干燥的組分，該組分已以惰性氣體封裝而取代真空包裝。
實(shí)驗(yàn)室評(píng)估已說明經(jīng)VANGUARDPlus 5/CV-L免疫的狗可對抗CD、ICH、CAV-2及CPI呼吸道疾病、由CCV及CPV所造成的腸炎、及由犬鉤端螺旋體及黃疸出血型鉤端螺旋體所造成的螺旋體病，且在這些疫苗部分當(dāng)中不存在有免疫學(xué)干擾。大范圍的安全性測試顯示出其安全，且在正常使用條件下于年齡如6周的狗中基本上無反應(yīng)。
此也說明CAV-2疫苗可交叉保護(hù)對抗由CAV-1所造成的ICH。研究說明CAV-2不僅保護(hù)對抗ICH，而且同樣對抗CAV-2呼吸道疾病。在所進(jìn)行的測試中，2型犬腺病毒激發(fā)免疫反應(yīng)病毒不會(huì)從接種CAV-2的狗重新獲得。
在VANGUARDPlus 5/CV-L中的CPV部分已接受廣泛的安全性及功效測試。其在實(shí)驗(yàn)室測試中及在范圍條件下的臨床測試中顯示出安全及基本上無反應(yīng)。產(chǎn)物安全性可進(jìn)一步由backpassage研究說明，其包括口服給藥多次劑量的疫苗株至易感狗群，其仍然全部正常。
研究說明3次含有增加的CPV病毒滴度的疫苗劑量可克服與母體抗體相關(guān)的血清中和(SN)滴度。如低至1∶4的血清中和滴度已由其他人顯示出會(huì)干擾使用傳統(tǒng)的經(jīng)改性的活疫苗的自身免疫作用。以50只6周大的幼犬來進(jìn)行臨床測試[25只經(jīng)接種(SN滴度范圍-256)及25只為未接種的對照組(SN滴度范圍4-1024)](表37)。接種組接受3次劑量，從6周的年齡開始間隔3周進(jìn)行一次接種。在第1次接種后，13/25只幼犬在CPV SN滴度(血清轉(zhuǎn)化)上顯示出增加4倍或較大(表38)。這13只幼犬的十二只在第一次接種時(shí)的母體SN滴度≤1∶16，剩余的幼犬的SN滴度為1∶64。另外9只具有起始SN滴度在1∶16至1∶256間的幼犬會(huì)在第二次接種后血清轉(zhuǎn)化。其母體抗體SN滴度在第二次接種時(shí)已下降至≤1∶64。類似地，最后3次具有1∶128的起始SN滴度的接種，在其母體抗體CPV滴度降至≤1∶64后，在第三次接種后血清轉(zhuǎn)化。因此，在此研究中，當(dāng)從年齡6周開始提供3次疫苗劑量后，全部25只接種狗(甚至具有最高母體抗體程度的那些)會(huì)變成自動(dòng)免疫(GM＝1∶1176；SN滴度的范圍128-4096)。在第三次以異種CPV激發(fā)免疫反應(yīng)病毒接種3周后，對全部50只的狗激發(fā)免疫反應(yīng)。25只未接種的對照狗有14只死亡或顯示出嚴(yán)重足以授權(quán)安樂死的病癥，然而全部25只接種狗基本上仍然健康。因此，在VANGUARDPlus 5/CV-L中高滴度、低傳代的疫苗病毒具高免疫性且能于母體抗體存在下刺激自動(dòng)免疫性。
VANGUARDPlus 5/CV-L的CCV部分的功效已在大量的接種激發(fā)免疫反應(yīng)研究中說明。十六只7至8周大的幼犬以VANGUARDPlus5/CV-L接種(接種狗)及17只以VANGUARDPlus 5/L接種(對照組)。全部的幼犬以3周的間隔接受三次1毫升的劑量。在第三次接種后三周，以毒性株CCV(CV-6)對幼犬進(jìn)行激發(fā)免疫反應(yīng)。監(jiān)視在感染后的臨床觀察、溫度、體重及血液參數(shù)21天。當(dāng)與對照組比較時(shí)，CCV接種狗表現(xiàn)出減低的腹瀉發(fā)生率及毒性CCV脫落的量。在激發(fā)免疫反應(yīng)后21天，對小腸部分切片的毒性CCV進(jìn)行螢光性抗體染色，在CCV接種狗與對照組之間可偵測的CCV抗原表現(xiàn)出顯著地減低(P)(表39)。
表37接種及對照組的起始血清中和(SN)滴度

表38.接種后血清中和(SN)滴度的幾何平均值(范圍)a

a在年齡6、9及12周接種的狗。
b激發(fā)免疫反應(yīng)前的SN滴度表39.在激發(fā)免疫反應(yīng)后21天，小腸部分切片的螢光性抗體染色

結(jié)論在此研究中，包含CD病毒、CAV-2、CPI病毒、CPV與犬鉤端螺旋體及黃疸出血型鉤端螺旋體及CCV的滅活的完整培養(yǎng)物的經(jīng)佐劑化的聯(lián)合疫苗顯示出，當(dāng)使用在幼犬時(shí)具有作為疫苗安全性和有效性。該聯(lián)合疫苗也顯示出可克服與母體抗體相關(guān)的血清中和(SN)滴度。
實(shí)施例5犬博德特氏桿菌天然的p68免疫原性研究動(dòng)物此研究包括二窩SPF小獵犬及二窩隨機(jī)來源的狗。將狗隨意分配成經(jīng)接種或無接種的組。此研究包括總共10只經(jīng)接種及11只無接種的狗。
實(shí)驗(yàn)疫苗的制備從48小時(shí)Bordet-Gengou血液瓊脂敷開板中采集支氣管敗血性博德特氏桿菌(110H株)，以5至10毫升的熱萃取緩沖液洗滌該板表面。再者，利用離心機(jī)拋棄上層液部分以采集在二培養(yǎng)物(CharlotteParker所定義的介質(zhì))中生長的細(xì)胞。將所采集的細(xì)胞懸浮在25mMTris-HCl，pH8.8中，且在60℃下培養(yǎng)1小時(shí)。利用離心機(jī)，以20,000×克在4℃下將細(xì)胞碎物與熱萃取物分離30分鐘。將疊氮化鈉(0.01％)加入至該熱萃取液的上層液部分，然后利用多微孔性過濾進(jìn)一步凈化。
可使用標(biāo)準(zhǔn)步驟，通過將單克隆抗體(經(jīng)標(biāo)示的Bord 2-7)與經(jīng)CNBr活化的瓊脂糖凝膠4B結(jié)合而制備單克隆抗體親和樹脂。將大約30.35毫克的單克隆抗體結(jié)合至1克的親和樹脂。以大約1升萃取物對20毫升樹脂的比率來結(jié)合該經(jīng)凈化的熱萃取上層液部分(上部)與Bord 2-7親和樹脂。
通過在環(huán)境溫度下溫育該混合物，伴隨著溫和搖晃，過夜，接著沉淀樹脂并抽出上層液部分促使天然p68與樹脂的結(jié)合。然后將該樹脂填入直徑2.6公分的管柱，并相繼以PBS(pH7.5)及10mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)使用5毫升/分鐘的流速來清洗該管柱。當(dāng)在280納米處的吸收到達(dá)基線程度時(shí)，使用100mM的三乙基胺來洗脫鍵結(jié)物質(zhì)，且收集在280納米處的吸收呈單一大波峰的餾分，利用ELISA來測試p68的存在?；旌习琾68的餾分且對PBS透析以移除三乙基胺。
以包含大約100微克的經(jīng)純化的p68與1％的氫氧化鋁凝膠來制備系列配制的實(shí)驗(yàn)疫苗。在1毫升的最后疫苗劑量的體積中，使用福爾馬林(0.01％)作為防腐劑。
激發(fā)免疫反應(yīng)接種物實(shí)質(zhì)上如描述在上述實(shí)施例一般制備激發(fā)免疫反應(yīng)物質(zhì)。
研究步驟將二十一(21)只血清反應(yīng)及培養(yǎng)物呈陰性的幼犬隨意分配成二個(gè)處理組。十一只狗分配至無接種組(對照組)及十只狗為接種組。第0天標(biāo)示為第一次接種當(dāng)天。在第0天時(shí)，皮下給藥一毫升的疫苗及21天后重復(fù)。在第一及第二次接種前收集血清學(xué)的p68 ELISA用的血液。
在第35天時(shí)(在第二次接種后14天)，如上所述對全部的狗施加支氣管敗血性博德特氏桿菌的氣溶膠激發(fā)免疫反應(yīng)。如描述于先前實(shí)施例，在激發(fā)免疫反應(yīng)后，監(jiān)視動(dòng)物的咳嗽14天。
結(jié)果臨床觀察及對p68的血清學(xué)反應(yīng)的總結(jié)顯示于表40。
表40臨床觀察及血清學(xué)反應(yīng)的總結(jié)

討論在此研究中，10只對照狗有10只至少連續(xù)咳嗽二天。若狗連續(xù)咳嗽二天則其視為臨床生病。借此標(biāo)準(zhǔn)，100％無接種的對照狗生病。在接種組中，在激發(fā)免疫反應(yīng)后第4天有一只狗咳嗽，且在激發(fā)免疫反應(yīng)后4及6天有一只狗咳嗽。二只狗在第14天咳嗽。經(jīng)接種的狗并無連續(xù)二天咳嗽。因此，在接種天然的p68的狗組中，在激發(fā)免疫反應(yīng)后100％判斷為保持正常。
結(jié)論此測試說明天然p68疫苗對抗支氣管敗血性博德特氏桿菌疾病的保護(hù)能力。
序列表<110>Dominowski，Paul J.
Frantz，Joseph C.
Krebs，Richard L.
Shields，Shelly L.
Sorensen，Robert G.
<120>對抗支氣管敗血性博德特氏桿菌的犬疫苗<130>16112(PC25496A)<140>60/443,418<141>2003-01-29<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>602<212>PRT<213>支氣管敗血性博德特氏桿菌<400>1Asp Pro Asn Thr Val Ser Ile Ile Lys Ala Gly Glu Arg Gln His Gly1 5 10 15Ile His Ile Lys Gln Ser Asp Gly Ala Gly Val Arg Thr Ala Thr Gly20 25 30Thr Thr Ile Lys Val Ser Gly Arg Gln Ala Gln Gly Val Leu Leu Glu35 40 45Asn Pro Ala Ala Glu Leu Arg Phe Gln Asn Gly Ser Val Thr Ser Ser50 55 60Gly Gln Leu Phe Asp Glu Gly Val Arg Arg Phe Leu Gly Thr Val Thr65 70 75 80Val Lys Ala Gly Lys Leu Val Ala Asp His Ala Thr Leu Ala Asn Val85 90 95Ser Asp Thr Arg Asp Asp Asp Gly Ile Ala Leu Tyr Val Ala Gly Glu100 105 110Gln Ala Gln Ala Ser Ile Ala Asp Ser Thr Leu Gln Gly Ala Gly Gly115 120 125Val Arg Val Glu Arg Gly Ala Asn Val Thr Val Gln Arg Ser Thr Ile130 135 140Val Asp Gly Gly Leu His Ile Gly Thr Leu Gln Pro Leu Gln Pro Glu145 150 155 160
Asp Leu Pro Pro Ser Arg Val Val Leu Gly Asp Thr Ser Val Thr Ala165 170 175Val Pro Ala Ser Gly Ala Pro Ala Ala Val Ser Val Phe Gly Ala Asn180 185 190Glu Leu Thr Val Asp Gly Gly His Ile Thr Gly Gly Arg Ala Ala Gly195 200 205Val Ala Ala Met Asp Gly Ala Ile Val His Leu Gln Arg Ala Thr Ile210 215 220Arg Arg Gly Asp Ala Pro Ala Gly Gly Ala Val Pro Gly Gly Ala Val225 230 235 240Pro Gly Gly Phe Gly Pro Leu Leu Asp Gly Trp Tyr Gly Val Asp Val245 250 255Ser Asp Ser Thr Val Asp Leu Ala Gln Ser Ile Val Glu Ala Pro Gln260 265 270Leu Gly Ala Ala Ile Arg Ala Gly Arg Gly Ala Arg Val Thr Val Ser275 280 285Gly Gly Ser Leu Ser Ala Pro His Gly Asn Val Ile Glu Thr Gly Gly290 295 300Gly Ala Arg Arg Phe Pro Pro Pro Ala Ser Pro Leu Ser Ile Thr Leu305 310 315 320Arg Ala Gly Ala Arg Ala Gln Gly Arg Ala Leu Leu Tyr Arg Val Leu325 330 335Pro Glu Pro Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Gly Ala Gln Gly Gln Gly340 345 350Asp Ile Val Ala Thr Glu Leu Pro Pro Ile Pro Gly Ala Ser Ser Gly355 360 365Pro Leu Asp Val Ala Leu Ala Ser Gln Ala Arg Trp Thr Gly Ala Thr370 375 380Arg Ala Val Asp Ser Leu Ser Ile Asp Asn Ala Thr Trp Val Met Thr385 390 395 400Asp Asn Ser Asn Val Gly Ala Leu Arg Leu Ala Ser Asp Gly Ser Val405 410 415
Asp Phe Gln Gln Pro Ala Glu Ala Gly Arg Phe Lys Val Leu Met Val420 425 430Asp Thr Leu Ala Gly Ser Gly Leu Phe Arg Met Asn Val Phe Ala Asp435 440 445Leu Gly Leu Ser Asp Lys Leu Val Val Met Arg Asp Ala Ser Gly Gln450 455 460His Arg Leu Trp Val Arg Asn Ser Gly Ser Glu Pro Ala Ser Ala Asn465 470 475 480Thr Met Leu Leu Val Gln Thr Pro Arg Gly Ser Ala Ala Thr Phe Thr485 490 495Leu Ala Asn Lys Asp Gly Lys Val Asp Ile Gly Thr Tyr Arg Tyr Arg500 505 510Leu Ala Ala Asn Gly Asn Gly Gln Trp Ser Leu Val Gly Ala Lys Ala515 520 525Pro Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro530 535 540Gln Pro Gly Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro545 550 555 560Gln Arg Gln Pro Glu Ala Pro Ala Pro Gln Pro Pro Ala Gly Arg Glu565 570 575Leu Ser Ala Ala Ala Asn Ala Ala Val Asn Thr Gly Gly Val Gly Leu580 585 590Ala Ser Thr Leu Trp Tyr Ala Glu Ser Asn595 600<210>2<211>1806<212>DNA<213>支氣管敗血性博德特氏桿菌<400>2gatccaaaca ctgtgtcaat catcaaggcc ggcgagcgcc agcacggcat ccacatcaag 60caaagcgatg gcgccggcgt acggaccgcc accggaacga ccatcaaggt aagcggtcgt120caggcccagg gcgtcctgct ggaaaatccc gcggccgagc tgcggttcca gaacggcagc180gtcacgtctt cgggacagct gttcgacgaa ggcgtccggc gctttctggg caccgtcacc240
gtcaaggccg gcaagctggt cgccgatcac gccacgctgg ccaacgtcag cgacacccgg300gacgacgacg gcatcgcgct ctatgtggcc ggcgagcagg cccaggccag catcgccgac360agcaccctgc agggcgcggg cggcgtgcgg gtcgagcgcg gcgccaatgt cacggtccaa420cgcagcacca tcgttgacgg gggcttgcat atcggcaccc tgcagccgct gcagccggaa480gaccttccgc ccagccgggt ggtgctgggc gacaccagcg tgaccgccgt gcccgccagc540ggcgcgcccg cggcggtgtc tgtattcggg gccaatgagc ttacggttga tggcgggcac600atcaccgggg ggcgggcagc gggggtggcg gccatggacg gggcgatcgt gcatctgcag660cgcgcgacga tacggcgggg ggacgcgcct gccggcggtg cggttccagg cggtgcggtt720cccggcggct tcggccccct ccttgacggc tggtatggcg tggatgtatc ggactccacc780gtggacctcg ctcagtcgat cgtcgaggcg ccgcagctgg gcgccgcgat ccgggcgggc840cgcggcgcca gggtgacggt gtcgggcggc agcttgtccg caccgcacgg caatgtcatc900gagaccggcg gcggtgcgcg tcgcttcccg cctccggcct cgcccctgtc gatcaccttg960cgggcgggcg cacgggcgca ggggagggcg ctgctgtacc gggtcctgcc ggagcccgtg 1020aagctgacgc tggcgggcgg cgcccagggg cagggcgaca tcgtcgcgac ggagctgcct 1080cccattccag gcgcgtcgag cgggccgctc gacgtggcgc tggccagcca ggcccgatgg 1140acgggcgcta cccgcgcggt cgactcgctg tccatcgaca acgccacctg ggtcatgacg 1200gacaactcga acgtcggcgc gctgcggctg gccagcgacg gcagcgtcga tttccagcag 1260ccggccgaag ctgggcggtt caaggtcctg atggtcgata cgctggcggg ttcggggctg 1320ttccgcatga atgtcttcgc ggacctgggg ctgagcgaca agctggtcgt catgcgggac 1380gccagcggcc agcacaggct gtgggtccgc aacagcggca gcgagccggc cagcgccaac 1440accatgctgc tggtgcagac gccacgaggc agcgcggcga cctttaccct tgccaacaag 1500gacggcaagg tcgatatcgg tacctaccgc tatcgattgg ccgccaacgg caatgggcag 1560tggagcctgg tgggcgcgaa ggcgccgccg gcgcccaagc ccgcgccgca gcccggtccc 1620cagcccggtc cccagcccgg tccccagccg ccgcagccgc cgcagccgcc gcagccgcca 1680cagaggcagc cggaagcgcc ggcgccgcaa ccgccggcgg gcagggagtt gtccgccgcc 1740gccaacgcgg cggtcaacac gggtggggtg ggcctggcca gcacgctctg gtacgccgaa 1800agcaat 1806<210>3<211>599<212>PRT<213>支氣管敗血性博德特氏桿菌<400>3Asp Trp Asn Asn Gln Ser Ile Ile Lys Ala Gly Glu Arg Gln His Gly1 5 10 15
Ile His Ile Lys Gln Ser Asp Gly Ala Gly Val Arg Thr Ala Thr Gly20 25 30Thr Thr Ile Lys Val Ser Gly Arg Gln Ala Gln Gly Val Leu Leu Glu35 40 45Asn Pro Ala Ala Glu Leu Arg Phe Gln Asn Gly Ser Val Thr Ser Ser50 55 60Gly Gln Leu Phe Asp Glu Gly Val Arg Arg Phe Leu Gly Thr Val Thr65 70 75 80Val Lys Ala Gly Lys Leu Val Ala Asp His Ala Thr Leu Ala Asn Val85 90 95Ser Asp Thr Arg Asp Asp Asp Gly Ile Ala Leu Tyr Val Ala Gly Glu100 105 110Gln Ala Gln Ala Ser Ile Ala Asp Ser Thr Leu Gln Gly Ala Gly Gly115 120 125Val Arg Val Glu Arg Gly Ala Asn Val Thr Val Gln Arg Ser Thr Ile130 135 140Val Asp Gly Gly Leu His Ile Gly Thr Leu Gln Pro Leu Gln Pro Glu145 150 155 160Asp Leu Pro Pro Ser Arg Val Val Leu Gly Asp Thr Ser Val Thr Ala165 170 175Val Pro Ala Ser Gly Ala Pro Ala Ala Val Ser Val Phe Gly Ala Asn180 185 190Glu Leu Thr Val Asp Gly Gly His Ile Thr Gly Gly Arg Ala Ala Gly195 200 205Val Ala Ala Met Asp Gly Ala Ile Val His Leu Gln Arg Ala Thr Ile210 215 220Arg Arg Gly Asp Ala Pro Ala Gly Gly Ala Val Pro Gly Gly Ala Val225 230 235 240Pro Gly Gly Phe Gly Pro Leu Leu Asp Gly Trp Tyr Gly Val Asp Val245 250 255Ser Asp Ser Thr Val Asp Leu Ala Gln Ser Ile Val Glu Ala Pro Gln260 265 270
Leu Gly Ala Ala Ile Arg Ala Gly Arg Gly Ala Arg Val Thr Val Ser275 280 285Gly Gly Ser Leu Ser Ala Pro His Gly Asn Val Ile Glu Thr Gly Gly290 295 300Gly Ala Arg Arg Phe Pro Pro Pro Ala Ser Pro Leu Ser Ile Thr Leu305 310 315 320Gln Ala Gly Ala Arg Ala Gln Gly Arg Ala Leu Leu Tyr Arg Val Leu325 330 335Pro Glu Pro Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Gly Ala Gln Gly Gln Gly340 345 350Asp Ile Val Ala Thr Glu Leu Pro Pro Ile Pro Gly Ala Ser Ser Gly355 360 365Pro Leu Asp Val Ala Leu Ala Ser Gln Ala Arg Trp Thr Gly Ala Thr370 375 380Arg Ala Val Asp Ser Leu Ser Ile Asp Asn Ala Thr Trp Val Met Thr385 390 395 400Asp Asn Ser Asn Val Gly Ala Leu Arg Leu Ala Ser Asp Gly Ser Val405 410 415Asp Phe Gln Gln Pro Ala Glu Ala Gly Arg Phe Lys Cys Leu Met Val420 425 430Asp Thr Leu Ala Gly Ser Gly Leu Phe Arg Met Asn Val Ala Phe Ala435 440 445Asp Leu Gly Leu Ser Asp Lys Leu Val Val Met Arg Asp Ala Ser Gly450 455 460Gln His Arg Leu Leu Val Arg Asn Ser Gly Ser Glu Pro Ala Ser Gly465 470 475 480Asn Thr Met Leu Leu Val Gln Thr Pro Arg Gly Ser Ala Ala Thr Phe485 490 495Thr Leu Ala Asn Lys Asp Gly Lys Val Asp Ile Gly Thr Tyr Arg Tyr500 505 510Arg Leu Ala Ala Asn Gly Asn Gly Gln Trp Ser Leu Val Gly Ala Lys515 520 525
Ala Pro Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly530 535 540Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Arg Gln545 550 555 560Pro Glu Ala Pro Ala Pro Gln Pro Pro Ala Gly Arg Glu Leu Ser Ala565 570 575Ala Ala Asn Ala Ala Val Asn Thr Gly Gly Val Gly Leu Ala Ser Thr580 585 590Leu Trp Tyr Ala Glu Ser Asn59權(quán)利要求
1.疫苗組合物，其包含一定量的支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原及佐劑，以有效保護(hù)狗對抗支氣管敗血性博德特氏桿菌。
2.如權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中該支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原包含如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，且該抗原是重組制備的。
3.如權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中該佐劑包含Quil A及膽固醇。
4.保護(hù)狗對抗支氣管敗血性博德特氏桿菌的方法，其包括將如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的疫苗組合物施用于狗。
5.用于使狗對于犬科病原體免疫的聯(lián)合疫苗，其包含犬瘟熱(CD)病毒的減毒株、2型犬腺病毒(CAV-2)的減毒株、犬副流感病毒(CPI)的減毒株及犬細(xì)小病毒(CPV)的減毒株的制劑，犬冠狀病毒(CCV)株的滅活的完整或部分細(xì)胞制劑、支氣管敗血性博德特氏桿菌p68蛋白質(zhì)及佐劑。
6.如權(quán)利要求5的聯(lián)合疫苗，其中該支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原包含如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，且該抗原是重組制備的。
7.如權(quán)利要求5的聯(lián)合疫苗，其中該佐劑包含Quil A及膽固醇。
8.用于使狗對于犬科病原體免疫的聯(lián)合疫苗，其包含犬瘟熱(CD)病毒的減毒株，2型犬腺病毒(CAV-2)的減毒株、犬副流感病毒(CPI)的減毒株及犬細(xì)小病毒(CPV)的減毒株的制劑、犬冠狀病毒(CCV)株的滅活的完整或部分細(xì)胞制劑、支氣管敗血性博德特氏桿菌p68蛋白質(zhì)、至少一種選自于由感冒傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體及波摩那鉤端螺旋體所組成的組的螺旋體的螺旋體細(xì)胞制劑，以及佐劑。
9.如權(quán)利要求8的聯(lián)合疫苗，其中該螺旋體細(xì)胞制劑包含布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體及波摩那鉤端螺旋體細(xì)胞制劑。
10.如權(quán)利要求8的聯(lián)合疫苗，其中該支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原包含如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，且該抗原是重組制備的。
11.如權(quán)利要求8的聯(lián)合疫苗，其中該佐劑包含Quil A及膽固醇。
12.用于使狗對于犬科病原體免疫的聯(lián)合疫苗，其包含犬瘟熱(CD)病毒的減毒株、2型犬腺病毒(CAV-2)的減毒株、犬副流感病毒(CPI)的減毒株及犬細(xì)小病毒(CPV)的減毒株的制劑；支氣管敗血性博德特氏桿菌p68蛋白質(zhì)、螺旋體疫苗，該螺旋體疫苗包含至少一種選自于由布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體及波摩那鉤端螺旋體所組成的組的螺旋體的細(xì)胞制劑；以及佐劑。
13.如權(quán)利要求12的聯(lián)合疫苗，其中該螺旋體疫苗包含布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體及波摩那鉤端螺旋體的細(xì)胞制劑。
14.如權(quán)利要求12的聯(lián)合疫苗，其中該支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原包含如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，且該抗原是重組制備的。
15.如權(quán)利要求12的聯(lián)合疫苗，其中該佐劑包含Quil A及膽固醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用來保護(hù)狗對抗由支氣管敗血性博德特氏桿菌所引起的疾病的疫苗及方法。本發(fā)明也涉及一種用來保護(hù)狗對抗由犬科病原體所引起的疾病或病癥的聯(lián)合疫苗及方法，該疾病或病癥例如有由支氣管敗血性博德特氏桿菌所造成的傳染性氣管與支氣管炎、由犬瘟熱(CD)病毒所造成的犬瘟熱、由1型犬腺病毒(CAV－1)所造成的傳染性犬肝炎(ICH)、由2型犬腺病毒(CAV－2)所造成的呼吸道疾病、由犬副流感病毒所造成的犬副流感、由犬冠狀病毒(CCV)及犬細(xì)小病毒(CPV)所造成的腸炎及由布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體、犬鉤端螺旋體、感冒傷寒型鉤端螺旋體、黃疸出血型鉤端螺旋體或波摩那鉤端螺旋體所造成的螺旋體病。本發(fā)明的疫苗包括支氣管敗血性博德特氏桿菌p68抗原。
文檔編號(hào)A61K39/39GK1835767SQ200480003087
公開日2006年9月20日 申請日期2004年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月29日
發(fā)明者P·J·多米諾夫斯基, J·C·弗朗茨, R·L·克萊布斯, S·L·希爾茲, R·G·索蘭森 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司