專利名稱：醫(yī)用角膜貼片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于治療角膜疾病的將間充質(zhì)干細胞種植于羊膜上制成的貼片及其制備方法。
背景技術(shù)：
角膜損傷的治療是目前臨床上比較復(fù)雜的問題。角膜分為五層，分別為角膜上皮層，前界層，角膜基質(zhì)層，后界層和角膜內(nèi)皮層，臨床角膜疾病包括物理及化學(xué)燒傷，機械性外傷，感染，復(fù)發(fā)性翼狀胬肉，Steven-Johnson綜合癥，類天胞瘡，沙眼等，嚴重的結(jié)角膜疾病仍然是眼科醫(yī)生復(fù)明治療中的一大難題。角膜燒傷后角膜緣干細胞大量缺失，角膜上皮無法正常修復(fù)，角膜混濁，新生血管增加形成纖維化，繼發(fā)感染后出現(xiàn)角膜潰瘍甚至積膿，影響正常視力甚至失明。
臨床上傳統(tǒng)治療角膜疾病的方法一般有以下幾種一、傳統(tǒng)的角膜移植術(shù)后短期角膜透明，診斷明確即不能或聯(lián)合手術(shù)。其主要缺點為僅為中央φ7mm光學(xué)透明區(qū)移植，對干細胞缺失無效，因排斥反應(yīng)明顯，需要長期使用免疫抑制劑配合治療。
二、自體角膜緣移植雖然無免疫排斥反應(yīng)，但材料來源受限，主要缺點為增加健眼患病的危險性，不能360°環(huán)狀移植，效果受限。
三、異體角膜緣移植供體材料極為有限，治療機會非常少，并且免疫排斥反應(yīng)明顯，需要長期用藥，費用很高。
骨髓來源的間充質(zhì)干細胞近年來備受關(guān)注緣于它很容易分離、培養(yǎng)和擴增，且能向骨、脂肪、軟骨、神經(jīng)等各個胚層的組織分化。干細胞是自我更新組織內(nèi)細胞增殖與分化的源泉，在臨床上，干細胞解決了器官移植所帶來的器官來源問題，近期角膜緣干細胞移植成為治療角膜疾病的熱點，其主要方法是取自體或異體的角膜緣培養(yǎng)角膜緣干細胞種植于羊膜上進行移植治療角膜性疾病，但由于角膜緣來源受限，異體的角膜緣干細胞移植后排斥反應(yīng)明顯，所以雖有顯著的治療效果但未在臨床普及應(yīng)用。自體來源的干細胞解決了器官移植的免疫排斥反應(yīng)問題，是臨床器官移植領(lǐng)域的一大熱點和希望的曙光。
本發(fā)明采用自體來源的間充質(zhì)干細胞種于羊膜上作為承載載體治療角膜疾病取得了一定的療效，目前已經(jīng)完成了51例動物有效性試驗，實驗結(jié)果顯示這種發(fā)明產(chǎn)品應(yīng)用于臨床能夠促進上皮缺失的恢復(fù)，減少損傷后新生血管的形成，改善潰瘍；通過視動儀分別測量角膜上皮損傷前，損傷后和移植細胞后的大鼠視力，發(fā)現(xiàn)有顯著性差異，大鼠的視力基本恢復(fù)到正常水平；根據(jù)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/4的免疫熒光染色結(jié)果，證實間充質(zhì)干細胞能夠減少炎癥反應(yīng)，促進角膜上皮的恢復(fù)；通過HE切片染色可以觀察到燒傷后上皮不完全，炎癥反映嚴重，而移植細胞4周后上皮完整，炎癥反映消失，細胞對上皮的恢復(fù)起到了決定性的作用。作為新技術(shù)與臨床醫(yī)院合作對3例適宜的角膜病患者進行了培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)細胞羊膜片移植手術(shù)，術(shù)后患者恢復(fù)較好，患者視力得到提高，證明該方法能有效的重建眼表。此方法既排除了免疫排斥反應(yīng)，又解決了細胞來源問題，為臨床角膜疾病的治療開辟了一條新路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有治療角膜疾病功能的醫(yī)用角膜貼片。
本發(fā)明的醫(yī)用角膜貼片，是將自體來源的間充質(zhì)干細胞種植于處理好的羊膜上，間充質(zhì)干細胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)保存，培養(yǎng)液的名稱為a-MEM，其組分為細胞生長必須的氨基酸，蛋白質(zhì)和多糖等。


圖1醫(yī)用角膜貼片外觀圖；圖2細胞在羊膜上生長圖；圖3a正常大鼠角膜；圖3b燒傷后大鼠角膜；圖4不同對照組大鼠術(shù)后4周角膜恢復(fù)情況圖(裂隙燈照相圖片)，圖4a-移植間充質(zhì)干細胞，圖4b-移植角膜緣干細胞，圖4c-移植成纖維細胞，圖4d-單純移植羊膜，圖4e-陰性對照；圖5不同對照組大鼠術(shù)后4周角膜恢復(fù)情況圖(H-E染色圖片)，圖5a-移植間充質(zhì)干細胞，圖5b-移植角膜緣干細胞，圖5c-移植成纖維細胞，圖5d-單純移植羊膜，圖5e-陰性對照；圖6視動跟蹤儀對實驗大鼠視力反射狀況的跟蹤圖，圖6a、圖6b、圖6c為三個不同光柵術(shù)前雙眼(綠色)，術(shù)前單眼(紫色)，燒傷前單眼(黃色)的運動總路程，圖6d為術(shù)前雙眼，圖6e為術(shù)前單眼，圖6f為燒傷后單眼的運動軌跡；圖7a單純移植羊膜后14天MMP-2的表達(20X)；圖7b移植間充質(zhì)干細胞后14天MMP-2的表達(20X)。
實施方案1.原料(1)培養(yǎng)基a-MEM購自GIBCO BRL(Grand Island，NY，USA)，組分為維持細胞生長的必需氨基酸，蛋白質(zhì)和多糖等，產(chǎn)品號1206692。
(2)胎牛血清(FBS)，購自Hyclone(Logan，UT)公司，細胞生長必需的營養(yǎng)成分，其產(chǎn)品嚴格按照胎牛血清質(zhì)量標準執(zhí)行。
(3)Trypsin-EDTA，購自GIBCO BRL(Grand Island，NY，USA)，消化細胞用。
(4)CD34，CD44，CD45，CD38，CD90，CD71，CD147，HLA-DR購自BD公司，為間充質(zhì)干細胞的標記鑒定抗體。
(5)羊膜取自剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦的胎盤，術(shù)前檢測孕母血清HBsAg，、抗-HCV、HCV-RNA、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HIV-1-RNA、RPR、CMV-DNA為陰性，試驗方法采用臨床術(shù)前常規(guī)檢測方法，結(jié)果均為陰性方可使用。在無菌條件下，用平衡鹽液清洗血凝塊，鈍性分離羊膜和絨毛膜。用含慶大霉素50μg/ml的平衡鹽液清洗羊膜三遍，并剪成1.5×1.5cm2大小約100塊。將羊膜編號，加入等量DMEM與純甘油中，-80℃貯存。
2.角膜貼片培養(yǎng)的溫度為37℃，保存溫度為4℃。
3.角膜貼片培養(yǎng)液的PH值7.2-7.5。
4.角膜貼片的面積1.5×1.5cm2。
5.實施方案是通過以下方法進行并測試的(1)將成人骨髓通過密度梯度離心法分離，培養(yǎng)，擴增到一定數(shù)量后，用流式細胞術(shù)檢測表面細胞標志，分別是CD34，CD38，CD45，CD147，HLA-DR，CD71，CD44，CD90。建立SD大鼠的角膜堿燒傷動物模型，使其角膜緣上皮脫落，視動儀測量視力總路程在500cm左右作為視力正常的入選標準。間充質(zhì)干細胞種植于處理好的羊膜上，密度達到90％以上時移植于燒傷7天后受損的角膜上，用視動儀對每只入選大鼠的視力進行測量看視力恢復(fù)情況，4-6周處死，將角膜用4％多聚甲醛固定，切片，HE染色觀察角膜修復(fù)情況，免疫熒光法染抗人核抗體檢測細胞的存活情況及MMP-2染色檢測間充質(zhì)干細胞對炎癥反應(yīng)的抑制作用。
(2)大鼠視力測定方法Head-tracking的建立大鼠視功能的評估方法比較常用的有兩種，一種是電生理法如非侵害性的VEP(visualevoked potentials)法和侵害性的大腦中樞單電極電生理法、視皮質(zhì)電生理記錄法。另外一種是行為學(xué)的評估方法，主要包括對大鼠反射發(fā)育，運動功能，反應(yīng)性，學(xué)習(xí)與記憶，感覺運動功能的評估，比較常見的有水迷宮試驗，前置刺激反應(yīng)，信號識別實驗，視動跟蹤反應(yīng)，選箱實驗等。電生理法的缺點是帶有一定的侵害性和時間的不可預(yù)測，而行為學(xué)的方法需要花大量的時間與精力對動物的行為習(xí)慣進行訓(xùn)練。而視動跟蹤反應(yīng)(Head-tracking)克服了以上的缺點，它通過三種不同寬度的光柵(0.125，0.25，0.5cycles/degree)對動物予以刺激，按其頭部視動跟蹤反應(yīng)來判斷動物的視功能狀況，判斷指標為跟蹤能力的有無和跟蹤時間的長短。視動跟蹤儀最早是用來跟蹤視網(wǎng)膜缺失大鼠的視力狀況，經(jīng)北京大學(xué)干細胞中心研發(fā)生產(chǎn)應(yīng)用于角膜受損大鼠視力的測定，它是由三部分組成一個直徑58cm高58cm的電動鼓形圓桶，電動設(shè)備能夠帶動圓桶以2rev./min的速度正向和反向旋轉(zhuǎn)，內(nèi)壁為黑白相間的三個不同寬度的光柵(0.125，0.25，0.5cycles/degree)，在圓桶的中央有一個直徑22cm，高38cm的小的圓桶，被測試大鼠放于其中。另外一個設(shè)備是電腦，里面安裝該設(shè)備的軟件，可以記錄大鼠的運動軌跡和計算總路程和運動時間，他們之間通過一個攝像裝備相連。本實驗通過此設(shè)備記錄了被測60只大鼠的正常雙眼，正常單眼(被燒傷的眼睛，縫合另外正常眼瞼)，燒傷后單眼(被燒傷的眼睛)，手術(shù)后4周的單眼和雙眼的視力情況。將大鼠頭部用染發(fā)劑涂黑，測量前將大鼠放入中間的圓桶中適應(yīng)30秒，開動儀器每只大鼠測量10分鐘，攝像設(shè)備記錄大鼠對每個光柵的反應(yīng)和行為學(xué)如識別，跟蹤，搖頭，暈眩等狀況，電腦記錄其運動軌跡，運動時間和運動總路程，將測試大鼠分組進行不同的細胞移植，通過統(tǒng)計學(xué)進行數(shù)據(jù)分析整理，橫向分析不同手段的細胞移植對視力的恢復(fù)情況。
(3)大鼠角膜堿燒傷模型的建立所有動物的使用方法嚴格根據(jù)北京大學(xué)實驗動物研究中心實驗動物關(guān)愛和使用協(xié)會規(guī)則執(zhí)行。120只雄性SD大鼠體重180-200克購自北京大學(xué)實驗動物研究中心，視動跟蹤儀篩選80只視力正常的大鼠，全身乙醚麻醉，右眼表面用表面麻醉劑進行表面麻醉，將外環(huán)直徑8mm，內(nèi)環(huán)直徑4mm的濾紙環(huán)浸泡于1.0N的NaOH溶液中，完全浸濕后棉棒吸去多余的堿液，置于大鼠角膜上30秒，燒去角膜緣上皮，立即用生理鹽水沖洗，鞏膜隧道刀刮去剩余的角膜緣和中央的上皮細胞，涂上治療炎癥反應(yīng)和免疫抑止劑混合型的眼膏碘必舒，每天2次，7天后進行細胞移植。
(3)細胞移植手術(shù)細胞在羊膜上生長密度達到90％以上時可以進行移植，選燒傷7天后的大鼠，去掉角膜上皮面粘連的組織和角質(zhì)層，將種有羊膜的細胞面朝上鋪于燒傷角膜表面，10-0縫合線四點對稱縫合，然后取一片處理好的羊膜，基底面朝上蓋于細胞面上縫合于結(jié)膜上以保護細胞，術(shù)后縫合眼瞼，7天后拆線，每天滴氯霉素三次，有些大鼠根據(jù)分組進行碘必舒激素治療。
(4)眼部表面觀察評定大鼠角膜每天進行日常觀察，每周兩次裂隙燈觀察，熒光素鈉鑒定上皮的修復(fù)情況，如果上皮缺損熒光素鈉著色，上皮無缺損熒光素鈉不著色。
(5)H-E染色術(shù)后大鼠4周，過量水合氯醛麻醉處死，取角膜固定，石蠟包埋，切片，脫水，H-E染色，蘇木精-伊紅著色染細胞質(zhì)和細胞核。
(6)免疫熒光染色取過量水合氯醛處死的大鼠角膜，固定，OCT包埋，冷凍切片，用含有0.5％的Triton-X100的PBS(PBST)洗滌，打孔，2％BSA封閉，加入一抗MMP-2，4度過夜，PBST洗滌三次，加入FITC或者TRITC標記的二抗，室溫1小時放置，洗滌，封片，熒光顯微鏡下觀察。
實施例一眼表上皮恢復(fù)評價堿燒傷后的大鼠角膜上皮嚴重缺損(見圖3a、圖3b)，手術(shù)四周后，對實驗動物角膜進行觀察，從角膜透明，角膜渾濁，前房積血，前房積膿，角膜穿孔五個方面對每只大鼠進行評價，評價效果(見表1)，從表中可以看出，間充質(zhì)干細胞移植后角膜恢復(fù)效果和角膜緣干細胞移植后效果基本相同，同時比單純羊膜移植和成纖維細胞移植效果好，同時，通過裂隙燈照相可以看出，移植了間充質(zhì)干細胞的燒傷角膜新生血管明顯減少，上皮基本恢復(fù)，角膜透明，與移植角膜緣干細胞移效果基本相同(見圖4a、圖4b、圖4c、圖4d、圖4e)，H-E染色后也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果(見圖5a、圖5b、圖5c、圖5d、圖5e)。MSC-移植間充質(zhì)干細胞，LSC-移植角膜緣干細胞，AM-單純移植羊膜，F(xiàn)B-移植成纖維細胞，CON-陰性對照。

表1不同對照組大鼠術(shù)后4周角膜恢復(fù)情況實施例二燒傷大鼠視力的恢復(fù)通過視動跟蹤儀對實驗大鼠視力反射狀況的跟蹤，對燒傷前雙眼，燒傷前單眼，燒傷后單眼的運動總路程和運動軌跡進行比較(見圖6a、圖6b、圖6c、圖6d、圖6e、圖6f)，可以看出在視動跟蹤儀對大鼠的視力狀況跟蹤有顯著性差異，視動跟蹤儀正常工作。燒傷后分別移植不同種類的細胞，對各組數(shù)據(jù)進行橫向比較，通過不同光柵的視動反應(yīng)比較其P值(見表2、表3、表4、表5)，得出間充質(zhì)干細胞比其他移植方法對大鼠視力恢復(fù)效果有顯著性提高。MSC-移植間充質(zhì)干細胞，LSC-移植角膜緣干細胞，AM-單純移植羊膜，F(xiàn)B-移植成纖維細胞。

表2不同組術(shù)后雙眼移動總距離比較(P＜0.05有顯著性差異)

表3不同組術(shù)后單眼移動總距離比較(P＜0.05有顯著性差異)

表4不同組術(shù)后雙眼平均速度比較(P＜0.05有顯著性差異)

表5不同組術(shù)后單眼平均速度比較(P＜0.05有顯著性差異)實施例三炎癥因子的反應(yīng)MMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶2)是以基底膜膠原為特異性底物，其組織型抑制劑能在體內(nèi)直接調(diào)節(jié)酶活性，所以MMP-2在角膜損傷中能夠反應(yīng)其新生血管的變化。從圖中可以看出(見圖7a、圖7b)，移植間充質(zhì)干細胞的角膜比單純移植羊膜的角膜基質(zhì)活性低，說明間充質(zhì)干細胞對抑制新生血管再生起到了決定性的作用，顯示移植間充質(zhì)干細胞的大鼠角膜基質(zhì)炎癥反應(yīng)比移植其他細胞輕。
權(quán)利要求
1.一種醫(yī)用角膜貼片，其特征在于該貼片是將干細胞種植于處理好的羊膜上制成的。
2.如權(quán)利要求1所述的醫(yī)用角膜貼片，其特征在于所使用的干細胞是自體來源的間充質(zhì)干細胞。
3.如權(quán)利要求2所述的醫(yī)用角膜貼片，其特征在于間充質(zhì)干細胞是通過以下方法培養(yǎng)的(1)取健康人的骨髓10ml，用PBS按1∶1稀釋；(2)加入5ML Ficoll(Sigma，密度1.077)，2000rpm離心20分鐘；(3)將中間云霧狀的單個核細胞懸液吸出，PBS洗滌3次，種于含有10％FBS的a-MEM的培養(yǎng)基中，10-14天后鋪滿瓶底；(4)傳代擴增到第四代后取2×105細胞種于處理好的羊膜上，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到細胞長滿整個羊膜。
4.如權(quán)利要求1所述的醫(yī)用角膜貼片，其特征在于所述羊膜是通過以下方法制備的(1)羊膜取自剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦的胎盤，術(shù)前檢測孕母血清HbsAg，抗-HCV.HCV-RNA，抗-HDV，抗-HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA，RPR，CMV-DNA，結(jié)果均為陰性方可使用；(2)臨床獲取羊膜后，用含有100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的PBS洗滌；(3)羊膜由上皮層，基底膜和其下面緊湊的基質(zhì)組成，先鈍性分離羊膜及絨毛膜，洗滌后剪成1.5cm×1.5cm小塊，將其保存在50％DMEM和50％甘油組成的保存液中，放入-80℃凍存?zhèn)溆茫?4)使用時取出凍存羊膜，在PBS中水化30分鐘，用0.25％胰酶和0.02％EDTA消化15-30分鐘；(5)細胞刮刀刮除上皮，基底面向上鋪于培養(yǎng)皿中，部分進行H-E染色，確定羊膜上皮已經(jīng)去除。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種醫(yī)用角膜貼片及其制備方法，是采用自體來源的間充質(zhì)干細胞種于羊膜上作為承載載體治療角膜疾病，臨床上獲得健康人的骨髓10ml，用PBS按1∶1稀釋，加入5ML Ficoll(Sigma，密度1.077)，2000rpm離心20分鐘，將中間云霧狀的單個核細胞懸液吸出，PBS洗滌3次，種于含有10％FBS的a－MEM的培養(yǎng)基中，10－14天后鋪滿瓶底，傳代擴增到第四代后取2×10
文檔編號A61L27/00GK1634610SQ20041008382
公開日2005年7月6日 申請日期2004年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月19日
發(fā)明者馬艷玲, 李凌松 申請人:北京科宇聯(lián)合干細胞生物技術(shù)有限公司